WO2023200069A1 - 에스트로겐과 항-pd-l1 항체를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

에스트로겐과 항-pd-l1 항체를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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antibody
estrogen
colon cancer
cancer
clause
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김나영
남령희
송진희
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서울대학교산학협력단
서울대학교병원
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition containing estrogen and an anti-PD-L1 antibody for preventing or treating colon cancer, and a composition for enhancing the anti-cancer effect of an anti-PD-L1 antibody containing estrogen.
  • Colorectal cancer the third leading cause of cancer-related death in the United States by 2022, shows gender differences in incidence and mortality worldwide.
  • the protective effect of estrogen has been reported in a variety of diseases, including neurodegenerative diseases, cardiovascular diseases, and esophageal diseases.
  • Sex hormones are mainly involved in sexual differentiation and reproduction, but they also affect the development and function of immune cells. Men and women have different immunological responses to external and self-antigens, and their innate and adaptive immune responses are also different. Additionally, some immunological factors (i.e., higher numbers of CD4 + T cells and CD4/CD8 T cell ratio in women) remain constant from birth to old age, whereas other immunological factors (i.e., pro-inflammatory response) changes during puberty. In fact, immune cells such as B cells, T cells, macrophages, monocytes, dendritic cells, and natural killer cells express estrogen receptors, and estrogen regulates the production and function of immune cells.
  • ICIs immune checkpoint inhibitors
  • PD-1 programmed cell death receptor-1
  • PD-L1 programmed cell death receptor-1 ligand
  • CLA-4 cytotoxic T lymphocyte-associated protein
  • TEE immunosuppressive tumor microenvironment
  • Republic of Korea Patent Publication No. 10-2015-0091058 proposes means and methods for determining whether PD-L1 inhibitor co-treatment is necessary in breast cancer, but confirmation in colon cancer is not disclosed.
  • the present inventors completed the present invention by co-administering estrogen and anti-PD-L1 antibody in an animal model of colon cancer.
  • the present inventors hypothesized that estrogen could increase the effect of anti-PD-L1 treatment in a colon cancer tumor model, and the effects of combination therapy of estrogen and anti-PD-L1 antibody in the colon tumor model and colon tumor growth, The effects of gender and estrogen on PD-L1 expression and tumor-related cell populations were determined.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating colon cancer comprising estrogen and an anti-PD-L1 antibody.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for enhancing the anticancer effect of an anti-PD-L1 antibody containing estrogen for colon cancer.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating colon cancer, comprising administering an effective amount of estrogen and an anti-PD-L1 antibody to an individual in need thereof.
  • an object of the present invention is to provide the use of estrogen and anti-PD-L1 antibody in the manufacture of a drug for preventing or treating colon cancer.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating colon cancer comprising estrogen and an anti-PD-L1 antibody.
  • the estrogen may be one or more selected from the group consisting of estradiol, estriol, and estrone.
  • the anti-PD-L1 antibody may be one or more selected from the group consisting of durvalumab, atezolizumab, avelumab, and MDX-1105.
  • the pharmaceutical composition may be administered by subcutaneous injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, or intramuscular injection.
  • the weight ratio of the estrogen to the anti-PD-L1 antibody may be 0.5 to 1.5 : 0.5 to 1.5.
  • the pharmaceutical composition may be administered to a male colon cancer patient.
  • the estrogen may be administered simultaneously, separately, or sequentially with the anti-PD-L1 antibody.
  • the estrogen may be administered before the anti-PD-L1 antibody.
  • the colon cancer may be any one or more types selected from the group consisting of colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, colon adenocarcinoma, and neuroendocrine tumor.
  • estrogen may be administered in combination with an anti-PD-L1 antibody to exhibit one or more activities selected from the group consisting of a) to b) below.
  • TAM tumor-associated macrophages
  • the present invention provides a composition for enhancing the anti-cancer effect of an anti-PD-L1 antibody containing estrogen.
  • the present invention provides a method for preventing or treating colon cancer, comprising administering an effective amount of estrogen and an anti-PD-L1 antibody to a subject in need thereof.
  • the present invention provides the use of estrogen and anti-PD-L1 antibody in the manufacture of a medicament for preventing or treating colon cancer.
  • the pharmaceutical composition for treating colon cancer containing estrogen and anti-PD-L1 according to the present invention When the pharmaceutical composition for treating colon cancer containing estrogen and anti-PD-L1 according to the present invention is used, a synergistic effect is observed in suppressing tumor growth compared to when estrogen or anti-PD-L1 is used alone.
  • Estrogen inhibits colon cancer tumor growth by reducing PD-L1 expression and regulating tumor-related cell populations in male mice. Additionally, estrogen enhances the antitumor effect of anti-PD-L1 on colorectal tumor growth and can therefore be used with immune checkpoint inhibitors in combination therapy.
  • the results of the present invention are useful for useful treatment strategies for precision medicine, such as simultaneous administration of immune checkpoint inhibitors and estrogen for the treatment of patients with colorectal cancer.
  • Figure 1 shows gender differences in MC38 tumor growth.
  • a and B is the experimental plan
  • C is the mouse was monitored for tumor development 2 or 3 times a week and tumor size was measured using a digital caliper
  • D is the result of measuring the weight of the resected tumor. .
  • Figure 2 shows the results of confirming the frequency of PD-L1 positive cells, showing that it was higher in males than in females.
  • A Representative IHC images of MC38 colon tumor sections are shown after PD-L1 staining. Magnification, ⁇ 200. Red arrows indicate PD-L1 stained cells.
  • B Graph shows the percent frequency of PD-L1 stained cells in male and female mice.
  • C Gating strategy to determine PD-L1-expressing cells, single cells were gated using SSC and FSC. PD-L1 expressing cells were identified in single cell populations (CD274 + ).
  • D Representative plots of flow cytometry (left panel) and frequency (right panel) of PD-L1 expressing cells (CD274 + ) in male and female MC38 tumors.
  • Figure 3 shows the results of confirming the frequency of PD-L1 expressing tumor cells, showing that it was higher in male mice than in female mice.
  • A Gating strategy to determine tumor cells, TAI, and PD-L1-expressing tumor cells and TAI, and single cells were gated using SSC and FSC. In single cell populations, cells were identified as tumor cells (CD45 ⁇ ), TAI (CD45 + ), PD-L1-expressing tumor cells (CD45 ⁇ CD274 + ), and PD-L1-expressing TAI (CD45 + CD274 + ).
  • TAMs were determined as CD11b + F4/80 + cells in the single cell population and PD-L1-expressing TAMs were determined as CD274 + cells within the TAM population.
  • E Representative plots of flow cytometry (left panel) and frequency (right panel) of TAMs (CD11b + F4/80 + ) in male and female MC38 tumors.
  • F Representative plots of flow cytometry (left panel) and frequency (right panel) of PD-L1 expressing TAMs (CD11b + F4/80 + CD274 + ) in male and female MC38 tumors.
  • Figure 4 shows that the frequency of CAF and PD-L1 expressing TEC was higher in male mice than in female mice.
  • TEC, CAF, and PD-L1 expression Gating strategy to determine TEC and CAF, and single cells were gated using SSC and FSC.
  • CD45 ⁇ cells were gated and then TECs were determined as CD140a ⁇ CD31 + cells and CAFs were determined as CD140a ⁇ CD31 ⁇ cells within the CD45 ⁇ cell population.
  • PD-L1 expressing TECs and CAFs were determined as CD274 + cells within the TEC and CAF populations, respectively.
  • FIG. 1 Representative plots of flow cytometry (left panel) and frequencies (middle and right panels) of TECs (CD45 - CD140a - CD31 + ) and CAFs (CD45 - CD140a - CD31 - ) in male and female MC38 tumors.
  • C Representative plots of flow cytometry (left panel) and frequency (right panel) of PD-L1 expressing TECs (CD45 - CD140a - CD31 + CD274 + ) in male and female MC38 tumors.
  • FIG. 1 Representative plots of flow cytometry (left panel) and frequency (right panel) of PD-L1 expressing CAFs (CD45 - CD140a - CD31 - CD274 + ) in male and female MC38 tumors.
  • Figure 5 shows results on the inhibitory effect of E2 on MC38 tumor growth in male mice.
  • a and B is the experimental plan
  • C mice were monitored 2 or 3 times per week for tumor development and tumor size was measured using digital calipers
  • D results of measuring the weight of the resected tumor.
  • Figure 6 shows the inhibitory effect of E2 on tumor-related cell populations and PD-L1 expression in male MC38 tumors.
  • A Representative plot of flow cytometry (top panel) and frequency (bottom panel) of PD-L1 expressing cells (CD274 + )
  • B flow cytometry analysis of tumor cells (CD45 ⁇ ) and TAI (CD45 + ) (top panel). ) and frequency (lower panel)
  • C Flow cytometry analysis (upper panel) and frequency (lower panel) of PD-L1 expressing tumor cells (CD45 - CD274 + ) and PD-L1 expressing TAI (CD45 + CD274 + ).
  • A Representative plot of flow cytometry (top panel) and frequency (bottom panel) of PD-L1 expressing cells (CD274 + )
  • B flow cytometry analysis of tumor cells (CD45 ⁇ ) and TAI (CD45 + ) (top panel). ) and frequency (lower panel)
  • C Flow cytometry analysis (
  • Figure 7 shows the synergistic effect of E2 on the anti-tumor effect of anti-PD-L1 antibody on MC38 tumor growth in male mice.
  • a and B Experimental plan
  • C Representative images of MC38 tumor-bearing mice and tumors at day 26,
  • D Mice were monitored 2 or 3 times per week for tumor development and tumor size was measured using digital calipers.
  • E This is the result of measuring the weight of the resected tumor.
  • Figure 8 shows that PD-L1 expression was significantly lower in MC38 tumor tissue in the male group treated with E2 or E2 + anti-PD-L1 combination.
  • A Representative IHC images of MC38 colon tumor sections after PD-L1 staining. Magnification, ⁇ 200, and red arrows indicate PD-L1 stained cells.
  • B Graphs of percent frequency of PD-L1 staining cells in male and female mice,
  • C flow cytometry analysis (left panel) and frequency (right panel) of PD-L1 expressing cells (CD274 + ) in male and female MC38 tumors. A representative plot is shown.
  • Figure 9 shows the synergistic effect of E2 on alteration of TAM and M1 TAM populations of anti-PD-L1 antibodies in male mice.
  • A Representative plot of flow cytometry (left panel) and frequency (right panel) of CD45 - tumor cells in male and female MC38 tumors,
  • B PD-L1-expressing tumor cells (CD45 - CD274) in male and female MC38 tumors. Representative plots of flow cytometry (left panel) and frequency (right panel) of + ),
  • C TAMs and M1 TAMs, gating strategy to determine PD-L1 expressing TAMs and M1 TAMs and single cells using SSC and FSC. It was gated.
  • TAMs were determined as CD11b + F4/80 + cells in the single cell population and M1 TAMs were determined as CD86 + cells within the TAM population.
  • PD-L1 expressing TAMs and M1 TAMs were determined as CD274 + cells within the TAM population and M1 TAMs, respectively.
  • D Representative plots of flow cytometry (left panel) and frequency (right panel) of TAMs (CD11b + F4/80 + ) in male and female MC38 tumors.
  • E Representative plots of flow cytometry (left panel) and frequency (right panel) of M1 TAMs (CD11b + F4/80 + CD86 + ) in male and female MC38 tumors.
  • Figure 10 shows the proposed regulatory mechanism of estrogen on MC38 tumor in male mice.
  • A Regulators of PD-L1 expression in the tumor microenvironment are shown. The abundance of PD-L1 is regulated by several transcription factors, such as HIF1 ⁇ , MYC, STAT3, AP1, NF- ⁇ B and NRF2.
