WO2023182460A1 - 慢性活動性Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス感染症（ＣＡＥＢＶ）の検出方法 - Google Patents

慢性活動性Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス感染症（ＣＡＥＢＶ）の検出方法 Download PDF

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biological sample
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文子 新井
彩香 大橋
悠 上村
謙一 今留
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学校法人 聖マリアンナ医科大学
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting chronic active Epstein-Barr virus infection (CAEBV).
  • CAEBV chronic active Epstein-Barr virus infection
  • the present invention also relates to a method for determining the disease activity of CAEBV, a method for predicting the prognosis of CAEBV, and a method for determining the therapeutic effect of CAEBV.
  • the present invention further relates to pharmaceutical compositions for the treatment of CAEBV.
  • Epstein-Barr virus is a familiar virus that has infected almost all humans around the world. In many humans, EBV is subclinically infected during childhood and remains a latent infection, mainly in B cells and epithelial cells, without being eliminated from the body. EBV can cause infectious mononucleosis in some people upon initial infection, which can become severe. Furthermore, EBV during latent infection may be affected by EBV-infected lymphoid tumors (Burkitt lymphoma, EBV-infected B-cell lymphoma, EBV-infected T-cell lymphoma, EBV-infected Hodgkin lymphoma, chronic active EBV infection (CAEBV), etc.) depending on the immune status of the host. ) and epithelial tumors (nasopharyngeal cancer, EBV-infected gastric cancer, etc.), but all of these diseases are intractable.
  • EBV-infected lymphoid tumors Bokitt lymphoma, E
  • CAEBV which is one of the EBV-infected lymphoid tumors, affects a wide range of age groups from children to those in their 80s, and the annual incidence in Japan is 23.8 (estimated number of patients is 100 nationwide). It is a rare disease.
  • the pathogenic mechanism of CAEBV has not been elucidated, and the only radical treatment is hematopoietic stem cell transplantation, and elucidation of the pathology and development of therapeutic drugs are urgent issues.
  • CAEBV activates EBV-infected T cells or NK cells, causing persistent inflammation throughout the body, and at the same time, these infected cells proliferate in a neoplastic manner.
  • Non-patent Documents 1 and 2 Because of the wide variety of inflammatory symptoms and the fact that even though it is a tumor, it rarely forms a lump or mass, it is difficult to perform a pathological examination of the diseased tissue, making it difficult to make a diagnosis. Biomarkers to be evaluated have also not been established (Non-patent Documents 1 and 2).
  • the purpose of the present invention is to provide a new method for detecting CAEBV.
  • the present invention also aims to provide a novel method for determining disease activity of CAEBV, a novel method for predicting the prognosis of CAEBV, and a novel method for determining the therapeutic effect of CAEBV.
  • the present invention further aims to provide novel pharmaceutical compositions for the treatment of CAEBV.
  • the present inventors have now found that the amount or concentration of Flt3-L in the blood of subjects who have developed CAEBV is different from the amount or concentration in the blood of subjects who have not developed CAEBV.
  • the inventors have also found that the amount or concentration in the blood correlates with the degree of disease or disease activity of CAEBV.
  • the present inventors further discovered that inhibiting Flt3 suppresses the proliferation of EBV-infected cells of CAEBV patients and suppresses the production of cytokines produced by the EBV-infected cells.
  • the present invention is based on these findings.
  • a method for detecting or diagnosing chronic active Epstein-Barr virus infection which comprises the step of measuring the amount or concentration of Flt3-L in a biological sample of a subject.
  • CAEBV chronic active Epstein-Barr virus infection
  • the detection method or diagnostic method according to [1] above further comprising a step of determining whether or not CAEBV has developed using the amount or concentration of Flt3-L in the target biological sample as an index.
  • [4] The detection method or diagnostic method according to [3] above, wherein the reference value is a value set based on the amount or concentration of Flt3-L in a biological sample of a subject not suffering from CAEBV.
  • [5] The detection method or diagnostic method according to any one of [1] to [4] above, wherein the presence or absence of CAEBV is determined using clinical information of the subject as an indicator.
  • the clinical information is the amount or concentration of a factor that is an indicator of inflammation in a biological sample.
