WO2023217839A1 - Procede d'analyse de la viabilite de cellules animales par mesure electrochimique - Google Patents

Procede d'analyse de la viabilite de cellules animales par mesure electrochimique Download PDF

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WO2023217839A1
WO2023217839A1 PCT/EP2023/062379 EP2023062379W WO2023217839A1 WO 2023217839 A1 WO2023217839 A1 WO 2023217839A1 EP 2023062379 W EP2023062379 W EP 2023062379W WO 2023217839 A1 WO2023217839 A1 WO 2023217839A1
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WO
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cells
cell
mediator
sample
viability
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Application number
PCT/EP2023/062379
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English (en)
Inventor
Simon GUETTE-MARQUET
Christine ROQUES
Alain Bergel
Original Assignee
Institut National Polytechnique De Toulouse
Centre National De La Recherche Scientifique
Universite Toulouse Iii-Paul Sabatier
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National Polytechnique De Toulouse, Centre National De La Recherche Scientifique, Universite Toulouse Iii-Paul Sabatier filed Critical Institut National Polytechnique De Toulouse
Publication of WO2023217839A1 publication Critical patent/WO2023217839A1/fr

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48735—Investigating suspensions of cells, e.g. measuring microbe concentration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability

Definitions

  • TITLE METHOD FOR ANALYZING THE VIABILITY OF ANIMAL CELLS BY ELECTROCHEMICAL MEASUREMENT
  • the present invention relates to the analysis of cell viability by electrochemistry, in particular by analysis of electron transfer activity.
  • Eukaryotic cells in particular animal cells, notably human cells, can transfer electrons to the extracellular compartment, that is to say transfer intracellular electrons to the extracellular environment through the plasma membrane.
  • This electron transfer mechanism is commonly called tPMET for “trans-Plasma Membrane Electron Transport”.
  • tPMET Trans-Plasma Membrane Electron Transport
  • tPMETs were demonstrated in the 1960s by showing that cells are capable of reducing dyes that are incapable of penetrating inside cells.
  • the effects of redox compounds on cells were observed long before the discovery of tPMETs.
  • dyes can be reduced by tissue explants, and then that plasma membranes are impermeable to these dyes.
  • tPMETs are involved in a wide variety of physiological and pathological cellular processes. By oxidizing intracellular NADH/NADPH, tPMETs adjust the redox state within the cell and control the NAD NADH and NADP NADPH ratios. These two ratios are major elements in the control of cellular metabolism. The simplicity of tPMET mechanisms allows rapid regeneration of NAD(P) + ; in a few seconds the entire intracellular pool of NAD(P)H can be re-oxidized.
  • tPMETs also appear to be associated with the regulation of cell proliferation. They are involved in the entry of nutrients into cells and the uptake of iron. Under physiological conditions, tPMETs are involved in the body's defense against attacks by pathogens, for example. Electrons captured from the cytoplasm are used to generate toxic oxidizing compounds like hydrogen peroxide.
  • tPMETs are further implicated in various pathological processes.
  • tPMETs appear to play a major role in terms of altered/increased metabolic activity. In particular, they contribute to the rapid re-oxidation of NADH generated by glycolysis and allow cells to grow in the absence of oxygen.
  • oncogenes such as N-myc
  • tPMET activity is commonly assessed spectrophotometrically by monitoring the appearance or disappearance of color associated with dye reduction. Due to the coupling between tPMET and mitochondrial activity, this method is routinely used to assess cell viability.
  • the main dyes used are XTT and MTT.
  • the detection kit marketed by ATCC XTT Cell proliferation Asasy Kit
  • PMS phenazine methosulfate
  • concentration of the reduced form is measured spectrophotometrically. It is therefore a final measurement which is made after the reduced form of the redox mediator has accumulated in solution.
  • EP 1 199 560 describes an electrochemical method for determining the number of cells and the activity of biological systems.
  • the process involves the application of a gelling substance in the counter electrode used as a reaction vessel, and the introduction of the biological system, previously suspended in a liquid phase, into the reaction vessel, so that said biological system is immobilized with the redox mediator within the gelling substance.
  • the method only measures intensity and there is no mention of applying a controlled potential (fixed or variable) to the working electrode.
  • the method according to EP 1 199 560 applies the biological system to be evaluated on the counter electrode without imposing a potential on the working electrode. This therefore seems to indicate a battery type operation in which the intensity is regulated by the potential difference between the working electrode and the counter electrode on which the biological system is immobilized.
  • These battery-type electrochemical systems are known for their lack of stability because the intensity which passes through the electrical circuit depends on the electrochemical kinetics of the working electrode and the counter electrode as well as the ionic migration within the suspension, therefore the ionic conduction characteristics of the solution.
  • WO 03/087293 describes a screening method for determining the impact of a test agent on a biological sample by electrochemistry.
  • EP 0 221 663 relates to a method for electrochemical monitoring of microbial samples.
  • the invention relates to an in vitro method for analyzing the viability of animal cells, said method comprising:
  • the cells as present in the sample at a given time reduce the redox mediator; the concentration of the reduced form of the mediator, which thus depends on the state, that is to say the viability of the cells in the sample, is measured by electrochemistry.
  • the electrochemical detection is carried out at constant imposed potential:
  • the electrochemical dosage according to the invention therefore has the effect of oxidizing the reduced redox mediator and therefore continuously regenerating its oxidized form ( Figure 1 B). This ensures a practically constant concentration of the oxidized form of the mediator.
  • the process is not limited by the concentration of the redox mediator. The measurement can thus be carried out continuously, without the oxidized form of the mediator being exhausted and without the reduced form of the mediator accumulating.
  • the process according to the invention is thus distinguished from spectrophotometric methods ( Figure 1 A), and from the electrochemical method after extraction described by Sherman et al, 2018 ( Figure 1 C): according to these methods, the concentration of the reduced redox mediator is accumulates within the solution and tends to gradually inhibit metabolic activity. This inhibition effect due to the accumulation of the reduced form of the mediator is therefore lifted according to the invention.
  • the method according to the invention allows monitoring of the evolution of cell viability over long periods, up to several hours for example.
  • viability measurement we mean the determination of the number or proportion of living and/or dead/damaged cells.
  • the measurement of viability can be correlated with the measurement of cellular activity, i.e. tPMET electron transfer activity. This transfer illustrates in particular the enzymatic or metabolic activity of the cells considered.
  • Said measurement may include measuring a value at a given time, or dynamic monitoring, tracking these parameters over time.
  • the method according to the invention is carried out on a sample of the cells to be tested.
  • the sample of cells to be tested can be obtained by taking a cell medium containing animal cells, such as human cells whose cell viability is being measured. According to this embodiment, the sample thus collected can be used directly in the process according to the invention, by adding the redox mediator.
  • the sample can be obtained by modifying the sample, for example by any method allowing its measurement by electrochemistry, such as in particular by dilution, concentration, and/or supplementation.
  • said cell sample can be diluted in a cell culture medium, or in a solution of simple chemical composition, in order to constitute the sample to be tested.
  • said sample can be diluted in a cell culture medium or a solution that does not alter cell survival such as for example a solution with controlled pH, in particular at physiological pH (7.20-7.5), having a physiological osmolarity ( 270-320 milli osmol), and preferably comprising an energy source (glucose 1-4 g/L), to ensure the survival of the cells during the measurement.
  • HBSS Hank's balanced salt solution
  • obtaining said sample comprises the step of sampling from a cellular medium containing the cells and possible dilution in a medium which ensures the survival of the cells for the duration of the measurement.
