WO2023219188A1 - 아세토젠 균주의 생장 및 대사 속도 증대를 위한 배양 배지 조성물 및 이를 이용한 아세토젠 균주의 배양방법 - Google Patents

아세토젠 균주의 생장 및 대사 속도 증대를 위한 배양 배지 조성물 및 이를 이용한 아세토젠 균주의 배양방법 Download PDF

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김지연
장인섭
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장누리
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the present invention relates to a culture medium composition for increasing the growth and metabolic rate of acetogen strains and a method for cultivating acetogen strains using the same, and more specifically, to the solubility of acetogens for the production of intermediate products of the Wood-Jungdahl pathway. It relates to a culture medium composition that allows the growth and metabolic rate of acetogen to increase by adding C1 compounds such as methanol, which is a substrate, and a method of cultivating acetogen strains using the same.
  • Syngas a representative alternative energy source, can be produced through the process of reforming natural gas or gasifying solid raw materials such as coal, organic waste, and biomass.
  • This synthesis gas has the following advantages as an alternative energy source.
  • the main components are hydrogen and carbon, it can be converted into various high value-added products such as acetic acid, butyric acid, ethanol, and butanol, making it highly usable and economical.
  • acetogen is characterized by fixing C1 gases such as carbon monoxide and carbon dioxide into acetyl-CoA through the Wood-Ljungdhal metabolic cycle and converting it into organic acids such as acetic acid to obtain energy necessary for cell growth power. .
  • Patent Document 1 Republic of Korea Patent Publication No. 10-2017-0076822
  • the technical problem to be achieved by the present invention is to solve the problems of the prior art described above.
  • By improving the low gas substrate consumption efficiency of acetogen strains it is possible to increase the efficiency of the overall bioconversion process by increasing the growth and metabolic rate of the strain.
  • an embodiment of the present invention provides a culture medium composition for increasing the growth and metabolic rate of acetogen strains.
  • the culture medium composition for increasing the growth and metabolic rate of the acetogen strain may be characterized by containing a C1 compound.
  • the C1 compound may be characterized in that it contains at least one selected from the group consisting of methanol, formic acid, and formaldehyde.
  • the C1 compound may be methanol.
  • the methanol may be contained at a concentration of more than 0 and less than or equal to 1.5M compared to the entire medium composition.
  • the acetogen strain may be characterized as including an acetogen strain capable of magnetizing methanol.
  • the acetogen strains include Eubacterium limosum, Clostridium autoethanogenum , Clostridium ljungdahlii , Clostridium carboxidivorans, and Clostridium carboxidivorans . Clostridium ragsdalei, Sporomusa ovata , Acetobacterium woodii , Acetobacterium dehalogenans , and Moorella thermoacetica . It may be characterized by comprising one or more selected from the group containing.
  • the increase in metabolic rate may be achieved through an increase in the gas substrate consumption rate of the acetogen strain.
  • the gas substrate may be characterized as containing any one or more of H 2 gas, CO gas, and CO 2 gas.
  • another embodiment of the present invention provides a culture method for increasing the growth and metabolic rate of acetogen strains.
  • the culture method for increasing the growth and metabolic rate of the acetogen strain includes a medium injection step of injecting an acetogen strain culture medium composition containing a C1 compound into the bioreactor; A strain inoculation step of inoculating the culture medium composition with an acetogen strain; and a bioreactor driving step of cultivating the acetogen strain by driving the bioreactor.
  • the C1 compound may be methanol.
  • the gas substrate consumption rate of the acetogen strain is increased, thereby increasing the growth of the acetogen strain. And it has the effect of providing a culture medium composition for increasing the growth and metabolic rate of acetogen strains that can improve the efficiency of the bioconversion process by increasing the overall metabolic rate.
  • Figure 1 is a diagram comparing the mta operon of Eubacterium rimosum strains and Acetobacterium woody.
  • Figure 2 is a diagram illustrating the Ud-Jjungdahl metabolic cycle of the Eubacterium limosum strain and the estimated path through which the Eubacterium limosum strain uses methanol in the metabolic circuit.
  • Figure 3 is a table showing metabolic changes in Eubacterium rimosum strains according to Comparative Examples 1 and 2 and Example 1 of the present invention by measuring protein expression.
  • Figure 4 is a graph showing the growth rate, substrate (CO, H 2 ) consumption rate and product concentration of Eubacterium limosum strains according to Comparative Examples 1 and 2 and Examples 2 and 3 of the present invention measured over time. .
  • Figure 5 shows the growth rate, substrate (CO, H 2 , CO 2 ) consumption rate, methanol concentration, and product concentration of Eubacterium limosum strains according to Comparative Example 3 and Examples 4 and 5 of the present invention measured over time. This is the graph shown.
  • a culture medium composition for increasing the growth and metabolic rate of acetogen strains according to an embodiment of the present invention is described.
  • the culture medium composition for increasing the growth and metabolic rate of the acetogen strain may be characterized by containing a C1 compound.
  • the C1 compound may be characterized in that it contains at least one selected from the group consisting of methanol, formic acid, and formaldehyde.