  • the biological sample is a blood sample.
  • a method for determining the disease activity of chronic active Epstein-Barr virus infection (CAEBV) or predicting the prognosis of CAEBV which comprises the step of measuring the amount or concentration of Flt3-L in a biological sample of a subject.
  • Method. Determination of disease activity according to [9] above, further comprising the step of evaluating CAEBV disease activity or CAEBV prognosis using the amount or concentration of Flt3-L in the target biological sample as an index. method or prognosis prediction method.
  • a method for determining the therapeutic effect on chronic active Epstein-Barr virus infection which comprises the step of measuring the amount or concentration of Flt3-L in a biological sample of a subject.
  • CAEBV chronic active Epstein-Barr virus infection
  • CAEBV chronic active Epstein-Barr virus infection
  • EBV-infected cells are T cells or NK cells.
  • Flt3-L as a marker for diagnosis or detection of CAEBV, a marker for determining disease activity of CAEBV, a marker for predicting prognosis of CAEBV, or a marker for determining therapeutic efficacy of CAEBV.
  • a CAEBV diagnostic kit, a CAEBV disease activity determination kit, a CAEBV prognosis prediction kit, or a CAEBV therapeutic effect determination kit which comprises a means for quantifying the amount or concentration of Flt3-L in a biological sample.
  • a method for treating CAEBV comprising: administering treatment to the subject determined to be suffering from CAEBV.
  • the present invention by measuring the amount or concentration of Flt3-L in a biological sample of a target, it is possible to easily detect or evaluate the presence or absence of the onset of CAEBV, and also to determine the disease state or disease activity of CAEBV.
  • This method is advantageous in that prognosis prediction and CAEBV therapeutic efficacy determination can be easily carried out.
  • the present invention is also advantageous in that it provides a new therapeutic agent for CAEBV that targets Flt3.
  • Figures 1A and B show the concentrations of Flt3-L and IFN- ⁇ in the plasma of blood samples from subjects who have not developed CAEBV (control group) and subjects who have developed CAEBV (CAEBV group), respectively. P values were calculated by Wilcoxon signed rank sum test.
  • Figures 2A and B show the plasma levels of blood samples from patients with disease activity (CAEBV (active +) group) and patients without disease activity (CAEBV (active -) group) among patients with CAEBV. The concentrations of Flt3-L and IFN- ⁇ are shown, respectively. P values were calculated by Wilcoxon signed rank sum test.
  • FIG. 3 shows the change in PBMC cell number over time when peripheral blood mononuclear cells (PBMC) (including EBV-infected T cells or EBV-infected NK cells) collected from CAEBV patients were treated with gilteritinib, an Flt3 inhibitor.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • FIG. 3A shows the amount of cytokines produced by PBMCs when EBV-infected PBMCs (including EBV-infected T cells or EBV-infected NK cells) collected from CAEBV patients were treated with gilteritinib, an Flt3 inhibitor. .
  • PBMC were collected from each of the CAEBV patients with CD4 infection type (one patient), CD8 infection type (one patient), and CD56 infection type (one patient).
  • FIG. 6A shows the concentration of Flt3-L in the plasma of blood samples of subjects developing CAEBV (CAEBV group) and subjects not developing CAEBV (control group).
  • FIG. 6B shows an ROC curve created based on the results of FIG. 6A.
  • Figure 7 shows changes over time in the number of PBMC cells when peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) (including EBV-infected T cells or EBV-infected NK cells) collected from CAEBV patients were treated with gilteritinib, an Flt3 inhibitor. are shown respectively.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • PBMCs of CAEBV patients are CD4-infected type (1 person), CD8-infected type (1 person), CD56-infected type (1 person), and CD56-negative NK cell-infected type (hereinafter referred to as "CD56(-)NK” in the present specification and figures). (sometimes referred to as "cell infection type”) (1 person).
  • CD56(-)NK CD56-negative NK cell-infected type
  • FIGS. 6A to D * indicates p ⁇ 0.05, ** indicates p ⁇ 0.01, *** indicates p ⁇ 0.001, and *** indicates p ⁇ 0.0001, respectively.