  • the measurement medium comprising the sample and the mediator typically has a cellular concentration allowing measurement of the current intensity proportional to the number of cells.
  • the cellular concentration in the measurement medium is between 1,000 and 1,000,000 cells. ml -1 (cell. ml' 1 ).
  • oxidoreduction mediator we mean an electron acceptor which is reduced by the cells then reoxidized by the electrodes. Said mediator is typically non-cytotoxic at the concentration considered so as not to affect the detection of cell viability.
  • said mediator is soluble in the cellular medium.
  • the transferred electrons allow the reduction of dioxygen or metal ions (Fe 3+ , Cu 2+ ).
  • electrons can reduce different redox compounds such as Fe(CN) 6 3 ', DCIP, quinones (hydroquinone, menadione, etc.) or tetrazolium-based dyes (MTT, XTT , WST-1 ).
  • tetrazolium-based dyes such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro- 5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT), 4-[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate (WST-1).
  • MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
  • XTT 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro- 5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide
  • WST-1,3-benzene disulfonate WST-1,3-benzene disulfonate
  • Redox mediators are also commonly used in electrochemical processes. These are, for example, phenazine methosulfate (PMS) (O. S. Ksenzhek et al., Bioelectrochemistry and Bioenergetics 4 (1977) 346-357), methylene blue (O. S. Ksenzhek et al., Bioelectrochemistry and Bioenergetics 4 (1977) 346-357) and redox mediators used in bioelectrocatalysis (in particular described by D.P. Hickey et al., Electrochemistry 13 (2016) 97-132) such as compounds derived from bipyridine (viologens), osmium or ferrocene.
  • PMS phenazine methosulfate
  • methylene blue O. S. Ksenzhek et al., Bioelectrochemistry and Bioenergetics 4 (1977) 346-357
  • redox mediators used in bioelectrocatalysis in particular described
  • mediators can also be used in the electrochemical process according to the invention.
  • redox compounds such as 2,6-dichlorophenolindophenol (DCIP); iron III hexacyanide (Fe(CN) 6 3 ); quinone derivatives such as hydroquinone or menadione; phenazine methosulfate (PMS); tetrazolium-based dyes such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro- 5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT), 4-[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate (WST-1).
  • DCIP 2,6-dichlorophenolindophenol
  • Fe(CN) 6 3 iron III hexacyanide
  • quinone derivatives
  • the method for bringing the mediator and the sample into contact and thus constituting the measurement medium is not limited:
  • this can be done for example by dissolving said mediator in said sample to constitute the measurement medium.
  • this can be achieved by mixing the sample with a solution of said mediator previously prepared.
  • a solution of said mediator may consist in particular of the mediator diluted in water or in a solute such as HBSS, PBS or EBSS medium, more particularly HBSS
  • the mediator thus in solution is placed in the electrochemical cell, then the sample is then injected into the electrochemical cell.
  • the mediator can be deposited in the form of a solid layer on the surface of the electrode and the mediator is dissolved in the sample when the latter is introduced into the cell.
  • This embodiment can be particularly useful for miniaturizing the measurement system.
  • the measurement medium comprising the sample and the mediator has a mediator concentration of between 10 and 500 pM.
  • electrochemical cell we mean a system capable of oxidizing the redox mediator using electrical energy.
  • the electrochemical cells suitable for the invention can be chosen from cells conventionally used, with 3 electrodes (reference electrode, working electrode and counter electrode, the latter being also called auxiliary electrode) or with 2 electrodes comprising a working electrode and a counter electrode which is then used as a reference electrode, commonly called “pseudo-reference”
  • the electrochemical cell comprises a working electrode, an auxiliary electrode, and optionally a reference electrode.
  • the application of a potential refers to the potential applied to the working electrode relative to the reference electrode.
  • the constant potential can be applied by means of a potentiostat or a voltage generator.
  • the potentiostat may in particular be a portable potentiostat.
  • said constant potential is applied between the working electrode and the reference electrode or the auxiliary electrode used as pseudo-reference.
  • the potential is constant in that it does not vary over time. It can be adjusted depending on the nature of the mediator used.
  • the potential is typically greater than or equal to the redox potential of the mediator used.
  • it is generally at least 50 mV higher than the redox potential of the redox mediator used.
  • the potential is generally lower than the oxidation potential of the water in the medium of the electrochemical cell comprising the sample and the redox mediator in solution.
  • the measured electricity is generated by the flow of electrons generated by the reoxidation of the mediator by the electrodes:
  • M Red designates the mediator in its reduced form
  • M ox designates the mediator in its oxidized form
  • the re-oxidation of said mediator previously reduced by the cells takes place at the working electrode, releasing electrons generating the current.
  • the intensity of the current measured is typically proportional to the flow of electrons transferred during the oxidation reaction of the mediator, therefore to the flow of mediator reduced by said sample and consequently to the flow of electrons resulting from the transfer by tPMET, and can ultimately be correlated to cell viability (and possibly to the number of cells in the sample).
  • cell viability can be correlated to the intensity by prior calibration: typically, these calibrations include the assay with calibration curves for reference cell media, for a given cell type, depending on the cell medium. to test.
  • the measured intensity corresponds to the transfer of electrons by tPMET (trans-Plasma Membrane Electron Transport).
  • the working electrode allows monitoring of the evolution of the intensity.
  • the intensity is measured between the working electrode and the auxiliary electrode.
  • the intensity can be measured using an ammeter located in the electrical circuit of the electrochemical cell, between the working electrode and the counter electrode.
  • an ammeter located in the electrical circuit of the electrochemical cell, between the working electrode and the counter electrode.
  • one or more samples can be taken at different times t, leading to one or more samples, respectively, on which to conduct the electrochemical measurement of the process according to the invention.
  • the intensity can present a plateau over time (stable cellular system) or variations of negative (cellular decay) or positive (cellular growth) slope.
  • the intensity settles at a plateau value when the stable operating regime of the cellular medium is reached, for which the concentration of the reduced form of the mediator is constant.
  • the mediator is consumed at the electrode at the same rate as it is generated by the cellular environment.
  • a decrease in intensity corresponds to a drop in the flow of mediator reduced by the cellular medium tested, and therefore, to a loss of cell viability and/or activity.
  • An increase in intensity detects an increase in the flow of mediator reduced by the cellular medium tested, and therefore, cell growth and/or growth in cellular activity.
  • the method according to the invention consists of a cellular test in that it is carried out on cells (“cell-based assay”) and makes it possible to maintain cell survival.
  • the method according to the invention makes it possible, unlike existing spectrophotometric detection tests, to maintain the concentration of the oxidized form of the mediator constant, that is to say, to maintain an environment favorable to cell survival.
  • the method according to the invention allows in particular the miniaturization of devices for evaluating cell viability and/or assays based on the detection of tPMET, as illustrated according to the examples.
  • spectrophotometric dosage does not allow easy miniaturization.
  • the method according to the invention also allows direct measurement without accumulation or extraction of the mediator.
  • the method according to the invention allows rapid rendering of results.
  • the process also allows continuous monitoring of the intensity and its variations. It also allows continuous monitoring of the cellular environment, for example during the cell growth phase until a steady state is obtained.
  • electrochemical detection allows more precise characterization of tPMETs, for example by determining initial speeds or variations in speed as a function of time. It also paves the way for continuous monitoring of metabolic activity. For example, it makes it possible to identify the activity of cytotoxic agents or growth activators on cells.
  • Figure 1 illustrates the principles of tPMET assay: A) Conventional assay with spectrophotometric detection of the reduced form of the redox mediator;
  • Figure 2 represents an illustrative diagram of an electrode and measuring cell which may be suitable for the invention.
