WO2023188138A1 - ホウ素中性子捕捉療法のための微粒子及びそれを含む医薬組成物 - Google Patents

ホウ素中性子捕捉療法のための微粒子及びそれを含む医薬組成物 Download PDF

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WO2023188138A1
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carborane
boron
psar
nanoparticles
plla
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栄次 松浦
学 石本
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国立大学法人 岡山大学
株式会社J-Beam
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to microparticles for boron neutron capture therapy, and more particularly, microparticles for boron neutron capture therapy containing an amphiphilic polymer containing polylactic acid as a hydrophobic block and an o-carborane derivative as a boron-containing compound. Regarding fine particles.
  • Boron-10 an isotope of boron, absorbs neutron beams extracted from nuclear reactors and accelerators, and undergoes a nuclear fission reaction ( 10 B(n, ⁇ ) 7 Li reaction) to form 4 He nuclei ( ⁇ rays). It has the property of emitting 7 Li atomic nuclei. Neutrons are captured by various atomic nuclei, but the probability of capturing a neutron by a 10 B atomic nucleus, expressed by the capture cross section, is much higher than that of the elements that make up living organisms.
  • the range of 4 He atomic nuclei ( ⁇ rays) emitted from 10 B atomic nuclei that have absorbed neutrons is about 9 ⁇ m
  • the range of 7 Li atomic nuclei is about 4 ⁇ m, which are shorter than the diameter of a typical cell. Therefore, by introducing a compound containing 10 B atoms into target cancer cells and irradiating them with neutron beams, cancer cells can be destroyed while preserving normal cells such as immune cells that exist around the cancer tissue.
  • BNCT Boron Neutron Capture Therapy
  • the therapeutic effect is mainly determined by the energy of the neutron beam and the amount of 10 B atoms introduced into the target cells, so boron drugs that can introduce a large number of 10 B atoms into the target cells are used. Development is extremely important. In addition, if we can increase the amount of 10 B atoms in target cells compared to surrounding tissues, we can suppress the energy of neutron beams that cause radiation damage, and also suppress the amount of ⁇ rays and 7 Li atoms generated in surrounding tissues. Therefore, it is expected to be able to kill cancer cells with few side effects.
  • L-BPA 4-borono-L-phenylalanine ( 10 B)
  • 18F -labeled Boron drugs that have been pharmaceutically approved in Japan include [ 18 F]F-BPA ( 18 F-fluoro-borono-L-phenylalanine), boric acid, and BSH (sodium mercaptododecaborate ( 10 B)).
  • BSH sodium mercaptododecaborate
  • L-BPA is a compound in which one molecule of the amino acid phenylalanine is modified with one atom of 10 B.
  • L-BPA is one of the amino acid transporters that is highly expressed in cancer cells. It is taken up into target cells via acid transporter 1) (Non-Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 2 the accumulation of L-BPA in tumors is not high, and currently L-BPA is administered at a concentration as high as 500 mg/kg in order to obtain a sufficient boron concentration in the tumor to be treated.
  • LAT-1 is not necessarily highly expressed in all cancer cells, and there are some cancer types for which it is difficult to apply L-BPA-based BNCT. Therefore, there is a strong need for the development of new boron drugs that can accumulate high concentrations of 10 B atoms in various cancer tissues.
  • Boron clusters such as carborane contain many boron atoms in one molecule, and are attracting attention as boron drugs that can dramatically increase the amount of 10 B atoms introduced into target cells.
  • boron clusters have problems in that they are not easily taken into cells and do not selectively accumulate in cancer tissues.
  • Nanoparticle delivery systems mainly accumulate and accumulate in cancer tissues due to the EPR effect (Enhanced Permeability and Retention Effect) (J. Fang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 63 (2011) 136-151). It is expected that boron drug concentration in cancer tissues can be efficiently increased.
  • Delivery systems for nanoparticle-type boron clusters include liposomes carrying boron clusters (Patent Document 1, Patent Document 2, Non-Patent Document 3, Non-Patent Document 4), polymeric micelles (Patent Document 3, Non-Patent Document 5). ) have been proposed, but to the best of the present inventors' knowledge, BNCT treatment using a nanoparticle-type boron cluster delivery system has not yet been realized.
  • the present invention has been made in view of the problems of the prior art as described above, and one aspect thereof is to provide microparticles for boron neutron capture therapy that can efficiently increase boron concentration in cancer cells.
  • the task is to
  • polylactic acid is known to have high biocompatibility and excellent biodegradability, and is a polymeric material that can be advantageously incorporated into pharmaceuticals applied to living organisms, particularly the human body. While the excellent biodegradability of polylactic acid is an advantage, polylactic acid gradually hydrolyzes in aqueous media, so nanoparticles formed from amphiphilic polymers containing polylactic acid as a hydrophobic block are not necessarily aqueous. Not stable in media.
  • nanoparticles formed from an amphiphilic polymer containing polylactic acid as a hydrophobic block and carborane which is a type of boron cluster, develop relatively quickly when stored in an aqueous medium at room temperature. It collapsed and the supported carborane could not be stably retained.
  • the present inventors surprisingly introduced an alkyl group having a predetermined carbon chain length to the two carbons (C) present in the ortho position of o-carborane. It has been found that o-carborane derivatives can significantly enhance the stability in aqueous media of nanoparticles formed from amphiphilic polymers containing polylactic acid as a hydrophobic block. Nanoparticles carrying the o-carborane derivative can raise the intracellular boron concentration in various cancer cells to a level that far exceeds that of L-BPA, which has been conventionally used in boron neutron capture therapy. The present invention was completed based on the discovery that the present invention can be improved.
  • the present invention Fine particles comprising an amphiphilic polymer having a hydrophilic block and a hydrophobic block, and a boron-containing compound,
  • the hydrophobic block includes polylactic acid,
  • the above problem is solved by providing fine particles in which the boron-containing compound is represented by the following formula (I).
  • ⁇ is C
  • ⁇ is each independently BH or B-halogen
  • R is each independently an optionally substituted saturated or unsaturated A substituent having an alkyl group, the alkyl group having 3 or more carbon atoms.
  • the boron-containing compound represented by the above formula (I) having two alkyl groups having 3 or more carbon atoms at the ortho position is a molecular glue that binds polylactic acid chains together.
  • the number of carbon atoms in the alkyl group of the substituent represented by R in the above formula (I) may be 3 or more and 11 or less, each independently.
  • the boron-containing compound represented by the above formula (I) is a fine particle formed from an amphipathic polymer containing polylactic acid as a hydrophobic block. In addition to being supported particularly efficiently, the particles can have a more significant stabilizing effect on the particles.
  • the polylactic acid contained in the hydrophobic block of the amphipathic polymer constituting the fine particles according to the present invention may be poly(L-lactic acid) or poly(D-lactic acid).
  • Poly(L-lactic acid) or poly(D-lactic acid) forms a left-handed or right-handed ⁇ -helix structure, respectively, and the ⁇ -helix structure formed by these polylactic acid chains has a hydrophobic portion on the outer surface. and can interact more strongly with the boron-containing compound represented by the above formula (I) having two alkyl groups at the ortho positions (FIG. 14). Therefore, when poly(L-lactic acid) or poly(D-lactic acid) is used as polylactic acid, the microparticles according to the present invention can exhibit even better stability.
  • polysarcosine is a polymer of sarcosine (N-methylglycine) that exhibits excellent solubility in water, excellent biodegradability, no immunogenicity, and low nonspecific adsorption of proteins. It is known. Therefore, microparticles formed from amphipathic polymers containing polysarcosine as a hydrophilic block exhibit high blood retention and are expected to accumulate and accumulate in tumors due to the EPR effect.
  • amphiphilic polymer having polysarcosine as a hydrophilic block and polylactic acid as a hydrophobic block for example, a block copolymer of polysarcosine and polylactic acid is suitably used, as shown in the experimental example described later. It can be done.
  • the fine particles according to the present invention are excellent even in an aqueous medium, although they are formed from an amphipathic polymer containing polylactic acid as a hydrophobic block. Furthermore, compared to L-BPA, which has traditionally been used in boron neutron capture therapy, boron concentration in cancer cells can be dramatically increased. Therefore, a composition containing fine particles according to the present invention can be suitably used in a pharmaceutical composition, particularly a pharmaceutical composition for treating cancer by boron neutron capture therapy (BNCT).
  • BNCT boron neutron capture therapy
  • microparticles are provided that have high stability in an aqueous medium and can thereby efficiently increase the boron concentration in target cells.
  • FIG. 1 It is a diagram showing the structure of the AB type polysarcosine-poly(L-lactic acid) block polymer (PSar 106 -block-PLLA 32 ) used in experimental examples, o-carborane, m-carborane, and p-carborane. .
  • PSAR-PLLA nanoparticles Polysarcosine-poly(L-lactic acid) nanoparticles that do not support carborane
  • FIG. 3 is a diagram showing the release behavior of o-carborane from PSAR-PLLA nanoparticles carrying o-carborane in PBS.
  • FIG. 3 is a diagram showing changes in particle size and polydispersity during time dialysis.
  • the structures of the three o-carborane derivatives used in the experimental examples, namely 1,2-dimethyl-o-carborane, 1,2-dihexyl-o-carborane, and 1,2-didodecyl-o-carborane, are shown below.
  • FIG. 2 is a diagram showing the particle size distribution of PSAR-PLLA nanoparticles supporting 2-didodecyl-o-carborane.
  • FIG. 2 A diagram showing a transmission electron micrograph of PSAR-PLLA nanoparticles supporting 1,2-dihexyl-o-carborane.
  • FIG. 2 is a diagram showing the release behavior of -carborane derivatives.
  • FIG. 3 is a diagram showing changes in particle size and polydispersity upon dialysis.
  • FIG. 3 is a diagram showing intracellular boron concentrations in cell CT26, (c) human pancreatic adenocarcinoma cell AsPC-1, and (d) human gastric cancer cell NC1-N87. (a) A diagram showing an outline of the experimental procedure for a cytotoxicity test.
  • FIG. 3 shows the cell viability of mouse breast cancer cells 4T1 brought into contact with nanoparticles or PSAR-PLLA nanoparticles carrying m-carborane.
  • FIG. 2 is a conceptual diagram illustrating the interaction between polylactic acid and a boron-containing compound in PSAR-PLLA nanoparticles in an embodiment of the present invention.
  • the fine particles of the present invention are fine particles containing an amphipathic polymer having a hydrophobic block and a hydrophilic block, and a boron-containing compound.
  • hydrophobic block that an amphipathic polymer has means a polymer chain that has hydrophobicity as a whole block.
  • the hydrophobic property of the hydrophobic block refers to low solubility in water, and more preferably, the amphiphilic polymer containing the hydrophilic block and the hydrophobic block self-assembles or It means that the solubility in water is so low that it can aggregate to form micelle-like or vesicle-like fine particles.
  • the formation of micelle-like or vesicle-like fine particles can be confirmed by those skilled in the art using, for example, a dynamic light scattering method or a transmission electron microscope.
  • the amphipathic polymer that can be contained in the fine particles of the present invention contains polylactic acid as a hydrophobic block.
  • Polylactic acid means a polymer formed by polymerizing lactic acid. Since polylactic acid has excellent biocompatibility and biodegradability, amphiphilic polymers containing polylactic acid as a constituent can be advantageously used as pharmaceutical materials.
  • L-lactic acid which is a monomer of polylactic acid, exists as L-lactic acid and D-lactic acid, which is its optical isomer.
  • Polylactic acid obtained mainly by polymerizing L-lactic acid is poly(L-lactic acid) (PLLA: poly( L-lactic acid)), polylactic acid obtained mainly by polymerizing D-lactic acid, and poly(D-lactic acid) (PDLA), obtained by polymerizing L-lactic acid and D-lactic acid.
  • the polylactic acid that is produced is called poly(DL-lactic acid) (PDLLA).
  • the ⁇ -helical structure formed by the polylactic acid chain has a hydrophobic portion on the outer surface and strongly interacts with the boron-containing compound described below that has two alkyl groups at the ortho position. ( Figure 14). Therefore, it is preferable that the "polylactic acid” that can be contained in the microparticles of the present invention is capable of forming an ⁇ -helical higher-order structure.
  • Such polylactic acid can be, for example, poly(L-lactic acid) and poly(D-lactic acid), and poly(L-lactic acid) can be particularly preferably used.
  • the poly(L-lactic acid) or poly(D-lactic acid) that can be used in the present invention may be one that can form an ⁇ -helical higher-order structure, and does not necessarily have an optical purity of 100% or an isomer content. need not be 0%.
  • Containing polylactic acid as a hydrophobic block includes both a case where all of the hydrophobic block is polylactic acid and a case where a part of the hydrophobic block is polylactic acid. That is, the hydrophobic block that can be used in the present invention may have monomer units other than lactic acid units as long as polylactic acid can form a higher-order structure. There is no particular restriction on the content of monomer units other than lactic acid units that may be included in the hydrophobic block, but it may be 10% or less of all monomer units (including lactic acid units) included in the hydrophobic block. It is preferably 8% or less, even more preferably 5% or less, even more preferably 1% or less, and particularly preferably 0%.
  • hydroxy acids other than lactic acid may be suitably used.
  • a hydroxy acid is an organic compound having a carboxyl group (-COOH) and a hydroxyl group (-OH) in one molecule
  • examples of hydroxy acids other than lactic acid include glycolic acid, 2-hydroxyisobutyric acid, May include 3-hydroxyisobutyric acid and the like.
  • the number of lactic acid units constituting polylactic acid that can be included in the hydrophobic block is not particularly limited, and can be adjusted as appropriate so that the hydrophobic block exhibits the above-mentioned hydrophobicity. It may be from 100 to 100, more preferably from 15 to 80, even more preferably from 20 to 60, even more preferably from 25 to 45. In this specification, the numerical range indicated by "to” means a numerical range including the upper limit and the lower limit.
  • hydrophilic block means a polymer chain having hydrophilic properties.
  • the hydrophilicity of the hydrophilic block means that the hydrophilicity is relatively high compared to at least a hydrophobic block containing polylactic acid, and more preferably, the hydrophilic block and the hydrophobic block are Hydrophilicity refers to the degree of hydrophilicity that allows the amphiphilic polymers contained therein to self-assemble or aggregate in an aqueous medium to form micelle-like or vesicle-like fine particles.
  • hydrophilic block may increase the retention of the microparticles in the blood and, in turn, may improve the ability of the microparticles to reach the tumor site to be treated. From the viewpoint of increasing the accumulation of fine particles, it is preferable to use a hydrophilic polymer with low protein adsorption properties.
  • hydrophilic polymers include, for example, polypeptoids such as polysarcosine and other N-substituted glycine polymers; polyglutamic acid, poly(hydroxyethyl-L-glutamine), poly(hydroxyethyl-L-asparagine), Polyamino acids such as PAS polypeptide consisting of a repeating unit of Pro-Ala-Ser, XTEN polypeptide consisting of a repeating unit of Gly-Ala-Pro-Glu-Ser-Thr, or their derivatives; Saccharides: Zwitterionic polymers such as phosphobetaine polymers, sulfobetaine polymers, carboxybetaine polymers; polyethylene glycol, polyglycerol, poly(2-ethyl-2-oxazoline), poly(2-methyl-2-oxazoline), polyvinylpyrrolidone , uncharged synthetic polymers such as poly(2-hydroxyethyl methacrylate).
  • polypeptoids such as polysarco
  • the number of monomer units of the polymer constituting the hydrophilic block there is no particular restriction on the number of monomer units of the polymer constituting the hydrophilic block, and it may be adjusted as appropriate depending on the type of polymer or monomer constituting the hydrophilic block so that the hydrophilic block exhibits the above-mentioned hydrophilicity.
  • it may be 10 to 300, preferably 20 to 250, more preferably 30 to 200, still more preferably 40 to 150, even more preferably 50 to 100.
  • the hydrophilic block may be linear or branched.
  • the number of branches is not particularly limited, but is preferably 2 to 3.
  • the number of monomer units constituting the hydrophilic block as a whole is, for example, 10 to 300, preferably 20 to 250, more preferably 30 to 200, even more preferably , 40 to 150, more preferably 50 to 100.
  • amphipathic polymer The amphiphilic polymer that can be contained in the fine particles of the present invention is not particularly limited as long as it contains a hydrophilic block and a hydrophobic block as explained above. It has a hydrophilic block containing sarcosine.
  • Polysarcosine refers to a polymer formed by polymerizing sarcosine (also referred to as "N-methylglycine"). Polysarcosine has high biocompatibility, has low adsorption of non-specific proteins, and has low immunogenicity and can avoid the ABC (accelerated blood clearance) phenomenon (K. Son et al., J. Controlled Rel.
  • amphipathic polymer having a hydrophobic block containing polylactic acid and a hydrophilic block containing polysarcosine is, for example, polysarcosine-polylactic acid, which is a block copolymer formed by bonding polysarcosine and polylactic acid.
  • polysarcosine-polylactic acid is known to self-assemble in an aqueous medium to form fine particles with a diameter of approximately 20 nm to 200 nm (M. Akira et al., Chemistry Letters, 2007, 36(10) , 1220-1221).
  • the fine particles formed by polysarcosine-polylactic acid have a high retention property in the blood and are less likely to accumulate in the liver.
  • a block copolymer of polysarcosine and polylactic acid can be particularly suitably used as an amphipathic polymer that can be included in the fine particles of the present invention.
  • polysarcosine may be linear, branched, or contain both.
  • polysarcosine-polylactic acid containing linear polysarcosine include AB type polysarcosine-polylactic acid block polymers.
  • the AB type polysarcosine-polylactic acid block polymer and its synthesis method are disclosed, for example, in International Publication No. WO2009/148121.
  • polysarcosine-polylactic acid containing branched polysarcosine includes, for example, an A3B type polysarcosine-polylactic acid block polymer, which is a block polymer of tri-branched polysarcosine and polylactic acid.
  • A3B type polysarcosine-polylactic acid block polymer and its synthesis method are described, for example, in International Publication No. WO2012/176885, M. S. H. Lim et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 2021, 110, 1788-1798, and M. S. H. Lim et al. , Life 2021, 11(2), 158.
  • Nanoparticles formed from A3B type polysarcosine-polylactic acid block polymers can further reduce the ABC phenomenon compared to nanoparticles formed from AB type polysarcosine-polylactic acid block polymers.
  • the number of repeating sarcosine units constituting the hydrophilic block polysarcosine is not particularly limited as long as the hydrophilic block as a whole exhibits the above-mentioned hydrophilicity, but for example, , 10 to 300, preferably 20 to 250, more preferably 30 to 200, even more preferably 40 to 150, even more preferably 50 to 100.
  • the number of repeating sarcosine units in the entire hydrophilic block is, for example, 10 to 300, preferably 20 to 250, more preferably 30 to 200, and still more preferably 40. It may be from 150 to 150, more preferably from 50 to 100.
  • the number of branches is not particularly limited, but is preferably 2 to 3.
  • the number of repeating lactic acid units constituting polylactic acid which is the hydrophobic block of the polysarcosine-polylactic acid block copolymer, is not particularly limited as long as the hydrophobic block as a whole exhibits the above-mentioned hydrophobicity.
