WO2023234487A1 - 리스테리아 속 균주와 리스테리아 모노사이토제니스를 동시 구분 검출할 수 있는 리얼-타임 pcr 키트 - Google Patents

리스테리아 속 균주와 리스테리아 모노사이토제니스를 동시 구분 검출할 수 있는 리얼-타임 pcr 키트 Download PDF

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WO2023234487A1
WO2023234487A1 PCT/KR2022/014995 KR2022014995W WO2023234487A1 WO 2023234487 A1 WO2023234487 A1 WO 2023234487A1 KR 2022014995 W KR2022014995 W KR 2022014995W WO 2023234487 A1 WO2023234487 A1 WO 2023234487A1
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listeria
seq
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real
listeria monocytogenes
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PCT/KR2022/014995
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박정웅
최진호
신은경
문혜진
남은우
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주식회사 세니젠
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a real-time PCR kit that can simultaneously detect Listeria spp. and Listeria monocytogenes .
  • Food poisoning refers to an infectious or toxic disease (Article 2, Paragraph 14 of the Food Sanitation Act) that is caused or determined to be caused by microorganisms or toxic substances harmful to the human body due to ingestion of food. It usually occurs in the summer when the days are hot. Although it is thought to be common, it is a disease that can occur all year round.
  • Listeria spp. includes Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii , Listeria innocua , Listeria seeligeri , Listeria welshimeri , Listeria It is classified into Listeria grayi, Listeria marthii , and Listeria rocourtiae .
  • Listeria monocytogenes is known to be the main cause of food poisoning, and in addition, Listeria ivanovii , Listeria innocua , and Listeria seeligeri are also reported to cause food poisoning. It is becoming.
  • Listeria monocytogenes causes food poisoning even at low contamination levels of 100 to 1,000 CFU/g, and is a high-risk pathogen that causes miscarriage, central nervous system infection, and endocarditis when infected with pregnant women, newborns, and the elderly.
  • the present invention provides a primer set (a) for detection of Listeria spp. strains, including a forward primer consisting of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
  • a primer set (b) for detection of Listeria monocytogenes comprising a forward primer consisting of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and a reverse primer consisting of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 5;
  • the primer set (a) preferably further includes a probe consisting of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the primer set (b) is, Preferably, it is better to further include a probe consisting of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the probe consisting of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is preferably tagged with a fluorescent dye at the 5' and 3' ends
  • the probe consisting of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 is preferably tagged with a fluorescent dye at the 5' and 3' ends.
  • the present invention provides a kit for polymerase chain reaction, which includes the multiplex primer set.
  • the polymerase chain reaction may preferably be real-time polymerase chain reaction (real-time PCR).
  • the real-time PCR kit of the present invention is a strain of the Listeria genus (Listeria monocytogenes, Listeria Ivanovi, Listeria innocua, Listeria siligeri, Listeria welshmeri, Listeria gray, Listeria marti, Listeria locurtiae) and Listeria monocytogenes. can be detected simultaneously with high sensitivity and specificity.
  • Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes, Listeria Ivanovi, Listeria innocua, Listeria siligeri, Listeria welshmeri, Listeria gray, Listeria marti, Listeria locurtiae
  • Listeria monocytogenes can be detected simultaneously with high sensitivity and specificity.
  • Figure 1 shows the results of a specificity verification experiment of real-time PCR using the primers and probes of the present invention.
  • Figure 2 shows the results of an experiment verifying the minimum detection limit of real-time PCR when using the primers and probes of the present invention.
  • the present invention provides a primer set (a) for detection of Listeria spp. strains, including a forward primer consisting of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
  • a primer set (b) for detection of Listeria monocytogenes comprising a forward primer consisting of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and a reverse primer consisting of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 5;
  • the primer set (a) preferably further includes a probe consisting of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the primer set (b) is, Preferably, it is better to further include a probe consisting of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the probe consisting of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is preferably tagged with a fluorescent dye at the 5' and 3' ends, More preferably, VIC is tagged with a fluorescent dye at the 5' end, and BHQ 1 is tagged with a fluorescent dye at the 3' end.
  • the probe consisting of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 is preferably tagged with a fluorescent dye at the 5' and 3' ends, and more preferably with a fluorescent dye at the 5' end. It is preferable that FAM is tagged and BHQ 1 is tagged with a fluorescent dye at the 3' end.
  • the present invention provides a kit for polymerase chain reaction, which includes the multiplex primer set.