  • Figure 2A represents an illustrative three-electrode system comprising: a carbon working electrode 1; an auxiliary electrode 2 made of carbon; a silver pseudo-reference 3 electrode (PRA); an electrical connection 4 of the working electrode 1; an electrical connection 5 of the auxiliary electrode; and an electrical connection 6 of the PRA.
  • PRA silver pseudo-reference 3 electrode
  • FIG. 2A represents an electrochemical measuring cell in which the strip 7 of Figure 2A is arranged at the base of a Teflon cell consisting of two parts: the upper part 8 of the cell; the lower part 9 of the cell; parts 8 and 9 being separated by an O-ring 10; a parafilm film 11 closing the upper part 8.
  • Such a system can be miniaturized by considerably reducing the volume of the sample, for example by providing above the electrode a volume of only a few microliters into which the sample to be measured is introduced by capillary action.
  • Such configurations are particularly developed for blood glucose measuring strips.
  • FIG 3 illustrates the results obtained during a viability test carried out on Vero cells (1 million cells). 50 pM DCIP in HBSS buffer, bias at 300 mV, DropSens carbon electrodes. The arrow indicates the injection of the cell suspension (1, 2 and 3) or the buffered solution (4, 5 and 6) for the controls.
  • FIG 4 illustrates the results obtained during a viability test carried out on Hela cells (1 million cells). 50 pM DCIP in HBSS buffer, bias at 300 mV, DropSens carbon electrodes. The arrow indicates the injection of the cell suspension (1 and 2) or the buffered solution (4 and 5) for the controls.
  • FIG 5 illustrates the results obtained during a viability test carried out on intact, fixed or lysed Vero cells (1 million cells). 50 pM DCIP in HBSS buffer, bias at 300 mV, DropSens carbon electrodes. The arrow indicates the injection of the cell suspension (1 and 2) or the lysate (3 and 4) or of fixed cells (5 and 6).
  • test lines were carried out on mammalian cell lines, a human Hela line (ATCC CCL-2, cervical carcinomas) and a non-human Vero line. (ATCC CCL-81, green monkey kidney Cercopithecus aethiops). All lines come from the American Type Culture Collection (Manassas, Virginia, United States).
  • the culture medium is RPMI 1640 (ref 31870-025, ThermoFisher scientific, Waltham, United States). This medium was supplemented with 10% (by volume) of decomplemented fetal calf serum (ref 10270, ThermoFisher scientific), 2 mM L-glutamine (ref 25030-54, ThermoFisher scientific) and a mixture of penicillin/streptomycin (10 units/mL and 10 pg/mL, ref 14140-122, ThermoFisher scientific). Subsequently, the medium supplemented with all the additives is called “complete medium”.
  • Cells were routinely cultured in 75 cm 2 flasks (Corning) at 37°C in a humidified atmosphere (80-95% relative humidity) and containing 5% CO2 (CO2 incubator). Arriving at 70-90% confluence, after rinsing the cell layer with DPBS, the cells were removed by trypsinization at 37°C. The action of trypsin was stopped by adding complete RPMI medium and the suspension obtained was centrifuged for 5 min at 200 g. The cell pellet was taken up in complete RPMI. After counting (Malassez cell in the presence of trypan blue), the cell suspension was diluted in RPMI in order to obtain the required cell density (in viable cells).
  • the lysed cells were obtained by taking the cell pellet obtained after centrifugation in ultra-pure water (ref 340 952-8 Cooper). The suspension obtained was passed through an ultrasonic bath for 5 min at full power (model USC3300D, VWR). After preparation, the lysate was stored in melting ice and used immediately.
  • the fixed cells were prepared by taking the cell pellet in one milliliter of formaldehyde (ref FB002, ThermoFisher scientific) at 4% in a phosphate solution (PBS). After one hour of incubation at 37°C, the cells were rinsed three times with PBS to remove excess formaldehyde. After the last rinse, the cell pellet was taken up in a buffered solution (HBSS). Electrochemical measurement of cell viability
  • Electrodes screen-printed on ceramic strips (Metrohm Dropsens, DRP 110, Figure 2A). These electrodes include a circular carbon working electrode with a diameter of 4 mm, partly surrounded by the auxiliary electrode and the silver pseudo-reference electrode (PRA), all deposited by ink jet (screen printed) on ceramic strips that fit into a dedicated electrical connector.
  • PRA silver pseudo-reference electrode
  • the electrodes and the electrochemical cell are shown in Figure 2.
  • the potential of the silver pseudo-reference electrode (PRA) given by the supplier is -131 mV compared to the classic silver chloride reference electrode, or +66 mV compared to the standard electrode hydrogen (ESH).
  • the electrodes are inserted into the base of Teflon reactors ( Figure 2B).
  • the lower part of the reactor ensures that the electrode is held in place.
  • the upper part has an opening which allows the reactors to be filled with medium.
  • the two parts are held together by four plastic screws. Sealing is ensured by an O-ring located between the electrode and the upper part of the reactors.
  • the reactors were cleaned by immersion for 2 h in a detergent solution (RBS35 2% v/v in water, Cari Roth, Düsseldorf, Germany) then carefully rinsed under running water then with distilled water.
  • the reactor parts (support, screw, gasket) as well as the electrodes were sterilized by immersion for 30 min in a 70% ethanol solution (v/v in water, VWR, Radnor, United States).
  • the electrodes were briefly rinsed by immersion in ultrapure water (water for injection, ref 340 952-8, Cooper, Melun, France) before complete drying in a microbiological safety station (PSM).
  • PSM microbiological safety station
  • the reactors equipped with a carbon electrode are filled with two milliliters of HBSS buffer containing 2,6-dichlorophenolindophenol (DCIP, (ref D1878 Sigma Aldrich) at a concentration of 50 pM, redox mediator used for the measurements.
  • DCIP 2,6-dichlorophenolindophenol
  • the reactors are transferred to an incubator at 37°C/5% CO2, the working electrodes are polarized at +300 mV/PRA (i.e. 366 mV/ESH) using a multi-channel potentiostat (Biologies) and the current is recorded continuously.
  • 50 ⁇ L of cell suspension one million cells
  • buffered solution for the controls are injected into the reactors, without interrupting the polarization.
  • the measurements are continued for at least one hour after the injection of the cells.
  • a potential of 300 mV relative to the DropSens pseudo-reference is applied continuously. This potential ensures the rapid oxidation of the reduced form of 2,6-dichlorophenolindophenol (DCIP), the redox mediator used for the measurements. This mediator is also commonly used for spectrophotometric assay.
  • DCIP 2,6-dichlorophenolindophenol
  • Vero cells are a cell line derived from green monkey kidney commonly used in biotechnology for virus culture, vaccine production and cytotoxicity determinations.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé in vitro d'analyse de la viabilité cellulaire par électrochimie, au moyen de médiateurs d'oxydoréduction, par application d'un potentiel constant, permettant une mesure stable en continu.

Description

DESCRIPTION
TITRE : PROCEDE D’ANALYSE DE LA VIABILITE DE CELLULES ANIMALES PAR MESURE ELECTROCHIMIQUE
La présente invention concerne l’analyse de la viabilité cellulaire par électrochimie, notamment par analyse de l’activité du transfert d’électrons.
