WO2023210752A1 - 免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性の検査方法 - Google Patents

免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性の検査方法 Download PDF

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WO2023210752A1
WO2023210752A1 PCT/JP2023/016673 JP2023016673W WO2023210752A1 WO 2023210752 A1 WO2023210752 A1 WO 2023210752A1 JP 2023016673 W JP2023016673 W JP 2023016673W WO 2023210752 A1 WO2023210752 A1 WO 2023210752A1
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liver cancer
fat
hepatocellular carcinoma
fat content
immune checkpoint
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PCT/JP2023/016673
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尚宏 小玉
大毅 村井
徹郎 竹原
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国立大学法人大阪大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/05—Detecting, measuring or recording for diagnosis by means of electric currents or magnetic fields; Measuring using microwaves or radio waves 
    • A61B5/055—Detecting, measuring or recording for diagnosis by means of electric currents or magnetic fields; Measuring using microwaves or radio waves  involving electronic [EMR] or nuclear [NMR] magnetic resonance, e.g. magnetic resonance imaging
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H30/00—ICT specially adapted for the handling or processing of medical images

Definitions

  • the present invention relates to a method for testing susceptibility to immune checkpoint inhibitors, a testing device, and a testing program.
  • HCC hepatocellular carcinoma
  • HCV Hepatitis C virus
  • Non-patent literature 5 non-alcoholic fatty liver disease
  • NAFLD non-alcoholic fatty liver disease
  • DM diabetes mellitus
  • Immune checkpoint inhibitors include monoclonal antibodies against cytotoxic T lymphocyte-associated protein 4 (CTLA-4), programmed cell death protein 1 (PD-1), and its ligand PD-L1 (CD274).
  • CTLA-4 cytotoxic T lymphocyte-associated protein 4
  • PD-1 programmed cell death protein 1
  • CD274 ligand PD-L1
  • atezolizumab anti-PD-L1 antibody
  • bevacizumab anti-VEGF antibody
  • PFS progression-free survival rate
  • Non-Patent Document 10 Combination therapy of atezolizumab and bevacizumab has become the first-choice drug for advanced hepatocellular carcinoma, but the current situation is that many patients do not receive any response. On the other hand, if the selected drug is ineffective, the treatment method must be changed, such as changing the drug, but if this is repeated, the liver reserve capacity gradually declines. Therefore, it is important to select the appropriate drug for each patient.
  • TIME tumor immune microenvironment
  • TILs tumor-infiltrating lymphocytes
  • Immunocomplements 13 and 14 Meta-analyses have shown that TIL levels and PD-1/PD-L1 expression are positively correlated with response to ICI in various types of cancer.
  • Non-Patent Documents 13 and 14 Meta-analyses have shown that TIL levels and PD-1/PD-L1 expression are positively correlated with response to ICI in various types of cancer.
  • Non-Patent Documents 13 and 14 the heterogeneity of tumor immunity in hepatocellular carcinoma, especially non-viral hepatocellular carcinoma, and its influence on the response to combined immunotherapy have not been clarified.
  • the present inventors set out to provide a biomarker that is an indicator of sensitivity to immune checkpoint inhibitors.
  • the present inventors focused on the high heterogeneity of molecular abnormalities and tumor immune microenvironment in liver cancer patients, conducted extensive research, and stratified liver cancer patients by prognosis and tumor immune microenvironment. We revealed a new relationship between fat-containing liver cancer and the tumor immune microenvironment, which is both immune-enhancing and immuno-depleted. Furthermore, the present invention was completed based on the discovery that patients with fatty liver cancer are sensitive to immunotherapy using immune checkpoint inhibitors.
  • the present invention consists of the following.
  • a method for testing sensitivity to immune checkpoint inhibitors comprising the step of measuring fat content in liver cancer tissue.
  • the fat content rate is calculated from an image obtained from the liver cancer tissue or a signal for displaying an image obtained from the liver cancer tissue.
  • the image is an MRI image.
  • the MRI image is a chemical shift imaging image. 5.
  • the reference value is a value selected from a range of 5% or more and 15% or less. 7.
  • the reference value for fat content measured by chemical shift imaging is 10%.
  • the immune checkpoint inhibitor is an anti-PD-L1 antibody or an anti-PD-1 antibody.
  • the liver cancer is hepatocellular carcinoma. 10.
  • a device for testing susceptibility to immune checkpoint inhibitors comprising: a signal detection unit that detects MR signals of liver cancer tissue; a fat content calculation unit that calculates the fat content in the liver cancer tissue from the detected MR signal; A device comprising an output section that compares the calculated fat content with a reference value and indicates a level of sensitivity to an immune checkpoint inhibitor.
  • a program for testing susceptibility to immune checkpoint inhibitors the program comprising: inputting MR signal data of liver cancer tissue; calculating fat content in liver cancer tissue from input MR signal data, and A program that executes the process of comparing the calculated fat content with a reference value and outputting the sensitivity level.
  • the present invention makes it possible to predict the effectiveness of immune checkpoint inhibitors and to select a treatment method appropriate for each individual liver cancer patient.
  • the method, device, and program of the present invention can be easily applied clinically. Furthermore, the testing method of the present invention is a testing method that is less burdensome for patients.
  • results of classification of non-viral hepatocellular carcinoma based on tumor immune microenvironment (A) Comparison of CIBERSORT scores for total immune cells and cytotoxic T cells between immune classes and other classes, (B) Comparison of the proportion of each molecular class in immune classes and other classes, (C) Comparison of the proportion of CTNNB1 or TP53 mutations between immune classes and other classes, (D) Hepatocellular carcinoma with CTNNB1 mutations (“+” in the figure) and hepatocellular carcinoma without CTNNB1 mutations (“ ⁇ ” in the figure) ”) and the CIBERSORT score of total immune cells are shown.
  • immunosorbent class means the immune class
  • others means other classes.
  • T and NT represent tumor and non-tumor, respectively
  • B CIBERSORT score of total immune cells of fat-containing hepatocellular carcinoma and non-fat-containing hepatocellular carcinoma
  • C Comparison of T cell exhaustion signature, stromal signature, enrichment score of TGF- ⁇ signaling pathway between fat-containing hepatocellular carcinoma and non-fat-containing hepatocellular carcinoma
  • D comparison between fat-containing hepatocellular carcinoma and non-fatty hepatocellular carcinoma.
  • Test example 2 Results of total fatty acid profiling by lipidomics.
  • Step 3 results of evaluation of the influence of lipid accumulation on tumor cells.
  • BSA bovine serum albumin
  • PA palmitic acid
  • A (A1) In-phase T1-weighted gradient-echo MR image (showing a clear high signal area (arrow) just below the diaphragm side of liver section VIII), (A2) Opposite-phase T1-weighted gradient-echo MR image corresponding to A1 (showing a decrease in signal intensity of the tumor (arrow)), (A3) hepatic arterial phase Gd-EOB-DTPA weighted MR image (showing arterial enhancement of the tumor (arrow)), (A4) hepatocytes after 20 minutes Phase Gd-EOB-DTPA-weighted MR image showing decreased signal intensity of the tumor (arrow); (B) Hematoxylin and eosin image of a tumor biopsy specimen.
  • Example 3 Results of evaluation of therapeutic response to immunotherapy for fat-containing hepatocellular carcinoma.
  • A Kaplan-Meier analysis of progression-free survival period of patients stratified by the presence or absence of steatosis in hepatocellular carcinoma
  • B Disease control rate (DCR) of patients stratified by the presence or absence of steatosis. The results are shown below.
  • Step 3) means fat-containing hepatocellular carcinoma
  • non-Steatotic HCC means non-fatty hepatocellular carcinoma.
  • the present invention relates to a method for testing susceptibility to immune checkpoint inhibitors, a testing device, and a testing program.
  • Immune checkpoint inhibitors conceptually reactivate exhausted effector T cells, and are more effective in tumor-infiltrated cytotoxic T cells and cancers with high PD-L1 expression ( JAMA Oncol. 2019 Aug 1;5(8):1195-1204.)
  • Immune checkpoint inhibitors whose sensitivity can be evaluated by the test method of the present invention include, but are not particularly limited to, anti-PD-1 antibodies, anti-PD-L1 antibodies, anti-PD-L2 antibodies, anti-CTLA4 antibodies, and anti-TIM-3 antibodies. Examples include at least one type of antibody against an immune checkpoint molecule, such as anti-LAG-3 antibody, anti-TIGIT antibody, or antibody against its ligand.
  • Suitable immune checkpoint inhibitors include anti-PD-L1 antibodies and anti-PD-1 antibodies, more preferably anti-PD-L1 antibodies.
  • the testing method of the present invention can also evaluate sensitivity to combination therapy of immune checkpoint inhibitors and other drugs.
  • Other drugs include angiogenesis inhibitors, anticancer antibiotics, hormone therapy agents, and the like.
  • the angiogenesis inhibitor include, but are not particularly limited to, preparations containing at least one type of antibody against vascular endothelial growth factor or its receptor, such as anti-VEGF antibody and anti-VEGFR2 antibody.
  • Preferred other drugs include angiogenesis inhibitors, and more preferably anti-VEGF antibodies.
  • the immune checkpoint inhibitor of the present invention is preferably an immune checkpoint inhibitor used in combination with another drug, more preferably an immune checkpoint inhibitor used in combination with an angiogenesis inhibitor. . More preferred are anti-PD-L1 antibodies or anti-PD-1 antibodies used in combination with an angiogenesis inhibitor, and most preferred are anti-PD-L1 antibodies used in combination with an anti-VEGF antibody.
  • antibody includes polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, antigen-binding fragments of the antibodies, chimeric antibodies containing the antigen-binding fragments, recombinant antibodies, and derivatives thereof.
  • the liver cancer targeted by the testing method of the present invention includes metastatic liver cancer and primary liver cancer, preferably primary liver cancer such as hepatocellular carcinoma and cholangiocellular carcinoma, and more preferably hepatocellular carcinoma.
  • Sensitivity to immune checkpoint inhibitors can also be referred to as reactivity to immune checkpoint inhibitors. Cancer immunotherapy using immune checkpoint inhibitors has been used for many patients with liver cancer, but the same effects are not achieved in all patients, with some patients having high sensitivity and others having low sensitivity. In addition, some patients may develop resistance to the drug even after treatment has been shown to be effective. Sensitivity to immune checkpoint inhibitors can be tested before starting treatment or during treatment. If the test shows that the patient is highly sensitive, good anticancer effects can be obtained by starting or continuing administration of an immune checkpoint inhibitor. If the test shows that the patient is less susceptible, other drugs or other treatment options can be chosen. In this way, it is possible to provide the patient with an appropriate treatment method and continue the treatment without reducing liver reserve.
  • the testing method of the present invention uses fat content as an index of sensitivity to immune checkpoint inhibitors, and is characterized by including a step of measuring fat content in liver cancer tissue.
  • the fat content of the present invention is calculated from an image obtained from a liver cancer tissue or a signal for image display obtained from a liver cancer tissue.
  • Images include medical images such as MRI images, CT images, ultrasound images, stained images of tissue biopsies, and pathological tissue images.
  • an MRI image is an image obtained by magnetic resonance imaging (MRI), preferably a chemical shift imaging image.
  • a chemical shift imaging image is an image obtained by chemical shift imaging.
  • liver cancer tissue in the present invention is a tumor tissue in the liver, and is not particularly limited as long as it can be tested for sensitivity to immune checkpoint inhibitors, but it is preferably a tissue that is suffering from or suspected of having liver cancer. This is the tumor tissue in the liver that is being examined.
  • Subjects to be tested are not particularly limited, but are preferably humans and pets, more preferably humans.
  • cancer tissue or “tumor tissue” refers to tissue containing at least one tumor cell, and may include connective tissue and blood vessels that support the tumor.
  • the fat content rate in the present invention is not particularly limited as long as it is an index indicating the proportion of fat in liver cancer tissue.
  • the fat content rate may be, for example, the proportion of fat in the entire liver cancer tissue, or may be the proportion of fat measured, calculated, or estimated in a part of the two-dimensional region or three-dimensional region of the liver cancer tissue.
  • the fat content rate may be the ratio of the number of cells having lipid droplets to the number of cells of the liver cancer tissue (ratio of cells having lipid droplets, hereinafter also referred to as fat conversion rate). It can also be a percentage of the area or volume of a lipid droplet obtained from an image. It may also be the proportion of fat components in liver cancer tissue.
  • it may be a fat percentage calculated from a signal for image display.
  • it may be a fat conversion rate calculated from an image obtained from a liver cancer tissue or a fat content rate calculated from a signal for image display obtained from a liver cancer tissue.
  • the fat conversion rate calculated from the stained image of tissue biopsy, the net MR signal intensity of MRI is decomposed into fat signal intensity and water signal intensity, and the fat signal intensity/(fat signal intensity + For example, the fat content calculated based on the water signal intensity).
  • the method of obtaining images for measuring fat content in the test method of the present invention is not particularly limited, and may be an invasive method or a non-invasive method, but unresectable advanced liver cancer that is a target of immunotherapy
  • Non-invasive methods are preferred because many patients are diagnosed and treated without tumor biopsy.
  • Invasive methods include, for example, tissue biopsy. As a specific example, it can be quantified by the ratio of cells in which large lipid droplets are present in a stained image of liver cancer tissue biopsy.
  • the non-invasive method is not particularly limited, and for example, MRI, CT, ultrasound, etc. can be used, and MRI is more preferable from the viewpoint of detection accuracy.