  • it may be 10 to 100, preferably 15 to 80, more preferably 15 to 60, even more preferably 20 to 50, even more preferably 25 to 45.
  • the number of repeating lactic acid units in the entire hydrophobic block may be, for example, 10 to 400, preferably 20 to 200.
  • the number of branches in the hydrophobic block is less than or equal to the number of branches in the hydrophilic block. It is preferable that
  • the boron-containing compound that can be contained in the fine particles of the present invention is a compound represented by the following formula (I), that is, an o-carborane derivative.
  • ⁇ is C
  • ⁇ is each independently BH or B-halogen
  • R is each independently an optionally substituted saturated or unsaturated alkyl group is a substituent having the following, and the number of carbon atoms in the alkyl group is 3 or more.
  • each independently means that each may be the same or different.
  • the boron-containing compound represented by the above formula (I) has 3 or more carbon atoms present in the ortho position in fine particles formed from an amphipathic polymer containing polylactic acid as a hydrophobic block.
  • the polylactic acid chains that constitute the hydrophobic core of the microparticles especially the polylactic acid chains that form an ⁇ -helical structure, through the two alkyl groups mentioned above, it acts as a molecular glue that binds the two polylactic acid chains.
  • the stability of the microparticles in an aqueous medium can be dramatically increased (FIG. 14).
  • the number of carbon atoms in the alkyl group is preferably 3 or more, more preferably 4 or more, still more preferably 5 or more, even more preferably 6 or more.
  • the formula (I) Since the boron-containing compound represented by formula forms aggregates by itself, there is a possibility that the boron-containing compound will be difficult to be supported on the fine particles.
  • the number of carbon atoms in the alkyl group is preferably 11 or less, more preferably 10 or less, more preferably 9 or less, even more preferably 8 or less, even more preferably 7 or less, even more preferably is less than or equal to 6.
  • the number of carbon atoms in the alkyl group is preferably 3 or more, more preferably 3 or more and 11 or less, even more preferably 4 or more and 10 or less, even more preferably 4 or more and 9 or less, and even more preferably 5 or more. It is 8 or less, more preferably 5 or more and 7 or less, particularly preferably 6.
  • substituents having an alkyl group include an optionally substituted saturated or unsaturated alkyl group, an optionally substituted saturated or unsaturated alkoxy group, or an optionally substituted saturated or unsaturated alkoxy group. It includes a saturated alkylthio group, but an optionally substituted saturated or unsaturated alkyl group is preferred, an optionally substituted saturated alkyl group is more preferred, and an unsubstituted saturated alkyl group It is more preferable that Furthermore, the substituent having an alkyl group may be linear or branched, but is preferably linear.
  • substituents having an alkyl group having 3 or more carbon atoms include n-propyl group (-(CH 2 ) 2 CH 3 ), n-butyl group (-(CH 2 ) 3 CH 3 ). , n-pentyl group (-(CH 2 ) 4 CH 3 ), n-hexyl group (-(CH 2 ) 5 CH 3 ), n-heptyl group (-(CH 2 ) 6 CH 3 ), n- Alkyl groups represented by the general formula (-(CH 2 ) n CH 3 )) (where n is 2 or more) such as octyl group (-(CH 2 ) 7 CH 3 ), n-propoxy group (-O( CH 2 ) 2 CH 3 )), n-butoxy group (-O(CH 2 ) 3 CH 3 )), n-pentoxy group (-O(CH 2 ) 4 CH 3 )), n-hexyloxy group (- Alkoxy groups represented by the general
  • n in the general formula is preferably is 2 or more and 10 or less, more preferably 3 or more and 9 or less, even more preferably 3 or more and 8 or less, still more preferably 4 or more and 7 or less, still more preferably 4 or more and 6 or less, particularly preferably 5.
  • Specific examples of the boron-containing compound represented by the above formula (I) having a substituent having an alkyl group as R include 1,2-dihexyl-schreib- shown in the experimental example described below. Examples include carborane.
  • substitutable hydrogen atoms constituting the group are unsubstituted and substituted.
  • substitutable hydrogen atoms are not substituted means that all substitutable hydrogen atoms are hydrogen atoms.
  • substitutable hydrogen atoms are substituted means that at least one of the substitutable hydrogen atoms is substituted with an atom other than a hydrogen atom or a carbon atom.
  • atoms with relatively high hydrophobicity are preferred. Specific examples of such atoms include, but are not limited to, halogens such as fluorine, chlorine, bromine, iodine, and astatine. There may be multiple replacement locations.
  • o-carborane derivative represented by the above formula (I) can be synthesized by a suitable method by those skilled in the art.
  • o-carborane derivatives in which the substituent represented by R in formula (I) is an optionally substituted saturated or unsaturated alkyl group can be prepared by reacting o-carborane with a strong base such as BuLi or PhLi. can be obtained by then reacting with an appropriate alkyl halide.
  • o-carborane derivatives in which the substituent represented by R in formula (I) is an optionally substituted alkoxy group or alkylthio group are o-carborane derivatives having hydroxyl groups (-OH) at the 1st and 2nd positions.
  • o-carborane derivative (1,2-(OH) 2 -1,2-closo-C 2 B 10 H 10 ; CAS number 868382-62-1) or o-carborane derivative (1, 2-(SH) 2 -1,2-closo-C 2 B 10 H 10 ; CAS number 23810-63-1) is reacted with an appropriate alkyl halide in the presence of a strong base such as KOH to form alkoxylation or alkylthio. It can be obtained by converting However, the method for synthesizing o-carborane derivatives is not limited to the above, and those skilled in the art can use any appropriate method (TL Heying et al., Inorg. Chem. 1963, 2(6), 1097- 1105; M. M. Fein et al., Inorg. Chem. 1963, 2(6), 1115-1119).
  • the boron-containing compound that can be contained in the fine particles of the present invention preferably contains boron 10 ( 10 B) as boron.
  • boron 10 ( 10 B) Two naturally occurring isotopes of boron are known: boron 10 ( 10 B) and boron 11 ( 11 B). accounts for approximately 80.1%.
  • Boron neutron capture therapy uses the fission reaction caused by 10 B, one of these boron isotopes. Therefore, from the viewpoint of use in boron neutron capture therapy, the isotope ratio of 10 B in the boron-containing compound that can be contained in the fine particles of the present invention is preferably 19.9% or more, more preferably 50% or more. It is preferably 70% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 90% or more.
  • the isotope ratio of 10 B in boron-containing compounds can be increased by using boron with increased 10 B content ( 10 B enriched boron) as a raw material.
  • 10 B enriched boron 10 B content
  • a chemical exchange distillation method is known as a method for producing 10 B concentrated boron.
  • the fine particles according to the present invention are fine particles containing the above-described amphiphilic polymer and a boron-containing compound.
  • the fine particles according to the present invention are typically made of amphiphilic polymers obtained by self-assembly of amphiphilic polymers containing a hydrophilic block and a hydrophobic block and a boron-containing compound in an aqueous medium. These are fine particles formed by non-covalently bonding with a boron-containing compound.
  • an amphipathic polymer containing polylactic acid and a boron-containing compound represented by the above formula (I) may be mixed. It may be prepared by a method of preparation comprising the steps of obtaining a mixture and contacting said mixture with an aqueous medium.
  • the fine particles of the present invention may typically be polymeric micelle-like fine particles.
  • Polymer micellar fine particles are typically core-shell type fine particles having a shell composed of hydrophilic blocks and a core composed of hydrophobic blocks.
  • the form of the fine particles of the present invention may be vesicle-like hollow fine particles. Vesicle-like hollow particles formed from amphiphilic polymers having polylactic acid as a hydrophobic block can be appropriately prepared by those skilled in the art (H. Yin et al., Macromolecules 2009, 42(19), 7456- 7464; H. Qi et al., Nature communications 9, Article number: 3005 (2018)).
  • the fine particles may have an average particle size of 20 nm to 500 nm in diameter as measured by dynamic light scattering.
  • the average particle size (diameter) measured by dynamic light scattering is 20 nm to 150 nm.
  • the wavelength is preferably 20 nm to 140 nm, more preferably 20 nm to 130 nm, even more preferably 20 nm to 120 nm.
  • the diameter of the fine particles can be appropriately controlled by adjusting the molecular weight of the amphipathic polymer constituting the fine particles, the ratio of hydrophilic blocks to hydrophobic blocks, and the like.
  • nanoparticles with smaller particle sizes can be prepared compared to nanoparticles formed from polysarcosine-polylactic acid block polymers of type AB ( M. S. H. Lim et al., Life 2021, 11(2), 158).
  • the amount of boron supported in the fine particles according to the present invention is no particular restriction on the amount of boron supported in the fine particles according to the present invention, but as long as the fine particles themselves are stable, it is preferable that the amount of boron supported is large.
  • the ratio of the amphipathic polymer and the boron-containing compound there is no particular restriction on the ratio of the amphipathic polymer and the boron-containing compound, but for example, the molar ratio (A/B) of (A) boron contained in the boron-containing compound and (B) the amphipathic polymer can be 0.1 to 30.0, 0.2 to 15.0, 0.3 to 12.0, 0.5 to 8.0, 0.5 to 5.0, or 0.6 to 3.5.
  • the microparticles according to the present invention may contain targeting molecules.
  • the targeting molecule refers to a chemical substance that can increase the ability of microparticles containing targeting molecules to accumulate in target tissues or bind to target cells, compared to when they do not contain targeting molecules. Specifically, it is a molecule that has the property of selectively binding to substances such as proteins that are highly expressed specifically in target cells.
  • Such targeting molecules are not particularly limited, but may be, for example, antibodies, small antibody variants, proteins, peptides, peptoids, nucleic acids, vitamins, sugars, and the like.
  • targeting molecules are molecules that selectively bind to specific substances present in target cells, they are preferably present on the surface of the microparticles.
  • Fine particles having targeting molecules on the particle surface can be obtained by preparing fine particles using, for example, an amphipathic polymer in which a targeting molecule is bound to the end of a hydrophilic block contained in the above-mentioned amphipathic polymer. Obtainable. In addition to amphiphilic polymers and boron-containing compounds, we have also prepared microparticles using a combination of polylactic acid and targeting molecules, in which targeting molecules are bound to the terminals of polylactic acid, to carry targeting molecules. Fine particles may also be prepared.
  • the microparticles according to the present invention may contain a cell-penetrating peptide.
  • Cell-penetrating peptides are peptides that have the property of permeating cell membranes of cells, particularly human cells, and microparticles containing cell-penetrating peptides can be efficiently introduced into cells.
  • TAT peptide TAT peptide
  • penetratin penetratin
  • polyarginine R9
  • transportan transportan
  • Pep-1 Pep-1.
  • Microparticles containing cell-penetrating peptides can be prepared, for example, by using an amphiphilic polymer in which a cell-penetrating peptide is bound to the end of a hydrophilic block contained in the above-mentioned amphipathic polymer.
  • microparticles can be prepared using a combination of polylactic acid and a cell-penetrating peptide, in which a cell-penetrating peptide is bound to the terminal of polylactic acid.
  • Microparticles carrying cell-penetrating peptides may also be prepared.
  • methods of preparing microparticles carrying cell-penetrating peptides see, for example, M. S. H. Lim et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 2021, 110, 1788-1798 and M. S. H. Lim et al., Life 2021, 11(2), 158.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention contains the fine particles as described above.
  • it can be particularly preferably used for cancer treatment, more specifically, cancer treatment by boron neutron capture therapy.
  • treatment of cancer includes not only curing the cancer completely, but also reducing the size of the cancer, alleviating or improving the symptoms of the cancer, and the progression of the cancer. This includes delaying the
  • cancer there are no particular limitations on the type of cancer for which the pharmaceutical composition of the present invention can be used, but examples include brain tumors (meningioma, glioma, pituitary tumor, acoustic neuroma, glioblastoma multiforme, etc.) , malignant melanoma, head and neck cancer, lung cancer, liver cancer, thyroid cancer, kidney cancer, prostate cancer, breast cancer, pancreatic cancer, colorectal cancer, bladder cancer, meningioma, mesothelioma, sarcoma, stomach cancer, ovarian cancer, uterus Cancer, solid cancers including cervical cancer, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, etc. and blood cancers may be included.
  • brain tumors meningioma, glioma, pituitary tumor, acoustic neuroma, glioblastoma multiforme, etc.
  • malignant melanoma head and neck cancer
  • lung cancer liver cancer, thyroid
  • boron neutron capture therapy is known to be effective in treating head and neck cancers such as highly malignant brain tumors in which cancer cells and normal cells coexist, as well as malignant melanoma.
  • the pharmaceutical composition according to the invention can be particularly suitably used for the treatment of head and neck cancer and malignant melanoma.
  • an appropriate administration method may be selected depending on the subject to which they are applied. Examples include, but are not limited to, oral administration, sublingual administration, intravenous administration, intraarterial administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, local administration including intratumoral administration, and drip administration.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited, and may be an appropriate dosage form depending on the intended subject and administration method.
  • the dosage form can be, but is not limited to, injections, tablets, powders, granules, liquids, syrups, capsules, and the like. It may also be a ready-to-use preparation.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain pharmaceutically acceptable excipients, binders, disintegrants, lubricants, coatings, solvents, buffers, and preservatives. , a chelating agent, an antioxidant, an isotonizing agent, etc., may of course be included.
  • Excipients that may be included in the pharmaceutical composition of the present invention include, but are not limited to, lactose, mannitol, crystalline cellulose, corn starch, and the like. Binders may include, but are not limited to, crystalline cellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, and the like. Disintegrants may include, but are not limited to, hydroxypropyl cellulose, carboxymethyl cellulose, corn starch, croscarmellose, and the like. Lubricants may include, but are not limited to, magnesium stearate, calcium stearate, talc, carnauba wax, and the like.
  • Coatings may include, but are not limited to, hydroxypropyl methylcellulose, polyethylene glycol, talc, titanium oxide, iron oxide, and the like.
  • Solvents may include, for example, but are not limited to, water, ethanol, propylene glycol, glycerin, vegetable oil, and the like.
  • Buffers may include, for example, but are not limited to, phosphate buffers, borate buffers, citrate buffers, tartrate buffers, acetate buffers, amino acids, and the like.
  • preservatives include quaternary ammonium salts such as benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid esters such as methyl paraoxybenzoate, benzyl alcohol, sorbic acid and its salts, thimerosal, parabens, cetylpyridinium chloride, and catechin.
  • quaternary ammonium salts such as benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid esters such as methyl paraoxybenzoate, benzyl alcohol, sorbic acid and its salts, thimerosal, parabens, cetylpyridinium chloride, and catechin.
  • Chelating agents may include, for example, but are not limited to, sodium edetate, citric acid, and the like.
  • Antioxidants may include, for example, but are not limited to, sodium bisulfite, sodium sulfite, sodium pyrosulfite, ascorbic acid, ascorbic acid glycoside, and the like.
  • Isotonic agents may include, but are not limited to, glucose and common salt, for example.
  • the pharmaceutical according to the present invention may contain one or more active ingredients that are mixed in other pharmaceuticals, such as anticancer drugs, photosensitizers, and nucleic acids such as siRNA and mRNA. .
  • a method for preparing fine particles supporting substances such as photosensitizers and nucleic acids is described in, for example, M. S. H. Lim et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 2021, 110, 1788-179.
  • Microparticles carrying photosensitizers and nucleic acids are not limited to cancer treatment using BNCT, but can be effectively used for cancer treatment using photodynamic therapy (PDT) and RNA interference (RNAi).
  • PDT photodynamic therapy
  • RNAi RNA interference
  • a method for producing fine particles according to one embodiment of the present invention includes a step of mixing an amphiphilic polymer containing polylactic acid and a boron-containing compound represented by the formula (I) to obtain a mixture; This is a method for producing fine particles, including a step of contacting them with an aqueous medium.
  • Amphipathic polymers including polylactic acid have the property of forming fine particles by self-assembly when they come into contact with an aqueous medium.
  • the method for producing fine particles including the above steps may include, for example, a film method and an injection method (International Publication No. WO2012/176885).
  • the film method refers to a film-like mixture obtained by drying a solution containing an amphiphilic polymer and a boron-containing compound in an organic solvent, and an aqueous medium, as shown in the experimental examples described below.
  • the method may include: The above steps (a1), (a2), and (a3) are usually performed in this order.
  • the organic solvent used in step (a1) above is not particularly limited as long as it can dissolve both the amphipathic polymer and the boron-containing compound, but suitable examples include chloroform, dimethylformamide, and dimethylsulfoxide. It can be used for There are no particular limitations on the method for removing the organic solvent in step (a2) above, and those skilled in the art can adopt any appropriate method depending on the organic solvent used. For example, the solvent may be removed by drying under reduced pressure or by natural drying.
  • the aqueous medium used in step (a3) above is not particularly limited as long as it is water or a solvent containing water as a main component, but examples include distilled water for injection, physiological saline, and buffer solutions (e.g. , PBS), etc. can be suitably used.
  • the method for producing fine particles according to the present invention may further include, after the step (a3) above, a step of stirring or ultrasonicating the mixture of the film and the aqueous medium.
  • the injection method is a method in which a solution containing an amphiphilic polymer and a boron-containing compound in an organic solvent is dispersed in an aqueous medium to obtain a dispersion in which fine particles are dispersed in the aqueous medium.
  • (b1) preparing a mixed solution containing an amphipathic polymer and a boron-containing compound in an organic solvent; (b2) dispersing the liquid mixture in an aqueous medium; and (b3) removing the organic solvent;
  • the method may include: The above steps (b1), (b2), and (b3) are usually performed in this order.
  • the organic solvent used in the step (b1) above is not particularly limited as long as it can dissolve both the amphipathic polymer and the boron-containing compound, but for example, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, etc. are preferably used. It can be done.
  • a mixture containing an amphipathic polymer and a boron-containing compound in an organic solvent is injected into an aqueous medium and mixed, and the amphipathic polymer and boron-containing compound are mixed together.
  • the aqueous medium used in this step is not particularly limited as long as it is water or a solvent mainly composed of water, but examples include distilled water for injection, physiological saline, and a buffer solution (e.g., PBS). etc. may be suitably used.
  • the method for dispersing a mixed solution containing an amphipathic polymer and a boron-containing compound in an organic solvent in an aqueous medium can be carried out using a stirrer.
  • the method for removing the organic solvent from the aqueous medium containing the organic solvent there is no particular restriction on the method for removing the organic solvent from the aqueous medium containing the organic solvent, and those skilled in the art can adopt any appropriate method.
  • the organic solvent may be removed in a reduced pressure environment.
  • the above production method may further include an appropriate purification step before or after the step (b3) above.
  • purification methods include, but are not limited to, gel filtration chromatography, filter treatment, ultracentrifugation, and the like. Furthermore, these purification methods may be combined as necessary.
  • the method for producing fine particles according to the present invention includes a step of mixing a polymer containing polylactic acid and a boron-containing compound represented by the formula (I) to obtain a mixture; The method may include the step of contacting the mixture with an aqueous medium.