Les cellules eucaryotes, notamment les cellules animales, notamment humaines, peuvent réaliser des transferts d’électrons vers le compartiment extracellulaire, c’est-à-dire transférer des électrons intracellulaires vers le milieu extracellulaire au travers de la membrane plasmique. Ce mécanisme de transfert d’électrons est couramment nommé tPMET pour « trans-Plasma Membrane Electron Transport ». Outre les cellules animales et humaines il est retrouvé chez de nombreux organismes tels que les levures et les plantes.
Les tPMET ont été mis en évidence dans les années 60 en montrant que des cellules sont capables de réduire des colorants incapables de pénétrer à l’intérieur des cellules. Cependant, les effets de composés redox sur les cellules ont été observés bien avant la découverte des tPMET. Dès 1925, il a été démontré que des colorants peuvent être réduits par des expiants de tissus, puis que les membranes plasmiques sont imperméables à ces colorants.
Les tPMET sont impliqués dans une grande diversité de processus cellulaires physiologiques et pathologiques. En oxydant le NADH/NADPH intracellulaire, les tPMET permettent d’ajuster l’état redox au sein de la cellule et de contrôler les ratios NAD NADH et NADP NADPH. Ces deux ratios sont des éléments majeurs du contrôle du métabolisme cellulaire. La simplicité des mécanismes tPMET permet de régénérer rapidement le NAD(P)+ ; en quelques secondes l’ensemble du pool intracellulaire de NAD(P)H peut être ré-oxydé.
Les tPMET semblent également être associés à la régulation de la prolifération cellulaire. Ils sont impliqués dans l’entrée d’éléments nutritifs dans les cellules et à la captation du fer. En conditions physiologiques, les tPMET sont impliqués dans la défense de l’organisme contre les attaques d’agents pathogènes par exemple. Les électrons captés du cytoplasme sont utilisés pour générer des composés oxydants toxiques comme du peroxyde d’hydrogène.
Les tPMET sont en outre impliqués dans divers processus pathologiques. Dans les cellules cancéreuses, les tPMET semblent jouer un rôle majeur en termes d’activité métabolique modifiée/augmentée. En particulier, ils contribuent à la ré-oxydation rapide du NADH généré par la glycolyse et permettent aux cellules de se développer en absence de dioxygène. L’expression d’oncogènes, comme N-myc, semble corrélée au niveau d’activité tPMET de lignées en culture. L’inhibition des tPMET chez les cellules cancéreuses pourrait constituer une nouvelle stratégie pour les thérapies anticancéreuses.
Le suivi des tPMET présente donc un grand intérêt dans de nombreux domaines de la biologie cellulaire visant des applications biomédicales très variées.
L’activité tPMET est couramment évaluée par spectrophotométrie en suivant l’apparition ou la disparition de couleur associée à la réduction de colorants. En raison du couplage entre les tPMET et l’activité mitochondriale, cette méthode est utilisée en routine pour évaluer la viabilité des cellules. Les principaux colorants utilisés sont le XTT et le MTT. Le kit de détection commercialisé par ATCC (XTT Cell proliferation Asasy Kit) repose sur ce principe. Les cellules réduisent le médiateur redox phénazine methosulfate (PMS) qui, à son tour, réduit le sel de tétrazolium XTT. La concentration de la forme réduite est mesurée par spectrophotométrie. Il s’agit donc d’une mesure finale qui se fait après que la forme réduite du médiateur redox se soit accumulée en solution.
Plus récemment, Sherman et al., Whole Eukaryotic Cells. Anal. Chem. 90, 2780-2786, 2018b ont également rapporté l’évaluation de l’activité tPMET par électrochimie : Dans ce cas, le médiateur redox est le ferricyanure de potassium et la concentration de sa forme réduite est mesurée par électrochimie. Toutefois, la mesure décrite dans cette étude est une mesure réalisée sur le milieu, après extraction des cellules de la suspension cellulaire. Cette méthode reste donc une mesure finale de la forme réduite du médiateur qui doit d’abord s’accumuler en solution. Elle ne permet pas le suivi en temps réel. Elle exige en outre une étape supplémentaire d’extraction des cellules du milieu de culture avant que la concentration du ferrocyanure ne soit mesurée par électrochimie
EP 1 199 560 décrit un procédé électrochimique pour la détermination du nombre de cellules et l’activité des systèmes biologiques. Cependant, le procédé implique l’application d’une substance gélifiante dans la contre-électrode employée comme récipient de réaction, et l’introduction du système biologique, préalablement mis en suspension dans une phase liquide, dans le récipient de réaction, de façon à ce que ledit système biologique soit immobilisé avec le médiateur d’oxydoréduction au sein de la substance gélifiante.
De plus, le procédé ne fait que mesurer l’intensité et il n’est fait aucune mention de l’application d’un potentiel contrôlé (fixe ou variable) à l’électrode de travail. Curieusement, le procédé selon EP 1 199 560 applique le système biologique à évaluer sur la contre- électrode sans imposer de potentiel à l’électrode de travail. Ceci semble donc indiquer un fonctionnement de type pile dans lequel l’intensité est régulée par la différence de potentiel entre l’électrode de travail et la contre-électrode sur laquelle le système biologique est immobilisé. Ces systèmes électrochimiques de type pile sont connus pour leur manque de stabilité car l’intensité qui traverse le circuit électrique dépend des cinétiques électrochimiques de l’électrode de travail et de la contre-électrode ainsi que de la migration ionique au sein de la suspension, donc des caractéristiques de conduction ionique de la solution.
Ce procédé exige donc une préparation préalable du système biologique qui doit être fixé sur la contre-électrode et II ne permet pas la mesure stable et fiable de la viabilité cellulaire.
WO 03/087293 décrit un procédé de screening pour déterminer l’impact d’un agent test sur un échantillon biologique par électrochimie.
EP 0 221 663 concerne une méthode de suivi électrochimique d’échantillons microbiens.
Il reste donc désirable de mettre à disposition un procédé permettant une mesure en direct, en temps réel, fiable, rapide et stable du transfert d’électrons, corrélée à la quantité/activité des cellules et permettant une miniaturisation. Idéalement, ce procédé ne doit exiger qu’un minimum d’opérations de préparation du milieu afin de ne pas risquer d’altérer la viabilité cellulaire du fait de ces opérations ou risquer d’introduire un biais à la mesure du fait de l’impact de la phase de préparation de l’échantillon. Par exemple, des étapes d’immobilisation du système biologique, comme décrit dans EP 1 199 560, peuvent introduire une variabilité sur l’état ou sur la quantité des cellules impliquées dans la mesure. Il reste en outre désirable d’obtenir une mesure d’intensité de courant qui soit le plus strictement corrélée à l’activité cellulaire, c’est-à-dire à la cinétique des transferts d’électrons qui ont lieu sur l’électrode de mesure, dite électrode de travail, en s’affranchissant de la cinétique des transferts à la seconde électrode, dite contre-électrode ou électrode auxiliaire, et des caractéristiques de conductivité ionique du milieu. Pour cela, l’électrochimie met en œuvre des montages expérimentaux dits à trois électrodes avec potentiel contrôlé, qui assurent que le courant traversant le circuit ne dépend que de la cinétique des transferts d’électrons à l’électrode. Les montages à trois électrodes avec potentiel contrôlé permettent de s’affranchir de la cinétique des transferts à la contre- électrode et, de l’impact de la conductivité ionique de la solution.
Selon un premier objet, l’invention concerne un procédé in vitro d’analyse de la viabilité de cellules animales, ledit procédé comprenant :
L’obtention d’un échantillon contenant lesdites cellules animales ;
- la mise en contact dans une cellule électrochimique dudit échantillon avec un médiateur d’oxydoréduction ; l’application d’un potentiel constant à ladite cellule électrochimique ; la mesure de l’intensité ; et
- la détermination de la viabilité desdites cellules animales.