  • FIG. 8A shows the amount of TNF- ⁇ produced when EBV-infected PBMCs (including EBV-infected T cells or EBV-infected NK cells) collected from CAEBV patients were treated with gilteritinib, an Flt3 inhibitor, at various concentrations.
  • PBMC were collected from CAEBV patients with CD4 infection type (1 patient), CD8 infection type (1 patient), CD56 infection type (1 patient), and CD56(-) NK cell infection type (1 patient).
  • Figure 8B shows the amount of IFN- ⁇ produced when EBV-infected PBMCs (including EBV-infected T cells or EBV-infected NK cells) collected from CAEBV patients were treated with gilteritinib, an Flt3 inhibitor, at various concentrations. .
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • Figure 8C shows the amount of IL-6 produced when EBV-infected PBMCs (including EBV-infected T cells or EBV-infected NK cells) collected from CAEBV patients were treated with gilteritinib, an Flt3 inhibitor, at various concentrations.
  • PBMC were collected from each of the CD8-infected patients (one patient) and CD56-infected patients (one patient).
  • Figure 9A shows the number of PBMC cells when peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) (including EBV-infected T cells) collected from one CAEBV patient (CD4-infected type) were treated with quizartinib, an Flt3 inhibitor, at various concentrations. shows changes over time.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • Figure 9B shows the number of PBMC cells over time when peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) (EBV-infected T cells) collected from two CAEBV patients (CD8-infected type) were treated with quizartinib, an Flt3 inhibitor, at various concentrations. It shows a change.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • Figure 9C shows the number of PBMC cells when peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) (including EBV-infected NK cells) collected from two CAEBV patients (CD56-infected type) were treated with quizartinib, an Flt3 inhibitor, at various concentrations. shows changes over time.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • FIG. 8C * indicates p ⁇ 0.05, ** indicates p ⁇ 0.01, *** indicates p ⁇ 0.001, and *** indicates p ⁇ 0.0001, respectively.
  • FIG. 9D shows the results when peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) (including EBV-infected NK cells) collected from CAEBV patients (CD56(-) NK cell-infected type) were treated with quizartinib, an Flt3 inhibitor, at various concentrations. It shows the change over time in the number of PBMC cells.
  • FIG. 10A shows the amount of TNF- ⁇ produced when EBV-infected PBMCs (including EBV-infected T cells or EBV-infected NK cells) collected from CAEBV patients were treated with quizartinib, an Flt3 inhibitor.
  • FIG. 10B shows the amount of IFN- ⁇ produced when EBV-infected PBMCs (including EBV-infected T cells or EBV-infected NK cells) collected from CAEBV patients were treated with quizartinib, an Flt3 inhibitor.
  • PBMC were collected from CAEBV patients with CD4 infection type (1 patient), CD8 infection type (1 patient), CD56 infection type (2 patients), and CD56(-) NK cell infection type (1 patient).
  • FIG. 10C shows the amount of IL-6 produced when EBV-infected PBMCs (including EBV-infected T cells or EBV-infected NK cells) collected from CAEBV patients were treated with quizartinib, an Flt3 inhibitor.
  • PBMC were collected from CAEBV patients with CD4 infection type (1 patient), CD8 infection type (1 patient), CD56 infection type (2 patients), and CD56(-) NK cell infection type (1 patient).
  • FIG. 11 shows the concentrations of Flt3-L in the plasma of blood samples of four CAEBV patients before and after treatment, respectively.
  • CAEBV Choleic active Epstein-Barr virus infection
  • EBV-infected T cells a disease caused by lymphoid tumors of EBV-infected T cells and EBV-infected NK cells due to infection with Epstein-Barr virus (EBV). It has the aspects of ⁇ inflammation'' and ⁇ tumor,'' causing systemic inflammation due to activation of EBV-infected T cells and NK cells, and multiorgan damage due to neoplastic proliferation and infiltration of infected cells.