  • the present invention also provides a stabilizer for fine particles containing polylactic acid, which contains a boron-containing compound represented by the above formula (I) as an active ingredient.
  • the boron-containing compound represented by the above formula (I) is expected to have a stabilizing effect on fine particles formed from a polymer containing polylactic acid.
  • a stabilizer for fine particles containing polylactic acid is an agent that improves the stability of fine particles in an aqueous medium compared to fine particles that do not contain the stabilizer, or an agent that improves the stability of fine particles in an aqueous medium compared to fine particles that do not contain the stabilizer. It can be an agent that retards disintegration.
  • the stability or disintegration of fine particles in an aqueous medium can be evaluated by those skilled in the art, for example, by observing changes in particle diameter of fine particles over time using a dynamic light scattering method.
  • Nanoparticles carrying carborane as a boron-containing compound were prepared.
  • Amphiphilic polymers for preparing nanoparticles include polysarcosine-poly(L-lactic acid) block polymer (PSAR-PLLA) with polysarcosine as the hydrophilic block and poly(L-lactic acid) as the hydrophobic block.
  • AB-type polysarcosine-poly(L-lactic acid) block polymer PSar 106 -block-PLLA 32 ) (weight average molecular weight: 10,001 Da) (Kobe (manufactured by Tennen Kagaku Co., Ltd.) was used.
  • PSAR-PLLA polymer weight average molecular weight: 10,001 Da
  • the above AB type polysarcosine-poly(L-lactic acid) block polymer was referred to as "PSAR-PLLA polymer”
  • the nanoparticles prepared using the block polymer were referred to as "polysarcosine-poly(L-lactic acid)”. They are sometimes called "lactic acid nanoparticles" (PSAR-PLLA nanoparticles).
  • Figure 1 shows the structures of PSar 106 -block-PLLA 32 , o-carborane, m-carborane, and p-carborane used in this experiment.
  • PSAR-PLLA nanoparticles carrying o-carborane, m-carborane, and p-carborane were prepared by a film method. That is, 1 ⁇ mol of PSAR-PLLA polymer was dissolved in 1.0 mL of chloroform to obtain a solution containing PSAR-PLLA polymer. On the other hand, 10 ⁇ mol of carborane (o-carborane, m-carborane, or p-carborane) was dissolved in 100 ⁇ L of chloroform to obtain a solution containing carborane.
  • PSAR-PLLA nanoparticles not carrying carborane were prepared in the same manner as above, except that a solution containing carborane was not used.
  • the boron loading rate (DLC (%)) of PSAR-PLLA nanoparticles was calculated according to the following formula.
  • “weight of loaded drug” is the boron loading amount determined by the ICP-AES method
  • “weight of nanoparticles” is the mass of the PSAR-PLLA polymer used to prepare PSAR-PLLA nanoparticles. It is.
  • the boron loading rates (DLC(%)) in PSAR-PLLA nanoparticles carrying o-carborane, m-carborane, or p-carborane are 13.0%, 3.49%, and 1.80%, respectively. It was confirmed that both carboranes were supported on PSAR-PLLA nanoparticles. In particular, among the three carborane isomers, the boron loading rate when o-carborane was used was 13.0%, which was significantly higher than the boron loading rate when m-carborane or p-carborane was used. .
  • Table 2 shows the results of measuring the particle size and polydispersity of PSAR-PLLA nanoparticles supporting three types of carboranes using a dynamic light scattering method. Note that Table 2 also shows the particle size and polydispersity of PSAR-PLLA nanoparticles not carrying carborane for comparison.
  • the PSAR-PLLA nanoparticles supporting o-carborane, m-carborane, or p-carborane all have a particle size of about 60 nm to 72 nm and a PDI of about 0.20.
  • the nanoparticles had the same particle size and PDI as unsupported PSAR-PLLA nanoparticles.
  • PSAR-PLLA nanoparticles carrying o-carborane had the smallest polydispersity and an extremely monodisperse particle size distribution.
  • Figure 2 shows a histogram of the particle size distribution obtained by dynamic light scattering for PSAR-PLLA nanoparticles carrying o-carborane and PSAR-PLLA nanoparticles not carrying carborane.
  • the o-carborane-loaded PSAR-PLLA nanoparticles are highly monodisperse, similar to the non-carborane-loaded PSAR-PLLA nanoparticles. Furthermore, when PSAR-PLLA nanoparticles carrying o-carborane were confirmed using a transmission electron microscope, nanoparticles with a particle size distribution corresponding to the results shown by dynamic light scattering were confirmed ( Figure 2 ).
  • FIG. 3(a) An overview of the experimental procedure is shown in Figure 3(a).
  • a cell suspension containing mouse breast cancer cells 4T1 (ATCC, Rockville, Maryland, USA) at a concentration of 0.5 ⁇ 10 5 cells/mL in cell culture medium was placed in a 6-well microplate at 1 cell suspension per well. mL portions were inoculated and incubated for 24 hours in an environment of 5% CO 2 and 37 ° C. according to a conventional method.
  • PSAR-PLLA nanoparticles or L-BPA carrying o-carborane prepared in Experiment 1-1 were added to the cell culture medium so that the boron concentration in the cell culture medium was 2 mM. or incubated for 6 hours.
  • the cells were washed three times with PBS according to a conventional method, and then recovered by trypsin treatment.
  • the obtained collected solution was centrifuged at 1,800 rpm for 5 minutes, and the supernatant was removed to obtain a pellet.
  • the resulting pellets were treated with 60% nitric acid (1 mL) overnight at room temperature. Thereafter, it was filtered through a syringe filter with a pore size of 0.45 ⁇ m, and pure water was added to the obtained filtrate to make the total volume 10 mL.
  • the solution thus obtained was subjected to ICP-AES, and the boron content in the solution was measured.
  • PSAR-PLLA nanoparticles carrying o-carborane can efficiently increase the boron concentration in cancer cells compared to using L-BPA, and o- It is suggested that PSAR-PLLA nanoparticles loaded with carboranes may be useful as boron agents for boron neutron capture therapy.
  • the release of o-carborane from PSAR-PLLA nanoparticles was evaluated by dialysis method. That is, 2 mL of a solution containing PSAR-PLLA nanoparticles carrying o-carborane prepared according to the procedure described in Experiment 1-1 was poured into a dialysis tube (trade name "Cellulose Tube 20/32", molecular weight cut off: 12,000 to 14,0000, sold by Nacalai Tesque Co., Ltd.), the dialysis tube was closed, and the dialysis tube was immersed in 300 mL of PBS (phosphate buffered saline) at 37°C or 4°C.
  • PBS phosphate buffered saline
  • PSAR-PLLA nanoparticles loaded with o-carborane were incubated in physiological saline.
  • the particle size and polydispersity of the nanoparticles were evaluated by dynamic light scattering. Specifically, in the above experiment, after 24 hours of dialysis, the aqueous solution remaining in the dialysis tube was appropriately diluted and subjected to measurement of particle size and polydispersity by dynamic light scattering.
  • dialysis was performed using PSAR-PLLA nanoparticles that do not support carborane and PSAR-PLLA nanoparticles that support m-carborane instead of o-carborane using the same procedure as the above experiment.
  • the aqueous solution remaining in the dialysis tube was appropriately diluted, and the particle size and polydispersity were measured by dynamic light scattering.
  • PSAR-PLLA nanoparticles carrying o-carborane were shown to become significantly unstable at 37°C, similar to PSAR-PLLA nanoparticles.
  • the release of o-carborane from the o-carborane-loaded PSAR-PLLA nanoparticles shown in Figure 4 involves the leakage of hydrophobic compounds physically encapsulated in the PSAR-PLLA nanoparticles as well as the carrier PSAR -It is presumed that destabilization of the PLLA nanoparticles themselves is involved.
  • Such an interaction between carborane and polylactic acid may interfere with the interaction between ⁇ -helices of poly(L-lactic acid) that constitutes the hydrophobic core of PSAR-PLLA nanoparticles, thereby destabilizing the PSAR-PLLA nanoparticles. It is also thought to be involved in the release of o-carborane PSAR-PLLA nanoparticles, since it can lead to partial decomposition and polarization of o-carborane molecules.
  • the amphiphilic polymer used to form the nanoparticles was polysarcosine-polylactic acid block copolymer (PSar 106 -block-PLLA 32 ) (weight average molecular weight: 10,001 Da; Kobe Natural Products). (manufactured by Kagaku Co., Ltd.) was used.
  • o-carborane derivatives include 1,2-dimethyl-o-carborane, 1,2-dihexyl-o-carborane, and 1,2-didodecyl-o-carborane (Katchem, Ltd., Prague, Czech Republic). ) was used.
  • Figure 6 shows the structure of the carborane derivative used in this experiment.
  • PSAR-PLLA nanoparticles Preparation of PSAR-PLLA nanoparticles and evaluation of their characteristics> PSAR-PLLA nanoparticles were prepared in the same manner as in Experiment 1-1, except that the above-mentioned o-carborane derivative was used instead of carborane.
  • the particle size and polydispersity were measured using a dynamic light scattering method in the same manner as in Experiment 1.
  • the amount of boron supported was measured by the ICP-AES method, and the boron support rate (DLC (%)) was determined based on the obtained amount of boron supported. The results obtained are shown in Table 3.
  • Dihexyl-o-carborane was about twice as large. However, the boron loading rate does not necessarily increase as the number of carbon atoms in the alkyl chain increases. The boron loading rate remained at about 1/4 to 1/5 of that of PSAR-PLLA nanoparticles supporting 1,2-dihexyl-o-carborane having a C6 alkyl chain. It is speculated that o-carborane derivatives, like o-carborane, are physically encapsulated in PSAR-PLLA nanoparticles mainly through hydrophobic interaction with polylactic acid that constitutes the hydrophobic core of PSAR-PLLA nanoparticles.
  • the particle size of PSAR-PLLA nanoparticles supporting 1,2-dimethyl-o-carborane is 63.7 nm, PDI is 0.23, and carborane is supported.
  • the nanoparticles had a particle size and PDI comparable to that of PSAR-PLLA nanoparticles. This result is similar to the measurement results for PSAR-PLLA nanoparticles carrying three types of carborane isomers shown in Experiment 1-2.
  • the particle size of nanoparticles supporting 1,2-dihexyl-o-carborane or 1,2-didodecyl-o-carborane is 93.2 nm to 104 nm, and PSAR-PLLA nanoparticles not supporting carborane. Differences were observed between PSAR-PLLA nanoparticles carrying three types of carborane isomers and 1,2-dimethyl-o-carborane. Also, when comparing 1,2-dihexyl-o-carborane and 1,2-didodecyl-o-carborane, the polydispersity is 0.15 when 1,2-dihexyl-o-carborane is used.
  • PSAR-PLLA nanoparticles were formed with a small and extremely monodisperse particle size distribution. Therefore, when we observed the particle morphology of PSAR-PLLA nanoparticles supporting 1,2-dihexyl-o-carborane using a transmission electron microscope, we found that the particle size distribution obtained by dynamic light scattering was The formation of monodisperse nanoparticles with a particle size similar to that of the above was confirmed.
  • Figure 8 shows the measurement results of the amount of o-carborane derivative released.
  • Figure 8(a) for PSAR-PLLA nanoparticles carrying 1,2-dimethyl-o-carborane, release of 1,2-dimethyl-o-carborane over time was observed during dialysis. Ta. The release of 1,2-dimethyl-o-carborane was more pronounced at 37°C than at 4°C, and after 24 hours of dialysis at 37°C, as much as 60% of the total loaded amount of 1,2-dimethyl-o-carborane was released. It has become clear that the is released. This result is similar to that obtained for PSAR-PLLA nanoparticles loading o-carborane.
  • PSAR-PLLA nanoparticles carrying 1,2-dihexyl-o-carborane surprisingly showed Even under these conditions, little release of 1,2-dihexyl-o-carborane was observed during 24 hours of dialysis.
  • Figure 9 shows the change in particle size of PSAR-PLLA nanoparticles before and after dialysis in PBS for 24 hours.
  • the PSAR-PLLA nanoparticles loaded with 1,2-dimethyl-o-carborane showed a significant change in particle size and increase in polydispersity after dialysis for 24 hours at 37°C. Met.
  • no significant changes in particle size or polydispersity were observed after 24 hours of dialysis at 4°C.
  • the above results indicate that PSAR-PLLA nanoparticles carrying 1,2-dimethyl-o-carborane become significantly unstable at 37°C.
  • PSAR-PLLA nanoparticles carrying 1,2-dihexyl-o-carborane showed a significant change in particle size even after dialysis at 37°C for 24 hours. Little change in polydispersity was observed. This result indicates that PSAR-PLLA nanoparticles carrying 1,2-dihexyl-o-carborane have excellent stability even at temperatures and salt concentrations close to biological environments, such as 37°C and PBS. There is. It was thought that it would be extremely difficult to stabilize PSAR-PLLA nanoparticles in aqueous media because polylactic acid, which constitutes the hydrophobic core of PSAR-PLLA nanoparticles, gradually hydrolyzes in aqueous media.
  • PSAR-PLLA nanoparticles supporting 1,2-dihexyl-o-carborane were prepared using the following procedure. First, take 100 ⁇ L of a solution containing PSar 106 -block-PLLA 32 (0.1, 0.5, or 1.0 ⁇ mol) dissolved in chloroform into a test tube, remove the solvent by evaporation, and prepare PSar 106 -block-PLLA 32 . did. To the test tube containing the obtained film, 100 ⁇ L of a solution containing 1,2-dihexyl-o-carborane (10 ⁇ mol) dissolved in DMSO was added and dried to form a film again.
  • DMSO 1,2-dihexyl-o-carborane
  • PSAR-PLLA nanoparticles supporting 1,2-dihexyl-o-carborane were obtained under all preparation conditions.
  • the ratio (A/B) of the amount of PSAR-PLLA polymer (B) to the amount of 1,2-dihexyl-o-carborane (A) is 10 ⁇ mol/0.1 ⁇ mol (in Table 5, "Ratio 1 ”), 10 ⁇ mol/0.5 ⁇ mol (“Ratio 2” in Table 5), and 10 ⁇ mol/1.0 ⁇ mol (“Ratio 3” in Table 5), the boron and PSAR-
  • the ratio of PLLA polymer (B/PSAR-PLLA Ratio) decreased to 3.27, 1.30, and 0.80.
  • the ratio (A/B) of the charged amount of PSAR-PLLA polymer (B) to the charged amount of 1,2-dihexyl-o-carborane (A) is 10 ⁇ mol/0.1 ⁇ mol (in Table 5, “Ratio 1), 10 ⁇ mol/0.5 ⁇ mol (“Ratio 2” in Table 5), and 10 ⁇ mol/1.0 ⁇ mol (“Ratio 3” in Table 5), the particle size of the obtained PSAR-PLLA nanoparticles increased to 83.7 nm, 91.8 nm, and 111 nm.
  • This result indicates that the particle size of PSAR-PLLA nanoparticles can be controlled by adjusting the ratio of the amount of PSAR-PLLA polymer charged to the amount of 1,2-dihexyl-o-carborane charged. There is.
  • mouse breast cancer cells 4T1, mouse colon cancer cells CT26, human pancreatic adenocarcinoma cells AsPC-1, or human gastric cancer cells NC1-N87 (all purchased from ATCC, Rockville, Maryland, USA) were Cell suspension contained in cell culture medium at a concentration of 0.5 ⁇ 10 6 cells/mL, 0.5 ⁇ 10 6 cells/mL, 1.0 ⁇ 10 6 cells/mL, or 1.0 ⁇ 10 6 cells/mL was added to 6 wells. 1 mL of each well was seeded in a microplate, and incubated for 24 hours in an environment of 5% CO 2 and 37°C according to a conventional method.
  • 1 was prepared in the same manner as in Experiment 2-3 with a blending ratio of 10 ⁇ mol of 1,2-dihexyl-o-carborane and 1.0 ⁇ mol of PSAR-PLLA (“Ratio 3” in Table 5).
  • PSAR-PLLA nanoparticles carrying 2-dihexyl-o-carborane or PSAR-PLLA nanoparticles carrying o-carborane prepared by the same procedure as in Experiment 1-1 were added to the cell culture medium. was added to the cell culture medium at a boron concentration of 0.15, 0.5, or 2 mM, and incubated for 2 hours.
  • PSAR-PLLA nanoparticles carrying 1,2-dihexyl-o-carborane are more effective against cancer compared to PSAR-PLLA nanoparticles carrying o-carborane.
  • PSAR-PLLA nanoparticles can be advantageously used for cancer treatment by BNCT.
  • FIG. 11(a) The outline of the experimental procedure is shown in Figure 11(a).
  • Mouse breast cancer cells 4T1 were seeded in a 96-well microplate at a density of 5 x 10 3 cells/cell in each well, and incubated for 24 hours at 37°C and 5% CO 2 according to a standard method. did.
  • PSAR-PLLA nanoparticles carrying o-carborane or m-carborane prepared in the same manner as in Experiment 1-1 or 1,2-dimethyl-o prepared in the same manner as in Experiment 2-1 were prepared.
  • -PSAR-PLLA nanoparticles carrying carborane or 1,2-dihexyl-o-carborane were added to the cell culture medium at a boron concentration of 5, 25, 50, 100 or 250 ppm for 24 hours. Incubated.
  • the cytotoxicity test was performed using Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Kumamoto, Japan) according to the manual attached to the kit.
  • Measurement of optical density (OD) at a wavelength of 450 nm was performed using a microplate reader (Sunrise TM , Tecan Trading AG, Mannedorf, Switzerland). Cell viability was determined as a percentage (%) when the cell viability of untreated cells (control) was set as 100%.
  • the results are shown as the mean value ⁇ standard error (SEM) of the values obtained from 4 independent samples. The obtained results are shown in FIG. 11(b).
  • PSAR-PLLA nanoparticles carrying either o-carborane, m-carborane, 1,2-dimethyl-o-carborane or 1,2-dihexyl-o-carborane no significant cytotoxicity was observed in the boron concentration range of 5 ppm to 250 ppm. Note that the maximum concentration tested in this experiment, 250 ppm, corresponds to 25 mM when converted to molar concentration. Considering this result together with the results of Experiment 2-3, it is possible to achieve a boron concentration exceeding 1 ⁇ 10 9 cells/cell, which is suitable for BNCT, within a concentration range that does not show significant cytotoxicity. It is suggested that PSAR-PLLA nanoparticles loaded with xyl-o-carborane derivatives are extremely useful as low-toxic and effective boron agents for BNCT.
  • PSAR-PLLA nanoparticles carrying ICG-labeled 1,2-dihexyl-o-carborane were prepared using the following procedure. First, PSar 106 -block-PLLA 32 (1 ⁇ mol/mL; 1 mL) and ICG-PLLA 34 (1 mol%; 1 mL) dissolved in chloroform were mixed in a test tube, the solvent was removed by evaporation, and PSar Films containing 106 -block-PLLA 32 and ICG-PLLA 34 were prepared.