  • PD-L1 expressed on tumor cells binds to PD-1 on T cells and is involved in immune evasion.
  • B Shows the mechanism of inhibition of PD-L1 abundance by co-treatment with E2 and anti-PD-L1 antibody.
  • ER ⁇ activated by E2 binding moves to the nucleus and inhibits NF-kB, which is activated by the TLR signaling pathway, and NRF2, which is activated by the GPCR signaling pathway, thereby suppressing PD-L1 transcriptional activity.
  • Anti-PD-L1 antibodies bind to PD-L1 and inhibit PD-L1 binding to PD-1 on T cells.
  • relevant cell populations, PD-L1 expression levels, and expression levels of cancer-related fibroblasts and tumor cells were evaluated.
  • the present invention was completed by confirming the level of macrophages and confirming that a synergistic effect occurred compared to the case of treatment alone.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating colon cancer comprising estrogen and an anti-PD-L1 antibody.
  • the term “pharmaceutical composition” refers to a mixture containing an anti-PD-L1 antibody containing an estrogen of the present invention and a pharmaceutically acceptable excipient such as a diluent or carrier. According to some embodiments, a method of administering a pharmaceutical composition comprising an anti-PD-L1 antibody containing estrogen of the present invention to a subject as needed is provided. In some embodiments, compositions of the present invention can be administered to humans. Although the description of the pharmaceutical compositions provided herein principally relates to pharmaceutical compositions for administration to humans, those skilled in the art will understand that such compositions are generally suitable for administration to all types of animals. A skilled veterinary pharmacologist with a good understanding of the modifications of pharmaceutical compositions for administration to various animals can design and/or perform such modifications, if necessary, simply by routine experimentation.
  • a pharmaceutically acceptable salt refers to a composition that is physiologically acceptable and does not usually cause gastrointestinal disorders, allergic reactions such as dizziness, or similar reactions when administered to humans.
  • the carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Examples include polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers and preservatives may be additionally included.
  • compositions of the present invention can be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • Dosage forms may be in the form of powders, granules, tablets, emulsions, syrups, aerosols, soft or hard gelatin capsules, sterile injectable solutions, or sterile powders.
  • Treatment means an approach to obtain a beneficial or desirable clinical outcome.
  • beneficial or desirable clinical outcomes include, but are not limited to, alleviation of symptoms, reduction of disease extent, stabilization of the disease state (i.e., not worsening), delay or reduction in the rate of disease progression, disease state, etc. Improvement or temporary relief and alleviation (partial or total) of, whether detectable or undetectable.
  • Treatment may also mean increasing survival compared to expected survival without treatment.
  • Treatment refers to both therapeutic treatment and prophylactic or preventive measures. The treatments include treatment required for disorders that have already occurred as well as disorders that are being prevented.
  • “Palliating” a disease means reducing the extent of the condition and/or undesirable clinical signs and/or slowing or prolonging the time course of the disease compared to no treatment. It means losing.
  • compositions for preventing or treating colorectal cancer comprising an estrogen and an anti-PD-L1 antibody of the present invention treat, alleviate, ameliorate, alleviate, delay the onset of, and/or one or more symptoms or features of cancer.
  • the estrogen may be one or more selected from the group consisting of estradiol, estriol, and estrone
  • the anti-PD-L1 antibody may be characterized as being any one or more selected from the group consisting of durvalumab, atezolizumab, avelumab, and MDX-1105, but is not limited thereto.
  • estrogen is a steroid-type hormone that regulates the development and growth of the human reproductive system. When it was first discovered, it was considered a sex hormone limited to the reproductive system.
  • estrogen receptors are found in cardiovascular and skeletal areas other than the reproductive system. It is known to be involved in other physiological and pathological processes of the neuroendocrine system. In other words, estrogen shows genetic or non-genomic effects through estrogen receptors, and these estrogen receptors are largely divided into ERa and ERb. While ERa is mainly distributed in female reproductive organs such as the breast, uterus, and ovaries, ERb is distributed more widely in various organs of our body and has been found to have a different function from ERa.
  • Estrogen can have various effects on each organ, such as increasing the risk of breast cancer and endometrial cancer, but lowering the risk of colon cancer.
  • the estrogen may preferably be estradiol, and more preferably 17b-estradiol among estradiol.
  • the anti-PD-L1 antibody refers to a substance that attacks cancer cells by activating T cells by blocking the activation of immune checkpoint proteins involved in T cell suppression.
  • the anti-PD-L1 antibody may bind to a protein expressed on the surface of cancer cells and may specifically act as a PD-L1 inhibitor.
  • Antibody of the present invention is a term known in the art and refers to a specific protein molecule directed to an antigenic site.
  • an antibody refers to an antibody that specifically binds to the PD-L1 protein of the present invention, and such antibody is produced by cloning each gene into an expression vector according to a conventional method and expressing the PD-L1 gene.
  • the encoded protein can be obtained and manufactured from the obtained protein by conventional methods.
  • This also includes partial peptides that can be made from the above proteins, and the partial peptides of the present invention include at least 7 amino acids, preferably 9 amino acids, and more preferably 12 or more amino acids.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and as long as it is a polyclonal antibody, monoclonal antibody, or has antigen binding properties, a portion thereof is also included in the antibody of the present invention, and all immunoglobulin antibodies are included. Furthermore, the antibodies of the present invention also include special antibodies such as humanized antibodies.
  • the antibody against the protein encoded by the PD-L1 gene of the present invention can be any antibody that can be produced by methods known in the art.
  • anti-PD-L1 antibodies of the invention may include intact forms with two full-length light chains and two full-length heavy chains as well as functional fragments of the antibody molecule.
  • the functional fragment of the antibody molecule refers to a fragment that possesses at least an antigen-binding function and may be Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, etc., but is not particularly limited thereto.
  • cancer immunotherapy refers to a treatment that helps treat cancer by increasing the patient’s immunity, instead of treatments or drugs that directly attack cancer cells, such as radiation or anticancer drugs. It mainly finds immune checkpoint proteins (PD-1, PDL1, CTLA-4) and paralyzes the immune evasion function of cancer cells to help T cells (immune cells) destroy cancer cells. Because it plays a role in activating the body's immune system to attack cancer cells, it can be applied to various cancers and can also reduce side effects such as indigestion, vomiting, leukopenia, and hair loss. Currently, a variety of antibodies that block immune checkpoint proteins are in clinical use or in clinical trials. In the present invention, anti-PD-L1 was used as an anticancer immunotherapy agent.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered by any route.
  • the pharmaceutical composition can be administered intravenously, intramuscularly, intraarterially, intramedullarily, intrathecally, subcutaneously, intracerebroventricularly, transdermally, intradermally, rectally, intravaginally, intraperitoneally, topically (powders, ointments, creams, and/or or by droplets), mucous membrane, sublingual; It is administered by a variety of routes, including intratracheal instillation, bronchial instillation, and/or inhalation. Particularly contemplated routes are permeable intravenous injection, local administration via the blood and/or lymphatic supply, and/or direct administration to the affected area.
  • the most appropriate route of administration will depend on a variety of factors, including the properties of the agent (e.g., stability in the environment of the gastrointestinal tract), and the disorder of the subject.
  • the present invention encompasses the delivery of the pharmaceutical composition according to the invention by any suitable route taking into account advances in the field of drug delivery.
  • the pharmaceutical composition may be administered by subcutaneous injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, or intramuscular injection, but is not limited thereto as long as it is the most effective and has no side effects. .
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating colorectal cancer comprising an estrogen and an anti-PD-L1 antibody of the present invention is administered in an amount of about 0.001 mg/kg to about 100 mg/kg, about 0.01 mg/kg of the subject's body weight daily. to about 50 mg/kg, from about 0.1 mg/kg to about 40 mg/kg, from about 0.5 mg/kg to about 30 mg/kg, from about 0.01 mg/kg to about 10 mg/kg, from about 0.1 mg/kg to about
  • the desired therapeutic effect may be achieved by administering 10 mg/kg, or about 1 mg/kg to about 25 mg/kg, at a dosage level sufficient to deliver once or more per day.
  • the intended dosage may be delivered three times a day, twice a day, daily, every two days, every three days, weekly, every two weeks, every three weeks, or every four weeks.
  • the desired dosage may be delivered via multiple administrations (e.g., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or more administrations). .
  • the weight ratio of the estrogen to the anti-PD-L1 antibody may be 0.5 to 1.5:0.5 to 1.5, preferably 1:1, and may be adjusted appropriately by a person skilled in the art. , but is not limited to this.
  • estrogen and anti-PD-L1 were each administered at a dose of 10 mg/kg.
  • the pharmaceutical composition may be administered to a male colon cancer patient.
  • gender was confirmed to be an important factor in colon cancer growth (Figure 1), and a higher proportion of TECs expressing PD-L1 contributed to tumor growth in male mice (Figure 4C). Additionally, tumor growth was significantly reduced following anti-PD-L1 antibody treatment in male mice, and tumor growth was significantly slower and smaller with estrogen and anti-PD-L1 treatment ( Figure 7). That is, it was confirmed that tumor growth was significantly inhibited when male mice were treated with a pharmaceutical composition containing estrogen and anti-PD-L1 antibody.
  • the estrogen may be administered simultaneously, separately, or sequentially with the anti-PD-L1 antibody. Alternatively, in one embodiment, the estrogen may be administered before the anti-PD-L1 antibody.
  • the colon cancer may be one or more types selected from the group consisting of colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, colon adenocarcinoma, and neuroendocrine tumor, but the colon cancer is not limited thereto.
  • TAM tumor associated macrophage
  • TAM tumor associated macrophage
  • Macrophages crowd around the tumor and infiltrate into it, and it has been reported that in cancer patients, if a large number of TAMs are present around the tumor, the patient's prognosis and survival rate are poor.
  • TAM contributes to angiogenesis and suppresses anti-cancer immunity, thereby enabling tumor deterioration, so removal of TAM is considered important in cancer treatment.
  • TAMs are differentiated into M1 macrophages and M2 macrophages by the tumor (cancer) microenvironment. Macrophages are activated into the M1 type, which induces an inflammatory response, and the M2 type, which suppresses the immune response. TAMs share the characteristics of M2.
  • M1 macrophages also called CLS macrophages (crown-like structure macrophages)
  • CLS macrophages crown-like structure macrophages
  • M2 macrophages called resident macrophages
  • estrogen may be administered in combination with an anti-PD-L1 antibody to exhibit one or more activities selected from the group consisting of a) to b) below.
  • TAM tumor-associated macrophages
  • administered in combination means that the compounds or ingredients are administered together to the subject animal. That each compound or component is administered together means that each component can be administered sequentially at the same time or in any order or at different times to obtain the desired therapeutic effect.
  • Figure 10 shows the mechanism of inhibition of PD-L1 abundance by co-treatment with estrogen and anti-PD-L1 antibody.
  • ER ⁇ activated by binding of estrogen, expressed as E2 moves to the nucleus and inhibits NF-kB, which is activated by the TLR signaling pathway, and NRF2, which is activated by the GPCR signaling pathway, thereby suppressing PD-L1 transcriptional activity.
  • Anti-PD-L1 antibodies exhibit anti-tumor effects by binding to PD-L1 and inhibiting PD-L1 binding to PD-1 on T cells.
  • the present invention provides a composition for enhancing the anti-cancer effect of an anti-PD-L1 antibody containing estrogen.
  • composition for enhancing the anti-cancer effect of colon cancer the above description that overlaps with the pharmaceutical composition for preventing or treating colon cancer is omitted.
  • the present invention provides a method for preventing or treating colon cancer, comprising administering an effective amount of estrogen and an anti-PD-L1 antibody to a subject in need thereof.