  • Methods for measuring fat content using MRI include existing methods, such as proton nuclear magnetic resonance spectroscopy ( 1 H-MRS), 3-point Dixon (DIXON) method, and multi-echo gradient-echo (MEGE) method.
  • chemical shift imaging, and frequency-selective imaging can be applied (Magn Reson Med Sci. 2011;10(1):41-8;Radiographics.2009Jan-Feb;29( 1):231-60.).
  • a suitable method for measuring fat content includes a method using chemical shift imaging (CSI). More preferably, the fat content is expressed as a fat fraction measured by CSI (FF CSI ) according to the following equation (1), which is determined by dividing the water signal and fat signal decomposed from the MR signal. It can be calculated based on the strength of , and more specifically, it can be calculated from the ratio of the fat signal strength to the sum of the fat signal strength and the water signal strength.
  • Equation (1) can be converted into the following equation (2).
  • the fat content is determined by the in-phase image and the opposed-phase image of the frequency of the MR signal obtained from the protons of water molecules and the protons of methylene groups of fat molecules. It can be calculated from the signal intensity in a common region of interest (ROI).
  • ROI region of interest
  • a region of interest is set on the tumor tissue of the MRI image, preferably the whole or part of the tumor tissue of the MRI image, more preferably the whole of the tumor tissue of the MRI image, and the average of the regions of interest in the in-phase images is set.
  • Equation (2) can be applied by setting the signal intensity as IP and setting the average signal intensity of the region of interest in the anti-phase image as OP.
  • the part of the tumor tissue is not particularly limited, but may be, for example, a part having an area of 1 mm 2 to 10,000 mm 2 , preferably 20 mm 2 to 1,000 mm 2 within the outline of the tumor tissue.
  • tumor tissue can be identified using an MRI image enhanced with a contrast agent.
  • the contrast agent used to identify the tumor tissue is not particularly limited as long as it can be used to detect liver cancer, and examples include sodium gadoxetate (Gd-EOB-DTPA) and superparamagnetic iron oxide (SPIO). etc. can be mentioned.
  • IP indicates the in-phase signal intensity expressed by the following equation (3)
  • OP indicates the anti-phase signal intensity expressed by the following equation (4). It shows the intensity (Opposed-phase intensity) (Radiographics.2009Jan-Feb;29(1):231-60.).
  • the testing method of the present invention can further include the step of comparing the fat content with a reference value.
  • the test method of the present invention can determine the level of sensitivity to immune checkpoint inhibitors by comparing the measured fat content with a preset reference value.
  • the sensitivity level include high sensitivity, high sensitivity, low sensitivity, resistance, and moderate sensitivity.
  • the sensitivity level can also be expressed numerically in stages, for example, sensitivity level 1, sensitivity level 2, etc. For example, if the calculated fat content is equal to or higher than a preset reference value, the sensitivity level can be determined to be high or sensitive to immune checkpoint inhibitors. If the calculated fat content is less than a preset reference value, the sensitivity level can be determined to be low sensitivity, high resistance, or resistance to the immune checkpoint inhibitor.
  • the reference value for being highly sensitive or susceptible to immune checkpoint inhibitors is a value selected from the range of 1% to 40%, for example, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%. %, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 17%, 20%, 25%, 30%, 40%. can.
  • a value selected from the range of 3% or more and 20% or less, more preferably 5% or more and 15% or less, and even more preferably 5% or more and 10% or less can be mentioned.
  • the reference value for low sensitivity, high resistance, or resistance to immune checkpoint inhibitors is a value selected from the range of 1% to 40%, for example, 40%, 30%, 25%.
  • % 20%, 17%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% can be mentioned.
  • a value selected from the range of 3% or more and 20% or less, more preferably 5% or more and 15% or less, and even more preferably 5% or more and 10% or less can be mentioned.
  • the standard value of fat content can be set for each method of measuring fat content.
  • the level of sensitivity to immune checkpoint inhibitors high sensitivity, low sensitivity, resistance, intermediate sensitivity, etc.
  • the reference values for the fat conversion rate ratio of the number of cells with fat droplets to the number of cells in the liver cancer tissue (ratio of cells with fat droplets)
  • the fat content FF CSI %) measured by chemical shift imaging. The setting of the reference value in will be further explained.
  • the standard value for fat conversion rate can be set as follows.
  • the reference value for being highly sensitive or susceptible to immune checkpoint inhibitors is a value selected from the range of 1% to 40%, for example, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%. %, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 17%, 20%, 25%, 30%, 40%. can.
  • the value is selected from the range of 3% to 15%, more preferably 4% to 10%, and even more preferably 5%.
  • the reference value for low sensitivity, high resistance, or resistance to immune checkpoint inhibitors is a value selected from the range of 1% to 40%, for example, 40%, 30%, 25%.
  • the value is selected from the range of 3% to 15%, more preferably 4% to 10%, and even more preferably 5%.
  • the reference value for the fat content FF CSI (%) measured by chemical shift imaging can be set as follows.
  • the reference value for being highly sensitive or susceptible to immune checkpoint inhibitors is a value selected from the range of 3% to 40%, for example, 3%, 4%, 5%, 6%, 7 %, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 17%, 20%, 25%, 30%, 40%.
  • the value is selected from the range of 5% to 20%, more preferably 5% to 15%, still more preferably 8% to 12%, and most preferably 10%.
  • the reference value for low sensitivity, high resistance, or resistance to immune checkpoint inhibitors is a value selected from the range of 3% to 40%, for example, 40%, 30%, 25%.
  • FF CSI (%) has a strong positive correlation with fat conversion rate. Therefore, the reference value of the fat content FF CSI (%) may be the same as the reference value of the fat conversion rate described above.
  • the present inventors conducted a study on fat-containing hepatocytes in which the proportion of cells in which large lipid droplets exist in liver cancer tissue is equal to or higher than a reference value. We revealed that cancer is characterized by an immunodepleted tumor immune microenvironment with high PD-L1 expression, and further revealed that fatty hepatocellular carcinoma is highly sensitive to immune checkpoint inhibitor therapy. I made it.
  • the device for testing sensitivity to immune checkpoint inhibitors of the present invention includes any one or more of the following configurations. a signal detection unit that detects MR signals of liver cancer tissue; a fat content calculation unit that calculates the fat content in the liver cancer tissue from the detected MR signal; An output section that compares the calculated fat content with a reference value and indicates the sensitivity level to immune checkpoint inhibitors.
  • the signal detection unit detects an MR signal generated by a nuclear magnetic resonance phenomenon.
  • the detected MR signal is transmitted and received as signal data to the fat content calculation section by a known data transmitting/receiving means.
  • the fat content calculation section calculates the fat content from the MR signal detected by the signal detection section.
  • a preferred calculation method is to decompose the net MR signal into a water signal and a fat signal, and calculate the fat content percentage from the fat signal intensity relative to the sum of the fat signal intensity and the water signal intensity.
  • the output unit compares the fat content calculated by the fat content calculation unit with a preset reference value, and indicates the sensitivity level to the immune checkpoint inhibitor according to the comparison result.
  • the sensitivity level may be the presence or absence of sensitivity, or may be quantified or stratified as a sensitivity level according to the high fat content.
  • the testing device of the present invention may be a standalone device or may be a device externally connected to a known MRI device. If the device is externally connected to the MRI device, the signal detection unit is included in the MRI device, and the fat content calculation unit and the output unit are provided in a computer that is externally connected to the MRI device and includes a CPU, a storage medium, etc. It is prepared for. Embodiments of each configuration related to the inspection device of the present invention are the same as the embodiments described in the inspection method.
  • the program for testing susceptibility to immune checkpoint inhibitors of the present invention executes any one or more of the following steps. inputting MR signal data of liver cancer tissue; calculating fat content in liver cancer tissue from input MR signal data, and A process of comparing the calculated fat content with a reference value and outputting the sensitivity level.
  • the step of inputting MR signal data data of an MR signal generated by a nuclear magnetic resonance phenomenon is input.
  • the fat content rate is calculated from the input MR signal data.
  • a preferred calculation method is to decompose the net MR signal data into water signal data and fat signal data, and calculate the fat content percentage from the fat signal intensity relative to the sum of the fat signal intensity and the water signal intensity.
  • the step of outputting the sensitivity level compares the calculated fat content with a preset reference value, and outputs the sensitivity level to the immune checkpoint inhibitor according to the comparison result.
  • Genomic DNA and total RNA were extracted from tissue specimens using the DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Venlo, The Netherlands) and the RNeasy Mini Kit (QIAGEN), respectively, according to previously reported procedures (Proc Natl Acad Sci U S A. 2018;115 :E10417-E10426.). The integrity of the DNA and RNA obtained was confirmed using a 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).
  • RNA sequence analysis Total RNA was isolated from liver tissue according to a previously reported procedure (Gastroenterology.2010Jun;138(7):2487-98,2498.e1-7.). Library preparation was performed using the TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit (Illumina, San Diego, CA, USA) on the Apollo Library Prep System (TaKaRa). Sequencing was performed on an Illumina HiSeq 3000 platform in 75 base single-end mode. Sequenced reads were mapped to the human reference genome sequence (hg19) using TopHat v2.1.1. The count data was normalized by the relative log expression (RLE) method or the trimmed mean of M values (TMM) method.
  • RLE relative log expression
  • TMM trimmed mean of M values
  • the amplified products were further ligated to barcode adapters (IonXpress Barcode Adapters; Thermo Fisher Scientific) for sample identification and transfected with Agencourt AMPure XP Reagent (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). It was purified using In the latter, 10 ng of DNA was used as template. Multiplex PCR, ligation of barcode adapters (IonCode Barcode Adapters; Thermo Fisher Scientific), and sample purification were performed automatically by the Ion Chef system (Thermo Fisher Scientific). The library was sequenced after emulsion PCR was performed with 14-16 samples per Ion PI chip v3 using the Ion PI HI-Q Chef Kit (Thermo Fisher Scientific).
  • the library was sequenced on an Ion Proton using an Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit.
  • the FASTQ files obtained from the sequencing were aligned to the human reference genome sequence (GRCh38) using the Burrows-Wheeler Alignment tool v0.7.12 (Bioinformatics. 2009 Jul 15;25(14):1754-60.).
  • the alignment was converted from the SAM (Sequence Alignment Map) format to a BAM (Binary Alignment Map) file by SAMtools v1.9 (Bioinformatics. 2009 Aug 15;25(16):2078-9.).
  • Realignment and base quality score recalibration were performed using Genome Analysis Toolkit version 4.1.
  • RNA-seq data Unsupervised hierarchical clustering of RNA-seq data, principal component analysis (PCA), detection of differentially expressed genes, and Gene Ontology (GO) biological process-focused generally applicable gene-set enrichment (GAGE) pathways Analysis was performed using iDEP92 (http://bioinformatics.sdstate.edu/idep92/).
  • the immune class was determined by nearest neighbor template prediction (NTP) analysis using immune subclass gene classifier (Gastroenterology. 2017 Sep; 153(3):812-826.).
  • NTP nearest neighbor template prediction
  • Single-sample gene set enrichment analysis (ssGSEA) and NTP use Gene Pattern (https://cloud.genepattern.org/gp/pages/index.jsf) I used it.
  • CIBERSORT analysis with RNA-seq data was performed in absolute mode using the LM22 signature matrix from the website (https://cibersort.stanford.edu/).
  • liver samples were embedded in paraffin blocks and stained with hematoxylin and eosin according to standard methods. Hepatocellular carcinoma in which lipid droplets were present in more than 5% of tumor cells was defined as steatotic HCC.
  • Immunohistochemistry for CD163, ⁇ SMA and PD-L1 was performed in a subset of patients from a cohort of 113 patients. Immunohistochemical staining was performed using 3 ⁇ m thick formalin after microwave heat-induced antigen retrieval using 10 mM TRIS-EDTA (pH 9.0 for CD163, pH 6.0 for ⁇ SMA and PD-L1). Performed on fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue sections.
  • FFPE fixed paraffin-embedded
  • the primary antibodies used were anti-CD163 antibody (Proteintech Rosemont, IL, USA), anti- ⁇ SMA antibody (Abcam, Cambridge, UK) and anti-PD-L1 antibody (Abcam, clone 28-8).
  • CD163 and ⁇ SMA the positive staining area was quantified using BZ-X700 (KEYENCE, Osaka, Japan) and used for comparative analysis between fat-containing and non-fat-containing hepatocellular carcinoma.
  • PD-L1 expression was assessed in neoplastic HCC cells. As previously reported for hepatocellular carcinoma and other cancers (Hepatology. 2016 Dec;64(6):2038-2046.), the percentage of neoplastic cells showing membranous staining was recorded and was at least 1%. Tumors with positive cells were classified as positive.
  • Hep3B human hepatoma cell line, THP-1 human monocyte-derived cell line, and LX-2 human hepatic stellate cell line were purchased from American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). These cell lines were cultured in DMEM or RPMI-1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum and antibiotics. All cells are confirmed to be free of pathogens and mycoplasma.
  • Bovine serum albumin (BSA, fat-free) was purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. and used as a control for palmitic acid (PA).
  • Palmitic acid was purchased from Sigma-Aldrich, dissolved in ethanol to prepare a stock solution, and diluted in cell growth medium for assay.
  • Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) was purchased from Sigma-Aldrich, dissolved in DMSO to prepare a stock solution, and diluted in cell growth medium for assay. PMA was used as a stimulant for the differentiation of THP-1 cells into macrophages.