  • the in-vivo dynamics test was performed according to the procedure shown in Figure 12(a). Specifically, 4T1 cells were suspended in PBS at a concentration of 5 ⁇ 10 cells/mL, and 100 ⁇ L of the resulting suspension was added to 6-week-old female nude mice (BALB/c nu/nu) (Charles River). A Xenograft model was created by subcutaneously injecting the seeds into the thigh of the right leg of a (purchased from). Two weeks after seeding of 4T1 cells, 100 ⁇ L of the solution containing PSAR-PLLA nanoparticles carrying ICG-labeled 1,2-dihexyl-o-carborane prepared as described above was injected intravenously through the tail vein. It was administered by injection.
  • In vivo near-infrared fluorescence imaging was performed 1, 3, 6, 12, 24, 48, and 72 hours after intravenous injection of solutions containing nanoparticles. After 72 hours of in vivo near-infrared biofluorescence imaging, mice were euthanized and blood, heart, lungs, liver, spleen, pancreas, kidneys, stomach, intestines, muscle, and tumors were collected and weighed. did. In addition, the fluorescence intensity in each organ was measured by ex vivo near-infrared fluorescence imaging.
  • near-infrared fluorescence imaging was performed using an IVIS spectrum system (Xenogen, Hopkinton, Massachusetts) equipped with a filter for ICG (excitation wavelength 745 nm, fluorescence wavelength 840 nm).
  • ICG excitation wavelength 745 nm, fluorescence wavelength 840 nm.
  • the collected organs were treated with HNO 3 and then subjected to ICP-AES to measure the boron concentration in each organ.
  • Figure 12(b) shows the evaluation results of the in vivo dynamics of PSAR-PLLA nanoparticles by in vivo near-infrared biofluorescence imaging.
  • strong fluorescence derived from ICG was observed from the tumor site in the right thigh of the mouse to which ICG-labeled PSAR-PLLA nanoparticles were administered.
  • the intensity of ICG-derived fluorescence at the tumor site peaked between 12 and 24 hours after administration of PSAR-PLLA nanoparticles.
  • the ratio of fluorescence intensity at the tumor site to that in normal tissue continued to gradually increase over 72 hours after administration.
  • the above results indicate that PSAR-PLLA nanoparticles labeled with ICG accumulate at tumor sites. Since the ratio of the fluorescence intensity at the tumor site and the fluorescence intensity at normal tissue gradually increases, it is inferred that the PSAR-PLLA nanoparticles that reach the tumor site accumulate at the tumor site due to the EPR effect. Ru.
  • FIG. 13(a) shows the results of measuring the fluorescence intensity derived from ICG in each organ recovered 72 hours after intravenous injection of PSAR-PLLA nanoparticles by ex vivo near-infrared fluorescence imaging.
  • the strongest ICG fluorescence intensity was observed in the tumor. This result indicates that ICG-labeled PSAR-PLLA nanoparticles are most concentrated at the tumor site, and is consistent with the in vivo near-infrared fluorescence imaging results shown in Figure 11.
  • FIG. 13(b) results of measuring the amount of boron accumulated in each organ by ICP-AES are shown in FIG. 13(b).
  • the boron concentration at the tumor site was more than three times greater than that in normal tissue (muscle).
  • the ideal ratio (T/N ratio) between the boron concentration (T) at the tumor site and the boron concentration (N) in normal tissue (muscle) is 3 or more (Tsurubuchi et al. , T. et al., Cells 2020, 9(5), 1-20).
  • the T/N ratio at the tumor site can be increased to more than 3. It is suggested that PSAR-PLLA nanoparticles carrying carborane are extremely useful for cancer treatment by BNCT.
  • Nanoparticles formed from an AB type polysarcosine-polylactic acid block polymer were used as nanoparticles supporting carborane or o-carborane derivatives.
  • Nanoparticles formed from polysarcosine-polylactic acid block polymers of the so-called A3B type, in which three polysarcosine chains are attached to a polylactic acid chain can also be used (M. S. H. Lim et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 2021, 110, 1788-179; M. S. H. Lim et al., Life 2021, 11(2), 158; F. Takenaka et al., Drug Delivery System 33-3, 2018).
  • Nanoparticles formed from A3B type polysarcosine-polylactic acid block polymers have a smaller particle size and reduce the ABC phenomenon compared to nanoparticles formed from AB type polysarcosine-polylactic acid block polymers. It is expected that On the other hand, in the above experiments, it is thought that the nanoparticles carrying carborane or o-carborane derivatives exhibited excellent accumulation in tumor tissues based on the EPR effect. However, in order to further increase the ability of nanoparticles to accumulate in tumor tissues and, if necessary, increase the amount of nanoparticles taken into cells, they specifically bind only to target cells and It goes without saying that nanoparticles may be modified with ligands that enable drug delivery to.
  • ligands there are no particular restrictions on such ligands, but they are known to be expressed at high rates in many types of cancer, such as mesothelioma, pancreatic adenocarcinoma, ovarian cancer, and lung cancer.
  • Small antibody variants (scFv) against mesothelin (MSLN) can be preferably used.
  • microparticles of the present invention or pharmaceutical compositions containing the same higher intracellular boron concentrations can be achieved compared to boron-containing compounds used in conventional boron neutron capture therapy.
  • the present invention is expected to improve the therapeutic effects of boron neutron capture therapy and reduce side effects, and has great industrial applicability.

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Abstract

がん細胞におけるホウ素濃度を効率的に高め得る、ホウ素中性子捕捉療法のための微粒子を提供することを課題とし、親水性ブロックと疎水性ブロックを有する両親媒性高分子と、ホウ素含有化合物とを含む、微粒子であって、　前記疎水性ブロックはポリ乳酸を含み、　前記ホウ素含有化合物が下記式（Ｉ）： （上記式（Ｉ）において、●はＣであり、〇は、それぞれ独立して、ＢＨ又はＢ－ハロゲンであり、Ｒは、それぞれ独立して、置換されていてもよい飽和又は不飽和のアルキル基を有する置換基であって、前記アルキル基の炭素原子数は３以上である。）で表される、微粒子を提供することにより上記課題を解決する。

Description

ホウ素中性子捕捉療法のための微粒子及びそれを含む医薬組成物
　本発明はホウ素中性子捕捉療法のための微粒子に関し、より詳細には、疎水性ブロックとしてポリ乳酸を含む両親媒性高分子とホウ素含有化合物としてo-カルボラン誘導体を含む、ホウ素中性子捕捉療法のための微粒子に関する。
　ホウ素の同位体であるホウ素10（10B）は、原子炉や加速器により取り出される中性子線を吸収し、核分裂反応（10B（n,α）7Li反応）により、4He原子核（α線）と7Li原子核を放出する性質を有している。中性子は様々な原子核によって捕獲されるが、捕獲断面積で表される10B原子核による中性子の捕獲の確率は、生体を構成する諸元素と比べると遥かに大きく、その中で最大の捕獲断面積を有する窒素（14N）と比べても約2,000倍と桁違いに大きい。一方、中性子を吸収した10B原子核から放出される4He原子核（α線）の飛程は約9μm程度、7Li原子核の飛程は約4μm程度と、一般的な細胞の直径より短い。したがって、10B原子を含有する化合物を標的細胞であるがん細胞に導入し、中性子線を照射すれば、がん組織において周辺に存在する免疫細胞などの正常細胞を温存しながら、がん細胞のみを選択的に死滅させることができるものと期待される。これがホウ素中性子捕捉療法（Boron Neutron Capture Therapy、以下「BNCT」ということがある。）であり、ホウ素10（10B）を含有するホウ素薬剤をがん細胞へ送り込んだ後に、中性子線を照射することで、腫瘍組織においてα線と7Li核を放出させ、がん細胞を死滅させる治療方法である。
　BNCTにおいては、主として、中性子線のエネルギーと標的細胞中に導入される10B原子の量によって治療効果が決定することから、標的細胞内に多くの10B原子を導入することができるホウ素薬剤の開発が極めて重要である。また、標的細胞における10B原子の量を周辺組織と比較して高めることができれば、放射線傷害の原因となる中性子線のエネルギーを抑えるとともに、周辺組織におけるα線及び7Li原子核の発生量を抑えることができるため、副作用少なく、がん細胞を死滅させることができると期待される。
　BNCT用のホウ素薬剤は種々開発されているが、臨床研究まで進んでいるものは数が少なく、例えば、L-BPA（4-borono-L-phenylalanine(10B)）、その18F標識体である[18F]F-BPA（18F-fluoro-borono-L-phenylalanine）、ホウ酸、BSH（sodium mercaptododecaborate(10B)）などに限られ、日本国で薬事承認されているホウ素薬剤は、2022年3月現在において、L-BPA（ステラファーマ株式会社製、非特許文献１）のみである。
　L-BPAは、アミノ酸であるフェニルアラニン1分子に1原子の10Bが修飾された化合物であり、がん細胞に高発現しているアミノ酸トランスポータの１つであるLAT-1（L-type amino acid transporter 1）を介して標的細胞に取り込まれる（非特許文献２）。しかしながら、L-BPAの腫瘍への集積性は高くなく、現状では、治療対象となる腫瘍において十分なホウ素濃度を得るために、L-BPAは500 mg/kgもの高濃度で投与されている。また、必ずしも全てのがん細胞においてLAT-1が高発現しているわけではなく、L-BPAに基づくBNCTの適用が困難ながん種も存在する。よって、種々のがん組織に高濃度の10B原子を集積させることができる、新たなホウ素薬剤の開発が強く求められている。
　カルボランなどのホウ素クラスターは、一分子中に多くのホウ素原子を含むことから、標的細胞に対する10B原子の導入量を飛躍的に高め得るホウ素薬剤として注目を集めている。しかしながら、ホウ素クラスターは、容易には細胞内へ取り込まれない点や、がん組織へ選択的に集積しない点などに課題がある。
　ホウ素クラスターの細胞への取り込み量の向上、がん組織への集積性を向上させるためのデリバリーシステムが種々開発されている。中でも、ナノ粒子型のデリバリーシステムは主として、EPR効果（Enhanced Permeability and Retention Effect）（J. Fang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 63 (2011) 136-151）によりがん組織に集積及び蓄積し、がん組織におけるホウ素薬剤濃度を効率的に高め得ることが期待される。ナノ粒子型のホウ素クラスターのデリバリーシステムとしては、ホウ素クラスターを担持するリポソーム（特許文献１、特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）、高分子ミセル（特許文献３、非特許文献５）などが提案されているが、本発明者らの知る限りにおいて、未だナノ粒子型のホウ素クラスターデリバリーシステムによるBNCT治療は実現されていない。
特開２００８－０７４８１７号公報 国際公開第ＷＯ２０１４/０３０７１５号 特開２０１５－０４４９２０号公報
ステボロニン点滴静注バッグ　９０００ｍｇ／３００ｍＬ、医薬品インタビューフォーム、２０２０年５月改訂（第２版） P. Wongthai, et al., Cancer Sci. 2015, 106(3), 279-286. H Yanagie, et al., British Journal of Cancer 1991, 63, 522-526. K. Shelly, et al,. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 9039-9043. P. Mi, et al., J. Control. Release 2017, 254, 1-9.
　本発明は上記のような従来技術の課題に鑑みてなされたものであり、ある一側面において、がん細胞におけるホウ素濃度を効率的に高め得る、ホウ素中性子捕捉療法のための微粒子を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決しようと鋭意研究努力を重ねる過程において、疎水性ブロックとしてポリ乳酸を含む両親媒性高分子から形成されるナノ粒子に着目した。ポリ乳酸は、生体適合性が高く、また、優れた生分解性を有することが知られており、生体、特に人体へ適用される医薬品に有利に配合され得る高分子素材である。ポリ乳酸の優れた生分解性はメリットである反面、ポリ乳酸は水性媒体中で徐々に加水分解するため、疎水性ブロックとしてポリ乳酸を含む両親媒性高分子から形成されるナノ粒子は必ずしも水性媒体中で安定ではない。後述する実験例に示すとおり、疎水性ブロックとしてポリ乳酸を含む両親媒性高分子と、ホウ素クラスターの一種であるカルボランとから形成されるナノ粒子は、水性媒体中で常温保存すると比較的速やかに崩壊し、担持したカルボランを安定に保持できないものであった。
　そこで、本発明者らは、更に鋭意研究努力を重ねた結果、驚くべきことに、o-カルボランのオルト位に存在する２つの炭素（Ｃ）に所定の炭素鎖長を有するアルキル基を導入したo-カルボラン誘導体は、疎水性ブロックとしてポリ乳酸を含む両親媒性高分子から形成されるナノ粒子の水性媒体中での安定性を顕著に高め得ることを見出した。そして、当該o-カルボラン誘導体を担持するナノ粒子によれば、種々のがん細胞内において、従来、ホウ素中性子捕捉療法に用いられてきたL-BPAを遥かに上回る水準にまで細胞内ホウ素濃度を高め得ることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、
　親水性ブロックと疎水性ブロックを有する両親媒性高分子と、ホウ素含有化合物とを含む、微粒子であって、
　前記疎水性ブロックはポリ乳酸を含み、
前記ホウ素含有化合物が下記式（Ｉ）で表される、微粒子
を提供することにより上記課題を解決するものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　なお、上記式（Ｉ）において、●はCであり、〇は、それぞれ独立して、BH又はB-ハロゲンであり、Rは、それぞれ独立して、置換されていてもよい飽和又は不飽和のアルキル基を有する置換基であって、前記アルキル基の炭素原子数は3以上である。本発明者らが見出した知見によれば、オルト位に炭素原子数が3以上の2つのアルキル基を有する上記式（Ｉ）で表されるホウ素含有化合物は、ポリ乳酸鎖間を結びつける分子糊として作用することにより、疎水性ブロックとしてポリ乳酸を含む両親媒性高分子から形成される微粒子の水性媒体中での安定性を飛躍的に高め得る（図14）。
　ある好適な一態様において、上記式（Ｉ）においてRで表される前記置換基が有する前記アルキル基の炭素原子数は、それぞれ独立して、3以上11以下であり得る。前記アルキル基の炭素原子数が3以上11以下である場合には、上記式（Ｉ）で表されるホウ素含有化合物は、疎水性ブロックとしてポリ乳酸を含む両親媒性高分子から形成される微粒子に特に効率的に担持されるとともに、より顕著な微粒子の安定化作用を奏し得る。
　ある好適な一態様において、本発明に係る微粒子を構成する両親媒性高分子の疎水性ブロックに含まれる前記ポリ乳酸は、ポリ（L-乳酸）又はポリ（D-乳酸）であり得る。ポリ（L-乳酸）又はポリ（D-乳酸）は、それぞれ左巻き又は右巻きのα-ヘリックス構造を形成するところ、これらのポリ乳酸鎖が形成するα-ヘリックス構造は、外面に疎水性部分を有し、オルト位に２つのアルキル基を有する上記式（Ｉ）で表されるホウ素含有化合物とより強固に相互作用し得る（図14）。したがって、ポリ乳酸としてポリ（L-乳酸）又はポリ（D-乳酸）が用いられる場合、本発明に係る微粒子は、さらに優れた安定性を発揮し得る。