  • the subject may be a male colon cancer patient.
  • the present invention provides the use of estrogen and anti-PD-L1 antibody in the manufacture of a medicament for preventing or treating colon cancer.
  • MC38 cells purchased from Kerafast Inc. (# ENH204-FP, Boston, MA, USA) were grown in a 95% humidified atmosphere containing 5% CO2, 10% fetal bovine serum (FBS), and 2mM L-glutamine at a temperature of 37°C. , were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 1mM sodium pyruvate, 10mM HEPES, and antibiotic-antifungal mixture. All media were purchased from Gibco BRL (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • MC38 cells (passage numbers 7-8) were washed with Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), lightly trypsinized, washed with DPBS, and checked for viability before final resuspension in DPBS at the desired concentration. .
  • DPBS Dulbecco's phosphate-buffered saline
  • mice Seven-week-old male and female C57BL/6 mice were obtained from Orient Bio Inc. (Seoul, Korea) and maintained under specific pathogen-free conditions with a light/dark cycle (12/12 h) at 23°C. All mice were randomly divided by sex, weighed, grouped, and housed in filter-top cages with 3–5 mice per cage. Animals were marked with an ear punch so that individual mice could be tracked throughout the experiment. The preclinical animal room was managed by specialized personnel according to Animals in Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE) guidelines. All animal experiments were approved by the Animal Care and Use Committee (IACUC) of Seoul National University Bundang Hospital (approval number BA-2013-316-023-01). All experiments were conducted in accordance with the relevant guidelines and regulations of the Animal Care Committee of the Animal Hospital of Seoul National University Bundang Hospital and the recommendations of the ARRIVE guidelines.
  • IACUC Animal Care and Use Committee
  • the digested cell suspension was filtered through a 70- ⁇ m cell strainer (# 352350, BD Biosciences, USA). Next, the single cell suspension was incubated with an Fc receptor blocking antibody (# 156604, BioLegend Inc., San Diego, CA, USA) for 30 min to prevent non-specific antibody binding and then stained with a fluorescently labeled specific antibody. Detailed information on the antibodies used is given in [Table 1].
  • Antigen Label Clone Isotype Conc.(ml/ml) Dilution Supplier, Cat. No., Lot no.
  • In vivo treatment PD-L1 - 10F.9G2 Rat IgG2b, ⁇ 6.6 10mg/kg BioXcell, Be0101, 751220D1B Isotype control - LTF-2 Rat IgG2b, ⁇ 9.45 10mg/kg BioXcell, Be0090, 767920D1 Flow cytometry CD274(PD-L1) P.E.
  • TAI tumor-associated immune cell
  • TAM tumor-associated macrophage
  • TEC tumor-associated endothelial cell
  • CAF cancer-associated fibroblast
  • PD-L programmed death-ligand 1
  • CD cluster of differentiation.
  • Tumor growth in mice was monitored 2-3 times weekly and tumor size was measured using digital calipers. Tumor volume was calculated using the formula: (minimum diameter) 2 ⁇ (maximum diameter) ⁇ 0.5. On the day of sacrifice, each resected tumor was weighed and used for subsequent analysis. The same tumor was divided into two, samples for flow cytometry and immunohistochemistry were prepared, and experiments were performed.
  • Tumor tissues were fixed with 4% paraformaldehyde and embedded in paraffin.
  • IHC for PD-L1 was performed using the BenchMark XT automated slide staining system (Ventana Medical Systems, Arlington, AZ, USA) and ultraView Universal DAB Detection Kit (Ventana Medical Systems) according to the manufacturer's instructions. Each section was blocked with 3% hydrogen peroxide and normal serum. Sections were then incubated with anti-PD-L1 antibody (# 14-5982-82, eBioscience, San Diego, USA). Section slides were imaged using a Pannoramic 250 Flash III digital slide scanner (3DHISTECH Ltd., Budapest, Hungary). Low-power field (magnification, 40x) images were acquired automatically.
  • PD-L1 expressing cells were quantitatively assessed using the Image-Pro Plus analysis system. Within the acquired low-magnification images, several high-magnification fields (magnification, 200x) were randomly selected into three regions and the average number of cells stained for PD-L1 was calculated from the total cell count. Non-specific PD-L1 staining was manually excluded. Reported values are the average of different images from different mice within each group. Values on the y axis are expressed as percentage of cells stained for PD-L1 from the total number of cells.
  • TAI tumor-associated immune cells
  • TAM tumor-associated macrophages
  • TEC tumor-associated endothelial cells
  • CD45 - and CD45 + cells were identified as tumor cells and TAI, respectively (Figure 3A).
  • TAI CD45 +
  • Figure 3C right panel
  • the gating strategy for stained cells is shown in Figure 3C.
  • the ratio of TAMs (CD45 + CD11b + F4/80 + ) and PD-L1-expressing TAMs did not differ between genders ( Figures 3E and 3F).
  • mice were treated with E2 according to the experimental plan using the MC38 tumor model.
  • a total of 5 x 10 5 MC38 cells (passage number 7) resuspended in 100 ⁇ l DPBS were injected subcutaneously into the right flank of 8 week old C57BL/6 male mice.
  • E2 (10 mg/kg) was injected into MC38 cells 3 days before (before MC38 group) or on the day of injection (after MC38 group) for 1 week.
  • mice from each group were used for MC38 cancer cell transplantation, and 1 mouse from each group that did not develop tumors was excluded from the experiment. Therefore, in the experiment described in Figure 5A, results were obtained from 12 of a total of 15 mice.
  • E2 (# E8876, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) dissolved in olive oil was administered intraperitoneally (i.p.) at a concentration of 10 mg/kg 7 times daily for 1 week.
  • E2 was injected 3 days before MC38 cell injection (before MC38 group) or on the day of injection (after MC38 group) (Figure 5A). Mice were sacrificed 20 days after injection with MC38 cells (Figure 5A), and collected tumor samples were used for flow cytometry (Figure 5B).
  • Tumor growth in mice was monitored 2-3 times weekly and tumor size was measured using digital calipers. Tumor volume was calculated using the formula: (minimum diameter) 2 ⁇ (maximum diameter) ⁇ 0.5. On the day of sacrifice, each resected tumor was weighed and used for subsequent analysis.
  • mice with tumors measuring 50-100 mm 3 were selected from all groups and injected with anti-PD-L1 antibody.
  • mice from each group were used for MC38 cancer cell transplantation.
  • E2 (10 mg/kg) was administered intraperitoneally for 1 week 3 days prior to MC38 cell injection. Mice were sacrificed 26 days after MC38 cell injection (Figure 7A), and at the end of the experiment, MC38 tumor samples were collected and FACS and IHC were performed to assess PD-L1 expression ( Figure 7B).
  • Tumor growth in mice was monitored 2-3 times weekly and tumor size was measured using digital calipers. Tumor volume was calculated using the formula: (minimum diameter) 2 ⁇ (maximum diameter) ⁇ 0.5. On the day of sacrifice, each resected tumor was weighed and used for subsequent analysis. The same tumor was divided into two, samples for flow cytometry and immunohistochemistry were prepared, and experiments were performed.

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Abstract

본 발명은 에스트로겐과 항-PD-L1을 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 에스트로겐을 포함하는 항-PD-L1 항암효과 증진용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로, 대장암 모델에서 에스트로겐과 항-PD-L1 항체의 병용 요법을 수행하는 경우 각각을 단독으로 이용하는 경우에 비해 종양 성장 억제에서 상승효과가 나타나며, 종양 관련 세포 집단의 변화를 초래하는 바, 정밀 의학을 위한 치료에서 유용하다.

Description

에스트로겐과 항-PD-L1 항체를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 대장암 예방 또는 치료를 위한 에스트로겐과 항-PD-L1 항체를 포함하는 약학적 조성물 및 에스트로겐을 포함하는 항-PD-L1 항체의 항암효과 증진용 조성물에 관한 것이다.
한편, 본 출원은 하기 국가연구개발사업에 의해 지원받았다.
[이 발명을 지원한 국가연구개발사업]
[과제고유번호] 1711130790
[과제번호] 2019R1A2C2085149
[부처명] 과학기술정보통신부
[과제관리(전문)기관명]한국연구재단
[연구사업명] 개인기초연구(과기정통부)(R＆D)
[연구과제명] 대장암 발생과 진행에 있어 면역관문 및 Nrf2에 미치는 성
호르몬의 영향
[기여율] 1/1
[과제수행기관명] 서울대학교
[연구기간] 2019.09.01 ~ 2024.02.29
2022년 미국에서 암 관련 사망의 세 번째 주요 원인인 대장암(Colorectal cancer, CRC)은 전 세계적으로 발병률과 사망률에서 성별에 따른 차이를 나타낸다. 에스트로겐의 보호 효과는 신경퇴행성 질환, 심혈관 질환, 식도 질환을 비롯한 다양한 질병에서 보고된 바 있다.
성 호르몬은 주로 성적 분화와 생식에 관여하지만 면역 세포의 발달과 기능에도 영향을 미친다. 남성과 여성은 외부 항원과 자가 항원에 대한 면역학적 반응이 다르며 선천성 면역 반응과 후천성 면역 반응도 다르다. 또한, 일부 면역학적 요인(즉, 여성의 경우 더 많은 수의 CD4+ T 세포 및 CD4/CD8 T 세포 비율)은 출생부터 노년기까지 일정하게 유지되는 반면, 다른 면역학적 요인(즉, 전염증 반응)은 사춘기 동안 변화한다. 실제로 B세포, T세포, 대식세포, 단핵구, 수지상세포, 자연살해세포 등의 면역세포는 에스트로겐 수용체를 발현하고 에스트로겐은 면역세포의 생산과 기능을 조절한다.
한편, 최근 면역요법은 화학요법, 방사선, 수술과 같은 기존의 암 치료를 위한 강력한 암 관리 도구로 부상하고 있다. 특히 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor, ICI)는 독성이 낮고 치료효과가 높아 암 환자의 생존기간 연장에 효과적인 것으로 입증되었다. 가장 널리 기술된 ICI는 프로그램된 세포사멸 수용체-1(PD-1), 프로그램된 세포사멸 수용체-1 리간드(PD-L1) 및 세포독성 T 림프구 관련 단백질(CTLA-4)을 표적으로 한다. 일반적으로 활성화된 T 세포의 표면에서 상향 조절되는 PD1은 항원 제시 세포 및 기타 면역 세포에서 발현되는 PD-L1에 결합하고 음성 공동 자극 신호를 받아 T 세포 활성화를 제한한다. 암세포에서 PD-L1의 과발현은 면역 회피를 유도하고 궁극적으로 면역 억제 종양 미세 환경(tumor microenvironment, TME)을 형성한다. PD-1/PD-L1 상호작용을 차단하는 ICI는 암 치료에서 놀라운 결과를 보여 현재 폐암, 악성 흑색종 및 위암에서 단일 제제 또는 화학 요법과의 1차 또는 2차 치료제로 병용되고 있으나, 대장암에서 보고된 바는 없다. ICI는 PD-L1 양성 종양과 5개의 면역 세포의 총 수로 정의되는 MSI-H(high microsatellite instability) 또는 CPS(combined positive score)를 갖는 암의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다. 그러나 이러한 점수를 만족하는 CRC 환자는 매우 드물며 ICI의 효능이 남성에게 더 효과적이거나 환자의 성별과 관련이 없다는 메타 분석 보고서가 존재한다. 현재까지 CRC에서 ICI의 효과에 대한 성별 차이와 면역 환경의 영향에 대한 연구는 부족한 실정이다.