  • the synthesis gas bioconversion process using acetogen is directly affected by the growth rate and gas consumption rate of microorganisms, so the problem is that it has a relatively low reaction rate and production efficiency compared to the existing chemical conversion process.
  • synthetic gas was used as a raw material, there was a problem that the growth and metabolism rates of microorganisms were slower due to the low solubility of the synthetic gas components.
  • the inventors of the present invention added to the culture medium a C1 soluble compound capable of converting acetogen into an intermediate product of the Ud-Jungdahl metabolic cycle in which acetogen fixes gaseous substrates such as carbon monoxide and carbon dioxide into acetyl-CoA, thereby promoting metabolism.
  • a culture medium composition that makes it possible to increase the overall metabolism by increasing the concentration of intermediate products.
  • the C1 soluble compound may be methanol.
  • the methanol is suitable as an additive for increasing strain growth and metabolism in terms of cost and the fact that it does not have a negative effect on strain growth when added to the strain culture medium.
  • the acetogen strain may be characterized as including an acetogen strain capable of magnetizing the methanol.
  • some acetogens can metabolize methanol by methanol hydrocarbonase or methyltransferase, and some use a metal transfer system to utilize methanol.
  • Such acetogen strains capable of magnetizing methanol include, for example, Eubacterium limosum , Clostridium autoethanogenum , Clostridium ljungdahlii , and Clostridium carboxydivo. Lance ( Clostridium carboxidivorans ), Clostridium ragsdalei ( Clostridium ragsdalei ), Sporomusa ovata ( Sporomusa ovata ), Acetobacterium woodii ( Acetobacterium woodii ), Acetobacterium dehalogenans ( Acetobacterium dehalogenans ), Murella thermo There is Acetica ( Moorella thermoacetica ).
  • Eubacterium limosum KIST612 is characterized by having an operon ( mta operon) encoding a methyltransferase similar to that of Acetobacterium woodii , a closely related acetogen. do.
  • Figure 1 is a diagram comparing the mta operon of Eubacterium rimosum strains and Acetobacterium woody.
  • Figure 2 is a diagram illustrating the Ud-Jjungdahl metabolic cycle of the Eubacterium limosum strain and the estimated path through which the Eubacterium limosum strain uses methanol in the metabolic circuit.
  • the Eubacterium limosum strain also has a methyltransferase capable of converting methanol into methyl-THF.
  • Eubacterium Limosum can enhance the autotrophic metabolism of the strain by converting methanol into methyl-THF, an intermediate metabolite of the Ud-Jjungdahl metabolic cycle, using the methyltransferase. You can confirm that it is.
  • the gas substrate may be characterized as including any one or more of H 2 gas, CO gas, and CO 2 gas.
  • the methanol may be contained at a concentration of more than 0 and 1.5M or less compared to the entire medium composition.
  • concentration of methanol exceeds 1.5M, growth inhibition occurs due to the addition of a high concentration of organic solvent, which is not preferable.
  • the methanol is included in a concentration of more than 0 and less than or equal to 1.5M compared to the total medium composition.
  • the gas substrate consumption rate of the acetogenic strain is increased.
  • This has the effect of providing a culture medium composition for increasing the growth and metabolic rate of acetogen strains, which can improve the efficiency of the bioconversion process by increasing the overall growth and metabolic rate of the acetogen strain.
  • the method of cultivating the acetogen strain includes a medium injection step of injecting an acetogen strain culture medium composition containing a C1 compound into the bioreactor; A strain inoculation step of inoculating the culture medium composition with an acetogen strain; and a bioreactor driving step of cultivating the acetogen strain by driving the bioreactor.
  • the C1 compound may be methanol.
  • the culture method may be characterized in that the cell concentration in a steady state (dilution rate 0.018/h) is maintained at 8.7 g/L in the presence of CO and CO 2 gas substrates without the addition of methanol.
  • the cell concentration at steady state (dilution rate 0.018/h) is maintained at 17.4 g/L in the presence of CO and CO 2 gas substrates, and the cell conversion yield is 0.008.
  • g DCW/mmol MeOH g DCW/mmol MeOH.
  • methanol may be included in the culture medium composition at a concentration of 0 to 1.5M in the medium injection step, and most preferably, it may be included at a concentration of 1.1M. .
  • the acetogen strain culture medium composition containing methanol is injected into the reactor in the medium injection step, and then the strain is inoculated in the strain inoculation step, and the bioreactor operation step It can be operated by removing part of the culture medium in the reactor at regular intervals and then replenishing the same volume of new culture medium containing methanol.
  • the concentration in the culture solution must be adjusted so that 27.16 mmol of methanol can be introduced.
  • the culture solution containing the methanol is continuously supplied to the reactor in the bioreactor operation step, and the fermentation solution in the reactor is removed at the same flow rate.
  • the acetogen strain culture medium composition containing methanol in a high concentration of 1M or more is slowly supplied at a very slow flow rate in the bioreactor operation step while minimizing water level changes in the reactor. It can be driven.
  • an acetogen strain culture method that can improve acetogen culture efficiency and product yield efficiency using an acetogen strain culture medium composition containing a C1 compound. It has the effect of providing.