  • CAEBV is diagnosed by meeting the following four items 1) to 4) (Diagnostic Criteria for Chronic Active EB Virus Infection (CAEBV) (Ministry of Health, Labor and Welfare Research Group, 2015)). 1) Infectious mononucleosis-like symptoms persist for more than 3 months (continuous or intermittent) 2) Increased amount of EB virus genome in peripheral blood or diseased tissue 3) EB virus infection found in T cells or NK cells 4) Different from known diseases
  • Flt3-ligand (Flt3-L: Fms-like tyrosine kinase receptor-3-ligand)” is a hematopoietic cytokine that acts on undifferentiated hematopoietic cells and cooperates with other cytokines to promote blood cell growth. Contributes to differentiation.
  • Flt3 (Fms-like tyrosine kinase receptor-3) which is a receptor for Flt3-L, is a receptor-type tyrosine kinase, is expressed in hematopoietic progenitor cells, and contributes to their differentiation and proliferation.
  • biological sample refers to a sample separated from a living body, such as body fluids such as blood, bone marrow fluid, cerebrospinal fluid, pleural effusion, and ascites fluid, and cells (including cells isolated from CAEBV patients). and is preferably a blood sample (more preferably a plasma sample or serum sample, even more preferably a plasma sample) or a cell sample.
  • subject in the present invention is used to include not only humans but also non-human mammals (eg, model animals).
  • CAEBV chronic active Epstein-Barr virus infection
  • the detection method of the present invention CAEBV can be detected using the amount or concentration of Flt3-L in a target biological sample as an index. That is, the detection method of the present invention is characterized in that the amount or concentration of Flt3-L in a biological sample of a subject is correlated with the presence or absence of onset of CAEBV in the subject.
  • the detection method of the present invention first, (A) the step of measuring the amount or concentration of Flt3-L in the target biological sample is performed.
  • the amount or concentration of Flt3-L can be measured by known methods.
  • the detection method of the present invention measures the amount or concentration of Flt3-L in a biological sample collected from a subject, so it can be called an in vitro detection method for CAEBV.
  • Methods for measuring the amount or concentration of Flt3-L include, for example, immunoassays using antibodies and aptamers such as enzyme immunoassays (ELISA and EIA), radioimmunoassays (RIA), fluorescence immunoassays (FIA), and fluorescence polarization immunoassays (FPIA). , chemiluminescent immunoassay, etc., and from the viewpoint of highly sensitive detection with a small amount of sample, multiplex assay and cytometric bead assay (CBA) can also be used.
  • immunoassays using antibodies and aptamers such as enzyme immunoassays (ELISA and EIA), radioimmunoassays (RIA), fluorescence immunoassays (FIA), and fluorescence polarization immunoassays (FPIA).
  • chemiluminescent immunoassay etc.
  • CBA cytometric bead assay
  • the amount or concentration of Flt3-L can also be measured indirectly by measuring the amount or concentration of RNA encoding the protein.
  • methods for measuring the amount or concentration of RNA include RNA-seq using a next-generation sequencer, quantitative RT-PCR (RT-qPCR), digital PCR, microarray, fluorescence in situ hybridization (FISH) method, and mass spectrometry.
  • RT-qPCR quantitative RT-PCR
  • digital PCR digital PCR
  • microarray microarray
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • mass spectrometry mass spectrometry.
  • analytical methods but RT-qPCR and digital PCR are preferred from the viewpoint of rapid and simple detection.
  • the detection method of the present invention further includes the step of (B) determining or evaluating the presence or absence of the onset of CAEBV in the subject from whom the biological sample was collected, using the amount or concentration of Flt3-L measured in step (A) as an index. can be included.
  • Step (B) consists of (B-1) comparing the amount or concentration of Flt3-L in the biological sample with a predetermined reference value, and (B-2) comparing the amount or concentration of Flt3-L in the biological sample of the subject from which the biological sample was collected. This can be carried out by determining that the test subject has developed CAEBV when the amount or concentration of Flt3-L is equal to or higher than a reference value.
  • “having developed” is used to include not only the occurrence of CAEBV but also the case where there is a possibility that the patient has developed CAEBV.
  • the "reference value" can be calculated and determined from the measured value of the amount or concentration of Flt3-L in a biological sample of a subject who has not developed CAEBV (normal subject).
  • a subject is preferably a healthy subject without the disease being treated, but may also be a subject with a disease other than CAEBV.