  • Hep3B cells were plated at a density of 1.0 x 10 cells/well in 6-well plates one day before palmitic acid addition. The next day, cells were supplemented with palmitic acid at a concentration of 400 ⁇ M for 24 hours.
  • THP-1 cells were plated at a density of 1.0 ⁇ 10 5 cells/well in 6-well plates one day before PMA supplementation. The next day, the cells were induced to differentiate into macrophages by supplementing with PMA at a concentration of 10 ng/ml for 24 hours. The next day, after removing the supernatant containing palmitic acid, the cells were co-cultured with adipogenic Hep3B cells by transwell assay for 72 hours. LX-2 cells were plated at a density of 1.0 ⁇ 10 5 cells/well in 6-well plates one day before co-culture. The next day, after removing the supernatant containing palmitic acid, the cells were co-cultured with fat-accumulating Hep3B cells by transwell assay for 72 hours.
  • Flow cytometry One million cells were mixed with 0.25 ml of phycoerythrin (PE)-labeled anti-CD274 antibody (0.5 mg/ml) (BioLegend, San Diego, CA, USA) and incubated for 15 min at room temperature in the dark. Incubated. After washing, cells were analyzed using a Becton Dickinson FACS Canto II flow cytometer (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA).
  • PE phycoerythrin
  • Liver fatty acids were measured using Gas Chromatography-Flame Ionization Detector (GC-FID) as previously reported (Bio Protoc. 2020 May 5;10(9):e3613.). Briefly, frozen liver samples were weighed and ground using an oat mill (Tokken Co., Ltd.). Total lipids were extracted from the ground tissue powder by the Blight and Dyer method (Can J Biochem Physiol. 1959 Aug;37(8):911-7.). Methyl tricosanoate (C23:0) was added to the collected lipids as an internal standard.
  • GC-FID Gas Chromatography-Flame Ionization Detector
  • fatty acids were methylated using Fatty Acid Methylation Kit (Nacalai Tesque Co., Ltd.).
  • Fatty acid methyl esters were measured using a GC-2010 Plus system (Shimadzu Corporation) equipped with a flame ionization detector (FID).
  • the separation capillary column used was FAMEWAX, 30 m, inner diameter 0.25 mm, 0.25 ⁇ m (Restek Corporation).
  • the flow rate of the carrier gas was a linear velocity of 45 cm/sec.
  • the oven temperature was initially set at 140°C, increased to 200°C at a rate of 11°C/min, increased to 225°C at a rate of 3°C/min, and finally increased to 240°C at a rate of 20°C/min.
  • Each fatty acid methyl ester was prepared using a mixture of fatty acid methyl ester standards (Supelco 37 Component FAME Mix and 2-(diisopropylamino)ethyl methacrylate (DPA) (n-3) (Sigma-Aldrich); DPA (n -6) (NU-CHEK PREP, INC., Elysian, MN, USA); DTA(n-6) (Cayman)). The value of each fatty acid was normalized with the value of C23:0.
  • a p value ⁇ 0.05 indicates a statistically significant difference.
  • Prism ver. is used for analysis. 8.4.2 for Mac (GraphPad Prism, RRID: SCR_002798, San Diego, CA, USA) and SPSS software version 24 (IBM, Armonk, NY, USA) were used.
  • Test example 1 Stratification by multi-omics profiling At the Japan Cancer Research Foundation Cancer Research Ariake Hospital and Kagoshima University Hospital, between 2005 and 2018, there was no cure for non-viral hepatocellular carcinoma.
  • the subjects were 113 patients who underwent liver resection. We confirmed that these patients did not have chronic liver disease, including viral hepatitis and autoimmune hepatitis.
  • Flash-frozen hepatocellular carcinoma tissues were used for RNA and DNA sequencing, and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) hepatocellular carcinoma tissues and surrounding liver tissues were used for histological analysis. Tumor RNA sequencing was performed to understand the molecular abnormalities of non-viral hepatocellular carcinoma.
  • FFPE formalin-fixed paraffin-embedded
  • TIME tumor immune microenvironment
  • FIG. 1A represents p ⁇ 0.05 for immune class versus other classes.
  • This immune class showed an abundance of class II tumors and a significantly lower frequency of mutations in CTNNB1 (Fig. 1B,C).
  • FIGS. 1B and 1C represents p ⁇ 0.05 for immune class versus other classes.
  • non-viral hepatocellular carcinomas harboring CTNNB1 mutations showed significantly less intratumoral immune cell infiltration ( Figure 1D), which is consistent with previous reports (Clin Cancer Res. 2019 Apr 1;25( 7):2021-2023.).
  • * in FIG. 1D represents p ⁇ 0.05 for hepatocellular carcinoma with CTNNB1 mutation versus hepatocellular carcinoma without CTNNB1 mutation.
  • fatty-containing hepatocellular carcinomas showed upregulation of various immune checkpoints and transcription factors involved in T-cell exhaustion and markers of cancer-associated fibroblasts (CAFs).
  • CAFs cancer-associated fibroblasts
  • CIBERSORT analysis showed strong infiltration of M2 macrophages in fatty hepatocellular carcinomas, with upregulation of cytokines and chemokines involved in M2 polarization of macrophages and immunosuppression (Figure 2D). * in Figure 2D represents p ⁇ 0.05 for non-fat-containing hepatocellular carcinoma versus fat-containing hepatocellular carcinoma.
  • fatty hepatocellular carcinoma is an immunoenriched but immunodepleted tumor characterized by T cell exhaustion, M2 macrophage and CAF infiltration, high PD-L1 expression, and activation of TGF- ⁇ signaling. demonstrated the immune microenvironment.
  • the Visium library is available in the instruction manual (Visium Spatial Gene Expression User Guide; CG000239_VisiumSpatialGeneExpression_UserGuide_Rev_A.pd Prepared according to f).
  • the tissue was permeabilized for 3 minutes, which was confirmed as the optimal time in a tissue optimization time course experiment.
  • the library was sequenced with sufficient sequencing depth on the NovaSeq 6000 System (Illumina) using the NovaSeq S4 Reagent Kit (200 cycles, catalog number 20027466, Illumina).
  • Raw FASTQ files and histological images were downloaded from Space Ranger software v1.2.1 (https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/software/pipelines/latest/ installation) .
  • the tumor section was divided into 1,768 spots, and transcriptome data was obtained from each spot.
  • the expression of the immune cell population was high in cluster 2 (Figure 5).
  • ssGSEA showed that the stromal signature and T cell exhaustion signature were enhanced in cluster 2 ( Figure 5).
  • * in FIG. 5 represents p ⁇ 0.05 for cluster 2 versus other clusters.
  • Palmitic acid-treated Hep3B cells upregulated the expression levels of CD206 and IL10 in the co-cultured human macrophage cell line ( Figure 9B) and the expression level of TGFB1 in the co-cultured human hepatic stellate cell line ( Figure 9C).
  • the present inventors used multi-omics profiling to stratify non-viral hepatocellular carcinoma according to prognosis or tumor immune microenvironment (TIME), and found that intratumoral adipose tissue and immunity in hepatocellular carcinoma We clarified the relationship between exhaustion-type immunotherapy sensitivity and TIME.
  • TIME tumor immune microenvironment
  • Example 1 Measurement of fat content using histopathological images Tissue pieces of hepatocellular carcinoma (HCC) surgically excised from 20 hepatocellular carcinoma (HCC) patients were stained with hematoxylin and eosin (HE), and fat droplets were detected. The number of cells contained was measured, and the ratio of the number of cells containing lipid droplets to the number of cells in the hepatocellular carcinoma tissue was calculated as the fat content rate (fat conversion rate, histological fat accumulation) (FIG. 11).
  • HCC hepatocellular carcinoma
  • HE hematoxylin and eosin
  • Example 2 Measurement of fat content of hepatocellular carcinoma by MRI
  • the 20 HCC patients described in Example 1 underwent abdominal MRI examination including chemical shift imaging (CSI) before cancer tissue removal surgery.
  • the signal intensity of the largest tumor in each patient was obtained by drawing a region of interest (ROI) from in-phase and out-of-phase images at the same level.
  • the ROI was drawn by manually outlining the tumor using HorosTM software (Nimble Co LLC, d/b/a Purview).
  • Fat fraction measured by CSI (FF CSI ) was calculated using the following formula (2).
  • Five patients' hepatocellular carcinomas with fat content of 10% or more were determined to be sensitive to immune checkpoint inhibitors ( Figure 11).
  • IP indicates the average signal intensity of the region of interest in the in-phase image
  • OP indicates the average signal intensity of the region of interest in the anti-phase image
  • Example 3 Identification of fat-containing hepatocellular carcinoma by MRI and evaluation of treatment response to immunotherapy Between October 2020 and September 2021, hepatocellular carcinoma (HCC) was ), combined immunotherapy using atezolizumab (anti-PD-L1 antibody) and bevacizumab (anti-VEGF antibody) was performed. Thirty patients who underwent abdominal MRI including chemical shift imaging (CSI) before initiation of combined immunotherapy were retrospectively enrolled for the immunotherapy trial. Enrollment criteria were patients with measurable liver disease, no significant liver iron deposits, and patients who underwent initial treatment response evaluation. The signal intensity of the largest tumor in each patient was obtained by drawing a region of interest (ROI) from in-phase and out-of-phase images at the same level.
  • ROI region of interest
  • the ROI was drawn by manually outlining the tumor using HorosTM software (Nimble Co LLC, d/b/a Purview). Fat fraction measured by CSI (FF CSI ) was calculated using the above equation (2). Tumors with FF CSI of 10% or more were defined as fat-containing hepatocellular carcinoma. As a result, 7 out of 30 patients were classified as having fat-containing hepatocellular carcinoma. There was no significant difference in clinical background between fat-containing and non-fat-containing hepatocellular carcinoma. Chemical shift imaging images of hepatocellular carcinoma with FF CSI 35% (FIGS. 12A1-2), Gd-EOB-DTPA weighted MR images (FIGS. 12A3-4), and hematoxylin and eosin images of tumor biopsy specimens (FIG. 12B) are shown. .
  • DCR ⁇ (CR + PR + SD) / (CR + PR + SD + PD) ⁇ was 100%, and the treatment was effective for all patients.
  • the DCR was 56.5%, meaning that a sufficient therapeutic effect was not obtained in nearly half of the patients.
  • Patients with fat-containing hepatocellular carcinoma are sensitive to immune checkpoint inhibitors, and intratumoral fat content has been shown to be a novel biomarker to predict the effectiveness of treatment with immune checkpoint inhibitors in hepatocellular carcinoma. .
  • fat-containing hepatocellular carcinoma can be identified by chemical shift imaging. Identification of fat-containing hepatocellular carcinoma by chemical shift imaging can be easily applied clinically by combining it with sodium gadoxetate-enhanced MRI, which is used for diagnosis of advanced hepatocellular carcinoma. Fat-containing hepatocellular carcinoma patients identified by chemical shift imaging images showed significantly longer progression-free survival than non-fat-containing hepatocellular carcinoma patients on therapy with anti-PD-L1 and anti-VEGF antibodies. These results indicate that intratumoral fat accumulation serves as a novel biomarker to predict the effect of immune checkpoint inhibitor therapy on advanced hepatocellular carcinoma.

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Abstract

肝癌に対する免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性の指標となるバイオマーカーを提供し、個々の肝癌患者に適切な治療を提供することを課題とする。　肝癌患者を予後や腫瘍免疫微小環境によって層別化し、脂肪含有肝癌と免疫強化型でありながら免疫疲弊型である腫瘍免疫微小環境との間に新たな関連性があることを明らかにし、さらに脂肪含有肝癌患者は、免疫チェックポイント阻害剤を用いた免疫療法に感受性があることを見出した。肝癌組織中の脂肪含有率を免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性の指標とすることにより、免疫チェックポイント阻害剤の奏功を予測可能にし、個々の肝癌患者に適切な治療を提供できる。脂肪含有率は、肝癌組織の画像又は画像表示のための信号から算出できる。

Description

免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性の検査方法
　本発明は、免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性の検査方法、検査用装置及び検査用プログラムに関する。
　本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願2022-074111号優先権を請求する。
　肝臓癌は、世界の癌関連死亡原因の第４位である（非特許文献１）。免疫療法は肝細胞癌（ＨＣＣ）の標準的な治療法となっているが、その効果は未だ限定的である。肝細胞癌は、原発性肝癌の中で最も一般的なタイプであり、様々な病因を持つ不均一な疾患である（非特許文献２及び３）。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、肝細胞癌の主要な原因の一つであるが、近年のサーベイランスや治療の進歩により、ＨＣＶ関連肝細胞癌（ＨＣＶ－ＨＣＣ）の有病率は世界的に減少している（非特許文献４）。一方、非ウイルス性肝細胞癌の有病率は急速に増加しており、その原因は多量の飲酒、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、糖尿病（ＤＭ）など様々である（非特許文献５）。肝細胞癌の多様性を理解し、標的治療法を開発するためには、発がん過程の分子機構を解明する必要があり、遺伝子及びトランスクリプトームレベルでの肝細胞癌のプロファイリングが行われてきた（非特許文献６－８）。しかし、非ウイルス性肝細胞癌における分子的特徴と臨床病理学的特徴の関係は、十分に明らかにされていない。
　近年、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）が様々な種類の固形がんに顕著な有効性を有することが示されてきた（非特許文献９）。免疫チェックポイント阻害剤には、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１（ＰＤ－１）、及びそのリガンドＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）に対するモノクローナル抗体が含まれる。２０２０年、ＩＭｂｒａｖｅ１５０試験により、切除不能なＨＣＣ患者において、アテゾリズマブ（抗ＰＤ－Ｌ１抗体）及びベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ抗体）の併用療法がソラフェニブと比較して無増悪生存期間（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ－ｆｒｅｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅ：ＰＦＳ）と全生存期間（ＯＳ）を有意に改善したことが示され（非特許文献１０）、現在は、ＨＣＣ領域で複合免疫療法が注目されている。アテゾリズマブ及びベバシズマブの併用療法が進行性肝細胞癌に対する第一選択薬となっているが、効果を得られない患者が少なくないのが現状である。一方、選択薬剤が無効の場合、薬剤を変更するなど治療方法を変更することになるが、それを繰り返すと徐々に肝予備能が低下する。よって、各患者に適切な薬剤を選択することは重要である。
　一般に、腫瘍免疫微小環境（ＴＩＭＥ）は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬｓ）及び免疫チェックポイント発現のレベルに基づいて、免疫排除型、免疫活性型、免疫疲弊型のサブタイプに層別化されている（非特許文献１１及び１２）。メタ解析により、様々な種類の癌において、ＴＩＬレベル及びＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１発現がＩＣＩに対する反応と正の相関があることが示された（非特許文献１３及び１４）。しかし、肝細胞癌、特に非ウイルス性肝細胞癌における腫瘍免疫の不均一性、及び複合免疫療法に対する応答への影響については明らかにされていない。
CA Cancer J Clin. 2018 Nov;68(6):394-424. Recent Results Cancer Res. 2013;190:21-32. Gastroenterology. 2019 Jul;157(1):54-64. Liver Int. 2013 Oct;33(9):1420-7 World J Hepatol. 2013 Jun 27; 5(6): 311-322. Nat Genet. 2015 May;47(5):505-511. Cancer Res. 2009 Sep 15;69(18):7385-92. Cancer Res. 2008 Aug 15;68(16):6779-88. Immunotherapy. 2016 Jun;8(7):821-37. N Engl J Med. 2020 May 14;382(20):1894-1905. J Hepatol. 2020 Feb;72(2):215-229. Gastroenterology. 2017 Sep;153(3):812-826. EClinical Medicine. 2021 Sep 16;41:101134. JAMA Oncol. 2019 Aug 1;5(8):1195-1204.