　本発明に係る微粒子に含まれる上記両親媒性高分子が有する親水性ブロックを構成する高分子の種類に特段の制限はないが、ある好適な一態様において、ポリサルコシンであり得る。ポリサルコシンはサルコシン（N-メチルグリシン）の重合体であり、水に対して優れた溶解性を示すとともに、生分解性に優れ、免疫原性をもたず、タンパク質の非特異的吸着が少ないことが知られている。したがって、親水性ブロックとしてポリサルコシンを含む両親媒性高分子から形成される微粒子は高い血中滞留性を示し、EPR効果による腫瘍への集積及び蓄積が期待される。親水性ブロックとしてポリサルコシンを有し、疎水性ブロックとしてポリ乳酸を有する両親媒性高分子としては、例えば、後述する実験例に示すとおり、ポリサルコシンとポリ乳酸のブロック共重合体が好適に用いられ得る。
　本発明者らが見出した知見によれば、本発明に係る微粒子は、疎水性ブロックとしてポリ乳酸を含む両親媒性高分子から形成される微粒子であるにもかかわらず、水性媒体中においても優れた安定性を示し、また、従来ホウ素中性子捕捉療法に用いられてきたL-BPAと比較して、がん細胞におけるホウ素濃度を飛躍的に高め得る。したがって、本発明に係る微粒子を含有する組成物は、医薬組成物、特に、ホウ素中性子捕捉療法（BNCT）によるがん治療のための医薬組成物に好適に用いられ得る。
　本発明によれば、水性媒体中での安定性が高く、もって、標的細胞におけるホウ素濃度を効率的に高め得る微粒子が提供される。
実験例にて用いたAB型のポリサルコシン－ポリ（L-乳酸）のブロックポリマー（PSar106-block-PLLA32）とo-カルボラン、m-カルボラン、及びp-カルボランの構造を示す図である。 (a)カルボランを担持していないポリサルコシン－ポリ（L-乳酸）ナノ粒子(以下、ポリサルコシン－ポリ（L-乳酸）ナノ粒子を「PSAR-PLLAナノ粒子」と略記することがある)の粒径分布、及び、透過型電子顕微鏡写真を示す図である。(b)o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子の粒径分布、及び、透過型電子顕微鏡写真を示す図である。 (a)細胞内取り込み試験の実験手順の概略を示す図である。(b) o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子又はL-BPA（ホウ素濃度：2 mM）と所定時間接触させたマウス乳がん細胞4T1における細胞内ホウ素濃度を示す図である。 PBS中における、o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子からのo-カルボランの放出挙動を示す図である。 (a)カルボランを担持していないPSAR-PLLAナノ粒子、(b)o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子、及び(c)m-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子をPBS中で24時間透析したときの粒径及び多分散度の変化を示す図である。 実験例にて用いた3種のo-カルボラン誘導体、すなわち、1,2-ジメチル-o-カルボラン、1,2-ジへキシル-o-カルボラン、1,2-ジドデシル-o-カルボランの構造を示す図である。 (a)1,2-ジメチル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子、(b)1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子、及び(c)1,2-ジドデシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子の粒径分布を示す図である。(d)1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真を示す図である。 PBS中における(a)1,2-ジメチル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子、及び(b)1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子からのo-カルボラン誘導体の放出挙動を示す図である。 (a)1,2-ジメチル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子、及び(b)1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子をPBS中で24時間透析したときの粒径及び多分散度の変化を示す図である。 (a)1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子又はo-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子と接触させたマウス乳がん細胞4T1、(b)マウス大腸がん細胞CT26、(c)ヒト膵臓腺がん細胞AsPC-1、及び(d)ヒト胃がん細胞NC1-N87における細胞内ホウ素濃度を示す図である。 (a)細胞毒性試験の実験手順の概略を示す図である。(b)1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子、1,2-ジメチル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子、o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子、又はm-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子と接触させたマウス乳がん細胞4T1の細胞生存率を示す図である。 (a)生体内動態試験の実験手順の概略を示す図である。(b)ICG（Indocyanime Green）で標識した1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子を投与したXenograftマウスのin vivo近赤外蛍光イメージングの結果を示す図である。 (a)ICGで標識した1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子を投与したXenograftマウスのex vivo近赤外蛍光イメージングの結果を示す図である。(b)ICGで標識した1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子を投与したXenograftマウスの各組織におけるホウ素含有量をICP-AESにより測定した結果を示す図である。 本発明の一実施形態におけるPSAR-PLLAナノ粒子中でのポリ乳酸とホウ素含有化合物の相互作用を説明する概念図である。
　以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
　本発明の微粒子は、疎水性ブロックと親水性ブロックとを有する両親媒性高分子と、ホウ素含有化合物とを含む、微粒子である。
＜疎水性ブロック＞
　両親媒性高分子が有する「疎水性ブロック」とは、ブロック全体として疎水性を有する高分子鎖を意味する。ここで疎水性ブロックが有する疎水性とは、水に対する溶解性が低いことをいい、より好適には、親水性ブロックと疎水性ブロックとを含む両親媒性高分子が水性媒体中で自己集合又は凝集してミセル状又はベシクル状の微粒子を形成することができる程度に水への溶解性が低いことをいう。ミセル状又はベシクル状の微粒子の形成は、当業者であれば、例えば、動的光散乱法や透過型電子顕微鏡により確認することができる。
　本発明の微粒子に含まれ得る両親媒性高分子は、疎水性ブロックとしてポリ乳酸を含んでいる。「ポリ乳酸」とは、乳酸が重合してなる高分子を意味する。ポリ乳酸は、優れた生体適合性と生分解性を有するため、ポリ乳酸を構成成分として含む両親媒性高分子は医薬品素材として有利に使用され得る。ポリ乳酸のモノマーである乳酸としてはL-乳酸及びその光学異性体であるD-乳酸が存在し、主としてL-乳酸を重合して得られるポリ乳酸はポリ（L-乳酸）（PLLA：poly(L-lactic acid)）、主としてD-乳酸を重合して得られるポリ乳酸はポリ（D-乳酸）（PDLA：poly(D-lactic acid)）、L-乳酸とD-乳酸を重合して得られるポリ乳酸はポリ（DL-乳酸）（PDLLA：poly(DL-lactic acid)）と呼ばれる。
　本発明者らが見出した知見によれば、ポリ乳酸鎖が形成するα-ヘリックス構造は、外面に疎水性部分を有し、オルト位に２つのアルキル基を有する後述するホウ素含有化合物と強く相互作用し得る（図14）。したがって、本発明の微粒子に含まれ得る「ポリ乳酸」は、α-ヘリックス型の高次構造を形成し得るものであることが好ましい。このようなポリ乳酸は、例えば、ポリ（L-乳酸）及びポリ（D-乳酸）であり得るが、ポリ（L-乳酸）が特に好適に用いられ得る。なお、本発明に用いられ得るポリ（L-乳酸）又はポリ（D-乳酸）は、α-ヘリックス型の高次構造を形成し得るものであれば良く、必ずしも光学純度100%又は異性体含量が0%のものである必要はない。例えば、異性体含量が10%以下、好ましくは6%以下、より好ましくは5%以下、さらに好ましくは3%以下、さらに好ましくは2%以下、よりさらに好ましくは1%以下のポリ（L-乳酸）又はポリ（D-乳酸）であり得る。
　疎水性ブロックとしてポリ乳酸を含むとは、疎水性ブロックの全部がポリ乳酸である場合と、疎水性ブロックの一部がポリ乳酸である場合の双方を含む。すなわち、本発明に用いられ得る疎水性ブロックは、ポリ乳酸が高次構造を形成し得る範囲で乳酸単位以外のモノマー単位を有していても良い。疎水性ブロックに含まれ得る乳酸単位以外のモノマー単位の含有量に特段の制限はないが、疎水性ブロックに含まれる全モノマー単位（乳酸単位を含む）に対して、10%以下とすることが好ましく、より好ましくは8%以下、さら好ましくは5%以下、よりさらに好ましくは1%以下、特に好ましくは0%である。
　疎水性ブロックに含まれ得る乳酸単位以外のモノマー単位の種類に特段の制限はないが、乳酸以外のヒドロキシ酸が好適に用いられ得る。なお、ヒドロキシ酸とは、一分子中にカルボキシル基（-COOH）とヒドロキシル基（-OH）を有する有機化合物であり、乳酸以外のヒドロキシ酸としては、例えば、グリコール酸、2-ヒドロキシイソ酪酸、3-ヒドロキシイソ酪酸などが含まれ得る。
　疎水性ブロックに含まれ得るポリ乳酸を構成する乳酸単位の数に特段の制限はなく、疎水性ブロックが上述した疎水性を示すように適宜調整され得るが、例えば、5乃至200、好ましくは10乃至100、より好ましくは15乃至80、さらに好ましくは、20乃至60、よりさらに好ましくは25乃至45であり得る。なお、本明細書において「乃至」で示す数値範囲は上限と下限を含む数値範囲を意味する。
＜親水性ブロック＞
　一方、「親水性ブロック」とは、親水性を有する高分子鎖を意味する。ここで親水性ブロックが有する親水性とは、少なくとも、ポリ乳酸を含む疎水性ブロックと比較して相対的に親水性が高いことをいい、より好適には、親水性ブロックと疎水性ブロックとを含む両親媒性高分子が水性媒体中で自己集合又は凝集してミセル状又はベシクル状の微粒子を形成することができる程度の親水性をいう。
　本発明の微粒子に用いられ得る「親水性ブロック」を構成する具体的な高分子の種類に特段の制限はないが、微粒子の血中滞留性を高め、ひいては、治療対象となる腫瘍部位への微粒子の集積性を高めるという観点からは、タンパク質の吸着性が低い親水性高分子であることが好ましい。このような親水性高分子としては、例えば、ポリサルコシンや他のN置換グリシンの重合体などのポリペプトイド；ポリグルタミン酸、ポリ（ヒドロキシエチル-L-グルタミン）、ポリ（ヒドロキシエチル-L-アスパラギン）、Pro-Ala-Serの繰り返し単位からなるPASポリペプチド、Gly-Ala-Pro-Glu-Ser-Thrの繰り返し単位からXTENポリペプチドなどのポリアミノ酸又はその誘導体；デキストラン、ヒアルロン酸、ポリシアル酸などの多糖類；ホスホベタインポリマー、スルホベタインポリマー、カルボキシベタインポリマーなどの双性イオンポリマー；ポリエチレングリコール、ポリグリセロール、ポリ（2-エチル-2-オキサゾリン）、ポリ（2-メチル-2-オキサゾリン）、ポリビニルピロリドン、ポリ（2-ヒドロキシエチルメタクリレート）などの非荷電性合成高分子が含まれ得る。
　親水性ブロックを構成する高分子のモノマー単位の数に特段の制限はなく、親水性ブロックが上述した親水性を示すように親水性ブロックを構成する高分子又はモノマーの種類に応じて適宜調整され得るが、例えば、10乃至300、好ましくは20乃至250、より好ましくは30乃至200、さらに好ましくは、40乃至150、よりさらに好ましくは50乃至100であり得る。
　親水性ブロックは直鎖状でも、分岐状であっても良い。親水性ブロックが分岐を有する場合、その分岐の数に特段の制限はないが好ましくは2乃至3個である。親水性ブロックが分岐状である場合、親水性ブロックを構成するモノマー単位の数は、親水性ブロック全体として、例えば、10乃至300、好ましくは20乃至250、より好ましくは30乃至200、さらに好ましくは、40乃至150、よりさらに好ましくは50乃至100であり得る。
＜両親媒性高分子＞
　本発明の微粒子に含まれ得る両親媒性高分子は、以上説明したとおりの親水性ブロック及び疎水性ブロックを含む高分子である限りにおいて特段の制限はないが、ある好適な一態様において、ポリサルコシンを含む親水性ブロックを有する。ポリサルコシンとは、サルコシン（「N-メチルグリシン」とも言う）が重合してなる高分子を意味する。ポリサルコシンは生体適合性が高く、非特異的なタンパク質の吸着が少ないこと、また、免疫原性が低くABC（Accelerated Blood clearance）現象を回避し得ることから（K. Son et al., J. Controlled Rel. 2020, 322(10), 209-216）、本発明に係る微粒子が有する両親媒性高分子の親水性ブロックとして特に好適に用いられ得る。ポリ乳酸を含む疎水性ブロックと、ポリサルコシンを含む親水性ブロックを有する両親媒性高分子は、例えば、ポリサルコシンとポリ乳酸が結合してなるブロック共重合体であるポリサルコシン－ポリ乳酸であり得る。ポリサルコシン－ポリ乳酸は、水性媒体中において自己集合し、直径20 nm～200 nm程度の微粒子を形成することが知られている（M. Akira et al., Chemistry Letters, 2007, 36(10), 1220-1221）。また、ポリサルコシン－ポリ乳酸が形成する微粒子は血中滞留性が高く、肝臓への集積も少ない。これらのことからポリサルコシンとポリ乳酸のブロック共重合体は、本発明の微粒子に含まれ得る両親媒性高分子として特に好適に用いられ得る。なお、ポリサルコシンは直鎖状のものであっても、分岐状のものであっても、その双方を含むものであっても良い。直鎖状のポリサルコシンを含むポリサルコシン－ポリ乳酸としては、例えば、AB型のポリサルコシン－ポリ乳酸ブロックポリマーが含まれる。AB型のポリサルコシン－ポリ乳酸ブロックポリマー及びその合成方法は、例えば、国際公開第WO2009/148121号に開示されている。一方、分岐状のポリサルコシンを含むポリサルコシン－ポリ乳酸としては、例えば、3分岐型のポリサルコシンとポリ乳酸のブロックポリマーであるA3B型のポリサルコシン－ポリ乳酸ブロックポリマーが含まれる。A3B型のポリサルコシン－ポリ乳酸ブロックポリマー及びその合成方法は、例えば、国際公開第WO2012/176885号や、M. S. H. Lim et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 2021, 110, 1788-1798及びM. S. H. Lim et al., Life 2021, 11(2), 158に開示されている。A3B型のポリサルコシン－ポリ乳酸ブロックポリマーから形成されるナノ粒子によれば、AB型のポリサルコシン－ポリ乳酸ブロックポリマーから形成されるナノ粒子と比較しても、より一層ABC現象が軽減され得る（Takenaka et al., Drug Delivery System 33-3, 2018;M. S. H. Lim et al., Life 2021, 11(2), 158）。
　ポリサルコシン－ポリ乳酸ブロック共重合体において、親水性ブロックであるポリサルコシンを構成するサルコシン単位の繰り返し数は、親水性ブロックが全体として上述した親水性を示す限りにおいて特段の制限はないが、例えば、10乃至300、好ましくは20乃至250、より好ましくは30乃至200、さらに好ましくは40乃至150、よりさらに好ましくは50乃至100であり得る。ポリサルコシンが分岐状のポリサルコシンである場合には、親水性ブロック全体としてのサルコシン単位の繰り返し数は、例えば、10乃至300、好ましくは20乃至250、より好ましくは30乃至200、さらに好ましくは40乃至150、よりさらに好ましくは50乃至100であり得る。なお、ポリサルコシンが分岐を有する場合において、その分岐の数に特段の制限はないが、好ましくは2乃至3個である。
　一方、ポリサルコシン－ポリ乳酸ブロック共重合体の疎水性ブロックであるポリ乳酸を構成する乳酸単位の繰り返し数は、疎水性ブロックが全体として上述した疎水性を示す限りにおいて特段の制限はないが、例えば、10乃至100、好ましくは15乃至80、より好ましくは、15乃至60、さらに好ましくは20乃至50、よりさらに好ましくは25乃至45であり得る。ポリ乳酸が分岐構造を有する場合には、疎水性ブロック全体としての乳酸単位の繰り返し数は、例えば、10乃至400、好ましくは20乃至200であり得る。なお、疎水性ブロックが分岐する場合、疎水性ブロックの分岐の数に特段の制限はないが、両親媒性高分子の自己集合により微粒子を得るという観点からは、親水性ブロックの分岐の数以下とすることが好ましい。
＜ホウ素含有化合物＞
　一方、本発明の微粒子に含まれ得るホウ素含有化合物は下記式（Ｉ）で表される化合物、すなわち、o-カルボラン誘導体である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　上記式（Ｉ）において、●はCであり、〇は、それぞれ独立して、BH又はB-ハロゲンであり、Rは、それぞれ独立して、置換されていてもよい飽和又は不飽和のアルキル基を有する置換基であって、前記アルキル基の炭素原子数は3以上である。ここで、本明細書において、「それぞれ独立して」とは、それぞれが同一であってもよいし、異なっていてもよいことを意味する。
　前述したとおり、上記式（Ｉ）で表されるホウ素含有化合物は、疎水性ブロックとしてポリ乳酸を含む両親媒性高分子から形成される微粒子において、オルト位に存在する炭素原子数が3以上の上記2つのアルキル基を介して、当該微粒子の疎水性コアを構成するポリ乳酸鎖、特にα-ヘリックス構造を形成するポリ乳酸鎖と相互作用することで、2つのポリ乳酸鎖を結びつける分子糊として作用し、これにより、当該微粒子の水性媒体中での安定性を飛躍的に高め得る（図14）。微粒子の安定性を高めるという観点からは、前記アルキル基の炭素原子数は3以上であることが好ましく、より好ましくは4以上、さらに好ましくは5以上、よりさらに好ましくは6以上である。一方、前記アルキル基の炭素原子数の上限に特段の制限はないが、本発明者らが見出した知見によれば、前記アルキル基を構成する炭素原子数が多すぎると、上記式（Ｉ）で表されるホウ素含有化合物がそれ自体で凝集体を形成するため、当該ホウ素含有化合物が微粒子へ担持されにくくなる恐れがある。このような観点から、前記アルキル基の炭素原子数は11以下であることが好ましく、より好ましくは10以下、より好ましくは9以下、さらに好ましくは8以下、よりさらに好ましくは7以下、よりさらに好ましくは6以下である。以上をまとめると、前記アルキル基の炭素原子数は3以上であることが好ましく、より好ましくは3以上11以下、さらに好ましくは4以上10以下、さらに好ましくは4以上9以下、さらに好ましくは5以上8以下、さらに好ましくは5以上7以下、特に好ましくは6である。
　アルキル基を有する置換基の具体例としては、置換されていてもよい飽和又は不飽和のアルキル基、置換されていてもよい飽和又は不飽和のアルコキシ基、又は置換されていてもよい飽和又は不飽和のアルキルチオ基が含まれるが、置換されていてもよい飽和又は不飽和のアルキル基であることが好ましく、置換されていてもよい飽和アルキル基であることより好ましく、置換されていない飽和アルキル基であることがより好ましい。また、アルキル基を有する置換基は、直鎖状又は分岐鎖状のいずれであっても良いが、直鎖状であることが好ましい。
　炭素原子数が3以上のアルキル基を有する置換基の更なる具体例としては、n-プロピル基（-(CH2)2CH3）、n-ブチル基（-(CH2)3CH3）、n-ペンチル基（-(CH2)4CH3）、n-へキシル基（-(CH2)5CH3）、n-へプチル基（-(CH2)6CH3）、n-オクチル基（-(CH2)7CH3）などの一般式（-(CH2)nCH3））（但し、nは2以上）で表されるアルキル基、n-プロポキシ基（-O(CH2)2CH3））、n-ブトキシ基（-O(CH2)3CH3））、n-ペントキシ基（-O(CH2)4CH3））、n-へキシルオキシ基（-O(CH2)5CH3））などの一般式（-O(CH2)nCH3））（但し、nは2以上）で表されるアルコキシ基、n-プロピルチオ基（-S(CH2)2CH3））、n-ブチルチオ基（-S(CH2)3CH3））、n-ペンチルチオ基（-S(CH2)4CH3））、n-へキシルチオ基（-S(CH2)5CH3））などの一般式（-S(CH2)nCH3））（但し、nは2以上）で表されるアルキルチオ基が含まれ得るが、これらに限定されない。なお、炭素原子数が3以上のアルキル基を有する置換基が以上の一般式のいずれかで表されるアルキル基、アルコキシ基、又はアルキルチオ基である場合には、一般式中のnは、好ましくは2以上10以下、さらに好ましくは3以上9以下、さらに好ましくは3以上8以下、さらに好ましくは4以上7以下、さらに好ましくは4以上6以下、特に好ましくは5である。以上のようなアルキル基を有する置換基をRとして有する上記式（Ｉ）で表されるホウ素含有化合物の具体例としては、例えば、後述する実験例で示す1,2-ジへキシル-о-カルボランが挙げられる。
　なお、本明細書において、「置換されていてもよい」とは、当該基を構成する置換可能な水素原子が置換されていない場合と置換されている場合の双方を含む。置換可能な水素原子が置換されていない場合とは、置換可能な水素原子が全て水素原子であることを意味する。一方、置換可能な水素原子が置換されている場合とは、置換可能な水素原子の少なくとも１つが、水素原子及び炭素原子以外の原子に置換されていることを意味する。置換基となる原子の種類に特段の制限はないが、ポリ乳酸が形成するα-ヘリックス構造への結合性という観点からは、比較的疎水性が高い原子であることが好ましい。このような原子の具体例としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アスタチンなどのハロゲンが含まれるが、これらに限定されない。置換箇所は複数あってもよい。