  • the multiplex primer set developed in the present invention is used for PCR. When PCR is performed on a sample, it is possible to simultaneously distinguish and detect the Listeria genus strains and Listeria monocytogenes.
  • buffers, dNTPs, etc. may be added to the PCR kit. Since known ones can be used without being limited to specific ones, detailed description thereof will be omitted.
  • the polymerase chain reaction may preferably be real-time polymerase chain reaction (real-time PCR).
  • real-time PCR the chain polymerization reaction product can be quantitatively confirmed in real time, which has the advantage of immediately confirming viral infection in the field.
  • the concentration is preferably 0.035 for a working volume of about 17 ⁇ l for polymerase chain reaction. It is better to use it by adding ⁇ l, and in the case of the primers shown in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, it is preferably used by adding 0.1 ⁇ l to a working volume of about 17 ⁇ l for polymerase chain reaction, and the primers shown in SEQ ID NO: 6
  • the probe it is preferably used by adding 0.015 ⁇ l to a working volume of about 17 ⁇ l for polymerase chain reaction.
  • Example 1 Listeria genus strains ( Listeria spp.) and Listeria monocytogenes ( Listeria monocytogenes ) Production of a primer set for simultaneous detection of [
  • Example 1 Experiment to verify specificity of a real-time PCR kit containing a primer set for simultaneous detection of Listeria genus strains and Listeria monocytogenes prepared in Example 1]
  • Target Primers & Probes Con. Stock concentration ( ⁇ M) Volume( ⁇ l) Sequence information Listeria spp.
  • Forward primer 175 100 0.035 SEQ ID NO: 1
  • Reverse primer 175 100 0.035 SEQ ID NO: 2
  • Probe 175 100 0.035 SEQ ID NO: 3
  • Listeria monocytogenes Forward primer 500 100 0.1 SEQ ID NO: 4
  • Reverse primer 500 100 0.1 SEQ ID NO: 5
  • Probe 75 100 0.015 SEQ ID NO: 6 qRT-PCR Mix (with Rox dye)* 10.3 Molecular water 6.38 Total 17
  • Real-time PCR was performed 40 times in cycles consisting of 2 minutes at 50°C, 10 minutes at 95°C, 15 seconds at 95°C, and 1 minute at 60°C.
  • the instrument used was AB 7500 Real-time from Thermo Fisher Scientific. PCR Instrument System was used.
  • the degree of amplification can be predicted by checking the threshold cycle number (Ct value) of the target gene, and detection can be determined when the Ct value is between 10 and 35.
  • Ct value threshold cycle number
  • Strain/strain number CT value Strain/strain number CT value Listeria spp. Listeria monocytogenes Listeria spp. Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes ATCC 19115 16.4 17.88 EHEC ATCC 43895 ND * ND * Listeria grayi ATCC 25401 15.51 ND * Vibrio vulnificus CMCP6 ND * ND * Listeria innocua ATCC 33090 16.28 ND * Vibrio Cholerae NCCP 14552 ND * ND * Listeria marthii ATCC BAA-1595 15.2 ND * Vibrio parahaemolyticus KCTC 2471 ND * ND * Listeria rocourtiae KCTC 13856 16.69 ND * Salmonella typhimurium ATCC 43971 ND * ND * Listeria welshimeri ATCC 35897 15.45 ND * Cronobacter sakazakii ATCC 29544 ND * ND * Listeria seeliger
  • Example 2 Experiment to verify the minimum detection limit of a real-time PCR kit containing a primer set for simultaneous detection of Listeria genus strains and Listeria monocytogenes prepared in Example 1]

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Abstract

본 발명은 리스테리아 속(Listeria spp.) 균주와 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)를 동시 구분 검출할 수 있는 리얼-타임 PCR 키트에 관한 것으로, 본 발명의 리얼-타임 PCR 키트는 리스테리아 속 균주(리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii), 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua), 리스테리아 실리게리(Listeria seeligeri), 리스테리아 웰시메리(Listeria welshimeri), 리스테리아 그라이(Listeria grayi), 리스테리아 마르티(Listeria marthii), 리스테리아 로쿠르티애(Listeria rocourtiae))와 리스테리아 모노사이토제니스를 구분하되, 높은 민감도와 특이도로 동시 구분 검출할 수 있다.

Description

리스테리아 속 균주와 리스테리아 모노사이토제니스를 동시 구분 검출할 수 있는 리얼-타임 PCR 키트
본 발명은 리스테리아 속(Listeria spp.) 균주와 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)를 동시 구분 검출할 수 있는 리얼-타임 PCR 키트에 관한 것이다.