　本発明者らは、肝癌に対する薬物療法における免疫チェックポイント阻害剤による免疫療法の低い有効性に鑑み、免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性の指標となるバイオマーカーを提供することを課題とした。
　本発明者らは上記課題を解決するために肝癌患者の分子異常や腫瘍免疫微小環境の高い不均一性に着目し、鋭意研究を重ね、肝癌患者を予後や腫瘍免疫微小環境によって層別化し、脂肪含有肝癌と免疫強化型でありながら免疫疲弊型である腫瘍免疫微小環境との間に新たな関連性があることを明らかにした。さらに脂肪含有肝癌患者は、免疫チェックポイント阻害剤を用いた免疫療法に感受性があることを見出し、本発明を完成した。
　即ち本発明は、以下よりなる。
　１．肝癌組織中の脂肪含有率を測定する工程を含む、免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性の検査方法。
　２．前記脂肪含有率は、前記肝癌組織から得られた画像又は前記肝癌組織から得られた画像表示のための信号から算出される、前項１に記載の方法。
　３．前記画像がＭＲＩ画像である、前項２に記載の方法。
　４．前記ＭＲＩ画像が化学シフトイメージング画像である、前項３に記載の方法。
　５．前記脂肪含有率を基準値と比較する工程をさらに含み、前記脂肪含有率が前記基準値以上である場合に、免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性が高い又は感受性があると判定される、前項１～４のいずれか１に記載の方法。
　６．前記基準値が５％以上１５％以下の範囲から選択される値である、前項５に記載の方法。
　７．化学シフトイメージングにより測定された脂肪含有率における前記基準値が１０％である、前項６に記載の方法。
　８．前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ－１抗体である、前項１～７のいずれか１に記載の方法。
　９．前記肝癌が、肝細胞癌である、前項１～８のいずれか１に記載の方法。
　１０．免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性の検査用装置であって、
　肝癌組織のＭＲ信号を検出する信号検出部、
　検出されたＭＲ信号から肝癌組織中の脂肪含有率を算出する脂肪含有率算出部、及び、
　算出された脂肪含有率と基準値とを比較し、免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性レベルを示す出力部
を備えた、装置。
　１１．免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性の検査用プログラムであって、
　肝癌組織のＭＲ信号データを入力する工程、
　入力されたＭＲ信号データから肝癌組織中の脂肪含有率を算出する工程、及び、
　算出された脂肪含有率と基準値とを比較し、感受性レベルを出力する工程
を実行させる、プログラム。
　本発明は、免疫チェックポイント阻害剤の有効性を予測可能にするものであり、個々の肝癌患者に適切な治療方法の選択を可能にする。
　多くの肝癌患者が、一般診療では腫瘍生検を受けず画像診断を行っているため、本発明の方法、装置及びプログラムは臨床応用が容易である。また、本発明の検査方法は、患者にとって負担の少ない検査方法である。
腫瘍免疫微小環境に基づく非ウイルス性肝細胞癌の分類の結果。（Ａ）総免疫細胞と細胞傷害性Ｔ細胞のＣＩＢＥＲＳＯＲＴスコアの免疫クラスとそれ以外のクラスとの比較、（Ｂ）免疫クラスとそれ以外のクラスとにおける各分子クラスの割合の比較、（Ｃ）免疫クラスとそれ以外のクラスとにおけるＣＴＮＮＢ１又はＴＰ５３変異の割合の比較、（Ｄ）ＣＴＮＮＢ１変異のある肝細胞癌（図中の「＋」）とＣＴＮＮＢ１変異のない肝細胞癌（図中の「－」）との総免疫細胞のＣＩＢＥＲＳＯＲＴスコアの比較の結果を示す。図において「ｉｍｍｕｎｅ　ｃｌａｓｓ」は免疫クラスを意味し、「ｏｔｈｅｒｓ」はそれ以外のクラスを意味する。（試験例２） 腫瘍免疫微小環境に基づく脂肪含有肝細胞癌の分類の結果。（Ａ）脂肪含有肝細胞癌の代表的な画像（Ｔ及びＮＴは、それぞれ腫瘍および非腫瘍を表す）、（Ｂ）総免疫細胞のＣＩＢＥＲＳＯＲＴスコアの脂肪含有肝細胞癌と非脂肪含有肝細胞癌との比較、（Ｃ）脂肪含有肝細胞癌と非脂肪含有肝細胞癌のＴ細胞疲弊シグネチャー、間質シグネチャー、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路のｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔスコアの比較、（Ｄ）脂肪含有肝細胞癌と非脂肪含有肝細胞癌とのＭ２マクロファージのＣＩＢＥＲＳＯＲＴスコアの比較の結果を示す。図において「ｓｔｅａｔｏｔｉｃ」は脂肪含有肝細胞癌を意味し、「ｎｏｎ－ｓｔｅａｔｏｔｉｃ」は非脂肪含有肝細胞癌を意味する。（試験例２） 免疫組織化学的解析の結果。脂肪含有肝細胞癌と非脂肪含有肝細胞癌とにおけるＰＤ－Ｌ１、αＳＭＡ、ＣＤ１６３の免疫組織化学染色の代表的な画像を示す。図において「ｓｔｅａｔｏｔｉｃ」は脂肪含有肝細胞癌を意味し、「ｎｏｎ－ｓｔｅａｔｏｔｉｃ」は非脂肪含有肝細胞癌を意味する。（試験例２） 腫瘍免疫微小環境の解析の結果。（Ａ）脂肪含有肝細胞癌と非脂肪含有肝細胞癌とにおけるＰＤ－Ｌ１陽性肝細胞癌の割合の比較、（Ｂ）脂肪含有肝細胞癌と非脂肪含有肝細胞癌とのαＳＭＡ陽性領域の割合の比較及び（Ｃ）脂肪含有肝細胞癌と非脂肪含有肝細胞癌とにおけるＣＤ１６３陽性領域の割合の比較の結果を示す。図において「ｓｔｅａｔｏｔｉｃ」は脂肪含有肝細胞癌を意味し、「ｎｏｎ－ｓｔｅａｔｏｔｉｃ」は非脂肪含有肝細胞癌を意味する。（試験例２） 脂肪含有肝細胞癌における空間的トランスクリプトーム解析の結果。各クラスターにおける免疫シグネチャー、間質シグネチャー、Ｔ細胞疲弊シグネチャーのｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔスコアを示す。（試験例２） 脂肪含有肝細胞癌における空間的トランスクリプトーム解析の結果。（Ａ）ＣＤ８Ａ陽性及びＮＲ４Ａ１陽性と定義された疲弊型の細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含むスポットにおける各クラスターの割合を示す円グラフ、（Ｂ）疲弊型のＣＴＬスポットとそれ以外のスポットとにおけるＴ細胞疲弊マーカーであるＣＤ８Ａ及びＮＲ４Ａ１、Ｍ２マクロファージマーカーであるＣＤ１６３、ＣＡＦマーカーであるＶＩＭ、ＴＧＦＢ１、及び内部標準であるＧＡＰＤＨの発現量を示したバイオリン図を示す。図において「Ｅｘｈａｕｓｔｅｄ　ＣＴＬ」は疲弊型の細胞障害性Ｔリンパ球のスポットを意味し、「ｏｔｈｅｒｓ」はそれ以外のスポットを意味する。（試験例２） リピドミクスによる総脂肪酸プロファイリングの結果。図において「Ｓｔｅａｔｏｔｉｃ　ＨＣＣ」は脂肪含有肝細胞癌を意味し、「ｎｏｎ－Ｓｔｅａｔｏｔｉｃ　ＨＣＣ」は非脂肪含有肝細胞癌を意味する。（試験例３） 腫瘍細胞への脂質蓄積の影響評価の結果。（Ａ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はパルミチン酸（ＰＡ）添加の２４時間後のＨｅｐ３Ｂ細胞におけるＢＯＤＩＰＹ染色像、（Ｂ）ＢＳＡ又はＰＡ添加の２４時間後のＨｅｐ３Ｂ細胞におけるＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）の相対的ｍＲＮＡレベル、（Ｃ）ヒストグラム（左）及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）（右）として示した、ＢＳＡ又はＰＡ添加の２４時間後のＨｅｐ３Ｂ細胞におけるＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）タンパク質レベルのフローサイトメトリー分析の結果を示す。図において「－」はウシ血清アルブミン添加を意味し、「＋」はパルミチン酸添加を意味する。（試験例３） 腫瘍細胞への脂質蓄積の影響評価の結果。（Ａ）ＢＳＡ又はＰＡ添加の２４時間後のＨｅｐ３Ｂ細胞におけるＣＳＦ１、ＣＸＣＬ８及びＴＧＦＢ１の相対的ｍＲＮＡレベル、（Ｂ）ＢＳＡ又はＰＡ添加Ｈｅｐ３Ｂ細胞と３日間共培養した後のマクロファージにおけるＣＤ２０６とＩＬ１０の相対的ｍＲＮＡレベル、（Ｃ）ＢＳＡ又はＰＡを添加されたＨｅｐ３Ｂ細胞と３日間共培養したＬＸ－２細胞におけるＴＧＦＢ１の相対的ｍＲＮＡレベルを示す。図において「－」はウシ血清アルブミン添加（脂肪蓄積なし）を意味し、「＋」はパルミチン酸添加（脂肪蓄積あり）を意味する。（試験例３） 腫瘍細胞への脂質蓄積の影響評価の結果。脂肪含有肝細胞癌及び非脂肪含有肝細胞癌におけるＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）、ＣＳＦ１、ＣＸＣＬ８、ＴＧＦＢ１、ＣＤ２０６及びＩＬ１０の相対的ｍＲＮＡレベルを示す。図において「ｓｔｅａｔｏｔｉｃ」は脂肪含有肝細胞癌を意味し、「ｎｏｎ－ｓｔｅａｔｏｔｉｃ」は非脂肪含有肝細胞癌を意味する。（試験例３） 外科的に切除された２０例の肝細胞癌試料におけるＦＦＣＳＩと組織学的脂肪蓄積との相関図。（実施例２） ＭＲＩによる脂肪含有肝細胞癌の同定。（Ａ）（Ａ１）同位相Ｔ１強調グラジエントエコーＭＲ画像（肝切片ＶＩＩＩの横隔膜側直下に明確な高信号域（矢印）を示す）、（Ａ２）Ａ１に対応する逆位相Ｔ１強調グラジエントエコーＭＲ画像（腫瘍（矢印）の信号強度の低下を示す）、（Ａ３）肝動脈相Ｇｄ－ＥＯＢ－ＤＴＰＡ強調ＭＲ画像（腫瘍（矢印）の動脈性増強を示す）、（Ａ４）２０分後の肝細胞相Ｇｄ－ＥＯＢ－ＤＴＰＡ－強調ＭＲ画像（腫瘍（矢印）の信号強度の低下を示す）、（Ｂ）腫瘍生検標本のヘマトキシリン・エオジン像を示す。図においてバーは２００μｍを示す。（実施例３） 脂肪含有肝細胞癌の免疫療法に対する治療応答性の評価の結果。（Ａ）肝細胞癌における脂肪化の有無により層別化された患者の無増悪生存期間のＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ解析、（Ｂ）脂肪化の有無により層別化された患者の病勢コントロール率（ＤＣＲ）の結果を示す。図において「Ｓｔｅａｔｏｔｉｃ　ＨＣＣ」は脂肪含有肝細胞癌を意味し、「ｎｏｎ－Ｓｔｅａｔｏｔｉｃ　ＨＣＣ」は非脂肪含有肝細胞癌を意味する。（実施例３）
　本発明は、免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性の検査方法、検査用装置及び検査用プログラムに関する。
　免疫チェックポイント阻害剤は、概念的には疲弊したエフェクターＴ細胞を再活性化するものであり、腫瘍に浸潤した細胞傷害性Ｔ細胞やＰＤ－Ｌ１の発現が高い癌においてより効果的である（JAMA Oncol. 2019 Aug 1;5(8):1195-1204.）。本発明の検査方法により感受性を評価できる免疫チェックポイント阻害剤としては、特に限定されないが、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体等の免疫チェックポイント分子に対する抗体若しくはそのリガンドに対する抗体の少なくとも１種を挙げることができる。好適な免疫チェックポイント阻害剤としては、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び抗ＰＤ－１抗体が挙げられ、さらに好ましくは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体が挙げられる。
　本発明の検査方法は、免疫チェックポイント阻害剤と他の薬剤との併用療法に対する感受性も評価できる。他の薬剤としては、血管新生阻害剤、抗癌性抗生物質、ホルモン療法剤等が挙げられる。血管新生阻害剤としては、特に限定されないが、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦＲ２抗体等の血管内皮増殖因子に対する抗体若しくはその受容体に対する抗体の少なくとも１種を含む製剤を挙げることができる。好ましい他の薬剤としては、血管新生阻害剤が挙げられ、さらに好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体が挙げられる。
　本発明の免疫チェックポイント阻害剤は、好適には、他の薬剤と併用される免疫チェックポイント阻害剤であって、より好適には、血管新生阻害剤と併用される免疫チェックポイント阻害剤である。さらに好ましくは、血管新生阻害剤と併用される抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ－１抗体であり、最も好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体と併用される抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。
　本発明において「抗体」とは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、該抗体の抗原結合断片、該抗原結合断片を含むキメラ抗体、組換え抗体及びこれらの誘導体を含む。
　本発明の検査方法の対象となる肝癌は、転移性肝癌、原発性肝癌を含み、好適には、肝細胞癌、胆管細胞癌等の原発性肝癌であり、さらに好ましくは肝細胞癌である。
　免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性は、免疫チェックポイント阻害剤に対する反応性と言い換えることもできる。免疫チェックポイント阻害剤による癌免疫療法は、多くの肝癌患者に用いられているが、すべての患者で同様の効果が得られるわけではなく、感受性が高い患者と低い患者が存在する。また、治療効果が認められても後に耐性になる患者もいる。免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性は、治療開始前、又は治療中に検査することができる。検査により感受性が高いことが判明した場合は、免疫チェックポイント阻害剤を投与開始又は継続することにより良好な抗癌効果を得ることができる。検査により感受性が低いことが判明した場合は、他の薬剤の投与又は他の治療方法を選択することができる。このように、患者に適切な治療方法を提供し、肝予備能を低下させることなく治療を継続することを可能にする。