  • the average value, percentile value, maximum value or minimum value of the group of normal subjects can be used.
  • the percentile value can be selected to be any value, for example, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90 or 95.
  • the number of targets for calculating the reference value is preferably a plurality of examples, and can be, for example, 2 or more, 5 or more, 10 or more, 20 or more, or 50 or more.
  • the reference value is a numerical value that distinguishes the presence or absence of the onset of CAEBV when implementing the detection method of the present invention, and in this sense, it can be referred to as a cutoff value or a boundary value.
  • the "reference value” refers to the amount of Flt3-L in a biological sample of a subject who has developed CAEBV (onset subject), with a subject who has not developed CAEBV (normal subject) as a comparison subject. Alternatively, it can also be calculated from the concentration.
  • the cutoff value is set by measuring the amount or concentration of Flt3-L in biological samples for the normal subject group and the disease subject group, and performing statistical analysis such as ROC analysis using the obtained measurement values. can do.
  • ROC Receiveiver Operating Characteristic curve
  • the concentration of Flt3-L in the target biological sample is, for example, 20 pg/mL or more, 30 pg/mL or more, 40 pg/mL or more, 50 pg/mL or more, 60 pg/mL or more, 70 pg/mL
  • step (B) of the detection method of the present invention for example, the amount or concentration of Flt3-L in the biological sample of the test subject is higher than the average value of the amount or concentration of the protein in the normal subject group, or Approximately 1.05 times or more, approximately 1.1 times or more, approximately 1.2 times or more, approximately 1.3 times or more, approximately 1.4 times or more, approximately 1.5 times or more, approximately 1 compared to the average value .6 times or more, about 1.7 times or more, about 1.8 times or more, about 1.9 times or more, about 2.0 times or more, about 2.5 times or more, or about 3 times or more, It can be determined that the subject has developed CAEBV (or is likely to have developed CAEBV).
  • detection of CAEBV can be performed by combining the measurement of Flt3-L in a biological sample with the measurement of other clinical information.
  • the clinical information to be combined includes at least the amount or concentration of factors indicative of inflammation in the biological sample and the amount or concentration of EBV-DNA in the biological sample.
  • Factors that are indicators of inflammation include, for example, IFN- ⁇ (interferon-gamma), TNF- ⁇ (tumor necrosis factor-alpha), IL-6 (interleukin-6), blood fibrinogen, blood ferritin, and soluble interferon.
  • Leukin-2 receptor sIL-2R
  • hemoglobin hemoglobin
  • lactate dehydrogenase LD
  • C-reactive protein C-reactive protein
  • ALT alanine aminotransferase
  • leukocytes and platelets preferably IFN- ⁇ , TNF- ⁇ , sIL-2R and LD in a biological sample, more preferably IFN- ⁇ and TNF- ⁇ in a biological sample.
  • the amount of EB virus genome, EB virus-related antibody titer, histopathological and molecular biological evaluation of diseased tissue, etc. can also be used as clinical information. In the present invention, the above clinical information can also be used in combination as appropriate.
  • detection accuracy can be further improved by using Flt3-L in combination with such clinical information.
  • improving detection accuracy means that when ROC analysis is used, the area under the ROC curve (AUC) improves.
  • the detection method of the present invention it is possible to detect whether or not a subject has developed CAEBV. Therefore, the detection method of the present invention can be used as an auxiliary for diagnosing whether or not a subject has developed CAEBV. In combination with this, it can ultimately be performed by a doctor. That is, the detection method of the present invention can be rephrased as a method for assisting diagnosis.
  • the detection method of the present invention it is possible to quantitatively determine whether or not a subject has developed CAEBV (presence or absence of the possibility of developing CAEBV) based on the amount or concentration of Flt3-L in a biological sample collected from the subject. can be detected or evaluated. Therefore, the detection method of the present invention can be rephrased as a biological sample analysis method (preferably a blood sample analysis method) for detecting or evaluating CAEBV.
  • the detection method of the present invention is advantageous in that the presence or absence of the onset of CAEBV can be detected or evaluated simply and accurately.
  • a method for diagnosing CAEBV is also provided.