아울러, 대한민국 공개특허공보 제 10-2015-0091058호는 유방암에서 PD-L1 억제제 공동치료가 필요한지를 결정하기 위한 수단 및 방법을 제시하고 있으나, 대장암에서 확인한 바는 개시되지 않았다.
이에 본 발명자들은 대장암 모델에서 에스트로겐과 항-PD-L1 항체를 동물모델에서 병용 투여하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명자들은 에스트로겐이 대장암 종양 모델에서 항-PD-L1 치료의 효과를 증가시킬 수 있다고 가정하였고, 대장 종양 모델에서 에스트로겐과 항-PD-L1 항체의 병용 요법의 효과와 결장 종양 성장, PD-L1 발현 및 종양 관련 세포 집단에 대한 성별 및 에스트로겐의 효과를 확인하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 에스트로겐 및 항-PD-L1 항체를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 에스트로겐을 포함하는 항-PD-L1 항체의 대장암 항암효과 증진용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 에스트로겐 및 항-PD-L1 항체를 유효량으로 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대장암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 대장암을 예방 또는 치료하기 위한 약제 제조시 에스트로겐 및 항-PD-L1 항체의 용도를 제공하는 것이다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안 된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속 하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 에스트로겐 및 항-PD-L1 항체를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
일실시예에 있어서, 상기 에스트로겐은 에스트라디올(estradiol), 에스트리올(estriol) 및 에스트론(estrone)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
일실시예에 있어서, 상기 항-PD-L1 항체는 두르발루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙 및 MDX-1105로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
일실시예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 피하주사, 복강내주사, 정맥주사 또는 근육내 주사의 주입방식에 의하여 투여될 수 있다.
일실시예에 있어서, 상기 에스트로겐과 항-PD-L1 항체의 중량비는 0.5~1.5 : 0.5~1.5 중량비일 수 있다.
일실시예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 남성 대장암 환자에게 투여되는 것을 특징으로 할 수 있다.
일실시예에 있어서, 상기 에스트로겐은 항-PD-L1 항체와 동시에(simultaneous), 별도(separate), 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있다.
일실시예에 있어서, 상기 에스트로겐은 항-PD-L1 항체보다 먼저 투여되는 것을 특징으로 할 수 있다.
일실시예에 있어서, 상기 대장암은 결장암, 직장암, 결장직장암, 대장 선암 및 신경내분비종양으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상인 것일 수 있다.
일실시예에 있어서, 에스트로겐은 항-PD-L1 항체와 병용투여 되어 다음의 a) 내지 b)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 나타낼 수 있다.
a) TAM(tumor-associated macrophages)의 감소;
b) M1 TAM의 증가.
또한, 본 발명은 에스트로겐을 포함하는 항-PD-L1 항체의 대장암 항암효과 증진용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 에스트로겐 및 항-PD-L1 항체를 유효량으로 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대장암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 대장암을 예방 또는 치료하기 위한 약제 제조시 에스트로겐 및 항-PD-L1 항체의 용도를 제공한다.
본 발명에 의한 에스트로겐과 항-PD-L1을 포함하는 대장암 치료용 약학적 조성물을 이용하는 경우 에스트로겐이나 항-PD-L1을 단독으로 이용하는 경우에 비해 종양 성장 억제에서 상승효과가 나타난다. 에스트로겐은 PD-L1 발현을 감소시키고 수컷 마우스에서 종양 관련 세포 집단을 조절함으로써 대장암 종양 성장을 억제한다. 또한 에스트로겐은 대장암 종양 성장에 대한 항-PD-L1의 항종양 효과를 강화하므로 병용 요법에서 면역관문 억제제와 함께 사용할 수 있다. 본 발명의 결과는 대장암 환자의 치료를 위한 면역관문 억제제와 에스트로겐의 동시 투여와 같은 정밀 의학을 위한 유용한 치료 전략에 유용하다.
도 1은 MC38 종양 성장에 대한 성별 차이를 나타낸다. (A 및 B)는 실험 계획, (C)는 마우스를 주당 2 또는 3회 종양 발달에 대해 모니터링하고 종양 크기를 디지털 캘리퍼스를 사용하여 측정하였으며, (D)는 절제된 종양의 무게를 측정한 결과이다.
도 2는 PD-L1 양성 세포의 빈도를 확인한 결과이며, 암컷보다 수컷에서 더 높았음을 나타낸다. (A) PD-L1 염색 후 MC38 결장 종양 절편의 대표적인 IHC 이미지를 나타낸다. 배율,×200. 빨간색 화살표는 PD-L1 염색 세포를 나타낸다. (B) 그래프는 수컷 및 암컷 마우스에서 PD-L1 염색 세포의 퍼센트 빈도를 나타낸다. (C) PD-L1-발현 세포를 결정하기 위한 게이팅 전략으로, 단일 세포는 SSC 및 FSC를 사용하여 게이팅되었다. 단일 세포 집단에서 PD-L1 발현 세포가 확인되었다(CD274+). (D) 남성 및 여성 MC38 종양에서 PD-L1 발현 세포(CD274+)의 유세포 분석(왼쪽 패널) 및 빈도(오른쪽 패널)의 대표적인 플롯을 나타낸다.
도 3은 PD-L1 발현 종양 세포의 빈도를 확인한 결과이며, 암컷보다 수컷 마우스에서 더 높았음을 나타낸다. (A) 종양 세포, TAI 및 PD-L1-발현 종양 세포 및 TAI를 결정하기 위한 게이팅 전략이고, 단일 세포는 SSC 및 FSC를 사용하여 게이팅되었다. 단일 세포 집단에서 세포는 종양 세포(CD45-), TAI(CD45+), PD-L1 발현 종양 세포(CD45-CD274+) 및 PD-L1-발현 TAI(CD45+CD274+)로 식별되었다. (B) 남성 및 여성 MC38 종양에서 종양 세포(CD45-) 및 TAI(CD45+)의 유세포 분석(왼쪽 패널) 및 빈도(중간 및 오른쪽 패널)의 대표적인 플롯을 나타낸다. (C) 남성 및 여성 MC38 종양에서 PD-L1 발현 종양 세포(CD45-CD274+) 및 PD-L1 발현 TAI(CD45+CD274+)의 유세포 분석(왼쪽 패널) 및 빈도(중간 및 오른쪽 패널)의 대표적인 플롯을 나타낸다. (D) TAM 및 PD-L1 발현 TAM을 결정하기 위한 게이팅 전략이고, 단일 세포는 SSC 및 FSC를 사용하여 게이팅되었다. TAM은 단일 세포 집단에서 CD11b+F4/80+ 세포로 결정되었고 PD-L1-발현 TAM은 TAM 집단 내에서 CD274+세포로 결정되었다. (E) 남성 및 여성 MC38 종양에서 TAM(CD11b+F4/80+)의 유세포 분석(왼쪽 패널) 및 빈도(오른쪽 패널)의 대표적인 플롯을 나타낸다. (F) 남성 및 여성 MC38 종양에서 PD-L1 발현 TAM(CD11b+F4/80+CD274+)의 유세포 분석(왼쪽 패널) 및 빈도(오른쪽 패널)의 대표적인 플롯을 나타낸다.
도 4는 CAF 및 PD-L1 발현 TEC의 빈도는 암컷보다 수컷 마우스에서 더 높았음을 나타낸다. (A) TEC, CAF 및 PD-L1 발현 TEC 및 CAF를 결정하기 위한 게이팅 전략이고, 단일 세포는 SSC 및 FSC를 사용하여 게이팅되었다. 단일 세포 집단에서, CD45-세포가 게이트된 다음 TEC는 CD140a-CD31+ 세포로 결정되었고 CAF는 CD45-세포 집단 내에서 CD140a-CD31- 세포로 결정되었다. PD-L1 발현 TEC 및 CAF는 각각 TEC 및 CAF 집단 내에서 CD274+ 세포로 결정되었다. (B) 남성 및 여성 MC38 종양에서 TEC(CD45- CD140a-CD31+) 및 CAF(CD45-CD140a-CD31-)의 유세포 분석(왼쪽 패널) 및 빈도(중간 및 오른쪽 패널)의 대표적인 플롯을 나타낸다. (C) 남성 및 여성 MC38 종양에서 PD-L1 발현 TEC(CD45-CD140a-CD31+CD274+)의 유세포 분석(왼쪽 패널) 및 빈도(오른쪽 패널)의 대표적인 플롯을 나타낸다. (D) 남성 및 여성 MC38 종양에서 PD-L1 발현 CAF(CD45-CD140a-CD31-CD274+ 의 유세포 분석(왼쪽 패널) 및 빈도(오른쪽 패널)의 대표적인 플롯을 나타낸다.
도 5는 수컷 마우스에서 MC38 종양 성장에 대한 E2의 억제 효과에 대한 결과를 나타낸다. (A 및 B)는 실험 계획이고, (C) 마우스는 종양 발달에 대해 주당 2 또는 3회 모니터링되었고 종양 크기는 디지털캘리퍼스를 사용하여 측정하였으며, (D) 절제된 종양의 무게를 측정한 결과이다.
도 6은 남성 MC38 종양에서 종양 관련 세포 집단 및 PD-L1 발현에 대한 E2의 억제 효과를 나타낸다. (A) PD-L1 발현 세포(CD274+)의 유세포 분석(상단 패널) 및 빈도(하단 패널)의 대표적인 플롯, (B) 종양 세포(CD45-) 및 TAI(CD45+)의 유세포 분석(상단 패널) 및 빈도(하단 패널)의 대표적인 플롯, (C) PD-L1 발현 종양 세포(CD45-CD274+) 및 PD-L1 발현 TAI(CD45+CD274+)의 유세포 분석(상단 패널) 및 빈도(하단 패널)의 대표적인 플롯이다. (D) TAM(CD11b+F4/80+)(상단 패널) 및 PD-L1 발현 TAM(CD11b+F4/80+CD274+)(하단 패널)의 유세포 분석의 대표적인 플롯이다. (E) TAM의 빈도(CD11b+F4/80+),(F) PD-L1-발현 TAM의 (CD11b+F4/80+CD274+)빈도, (G) TEC(CD45-CD140a-CD31+) 및 CAF(CD45-CD140a-CD31-)의 유세포 분석(상단 패널) 및 빈도(하단 패널)의 대표적인 플롯, (H) PD-L1 발현 TEC(CD45- CD140a-CD31+CD274+)의 유세포 분석(상단 패널) 및 빈도(하단 패널)의 대표적인 플롯, (I) PD-L1 발현 CAF(CD45-CD140a-CD31-CD274+)의 유세포 분석(상단 패널) 및 빈도(하단 패널)의 대표적인 플롯을 나타낸다.
도 7은 수컷 마우스에서 MC38 종양 성장에 대한 항-PD-L1 항체의 항종양 효과에 대한 E2의 상승 효과를 나타낸다. (A 및 B) 실험 계획이고, (C) 26일째에 MC38종양 보유 마우스 및 종양의 대표적인 이미지이며, (D) 마우스는 종양 발달에 대해 주당 2 또는 3회 모니터링되었고 종양 크기는 디지털캘리퍼스를 사용하여 측정하였으며, (E) 절제된 종양의 무게를 측정한 결과이다.
도 8은 PD-L1 발현은 E2 또는 E2 + 항-PD-L1 조합으로 처리된 남성 그룹의 MC38 종양 조직에서 유의하게 더 낮았음을 나타낸다. (A) PD-L1 염색 후 MC38 결장 종양 섹션의 대표적인 IHC 이미지이다. 배율, ×200이며, 빨간색 화살표는 PD-L1 염색된 세포를 나타낸다. (B) 그래프는 수컷 및 암컷 마우스에서 PD-L1 염색 세포의 퍼센트 빈도, (C) 남성 및 여성 MC38 종양에서 PD-L1 발현 세포(CD274+)의 유세포 분석(왼쪽 패널) 및 빈도(오른쪽 패널)의 대표적인 플롯을 나타낸다.