  • Example 1 Culture of Eubacterium rimosum KIST612 strain by adding only methanol without a separate gas substrate
  • CBBM carbonate buffered medium
  • CBBM Vitamin solution (Final) Trace element solution
  • Components Conc. (g/L) Components Conc. (mg/L) Components Conc. (g/L) NaCl 0.9 Biotin 2.0 Nitrilotriacetic acid 1.5 MgSO 4 7H 2 O 0.32 Folic acid 2.0 FeSO 4 7H 2 O 0.1 CaCl 2 2H 2 O 0.2 Pyridoxine HCl 10.0 MnCl 2 4H 2 O 0.1 NH 4 Cl 1.0 Thiamine HCl 5.0 CoCl 2 6H 2 O 0.17 Yeast extract 2.0 Riboflavin 5.0 ZnCl 2 0.1 Vitamin solution 10mL Nicotinic acid 5.0 CaCl 2 6H 2 O 0.1 Trace element sol.
  • Example 2 Eubacterium rimosum KIST612 strain culture by adding MeOH under CO/CO 2 conditions
  • the Eubacterium limosum KIST612 strain was cultured in the same carbonate buffered medium (CBBM) as Example 1 containing 50mM methanol. At this time, CO and CO 2 were added at a ratio of 8:2.
  • CBBM carbonate buffered medium
  • Example 3 Culture of Eubacterium rimosum KIST612 strain by adding MeOH under H 2 /CO 2 conditions
  • Eubacterium limosum KIST612 strain was cultured in the same carbonate buffered medium (CBBM) as Example 1 containing 50 mM methanol using H 2 /CO 2 as an energy and electron source. At this time, H 2 and CO 2 were added at a ratio of 8:2.
  • CBBM carbonate buffered medium
  • Example 4 Culture of Eubacterium rimosum KIST612 strain by adding MeOH under H 2 /CO/CO 2 conditions
  • Eubacterium limosum KIST612 strain was cultured in the same carbonate buffered medium (CBBM) as Example 1 containing 15mM methanol using H 2 /CO/CO 2 as an energy and electron source. At this time, H 2 , CO and CO 2 were added at a ratio of 4:5:1, respectively.
  • CBBM carbonate buffered medium
  • Example 5 Culture of Eubacterium rimosum KIST612 strain by adding MeOH under H 2 /CO/CO 2 conditions
  • Example 4 the Eubacterium rimosum KIST612 strain was cultured under the same process conditions as Example 4, except that it contained 30mM of methanol.
  • Eubacterium rimosum KIST612 strain was cultured under the same process conditions as in Example 1, except that methanol was not additionally added in Example 1.
  • Eubacterium rimosum KIST612 strain was cultured under the same process conditions as in Example 2, except that methanol was not additionally added in Example 2.
  • Eubacterium rimosum KIST612 strain was cultured under the same process conditions as in Example 3, except that methanol was not additionally added in Example 3.
  • Figure 3 is a table showing metabolic changes in the KIST612 strain according to Comparative Examples 1 and 2 and Example 1 of the present invention by measuring protein expression.
  • the green part in Figure 3 represents the down-regulated protein, and the red part represents the up-regulated protein.
  • Figure 4 is a graph showing the growth rate, substrate (CO, H 2 ) consumption rate, and product concentration of the KIST612 strain according to Comparative Examples 1 and 2 and Examples 2 and 3 of the present invention measured over time.
  • KIST612 was grown for 48 hours at a growth rate of 0.03 ⁇ 0.02/h and 0.12 ⁇ 0.01/h, respectively, under CO/CO 2 conditions in Example 2 or H 2 /CO 2 conditions in Example 3. did. Under these conditions, CO or H 2 consumption rates were 2.0 ⁇ 0.2 mmol g/cell h and 3.1 ⁇ 1.5 mmol g/cell h, respectively.
  • Example 3 it can be seen that more significant changes in the physiological properties of KIST612 are observed under H 2 /CO 2 conditions.
  • the specific growth rate was observed to be 0.12 ⁇ 0.01/h and the H 2 consumption rate was observed to be 8.3 ⁇ 5.4 mmol g/cell h, which were 4.0 and 2.7 times higher than those without methanol in Comparative Example 2, respectively. Therefore, it can be confirmed that the addition of methanol can particularly improve the H 2 /CO 2 utilization rate in KIST612.
  • Figure 5 is a graph showing the growth rate, substrate (CO, H 2 , CO 2 ) consumption rate, methanol concentration, and product concentration of the KIST612 strain according to Comparative Example 3 and Examples 4 and 5 of the present invention measured over time. .

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Abstract

본 발명의 일 실시예는 아세토젠 균주의 생장 및 대사 속도 증대용 배양 배지 조성물 및 이를 이용한 아세토젠 균주 배양 방법을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 아세토젠의 우드-융달 경로의 중간 산물의 생성을 위한 가용성 기질인 메탄올 등 C1 화합물을 첨가함으로써 아세토젠의 생장 및 대사 속도 증대를 가능하게 하는 배양 배지 조성물 및 이를 이용한 아세토젠 균주의 배양방법을 제공 가능한 효과가 있다.