  • CAEBV can be diagnosed using the amount or concentration of Flt3-L in a biological sample as an index. Since the detection method of the present invention measures the amount or concentration of Flt3-L in a biological sample collected from a subject, it can be called an in vitro diagnostic method for CAEBV.
  • the step (A') of measuring the amount or concentration of Flt3-L in the target biological sample is carried out.
  • the diagnostic method of the present invention may further include the step of (B') determining or evaluating the presence or absence of the onset of CAEBV using the amount or concentration of Flt3-L measured in step (A') as an index.
  • the steps (A') and (B') correspond to the steps (A) and (B), respectively, and can be carried out according to the description of the detection method of the present invention.
  • a method for determining disease activity of CAEBV is provided.
  • the disease activity of CAEBV can be determined using Flt3-L in a subject's biological sample as an index. That is, the method for determining disease activity of the present invention is characterized by correlating the amount or concentration of Flt3-L in a biological sample of a subject with the disease activity of CAEBV in the subject.
  • disease activity means the degree of vigor of the CAEBV disease in the subject (for example, the degree of inflammatory state in the subject), and is defined as a case where one or more of the following items apply: be done.
  • ⁇ Fever / ALT more than double the upper limit of the facility standard value ⁇ Progressing skin lesions, vasculitis, uveitis
  • disease activity refers to the degree of CAEBV disease intensity that is roughly divided into “high (present)” and “low (absent)” or “high”. It can be determined by stage such as ⁇ normal,'' ⁇ low,'' and ⁇ none (remission).''
  • the step of (C) measuring the amount or concentration of Flt3-L in the target biological sample is carried out.
  • the amount or concentration of Flt3-L can be measured in the same manner as in the detection method of the present invention.
  • the method for determining disease activity of the present invention measures the amount or concentration of Flt3-L in a biological sample collected from a subject, and therefore can be referred to as an in vitro method for determining disease activity of CAEBV.
  • the method for determining disease activity of the present invention further includes the step of (D) evaluating the disease activity of CAEBV in which the subject has developed, using the amount or concentration of Flt3-L in the subject's biological sample as an index. be able to.
  • Step (D) includes (D-1) a step of comparing the amount or concentration of Flt3-L in the biological sample with a predetermined reference value, and (D-2) a step of comparing the amount or concentration of Flt3-L in the biological sample with a predetermined reference value;
  • the method can be carried out by determining the disease activity of CAEBV developed in the subject according to the degree of difference between the amount or concentration of Flt3-L and a reference value.
  • the amount or concentration of Flt3-L in the biological sample of the subject from which the biological sample was collected is determined in the biological sample previously measured for the subject.
  • the amount or concentration of Flt3-L is compared with the average value of the amount or concentration of Flt3-L in biological samples of subjects who have not developed the disease etc.
  • measurement of the amount or concentration of Flt3-L in a biological sample of the same subject before implementing the method for determining disease activity of the present invention may be performed, for example, at the time of diagnosing the disease, etc. in the present invention for the subject. It can be performed at times such as when the diagnosis is suspected), before the start of treatment, during the treatment period, and during follow-up observation.
  • the "reference value" is obtained by stratifying subjects who have previously measured the amount or concentration of Flt3-L in a biological sample according to the disease activity of the disease in the present invention, It can be determined based on the average value of the amount or concentration of Flt3-L in each group of "high”, “same (normal)", “low”, and “none (remission)". Further, the reference value can also be determined by setting a cutoff value by performing statistical analysis such as ROC analysis, similarly to the detection method of the present invention.
  • the "subject" of the method for determining disease activity of the present invention can be a subject who has developed CAEBV or is suspected of having developed CAEBV, preferably a subject who has developed these diseases or pathological conditions according to a doctor. It is possible to apply to patients who have been diagnosed with.
  • the method for determining disease activity of the present invention can be used as an auxiliary for diagnosing the disease activity of CAEBV that a subject has developed. Ultimately, it can be done by a doctor. That is, the method for determining disease activity of the present invention can be rephrased as a method for assisting in determining disease activity.
  • the method for determining disease activity of the present invention it is possible to determine the disease activity of CAEBV that a subject has developed. Therefore, the method for determining disease activity of the present invention can be used as an auxiliary judgment when selecting a treatment method or formulating a treatment plan for the subject according to the disease activity, and these judgments can be made depending on the case. In some cases, in combination with other findings, a doctor may ultimately be able to perform this.