　本発明の検査方法は、脂肪含有率を免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性の指標とするものであり、肝癌組織中の脂肪含有率を測定する工程を含むことを特徴とする。肝癌組織中の脂肪含有率を測定する方法に特に制限はない。好適には、本発明の脂肪含有率は、肝癌組織から得られた画像又は肝癌組織から得られた画像表示のための信号から算出される。画像には、ＭＲＩ画像、ＣＴ画像、超音波画像、組織生検の染色像、病理組織画像等の医用画像が含まれる。本発明において、ＭＲＩ画像とは、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）により得られた画像であり、好ましくは化学シフトイメージング画像である。本発明において、化学シフトイメージング画像とは、化学シフトイメージングにより得られた画像である。肝癌組織から画像又は画像表示のための信号を得る方法は、公知の方法を用いることができ、例えば、腹部ＭＲＩ、腹部ＣＴ（コンピュータ断層撮影）、腹部エコー、肝生検組織切片のＨＥ染色等が挙げられる。本発明における「肝癌組織」は、肝臓中の腫瘍組織であり、免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性の検査対象となり得るものであれば特に限定されないが、好ましくは肝癌を罹患している又は罹患が疑われる検査対象の肝臓中の腫瘍組織である。検査対象は特に限定されないが、好ましくは、ヒトおよび愛玩動物であり、より好ましくはヒトである。用語「癌組織」又は「腫瘍組織」とは、少なくとも一つの腫瘍細胞を含む組織をいい、腫瘍を支持する結合組織や血管を含み得る。
　本発明における脂肪含有率は、肝癌組織中の脂肪の割合を示す指標であれば特に限定されない。脂肪含有率は、例えば、肝癌組織全体における脂肪の割合であってもよく、肝癌組織の一部の二次元領域又は三次元領域において測定、算出又は推定された脂肪の割合であってもよい。脂肪含有率は、肝癌組織の細胞数に対する脂肪滴を有する細胞数の割合（脂肪滴の存在する細胞の比率、以下脂肪化率ともいう）であり得る。また、画像から得られる脂肪滴の面積又は体積の割合であり得る。また、肝癌組織中の脂肪成分の割合であり得る。また、画像表示のための信号から算出される脂肪の割合であり得る。また、肝癌組織から得られた画像から算出された脂肪化率又は肝癌組織から得られた画像表示のための信号から算出された脂肪含有率であり得る。より具体的な例としては、組織生検の染色画像から算出された脂肪化率、ＭＲＩの正味ＭＲ信号強度を脂肪信号強度と水信号強度に分解して、脂肪信号強度／（脂肪信号強度＋水信号強度）により算出された脂肪含有率を挙げることができる。
　本発明の検査方法における脂肪含有率を測定するための画像を得る方法は、特に限定されず、侵襲的方法又は非侵襲的方法であってもよいが、免疫療法の対象となる切除不能進行肝癌患者の多くは腫瘍生検を行わずに診断及び治療が行われるため、非侵襲的方法が好ましい。侵襲的方法としては、例えば組織生検が挙げられる。具体例としては、肝癌組織生検の染色像における大型脂肪滴の存在する細胞の比率により定量化可能である。非侵襲的方法としては、特に限定されず、例えばＭＲＩ、ＣＴ、超音波等を用いることができ、検出精度の観点からＭＲＩがより好ましい。
　ＭＲＩを用いた脂肪含有率の測定方法は、既存の方法、例えばプロトン核磁気共鳴スペクトロスコピー（１Ｈ－ＭＲＳ）法、３－ｐｏｉｎｔ　Ｄｉｘｏｎ（ＤＩＸＯＮ）法、ｍｕｌｔｉ－ｅｃｈｏ　ｇｒａｄｉｅｎｔ－ｅｃｈｏ（ＭＥＧＥ）法、化学シフトイメージング（ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｓｈｉｆｔ　ｉｍａｇｉｎｇ）、周波数選択イメージング（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｉｍａｇｉｎｇ）を適用することができる（Magn Reson Med Sci. 2011;10(1):41-8；Radiographics.2009Jan-Feb;29(1):231-60.）。好適な脂肪含有率の測定方法としては、化学シフトイメージング（ＣＳＩ）を用いる方法が挙げられる。より好ましくは、脂肪含有率は、以下の式（１）により、ＣＳＩにより測定された脂肪含有率（ｆａｔ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ＣＳＩ；ＦＦＣＳＩ）として、ＭＲ信号から分解された水の信号及び脂肪の信号の強度に基づき算出可能であり、より詳しくは脂肪信号強度と水信号強度の合計に対する脂肪信号強度の割合から算出可能である。
　式（１）中、「Ｓｆａｔ」は脂肪の信号強度、「Ｓｗａｔｅｒ」は水の信号強度を表す。式（１）は、以下の式（２）に変換可能である。式（２）では、脂肪含有率は、水分子のプロトンと脂肪分子のメチレン基のプロトンとから得られるＭＲ信号の周波数の同位相（ｉｎ－ｐｈａｓｅ）画像及び逆位相（ｏｐｐｏｓｅｄ－ｐｈａｓｅ）画像の共通する関心領域（ＲＯＩ）における信号強度から算出可能である。具体的には、ＭＲＩ画像の腫瘍組織上、好ましくはＭＲＩ画像の腫瘍組織の全体又は一部、より好ましくはＭＲＩ画像の腫瘍組織の全体に関心領域を設定し、同位相画像における関心領域の平均信号強度をＩＰとして、逆位相画像における関心領域の平均信号強度をＯＰとして、式（２）に適用することができる。腫瘍組織の一部とは、特に限定されないが、例えば、腫瘍組織の輪郭内の１ｍｍ２～１００００ｍｍ２、好ましくは２０ｍｍ２～１０００ｍｍ２の面積を有する部分であり得る。関心領域の設定では、造影剤により強調されたＭＲＩ画像を用いて腫瘍組織を特定することができる。腫瘍組織の特定のために用いる造影剤は、肝癌の検出に利用可能であれば特に限定されず、例えばガドキセト酸ナトリウム（Ｇｄ－ＥＯＢ－ＤＴＰＡ）、超常磁性酸化鉄（Ｓｕｐｅｒ　Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｉｒｏｎ　Ｏｘｉｄｅ；ＳＰＩＯ）等を挙げることができる。
　式（２）中、「ＩＰ」は以下の式（３）で表される同位相信号強度（Ｉｎ－ｐｈａｓｅ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を示し、「ＯＰ」は以下の式（４）で表される逆位相信号強度（Ｏｐｐｏｓｅｄ－ｐｈａｓｅ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を示す（Radiographics.2009Jan-Feb;29(1):231-60.）。
　式（３）中、「Ｓｗａｔｅｒ」は水の信号強度、「Ｓｆａｔ」は脂肪の信号強度を表す。
　式（４）中、「Ｓｗａｔｅｒ」は水の信号強度、「Ｓｆａｔ」は脂肪の信号強度を表す。
　本発明の検査方法は、脂肪含有率を基準値と比較する工程をさらに含むことができる。本発明の検査方法は、測定された脂肪含有率を予め設定された基準値と比較することにより免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性レベルを決定することができる。感受性レベルとしては、例えば、感受性が高い、感受性がある、感受性が低い、抵抗性である、感受性が中程度である等が挙げられる。感受性レベルを段階的に数字で表すこともでき、例えば、感受性レベル１、感受性レベル２等とすることもできる。例えば、算出した脂肪含有率が予め設定した基準値以上である場合には、感受性レベルは、免疫チェックポイント阻害剤に対して感受性が高い又は感受性があると判定することができる。算出した脂肪含有率が予め設定した基準値未満である場合には、感受性レベルは、免疫チェックポイント阻害剤に対して感受性が低い、抵抗性が高い又は抵抗性であると判定することができる。
　免疫チェックポイント阻害剤に対して感受性が高い又は感受性があるとする基準値は、１％以上４０％以下の範囲から選択される値、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、４０％を挙げることができる。好ましくは３％以上２０％以下、より好ましくは５％以上１５％以下、さらに好ましくは５％以上１０％以下の範囲から選択される値を挙げることができる。免疫チェックポイント阻害剤に対して感受性が低い、抵抗性が高い又は抵抗性であるとする基準値は、１％以上４０％以下の範囲から選択される値、例えば、４０％、３０％、２５％、２０％、１７％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％を挙げることができる。好ましくは３％以上２０％以下、より好ましくは５％以上１５％以下、さらに好ましくは５％以上１０％以下の範囲から選択される値を挙げることができる。
　脂肪含有率の基準値は、脂肪含有率の測定方法毎に設定し得る。基準値と脂肪含有率を比較することにより免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性レベル（感受性が高い、感受性が低い、抵抗性である、感受性が中程度である等）を決定することができる。以下に脂肪化率（肝癌組織の細胞数に対する脂肪滴を有する細胞数の割合（脂肪滴の存在する細胞の比率））における基準値及び化学シフトイメージングにより測定された脂肪含有率ＦＦＣＳＩ（％）における基準値の設定について更に説明する。
　脂肪化率における基準値は、以下のように設定することができる。免疫チェックポイント阻害剤に対して感受性が高い又は感受性があるとする基準値は、１％以上４０％以下の範囲から選択される値、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、４０％を挙げることができる。好ましくは３％以上１５％以下、より好ましくは４％以上１０％以下の範囲から選択される値、さらに好ましくは５％を挙げることができる。免疫チェックポイント阻害剤に対して感受性が低い、抵抗性が高い又は抵抗性であるとする基準値は、１％以上４０％以下の範囲から選択される値、例えば、４０％、３０％、２５％、２０％、１７％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％を挙げることができる。好ましくは３％以上１５％以下、より好ましくは４％以上１０％以下の範囲から選択される値、さらに好ましくは５％を挙げることができる。
　化学シフトイメージングにより測定された脂肪含有率ＦＦＣＳＩ（％）における基準値は、以下のように設定することができる。免疫チェックポイント阻害剤に対して感受性が高い又は感受性があるとする基準値は、３％以上４０％以下の範囲から選択される値、例えば、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、４０％を挙げることができる。好ましくは５％以上２０％以下、より好ましくは５％以上１５％以下、さらに好ましくは８％以上１２％以下の範囲から選択される値、最も好ましくは１０％を挙げることができる。免疫チェックポイント阻害剤に対して感受性が低い、抵抗性が高い又は抵抗性であるとする基準値は、３％以上４０％以下の範囲から選択される値、例えば、４０％、３０％、２５％、２０％、１７％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％を挙げることができる。好ましくは５％以上２０％以下、より好ましくは５％以上１５％以下、さらに好ましくは８％以上１２％以下の範囲から選択される値、最も好ましくは１０％を挙げることができる。ＦＦＣＳＩ（％）は、脂肪化率と強い正の相関がある。よって、脂肪含有率ＦＦＣＳＩ（％）の基準値は前述の脂肪化率の基準値と同一であってもよい。
　後述する実施例は本発明の範囲を限定するものではないが、本発明者らは、実施例において、肝癌組織中の大型脂肪滴の存在する細胞の比率が基準値以上である脂肪含有肝細胞癌が、ＰＤ－Ｌ１高発現の免疫疲弊型の腫瘍免疫微小環境を特徴とすることを明らかにし、さらに脂肪含有肝細胞癌は、免疫チェックポイント阻害剤療法に対して高い感受性を有することを明らかにした。
（免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性の検査用装置）
　本発明の免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性の検査用装置は、以下のいずれか１以上の構成を備える。
　肝癌組織のＭＲ信号を検出する信号検出部、
　検出されたＭＲ信号から肝癌組織中の脂肪含有率を算出する脂肪含有率算出部、及び、
　算出された脂肪含有率と基準値とを比較し、免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性レベルを示す出力部。
　信号検出部は、核磁気共鳴現象により発生するＭＲ信号を検出する。検出されたＭＲ信号は、信号データとして公知のデータ送受信手段により脂肪含有率算出部へ送受信される。脂肪含有率算出部は、信号検出部において検出されたＭＲ信号から脂肪含有率を算出する。好適な算出方法としては、正味ＭＲ信号を水信号及び脂肪信号に分解し、脂肪信号強度と水信号強度の合計に対する脂肪信号強度から脂肪含有率を算出する。出力部は、脂肪含有率算出部において算出された脂肪含有率と予め設定された基準値とを比較し、比較結果に応じて免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性レベルを示す。感受性レベルは、感受性の有無であってもよく、脂肪含有率の高さに応じた感受性レベルとして数値化又は層別化されてもよい。本発明の検査用装置は、単独の装置であってもよく、公知のＭＲＩ装置に外部接続された装置であってもよい。ＭＲＩ装置に外部接続された装置である場合、信号検出部は、ＭＲＩ装置に備えられており、脂肪含有率算出部及び出力部は、ＭＲＩ装置に外部接続され、ＣＰＵ及び記憶媒体等を備えるコンピュータに備えられている。本発明の検査用装置に係る各構成の実施形態については前記検査方法に記載の実施形態と同様である。