식중독이란 식품의 섭취로 인하여 인체에 유해한 미생물 또는 유독물질에 의하여 발생하였거나 발생한 것으로 판단되는 감염성 또는 독소형 질환(식품위생법 제2조 제14호)을 말하는 것으로, 보통 날이 더워지는 여름철에 주로 발생하는 것으로 생각되나, 사계절 내내 찾아올 수 있는 질환이다.
리스테리아 속(Listeria spp.)은 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii), 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua), 리스테리아 실리게리(Listeria seeligeri), 리스테리아 웰시메리(Listeria welshimeri), 리스테리아 그라이(Listeria grayi), 리스테리아 마르티(Listeria marthii), 리스테리아 로쿠르티애(Listeria rocourtiae) 등으로 분류된다. 이 중, 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)는 주요 식중독 원인균으로 알려져 있으며, 그 외에 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii), 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua), 리스테리아 실리게리(Listeria seeligeri)도 식중독을 일으키는 것으로 보고되고 있다.
리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)는 100~1,000 CFU/g의 낮은 오염수준에서도 식중독을 유발하며, 임산부, 신생아 및 노인에게 감염할 경우 유산, 중추신경계 감염, 심내막염 등을 유발하는 고위험성 병원균이다.
기존 연구에서 리스테리아 속 균주의 신속 검출을 위해 ELISA kit, immunochromatography assay kit 등이 개발되었으나, 사용되는 항체가 리스테리아 속 균주 모두에 반응하여 리스테리아 모노사이토제니스를 분리 동정하지 못하였다. 또한, 리스테리아 속 균주를 분리배양하기 위해 사용하는 선택 배지인 Palcam 배지 또는 Oxford 배지는 에스큘린(esculin) 분해능을 기초로 리스테리아 속 균주를 분리 동정하나, 리스테리아 모노사이토제니스와 리스테리아 속 균주를 구분하는 것이 불가능하였다. 한편, 리스테리오라이신(listeriolysin), iap 또는 dth 유전자를 이용한 하이브리디제이션(hybridization) 기법은 리스테리아 모노사이토제니스의 분리 동정이 가능하지만, 이에 일주일 이상의 시간이 소요되며 낮은 민감도를 가진다는 한계가 있었다.
이에 리스테리아 속 균주(리스테리아 모노사이토제니스, 리스테리아 이바노비, 리스테리아 이노쿠아, 리스테리아 실리게리, 리스테리아 웰시메리, 리스테리아 그라이, 리스테리아 마르티, 리스테리아 로쿠르티애)와 리스테리아 모노사이토제니스를 구분하여 동시 검출할 수 있는, 신속하고도 정확하게 높은 특이도와 민감도를 가지는 기술이 필요한 실정이다.
본 발명에서는 기존 방법에서는 구분하기 어려웠던 한계를 극복하여 리스테리아 속 균주(리스테리아 모노사이토제니스, 리스테리아 이바노비, 리스테리아 이노쿠아, 리스테리아 실리게리, 리스테리아 웰시메리, 리스테리아 그라이, 리스테리아 마르티, 리스테리아 로쿠르티애)와 리스테리아 모노사이토제니스를 구분하되, 높은 민감도와 특이도로 동시 구분 검출할 수 있는 리얼-타임 PCR 키트를 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 서열번호 1에 기재된 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 2에 기재된 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 리스테리아 속(Listeria spp.) 균주의 검출을 위한 프라이머 세트 (a) 및; 서열번호 4에 기재된 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 5에 기재된 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)의 검출을 위한 프라이머 세트 (b);를 포함하는 것을 특징으로 하는 리스테리아 속(Listeria spp.) 균주 및 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)의 동시 검출을 위한 멀티플렉스 프라이머 세트를 제공한다.
한편, 본 발명의 멀티플렉스 프라이머 세트에 있어서, 상기 프라이머 세트 (a)는, 바람직하게 서열번호 3에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)을 더 포함하는 것이 좋고, 상기 프라이머 세트 (b)는, 바람직하게 서열번호 6에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)을 더 포함하는 것이 좋다.
한편, 본 발명의 멀티플렉스 프라이머 세트에 있어서, 상기 서열번호 3에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)은, 바람직하게 5'말단 및 3'말단에 형광염료가 태깅(tagging)되어 있는 것이 좋고, 상기 서열번호 6에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)은, 바람직하게 5'말단 및 3'말단에 형광염료가 태깅(tagging)되어 있는 것이 좋다.