도 9는 수컷 마우스에서 항-PD-L1 항체의 TAM 및 M1 TAM 집단의 변경에 대한 E2의 상승 효과를 나타낸다. (A) 남성 및 여성 MC38 종양에서 CD45-종양 세포의 유세포 분석(왼쪽 패널) 및 빈도(오른쪽 패널)의 대표적인 플롯, (B) 남성 및 여성 MC38 종양에서 PD-L1-발현 종양 세포(CD45-CD274+)의 유세포 분석(왼쪽 패널) 및 빈도(오른쪽 패널)의 대표적인 플롯, (C) TAM 및 M1 TAM, PD-L1 발현 TAM 및 M1 TAM을 결정하기 위한 게이팅 전략이며 단일 세포는 SSC 및 FSC를 사용하여 게이팅되었다. TAM은 단일 세포 집단에서 CD11b+F4/80+ 세포로 결정되었고 M1 TAM은 TAM 집단 내에서 CD86+ 세포로 결정되었다. PD-L1 발현 TAM 및 M1 TAM은 각각 TAM 집단 및 M1 TAM 내에서 CD274+ 세포로 결정되었다. (D) 남성 및 여성 MC38 종양에서 TAM(CD11b+F4/80+)의 유세포 분석(왼쪽 패널) 및 빈도(오른쪽 패널)의 대표적인 플롯이다. (E) 남성 및 여성 MC38 종양에서 M1 TAM(CD11b+F4/80+CD86+)의 유세포 분석(왼쪽 패널) 및 빈도(오른쪽 패널)의 대표적인 플롯이다. (F) 남성 및 여성 MC38 종양에서 PD-L1 발현 TAM(CD11b+F4/80+CD274+)의 유세포 분석(왼쪽 패널) 및 빈도(오른쪽 패널)의 대표적인 플롯이다. (G) 남성 및 여성 MC38 종양에서 PD-L1-발현 M1 TAM(CD11b+F4/80+CD86+CD274+)의 유세포 분석(왼쪽 패널) 및 빈도(오른쪽 패널)의 대표적인 플롯이다.
도 10은 제안된 수컷 마우스의 MC38 종양에 대한 에스트로겐의 조절 메커니즘을 나타낸다. (A) 종양 미세환경에서 PD-L1 발현의 조절인자를 나타낸다. PD-L1의 풍부함은 HIF1α, MYC, STAT3, AP1, NF-κB 및 NRF2와 같은 여러 전사 인자에 의해 조절된다. 종양 세포에서 발현되는 PD-L1은 T 세포의 PD-1에 결합하고 면역 회피에 관여한다. (B) E2 및 항-PD-L1 항체 공동 처리에 의한 PD-L1 존재비의 억제 메커니즘을 나타낸다. E2 결합에 의해 활성화된 ERβ는 핵으로 이동하여 TLR 신호전달 경로에 의해 활성화되는 NF-kB 및 GPCR 신호전달 경로에 의해 활성화되는 NRF2를 억제하여 PD-L1 전사 활성을 억제한다. 항-PD-L1 항체는 PD-L1에 결합하여 T 세포에서 PD-1에 결합하는 PD-L1을 억제한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 본 발명자들은 에스트로겐이 대장암 모델에서 항-PD-L1 치료의 효과를 증가시킬 수 있다고 가정하였고, 대장암 모델에서 에스트로겐과 항-PD-L1 항체의 병용 요법의 효과와 대장암 모델에서 관련 세포 집단, PD-L1 발현 수준 및 암과 관련된 섬유아세포와 종양 세포의 발현 수준을 평가하였다. 또한, 대식세포의 수준을 확인하여 단독 처리한 경우보다 시너지 효과를 발생시키는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 에스트로겐 및 항-PD-L1 항체를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 용어 "약학적 조성물(pharmaceutical composition)"은 본 발명의 에스트로겐을 포함하는 항-PD-L1 항체에 희석제 또는 담체와 같은 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 혼합물을 의미한다. 일부 실시예에 따르면, 본 발명의 에스트로겐을 포함하는 항-PD-L1 항체를 포함하는 약학적 조성물을 그 필요에 따라 대상체에게 투여하는 방법이 제공되어 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물은 인간에게 투여할 수 있다. 본원에 제공된 약학적 조성물의 설명은 원칙적으로 인간에게 투여하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이지만, 통상의 기술자는 이러한 조성물이 일반적으로 모든 종류의 동물에게 투여하기 적합함을 이해하게 될 것이다. 다양한 동물에게 투여하기 위한 약학적 조성물의 변형을 잘 이해하고, 숙련된 수의학 약리학자는 필요하다면 단순히 통상적인 실험으로 이러한 변형을 설계 및/또는 수행할 수 있다.
상기에서 약학적으로 허용되는 염이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
"치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지않거나의 여부를 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.
일부 실시예에서, 본 발명의 에스트로겐 및 항-PD-L1 항체를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 하나 이상의 증상 또는 암 특징을 치료, 경감, 개선, 완화시키고, 그 개시를 지연시키고, 그 진행을 억제시키고, 그 중증도를 감소시키고, 및/또는 그 발생률을 감소시키는 데 유용한 임의의 치료 활성제 또는 절차 (예를 들어, 수술, 방사선 요법)와 조합하여 투여될 수 있다.
일실시예에 있어서, 상기 에스트로겐은 에스트라디올(estradiol), 에스트리올(estriol) 및 에스트론(estrone)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 항-PD-L1 항체는 두르발루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙 및 MDX-1105로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 에스트로겐은 스테로이드 계열의 호르몬으로서, 인간 생식기관의 발달과 성장을 조절하는 물질로 처음 발견되면서 생식계에 국한되는 성호르몬으로 여겨졌으나, 이후 여러가지 연구를 통해 에스트로겐 수용체는 생식계 이외의 심혈관, 골격 및 신경 내분비계의 다른 생리적, 병리학적 과정에 관여하는 것으로 알려진 바 있다. 즉, 에스트로겐은 에스트로겐 수용체를 통해 유전적(genomic) 또는 비유전자적(non-genomic)효과를 보이며, 이러한 에스트로겐 수용체는 크게 ERa와 ERb로 나뉜다. ERa는 유방, 자궁, 난소와 같은 여성 생식기관에 주로 분포하는 반면 ERb는 우리 몸의 여러 기관에 더 광범위하게 분포하고 있고, ERa와는 그 기능이 다름이 밝혀진 바 있다. 에스트로겐은 유방암, 자궁내막암의 위험도를 높이나, 대장암의 위험도를 낮추는 등 각 기관에 대해 다양한 영향을 미칠 수 있다. 본 발명에 있서서, 상기 에스트로겐은 바람직하게는 에스트라디올일 수 있고, 더욱 바람직하게는 에스트라디올 중 17b-estradiol일 수 있다.
상기 항-PD-L1 항체는 T 세포 억제에 관여하는 면역관문단백질(immune checkpoint protein)의 활성화를 차단하여, T 세포를 활성화시켜 암세포를 공격하는 물질을 말한다. 상기 항-PD-L1항체는 암세포 표면에 발현된 단백질과 결합하는 것일 수 있으며, 구체적으로 PD-L1 억제제로 작용할 수 있다.
본 발명의 "항체"는 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 PD-L1 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 PD-L1 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개의 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 이러한 본 발명의 PD-L1 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 대한 항체는 당업계의 공지된 방법으로 제조될 수 있는 모든 항체가 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항-PD-L1 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 상기 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
또한, "면역항암제"란, 방사선, 항암제 등 암세포를 직접적으로 공격하는 치료나 약물 대신 환자의 면역력을 키워 암을 치료할 수 있도록 돕는 치료제를 말한다. 주로 면역 체크포인트 단백질(PD-1, PDL1, CTLA-4)을 찾아 암세포의 면역회피 기능을 마비시켜 T세포(면역세포)가 암세포를 파괴하는 것을 도와주는 방식이다. 몸속의 면역체계가 암세포를 공격하는 성질을 활성화시키는 역할을 하기 때문에 다양한 암에 적용할 수 있으며 소화불량, 구토, 백혈구 감소증, 탈모 등의 부작용도 줄일 수 있다. 현재 면역 체크포인트 단백질을 막는 다양한 항체들이 임상적으로 사용되거나 임상시험 중에 있다. 본 발명에 있어서 면역항암제로서 항-PD-L1을 이용하였다.
본 발명의 약학적 조성물은 임의의 경로로 투여될 수도 있다. 일부 실시예에서, 약학적 조성물은 정맥내, 근육내, 동맥내, 수질내, 척수강내, 피하, 뇌실내, 경피, 피내, 직장, 질내, 복강내, 국소(분말, 연고, 크림, 및/또는 액적에 의함), 점막, 설하; 기관내 점적주입, 기관지 점적주입, 및/또는 흡입을 포함하는 다양한 경로에 의해 투여된다. 구체적으로 고려되는 경로는 침투성 정맥내 주사, 혈액 및/또는 림프 공급을 통한 국부 투여, 및/또는 환부 부위에 대한 직접 투여이다. 일반적으로 투여의 가장 적합한 경로는 작용제의 특성(예를 들어, 위장관의 환경에서의 안정성), 및 대상체의 장애를 포함하는 다양한 인자에 좌우될 것이다. 그러나 본 발명은 약물 전달 분야에서의 진전을 고려하는 임의의 적절한 경로에 의한 본 발명에 따른 약학적 조성물의 전달을 포함한다.
일실시예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 피하주사, 복강내주사, 정맥주사, 근육내 주사의 주입방식에 의하여 투여될 수 있으나, 가장 효과적이고 부작용이 없는 방식이라면 이에 제한되지 않고 투여될 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명의 에스트로겐 및 항-PD-L1 항체를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 매일 대상체 체중의 약 0.001 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 또는 약 1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg을 하루에 1회 이상 전달하기 충분한 투여량 수준으로 투여하여 원하는 치료 효과를 얻을 수도 있다. 목적 투여량은 하루에 세 번, 하루에 두 번, 하루마다, 이틀마다, 삼일마다, 매주마다, 2주마다, 3주마다, 또는 4주마다 전달될 수도 있다. 특정 실시양태에서, 목적 투여량은 다중 투여(예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 회 이상의 투여)를 통해 전달될 수도 있다.
일실시예에 있어서, 상기 에스트로겐과 항-PD-L1 항체의 중량비는 0.5~1.5 : 0.5~1.5 중량비일 수 있으며, 바람직하게는 1:1의 중량비일 수 있고, 통상의 기술자가 적절히 조절할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적인 실시예에서, 실시예 6에 나타난 바와 같이, 에스트로겐과 항-PD-L1은 각각 10mg/kg의 용량으로 투여되었다.
일실시예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 남성 대장암 환자에게 투여되는 것을 특징으로 할 수 있다.
구체적인 일실시예에서 성별이 대장암 성장에 중요한 요인임을 확인하였으며(도 1), 더 높은 비율의 PD-L1 발현하는 TEC가 수컷 마우스의 종양 성장에 기여했다(도 4C). 또한, 종양 성장은 수컷 마우스에서 항-PD-L1 항체 처리 후 크게 감소했으며, 종양 성장은 에스트로겐 및 항-PD-L1 처리로 유의하게 더 느리고, 더 작았다(도 7). 즉, 수컷 마우스에 에스트로겐 및 항-PD-L1 항체를 포함하는 약학적 조성물을 처리하는 경우 유의적으로 종양 성장을 억제함을 확인하였다.