Description

아세토젠 균주의 생장 및 대사 속도 증대를 위한 배양 배지 조성물 및 이를 이용한 아세토젠 균주의 배양방법
본 발명은 아세토젠 균주의 생장 및 대사 속도 증대를 위한 배양 배지 조성물 및 이를 이용한 아세토젠 균주의 배양방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 아세토젠의 우드-융달 경로의 중간 산물의 생성을 위한 가용성 기질인 메탄올 등 C1 화합물을 첨가함으로써 아세토젠의 생장 및 대사 속도 증대를 가능하게 하는 배양 배지 조성물 및 이를 이용한 아세토젠 균주의 배양방법에 관한 것이다.
석유기반의 화합물의 이용으로 인한 환경문제 및 에너지 고갈 등의 문제가 갈수록 심각해지면서, 전 세계는 화석연료 사용에 따른 지구온난화 방지를 위하여 이산화탄소 발생량을 줄이는 한편 고유가에 대비하여 다양한 대체에너지 개발에 박차를 가하고 있다.
대표적인 대체에너지원인 합성가스(syngas)는, 천연가스를 리포밍(reforming)하거나, 석탄, 유기성 폐기물, 바이오매스(biomass)와 같은 고형 원료를 가스화(gasification)시키는 과정을 통해 생산될 수 있다.
이러한 합성가스는 대체에너지원으로 다음과 같은 장점을 가진다.
첫째, 합성가스는 대부분의 탄화수소로부터 전환될 수 있기 때문에 원료 고갈의 위험성이 낮으며, 화석 연료와 비교하여 가격 변동도 적어 안정적인 원료의 확보가 가능하다.
둘째, 합성가스 기반 에너지 전환의 경우 이산화탄소를 방출하는 형태가 아닌, 사용하는 형태가 되므로 이산화탄소 발생에 따른 환경 오염의 우려가 적다.
셋째, 주 성분이 수소 및 탄소이므로, 아세트산, 부티르산, 에탄올 및 부탄올 등의 다양한 고부가가치 산물의 형태로 전환될 수 있어 그 활용 가능성이 높고 경제적이다.
이러한 합성가스들은 미생물을 이용한 생물전환공정(biorefinery)을 거쳐 이용될 수 있다. 대표적으로, 아세토젠(Acetogen)으로 통칭되는 혐기성 아세트산 생성균이 이용된다. 아세토젠은 우드-융달(Wood-Ljungdhal) 대사 회로를 통해 일산화탄소, 이산화탄소와 같은 C1 가스를 아세틸-CoA로 고정하며, 이를 아세트산 등의 유기산으로 전환함으로써 세포 생장 동력에 필요한 에너지를 얻는 것을 특징으로 한다.
아세토젠을 이용한 합성가스 생물전환공정은 미생물의 생장 속도 및 가스 소비속도에 직접적인 영향을 받게 되므로, 기존의 화학전환공정과 비교하여 상대적으로 낮은 반응 속도 및 생산 효율을 가진다는 문제점이 있었다.
특히, 종래의 포도당, 과당과 같은 용존성 유기 물질을 기반으로 한 발효 기술과 달리 기체상 기질인 합성 가스를 이용한 생물 공정 운전시에는 상기 합성 가스가 미생물의 배양 조건인 수성 상에서 용해도가 매우 낮기 때문에 미생물의 생장 및 대사 속도가 더욱 느리다는 문제점이 있었다.
따라서, 생물전환공정의 효율 향상을 통한 공정 성능 증대, 및 더 나아가 경제성 있는 공정 시스템 개발을 위하여 아세토젠의 생장 및 생산성을 향상하는 것이 매우 중요하며 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
<선행기술문헌>
(특허문헌 1) 대한민국 공개특허 제10-2017-0076822호
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 아세토젠 균주의 낮은 가스 기질 소비 효율을 개선하여 균주의 생장 및 대사 속도 증대를 통한 전체 생물 전환 공정 효율 증대를 가능하게 하는 균주 배양 배지 조성물 및 이를 이용한 아세토젠 균주 배양 방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예는 아세토젠 균주의 생장 및 대사 속도 증대용 배양 배지 조성물을 제공한다.
상기 아세토젠 균주의 생장 및 대사 속도 증대용 배양 배지 조성물은, C1 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 C1 화합물은, 메탄올, 포름산 및 포름알데히드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 C1 화합물은, 메탄올인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 메탄올은, 전체 배지 조성물 대비 0 초과 1.5M 이하의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 아세토젠 균주는, 메탄올을 자화 가능한 아세토젠 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 아세토젠 균주는, 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum), 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 융달리(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 카르복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 스포로무사 오바타(Sporomusa ovata), 아세토박테리움 우디(Acetobacterium woodii), 아세토박테리움 디할로게난스(Acetobacterium dehalogenans), 무렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica)를 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 대사 속도 증대는, 상기 아세토젠 균주의 가스 기질 소비 속도 증대를 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 가스 기질은, H2 가스, CO 가스 및 CO2 가스 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 실시예는 아세토젠 균주의 생장 및 대사 속도 증대를 위한 배양방법을 제공한다.