De façon classique, les cellules telles que présentes dans l'échantillon à un instant donné réduisent le médiateur redox ; la concentration de la forme réduite du médiateur, qui dépend ainsi de l’état c’est-à-dire de la viabilité des cellules dans l’échantillon, est mesurée par électrochimie.
Selon l’invention, la détection électrochimique est effectuée à potentiel imposé constant : Le dosage électrochimique selon l’invention a donc pour effet d’oxyder le médiateur redox réduit et donc de régénérer en continu sa forme oxydée (Figure 1 B). Ceci assure une concentration de la forme oxydée du médiateur pratiquement constante. Ainsi, le procédé n’est pas limité par la concentration du médiateur redox. La mesure peut ainsi être réalisée en continu, sans que la forme oxydée du médiateur ne s’épuise et sans que la forme réduite du médiateur ne s’accumule.
Le principe est représenté schématiquement à la Figure 1 B.
Le procédé selon l’invention se distingue ainsi des méthodes spectrophotométriques (Figure 1 A), et de la méthode électrochimique après extraction décrite par Sherman et al, 2018 (Figure 1 C) : selon ces méthodes, la concentration du médiateur redox réduit s’accumule au sein de la solution et tend à inhiber progressivement l’activité métabolique. Cet effet d’inhibition dû à l’accumulation de la forme réduite du médiateur est donc levé selon l’invention. Ainsi, le procédé selon l’invention permet un suivi de l’évolution de la viabilité cellulaire sur de longues périodes, jusqu’à plusieurs heures par exemple.
On entend par mesure de viabilité la détermination en nombre ou en proportion de cellules vivantes et/ou mortes/endommagées.
La mesure de la viabilité peut être corrélée à la mesure de l’activité cellulaire, c’est-à-dire l’activité de transfert d’électrons tPMET. Ce transfert illustre notamment l’activité enzymatique ou métabolique des cellules considérées.
Ladite mesure peut comprendre la mesure d’une valeur à un moment donné, ou le suivi dynamique, en suivant ces paramètres dans le temps.
Typiquement, le procédé selon l’invention est réalisé sur un échantillon des cellules à tester.
L’échantillon des cellules à tester peut être obtenu par prélèvement d’un milieu cellulaire contenant les cellules animales, telles que des cellules humaines dont on cherche à mesurer la viabilité cellulaire. Selon ce mode de réalisation, l’échantillon ainsi prélevé peut être utilisé directement dans le procédé selon l’invention, en y ajoutant le médiateur d’oxydoréduction.
Alternativement, l’échantillon peut être obtenu par modification du prélèvement, par exemple par toute méthode permettant sa mesure par électrochimie, telle que notamment par dilution, concentration, et/ou supplémentation. Ainsi, ledit prélèvement cellulaire peut ainsi être dilué dans un milieu de culture cellulaire, ou dans une solution de composition chimique simple, afin de constituer l’échantillon à tester. A titre illustratif, ledit prélèvement peut être dilué dans un milieu de culture cellulaire ou une solution n’altérant pas la survie cellulaire tel que par exemple une solution à pH contrôlé, notamment à pH physiologique (7.20-7.5), présentant une osmolarité physiologique (270-320 milli osmol), et comprenant de préférence une source d’énergie (glucose 1-4 g/L), pour assurer la survie des cellules le temps de la mesure. Typiquement, on peut citer la solution saline équilibrée de Hank (HBSS).
Ainsi, selon un mode de réalisation, l’obtention dudit échantillon comprend l’étape de prélèvement à partir d’un milieu cellulaire contenant les cellules et la dilution éventuelle dans un milieu qui assure la survie des cellules le temps de la mesure. Le milieu de mesure comprenant l’échantillon et le médiateur présente typiquement une concentration cellulaire permettant une mesure de l’intensité du courant proportionnelle au nombre de cellules. Ainsi selon un mode de réalisation, la concentration cellulaire dans le milieu de mesure est comprise entre 1 000 et 1 000 000 cellules. ml-1 (cell. ml’1).
On entend par « médiateur d’oxydoréduction » un accepteur d’électrons qui est réduit par les cellules puis réoxydé par les électrodes. Ledit médiateur est typiquement non cytotoxique à la concentration considérée pour ne pas affecter la détection de la viabilité cellulaire.
Selon le mode de réalisation, ledit médiateur est soluble dans le milieu cellulaire.
Il existe une grande variété d’accepteurs d’électrons extracellulaires.
In vivo, les électrons transférés permettent notamment la réduction du dioxygène ou d’ions métalliques (Fe3+, Cu2+). In vitro, en plus des substrats cités précédemment, les électrons peuvent réduire différents composés redox tels que Fe(CN)6 3’, DCIP, des quinones (hydroquinone, ménadione...) ou des colorants à base de tétrazolium (MTT, XTT, WST-1 ). Des médiateurs d’oxydoréduction sont utilisés pour les mesures de viabilité cellulaire avec détection spectrophotométrie, tels que le 2,6-dichlorophenolindophenol (DCIP) (E° = 0,226 V/ESH); l’hexacyanoferrate III, également appelé ferricyanure (Fe(CN)e3 ) (E° = 0,37 V/ESH) ; les dérivés de naphtoquinones, tels que la ménadione (2-methyl-1 ,4- naphthoquinone, également appelée vitamine K3) et ses dérivés (Elhabiri et al., Redox Behavior Predictions. Chem. Eur. J. 21 (2015) 3415 - 3424) tels que les hydroquinones (Martfnez-Cifuentes et al., Molecules 22 (2017) 577) et les benzoquinones (M.T. Huynh et al., J. Am. Chem. Soc. 138 (2015) 15903-15910); les colorants à base de tétrazolium tels que le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT), le 2,3-bis-(2- méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl)-2H-tétrazolium-5-carboxanilide (XTT), le disulfonate de 4- [3-(4-iodophényl)-2-(4-nitrophényl)-2H-5-tétrazolio]-1 ,3-benzène (WST-1 ).
Des médiateurs redox sont également communément utilisés dans des procédés électrochimiques. Il s’agit par exemple de la phénazine méthosulfate (PMS) (O. S. Ksenzhek et al., Bioelectrochemistry and Bioenergetics 4 (1977) 346-357), du bleu de méthylène (O. S. Ksenzhek et al., Bioelectrochemistry and Bioenergetics 4 (1977) 346-357) et les médiateurs redox utilisés en bioélectrocatalyse (notamment décrits par D.P. Hickey et al., Electrochemistry 13 (2016) 97-132) tels que les composés dérivés de bipyridine (viologènes), d’osmium ou de ferrocène.
Les références indiquent des travaux qui ont déterminé ou approché les valeurs des potentiels redox des médiateurs cités. Des valeurs différentes sont souvent trouvées dans la bibliographie du fait de la différence des dérivés, d’études divergentes ou de composés pouvant donner plusieurs réactions électrochimiques.
Ces médiateurs peuvent être également mis en œuvre dans le procédé électrochimique selon l’invention.
A titre de médiateur convenant à l’invention, on peut notamment citer des composés redox tels que le 2,6-dichlorophenolindophenol (DCIP) ; l’hexacyanure de fer III (Fe(CN)6 3 ) ; les dérivés de quinones tels que l’hydroquinone, ou la ménadione ; la phénazine méthosulfate (PMS) ; les colorants à base de tétrazolium tels que le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol- 2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT), le 2,3-bis-(2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl)-2H- tétrazolium-5-carboxanilide (XTT), le disulfonate de 4-[3-(4-iodophényl)-2-(4-nitrophényl)- 2H-5-tétrazolio]-1 ,3-benzène (WST-1 ).