　上記式（Ｉ）で表されるo-カルボラン誘導体は当業者であれば適宜の手法により合成することができる。例えば、式（Ｉ）においてRで表される置換基が置換されていてもよい飽和又は不飽和のアルキル基であるo-カルボラン誘導体は、o-カルボランとBuLi又はPhLi等の強塩基を反応させ、次いで、適宜のハロゲン化アルキルを反応させることにより得ることができる。また、式（Ｉ）においてRで表される置換基が置換されていてもよいアルコキシ基又はアルキルチオ基であるo-カルボラン誘導体は、1位と2位に水酸基（-OH）を有するo-カルボラン誘導体（1,2-(OH)2-1,2-closo-C2B10H10；CAS番号868382-62-1）又は1位と2位にチオール基を有するo-カルボラン誘導体（1,2-(SH)2-1,2-closo-C2B10H10；CAS番号23810-63-1）に適宜のハロゲン化アルキルをKOH等の強塩基の存在下で反応させアルコキシ化又はアルキルチオ化することにより得ることができる。しかしながら、o-カルボラン誘導体の合成方法は以上のものに限られず、当業者であれば適宜の方法を用いることができる（T.L. Heying et al., Inorg. Chem. 1963, 2(6), 1097-1105; M. M. Fein et al., Inorg. Chem. 1963, 2(6), 1115-1119）。
　なお、本発明の微粒子に含まれ得るホウ素含有化合物は、ホウ素としてホウ素10（10B）を含有するものであることが好ましい。天然に存在するホウ素の同位体としては、ホウ素10（10B）とホウ素11（11B）の2つの同位体が知られており、ホウ素10は天然に存在するホウ素の約19.9%、ホウ素11は約80.1%を占める。ホウ素中性子捕捉療法は、これらのホウ素の同位体のうち、10Bが起こす核分裂反応を用いるものである。したがって、ホウ素中性子捕捉療法に用いられるという観点から、本発明の微粒子に含まれ得るホウ素含有化合物における10Bの同位体比率は、19.9%以上であることが好ましく、50%以上であることがより好ましく、70%以上であることがさらに好ましく、90%以上であることがよりさらに好ましい。ホウ素含有化合物における10Bの同位体比率は、10B含有量を高めたホウ素（10B濃縮ホウ素)を原料として用いることで高めることができる。10B濃縮ホウ素を製造する方法としては、例えば、化学交換蒸留法が知られている。
＜微粒子＞
　本発明に係る微粒子は、以上説明した両親媒性高分子と、ホウ素含有化合物とを含む、微粒子である。
　本発明に係る微粒子は、典型的には、水性媒体中において親水性ブロックと疎水性ブロックを含む両親媒性高分子とホウ素含有化合物とが自己集合することにより得られる、両親媒性高分子とホウ素含有化合物とが非共有結合的に結合してなる微粒子である。このような微粒子の調製方法に特段の制限はないが、例えば、後述するように、ポリ乳酸を含む両親媒性高分子と、前記式（Ｉ）で表されるホウ素含有化合物とを混合して混合物を得る工程と、前記混合物を水性媒体と接触させる工程を含む、調製方法により調製され得る。
　本発明の微粒子の形態に特段の制限はないが、典型的には、高分子ミセル状の微粒子であり得る。高分子ミセル状の微粒子は、典型的には、親水性ブロックから構成されるシェル、疎水性ブロックから構成されるコアを有するコアシェル型の微粒子である。また、本発明の微粒子の形態はベシクル状の中空微粒子であっても良い。疎水性ブロックとしてポリ乳酸を有する両親媒性高分子から形成されるベシクル状の中空微粒子は当業者であれば適宜調製し得る（H. Yin et al., Macromolecules 2009, 42(19), 7456-7464; H. Qi et al., Nature communications 9, Article number: 3005 (2018)）。
　本発明の微粒子の大きさに特段の制限はないが、典型的には、動的光散乱法によって測定される平均粒径が直径20 nm乃至500 nmの微粒子であり得る。がん組織への集積性を高める、又は、がん組織への浸透性を高めるという観点からは、動的光散乱法によって測定される平均粒径（直径）は、20 nm乃至150 nmであることが好ましく、20 nm乃至140 nmであることがより好ましく、20 nm乃至130 nmであることがさらに好ましく、20 nm乃至120 nmであることがよりさらに好ましい。なお、微粒子の直径は、微粒子を構成する両親媒性高分子の分子量、親水性ブロック及び疎水性ブロックの比率等を調整することにより適宜制御され得る。例えば、A3B型のポリサルコシン－ポリ乳酸ブロックポリマーを用いることで、AB型のポリサルコシン－ポリ乳酸ブロックポリマーから形成されるナノ粒子と比較して、より粒径の小さいナノ粒子が調製され得る(M. S. H. Lim et al., Life 2021, 11(2), 158)。
　本発明に係る微粒子におけるホウ素担持量に特段の制限はないが、微粒子自体が安定である限りにおいて、ホウ素担持量は多いほうが好ましい。また、両親媒性高分子とホウ素含有化合物との比率に特段の制限はないが、例えば、(A)ホウ素含有化合物が含むホウ素と(B)両親媒性高分子のモル比(A/B)は、0.1乃至30.0、0.2乃至15.0、0.3乃至12.0、0.5乃至8.0、0.5乃至5.0又は0.6乃至3.5であり得る。
　また、ある好適な一態様において、本発明に係る微粒子は、ターゲティング分子を含んでいてもよい。ここで、ターゲティング分子とは、ターゲティング分子を含む微粒子の標的組織への集積性又は標的細胞への結合性を、ターゲティング分子を含んでいない場合と比較して高めることができる化学物質をいい、典型的には、標的細胞特異的に高発現するタンパク質等の物質に選択的に結合する性質を有する分子である。このようなターゲティング分子に特段の制限はないが、例えば、抗体、低分子抗体バリアント、タンパク質、ペプチド、ペプトイド、核酸、ビタミン、糖などであり得る。上述したとおり、ターゲティング分子は標的細胞に存在する特定の物質に選択的に結合する分子であるため、微粒子の表面に存在していることが好ましい。このようにターゲティング分子を粒子表面に有する微粒子は、例えば、前述した両親媒性高分子が含有する親水性ブロックの末端にターゲティング分子が結合した両親媒性高分子を用いて微粒子を調製することにより得ることができる。また、両親媒性高分子とホウ素含有化合物に加えて、更に、ポリ乳酸の末端にターゲティング分子を結合させたポリ乳酸とターゲティング分子の結合物を用いて微粒子を調製することにより、ターゲティング分子を担持する微粒子を調製しても良い。
　また、ある好適な一態様において、本発明に係る微粒子は、細胞透過性ペプチドを含んでいても良い。細胞透過性ペプチドは、細胞、特に、ヒト細胞の細胞膜を透過する性質を有するペプチドであり、細胞透過性ペプチドを含む微粒子は、細胞内に効率的に導入され得る。本発明に係る微粒子に含まれ得る細胞透過性ペプチドの種類に特段の制限はないが、例えば、TATペプチド、ペネトラチン(penetratin)、ポリアルギニン（R9)、トランスポータン(transportan)、Pep-1などが含まれ得るが、これらに限定されない。当業者であれば適宜の細胞透過性ペプチドを用いることができる（D. M. Copolovici et al., ACS Nano 2014, 8(3), 1972-1994; M. M. Khan et al., J. Controlled Rel. 2021, 330(10), 1220-1228）。このように細胞透過性ペプチドを含む微粒子は、例えば、前述した両親媒性高分子が含有する親水性ブロックの末端に細胞透過性ペプチドが結合した両親媒性高分子を用いて微粒子を調製することにより得ることができる。また、両親媒性高分子とホウ素含有化合物に加えて、更に、ポリ乳酸の末端に細胞透過性ペプチドを結合させたポリ乳酸と細胞透過性ペプチドの結合物を用いて微粒子を調製することにより、細胞透過性ペプチドを担持する微粒子を調製しても良い。細胞透過性ペプチドを担持する微粒子の調製方法については、例えば、M. S. H. Lim et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 2021, 110, 1788-1798やM. S. H. Lim et al., Life 2021, 11(2), 158に記載されている。
＜医薬組成物＞
　本発明に係る医薬組成物は以上説明したとおりの微粒子を含むものである。治療対象となる疾患に特段の制限はないが、特に、がんの治療、より具体的には、ホウ素中性子捕捉療法によるがん治療のために好適に用いられ得る。なお、本明細書において、がんの「治療」には、がんを根治することのみならず、がんを縮小させること、がんの症状を緩和乃至改善すること、及び、がんの進行を遅延させることが含まれる。
　本発明に係る医薬組成物が用いられ得るがんの種類に特段の制限はないが、例えば、脳腫瘍（髄膜腫、神経膠腫、下垂体腫瘍、聴神経腫瘍、多型性膠芽腫など）、悪性黒色腫、頭頸部癌、肺癌、肝臓癌、甲状腺癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、膵臓癌、大腸癌、膀胱癌、髄膜腫、中皮腫、肉腫、胃癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、咽頭癌、喉頭癌などを含む固形癌や血液がんが含まれ得る。なお、ホウ素中性子捕捉療法は、癌細胞と正常細胞が混在している悪性度の高い脳腫瘍などの頭頸部癌や、悪性黒色腫の治療に効果的であることが知られていることから、本発明に係る医薬組成物は、頭頸部癌や、悪性黒色腫の治療に特に好適に用いられ得る。
　本発明に係る微粒子、及び本発明に係る医薬組成物の投与方法に特段の制限はなく、適用対象に応じて適宜の投与方法を選択すれば良い。例えば、経口投与、舌下投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、腫瘍内投与を含む局所投与、点滴投与等が例示されるが、これらに限定されない。
　本発明に係る医薬組成物の剤形は特に限定されず、適用対象や投与方法に応じて適宜の剤形とすればよい。例えば、注射剤、錠剤、散剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤、カプセル剤などの剤形とすることができるが、これらに限定されない。また、用時調製型の製剤としてもよい。本発明に係る医薬組成物は、その剤形や投与方法に応じて、さらに、薬学的に許容される賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、被覆剤、溶媒、緩衝剤、防腐剤、キレート剤、酸化防止剤、等張化剤等を含んでいてもよいことは言うまでもない。
　本発明に係る医薬組成物に含まれ得る賦形剤としては、例えば、乳糖、マンニトール、結晶セルロース、コーンスターチなどが含まれ得るが、これらに限定されない。結合剤としては、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれ得るが、これらに限定されない。崩壊剤としては、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、クロスカルメロースなどが含まれ得るが、これらに限定されない。潤滑剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、カルナウバロウなどが含まれ得るが、これらに限定されない。被覆剤としては、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレングリコール、タルク、酸化チタン、酸化鉄などが含まれ得るが、これらに限定されない。溶媒としては、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、植物油などが含まれ得るが、これらに限定されない。緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酒石酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、アミノ酸などが含まれ得るが、これらに限定されない。防腐剤としては、例えば、塩化ベンザルコニウムなどの第四級アンモニウム塩、パラオキシ安息香酸メチルなどのパラオキシ安息香酸エステル、ベンジルアルコール、ソルビン酸およびその塩、チメロサール、パラベン、塩化セチルピリジニウム、カテキンなどが含まれ得るが、これらに限定されない。キレート剤としては、例えば、エデト酸ナトリウム、クエン酸などが含まれ得るが、これらに限定されない。酸化防止剤としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、アスコルビン酸グリコシドなどが含まれ得るが、これらに限定されない。等張化剤としては、例えば、ブドウ糖や食塩が含まれ得るが、これらに限定されない。また、本発明に係る医薬品は、その他の医薬品に配合される１種又は２種以上の有効成分、例えば、抗がん剤、光増感剤、siRNAやmRNAなどの核酸を含んでいても良い。光増感剤や核酸などの物質を担持する微粒子の調製方法については、例えば、M. S. H. Lim et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 2021, 110, 1788-179に記載されている。光増感剤や核酸を担持する微粒子は、BNCTによるがん治療のために限られず、光線力学的療法（PDT）やRNA干渉（RNAi）によるがん治療のために有効に用いられ得る。
＜微粒子の製造方法＞
　本発明の一態様に係る微粒子の製造方法は、ポリ乳酸を含む両親媒性高分子と、前記式（Ｉ）で表されるホウ素含有化合物とを混合して混合物を得る工程と、前記混合物を水性媒体と接触させる工程を含む、微粒子の製造方法である。ポリ乳酸を含む両親媒性高分子は、水性媒体と接触すると自己集合により微粒子を形成する性質を有する。ポリ乳酸を含む両親媒性高分子と前記式（Ｉ）で表されるホウ素含有化合物との混合物を水性溶媒と接触させることにより、ポリ乳酸を含む両親媒性高分子が形成する微粒子に前記式（Ｉ）で表されるホウ素含有化合物が内包される。
　以上の工程を含む微粒子の製造方法としては、例えば、フィルム法やインジェクション法が含まれ得る（国際公開第WO2012/176885号）。ここで、フィルム法とは、後述する実験例に示されるとおり、両親媒性高分子とホウ素含有化合物とを有機溶媒中に含む溶液を乾燥させて得られるフィルム状の混合物と水性媒体とを接触させ、当該水性媒体中に微粒子が分散した分散液を得る方法であり、より具体的には、
（a1）両親媒性高分子とホウ素含有化合物とを有機溶媒中に含む混合液を用意する工程；
（a2）前記混合液から前記有機溶媒を除去し、前記両親媒性高分子と前記ホウ素含有化合物とを含むフィルムを得る工程；及び
（a3）前記フィルムに水性媒体を加える工程；
を含む方法であり得る。上記の工程（a1）、（a2）、（a3）は、通常、この順に行われる。
　上記（a1）の工程において用いられる有機溶媒は両親媒性高分子とホウ素含有化合物の双方を溶解させることができる限りにおいて特段の制限はないが、例えば、クロロホルム、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等が好適に用いられ得る。上記(a2)の工程において有機溶媒を除去する方法に特段の制限はなく、使用する有機溶媒に応じて、当業者であれば適宜の方法を採用することができる。例えば、減圧乾燥による溶媒除去を行ってもよいし、自然乾燥による溶媒除去を行ってもよい。一方、上記（a3）の工程において用いられる水性媒体は、水又は水を主成分とする溶媒である限りにおいて特段の制限はないが、例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液（例えば、PBS）等が好適に用いられ得る。
　本発明に係る微粒子の製造方法は、ある好適な一態様において、上記（a3）の工程の後、前記フィルムと水性媒体の混合物を撹拌乃至超音波処理する工程を更に含んでいても良い。
　一方、インジェクション法とは、両親媒性高分子とホウ素含有化合物とを有機溶媒中に含む溶液を水性媒体に分散させ、当該水性媒体中に微粒子が分散した分散液を得る方法であり、より具体的には、
（b1）両親媒性高分子とホウ素含有化合物とを有機溶媒中に含む混合液を用意する工程；
（b2）前記混合液を水性媒体中に分散させる工程；及び
（b3）前記有機溶媒を除去する工程；
を含む方法であり得る。上記の工程（b1）、（b2）、（b3）は、通常、この順に行われる。
　上記（b1）の工程において用いられる有機溶媒は両親媒性高分子とホウ素含有化合物の双方を溶解させることができる限りにおいて特段の制限はないが、例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等が好適に用いられ得る。
一方、上記（b2）の工程は、両親媒性高分子とホウ素含有化合物とを有機溶媒中に含む混合液を、水性媒体中に注入、混合し、両親媒性高分子とホウ素含有化合物とを含む微粒子が分散した分散液を得る工程である。ここで、本工程において用いられる水性媒体は、水又は水を主成分とする溶媒である限りにおいて特段の制限はないが、例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液（例えば、PBS）等が好適に用いられ得る。また、両親媒性高分子とホウ素含有化合物とを有機溶媒中に含む混合液を、水性媒体中に分散させる方法に特段の制限はなく、例えば、撹拌機により行うことができる。また、上記(b3)の工程において、有機溶媒を含む水性媒体から、当該有機溶媒を除去する方法に特段の制限はなく、当業者であれば適宜の方法を採用し得る。例えば、減圧環境下で有機溶媒を除去しても良い。
　また、上記の製造方法は、ある好適な一態様において、上記の(b3)の工程の前又は後に適宜の精製処理工程を更に含んでいても良い。精製方法としては、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、フィルター処理、超遠心等の方法が用いられ得るが、これらに限定されない。また、必要に応じて、これらの精製方法を組み合わせて行っても良い。
　なお、上記式（Ｉ）で表されるホウ素含有化合物は、主として、ポリ乳酸から構成される疎水性コアを安定化することにより、微粒子の安定化作用を奏するものである。したがって、上記式（Ｉ）で表されるホウ素含有化合物によれば、両親媒性高分子に限られず、広くポリ乳酸を含む高分子から形成される微粒子の安定化作用が期待される。すなわち、本発明に係る微粒子の製造方法は、ある好適な一態様において、ポリ乳酸を含む高分子と、前記式（Ｉ）で表されるホウ素含有化合物とを混合して混合物を得る工程と、前記混合物を水性媒体と接触させる工程を含む、微粒子の製造方法であり得る。
　また、同様の観点から、本発明は、ある一側面において、上記式（Ｉ）で表されるホウ素含有化合物を有効成分とする、ポリ乳酸を含む微粒子の安定化剤をも提供するものである。以上説明したとおり、上記式（Ｉ）で表されるホウ素含有化合物によれば、ポリ乳酸を含む高分子から形成される微粒子の安定化作用が期待される。なお、ポリ乳酸を含む微粒子の安定化剤とは、当該安定化剤を含まない微粒子と比較して、水性媒体中での微粒子の安定性を向上させる剤、又は、水性媒体中での微粒子の崩壊を遅延させる剤であり得る。微粒子の水性媒体中での安定性又は崩壊は、当業者であれば、例えば、動的光散乱法により微粒子の粒子径変化を経時的に観察することにより評価することができる。
　本明細書において引用されたすべての文献の開示内容は、全体として明細書に参照により組み込まれる。また、本明細書が英語に翻訳された場合において、単数形の「a」、「an」、および「the」の単語が含まれる場合、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、単数のみならず複数のものを含むものとする。
　以下、実験例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、これらの実験例は、あくまでも本発明の実施形態の例示にすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
＜実験1. カルボラン誘導体を担持するポリサルコシン-ポリ乳酸ナノ粒子（PSAR-PLLAナノ粒子＞
　ホウ素含有化合物としてカルボランを担持するナノ粒子を調製した。ナノ粒子を調製するための両親媒性高分子としては、親水性ブロックとしてポリサルコシン、疎水性ブロックとしてポリ（L-乳酸）を有するポリサルコシン－ポリ(L-乳酸)ブロックポリマー（PSAR-PLLA）、より具体的には、ポリサルコシンとポリ(L-乳酸)のAB型のポリサルコシン－ポリ(L-乳酸)ブロックポリマー（PSar106-block-PLLA32）（重量平均分子量：10,001 Da）（神戸天然化学株式会社製）を用いた。なお、以下の実験例においては、上記のAB型のポリサルコシン－ポリ(L-乳酸)ブロックポリマーを「PSAR-PLLAポリマー」、当該ブロックポリマーを用いて調製されるナノ粒子を「ポリサルコシン-ポリ乳酸ナノ粒子」（PSAR-PLLAナノ粒子）ということがある。カルボランとしては、o-カルボラン、m-カルボラン、及びp-カルボラン（Katchem, Ltd., Prague, Czech Republic）の３つの異性体を用いた。本実験に用いたPSar106-block-PLLA32とo-カルボラン、m-カルボラン、及びp-カルボランの構造を図１に示す。
＜実験1-1. PSAR-PLLAナノ粒子の調製＞
　o-カルボラン、m-カルボラン、及びp-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子はフィルム法にて調製した。すなわち、1 μmolのPSAR-PLLAポリマーを1.0 mLのクロロホルムに溶解し、PSAR-PLLAポリマーを含む溶液を得た。一方、10 μmolのカルボラン（o-カルボラン、m-カルボラン、又はp-カルボラン）を100 μLのクロロホルム中に溶解し、カルボランを含む溶液を得た。PSAR-PLLAポリマーを含む溶液1 mLと、カルボランを含む溶液100 μLを、試験管に加え、混合し、エバポレーションにより有機溶媒を除去することにより、PSAR-PLLAポリマーとカルボランを含むフィルムを得た。得られたフィルムを含む試験管に2.0 mLのPBS（リン酸緩衝生理食塩水）を加え、バス型超音波装置を用いて20分間超音波処理した。超音波処理の後、PD-10カラム（GE Healthcare社）を用いて、PSAR-PLLAナノ粒子を含む溶離液を回収した。PSAR-PLLAナノ粒子を含む溶離液は、孔径0.22 μmのシリンジフィルターを通してから後述する実験に用いた。なお、比較対象として、カルボランを含む溶液を使用しなかった以外は、以上の手順と同様にして、カルボランを担持していないPSAR-PLLAナノ粒子を調製した。
＜実験1-2. PSAR-PLLAナノ粒子の評価＞
粒子径分布及び多分散度
　得られたPSAR-PLLAナノ粒子の粒径及び多分散度（PDI）は、Zetasizer Nano ZSP（Malvern社、Malvern、United Kingdom）を用いて動的光散乱法により測定した。