또한, 본 발명은 상기 멀티플렉스 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)용 키트를 제공한다.
한편, 본 발명의 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)용 키트에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)은, 바람직하게 실시간중합효소연쇄반응 (real-time PCR)인 것일 수 있다.
본 발명의 리얼-타임 PCR 키트는 리스테리아 속 균주(리스테리아 모노사이토제니스, 리스테리아 이바노비, 리스테리아 이노쿠아, 리스테리아 실리게리, 리스테리아 웰시메리, 리스테리아 그라이, 리스테리아 마르티, 리스테리아 로쿠르티애)와 리스테리아 모노사이토제니스를 구분하되, 높은 민감도와 특이도로 동시 구분 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명의 프라이머 및 탐침을 이용하였을 때 리얼-타임 PCR의 특이도 검증 실험결과이다.
도 2는 본 발명의 프라이머 및 탐침을 이용하였을 때 리얼-타임 PCR의 최소 검출한계 검증 실험결과이다.
기존의 연구에서는 식중독균으로 알려진 리스테리아 속 균주와 리스테리아 모노사이토제니스를 분리 동정하기 어렵거나, 분리 동정하는데 많은 시간이 소요되거나 낮은 민감도를 가진다는 한계가 존재하였다. 본 발명에서는 이를 해결하기 위해 예의 노력하였으며 그 결과, 리스테리아 속 균주와 리스테리아 모노사이토제니스를 높은 민감도와 특이도로 동시 구분 검출할 수 있는 프라이머 세트를 개발하였다.
본 발명은 서열번호 1에 기재된 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 2에 기재된 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 리스테리아 속(Listeria spp.) 균주의 검출을 위한 프라이머 세트 (a) 및; 서열번호 4에 기재된 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 5에 기재된 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)의 검출을 위한 프라이머 세트 (b);를 포함하는 것을 특징으로 하는 리스테리아 속(Listeria spp.) 균주 및 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)의 동시 검출을 위한 멀티플렉스 프라이머 세트를 제공한다.
한편, 본 발명의 멀티플렉스 프라이머 세트에 있어서, 상기 프라이머 세트 (a)는, 바람직하게 서열번호 3에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)을 더 포함하는 것이 좋고, 상기 프라이머 세트 (b)는, 바람직하게 서열번호 6에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)을 더 포함하는 것이 좋다.
한편, 본 발명의 멀티플렉스 프라이머 세트에 있어서, 상기 서열번호 3에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)은, 바람직하게 5'말단 및 3'말단에 형광염료가 태깅(tagging)되어 있는 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 상기 5'말단에 형광염료로 VIC가 태깅(tagging)되어 있고, 3'말단에 형광염료로 BHQ1이 태깅(tagging)되어 있는 것이 좋다. 상기 서열번호 6에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)은, 바람직하게 5'말단 및 3'말단에 형광염료가 태깅(tagging)되어 있는 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 상기 5'말단에 형광염료로 FAM이 태깅(tagging)되어 있고, 3'말단에 형광염료로 BHQ1이 태깅(tagging)되어 있는 것이 좋다. 상기와 같은 형광염료의 태깅에 의해 타겟균들의 감염여부를 형광 분석기를 통해 바로 확인할 수 있으며, 본 발명에서는 리스테리아 모노사이토제니스에서 두 가지 탐침에 대한 형광이 발현되는 것을 통해 다른 리스테리아 속 균주들과 구분 검출할 수 있다.
상기와 같은 본 발명의 멀티플렉스 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, 높은 특이도와 민감도로 리스테리아 속 균주와 리스테리아 모노사이토제니스를 동시 구분 검출함이 확인되었다.
또한, 본 발명은 상기 멀티플렉스 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)용 키트를 제공한다. 상기 본 발명에서 개발한 멀티플렉스 프라이머 세트는 PCR에 사용되는데, 검체를 대상으로 하여 PCR을 수행할 경우, 상기 리스테리아 속 균주와 리스테리아 모노사이토제니스를 동시 구분 검출할 수 있게 된다. PCR용 키트에는 본 발명의 프라이머 세트 외에 버퍼, dNTP 등이 첨가될 수 있는데, 이는 공지의 것을 특별한 것에 한정하지 않고 사용할 수 있으므로, 이에 대한 구체적인 기재는 생략하기로 한다.