La méthode pour réaliser la mise en contact du médiateur et de l’échantillon et ainsi constituer le milieu de mesure n’est pas limitée:
Selon un mode de réalisation, ceci peut être fait par exemple par dissolution dudit médiateur dans ledit échantillon pour constituer le milieu de mesure.
Selon un autre mode de réalisation, ceci peut être réalisé par mélange de l’échantillon avec une solution dudit médiateur préalablement préparée. Une telle solution peut être constituée notamment par le médiateur dilué dans l’eau ou dans un soluté tel que le milieu HBSS, PBS ou EBSS, plus particulièrement HBSS
Le médiateur ainsi en solution est placé dans la cellule électrochimique, puis l’échantillon est injecté ensuite dans la cellule électrochimique.
Selon un autre mode de réalisation, le médiateur peut être déposé sous forme d’une couche solide à la surface de l’électrode et le médiateur est dissous dans l’échantillon lorsque ce dernier est introduit dans la cellule. Ce mode de réalisation peut être particulièrement utile pour miniaturiser le système de mesure.
Typiquement, le milieu de mesure comprenant l’échantillon et le médiateur présente une concentration en médiateur comprise entre 10 et 500 pM.
On entend par « cellule électrochimique » un système capable d’oxyder le médiateur d’oxydoréduction grâce à l’énergie électrique. Les cellules électrochimiques convenant à l’invention peuvent être choisies parmi les cellules classiquement utilisées, à 3 électrodes (électrode de référence, électrode de travail et contre-électrode, cette dernière étant également nommée électrode auxiliaire) ou à 2 électrodes comprenant une électrode de travail et une contre-électrode qui est alors utilisée comme électrode de référence, communément nommée « pseudo-référence »
Selon un mode de réalisation, la cellule électrochimique comprend une électrode de travail, une électrode auxiliaire, et éventuellement une électrode de référence.
Les cellules électrochimiques miniaturisées peuvent avantageusement être utilisées.
L’application d’un potentiel désigne le potentiel appliqué à l’électrode de travail par rapport à l’électrode de référence. Typiquement, le potentiel constant peut être appliqué au moyen d’un potentiostat ou d’un générateur de tension. Le potentiostat peut être notamment un potentiostat portable.
Selon un mode de réalisation, ledit potentiel constant est appliqué entre l’électrode de travail et l’électrode de référence ou l’électrode auxiliaire utilisée comme pseudo-référence.
Le potentiel est constant en ce qu’il ne varie pas au cours du temps. Il peut être ajusté en fonction de la nature du médiateur utilisé.
Selon un mode de réalisation, le potentiel est typiquement supérieur à ou égal au potentiel redox du médiateur utilisé. Ainsi, il est généralement supérieur d’au moins 50 mV au potentiel redox du médiateur d’oxydoréduction utilisé.
Selon un mode de réalisation, le potentiel est généralement inférieur au potentiel d’oxydation de l’eau dans le milieu de la cellule électrochimique comprenant l’échantillon et le médiateur d’oxydoréduction en solution.
Selon un mode de réalisation l’électricité mesurée est générée par le flux d’électrons générés par la réoxydation du médiateur par les électrodes :
M Red“> Mox+ e
Où M Red désigne le médiateur sous sa forme réduite et Mox désigne le médiateur sous sa forme oxydée.
Selon un mode de réalisation, la re-oxydation dudit médiateur préalablement réduit par les cellules a lieu à l’électrode de travail, en libérant des électrons générant le courant. L’intensité du courant mesurée est typiquement proportionnelle au flux d’électrons transférés lors de la réaction d’oxydation du médiateur, donc au flux de médiateur réduit par ledit échantillon et par conséquent au flux d’électrons issus du transfert par tPMET, et peut in fine être corrélée à la viabilité cellulaire (et éventuellement au nombre de cellules dans l’échantillon).
Selon un mode de réalisation, la viabilité cellulaire peut être corrélée à l’intensité par étalonnage préalable : typiquement, ces étalonnages comprennent le dosage avec des courbes de calibration pour des milieux cellulaires de référence, pour un type de cellules donné, selon le milieu cellulaire à tester.
Selon un mode de réalisation, il est possible de s’affranchir de la quantification du nombre de cellules dans l’échantillon en préparant pour chaque essai un contrôle avec des cellules fixées juste avant la mesure (de viabilité à 0 %) et un témoin non exposé au produit à tester (viabilité 100 % par convention), le contrôle et le témoin étant préparés dans les mêmes conditions, de façon à rendre négligeable la différence du nombre de cellules entre les différentes conditions.
Ainsi, toutes les mesures de viabilité peuvent être comprises entre la valeur pour le contrôle et le témoin.
Selon un mode de réalisation, l’intensité mesurée correspond au transfert d’électrons par tPMET (trans-Plasma Membrane Electron Transport).
Typiquement, l’électrode de travail permet le suivi de l’évolution de l’intensité. Selon un mode de réalisation, l’intensité est mesurée entre l’électrode de travail et l’électrode auxiliaire.
L’intensité peut être mesurée au moyen d’un ampèremètre situé dans le circuit électrique de la cellule électrochimique, entre l’électrode de travail et la contre-électrode. Lorsqu’un potentiostat est utilisé pour fixer le potentiel de l’électrode de travail, l’ampèremètre est généralement inclus dans le potentiostat.
A partir d’un milieu cellulaire, un ou plusieurs prélèvements peuvent être effectués à différents instants t, conduisant à un ou plusieurs échantillons, respectivement, sur lesquels conduire la mesure électrochimique du procédé selon l’invention.
Il est ainsi possible d’analyser la variation de la viabilité du milieu cellulaire en comparant les mesures pour des échantillons prélevés à différents instants t.
Pour un échantillon donné, il est également possible d’effectuer des mesures en continu sur une période de temps déterminée. L’intensité peut présenter en fonction du temps un plateau (système cellulaire stable) ou des variations de pente négative (décroissance cellulaire) ou positive (croissance cellulaire).
Typiquement, l’intensité s’établit à une valeur plateau lorsque le régime de fonctionnement stable du milieu cellulaire est atteint, pour lequel la concentration de la forme réduite du médiateur est constante. Dans ce régime stationnaire, le médiateur est consommé à l’électrode à la même vitesse qu’il est généré par le milieu cellulaire.
Une diminution d’intensité correspond à une baisse du flux de médiateur réduit par le milieu cellulaire testé, et de fait, à une perte de viabilité et/ou activité cellulaire.
Une augmentation d’intensité détecte une hausse du flux de médiateur réduit par le milieu cellulaire testé, et de fait, une croissance cellulaire et/ou croissance de l’activité cellulaire.
Le procédé selon l’invention consiste en un test cellulaire en ce qu’il est effectué sur cellules (« cell-based assay ») et permet de maintenir la survie cellulaire.
Le procédé selon l’invention permet, contrairement aux tests à détection spectrophotométrique existants, de maintenir la concentration de la forme oxydée du médiateur constante, c'est-à-dire de maintenir un environnement favorable à la survie cellulaire.
Le procédé selon l’invention permet notamment la miniaturisation des dispositifs d’évaluation de la viabilité cellulaire et/ou dosages basés sur la détection de tPMET, tel qu’illustré selon les exemples. A l’heure actuelle, le dosage spectrophotométrique ne permet pas une miniaturisation aisée.