일실시예에 있어서, 상기 에스트로겐은 항-PD-L1 항체와 동시에(simultaneous), 별도(separate), 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있다. 또는, 일실시예에 있어서, 상기 에스트로겐은 항-PD-L1 항체보다 먼저 투여되는 것을 특징으로 할 수 있다.
구체적인 일실시예에서, 에스트로겐의 처리 시간의 효과를 확인하였으며, 도 5A에 나타난 바와 같이 에스트로겐을 먼저 투여한 경우 종양 성장 억제에 중요한 것을 확인하였다. 이후 항-PD-L1 항체를 투여하기 전에 에스트로겐 처리를 한 경우 종양의 크기가 유의하게 낮은 것을 확인하였다(도 7).
일실시예에 있어서, 상기 대장암은 결장암, 직장암, 결장직장암, 대장 선암 및 신경 내분비종양으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상인 것일 수 있으나, 대장암이라면 이에 제한되지 않는다.
한편, TAM(tumor associated macrophage)은 종양(암) 미세환경에서 암 세포의 성장, 증식, 및 전이에 관여하는 대식세포로 알려져 있다. 대식세포는 종양 주변에 밀집하여 그 내부로 침투하여, 암 환자에서 많은 숫자의 TAM이 종양 주변에 존재하면 환자의 예후 및 생존률이 좋지 못한 것으로 보고되고 있다. TAM은 혈관 신생에 기여하며 항암 면역 작용을 억제함으로써 종양의 악화를 가능하게 하므로 암 치료에서 TAM의 제거가 중요하게 여겨지고 있다.　
TAM은 종양(암) 미세환경에 의해 M1 대식세포와 M2 대식세포로 분화된다. 대식세포는 염증 반응을 유도하는 M1 타입과 면역 반응을 억제하는 M2 타입으로 활성화되는데, TAM의 경우 M2의 특성을 공유한다. M1 대식세포는 CLS 대식세포(Crown like structure Macrophage)라고도 불리우며 암세포의 사멸을 야기하고 종양의 증식을 감소시키는 기능을 수행하며, 레지던트 대식세포(resident macrophage)라고 불리우는 M2 대식세포는 M1 대식세포와 달리 암의 미세환경에서 혈관신생을 유도하여 암세포의 전이를 야기하는 것으로 알려져 있다.
일실시예에 있어서, 에스트로겐은 항-PD-L1 항체와 병용투여 되어 다음의 a) 내지 b)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 나타낼 수 있다.
a) TAM(tumor-associated macrophages)의 감소;
b) M1 TAM의 증가.
"병용 투여(administered in combination)"라는 용어는 화합물 또는 성분이 대상 동물에 함께 투여되는 것을 의미한다. 각 화합물 또는 성분이 함께 투여된다는 것은 원하는 치료 효과를 얻기 위해서, 각 성분을 동일한 시간에 또는 임의의 순서로 또는 상이한 시간에 순차적으로 투여될 수 있음을 의미한다.
"상승작용(synergy)"이라는 용어는, 각 성분이 병용(조합) 투여될 때 발생되는 효과가, 단일 성분으로서 단독으로 투여될 때 발생되는 효과의 합보다 더 큰 것을 말한다.
구체적인 일실시예에 있어서, 도 9D 및 도 9E에 나타난 바와 같이 에스트로겐 또는 항-PD-L1 항체를 단독으로 투여한 경우보다 병용투여 한 경우에 유의적으로 TAM은 감소하고, M1 TAM은 증가하여 종양 증식이 억제됨을 확인하였다.
이에 관하여, 도 10은 에스트로겐 및 항-PD-L1 항체 공동 처리에 의한 PD-L1 존재비의 억제 메커니즘을 나타낸다. E2로 표시되는 에스트로겐의 결합에 의해 활성화된 ERβ는 핵으로 이동하여 TLR 신호전달 경로에 의해 활성화되는 NF-kB 및 GPCR 신호전달 경로에 의해 활성화되는 NRF2를 억제하여 PD-L1 전사 활성을 억제한다. 항-PD-L1 항체는 PD-L1에 결합하여 T 세포에서 PD-1에 결합하는 PD-L1을 억제하여 항종양 효과를 나타낸다.
또한, 본 발명은 에스트로겐을 포함하는 항-PD-L1 항체의 대장암 항암효과 증진용 조성물을 제공한다.
대장암 항암효과 증진용 조성물에 대하여 상기 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 중복되는 전술한 기재는 생략한다.
또한, 본 발명은 에스트로겐 및 항-PD-L1 항체를 유효량으로 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대장암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
대장암을 예방 또는 치료하는 방법에 대하여 상기 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 중복되는 전술한 기재는 생략한다.
일실시예에 있어서, 상기 개체는 남성 대장암 환자인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명은 대장암을 예방 또는 치료하기 위한 약제 제조시 에스트로겐 및 항-PD-L1 항체의 용도를 제공한다.
대장암을 예방 또는 치료하기 위한 약제 제조시 에스트로겐 및 항-PD-L1 항체의 용도에 대하여 상기 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 중복되는 전술한 기재는 생략한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[준비예]
세포 배양
Kerafast Inc.(# ENH204-FP, Boston, MA, USA)에서 구입한 MC38 세포는 5% CO2를 포함하는 95% 가습 대기, 37°C 온도에서 10% 소태아혈청(FBS), 2mM L-글루타민, 1mM 피루브산나트륨 10mM HEPES 및 항생제-항진균제 혼합물이 보충된 Dulbecco의 변형 이글 배지(DMEM)에서 유지되었다. 모든 배지는 Gibco BRL(Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)에서 구입했다. 이식을 위해 MC38 세포(계대 번호 7-8)를 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 세척하고, 약간 트립신 처리하고, DPBS로 세척하고, 원하는 농도의 DPBS에 최종 재현탁하기 전에 생존 가능성을 확인했다.
동물 모델
7주령의 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스는 Orient Bio Inc.(한국 서울)에서 입수했으며 23°C에서 명암 주기(12/12h)로 특정 병원체 없는 조건에서 유지했다. 모든 마우스는 성별에 따라 무작위로 나뉘고, 무게를 재고, 그룹화되었으며, 필터 탑 케이지에 케이지당 3-5마리의 마우스가 같은 방에 수용되었다. 동물은 개별 마우스가 실험 기간 동안 추적될 수 있도록 이어 펀치로 표시되었다. 전임상 동물실은 연구 중인 동물: 생체 내 실험 보고(ARRIVE) 지침에 따라 전문 인력이 관리했다. 모든 동물 실험은 분당서울대학교병원 동물관리위원회(IACUC)의 승인을 받았다(승인번호 BA-2013-316-023-01). 실험은 모두 분당서울대학교병원 동물병원 동물관리위원회의 관련 지침 및 규정 및 ARRIVE 지침의 권장 사항에 따라 수행되었다.
유세포분석
제조업체의 지침에 따라 마우스 Tumor Dissociation Kit(# 130-096-730, Miltenyi Biotec, Germany) 및 젠틀MACS™ Octo Dissociator with Heaters(# 130-096-427, Miltenyi Biotec)를 사용하여 종양에서 세포를 분리했다. 모든 단계는 얼음 위에서 수행되었다. 종양 조직을 2-4mm 조각으로 절단하고 제조업체의 지침에 따라 준비된 효소 혼합물이 들어 있는 젠틀맥스™ C 튜브(# 130-096-334, Miltenyi Biotec)로 옮겼다. 그런 다음 샘플이 있는 튜브를 37°C에서 40분 동안 GentleMACS™ Octo Dissociator에서 배양하였다(프로그램: 37C_m_TDK_1). 원심분리 후, 소화된 세포 현탁액을 70-μm 세포 여과기(# 352350, BD Biosciences, USA)를 통해 여과하였다. 다음으로, 단일 세포 현탁액을 Fc 수용체 차단 항체(# 156604, BioLegend Inc., San Diego, CA, USA)와 30분 동안 인큐베이션하여 비특이적 항체 결합을 방지한 다음 형광 표지된 특이적 항체로 염색하였다. 사용된 항체에 대한 자세한 정보는 [표 1]과 같다.
Antigen Label Clone Isotype Conc.(ml/ml) Dilution Supplier, Cat. no., Lot no.
In vivo treatment
PD-L1 - 10F.9G2 Rat IgG2b, κ 6.6 10mg/kg BioXcell, Be0101, 751220D1B
Isotype control - LTF-2 Rat IgG2b, κ 9.45 10mg/kg BioXcell, Be0090, 767920D1
Flow cytometry
CD274(PD-L1) PE 10F.9G2 Rat IgG2b, κ 0.2 1:100 Biolegend, 124308, B318306
CD45 AF488 30-F11 Rat IgG2b, κ 0.5 1:200 Biolegend, 103122, B285085
CD11b PerCP/Cy5.5 M1/70 Rat IgG2b, κ 0.2 1:50 Biolegend, 101228, B308468
F4/80 APC-Cy7 BM8 Rat IgG2a, κ 0.2 1:50 Biolegend, 123118, B335934
CD140a APC APA5 Rat IgG2a, κ 0.2 1:25 Biolegend, 135908, B257183
CD31 PE-Cy7 390 Rat IgG2a, κ 0.2 1:100 Biolegend, 102418, B312607
CD86 FITC GL1 Rat IgG2a, κ 0.5 1:50 BD Biosciences, 553691, 1032076
Immunohistochemistry
PD-L1 - M1H5 Rat IgG2a,λ 1:50 eBioscience, 14-5982-82, 2110796
데이터 수집은 BD FACSCalibur™ 또는 BD FACSAria™ III 유세포 분석기(BD Biosciences)에서 수행했으며 데이터 분석은 BD FACSDiva Software(BD Biosciences, 버전 9.0.1)를 사용하여 수행하였다. 세포 아형은 세포 표면에 발현된 마커의 존재(+로 표시) 또는 부재(-로 표시)로 정의되었다. 사용된 게이팅 전략은 [표 2]에 나열하였다.
Cell population Cell surface marker
Tumor cell CD45-
TAI CD45+
TAM CD11b+ F4/80+
TEC CD45- CD140a- CD31+
CAF CD45- CD140a- CD31-
M1 TAM CD11b+ F4/80+ CD86+
PD-L1-expressing cell CD274+
PD-L1-expressing tumor cell CD45- CD274+
PD-L1-expressing TAI CD45+ CD274+
PD-L1-expressing TAM CD11b+ F4/80+ CD274+
PD-L1-expressing TEC CD45- CD140a- CD31+ CD274+
PD-L1-expressing CAF CD45- CD140a- CD31- CD274+
PD-L1-expressing M1 TAM CD11b+ F4/80+ CD86+ CD274+
TAI, tumor-associated immune cell; TAM, tumor-associated macrophage; TEC, tumor- associated endothelial cell; CAF, cancer-associated fibroblast; PD-L1, programmed death-ligand 1; CD, cluster of differentiation.
통계 분석
PASW Statistics 18 소프트웨어(SPSS, Chicago, IL, USA)를 사용하여 통계 분석을 수행했다. 산점도의 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 표시된다. Mann-Whitney 테스트로 두 그룹 간의 차이의 통계적 유의성을 평가했으며, GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software, San Diego, USA)을 사용하여 그래프를 생성했다. 통계적 유의성은 P < 0.05로 설정되었다.
[실시예 1]
암컷 마우스보다 수컷 마우스에서 더 큰 MC38 종양의 성장 확인
숙주의 성별이 이식된 결장 종양 세포의 성장에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위해, 100 μl DPBS에 재현탁된 총 5 x 105 MC38 세포(계대 번호 7)를 8주령 C57BL/6 수컷 및 암컷 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사했다. MC38 세포 주사 후 205일째에 마우스를 희생시키고(도 1A), 수집된 종양 샘플을 유세포 분석 및 PD-L1 IHC 분석에 사용하였다(도 1B). 구체적으로, 각 군에서 5마리의 마우스를 MC38 암세포 이식에 사용하였고, 각 군에서 종양이 발생하지 않은 1마리의 마우스는 실험에서 제외하였다. 따라서, 도 1A에 기재된 실험에서는 총 10마리의 마우스 중 8마리로부터 결과를 얻었다.