상기 아세토젠 균주의 생장 및 대사 속도 증대를 위한 배양방법은, C1 화합물을 포함하는 아세토젠 균주 배양 배지 조성물을 생물 반응기 내부에 주입하는 배지 주입 단계; 상기 배양 배지 조성물에 아세토젠 균주를 접종하는 균주 접종 단계; 및 상기 생물 반응기를 구동시켜 상기 아세토젠 균주를 배양하는 생물 반응기 구동 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 C1 화합물은, 메탄올인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 우드-융달 대사 회로의 중간 산물로 전환 가능한 가용성 기질인 C1 화합물을 배양 배지에 첨가함으로써, 아세토젠 균주의 가스 기질 소비 속도가 증대되어, 이에 따라 아세토젠 균주의 생장 및 대사 속도가 전체적으로 증대됨으로써 생물 전환 공정의 효율 향상이 가능한 아세토젠 균주의 생장 및 대사 속도 증대용 배양 배지 조성물을 제공 가능한 효과가 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, C1 화합물을 포함하는 아세토젠 균주 배양 배지 조성물을 이용하여 아세토젠 배양 효율 및 생산물 수득 효율을 향상시킬 수 있는 아세토젠 균주 배양 방법을 제공할 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 유박테리움 리모숨 균주와 아세토박테리움 우디의 mta 오페론을 비교하여 나타낸 도면이다.
도 2는 유박테리움 리모숨 균주의 우드-융달 대사 회로 및 상기 대사 회로에서 유박테리움 리모숨 균주가 메탄올을 사용하는 경로를 추정하여 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 비교예 1, 2 및 실시예 1에 따른 유박테리움 리모숨 균주의 대사 변화를 단백질 발현을 측정하여 나타낸 표이다.
도 4는 본 발명의 비교예 1, 2 및 실시예 2, 3에 따른 유박테리움 리모숨 균주의 성장 속도, 기질(CO, H2) 소비 속도 및 산물 농도를 시간에 따라 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 비교예 3 및 실시예 4, 5에 따른 유박테리움 리모숨 균주의 성장 속도, 기질(CO, H2, CO2) 소비 속도, 메탄올 농도 및 산물 농도를 시간에 따라 측정하여 나타낸 그래프이다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결(접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
이하 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 아세토젠 균주의 생장 및 대사 속도 증대용 배양 배지 조성물을 설명한다.
상기 아세토젠 균주의 생장 및 대사 속도 증대용 배양 배지 조성물은, C1 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
이때, 상기 C1 화합물은, 메탄올, 포름산 및 포름알데히드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
전술한 바와 같이, 아세토젠을 이용한 합성가스 생물전환공정은 미생물의 생장 속도 및 가스 소비속도에 직접적인 영향을 받게 되므로, 기존의 화학전환공정과 비교하여 상대적으로 낮은 반응 속도 및 생산 효율을 가진다는 문제점이 있었으며, 특히, 합성 가스를 원료로 이용하는 경우 합성 가스 성분의 낮은 용해도로 인하여 미생물의 생장 및 대사 속도가 더욱 느리다는 문제점이 있었다.
이에 착안하여, 본 발명의 발명자들은, 아세토젠이 일산화탄소, 이산화탄소와 같은 가스 기질을 아세틸-CoA로 고정하는 우드-융달 대사 회로의 중간 산물로 전환이 가능한 C1 용해성 화합물을 배양 배지에 첨가함으로써, 대사 중간 산물의 농도를 증가시킴으로써 전체 대사를 증대시키는 것을 가능하게 하는 배양 배지 조성물을 발명하기에 이르렀다.
특히, 가장 바람직하게는, 상기 C1 용해성 화합물은 메탄올인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 메탄올은, 균주 배양 배지에 첨가되었을 때 균주 생장에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 점 및 비용적인 측면에서도 균주 생장 증대 및 대사 증대를 위한 첨가물로 적합하다.
이때, 상기 아세토젠 균주는, 상기 메탄올을 자화 가능한 아세토젠 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
여러 아세토젠 균주 중 일부 아세토젠은 메탄올 탄수소효소 또는 메틸 전이 효소에 의해 메탄올을 대사할 수 있으며, 일부는 메탄올 이용을 위하여 메탈 전달 시스템을 사용한다.
이러한 메탄올을 자화 가능한 아세토젠 균주는, 예를 들어 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum), 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 융달리(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 카르복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 스포로무사 오바타(Sporomusa ovata), 아세토박테리움 우디(Acetobacterium woodii), 아세토박테리움 디할로게난스(Acetobacterium dehalogenans), 무렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica)가 있다.
특히, 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum) KIST612는, 근연관계에 있는 아세토젠인 아세토박테리움 우디(Acetobacterium woodii)와 유사한 메틸 전이 효소(methyltransferase)를 코딩하는 오페론(mta 오페론)을 갖는 것을 특징으로 한다.
도 1은 유박테리움 리모숨 균주와 아세토박테리움 우디의 mta 오페론을 비교하여 나타낸 도면이다.