한편, 본 발명의 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)용 키트에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)은, 바람직하게 실시간중합효소연쇄반응 (real-time PCR)인 것일 수 있다. 리얼-타임 PCR을 수행하면, 연쇄중합반응 결과 산물을 실시간에 정량적으로 확인할 수 있어, 현장에서 바이러스의 감염을 즉시 확인할 수 있는 장점이 있다.
한편, 본 발명의 중합효소연쇄반응용 키트에 있어서, 상기 서열번호 1, 서열번호 2에 기재된 프라이머와 서열번호 3에 기재된 탐침의 경우 바람직하게 중합효소연쇄반응을 위해 워킹볼륨 17㎕ 정도에 대해 0.035 ㎕ 첨가되어 사용되는 것이 좋고, 상기 서열번호 4, 서열번호 5에 기재된 프라이머의 경우 바람직하게 중합효소연쇄반응을 위해 워킹볼륨 17㎕ 정도에 대해 0.1 ㎕ 첨가되어 사용되는 것이 좋고, 서열번호 6에 기재된 탐침의 경우 바람직하게 중합효소연쇄반응을 위해 워킹볼륨 17 ㎕ 정도에 대해 0.015 ㎕ 첨가되어 사용되는 것이 좋다. 이와 같은 처리 농도 및 첨가량을 사용할 경우, 타겟 미생물들의 검출 감도를 더욱 유사하게 맞출 수 있는 장점이 있다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[실시예 1: 리스테리아 속 균주( Listeria spp.)와 리스테리아 모노사이토제니스( Listeria monocytogenes )의 동시 구분 검출용 프라이머 세트의 제작]
본 실시예에서는 리스테리아 속 균주와 리스테리아 모노사이토제니스의 동시 구분 검출용 프라이머(primer) 세트를 제작하였다. 제작한 프라이머 및 탐침(probe) 서열은 하기 표 1과 같았다.
본 발명의 리스테리아 속 균주와 리스테리아 모노사이토제니스의 동시 구분 검출용 프라이머 및 탐침 서열
Target Primer & Probe Sequence(5'->3') Conc.(nM) 서열정보
Listeria spp. Forward primer CGT CCA AGC AGT RAG TG 175 서열번호1
Reverse primer TGA AAT CAG GAA CTT CCG TAC 175 서열번호2
Probe VIC CCA TCA CAG CTC ATG CTT CGC BHQ1 175 서열번호3
Listeria monocytogenes Forward primer TCC GGT TTY TCT GAG CTG AAA 500 서열번호4
Reverse primer TCG TCA TRC CTA GRC ARG C 500 서열번호5
Probe FAM CGC ATA MGC AAT TCT YGT CGC RAC TTG BHQ1 75 서열번호6
[실험예 1 : 상기 실시예 1에서 제작한 리스테리아 속 균주와 리스테리아 모노사이토제니스의 동시 구분 검출용 프라이머 세트를 포함하는 리얼-타임 PCR kit의 특이도 검증 실험]
일반적으로 프라이머의 길이가 짧은 경우, 낮은 특이도로 인해 비특이적 증폭이 일어날 수 있으므로 이를 검증하는 것이 매우 중요하다. 본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제작한 리스테리아 속 균주와 리스테리아 모노사이토제니스의 동시 구분 검출용 프라이머 세트를 포함하여 리얼-타임(Real-time) PCR을 진행할 시, 대상 균주만 특이적으로 증폭하는지의 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 리얼-타임 PCR reaction mixture에 대해서는 하기 표 2에 나타냈다.
Target Primer & Probe Con.(nM) Stock 농도
(μM)		 Volume(㎕) 서열정보
Listeria spp. Forward primer 175 100 0.035 서열번호1
Reverse primer 175 100 0.035 서열번호2
Probe 175 100 0.035 서열번호3
Listeria monocytogenes Forward primer 500 100 0.1 서열번호4
Reverse primer 500 100 0.1 서열번호5
Probe 75 100 0.015 서열번호6
qRT-PCR Mix (with Rox dye)* 10.3
Molecular water 6.38
Total 17
*Biofact 사 qPCR mix를 사용함.
리얼-타임 PCR은 50℃에서 2분, 95℃에서 10분 후, 95℃ 15초, 60℃에서 1분으로 구성된 사이클을 40회 반복하였으며, 사용된 기기는 Thermo Fisher Scientific 사의 AB7500 Real-time PCR Instrument System을 이용하였다.