ホウ素担持量及びホウ素担持率
　PSAR-PLLAナノ粒子のホウ素担持量は、ICP発光分光分析装置（島津製作所株式会社製）を用いて、発光分光分析法(Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectroscopy：ICP-AES)法により測定した。また、ICP-AES法により測定されたホウ素担持量に基づき、PSAR-PLLAナノ粒子のホウ素担持率（DLC(%)）を、次の式に従って計算した。なお、以下の式において「weight of loaded drug」は、ICP-AES法により求められたホウ素担持量であり、「weight of nanoparticles」はPSAR-PLLAナノ粒子の調製に用いたPSAR-PLLAポリマーの質量である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
　3種類のカルボラン異性体（すなわち、o-カルボラン、m-カルボラン、p-カルボラン）を担持するPSAR-PLLAナノ粒子のホウ素担持量（Loaded B）、ホウ素担持率(DLC(%))、及び、PSAR-PLLAナノ粒子におけるホウ素とPSAR-PLLAポリマーの比率（B/PSAR-PLLA Ratio）を表1に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表1に示されるとおり、o-カルボラン、m-カルボラン又はp-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子におけるホウ素担持率（DLC(%)）は、それぞれ13.0%、3.49%、1.80%であり、いずれのカルボランもPSAR-PLLAナノ粒子に担持されることが確認された。特に、3種のカルボラン異性体のうちo-カルボランを用いた場合のホウ素担持率は13.0%であり、m-カルボラン又はp-カルボランを用いた場合のホウ素担持率と比較して顕著に大きかった。3種のカルボラン異性体を用いた場合のホウ素担持率はo-カルボラン＞m-カルボラン＞p-カルボランの順に大きく、この順はカルボラン異性体の疎水性の強さの順（o-カルボラン＞m-カルボラン＞p-カルボラン）と一致した。この結果は、3種のカルボラン異性体は、主として、疎水性相互作用を介してPSAR-PLLAナノ粒子の疎水性コアに担持されていることを示唆するものである。
　一方、3種類のカルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子の粒径及び多分散度を動的光散乱法により測定した結果を表2に示す。なお、表2には、比較対象として、カルボランを担持していないPSAR-PLLAナノ粒子の粒径及び多分散度を併せて示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表2に示されるとおり、o-カルボラン、m-カルボラン、又はp-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子は、いずれも粒径が60 nm～72 nm程度、PDIは0.20程度であり、カルボランを担持していないPSAR-PLLAナノ粒子と同等の粒径及びPDIを有するナノ粒子であった。中でも、o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子は、多分散度が最も小さく、極めて単分散な粒径分布を有していた。o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子及びカルボランを担持していないPSAR-PLLAナノ粒子について動的光散乱により得られる粒径分布のヒストグラムを図2に示す。図2に示されるとおり、o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子は、カルボランを担持していないPSAR-PLLAナノ粒子と同様に極めて単分散である。さらに、o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子を透過型電子顕微鏡にて確認したところ、動的光散乱法により示される結果に対応する粒径分布を有するナノ粒子が確認された（図2）。
＜実験1-3. 細胞内取り込み挙動の評価＞
　実験1-1で調製したo-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子による細胞内ホウ素濃度の上昇効果について検討するため、PSAR-PLLAナノ粒子の細胞内取り込み挙動を評価した。なお、本実験においては、BNCT用のホウ素薬剤として従来使用されているL-BPAを比較対象として用いた。
　実験手順の概要を図3(a)に示す。詳細には、マウス乳がん細胞4T1（ATCC, Rockville, Maryland, USA）を0.5×105 個/mLの濃度で細胞培養培地中に含む細胞懸濁液を、6 wellのマイクロプレートに各wellあたり1 mLずつ播種し、常法にしたがって、5% CO2、37oCの環境下で24時間インキュベートした。次に、実験1-1で調製したo-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子又はL-BPAを、細胞培養培地中のホウ素濃度が2 mMとなるように細胞培養培地に加え、2、4又は6時間インキュベートした。所定時間のインキュベート後、常法にしたがって、PBSを用いて細胞を3回洗浄した後、トリプシン処理にて細胞を回収した。得られた回収液を1,800 rpmで5分間遠心し、上澄みを除去して、ペレットを得た。得られたペレットは、60%の硝酸（1 mL）で一晩、常温で処理した。その後、孔径0.45μmのシリンジフィルターを通してフィルター濾過し、得られた濾液に純水を加え、総量を10 mLとした。このようにして得られた溶液をICP-AESに供し、溶液中のホウ素含有量を測定した。得られたホウ素含有量に基づいて、一細胞あたりのホウ素原子数を求めた。なお、以上の実験において、細胞培養培地としては、10%(v/v)のFBS及び1%(v/v)のペニシリン－ストレプトマイシン液を含むRPMI-1640培地を用いた。得られた結果を図3(b)に示す。図3(b)においては、各サンプルについて独立した3回の試験から得られた値の平均値±標準誤差(SEM)を示した。
　図3(b)に示すとおり、いずれのインキュベーション時間においても、o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子と接触させた4T1細胞においては、L-BPAと接触させた4T1細胞と比較して、一細胞当たりのホウ素原子数が大きかった。インキュベーション時間が短いほど両者の差は顕著であり、特に、2時間のインキュベーション後においては、o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子と接触させた4T1細胞における一細胞当たりのホウ素原子数は13.2×109 個/cellであり、同じホウ素濃度のL-BPAと2時間接触させた4T1細胞における一細胞当たりのホウ素原子数（4.6×109 個/cell）と比較して、約3倍程度も大きかった。この結果は、o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子は、L-BPAを用いた場合と比較して、がん細胞内のホウ素濃度を効率的に高め得ることを示しており、o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子がホウ素中性子捕捉療法のためのホウ素薬剤として有用であり得ることが示唆される。
＜実験1-4. o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子の安定性評価＞
　o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子について、その生理条件下での安定性を検討するため、PSAR-PLLAナノ粒子をPBS中でインキュベートした際のPSAR-PLLAナノ粒子からのo-カルボランの放出を経時的に評価した。
　PSAR-PLLAナノ粒子からのo-カルボランの放出は透析法により評価した。すなわち、実験1-1に記載の手順に準じて調製したo-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子を含む溶液2 mLを、透析チューブ（商品名「セルロースチューブ　20/32」、分画分子量：12,000～14,0000、ナカライテスク株式会社販売）に加え、透析チューブを閉じ、透析チューブを37℃又は4℃の300 mLのPBS（リン酸緩衝生理食塩水）中に浸漬した。0、1、3、6、12及び24時間の透析の後、透析チューブ外の水溶液から2 mLを採取し、代わりに2 mLのPBSを加えた。採取した透析チューブ外の水溶液に含まれるホウ素原子量をICP-AES法により測定し、測定されたホウ素原子量に基づいて、透析チューブ外の水溶液に含まれるo-カルボランの含量を求め、PSAR-PLLAナノ粒子からの放出量とした。
　得られた結果を図4に示す。図4に示されるとおり、生理食塩水中でo-カルボランを担持したPSAR-PLLAナノ粒子をインキュベートすると、PSAR-PLLAナノ粒子からは比較的速やかにo-カルボランが放出されてしまうことが明らかとなった。この結果は、高分子ミセルに物理的に封入された疎水性化合物は、生理条件下において比較的速やかに漏出しやすいという当技術分野における知見と一致するものである。一方、PSAR-PLLAナノ粒子からのo-カルボランの放出は4℃のPBS中よりも37℃のPBS中でより顕著であった。
　o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子の生理条件下での安定性について更に詳細に検討するため、o-カルボランを担持したPSAR-PLLAナノ粒子を生理食塩水中でインキュベートした後のPSAR-PLLAナノ粒子の粒径及び多分散度を動的光散乱法により評価した。具体的には、上記実験において、24時間の透析の後、透析チューブ内に残った水溶液を適宜希釈して、動的光散乱法による粒径及び多分散度の測定に供した。なお、比較検討のため、カルボランを担持していないPSAR-PLLAナノ粒子、及び、o-カルボランに代えてm-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子を用いて上記実験と同様の手順にて透析を行い、24時間の透析の後、透析チューブ内に残った水溶液を適宜希釈して、動的光散乱法による粒径及び多分散度の測定を行った。
　得られた結果を図5に示す。図5(b)に示されるとおり、37℃、24時間の透析後において、o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子の粒径は顕著に増加するとともに、多分散度も顕著に増加した。この結果は、生体温度である37℃においては、o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子の不安定化が発生し、その構造が徐々に崩壊していることを示している。一方、o-カルボランを担持していないPSAR-PLLAナノ粒子そのものの粒径及び多分散度の測定結果を図5(a)に示す。図5(a)に示されるとおり、o-カルボランを担持していないPSAR-PLLAナノ粒子についても、37℃、24時間の透析後において顕著な粒径と多分散度の増加が観察された。
　以上のとおり、o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子は、PSAR-PLLAナノ粒子同様に、37℃において顕著に不安定化することが示された。図4に示されるo-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子からのo-カルボランの放出には、PSAR-PLLAナノ粒子に物理的に封入された疎水性化合物の漏出に加え、キャリアであるPSAR-PLLAナノ粒子自体の不安定化が関与しているものと推察される。ここで、PSAR-PLLAナノ粒子が有するポリ乳酸はカルボニル基（-C(=O)-）を有しているところ、カルボニル基は、o-カルボラン分子内のオルト位の2つの炭素原子（Ｃ）の近傍に存在するホウ素原子（Ｂ）に対して求核反応を起こすことが知られている（Ohta, K, et al. Journal of Synthetic Organic Chemistry, Japan. 2007;65(2):320-33）。このようなカルボランとポリ乳酸の相互作用は、PSAR-PLLAナノ粒子の疎水コアを構成するポリ（L-乳酸）のα-ヘリックス間相互作用に干渉しPSAR-PLLAナノ粒子を不安定化し得る。また、o-カルボラン分子の部分分解と極性化をもたらし得ることから、o-カルボランPSAR-PLLAナノ粒子の放出に関与するものと考えられる。
　なお、o-カルボランに代えてm-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子においては、37℃、24時間の透析後において、さらに顕著な粒径の増加と多分散度の増加が観察された（図5(c)）。表１に示されるとおり、m-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子は、o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子と比べて、カルボランの担持量は少ない。それにもかかわらず、より顕著な粒径の増加と多分散度の増加が観察されたことから、m-カルボランはPSAR-PLLAナノ粒子を不安定化する作用がo-カルボランと比較して強いことが示唆される。
＜実験２．　o-カルボラン誘導体を担持するPSAR-PLLAナノ粒子＞
　実験１により、o-カルボラン、m-カルボラン、p-カルボランの３種のカルボラン異性体のうち、o-カルボランが最も効率的にPSAR-PLLAナノ粒子に担持され、また、PSAR-PLLAナノ粒子の安定性という点においても有利であり得ることが示された。そこで、さらにPSAR-PLLAナノ粒子の安定性を高め、より優れた細胞内へのホウ素送達を可能とすべく、o-カルボラン及びその誘導体に着目して、o-カルボランのオルト位の２つの炭素に所定の炭素鎖長を有するアルキル基を導入したo-カルボラン誘導体を担持するPSAR-PLLAナノ粒子を調製し、その物性を評価した。
　ナノ粒子を形成するための両親媒性高分子としては、実験１と同じく、ポリサルコシン－ポリ乳酸のブロック共重合体（PSar106-block-PLLA32）（重量平均分子量：10,001 Da；神戸天然物化学株式会社製）を用いた。一方、o-カルボラン誘導体としては、1,2-ジメチル-o-カルボラン、1,2-ジへキシル-o-カルボラン、1,2-ジドデシル-o-カルボラン（Katchem， Ltd., Prague, Czech Republic）を用いた。本実験に用いたカルボラン誘導体の構造を図6に示す。
＜実験2-1. PSAR-PLLAナノ粒子の調製及びその特性評価＞
　PSAR-PLLAナノ粒子の調製は、カルボランに代えて上述のo-カルボラン誘導体を用いた以外は実験１-1と同様の手順にて行った。得られたPSAR-PLLAナノ粒子について、実験1と同様の手順にて、粒径及び多分散度を動的光散乱法により測定した。また、ホウ素担持量をICP-AES法により測定し、得られたホウ素担持量に基づき、ホウ素担持率（DLC(%)）を求めた。得られた結果を表3に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表3に示されるとおり、1,2-ジメチル-o-カルボラン、1,2-ジへキシル-o-カルボラン、又は1,2-ジドデシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子におけるホウ素担持率（DLC(%)）は、それぞれ1.30%、2.86%、0.61%であり、いずれのカルボラン誘導体もPSAR-PLLAナノ粒子に担持されることが確認された。ホウ素担持率(DLC(%))は、C1のアルキル鎖を有する1,2-ジメチル-o-カルボランと比較して、炭素数が大きいアルキル鎖、すなわち、C6のアルキル鎖を有する1,2-ジへキシル-o-カルボランの方が約2倍程度大きかった。しかしながら、アルキル鎖の炭素数が大きいほどホウ素担持率が上昇するというわけではなく、更に炭素数が大きいC12のアルキル鎖を有する1,2-ジドデシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子のホウ素担持率は、C6のアルキル鎖を有する1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子のホウ素担持率の1/4～1/5程度にとどまった。o-カルボラン誘導体は、o-カルボランと同様、主として、PSAR-PLLAナノ粒子の疎水性コアを構成するポリ乳酸との疎水性相互作用によりPSAR-PLLAナノ粒子に物理的に内包されていると推察されることに鑑みれば、1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子のホウ素担持率が最も大きいという知見は全く意外なものであった。1,2-ジへキシル-o-カルボランはC6のアルキル鎖によりポリ乳酸と強く相互作用できる一方、さらに炭素数が大きく、疎水性が強いC12のアルキル基を有する1,2-ジドデシル-o-カルボランでは、1,2-ジドデシル-o-カルボラン同士での疎水性相互作用による凝集体の形成が顕著に起こり、PSAR-PLLAナノ粒子との相互作用が効率的に起こらないためではないかと推察される。
　一方、3種類のo-カルボラン誘導体を担持するPSAR-PLLAナノ粒子について、動的光散乱法により測定された粒径及び多分散度を表4に、粒径分布のヒストグラムを図7(a)～(c)に示す。なお、表4には、比較対象として、カルボランを担持していないPSAR-PLLAナノ粒子の粒径及び多分散度を併せて示した。また、1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子を透過型電子顕微鏡により撮影した写真を図7(d)に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表4及び図7(a)～(c)に示されるとおり、1,2-ジメチル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子の粒径は63.7 nm、PDIは0.23であり、カルボランを担持していないPSAR-PLLAナノ粒子と同等の粒径及びPDIを有するナノ粒子であった。この結果は実験1-2に示した3種のカルボラン異性体を担持するPSAR-PLLAナノ粒子についての測定結果と類似している。一方、1,2-ジへキシル-o-カルボラン又は1,2-ジドデシル-o-カルボランを担持するナノ粒子の粒径は93.2 nm～104 nmと、カルボランを担持していないPSAR-PLLAナノ粒子と比較して大きく、3種のカルボラン異性体や1,2-ジメチル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子との間で違いが見られた。また、1,2-ジへキシル-o-カルボランと1,2-ジドデシル-o-カルボランとを比較すると、1,2-ジへキシル-o-カルボランを用いた場合に多分散度が0.15と小さく、極めて単分散な粒径分布を有するPSAR-PLLAナノ粒子が形成されることが明らかとなった。そこで、1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持させたPSAR-PLLAナノ粒子について、その粒子形態を透過型電子顕微鏡にて観察したところ、動的光散乱法により得られた粒径分布と同程度の粒径を有する単分散なナノ粒子の形成が確認された。
＜実験2-2. o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子の安定性評価＞
　次に、3種類のo-カルボラン誘導体を担持するPSAR-PLLAナノ粒子の安定性について評価した。なお、本実験においては、実験2-1において、ホウ素担持量が比較的高かった1,2-ジメチル-o-カルボランと1,2-ジへキシル-o-カルボランを用いた。安定性の評価としては、o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子に代えて、1,2-ジメチル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子又は1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子を用いた以外は実験1-2で説明した手順に従って、PBS中における経時的なo-カルボラン誘導体の放出及び粒径の変化を評価した。
　o-カルボラン誘導体の放出量の測定結果を図8に示す。図8(a)に示されるとおり、1,2-ジメチル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子においては、透析中、経時的な1,2-ジメチル-o-カルボランの放出が観察された。1,2-ジメチル-o-カルボランの放出は、4℃よりも37℃において顕著であり、37℃、24時間の透析後には総担持量のうち60%もの1,2-ジメチル-o-カルボランが放出されてしまうことが明らかとなった。この結果は、o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子について得られた結果と類似している。これに対して、図8(b)に示されるとおり、1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子においては、驚くべきことに、4℃と37℃のいずれの条件においても、24時間の透析中、1,2-ジへキシル-o-カルボランの放出はほとんど観察されなかった。
　一方、PBS中における24時間の透析の前後におけるPSAR-PLLAナノ粒子の粒径変化を図9に示す。図9(a)に示されるとおり、1,2-ジメチル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子は、37℃、24時間の透析後、粒径の変化及び多分散度の増加が顕著であった。一方、4℃、24時間の透析後には、粒径及び多分散度の顕著な変化は観察されなかった。以上の結果は、1,2-ジメチル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子は、37℃において顕著に不安定化することを示している。これに対して、図9(b)に示されるとおり、1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子は、37℃、24時間の透析後においても、粒径及び多分散度の変化はほとんど観察されなかった。この結果は、1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子は、37℃、PBS中という生体環境に近い温度及び塩濃度でも優れた安定性を有することを示している。PSAR-PLLAナノ粒子の疎水性コアを構成するポリ乳酸は水性媒体中で徐々に加水分解するため、PSAR-PLLAナノ粒子の水性媒体中での安定化は極めて困難であると考えられていたところ、1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持することにより、PSAR-PLLAナノ粒子の水性媒体中での安定性を飛躍的に改善することができるという知見は驚くべきものであり、また、PSAR-PLLAナノ粒子を、水性媒体中での保存や使用が要求される医薬品として応用する上で極めて重要なものである。