마우스의 종양 성장을 매주 2-3회 모니터링하고 디지털 캘리퍼스를 사용하여 종양 크기를 측정했다. 종양 부피는 (최소 직경)2 × (최대 직경) × 0.5 공식을 사용하여 계산되었다. 희생 당일에 절제된 각 종양의 무게를 측정하고 후속 분석에 사용했다. 동일한 종양을 2개로 분할하여 유세포분석 및 면역조직화학용 샘플을 준비하고 실험을 수행하였다.
그 결과, 수컷 마우스는 암컷 마우스에 비해 유의하게 증가된 MC38 종양 성장을 보였고, 그 차이는 시간이 지남에 따라 증가하였다(도 1C). 종양 무게는 또한 암컷 마우스보다 수컷 마우스에서 유의하게 더 높았다(도 1D; P = 0.043). 이러한 결과로 숙주의 성별이 대장암 성장에 중요한 요인임을 확인하였다.
[실시예 2]
암컷 마우스보다 수컷 마우스의 MC38 종양에서 PD-L1의 더 높은 발현 확인
다음으로, PD-L1의 발현과 PD-L1 발현 세포의 집단이 성별에 의해 영향을 받는지 조사했다. PD-L1 발현을 정량화하기 위해 PD-L1 염색에 대한 IHC 분석을 수컷 및 암컷 마우스의 MC38 종양 조직에서 수행했다.
PD-L1 발현의 면역조직화학(IHC) 분석
종양 조직을 4% 파라포름알데히드로 고정하고 파라핀에 포매했다. PD-L1에 대한 IHC는 제조업체의 지침에 따라 BenchMark XT 자동 슬라이드 염색 시스템(Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, USA) 및 ultraView Universal DAB Detection Kit(Ventana Medical Systems)를 사용하여 수행되었다. 각 섹션은 3% 과산화수소와 정상 혈청으로 차단하였다. 그런 다음 섹션을 항-PD-L1 항체(# 14-5982-82, eBioscience, San Diego, USA)와 함께 인큐베이션했다. 섹션 슬라이드는 Pannoramic 250 Flash III 디지털 슬라이드 스캐너(3DHISTECH Ltd., Budapest, 헝가리)를 사용하여 이미지화되었다. 저전력 필드(배율, 40x) 이미지가 자동으로 획득되었다. PD-L1 발현 세포는 Image-Pro Plus 분석 시스템을 사용하여 정량적으로 평가되었다. 획득한 저배율 이미지 내에서 여러 고배율 필드(배율, 200x)를 세 영역으로 무작위로 선택하여 총 세포 수에서 PD-L1에 대해 염색된 평균 세포 수를 계산했다. 비특이적 PD-L1 염색은 수동으로 제외되었다. 보고된 값은 각 그룹 내 다른 마우스의 다른 이미지의 평균이다. y축의 값은 총 세포 수에서 PD-L1에 대해 염색된 세포의 백분율로 표시하였다.
그 결과, 대표적인 IHC 이미지인 도 2A와 같이, PD-L1 양성 세포의 빈도는 암컷 마우스보다 수컷 마우스에서 유의하게 더 높았다(도 2B; P = 0.021).
또한, PD-L1 발현을 정량화하기 위해 유세포 분석을 수행하였다. 염색된 세포에 대한 게이팅 전략은 도 2C와 같다. 전체 세포 집단에서 PD-L1 발현 세포의 비율은 MC38 종양에서 여성보다 남성에서 더 높았지만, 그 차이는 통계적으로 유의하지 않았다(도 2D). 따라서, IHC 및 유세포 분석으로 결장 종양에서 PD-L1 발현이 성에 의해 영향을 받는다는 것을 확인하였다.
[실시예 3]
성별에 따른 PD-L1 발현 종양 및 종양 내피 세포 집단 비율 확인
다음으로, 우리는 게이팅 전략에 의해 종양 세포, 종양 관련 면역 세포(tumor-associated immune cell, TAI), 종양 관련 대식세포(tumor-associated macrophage, TAM), 종양 내피 세포(tumor- associated endothelial cell, TEC), 암 관련 섬유아세포(cancer-associated fibroblast, CAF)를 포함한 종양 관련 세포 집단의 빈도를 분석했다. 그런 다음, 각 세포 집단에서 PD-L1 발현 세포의 빈도를 분석하였다.
그 결과, CD45- 및 CD45+ 세포는 각각 종양 세포 및 TAI로 확인되었다(도 3A). CD45-종양 세포 집단의 비율에는 성별 차이가 없었지만(도 3B, 중간 패널), PD-L1 발현 종양 세포(CD45-CD274+)는 여성보다 남성의 MC38 종양에서 유의하게 더 높았다(도 3C, 중간 패널, P = 0.043). 대조적으로, TAI(CD45+)(도 3B, 오른쪽 패널) 및 PD-L1-발현 TAI 집단(CD45+CD274+)(도 3C, 오른쪽 패널)의 비율에는 성별 차이가 없었다. 염색된 세포에 대한 게이팅 전략은 도 3C에 나타냈다. TAMs(CD45+CD11b+F4/80+)와 PD-L1-발현 TAMs(CD11b+F4/80+CD274+)의 비율은 성별에 따라 다르지 않았다(도 3E와 3F).
마지막으로 CD45-세포 집단에서 CD140a-CD31+ 세포와 CD140a-CD31- 세포는 각각 TEC와 CAF로 확인되었다(도 4A). 종양에서 CD140a-CD31+ TEC의 비율에는 성별 차이가 없었지만(도 4B, 중간 패널), PD-L1 발현 TEC(CD140a-CD31+CD274+)는 여성보다 남성의 MC38 종양에서 유의하게 더 높았다(도 4C, P = 0.021). 더욱이, CAF 집단은 여성보다 남성의 MC38 종양에서 유의하게 더 높았지만(도 4B, 오른쪽 패널; P = 0.021), 종양 세포, TAI, TAM 및 TEC와 같은 다른 세포 유형과 관련하여 성별 간의 차이는 없었다. 그러나 PD-L1을 발현하는 CAF 집단(CD140a-CD31-CD274+)의 비율은 남성과 여성의 MC38 종양 사이에 유의미한 차이가 없었다(도 4D).
이러한 결과로 MC38 종양에서 더 높은 비율의 PD-L1 발현 종양 및 TEC가 수컷 마우스의 공격적인 종양 성장에 기여했음을 확인하였다.
[실시예 4]
수컷 마우스에서 MC38 종양 성장에 대한 E2의 억제 효과
암컷 마우스에 이식된 MC38 세포의 종양 성장이 수컷 마우스보다 현저히 작았기 때문에 MC38 종양 성장의 차이가 암컷 성 호르몬 때문인지 평가하였다.
E2 처리 시간의 효과를 확인하기 위해 MC38 종양 모델을 사용하여 실험 계획에 따라 수컷 마우스를 E2로 처리하였다. 100μl DPBS에 재현탁된 총 5 x 105 MC38 세포(계대 번호 7)를 8주령 C57BL/6 수컷 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사했다. E2(10 mg/kg)는 MC38 세포의 3일 전(MC38 그룹 전) 또는 주사 당일(MC38 그룹 후)에 MC38 세포를 1주일 동안 주사했다.
구체적으로, 각 군에서 5마리의 마우스를 MC38 암세포 이식에 사용하였고, 각 군에서 종양이 발생하지 않은 1마리의 마우스는 실험에서 제외하였다. 따라서, 도 5A에 기재된 실험에서는 총 15마리의 마우스 중 12마리로부터 결과를 얻었다. 올리브 오일에 녹인 E2(# E8876, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 1주일 동안 매일 총 7차례 10 mg/kg의 농도로 복강 내(i.p.) 투여하였다. E2 처리 시간의 효과를 확인하기 위해 E2를 MC38 세포 주입 3일 전(MC38 그룹 전) 또는 주입 당일(MC38 그룹 후)에 주입했다(도 5A). MC38 세포를 주사한 후 20일째에 마우스를 희생시켰고(도 5A), 수집된 종양 샘플을 유세포 분석에 사용했다(도 5B).
마우스의 종양 성장을 매주 2-3회 모니터링하고 디지털 캘리퍼스를 사용하여 종양 크기를 측정했다. 종양 부피는 (최소 직경)2 × (최대 직경) × 0.5 공식을 사용하여 계산되었다. 희생 당일에 절제된 각 종양의 무게를 측정하고 후속 분석에 사용했다.
그 결과, MC38 종양 성장은 MC38 주사 후 18일째에 대조군 수컷 마우스보다 E2 처리된 수컷 마우스에서 유의하게 더 작았다(도 5C; P = 0.021). 종양 중량은 또한 대조군 수컷 마우스보다 E2 처리된 수컷 마우스(MC38 주사 전)에서 상당히 더 낮았다(도 5D; P = 0.043). 대조적으로, MC38 세포 주사 후 E2 처리는 종양 성장에 대한 억제 효과가 없었다. 이러한 결과로, MC38 종양 세포 이식 전 에스트로겐 치료가 종양 성장 억제에 중요함을 확인하였다.
[실시예 5]
수컷의 MC38 종양에서 종양 세포의 PD-L1 발현 및 CAF 집단에 대한 E2의 억제 효과 확인
총 세포 중 PD-L1 발현 세포의 비율은 대조군보다 E2 처리된 수컷 마우스(MC38 주사 전)에서 유의하게 더 낮았다(도 6A, P = 0.021). 더욱이, CD45-종양 세포 집단의 비율은 E2 처리에 의해 영향을 받지 않았지만(도 6B, 왼쪽 패널), 종양 세포에서 PD-L1의 발현은 MC38 주사 전에 처리한 E2에 의해 감소되었다(도 6C, 왼쪽 패널; P = 0.021). TAI(도 6B, 오른쪽 패널) 또는 PD-L1-발현 TAI(도 6C, 오른쪽 패널) 세포 집단에서 E2 치료 의존적인 변화는 없었다. 예기치 않게 TAM 집단의 비율은 대조군에 비해 E2 처리 후 증가했다(도 6D, 상단 패널 및 도 6E, P = 0.043). 그러나, TAM 집단에서 PD-L1 발현 세포는 대조군에 비해 E2 처리 후 감소하였다(도 6D, 하단 패널 및 도 6F). TEC 및 PD-L1-발현 TEC 집단은 대조군과 비교하여 E2 처리 후 각각 증가 및 감소하였다(도 6G, 왼쪽 패널 및 6H). 또한, 총 CAF 집단은 대조군에 비해 E2 처리 후 유의하게 감소했지만(도 6G, 오른쪽 패널; P = 0.043), CAF 집단에서 PD-L1 발현 세포의 비율은 E2 처리 후 변화를 나타내지 않았다(도 6I).
종합하면, 이들 데이터로 수컷 마우스에 MC38 세포를 주입하기 전에 E2 처리가 암컷 마우스에서 관찰된 것과 유사한 세포 집단의 변화를 초래함을 확인하였다.
[실시예 6]
수컷 마우스의 MC38 종양에서 항-PD-L1 항체의 항종양 효과에 대한 E2의 상승 효과
다음으로, 항-PD-L1 항체의 항종양 효과에 성별 차이가 있는지 여부와 전처리 E2가 항-PD-L1 항체의 항종양 효과를 상승시켰는지 여부를 조사했다. 이를 위해 모든 그룹에서 50-100 mm3 크기의 종양을 가진 마우스를 선택하고 항-PD-L1 항체를 주입했다.