도 2는 유박테리움 리모숨 균주의 우드-융달 대사 회로 및 상기 대사 회로에서 유박테리움 리모숨 균주가 메탄올을 사용하는 경로를 추정하여 나타낸 도면이다.
도 1을 참조하면, 아세토박테리움 우디와 유사하게 유박테리움 리모숨 균주 또한 메탄올을 메틸-THF로 전환 가능한 메틸 전이 효소를 갖는다는 것을 확인할 수 있다.
도 2를 참조하면, 유박테리움 리모숨은, 상기 메틸 전이 효소를 이용하여 메탄올을 우드-융달 대사 회로의 중간 대사 산물인 메틸-THF로 전환함으로써 균주의 오토트로픽(autotrophic) 대사를 증진시킬 수 있을 것임을 확인할 수 있다.
이때, 상기 가스 기질은, H2 가스, CO 가스 및 CO2 가스 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 메탄올은, 전체 배지 내 0.008g DCW/mmol MeOH 이상을 만족시킬 수 있는 메탄올 농도가 확보되는 것이 바람직하다.
이때, 상기 메탄올은, 전체 배지 조성물 대비 0 초과 1.5M 이하 의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 메탄올의 농도가 1.5M 초과이면, 고농도의 유기용매 첨가로 인한 생장 저해가 발생하므로 바람직하지 않다.
따라서, 상기 메탄올은 전체 배지 조성물 대비 0 초과 1.5M 이하의 농도로 포함되는 것이 바람직하다.
상기와 같은 구성의 특징으로 인하여, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 우드-융달 대사 회로의 중간 산물로 전환 가능한 가용성 기질인 C1 화합물을 배양 배지에 첨가함으로써, 아세토젠 균주의 가스 기질 소비 속도가 증대되어, 이에 따라 아세토젠 균주의 생장 및 대사 속도가 전체적으로 증대됨으로써 생물 전환 공정의 효율 향상이 가능한 아세토젠 균주의 생장 및 대사 속도 증대용 배양 배지 조성물을 제공 가능한 효과가 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 아세토젠 균주의 배양 방법을 설명한다.
상기 아세토젠 균주의 배양 방법은, C1 화합물을 포함하는 아세토젠 균주 배양 배지 조성물을 생물 반응기 내부에 주입하는 배지 주입 단계; 상기 배양 배지 조성물에 아세토젠 균주를 접종하는 균주 접종 단계; 및 상기 생물 반응기를 구동시켜 상기 아세토젠 균주를 배양하는 생물 반응기 구동 단계;를 포함하는 것일 수 있다.
이때, 상기 C1 화합물은, 메탄올인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 배양 방법, 상기 메탄올의 추가 없이 CO, CO2 가스 기질 존재 조건에서 정상 상태(희석률 0.018/h)의 균체 농도는 8.7g/L로 유지되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
이하 기술하는 조건에서 상기 배양 방법은, 상기 메탄올을 추가하는 경우 CO, CO2 가스 기질 존재 조건에서 정상 상태(희석률 0.018/h)의 균체 농도가 17.4g/L로 유지되고 균체 전환 수율은 0.008g DCW/mmol MeOH 인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 배양 방법으로 아세토젠 균주를 회분 배양 하는 경우, 상기 배지 주입 단계에서 상기 메탄올은 상기 배양 배지 조성물 중 0 내지 1.5M의 농도로 포함될 수 있으며, 가장 바람직하게는, 1.1M의 농도로 포함될 수 있다.
상기 배양 방법으로 아세토젠 균주를 반 회분 배양 하는 경우, 상기 배지 주입 단계에서 메탄올을 포함하는 아세토젠 균주 배양 배지 조성물을 반응기 내부에 주입한 후, 균주 접종 단계에서 균주를 접종하고, 생물 반응기 구동 단계에서 일정 시간마다 반응기 내 배양액 일부를 제거한 뒤 메탄올을 포함하는 신규 배양액을 동일 부피만큼 보충하는 방식으로 운전될 수 있다.
이때, 상기 반응기 내 배양액 제거율을 10%로 가정하였을 때, 27.16mmol의 메탄올이 투입될 수 있도록 배양액 내 농도가 조절되어야 한다.
상기 배양 방법으로 아세토젠 균주를 연속 희석식으로 배양하는 경우, 상기 생물 반응기 구동 단계에서 상기 메탄올이 포함된 배양액을 반응기에 연속적으로 공급하고, 반응기 내 발효액을 동일 유량으로 제거하는 방식으로 운전될 수 있다.
이때, 0.018/h의 희석율 상태 가정 시 19.56mmol MeOH/L/hr의 메탄올이 제공되는 방식으로 운전될 수 있다.
상기 배양 방법으로 아세토젠 균주를 유가식으로 배양하는 경우, 상기 생물 반응기 구동 단계에서 메탄올이 1M 이상 고농축으로 포함된 아세토젠 균주 배양 배지 조성물을 매우 느린 유량으로 천천히 공급하여 반응기 내 수위 변화를 최소화 하면서 운전될 수 있다.