＜実験2-3. 1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子の製造条件の検討＞
　1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子の製造条件について検討するため、1,2-ジへキシル-o-カルボランとPSAR-PLLAポリマーの比率を異ならせ、1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子を調製した。
　PSAR-PLLAナノ粒子の調製手順は次のとおりである。まず、1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子を、以下の手順にて調製した。まず、クロロホルムに溶解したPSar106-block-PLLA32（0.1、0.5、又は1.0 μmol）を含む溶液100 μLを試験管に取り、エバポレーションにより溶媒を除去し、PSar106-block-PLLA32を調製した。得られたフィルムを含む試験管に、DMSOに溶解した1,2-ジへキシル-o-カルボラン(10μmol)を含む溶液100 μLを加え、乾燥させ、再度フィルムを形成させた。得られたフィルムに、2.0 mLのPBSを加え、1,200 rpmで1時間撹拌した。攪拌の後、PD-10カラム（GE Healthcare社, Buckinghamshire, United Kingdom）を用いて、ナノ粒子を含む溶離液を回収した。ナノ粒子を含む溶離液は、孔径0.22 μm、続いて、0.10 μmのシリンジフィルター（Merck Millipore社, Dublin, Ireland）を通してから後述する実験に用いた。得られたPSAR-PLLAナノ粒子について、実験1と同様の手順にて、粒径及び多分散度を動的光散乱法により測定した。また、ホウ素担持量をICP-AES法により測定し、得られたホウ素担持量に基づき、ホウ素担持率（DLC(%)）を求めた。得られた結果を表5に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表5に示されるとおり、いずれの調製条件においても、1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子が得られた。なお、1,2-ジへキシル-o-カルボランの仕込み量(A)に対するPSAR-PLLAポリマーの仕込み量(B)の比率(A/B)が10 μmol/0.1 μmol（表５において「Ratio 1」）、10 μmol/0.5 μmol（表５において「Ratio 2」）、10 μmol/1.0 μmol（表５において「Ratio3」）と増加するにしたがって、得られたPSAR-PLLAナノ粒子におけるホウ素とPSAR-PLLAポリマーの比率（B/PSAR-PLLA Ratio）は3.27、1.30、0.80と低下した。
　一方、1,2-ジへキシル-o-カルボランの仕込み量（A）に対するPSAR-PLLAポリマーの仕込み量(B)の比率(A/B)が、10 μmol/0.1 μmol（表５において「Ratio 1」）、10 μmol/0.5 μmol（表５において「Ratio 2」）、10 μmol/1.0 μmol（表５において「Ratio 3」）と増加するにしたがって、得られたPSAR-PLLAナノ粒子の粒径は83.7 nm、91.8 nm、111 nmと増加した。この結果は、1,2-ジへキシル-o-カルボランの仕込み量に対するPSAR-PLLAポリマーの仕込み量の比率を調整することで、PSAR-PLLAナノ粒子の粒径を制御し得ることを示している。
＜実験2-4．細胞取込試験＞
　次に、1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子の細胞内取り込み挙動を評価した。なお、本実験においては、先の実験において、BNCT用のホウ素薬剤として従来使用されているL-BPAよりも優れた細胞内ホウ素濃度の上昇効果を奏することが示されたo-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子を比較対象として用いた。
　実験手順の概要は図3(a)に示したとおりである。詳細には、マウス乳がん細胞4T1、マウス大腸がん細胞CT26、ヒト膵臓腺がん細胞AsPC-1、又はヒト胃がん細胞NC1-N87（いずれもATCC, Rockville, Maryland, USAから購入）を、それぞれ、0.5×106 個/mL、0.5×106 個/mL、1.0×106 個/mL、又は1.0×106 個/mLの濃度で細胞培養培地中に含有する細胞懸濁液を6 wellのマイクロプレートに各wellあたり1 mLずつ播種し、常法にしたがって、5% CO2、37℃の環境下で24時間インキュベートした。次に、1,2-ジへキシル-o-カルボランを10 μmol、PSAR-PLLAを1.0 μmolの配合比（表５において「Ratio 3」）で実験2-3と同様の手順にて調製した1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子、または、実験1-1と同様の手順にて調製したo-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子を、細胞培養培地中のホウ素濃度が0.15、0.5、又は2 mMとなるように細胞培養培地中に加え、2時間インキュベートした。インキュベート後、常法にしたがって、PBSを用いて細胞を3回洗浄した後、トリプシン処理にて細胞を回収した。得られた回収液を1,800 rpmで5分間遠心し、上澄みを除去して、ペレットを得た。得られたペレットを、60%の硝酸（1 mL）で、常温で一晩処理した。その後、孔径0.45 μmのシリンジフィルターを通してフィルター濾過した後、純水を加え、総量を10 mLとした。このようにして得られた溶液をICP-AESに供し、ホウ素含有量を測定した。得られた結果を図10に示す。なお、図10においては、各サンプルについて独立した3回の試験から得られた値の平均値±標準誤差（SEM）を示した。
　図10に示すとおり、ヒト由来の細胞及びマウス由来の細胞を含み、また、乳がんから、大腸がん、膵臓腺がん、胃がんまでのいずれの細胞種においても、1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子と接触させた細胞においては、o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子と接触させた細胞においてと比較して、一細胞当たりのホウ素原子数が顕著に大きかった。ここで、BNCTによる治療効果を得るために必要な最小限の一細胞当たりのホウ素原子数は1×109 個/cell（～20ngホウ素／106 cells）と言われていることに注目されたい。図10に示すとおり、o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子を作用させた場合には、0.5 mM又は2 mMのホウ素濃度で作用させた場合に1×109 個/cellを上回るホウ素原子数が観察されたのに対し、1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子を作用させた場合には、0.15 mMのホウ素濃度で作用させた場合でも、一細胞当たりのホウ素原子数が1×109 個/cellを上回っており、0.5 mM又は2 mMのホウ素濃度で作用させた場合には、一細胞当たりのホウ素原子数は1×109 個/cellを遥かに上回るものであった。
　以上の結果は、1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子によれば、o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子を用いた場合と比較して、がん細胞内のホウ素濃度をより一層高め得ることを示している。各種のがん細胞において、細胞内のホウ素濃度をBNCTによる治療効果を得るために要求される1×109 個/cellを超える水準まで高め得る1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子は、BNCTによるがん治療のために有利に使用され得る。
＜実験2-5．細胞毒性試験＞
　カルボラン又はo-カルボラン誘導体を担持するPSAR-PLLAナノ粒子の細胞毒性を評価した。
　実験手順の概要は図11(a)に示したとおりである。マウス乳がん細胞4T1を96wellのマイクロプレートに各wellあたりの細胞数が5×103 個/cellとなるように播種し、常法にしたがって、5% CO2、37℃の環境下で24時間インキュベートした。次に、実験1-1と同様の手順にて調製したo-カルボラン又はm-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子又は実験2-1と同様の手順にて調製した1,2-ジメチル-o-カルボラン又は1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子を、ホウ素濃度が5、25、50、100又は250 ppmとなるように細胞培養培地中に加え、24時間インキュベートした。細胞毒性試験は、Cell Counting Kit-8 (CCK-8)(Dojindo Molecular Technologies, Inc., Kumamoto, Japan)を、キットに付属のマニュアルにしたがって用いることにより行った。波長450nmにおける光学密度(OD)の測定は、マイクロプレートリーダー（SunriseTM, Tecan Trading AG, Mannedorf, Switzerland）を用いて行った。細胞生存率(cell viability)は、未処理の細胞（control）の細胞生存率を100%とした場合の割合（%）として求めた。結果は独立した4サンプルから得られた値の平均値±標準誤差（SEM）で示した。得られた結果を図11(b)に示す。
　図11(b)に示されるとおり、o-カルボラン、m-カルボラン、1,2-ジメチル-o-カルボラン又は1,2-ジへキシル-o-カルボランのいずれを担持するPSAR-PLLAナノ粒子も、ホウ素濃度換算で5 ppmから250 ppmの濃度範囲において、有意な細胞毒性は示さなかった。なお、本実験で試験した最大濃度である250 ppmはモル濃度に換算すると25 mMに相当する。この結果と実験2-3の結果を合わせ考えると、有意な細胞毒性を示さない濃度範囲で、BNCTに好適な1×109 個/cellを上回るホウ素濃度を実現し得る1,2-ジへキシル-o-カルボラン誘導体を担持するPSAR-PLLAナノ粒子は、低毒性かつ効果的なBNCT用のホウ素薬剤として極めて有用であることが示唆される。
＜実験2-5. 1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子の生体内動態評価＞
　以上のとおり、in vitroの細胞実験において、1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子は細胞内に取り込まれ、細胞内ホウ素濃度を効率的に高めることが示された。そこで、次のステップとして、1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子のがん組織への集積性について検討した。なお、以下の実験においては、まず、近赤外蛍光色素であるICG(Indocyanine Green)で標識したPSAR-PLLAナノ粒子を用いた近赤外蛍光イメージングによりPSAR-PLLAナノ粒子の体内動態を評価した。近赤外蛍光は可視光領域よりも吸収係数が低く組織透過性に優れるとともに、また生体からの自家蛍光の影響を受けにくい。よって、ICGで標識したPSAR-PLLAナノ粒子を用いた近赤外蛍光イメージングによれば、生体深部にあるPSAR-PLLAナノ粒子をも含め、PSAR-PLLAナノ粒子の生体内動態を鮮明に可視化することができる。
　ICGで標識した1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子を、以下の手順にて調製した。まず、クロロホルムに溶解したPSar106-block-PLLA32（1μmol/mL; 1 mL）とICG-PLLA34（1 mol%; 1 mL）を試験管内で混合し、エバポレーションにより溶媒を除去し、PSar106-block-PLLA32とICG-PLLA34を含むフィルムを調製した。得られたフィルムを含む試験管に1,2-ジへキシル-o-カルボラン(10 μmol in 1 mL DMSO)を加え、乾燥させ、溶媒を除去した後、2.0 mLのPBSを加え、1,200 rpmで1時間撹拌した。攪拌の後、PD-10カラム（GE Healthcare社）を用いて、ナノ粒子を含む溶離液を回収した。ナノ粒子を含む溶離液は、孔径0.10 μmのシリンジフィルターを通してから後述する実験に用いた。
　生体内動態試験は図12(a)に示す手順にて行った。すなわち、4T1細胞を5×106 個/mLの濃度でPBSに懸濁し、得られた懸濁液100 μLを、6週齢の雌のヌードマウス（BALB/c nu/nu）（Charles River社より購入）の右脚の太ももに皮下注射により播種することによりXenograftモデルを作製した。4T1細胞の播種から2週間後、上述の手順にて調製した、ICGで標識した1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子を含む溶液100 μLを尾静脈から静脈注射することにより投与した。ナノ粒子を含む溶液を静脈注射した後、1、3、6、12、24、48、及び72時間後に、in vivo近赤外蛍光イメージングを行った。72時間後のin vivo近赤外生体蛍光イメージングの後、マウスを安楽死させ、血液、心臓、肺、肝臓、脾臓、すい臓、腎臓、胃、腸、筋肉、及び腫瘍を回収し、重量を測定した。また、Ex vivo近赤外蛍光イメージングにより各臓器における蛍光強度を測定した。なお、以上の実験において、近赤外蛍光イメージングは、ICG（励起波長745nm、蛍光波長840nm）用のフィルターを装備したIVIS spectrum system(Xenogen, Hopkinton, Massachusetts)により行った。また、回収した臓器をHNO3で処理した後、ICP-AESに供して各臓器におけるホウ素濃度を測定した。
　in vivo近赤外生体蛍光イメージングによるPSAR-PLLAナノ粒子の生体内動態の評価結果を図12(b)に示す。図12(b)に示すとおり、ICGで標識したPSAR-PLLAナノ粒子を投与したマウスの右脚太ももの腫瘍部位からは、ICGに由来する蛍光が強く観察された。腫瘍部位におけるICGに由来する蛍光の強度は、PSAR-PLLAナノ粒子の投与後12時間から24時間でピークに達した。一方、腫瘍部位での蛍光強度と、通常組織での蛍光強度の比は、投与後72時間にわたって徐々に増加し続けた。以上の結果は、ICGで標識したPSAR-PLLAナノ粒子が腫瘍部位に集積していることを示している。腫瘍部位での蛍光強度と通常組織での蛍光強度の比率が徐々に増加していくことから、腫瘍部位に到達したPSAR-PLLAナノ粒子はEPR効果により腫瘍部位に蓄積しているものと推察される。
　一方、PSAR-PLLAナノ粒子の静脈注射から72時間後に回収した各臓器におけるICGに由来する蛍光強度をEx vivo近赤外蛍光イメージングにより測定した結果を図13(a)に示す。図13(a)に示されるとおり、血液、心臓、肺、肝臓、脾臓、すい臓、腎臓、胃、腸、筋肉、及び腫瘍のうち、腫瘍において最も強いICGの蛍光強度が観察された。この結果は、ICGで標識したPSAR-PLLAナノ粒子は、腫瘍部位に最も多く集積していることを示すものであり、図11に示すin vivo近赤外蛍光イメージングの結果と一致する。
　さらに、各臓器におけるホウ素の蓄積量をICP-AESにより測定した結果を図13(b)に示す。図13(b)に示されるとおり、腫瘍部位におけるホウ素濃度は、通常組織（筋肉）におけるホウ素濃度と比較して、3倍以上大きかった。BNCTにおいては、腫瘍部位におけるホウ素濃度（T）と通常組織（筋肉）におけるホウ素濃度（N）との比率（T/N比）が3以上であることが理想的であるとされている（Tsurubuchi， T. et al., Cells 2020, 9（5）， 1-20）。1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子によれば、腫瘍部位におけるT/N比を3以上に高め得るという結果は、1,2-ジへキシル-o-カルボランを担持するPSAR-PLLAナノ粒子がBNCTによるがん治療のために極めて有用であることが示唆される。
　なお、以上の実験においては、カルボラン又はo-カルボラン誘導体を担持するナノ粒子として、AB型のポリサルコシン-ポリ乳酸ブロックポリマーから形成されるナノ粒子を用いたが、これに代えて、一本のポリ乳酸鎖に3本のポリサルコシン鎖が結合した、いわゆるA3B型のポリサルコシン-ポリ乳酸ブロックポリマーから形成されるナノ粒子を用いることもできる（M. S. H. Lim et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 2021, 110, 1788-179; M. S. H. Lim et al., Life 2021, 11(2), 158; F. Takenaka et al., Drug Delivery System 33-3, 2018）。A3B型のポリサルコシン-ポリ乳酸ブロックポリマーから形成されるナノ粒子は、AB型のポリサルコシン－ポリ乳酸ブロックポリマーから形成されるナノ粒子と比較して、粒子径が小さく、また、ABC現象を軽減することが期待される。一方、以上の実験において、カルボラン又はo-カルボラン誘導体を担持するナノ粒子は、EPR効果に基づき、腫瘍組織への優れた集積性を示したものと考えられる。しかしながら、腫瘍組織へのナノ粒子の集積性をより一層高め、また、必要に応じて、細胞内へのナノ粒子の取り込み量を高めるため、標的とする細胞のみに特異的に結合し、細胞内への薬剤搬送を可能にするリガンドでナノ粒子を修飾しても良いことは言うまでもない。このようなリガンドに特段の制限はないが、例えば、中皮腫、膵臓腺がん、卵巣がん、肺線がんなどの多種類のがんに高率に発現することが知られているmesothelin（MSLN）に対する低分子抗体バリアント(scFv)（H. Yakushiji et al., Cancer Science. 2019, 110(9), 2722-2733）が好適に用いられ得る。
　本発明に係る微粒子、又は、これを含有する医薬組成物によれば、従来のホウ素中性子捕捉療法に用いられてきたホウ素含有化合物と比較して高い細胞内ホウ素濃度を達成し得る。本発明によれば、ホウ素中性子捕捉療法の治療効果の向上、副作用の低減が期待され、その産業上の利用可能性は大きい。

 

Claims (15)

  1. 　親水性ブロックと疎水性ブロックを有する両親媒性高分子と、ホウ素含有化合物とを含む、微粒子であって、
    　前記疎水性ブロックはポリ乳酸を含み、
    　前記ホウ素含有化合物が下記式（Ｉ）： 
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （上記式（Ｉ）において、●はＣであり、〇は、それぞれ独立して、ＢＨ又はＢ－ハロゲンであり、Ｒは、それぞれ独立して、置換されていてもよい飽和又は不飽和のアルキル基を有する置換基であって、前記アルキル基の炭素原子数は３以上である。）で表される、微粒子。
  2. 　前記アルキル基の炭素原子数が３以上１１以下ある、請求項１に記載の微粒子。
  3. 　前記置換基が、置換されていてもよい飽和又は不飽和のアルキル基、置換されていてもよい飽和又は不飽和のアルコキシ基、又は置換されていてもよい飽和又は不飽和のアルキルチオ基のいずれかである、請求項１又は２に記載の微粒子。
  4. 　前記疎水性ブロックがポリ乳酸である、請求項１乃至３に記載の微粒子。
  5. 　前記ポリ乳酸がポリ（Ｌ－乳酸）又はポリ（Ｄ－乳酸）である、請求項１乃至４のいずれかに記載の微粒子。
  6. 　前記親水性ブロックがポリサルコシンである、請求項１乃至５のいずれかに記載の微粒子。
  7. 　動的光散乱法で測定される平均粒径が直径２０ｎｍ以上１５０ｎｍ以下である、請求項１乃至６のいずれかに記載の微粒子。
  8. 　請求項１乃至７のいずれかに記載の微粒子を含有する、医薬組成物。
  9. 　請求項１乃至７のいずれかに記載の微粒子を含有する、ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）によるがん治療のための医薬組成物。
  10. 　ポリ乳酸を含む高分子と、下記式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （上記式（Ｉ）において、●はＣであり、〇は、それぞれ独立して、ＢＨ又はＢ－ハロゲンであり、Ｒは、それぞれ独立して、置換されていてもよい飽和又は不飽和のアルキル基を有する置換基であって、前記アルキル基の炭素原子数は３以上である。）で表されるホウ素含有化合物とを混合して混合物を得る工程、前記混合物を水性媒体と接触させる工程を含む、微粒子の製造方法。
  11. 　前記アルキル基の炭素原子数が３以上１１以下ある、請求項１０に記載の製造方法。
  12. 　前記置換基が、置換されていてもよい飽和又は不飽和のアルキル基、置換されていてもよい飽和又は不飽和のアルコキシ基、又は置換されていてもよい飽和又は不飽和のアルキルチオ基のいずれかである、請求項１０又は１１に記載の製造方法。
  13. 　下記式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （上記式（Ｉ）において、●はＣであり、〇は、それぞれ独立して、ＢＨ又はＢ－ハロゲンであり、Ｒは、それぞれ独立して、置換されていてもよい飽和又は不飽和のアルキル基を有する置換基であって、前記アルキル基の炭素原子数は３以上である。）で表されるホウ素含有化合物を有効成分とする、ポリ乳酸を含む微粒子の安定化剤。
  14. 　前記アルキル基の炭素原子数が３以上１１以下ある、請求項１３に記載の安定化剤。
  15. 　前記置換基が、置換されていてもよい飽和又は不飽和のアルキル基、置換されていてもよい飽和又は不飽和のアルコキシ基、又は置換されていてもよい飽和又は不飽和のアルキルチオ基のいずれかである、請求項１３又は１４に記載の安定化剤。

     
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