구체적으로, 도 7A에 설명된 실험에서 각 그룹의 10마리의 마우스가 MC38 암세포 이식에 사용되었다. 100 ㎕ DPBS에 재현탁된 총 5 x 105 MC38 세포(8번 계대)를 8주령 C57BL/6 수컷 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. MC38 주사 후 수컷 및 암컷 마우스를 포함하는 종양(50-100 mm3)이 선택되어 항-PD-L1 요법에 사용되었으며, 범위를 벗어난 종양이 있는 마우스는 이 절차에서 제외되었다. 따라서, 도 7A에 기재된 실험에서는 총 60마리의 마우스 중 34마리로부터 결과를 얻었다. 마우스에 In VivoMAb 항-마우스 PD-L1(B7-H1)(# BE0101, 로트 번호 751220D1B, 농도 6.6 mg/ml, BioXcell, 클론 10F.9G2) 또는 In VivoMab 래트 IgG2b 이소형 대조군(# BE0090, 로트 번호 767920D1, 농도 9.45 mg/ml, BioXcell, 클론 LTF-2) 항체 복강내로 3일마다 10mg/kg의 용량으로 총 3회 주사하였다.
E2(10 mg/kg)는 MC38 세포 주입 3일 전에 1주일 동안 복강 내 투여하였다. MC38 세포 주사 후 26일에 마우스를 희생시켰고(도 7A), 실험이 끝날 때 MC38 종양 샘플을 수집하고 PD-L1 발현을 평가하기 위해 FACS 및 IHC를 수행하였다(도 7B).
마우스의 종양 성장을 매주 2-3회 모니터링하고 디지털 캘리퍼스를 사용하여 종양 크기를 측정했다. 종양 부피는 (최소 직경)2 × (최대 직경) × 0.5 공식을 사용하여 계산되었다. 희생 당일에 절제된 각 종양의 무게를 측정하고 후속 분석에 사용했다. 동일한 종양을 2개로 분할하여 유세포분석 및 면역조직화학용 샘플을 준비하고 실험을 수행하였다.
그 결과, MC38 종양 성장은 수컷 마우스에서 항-PD-L1 항체 처리 후 크게 감소했지만 암컷 마우스에서는 그렇지 않았다(도 7C, 7D 및 7E). 더욱이, 종양 성장은 E2 + 항-PD-L1 처리로 유의하게 더 느리고(도 7D; P = 0.007) 더 작았다(도 7E; P = 0.012).
IHC는 [실시예 2]에서 수행된 것과 동일하게 수행되었다. IHC 결과는 PD-L1의 발현이 E2(P = 0.019) 또는 E2 + 항-PD-L1 조합(P = 0.028)으로 처리된 남성 그룹의 MC38 종양 조직에서 남성 대조군과 비교할 때, 더 유의하게 낮음을 보여주었다(도 8A 및 8B). 도 2A 및 2B에 나타낸 바와 같이, PD-L1 발현은 수컷 마우스보다 암컷 마우스에서 유의하게 낮았다(도 8A 및 8B; P = 0.035). 그러나 PD L1 발현 세포의 비율은 그룹 간에 차이가 없었다(도 8C).
다음으로, 종양 및 면역 세포, 특히 대식세포에서 PD-L1 발현을 분석하였다(도 9). 그룹 간에 CD45-종양 세포 집단의 구성에는 차이가 없었지만(도 9A), 종양 세포 집단에서 PD-L1-발현 세포는 수컷 마우스에서만 항-PD-L1-치료 후에 유의하게 감소하였다(도 9B, P = 0.022). TAM 및 M1 TAM에 대한 게이팅 전략은 도 9C에 나타냈다. 흥미롭게도, 남성에서 E2와 항-PD-L1의 동시 투여는 E2 또는 항-PD-L1 단독 치료와 비교할 때 TAM의 유의한 감소(도 9D; P = 0.038)와 M1 TAM의 유의한 증가(CD45+CD11b+F4/80+CD86+)를 초래했다(도 9E, P = 0.032). PD-L1을 발현하는 TAM은 여성에서만 PD-L1 처리 후에 유의하게 감소되었다(도 9F; P = 0.027). 또한 PD-L1을 발현하는 M1 TAMs는 수컷 대조군에 비해 E2 단독(P = 0.007), 항-PD-L1 단독(P = 0.034), 공동 치료군(P = 0.018)에서 유의하게 감소했다(도 9G).
종합하면, 이러한 결과로 수컷 마우스에서 E2 및 항-PD-L1을 사용한 공동 처리가 E2 또는 항-PD-L1 단독 처리에 비해 MC38 종양 성장 및 TAM을 강력하게 억제함을 확인하였다.

Claims (32)

  1. 에스트로겐 및 항-PD-L1 항체를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 에스트로겐은 에스트라디올(estradiol), 에스트리올(estriol) 및 에스트론(estrone)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상이고,
    상기 항-PD-L1 항체는 두르발루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙 및 MDX-1105로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상인 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 피하주사, 복강내주사, 정맥주사 또는 근육내 주사의 주입방식에 의하여 투여되는 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 에스트로겐과 항-PD-L1 항체의 중량비는 0.5~1.5 : 0.5~1.5 중량비인 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 남성 대장암 환자에게 투여되는 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 에스트로겐은 항-PD-L1 항체와 동시에(simultaneous), 별도(separate), 또는 순차적(sequential)으로 투여되거나,
    상기 에스트로겐은 항-PD-L1 항체보다 먼저 투여되는 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 대장암은 결장암, 직장암, 결장직장암, 대장 선암 및 신경내분비종양으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상인 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    에스트로겐은 항-PD-L1 항체와 병용투여 되어 다음의 a) 내지 b)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 나타내는, 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    a) TAM(tumor-associated macrophages)의 감소;
    b) M1 TAM의 증가.
  9. 에스트로겐을 포함하는 항-PD-L1 항체의 대장암 항암효과 증진용 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 에스트로겐은 에스트라디올(estradiol), 에스트리올(estriol) 및 에스트론(estrone)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상이고,
    상기 항-PD-L1 항체는 두르발루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙 및 MDX-1105로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상인 것을 특징으로 하는 항-PD-L1 항체의 대장암 항암효과 증진용 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 피하주사, 복강내주사, 정맥주사 또는 근육내 주사의 주입방식에 의하여 투여되는 것을 특징으로 하는 항-PD-L1 항체의 대장암 항암효과 증진용 조성물.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 에스트로겐과 항-PD-L1 항체의 중량비는 0.5~1.5 : 0.5~1.5 중량비인 것을 특징으로 하는 항-PD-L1 항체의 대장암 항암효과 증진용 조성물.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 남성 대장암 환자에게 투여되는 것을 특징으로 하는 항-PD-L1 항체의 대장암 항암효과 증진용 조성물.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 에스트로겐은 항-PD-L1 항체와 동시에(simultaneous), 별도(separate), 또는 순차적(sequential)으로 투여되거나,
    상기 에스트로겐은 항-PD-L1 항체보다 먼저 투여되는 것을 특징으로 하는 항-PD-L1 항체의 대장암 항암효과 증진용 조성물.
  15. 제9항에 있어서,
    상기 대장암은 결장암, 직장암, 결장직장암, 대장 선암 및 신경내분비종양으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상인 것을 특징으로 하는 항-PD-L1 항체의 대장암 항암효과 증진용 조성물.
  16. 제9항에 있어서,
    에스트로겐은 항-PD-L1 항체와 병용투여 되어 다음의 a) 내지 b)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 나타내는, 항-PD-L1 항체의 대장암 항암효과 증진용 조성물:
    a) TAM(tumor-associated macrophages)의 감소;
    b) M1 TAM의 증가.
  17. 에스트로겐 및 항-PD-L1 항체를 유효량으로 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대장암을 예방 또는 치료하는 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 에스트로겐은 에스트라디올(estradiol), 에스트리올(estriol) 및 에스트론(estrone)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상이고,
    상기 항-PD-L1 항체는 두르발루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙 및 MDX-1105로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상인 것을 특징으로 하는 대장암을 예방 또는 치료하는 방법.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 피하주사, 복강내주사, 정맥주사 또는 근육내 주사의 주입방식에 의하여 투여되는 것을 특징으로 하는 대장암을 예방 또는 치료하는 방법.
  20. 제17항에 있어서,
    상기 에스트로겐과 항-PD-L1 항체의 중량비는 0.5~1.5 : 0.5~1.5 중량비인 것을 특징으로 하는 대장암을 예방 또는 치료하는 방법.
  21. 제17항에 있어서,
    상기 개체는 남성 대장암 환자인 것을 특징으로 하는 대장암을 예방 또는 치료하는 방법.
  22. 제17항에 있어서,
    상기 에스트로겐은 항-PD-L1 항체와 동시에(simultaneous), 별도(separate), 또는 순차적(sequential)으로 투여되거나,
    상기 에스트로겐은 항-PD-L1 항체보다 먼저 투여되는 것을 특징으로 하는 대장암을 예방 또는 치료하는 방법.
  23. 제17항에 있어서,
    상기 대장암은 결장암, 직장암, 결장직장암, 대장 선암 및 신경내분비종양으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상인 것을 특징으로 하는 대장암을 예방 또는 치료하는 방법.
  24. 제17항에 있어서,
    에스트로겐은 항-PD-L1 항체와 병용투여 되어 다음의 a) 내지 b)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 나타내는, 대장암을 예방 또는 치료하는 방법:
    a) TAM(tumor-associated macrophages)의 감소;
    b) M1 TAM의 증가.
  25. 대장암을 예방 또는 치료하기 위한 약제 제조시 에스트로겐 및 항-PD-L1 항체의 용도.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 에스트로겐은 에스트라디올(estradiol), 에스트리올(estriol) 및 에스트론(estrone)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상이고,
    상기 항-PD-L1 항체는 두르발루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙 및 MDX-1105로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상인 것을 특징으로 하는 에스트로겐 및 항-PD-L1 항체의 용도.
  27. 제25항에 있어서,
    상기 약제는 피하주사, 복강내주사, 정맥주사 또는 근육내 주사의 주입방식에 의하여 투여되는 것을 특징으로 하는 에스트로겐 및 항-PD-L1 항체의 용도.
  28. 제25항에 있어서,
    상기 에스트로겐과 항-PD-L1 항체의 중량비는 0.5~1.5 : 0.5~1.5 중량비인 것을 특징으로 하는 에스트로겐 및 항-PD-L1 항체의 용도.
  29. 제25항에 있어서,
    상기 약제는 남성 대장암 환자에게 투여되는 것을 특징으로 하는 에스트로겐 및 항-PD-L1 항체의 용도.
  30. 제25항에 있어서,
    상기 에스트로겐은 항-PD-L1 항체와 동시에(simultaneous), 별도(separate), 또는 순차적(sequential)으로 투여되거나,
    상기 에스트로겐은 항-PD-L1 항체보다 먼저 투여되는 것을 특징으로 하는 에스트로겐 및 항-PD-L1 항체의 용도.
  31. 제25항에 있어서,
    상기 대장암은 결장암, 직장암, 결장직장암, 대장 선암 및 신경내분비종양으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상인 것을 특징으로 하는 에스트로겐 및 항-PD-L1 항체의 용도.
  32. 제25항에 있어서,
    에스트로겐은 항-PD-L1 항체와 병용투여 되어 다음의 a) 내지 b)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 나타내는, 에스트로겐 및 항-PD-L1 항체의 용도:
    a) TAM(tumor-associated macrophages)의 감소;
    b) M1 TAM의 증가.
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