상기와 같은 구성의 특징으로 인하여, 본 발명의 일 실시예에 따르면, C1 화합물을 포함하는 아세토젠 균주 배양 배지 조성물을 이용하여 아세토젠 배양 효율 및 생산물 수득 효율을 향상시킬 수 있는 아세토젠 균주 배양 방법을 제공할 수 있는 효과가 있다.
이하에서는 제조예, 비교예 및 실험예를 통해 본 발명에 대해 더욱 상세하게 설명한다. 하지만 본 발명이 하기 제조예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 별도의 가스 기질 없이 메탄올만 첨가하여 유박테리움 리모숨 KIST612 균주 배양
유박테리움 리모숨 KIST612 균주를 50mM 메탄올이 함유된 탄산 완충 배지(CBBM)에서 배양하였다. 이때, 상기 CBBM은 하기 표 1의 조성으로 구성되었다.
CBBM Vitamin solution (Final) Trace element solution
Components Conc. (g/L) Components Conc. (mg/L) Components Conc. (g/L)
NaCl 0.9 Biotin 2.0 Nitrilotriacetic acid 1.5
MgSO4 7H2O 0.32 Folic acid 2.0 FeSO4 7H2O 0.1
CaCl2 2H2O 0.2 Pyridoxine HCl 10.0 MnCl2 4H2O 0.1
NH4Cl 1.0 Thiamine HCl 5.0 CoCl2 6H2O 0.17
Yeast extract 2.0 Riboflavin 5.0 ZnCl2 0.1
Vitamin solution 10mL Nicotinic acid 5.0 CaCl2 6H2O 0.1
Trace element sol. 10mL Pantothenic acid 5.0 CuCl2 2H2O 0.02
Sodium bicarbonate 2.1 Cyanocobalamine 0.1 H3BO3 0.01
1 M K2HPO4 10mL r-aminobenzoic acid 5.0 Na2MoO4 0.01
L-cysteine HCl 0.5 Lipoic acid 5.0 Na2SeO3 0.017
0.1% (w/v) resazurin 200μl NiSO4 6H2O 0.026
CH3OH 0-50mM NaCl 1.0
<실시예 2> CO/CO2 조건에서 MeOH 첨가하여 유박테리움 리모숨 KIST612 균주 배양
CO/CO2를 에너지 및 전자원으로 사용하여 유박테리움 리모숨 KIST612 균주를 50mM 메탄올이 함유된 상기 실시예 1과 동일한 탄산 완충 배지(CBBM)에서 배양하였다. 이때, 상기 CO 및 CO2는 8:2의 비율로 첨가되었다.
<실시예 3> H2/CO2 조건에서 MeOH 첨가하여 유박테리움 리모숨 KIST612 균주 배양
H2/CO2를 에너지 및 전자원으로 사용하여 유박테리움 리모숨 KIST612 균주를 50 mM 메탄올이 함유된 상기 실시예 1과 동일한 탄산 완충 배지(CBBM)에서 배양하였다. 이때, 상기 H2 및 CO2는 8:2의 비율로 첨가되었다.
<실시예 4> H2/CO/CO2 조건에서 MeOH 첨가하여 유박테리움 리모숨 KIST612균주 배양
H2/CO/CO2를 에너지 및 전자원으로 사용하여 유박테리움 리모숨 KIST612 균주를 15mM 메탄올이 함유된 상기 실시예 1과 동일한 탄산 완충 배지(CBBM)에서 배양하였다. 이때, 상기 H2, CO 및 CO2는 각각 4:5:1의 비율로 첨가되었다.
<실시예 5> H2/CO/CO2 조건에서 MeOH 첨가하여 유박테리움 리모숨 KIST612균주 배양
상기 실시예 4에서, 메탄올을 30mM 함유하도록 한 것을 제외하고는 상기 실시예 4와 동일한 공정 조건으로 유박테리움 리모숨 KIST612 균주를 배양하였다.
<비교예 1> CO/CO2 조건에서 MeOH 미첨가하여 유박테리움 리모숨 KIST612균주 배양
상기 실시예 1에서 메탄올을 추가로 첨가하지 않은 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 공정 조건으로 유박테리움 리모숨 KIST612 균주를 배양하였다.
<비교예 2> H2/CO2 조건에서 MeOH 미첨가하여 유박테리움 리모숨 KIST612균주 배양
상기 실시예 2에서 메탄올을 추가로 첨가하지 않은 것을 제외하고는 상기 실시예 2와 동일한 공정 조건으로 유박테리움 리모숨 KIST612 균주를 배양하였다.
<비교예 3> H2/CO/CO2 조건에서 MeOH 미첨가하여 유박테리움 리모숨 KIST612균주 배양
상기 실시예 3에서 메탄올을 추가로 첨가하지 않은 것을 제외하고는 상기 실시예 3과 동일한 공정 조건으로 유박테리움 리모숨 KIST612 균주를 배양하였다.