（免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性の検査用プログラム）
　本発明の免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性の検査用プログラムは、以下のいずれか１以上の工程を実行させる。
　肝癌組織のＭＲ信号データを入力する工程、
　入力されたＭＲ信号データから肝癌組織中の脂肪含有率を算出する工程、及び、
　算出された脂肪含有率と基準値とを比較し、感受性レベルを出力する工程。
　ＭＲ信号データを入力する工程は、核磁気共鳴現象により発生したＭＲ信号のデータを入力する。脂肪含有率を算出する工程は、入力されたＭＲ信号データから脂肪含有率を算出する。好適な算出方法としては、正味ＭＲ信号データを水信号データ及び脂肪信号データに分解し、脂肪信号強度と水信号強度の合計に対する脂肪信号強度から脂肪含有率を算出する。感受性レベルを出力する工程は、算出された脂肪含有率と予め設定された基準値とを比較し、比較結果に応じて免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性レベルを出力する。本発明の検査用プログラムを、公知のＭＲＩ装置若しくはそれに外部接続された装置にインストールすることにより、免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性を検査することができる。本発明の検査用プログラムに係る各構成の実施形態については前記検査方法に記載の実施形態と同様である。
　以下、本発明の理解を深めるために実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。以下の試験は、ヘルシンキ宣言の原則に合致するものであり、大阪大学医学部付属病院倫理委員会により承認され、全ての患者から同意を得て行われた。
１．方法
（ＤＮＡ及びＲＮＡの抽出）
　ＤＮｅａｓｙ　Ｂｌｏｏｄ　＆　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、フェンロ、オランダ）及びＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、それぞれ既報の手順で組織標本からゲノムＤＮＡ及びｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した（Proc Natl Acad Sci U S A. 2018;115:E10417-E10426.）。得られたＤＮＡとＲＮＡの完全性は、２１００　Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ　（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンタクララ、カリフォルニア州、米国）を用いて確認した。
（ＲＮＡシークエンス解析）
　肝組織からｔｏｔａｌ　ＲＮＡを既報の手順で単離した（Gastroenterology.2010Jun;138(7):2487-98,2498.e1-7.）。ライブラリー調製は、Ａｐｏｌｌｏ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｐｒｅｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＴａＫａＲａ）上でＴｒｕＳｅｑ　Ｓｔｒａｎｄｅｄ　ｍＲＮＡ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を用いて実施した。配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ　ＨｉＳｅｑ　３０００プラットフォームで、７５塩基シングルエンドモードで実施した。配列決定されたリードをＴｏｐＨａｔ　ｖ２．１．１を用いてヒト参照ゲノム配列（ｈｇ１９）にマッピングした。カウントデータはｒｅｌａｔｉｖｅ　ｌｏｇ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＲＬＥ）法若しくはｔｒｉｍｍｅｄ　ｍｅａｎ　ｏｆ　Ｍ　ｖａｌｕｅｓ（ＴＭＭ）法により正規化した。
（ゲノムシークエンス解析）
　ライブラリー調製後、肝細胞癌において遺伝子変異の頻発が以前に報告されている６９遺伝子（表１）のコーディング領域とＴＥＲＴプロモーター領域をターゲットとしたアンプリコンシーケンス用のカスタムＰＣＲプライマーセットをＩｏｎ　ＡｍｐｌｉＳｅｑ　Ｄｅｓｉｇｎｅｒで設計した。ライブラリー作製には、５５組の腫瘍組織と正常組織から抽出したゲノムＤＮＡを使用した。ライブラリーの調製には、２つの異なる方法を使用した。１つはＩｏｎ　ＡｍｐｌｉＳｅｑ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｋｉｔ　２．０（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）、もう１つはＩｏｎ　ＡｍｐｌｉＳｅｑ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ　Ｃｈｅｆ　ＤＬ８（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。前者では、３０ｎｇのＤＮＡを鋳型としてマルチプレックスＰＣＲを行った。増幅産物はさらに、サンプル同定のためにバーコードアダプター（ＩｏｎＸｐｒｅｓｓ　Ｂａｒｃｏｄｅ　Ａｄａｐｔｅｒｓ；Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にライゲーションし、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ　ＡＭＰｕｒｅ　ＸＰ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ、ブレア、カリフォルニア州、米国）を用いて精製した。後者では、１０ｎｇのＤＮＡを鋳型として使用した。マルチプレックスＰＣＲ、バーコードアダプター（ＩｏｎＣｏｄｅ　Ｂａｒｃｏｄｅ　Ａｄａｐｔｅｒｓ；Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のライゲーション及びサンプル精製は、Ｉｏｎ　Ｃｈｅｆ　ｓｙｓｔｅｍ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により自動的に行われた。Ｉｏｎ　ＰＩ　ＨＩ－Ｑ　Ｃｈｅｆ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、Ｉｏｎ　ＰＩ　ｃｈｉｐ　ｖ３あたり１４－１６サンプルでエマルジョンＰＣＲを行った後、ライブラリーをシークエンシングした。Ｉｏｎ　ＰＩ　Ｈｉ－Ｑ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　２００　Ｋｉｔを使用したＩｏｎ　Ｐｒｏｔｏｎによりライブラリーをシークエンシングした。シークエンシングから得られたＦＡＳＴＱファイルをＢｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｔｏｏｌ　ｖ０．７．１２（Bioinformatics. 2009 Jul 15;25(14):1754-60.）を用いてヒト参照ゲノム配列（ＧＲＣｈ３８）にアライメントした。アラインメントは、ＳＡＭ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｍａｐ）形式からＳＡＭｔｏｏｌｓ　ｖ１．９（Bioinformatics. 2009 Aug 15;25(16):2078-9.）によってＢＡＭ（Ｂｉｎａｒｙ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｍａｐ）ファイルに変換された。再アラインメントと塩基品質スコアの再キャリブレーションは、Ｇｅｎｏｍｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｔｏｏｌｋｉｔ　ｖｅｒｓｉｏｎ　４．１を使って行った。一塩基変異（ＳＮＶ）解析を行うために、ＳＡＭｔｏｏｌｓを用いてＢＡＭファイルからｐｉｌｅｕｐファイルを作成し、ＶａｒＳｃａｎ２　ｖ２．４（Genome Res. 2012 Mar;22(3):568-76.）を用いて体細胞変異を検出した。フィルタリングされた腫瘍組織特異的変異のうち、マイナーアレル頻度が０．０５未満で、フィッシャーの正確検定によりＰ＜０．０５で有意とされるものを変異遺伝子候補とした。フィルターを通過したバリアントをＡＮＮＯＶＡＲ（Nucleic Acids Res. 2010 Sep;38(16):e164.）を用いてアノテーションし、ｄｂＳＮＰ（ｂｕｉｌｄ　１５０）及びＣＯＳＭＩＣ（ｖｅｒ．　９０）データベースと比較した。非同義変異の機能予測情報は、ＳＩＦＴとＰｏｌｙｐｈｅｎデータベースから得た。コピー数変異（ＣＮＶ）を検出するために、５５の正常組織サンプルセットと１つの腫瘍サンプルとのＢＡＭファイル間のコピー数比較に、ＤｅＣＯＮ（Wellcome Open Res. 2016 Nov 25;1:20.）を使用した。
（バイオインフォマティクス解析）
　ＲＮＡ－ｓｅｑデータの教師なし階層型クラスタリング、主成分分析（ＰＣＡ）、差次発現遺伝子の検出、及びＧｅｎｅ　Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）生物学的プロセスに焦点を当てたｇｅｎｅｒａｌｌｙ　ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ　ｇｅｎｅ－ｓｅｔ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＧＡＧＥ）パスウェイ解析をｉＤＥＰ９２（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｓｄｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／ｉｄｅｐ９２／）を用いて行った。免疫クラスは、ｉｍｍｕｎｅ　ｓｕｂｃｌａｓｓ　ｇｅｎｅ　ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ（Gastroenterology. 2017 Sep;153(3):812-826.）を用いた最近接テンプレート予測（ＮＴＰ）解析により決定した。Ｓｉｎｇｌｅ－ｓａｍｐｌｅ　ｇｅｎｅ　ｓｅｔ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ（ｓｓＧＳＥＡ）及びＮＴＰは、Ｇｅｎｅ　Ｐａｔｔｅｒｎ（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｏｕｄ．ｇｅｎｅｐａｔｔｅｒｎ．ｏｒｇ／ｇｐ／ｐａｇｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｆ）を用いて行った。ＲＮＡ－ｓｅｑデータを用いたＣＩＢＥＲＳＯＲＴ解析は、ウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｉｂｅｒｓｏｒｔ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／）のＬＭ２２シグネチャーマトリックスを用いて絶対モードで行った。
（免疫組織化学）
　肝臓試料は、標準法に従いパラフィンブロックに包埋し、ヘマトキシリン・エオジン染色を行った。５％を超える腫瘍細胞に脂肪滴が存在する肝細胞癌を、脂肪含有肝細胞癌（ｓｔｅａｔｏｔｉｃ　ＨＣＣ）と定義した。ＣＤ１６３、αＳＭＡ及びＰＤ－Ｌ１の免疫組織化学は、１１３人の患者コホートからの患者のサブセットにおいて実施された。免疫組織化学染色は、１０ｍＭ　ＴＲＩＳ－ＥＤＴＡ（ＣＤ１６３はｐＨ９．０、αＳＭＡ及びＰＤ－Ｌ１はｐＨ６．０）を用いたマイクロ波による加熱抗原賦活化（ｈｅａｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）後の３μｍ厚のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片に対して行った。使用した一次抗体は、抗ＣＤ１６３抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈローズモント、イリノイ州、米国）、抗αＳＭＡ抗体（Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、イギリス）及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体（Ａｂｃａｍ、ｃｌｏｎｅ　２８－８）であった。ＣＤ１６３及びαＳＭＡについては、ＢＺ－Ｘ７００（ＫＥＹＥＮＣＥ、大阪、日本）を用いて染色陽性領域を定量化し、脂肪含有肝細胞癌と非脂肪含有肝細胞癌との比較解析に使用した。ＰＤ－Ｌ１発現は、腫瘍性肝細胞癌（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ＨＣＣ）細胞で評価した。以前に肝細胞癌や他の癌で報告されたように（Hepatology. 2016 Dec;64(6):2038-2046.）、膜状の染色を示す腫瘍性細胞の割合を記録し、少なくとも１％の陽性細胞を有する腫瘍を陽性として分類した。
（細胞株及び試薬）
　Ｈｅｐ３Ｂヒト肝癌細胞株、ＴＨＰ－１ヒト単球由来細胞株、ＬＸ－２ヒト肝星細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア州、米国）から購入した。これらの細胞株は、１０％子牛胎児血清及び抗生物質を添加したＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ－１６４０培地中で培養した。全ての細胞は、病原体やマイコプラズマが存在しないことが確認されている。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、無脂肪）は和光純薬株式会社から購入し、パルミチン酸（ＰＡ）のコントロールとして使用した。パルミチン酸は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、エタノールに溶解してストック溶液を調製し、アッセイ用に細胞増殖培地で希釈した。ホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート（ＰＭＡ）をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、ＤＭＳＯに溶解してストック溶液を調製し、アッセイ用に細胞増殖培地で希釈した。ＰＭＡは、ＴＨＰ－１細胞のマクロファージへの分化のための刺激剤として使用された。