Le procédé selon l’invention permet également une mesure en direct sans accumulation ou extraction du médiateur. Le procédé selon l’invention permet un rendu de résultats rapide. Le procédé permet également un suivi de l’intensité et ses variations en continu. Il permet également un suivi du milieu cellulaire en continu, par exemple pendant la phase de croissance de cellules jusqu’à l’obtention d‘un régime stationnaire.
En offrant la possibilité d’une mesure en fonction du temps, la détection électrochimique permet une caractérisation plus précise des tPMET par exemple par la détermination de vitesses initiales ou de variations de la vitesse en fonction du temps. Elle ouvre également la voie au suivi en continu de l’activité métabolique. Il permet par exemple d’identifier l’activité d’agents cytotoxiques ou activateurs de croissance sur les cellules.
Ceci permet notamment la mise en œuvre du procédé dans le domaine de la thérapie cellulaire pour le contrôle de la viabilité des cellules en cours de préparation (du prélèvement à la production finale), avant utilisation/injection et au niveau des banques de tissus (greffes notamment) par exemple. Il permet des applications biomédicales très variées car les tPMET sont impliqués dans une grande diversité de processus cellulaires physiologiques et pathologiques : régulation de la prolifération cellulaire, activité métabolique modifiée/augmentée des cellules cancéreuses, etc.
Figures
[Fig 1 ] La Figure 1 illustre les principes de dosage des tPMET : A) Dosage conventionnel avec détection spectrophotométrique de la forme réduite du médiateur d’oxydoréduction ;
B) Détection électrochimique suivant le principe de l'invention ; C) Dosage électrochimique de la forme réduite du médiateur suivant le protocole du groupe de Rawson (Sherman et al., Anal. Chem. 90 (2018), 2780-2786, 2018), après extraction des cellules de la solution (surnageant).
[Fig 2] Figure 2 représente un schéma illustratif d’une électrode et cellule de mesure pouvant convenir à l’invention.
Plus précisément, la Figure 2A représente un système illustratif à trois électrodes comprenant : une électrode de travail 1 de carbone ; une électrode auxiliaire 2 en carbone ; une électrode de pseudo-référence 3 en argent (PRA) ; une connexion électrique 4 de l’électrode de travail 1 ; une connexion électrique 5 de l’électrode auxiliaire ; et une connexion électrique 6 de la PRA.
Ce système est réalisé par sérigraphie sur une bandelette en céramique de 34 mm de long, 10 mm de large et 0.5 mm d’épaisseur (Metrohm Dropsens, figure A). Ainsi, une électrode de travail de 4 mm de diamètre est illustrée à la Figure 2A. La Figure 2B représente une cellule de mesure électrochimique dans laquelle la bandelette 7 de la Figure 2A est disposée à la base d’une cellule en téflon constituée de deux parties : la partie supérieure 8 de la cellule; la partie inférieure 9 de la cellule ; les parties 8 et 9 étant séparées par un joint torique 10; un film de parafilm 11 obturant la partie supérieure 8.
Un tel système peut être miniaturisé en réduisant considérablement le volume de l’échantillon, par exemple en ménageant au-dessus de l’électrode un volume de seulement quelques microlitres dans lequel on introduit l’échantillon à doser par capillarité. De telles configurations sont notamment développées pour les bandelettes de mesure de la glycémie.
[Fig 3] La Figure 3 illustre les résultats obtenus lors d’un test de viabilité réalisé sur cellules Vero (1 million de cellules). DCIP 50 pM dans du tampon HBSS, polarisation à 300 mV, électrodes DropSens en carbone. La flèche indique l’injection de la suspension de cellules (1 ,2 et 3) ou de la solution tamponnée (4,5 et 6) pour les contrôles.
[Fig 4] La Figure 4 illustre les résultats obtenus lors d’un test de viabilité réalisé sur cellules Hela (1 million de cellules). DCIP 50 pM dans du tampon HBSS, polarisation à 300 mV, électrodes DropSens en carbone. La flèche indique l’injection de la suspension de cellules (1 et 2) ou de la solution tamponnée (4 et 5) pour les contrôles.
[Fig 5] La Figure 5 illustre les résultats obtenus lors d’un test de viabilité réalisé sur cellules Vero intactes, fixées ou lysées (1 million de cellules). DCIP 50 pM dans du tampon HBSS, polarisation à 300 mV, électrodes DropSens en carbone. La flèche indique l’injection de la suspension de cellules (1 et 2) ou du lysat (3 et 4) ou de cellules fixées (5 et 6).
Exemples
Préparation des cellules
Les essais ont été réalisés sur des lignées de cellules de mammifères, une lignée humaine Hela (ATCC CCL-2, carcinomateuses du col de l’utérus) et une lignée non humaine Vero (ATCC CCL-81 , rein de singe vert Cercopithecus aethiops). Toutes les lignées proviennent de I’American Type Culture Collection (Manassas, Virginie, Etats-Unis).
Les stocks primaires de cellules ont été gracieusement fournis par la Fonderphar (Fondation pour le développement et la recherche pharmaceutique, Toulouse, France). Pour chaque lignée cellulaire des stocks secondaires ont été produits en amplifiant le stock primaire. Les banques de cellules ont été conservées en solution cryoconservatrice (sérum fœtal de veau additionné de 10% de DMSO [Corning, Corning, Etats-Unis]) à -80°C.
Le milieu de culture est le RPMI 1640 (ref 31870-025, ThermoFisher scientific, Waltham, Etats-Unis). Ce milieu a été supplémenté avec 10% (en volume) de sérum de veau fœtal décomplémenté (ref 10270, ThermoFisher scientific), 2 mM de L-glutamine (ref 25030-54, ThermoFisher scientific) et un mélange de pénicilline/streptomycine (10 unités/mL et 10 pg/mL, ref 14140-122, ThermoFisher scientific). Par la suite, le milieu supplémenté avec tous les additifs est appelé « milieu complet ».
Les cellules ont été cultivées en routine dans des flacons de 75 cm2 (Corning) à 37°C dans une atmosphère humidifiée (80-95% d’humidité relative) et contenant 5% de CO2 (incubateur à CO2). Arrivé à 70-90% de confluence, après rinçage du tapis cellulaire avec du DPBS, les cellules ont été décrochées par trypsinisation à 37°C. L’action de la trypsine a été stoppée par ajout de milieu RPMI complet et la suspension obtenue a été centrifugée 5 min à 200 g. Le culot de cellules a été repris dans du RPMI complet. Après numération (cellule de Malassez en présence de bleu trypan), la suspension de cellules a été diluée dans du RPMI afin d’obtenir la densité cellulaire requise (en cellules viables).
Les cellules lysées ont été obtenues en reprenant le culot de cellules obtenu après centrifugation dans de l’eau ultra pure (ref 340 952-8 Cooper). La suspension obtenue a été passée au bain à ultrasons pendant 5 min à pleine puissance (modèle USC3300D, VWR). Après préparation, le lysat a été conservé dans de la glace fondante et utilisé sans délai.
Les cellules fixées ont été préparées en reprenant le culot de cellules dans un millilitre de formaldéhyde (ref FB002, ThermoFisher scientific) à 4% dans une solution de phosphates (PBS). Après une heure d’incubation à 37°C, les cellules ont été rincées trois fois avec du PBS afin d’éliminer le formaldéhyde en excès. Après le dernier rinçage, le culot de cellules a été repris dans une solution tamponnée (HBSS). Mesure électrochimique de la viabilité des cellules
Les mesures électrochimiques sont réalisées avec des électrodes en carbone sérigraphiées sur des bandelettes en céramique (Metrohm Dropsens, DRP 110, Figure 2A). Ces électrodes comprennent une électrode de travail en carbone circulaire d’un diamètre de 4 mm, en partie entourée par l’électrode auxiliaire et l’électrode de pseudo-référence en argent (PRA), le tout déposé par jet d’encre (screen printed) sur des bandelettes en céramique qui s’insèrent dans un connecteur électrique dédié. Les électrodes et la cellule électrochimique sont représentées dans la Figure 2.