증폭 정도는 표적 유전자의 역치 주기수(Ct value)를 확인하여 예측할 수 있는데, Ct value가 10~35 사이일 때 검출이 되었다고 판단할 수 있다. 그 결과, 하기 표 3 및 도 1과 같이 리스테리아 속 균주들만 특이적으로 증폭하는 것을 확인하였고, 그 중에서도 리스테리아 모노사이토 제니스의 검출결과는 두 개의 탐침에 해당하는 형광이 나타남에 따라 이들을 구분 검출할 수 있음을 확인하였다.
Strain/균주번호 Ct value
 Strain/균주번호 Ct value
Listeria spp. Listeria monocytogenes Listeria spp. Listeria monocytogenes
Listeria monocytogenes ATCC 19115 16.4 17.88 EHEC ATCC 43895 ND* ND*
Listeria grayi ATCC 25401 15.51 ND* Vibrio vulnificus CMCP6 ND* ND*
Listeria innocua ATCC 33090 16.28 ND* Vibrio Cholerae NCCP 14552 ND* ND*
Listeria marthii ATCC BAA-1595 15.2 ND* Vibrio
parahaemolyticus 		KCTC 2471 ND* ND*
Listeria rocourtiae KCTC 13856 16.69 ND* Salmonella typhimurium ATCC 43971 ND* ND*
Listeria welshimeri ATCC 35897 15.45 ND* Cronobacter sakazakii ATCC 29544 ND* ND*
Listeria seeligeri ATCC 35967 15.91 ND* Yersinia enterocolitica KCCM 41657 ND* ND*
Listeria ivanovii ATCC 19119 15.8 ND* Campylobacter jejuni NCTC 11168 ND* ND*
EIEC NCCP 15663 ND* ND* Campylobacter coli NCTC 15663 ND* ND*
ETEC NCCP 15732 ND* ND* Clostridium perfringens NCCP 15911 ND* ND*
EPEC NCCP 15661 ND* ND* Shigella boydii KCTC 22528 ND* ND*
EAEC NCCP 14039 ND* ND* Shigella sonnnei KCTC 22530 ND* ND*
ND* : Non-Detected
[실험예 2 : 상기 실시예 1에서 제작한 리스테리아 속 균주와 리스테리아 모노사이토제니스의 동시 구분 검출용 프라이머 세트를 포함하는 리얼-타임 PCR kit의 최소 검출한계 검증 실험]
본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제작한 리스테리아 속 균주와 리스테리아 모노사이토제니스의 동시 구분 검출용 프라이머 세트를 포함하여 리얼-타임(Real-time) PCR을 진행할 시, 최소 검출 가능한 균수를 측정하는 검증 실험을 수행하였다. 균주를 배양하여 DNA 추출후, 십진 희석하여 Real-time PCR을 수행하였다. 사용한 기기는 Thermo Fisher Scientific 사의 AB7500 Real-time PCR Instrument System을 이용하였다.
그 결과, 도 2와 같이 1 log CFU/㎕ 농도 수준으로 낮은 농도까지 리스테리아 속 균주와 리스테리아 모노사이토제니스를 동시 구분 검출할 수 있다는 것이 검증되었다.

Claims (5)

  1. 서열번호 1에 기재된 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 2에 기재된 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 리스테리아 속(Listeria spp.) 균주의 검출을 위한 프라이머 세트 (a) 및;
    서열번호 4에 기재된 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 5에 기재된 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)의 검출을 위한 프라이머 세트 (b);를 포함하는 것을 특징으로 하는 리스테리아 속(Listeria spp.) 균주 및 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)의 동시 검출을 위한 멀티플렉스 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 프라이머 세트 (a)는,
    서열번호 3에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)을 더 포함하는 것을 특징으로 하고,
    상기 프라이머 세트 (b)는,
    서열번호 6에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 리스테리아 속(Listeria spp.) 균주 및 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)의 동시 검출을 위한 멀티플렉스 프라이머 세트.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 서열번호 3에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)은,
    5'말단 및 3'말단에 형광염료가 태깅(tagging)되어 있는 것을 특징으로 하고,
    상기 서열번호 6에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)은,
    5'말단 및 3'말단에 형광염료가 태깅(tagging)되어 있는 것을 특징으로 하는 리스테리아 속(Listeria spp.) 균주 및 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)의 동시 검출을 위한 멀티플렉스 프라이머 세트.
  4. 제1항 내지 제3항 중 선택되는 어느 하나 항의 멀티플렉스 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)용 키트.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)은,
    실시간중합효소연쇄반응 (real-time PCR)인 것을 특징으로 하는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)용 키트.
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