（パルミチン酸の添加）
　Ｈｅｐ３Ｂ細胞は、パルミチン酸添加の１日前に６ウェルプレートに１．０×１０５細胞／ウェルの密度でプレーティングした。翌日、４００μＭの濃度で２４時間パルミチン酸を細胞に補給した。
（脂肪蓄積型Ｈｅｐ３Ｂ細胞とマクロファージ又は線維芽細胞との共培養系）
　ＴＨＰ－１細胞は、ＰＭＡ補給の１日前に６ウェルプレートに１．０×１０５細胞／ウェルの密度でプレーティングした。翌日、１０ｎｇ／ｍｌの濃度で２４時間ＰＭＡを補給することにより、該細胞をマクロファージへ分化誘導した。翌日、パルミチン酸を含有する上清を除去した後、７２時間のトランスウェルアッセイにより該細胞を脂肪蓄積型Ｈｅｐ３Ｂ細胞と共培養した。ＬＸ－２細胞は、共培養の１日前に６ウェルプレートに１．０×１０５細胞／ウェルの密度でプレーティングした。翌日、パルミチン酸を含有する上清を除去した後、７２時間のトランスウェルアッセイにより脂肪蓄積型Ｈｅｐ３Ｂ細胞と共培養した。
（リアルタイムＰＣＲ）
　ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造元の指示に従い、細胞からトータルＲＮＡを抽出した。ＲＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＶＩＬＯ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて逆転写した。ｑＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙ　プローブ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ　１２Ｋ　Ｆｌｅｘ　ＲＴ－ＰＣＲ　システムを使用して既報（Gastroenterology. 2016 Aug;151(2):324-337.e12.）と同様に実施した。
（フローサイトメトリー）
　１００万個の細胞を０．２５ｍｌのフィコエリスリン（ＰＥ）標識抗ＣＤ２７４抗体（０．５　ｍｇ／ｍｌ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）と混合し、１５分間暗所にて室温でインキュベートした。洗浄後、細胞をＢｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ＦＡＣＳ　Ｃａｎｔｏ　ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を用いて解析した。
（リピドミクスに基づく総脂肪酸プロファイリング）
　肝臓の脂肪酸は、Ｇａｓ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｆｌａｍｅ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＧＣ－ＦＩＤ）を用いて既報の通りに測定した（Bio Protoc. 2020 May 5;10(9):e3613.）。簡潔には、凍結した肝臓試料を秤量し、オートミル（株式会社トッケン）を用いて粉砕した。粉砕した組織粉からＢｌｉｇｈ　ａｎｄ　Ｄｙｅｒ法（Can J Biochem Physiol. 1959 Aug;37(8):911-7.）により総脂質を抽出した。内部標準として、回収した脂質にトリコサン酸メチル（Ｃ２３：０）を添加した。その後、Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄ　Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ナカライテスク株式会社）を用いて脂肪酸をメチル化した。水素炎イオン化型検出器（ＦＩＤ）を搭載したＧＣ－２０１０　Ｐｌｕｓシステム（株式会社島津製作所）により脂肪酸メチルエステルを測定した。分離キャピラリーカラムは、ＦＡＭＥＷＡＸ、３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、０．２５μｍ（Ｒｅｓｔｅｋ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用した。キャリアガスの流速は、線速度４５ｃｍ／ｓｅｃとした。オーブン温度は、最初１４０℃に設定し、１１℃／分の速度で２００℃まで上昇し、３℃／分の速度で２２５℃まで上昇し、最後に２０℃／分の速度で２４０℃まで上昇させ、この温度で５分間維持した。スプリット注入モードでの注入量は２μＬであった。各脂肪酸メチルエステルは、校正のために脂肪酸メチルエステル標準物質の混合物（Ｓｕｐｅｌｃｏ　３７　Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ＦＡＭＥ　Ｍｉｘ及び２－（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリラート（ＤＰＡ）（ｎ－３）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）；ＤＰＡ（ｎ－６）（ＮＵ－ＣＨＥＫ　ＰＲＥＰ，　ＩＮＣ．、エリジアン、ミネソタ州、米国）；ＤＴＡ（ｎ－６）（Ｃａｙｍａｎ））を用いて同定及び定量した。各脂肪酸の値は、Ｃ２３：０の値で正規化した。
（統計解析）
　データは、平均値±標準偏差で表した。統計解析は、対応のない（ｕｎｐａｉｒｅｄ）群間の差を評価するために、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ検定を用いて行った。多重比較のために一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定を行った。Ｆｉｓｈｅｒ'ｓ　ｅｘａｃｔ検定をカテゴリーデータの解析のために使用した。相関をピアソンの積率相関係数を用いて評価した。全生存期間（ＯＳ）又は無増悪生存期間（ＰＦＳ）における差を解析するためにＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法及びｌｏｇ－ｒａｎｋ検定を使用した。非ウイルス性肝細胞癌における免疫クラスと関連する因子を分析するために単変量ロジスティック回帰分析及び多変量ロジスティック回帰分析を用いた。オッズ比と９５％信頼区間（ＣＩ）を示す。特に断りのない限り、ｐ値＜０．０５は統計的有意差を示すものとする。解析にはＰｒｉｓｍ　ｖｅｒ．８．４．２　ｆｏｒ　Ｍａｃ　（ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍ、ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿００２７９８、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）及びＳＰＳＳ　ｓｏｆｔｗａｒｅ　ｖｅｒｓｉｏｎ　２４（ＩＢＭ、アーモンク、ニューヨーク州、米国）を使用した。
２．試験例
（試験例１）マルチオミクスプロファイリングによる層別化
　日本がん研究振興財団がん研有明病院及び鹿児島大学病院において、２００５年から２０１８年の間に非ウイルス性肝細胞癌に対して治癒的肝切除を行った患者１１３名を対象とした。これらの患者にはウイルス性肝炎及び自己免疫性肝炎を含む慢性肝疾患がないことを確認した。ＲＮＡ及びＤＮＡの配列決定のために、瞬間凍結肝細胞癌組織を使用し、組織学的解析にはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）肝細胞癌組織とその周辺肝組織を使用した。非ウイルス性肝細胞癌の分子異常を理解するために腫瘍ＲＮＡ配列決定を行った。トランスクリプトミクスの教師なし階層型クラスター分析により、１１３人の非ウイルス性肝細胞癌患者は３つの分子クラス（クラスＩ、ＩＩ、ＩＩＩ）に分類された。クラスＩはｎ＝３６、クラスＩＩはｎ＝４６、クラスＩＩＩはｎ＝３１であった。クラスＩの患者は最も予後が悪く、クラスＩＩＩの患者は最も予後が良かった（ｐ＜０．０５）。次に、肝細胞癌で遺伝子異常が複数名で報告（Cell. 2017 Jun 15;169(7):1327-1341.e23.）されている６９遺伝子を対象としたパネルを用いて、非ウイルス性肝細胞癌患者５５名の癌ゲノム配列決定を行った。体細胞変異は５５例中５０例で検出され、ＴＥＲＴプロモーター領域（５８％）、ＣＴＮＮＢ１（３６％）、ＴＰ５３（１８％）において頻繁に観察された（図１Ｃ）。統合解析の結果、クラスＩはＴＰ５３変異（ｐ＜０．０５）、クラスＩＩＩはＣＴＮＮＢ１変異（ｐ＜０．０５）と密接な関連があることが明らかとなった。ＴＰ５３変異を有する非ウイルス性肝細胞癌患者の予後は最も悪く、ＣＴＮＮＢ１変異を有する非ウイルス性ＨＣＣ患者の予後は最も良好であった（ＴＰ５３対ＣＴＮＮＢ１についてｐ＜０．０５）。
（試験例２）腫瘍免疫微小環境（ＴＩＭＥ）に基づく非ウイルス性肝細胞癌の分類
　非ウイルス性肝細胞癌を腫瘍免疫微小環境に基づいて分類するために、試験例１の患者１１３名を対象として腫瘍のトランスクリプトームのＮＴＰ（ｎｅａｒｅｓｔ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ）解析を行った。ＮＴＰ解析の結果、肝細胞癌における強い腫瘍内免疫細胞浸潤を特徴とするサブタイプとして報告されている免疫クラス（Gastroenterology. 2017 Sep;153(3):812-826.）を同定した。１１３個の腫瘍のうち４３個がこの免疫クラスに分類され、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴ解析により腫瘍内免疫細胞の推定総数と細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が有意に高いレベルを示した（図１Ａ）。図１Ａ中の＊は、免疫クラス対それ以外のクラスについてｐ＜０．０５を表す。この免疫クラスでは、クラスＩＩの腫瘍が豊富で、ＣＴＮＮＢ１の変異の頻度が有意に少ないことが示された（図１Ｂ、Ｃ）。図１Ｂ及び図１Ｃ中の＊は、免疫クラス対それ以外のクラスについてｐ＜０．０５を表す。一貫して、ＣＴＮＮＢ１変異を有する非ウイルス性肝細胞癌では、腫瘍内免疫細胞浸潤が有意に少ないことが示され（図１Ｄ）、これは以前の報告（Clin Cancer Res. 2019 Apr 1;25(7):2021-2023.）と一致している。図１Ｄ中の＊は、ＣＴＮＮＢ１変異を有する肝細胞癌対ＣＴＮＮＢ１変異を有しない肝細胞癌についてｐ＜０．０５を表す。
　この免疫クラスを特徴づける臨床病理学的因子を探索したところ、肝細胞癌における脂肪化がこの免疫クラスと強く関連していることを見出した。実際、非ウイルス性肝細胞癌の２３％を占める脂肪含有肝細胞癌は（図２Ａ）、非脂肪含有肝細胞癌よりも腫瘍内免疫細胞の総数が有意に高レベルであることが示された（図２Ｂ）。図２Ｂ中の＊は、非脂肪含有肝細胞癌対脂肪含有肝細胞癌についてｐ＜０．０５を表す。興味深いことに、ｓｓＧＳＥＡ及びパスウェイ解析により、脂肪含有肝細胞癌においてＴＧＦ－βシグナルの活性化とともに、Ｔ細胞疲弊シグネチャーと間質シグネチャーが、有意に高レベルであることが示された（図２Ｃ）。これらはすべて、腫瘍免疫の疲弊の特徴であった（Nat Med. 2010 Oct;16(10):1147-51.；NatCommun4,2612(2013).；Cancer Cell. 2018 Apr9;33(4):547-562.：Immunity. 2014 Sep 18;41(3):427-439.）。図２Ｃ中の＊は、非脂肪含有肝細胞癌対脂肪含有肝細胞癌についてｐ＜０．０５を表す。一貫して、脂肪含有肝細胞癌は、様々な免疫チェックポイント及びＴ細胞の疲弊に関与する転写因子及び癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）のマーカーの上方調節を示した。さらに、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴ解析により、マクロファージのＭ２分極化及び免疫抑制に関与するサイトカイン及びケモカインの上方調節とともに、脂肪含有肝細胞癌におけるＭ２マクロファージの強い浸潤が示された（図２Ｄ）。図２Ｄ中の＊は、非脂肪含有肝細胞癌対脂肪含有肝細胞癌についてｐ＜０．０５を表す。免疫組織化学的解析により、腫瘍細胞におけるＰＤ－Ｌ１の上方調節及び非ウイルス性肝細胞癌におけるＣＡＦ及びＭ２マクロファージの強い浸潤が示された（図３及び図４Ａ～Ｃ）。図４Ａ～Ｃにおいて、各群ｎ＝５～１３であり、＊は、非脂肪含有肝細胞癌対脂肪含有肝細胞癌についてｐ＜０．０５を表す。全体として、脂肪含有肝細胞癌は、Ｔ細胞の疲弊、Ｍ２マクロファージ及びＣＡＦの浸潤、高いＰＤ－Ｌ１発現、ＴＧＦ－βシグナルの活性化によって特徴づけられる免疫強化型であるが免疫疲弊型の腫瘍免疫微小環境を示した。