Le potentiel de l’électrode de pseudo-référence en argent (PRA) donné par le fournisseur est de -131 mV par rapport à l’électrode de référence classique au chlorure d’argent, soit +66 mV par rapport à l’électrode standard à hydrogène (ESH).
Les électrodes sont insérées à la base de réacteurs en téflon (Figure 2B). La partie inférieure du réacteur assure le maintien de l’électrode. La partie supérieure comporte une ouverture qui permet de remplir les réacteurs de milieu. Les deux parties sont maintenues entre elles par quatre vis en plastique. L’étanchéité est assurée par un joint torique situé entre l’électrode et la partie supérieure des réacteurs.
Avant chaque utilisation, les réacteurs ont été nettoyés par immersion durant 2 h dans une solution de détergent (RBS35 2% v/v dans l’eau, Cari Roth, Karlsruhe, Allemagne) puis soigneusement rincés à l’eau courante puis à l’eau distillée. Les pièces des réacteurs (support, vis, joint) ainsi que les électrodes ont été stérilisées par immersion 30 min dans une solution d’éthanol à 70% (v/v dans l’eau, VWR, Radnor, Etats-Unis). Les électrodes ont été brièvement rincées par immersion dans l’eau ultra pure (eau pour préparation injectable, ref 340 952-8, Cooper, Melun, France) avant séchage complet sous poste de sécurité microbiologique (PSM). Le montage des réacteurs a été réalisé en conditions stériles, sous PSM, avec des outils stérilisés selon le même protocole.
Les réacteurs équipés d’électrode en carbone (Metrohm Dropsens, DRP 110) sont remplis avec deux millilitres de tampon HBSS contenant du 2,6-dichlorophenolindophenol (DCIP, (ref D1878 Sigma Aldrich) à la concentration de 50 pM, médiateur redox utilisé pour les mesures. Immédiatement après, les réacteurs sont transférés dans un incubateur à 37°C/5% CO2, les électrodes de travail sont polarisées à +300 mV/PRA (soit 366 mV/ESH) à l’aide d’un potentiostat multicanaux (Biologies) et le courant est enregistré en continu. Après 20 à 50 minutes, 50 pL de suspension cellulaire (un million de cellules), ou seulement de solution tamponnée pour les contrôles, sont injectés dans les réacteurs, sans interruption de la polarisation. Les mesures sont poursuivies pendant au moins une heure après l’injection des cellules.
Un potentiel de 300 mV par rapport à la pseudo-référence DropSens est appliqué en continu. Ce potentiel assure l’oxydation rapide de la forme réduite du 2,6- dichlorophenolindophenol (DCIP), médiateur redox utilisé pour les mesures. Ce médiateur est également couramment utilisé pour le dosage spectrophotométrique.
Les cellules Vero sont une lignée cellulaire issue de rein de singe vert communément utilisées en biotechnologie pour la culture de virus, la production de vaccins et des déterminations de cytotoxicité.
Dès l’injection des cellules, le courant répond par un saut brusque qui atteint environ 800 nA après 2 à 3 minutes. Il croît ensuite lentement pendant environ 40 minutes et se stabilise les 30 minutes supplémentaires que dure l’essai aux environs de 1300 nA (Figure 2). Les contrôles sans cellules ne dépassent jamais 30 nA.
Le même protocole repris avec des cellules Hela conduit à des résultats similaires, avec des courants plus faibles (Figure 3). La différence des courants entre cellules Vero et Hela est cohérente avec les mesures spectrophotométriques qui donnent également des réponses plus importantes avec les cellules Vero.
Pour vérifier que le flux d’électrons enregistré est bien lié à la viabilité des cellules, le même type d’essai a été répété en injectant également des cellules préalablement fixées au formaldéhyde ou des cellules lysées par ultrasons dans de l’eau ultra-pure (Figure 4). Dans tous les cas, le nombre de cellules mises en œuvre est d’un million.
L’injection de cellules viables conduit aux mêmes observations que précédemment : une augmentation très rapide de l’intensité du courant durant les quelques minutes qui suivent l’injection des cellules puis une évolution plus lente. Ici le temps de mesure a été prolongé au-delà des 120 minutes de l’essai précédent, faisant apparaitre une décroissance linéaire de l’intensité du courant au-delà de deux heures de mesure. L’injection de cellules fixées ou lysées ne provoque pas de modification de l’intensité. Seules les cellules viables sont détectées.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé in vitro d’analyse de la viabilité de cellules animales, ledit procédé comprenant :
L’obtention d’un échantillon contenant lesdites cellules animales ;
La mise en contact dans une cellule électrochimique dudit échantillon avec un médiateur d’oxydoréduction ; l’application d’un potentiel constant à ladite cellule électrochimique ; la mesure de l’intensité liée au transfert d’électrons par tPMET (trans- Plasma Membrane Electron Transport) ; et
- la détermination de la viabilité desdites cellules animales.
2. Procédé selon la revendication 1 tel que le médiateur d’oxydoréduction est choisi parmi le 2,6-dichlorophenolindophenol (DCIP) ; hexacyanoferrate III (Fe(CN)6 3 ) ; les dérivés de quinone tels que l’hydroquinone, ou la ménadione ; phénazine méthosulfate (PMS) ; les colorants à base de tétrazolium tels que le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol- 2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT), le 2,3-bis-(2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl)-2H- tétrazolium-5-carboxanilide (XTT), le disulfonate de 4-[3-(4-iodophényl)-2-(4-nitrophényl)- 2H-5-tétrazolio]-1 ,3-benzène (WST-1 ).
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 tel que la cellule électrochimique comprend une électrode de travail, une électrode auxiliaire, et éventuellement une électrode de référence.
4. Procédé selon la revendication 3 tel que l’intensité est mesurée entre l’électrode de travail et l’électrode auxiliaire.
5. Procédé selon la revendication 3 tel que ledit potentiel constant est appliqué entre l’électrode de travail et l’électrode de référence ou l’électrode auxiliaire utilisée comme pseudo-référence.
6. Procédé selon la revendication 5 tel que ledit potentiel constant est appliqué au moyen d’un potentiostat ou d’un générateur de tension.
7. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes tel que ledit potentiel constant appliqué est supérieur au potentiel redox dudit médiateur d’oxydoréduction et inférieur au potentiel d’oxydation de l’eau dans le milieu de mesure comprenant ledit échantillon et ledit médiateur d’oxydoréduction.
8. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes tel que la concentration cellulaire dans le milieu de mesure comprenant l’échantillon et le médiateur est comprise entre 1 000 et 1 000 000 cell. ml-1.
9. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes tel que la détermination de la viabilité cellulaire comprend la corrélation de l’intensité du courant à la viabilité cellulaire, pour un type de cellules donné, par étalonnage préalable.
10. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes tel que l’obtention dudit échantillon comprend l’étape de prélèvement à partir d’un milieu cellulaire contenant les cellules et la dilution éventuelle dans un milieu qui assure la survie des cellules le temps de la mesure.
11. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes tel que l’intensité du courant est mesurée en continu sur une période de temps déterminée ou est mesurée à différents instants t, pour ledit échantillon.
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