<실험예 1> CO/CO2 또는 H2/CO2 조건 하에서 메탄올 첨가에 의한 아세토젠 균주의 대사 변화 분석 실험
상기 비교예 1 및 2, 실시예 1 내지 3에서 배양한 KIST612 균주의 대사 변화, 성장 속도, 기질(CO, H2) 소비 속도, 산물 농도 및 산물 생산 속도를 측정하는 실험을 진행하였다.
도 3은 본 발명의 비교예 1, 2 및 실시예 1에 따른 KIST612 균주의 대사 변화를 단백질 발현을 측정하여 나타낸 표이다.
도 3의 녹색 부분은 하향 조절된 단백질, 빨간색 부분은 상향 조절된 단백질을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 비교예 1, 2 및 실시예 2, 3에 따른 KIST612 균주의 성장 속도, 기질(CO, H2) 소비 속도 및 산물 농도를 시간에 따라 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3 및 도 4를 참조하면, KIST612는 실시예 2의 CO/CO2 또는 실시예 3의 H2/CO2 조건에서 각각 0.03±0.02/h 및 0.12±0.01/h의 성장률로 48시간 동안 성장하였다. 이러한 조건에서, CO 또는 H2 소비율은 각각 2.0±0.2mmol g/cell h 및 3.1±1.5mmol g/cell h이었다.
실시예 3을 참조하면, KIST612의 생리적 특성은 H2/CO2 조건 하에서 더욱 현저한 변화가 관찰되는 것을 확인할 수 있다. 실시예 3의 메탄올 존재 하에서 비 성장률은 0.12±0.01/h, H2 소비율은 8.3±5.4 mmol g/cell h로 관찰되었는데, 이는 비교예 2의 메탄올이 없는 경우보다 각각 4.0배 및 2.7배 높았다. 따라서, 메탄올의 첨가가 KIST612에서 특히 H2/CO2 이용률을 향상시킬 수 있음을 확인할 수 있다.
<실험예 2> CO/H2/CO2 조건 하에서 메탄올 첨가에 의한 아세토젠 균주의 기질 소비 및 대사 변화 분석 실험
상기 비교예 3 및 실시예 4, 5에서 배양한 KIST612균주의 성장 속도, 기질(CO, H2, CO2) 소비 속도, 산물 농도 및 산물 생산 속도를 측정하는 실험을 진행하였다.
도 5는 본 발명의 비교예 3 및 실시예 4, 5에 따른 KIST612균주의 성장 속도, 기질(CO, H2, CO2) 소비 속도, 메탄올 농도 및 산물 농도를 시간에 따라 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5를 참조하면, 메탄올이 첨가된 실시예 4, 5에서 균체의 성장 속도가 더욱 빠르게 나타났으며, 특히 H2가 비교예 3보다 더욱 빠르게 소비된 것을 확인할 수 있다. 뿐만 아니라, 메탄올 존재 하에서 산물 생산 속도 또한 증대된 것을 확인할 수 있다. 특히, 메탄올 농도가 급격히 감소한 부분은 가스 기질과 달리 균주의 성장 조건만 알맞게 조절되면 균주가 매우 쉽게 메탄올을 사용할 수 있다는 것을 암시한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (11)

  1. C1 화합물을 포함하는, 아세토젠 균주의 생장 및 대사 속도 증대용 배양 배지 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 C1 화합물은, 포름산 및 포름알데히드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 아세토젠 균주의 생장 및 대사 속도 증대용 배양 배지 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 C1 화합물은, 메탄올인 것을 특징으로 하는 아세토젠 균주의 생장 및 대사 속도 증대용 배양 배지 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 메탄올은, 전체 배지 조성물 대비 0 초과 1.5M 이하의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 아세토젠 균주의 생장 및 대사 속도 증대용 배양 배지 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 아세토젠 균주는, 메탄올을 자화 가능한 아세토젠 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 아세토젠 균주의 생장 및 대사 속도 증대용 배양 배지 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 아세토젠 균주는, 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum), 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 리융달리(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리듐 카르복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 스포로무사 오바타(Sporomusa ovata), 아세토박테리움 우디(Acetobacterium woodii), 아세토박테리움 디할로게난스(Acetobacterium dehalogenans), 무렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica)를 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 아세토젠 균주의 생장 및 대사 속도 증대용 배양 배지 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 대사 속도 증대는, 상기 아세토젠 균주의 가스 기질 소비 속도 증대를 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 아세토젠 균주의 생장 및 대사 속도 증대용 배양 배지 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 가스 기질은, H2 가스, CO 가스 및 CO2 가스 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 아세토젠 균주의 생장 및 대사 속도 증대용 배양 배지 조성물.
  9. C1 화합물을 포함하는 아세토젠 균주 배양 배지 조성물을 생물 반응기 내부에 주입하는 배지 주입 단계;
    상기 배양 배지 조성물에 아세토젠 균주를 접종하는 균주 접종 단계; 및
    상기 생물 반응기를 구동시켜 상기 아세토젠 균주를 배양하는 생물 반응기 구동 단계;를 포함하는 아세토젠 균주의 배양 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 C1 화합물은, 포름산 및 포름알데히드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 아세토젠 균주의 배양 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 C1 화합물은, 메탄올인 것을 특징으로 하는 아세토젠 균주 배양 방법.
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