　脂肪含有肝細胞癌における免疫疲弊型の腫瘍免疫微小環境の特徴をさらに明らかにするために、Ｖｉｓｉｕｍプラットフォーム上での空間的遺伝子発現解析により脂肪含有肝細胞癌におけるＭ２マクロファージ、ＣＡＦ及びＣＴＬのトポグラフィーを検討した。脂肪含有肝細胞癌の試料サンプルは、１０ｍｍ×１０ｍｍのクライオモールドでＯＣＴコンパウンド（ＴｉｓｓｕｅＴｅｋ、サクラ）にて－８０℃で包埋し、１０μｍの厚さで切片化した（Ｌｅｉｃａ　ＣＭ３０５０　Ｓ）。Ｖｉｓｉｕｍ用ライブラリーは、指示書（Ｖｉｓｉｕｍ　Ｓｐａｔｉａｌ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｕｓｅｒ　Ｇｕｉｄｅ；ＣＧ０００２３９＿ＶｉｓｉｕｍＳｐａｔｉａｌＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＿ＵｓｅｒＧｕｉｄｅ＿Ｒｅｖ＿Ａ．ｐｄｆ）に従って調製した。組織に対し、組織最適化タイムコース実験にて最適時間として確認された３分間の透過処理を行った。ライブラリーは、ＮｏｖａＳｅｑ　Ｓ４　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（２００ｃｙｃｌｅｓ、カタログ番号２００２７４６６、イルミナ）を用いて、ＮｏｖａＳｅｑ　６０００　Ｓｙｓｔｅｍ（イルミナ）で十分な配列深度で配列決定された。生のＦＡＳＴＱファイル及び組織学的画像は、Ｓｐａｃｅ　Ｒａｎｇｅｒソフトウェアｖ１．２．１（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｕｐｐｏｒｔ．１０ｘｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ／ｓｐａｔｉａｌ－ｇｅｎｅ－　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐｉｐｅｌｉｎｅｓ／ｌａｔｅｓｔ／ｉｎｓｔａｌｌａｔｉｏｎ）を用いて処理された。組織画像を用いた空間的発現の可視化のために、各試料の生のＶｉｓｉｕｍファイルをＬｏｕｐｅ　Ｂｒｏｗｓｅｒソフトウェアｖ４．０．０（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｕｐｐｏｒｔ．１０ｘｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ／ｓｐａｔｉａｌ－ｇｅｎｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ｌａｔｅｓｔ）に読み込ませた。その結果、平均塩基配列リード数２８８，７０２を取得し、スポットあたりの中央値３，３００の遺伝子を同定した。
　腫瘍切片を１，７６８のスポットに分割し、各スポットからトランスクリプトームデータを取得した。グラフベースのクラスタリングにより、すべてのスポットを６つのクラスターに分けたところ、クラスター２において免疫細胞集団の発現が高かった（図５）。ｓｓＧＳＥＡにより間質シグネチャー及びＴ細胞疲弊シグネチャーがクラスター２において増強されていることが示された（図５）。図５中の＊は、クラスター２対それ以外のクラスターについてｐ＜０．０５を表す。ＣＤ８Ａ及びＮＲ４Ａ１の二重陽性スポットを疲弊したＣＴＬを含むスポットとして抽出したところ、これらのスポットのほぼ半分がクラスター２に含まれることを見出した（図６Ａ）。次に、疲弊したＣＴＬを含むスポットと含まないスポットでトランスクリプトームプロファイルを比較した。その結果、疲弊したＣＴＬを有するスポットにおいてＴＧＦＢ１レベルの上昇に加えて、Ｍ２マクロファージマーカーＣＤ１６３及びＣＡＦマーカーＶＩＭの発現が増加していることを見出した（図６Ｂ）。図６Ｂ中の＊は、疲弊したＣＴＬ２を有するスポット対それ以外のスポットについてｐ＜０．０５を表す。これらの結果は、Ｍ２マクロファージ及びＣＡＦがＴＧＦ－βを産生し、近接した周囲のＣＴＬの疲弊を促進し、脂肪含有肝細胞癌において免疫疲弊型のＴＩＭＥを形成していることを示唆するものであった。
（試験例３）腫瘍細胞への脂質蓄積の影響評価
　脂肪含有肝細胞癌における腫瘍内状態と免疫疲弊ＴＩＭＥとの間の機構的関連について検討した。この目的のために、まずリピドミクスに基づく総脂肪酸プロファイリングを行い、非脂肪含有肝細胞癌に比べ、脂肪含有肝細胞癌ではパルミチン酸（Ｃ１６：０）及びパルミトレイン酸（Ｃ１６：１ｎ－７）のレベルが増加することを見出した（図７）。そこで、インビトロでの脂肪含有肝細胞癌細胞に対するパルミチン酸蓄積の影響を検討した。Ｈｅｐ３Ｂ細胞にパルミチン酸を添加すると、脂質の蓄積（図８Ａ）、ｍＲＮＡ及び表面タンパク質レベルでのＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）の発現の上方調節（図８Ｂ、Ｃ）、さらにＣＳＦ１、ＣＸＣＬ８及びＴＧＦＢ１の発現レベルの上方調節を誘導した（図９Ａ）。そこで、我々はさらに腫瘍細胞におけるパルミチン酸蓄積による周囲のマクロファージ及び線維芽細胞への影響をインビトロで検討した。パルミチン酸処理したＨｅｐ３Ｂ細胞は、共培養ヒトマクロファージ細胞株におけるＣＤ２０６及びＩＬ１０の発現レベル（図９Ｂ）、及び共培養ヒト肝星細胞株におけるＴＧＦＢ１の発現レベル（図９Ｃ）を上方調節した。図８Ｂ、Ｃ及び図９Ａ～Ｃにおいて、各群ｎ＝３であり、＊は、パルミチン酸添加群対ＢＳＡ添加（対照）群についてｐ＜０．０５を表す。これらの免疫抑制性サイトカイン及びケモカインの上方調節は、インビボでの脂肪含有肝細胞癌においても観察された（図１０）。図１０中の＊は、非脂肪含有肝細胞癌対脂肪含有肝細胞癌についてｐ＜０．０５を表す。これらのデータは、腫瘍細胞におけるパルミチン酸蓄積が免疫抑制を促進し、脂肪含有肝細胞癌における免疫疲弊型のＴＩＭＥの発達に寄与していることを示唆した。
　本発明者らは、以上の試験例において、マルチオミクスプロファイリングにより、非ウイルス性肝細胞癌を予後又は腫瘍免疫微小環境（ＴＩＭＥ）に応じて層別化し、肝細胞癌における腫瘍内脂肪組織と免疫疲弊型免疫療法感受性ＴＩＭＥとの関連性を明らかにした。
３．実施例
（実施例１）病理組織画像による脂肪含有率の測定
　肝細胞癌（ＨＣＣ）患者２０例から外科的に切除された肝細胞癌の組織片をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色し、脂肪滴含有細胞数を計測し、肝細胞癌組織の細胞数に対する脂肪滴含有細胞数の割合を脂肪含有率（脂肪化率、組織学的脂肪蓄積）として算出した（図１１）。
（実施例２）ＭＲＩによる肝細胞癌の脂肪含有率の測定
　実施例１に記載のＨＣＣ患者２０例は、癌組織摘出手術前に化学シフトイメージング（ＣＳＩ）を含む腹部ＭＲＩ検査を受けた。各患者の最大の腫瘍の信号強度を、同レベルでの同位相画像及び逆位相画像から関心領域（ＲＯＩ）を描画することにより取得した。ＲＯＩの描画は、Ｈｏｒｏｓ（商標）ソフトウェア（Ｎｉｍｂｌｅ　Ｃｏ　ＬＬＣ社、ｄ／ｂ／ａ　Ｐｕｒｖｉｅｗ）を用いて腫瘍の輪郭を手動で描画した。ＣＳＩで測定された脂肪含有率（ｆａｔ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ＣＳＩ；ＦＦＣＳＩ）を下記の式（２）で算出した。脂肪含有率１０％以上の５人の患者の肝細胞癌を免疫チェックポイント阻害剤に対して感受性ありと決定した（図１１）。
　式（２）中、「ＩＰ」は同位相画像における関心領域の平均信号強度を示し、「ＯＰ」は逆位相画像における関心領域の平均信号強度を示す（Radiographics. 2009 Jan-Feb;29(1):231-60.）。
　病理組織画像による脂肪化率と化学シフトイメージング画像で測定したＦＦＣＳＩとの間に強い正の相関が認められ（図１１）、ＭＲＩが脂肪含有肝細胞癌の同定に信頼できる手段であることが確認された。
（実施例３）ＭＲＩによる脂肪含有肝細胞癌の同定及び免疫療法に対する治療応答性の評価
　２０２０年１０月から２０２１年９月の間に大阪大学医学部附属病院及び関連６病院において肝細胞癌（ＨＣＣ）に対するアテゾリズマブ（抗ＰＤ－Ｌ１抗体）及びベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ抗体）を用いた複合免疫療法を実施した。複合免疫療法の開始前に、化学シフトイメージング（ＣＳＩ）を含む腹部ＭＲＩ検査を受けた患者３０人を免疫療法試験のために遡及的に登録した。登録基準は、肝臓に測定可能な病変がある患者、肝臓に顕著な鉄沈着がない患者、及び初回治療効果の評価を受けた患者であった。各患者の最大の腫瘍の信号強度を、同レベルでの同位相画像及び逆位相画像から関心領域（ＲＯＩ）を描画することにより取得した。ＲＯＩの描画は、Ｈｏｒｏｓ（商標）ソフトウェア（Ｎｉｍｂｌｅ　Ｃｏ　ＬＬＣ社、ｄ／ｂ／ａ　Ｐｕｒｖｉｅｗ）を用いて腫瘍の輪郭を手動で描画した。ＣＳＩで測定された脂肪含有率（ｆａｔ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ＣＳＩ；ＦＦＣＳＩ）を上記の式（２）で算出した。
　ＦＦＣＳＩが１０％以上の腫瘍を脂肪含有肝細胞癌と定義した。その結果、３０人中７人は、脂肪含有肝細胞癌に分類された。脂肪含有肝細胞癌と非脂肪含有肝細胞癌の間に臨床的背景に有意差はなかった。ＦＦＣＳＩ３５％の肝細胞癌の化学シフトイメージング画像（図１２Ａ１～２）、Ｇｄ－ＥＯＢ－ＤＴＰＡ強調ＭＲ画像（図１２Ａ３～４）及び腫瘍生検標本のヘマトキシリン・エオジン像（図１２Ｂ）を示す。
　アテゾリズマブ＋ベバシズマブ併用療法中は、６週間ごとにダイナミック造影ＣＴ検査を実施し、治療応答性を評価した。治療応答性は、ｍＲＥＣＩＳＴ基準（ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｒｅｓｐｏｎｓｅ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　Ｃｒｉｔｅｒｉａ　ｉｎ　Ｓｏｌｉｄ　Ｔｕｍｏｒｓ）を用いて評価した。
　脂肪含有肝細胞癌患者は、５．４ヶ月の観察期間中に病勢進行しなかった。脂肪含有肝細胞癌患者は、非脂肪含有肝細胞癌患者よりも有意に長い無増悪生存期間（ＰＦＳ）を示した（図１３Ａ）。図１３Ａ中の＊は、非脂肪含有肝細胞癌対脂肪含有肝細胞癌についてｐ＜０．０５を表す。また、脂肪含有肝細胞癌患者は、非脂肪含有肝細胞癌患者よりも病勢コントロール率（病勢制御率、ｄｉｓｅａｓｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｒａｔｅ；ＤＣＲ）が高かった（図１３Ｂ）。すなわち、アテゾリズマブ及びベバシズマブの併用療法開始前のＦＦＣＳＩが１０％以上である患者では、ＤＣＲ｛（ＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤ）／（ＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤ＋ＰＤ）｝が１００％であり、全ての患者に治療が有効であった。一方、併用療法開始前のＦＦＣＳＩが１０％未満である患者では、ＤＣＲが５６．５％であり、半数近くの患者には十分な治療効果が得られなかった。
　脂肪含有肝細胞癌患者は免疫チェックポイント阻害剤に感受性があり、腫瘍内脂肪含有率は肝細胞癌における免疫チェックポイント阻害剤による治療の有効性を予測する新規バイオマーカーとなり得ることが示された。
　本発明者らは、化学シフトイメージングにより脂肪含有肝細胞癌を同定できることを明らかにした。化学シフトイメージングによる脂肪含有肝細胞癌の同定は、進行肝細胞癌の診断に用いられるガドキセト酸ナトリウム強調ＭＲＩと組み合わせることにより、臨床的応用が容易である。化学シフトイメージング画像によって同定された脂肪含有肝細胞癌患者は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び抗ＶＥＧＦ抗体による療法において、非脂肪含有肝細胞癌患者より有意に長い無増悪生存期間を示した。これらの結果は、腫瘍内脂肪蓄積が進行性肝細胞癌に対する免疫チェックポイント阻害剤療法の効果を予測する新規バイオマーカーになることを示す。
　肝癌患者の免疫療法において薬剤の奏功を予測し適切な治療を提供する。

Claims (11)

  1. 　肝癌組織中の脂肪含有率を測定する工程を含む、免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性の検査方法。
  2. 　前記脂肪含有率は、前記肝癌組織から得られた画像又は前記肝癌組織から得られた画像表示のための信号から算出される、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記画像がＭＲＩ画像である、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記ＭＲＩ画像が化学シフトイメージング画像である、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記脂肪含有率を基準値と比較する工程をさらに含み、前記脂肪含有率が前記基準値以上である場合に、免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性が高い又は感受性があると判定される、請求項１～４のいずれか１に記載の方法。
  6. 　前記基準値が５％以上１５％以下の範囲から選択される値である、請求項５に記載の方法。
  7. 　化学シフトイメージングにより測定された脂肪含有率における前記基準値が１０％である、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ－１抗体である、請求項１に記載の方法。
  9. 　前記肝癌が、肝細胞癌である、請求項１に記載の方法。
  10. 　免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性の検査用装置であって、
    　肝癌組織のＭＲ信号を検出する信号検出部、
    　検出されたＭＲ信号から肝癌組織中の脂肪含有率を算出する脂肪含有率算出部、及び、
    　算出された脂肪含有率と基準値とを比較し、免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性レベルを示す出力部
    を備えた、装置。
  11. 　免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性の検査用プログラムであって、
    　肝癌組織のＭＲ信号データを入力する工程、
    　入力されたＭＲ信号データから肝癌組織中の脂肪含有率を算出する工程、及び、
    　算出された脂肪含有率と基準値とを比較し、感受性レベルを出力する工程
    を実行させる、プログラム。
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