  • the method for determining disease activity of the present invention is also advantageous in that it can prevent unnecessary medication, which in turn can contribute to reducing medical costs and reducing the burden on patients.
  • the disease activity of CAEBV that a subject has developed is determined by measuring Flt3-L in a biological sample and other clinical information, as in the detection method of the present invention.
  • the measurements can be performed in combination.
  • a method for predicting the prognosis of CAEBV is provided.
  • the prognosis of CAEBV can be predicted using Flt3-L in a subject's biological sample as an index. That is, the prediction method of the present invention is characterized by associating the amount or concentration of Flt3-L in a biological sample of a subject with the prognosis of a subject developing CAEBV.
  • prognosis means the life prognosis of a subject who has developed CAEBV, and is used to mean whether the subject will survive within 5 years (or within 3 years). .
  • prognosis can determine whether a subject who has developed CAEBV will survive within 5 years (or within 3 years).
  • the step of measuring the amount or concentration of Flt3-L in the target biological sample is implemented.
  • the amount or concentration of Flt3-L can be measured in the same manner as in the detection method of the present invention.
  • the prediction method of the present invention measures the amount or concentration of Flt3-L in a biological sample collected from a subject, and therefore can be called an in vitro prediction method for the prognosis of CAEBV.
  • the prediction method of the present invention can further include the step of (F) determining the prognosis of CAEBV developed in the subject using the amount or concentration of Flt3-L in the subject's biological sample as an index.
  • Step (F) includes (F-1) a step of comparing the amount or concentration of Flt3-L in the biological sample with a predetermined reference value, and (F-2) a step of comparing the amount or concentration of Flt3-L in the biological sample with a predetermined reference value; This can be carried out by determining the prognosis of the subject who has developed CAEBV according to the degree of difference between the amount or concentration of Flt3-L and a reference value.
  • the amount or concentration of Flt3-L in a biological sample of a subject from which a biological sample has been collected is determined from the amount or concentration of Flt3-L in a biological sample previously measured for that subject.
  • the prognosis of the subject is determined as ⁇ survival within 5 years (or within 3 years) (possible survival)'' or ⁇ 5. It can be a step to determine that Flt3-L has not survived (or may not have survived) within 20 years (or within 3 years), or Flt3-L in the biological sample of the subject from whom the biological sample was collected.
  • the amount or concentration of Flt3-L is compared with the average value of the amount or concentration of Flt3-L in the biological sample of a subject (normal subject) who has not developed a disease etc. according to the present invention, and the amount or concentration of Flt3-L is determined according to the degree of the difference.
  • the prognosis as ⁇ surviving within 5 years (or within 3 years) (possible survival)'' or ⁇ not surviving within 5 years (or within 3 years)''.
  • the process of determining that there is a possibility that the Here, the measurement of the amount or concentration of Flt3-L in a biological sample of the same subject before implementing the prediction method of the present invention may be performed, for example, at the time of diagnosing the disease, etc. (suspected diagnosis) of the subject in the present invention. It can be performed at other times (including at certain times), before the start of treatment, during treatment, or during follow-up.
  • the "reference value” is defined as “within 5 years (or within 3 years)” by stratifying subjects who have previously measured the amount or concentration of Flt3-L in biological samples according to the prognosis of CAEBV. It can be determined based on the average value of the amount or concentration of Flt3-L in each group: “group alive within 5 years (or within 3 years)” or “group who died within 5 years (or within 3 years)”. Further, the reference value can also be determined by setting a cutoff value by performing statistical analysis such as ROC analysis, similarly to the detection method of the present invention.
  • the "subject" of the prediction method of the present invention can be a subject who has developed or is suspected of having developed CAEBV, preferably a subject who has been diagnosed by a doctor as having developed CAEBV. can do.
  • the prediction method of the present invention can be used as an auxiliary for diagnosing the prognosis of a subject who has developed CAEBV, and the prognosis diagnosis can be ultimately performed by a doctor, depending on the case, in combination with other findings. I can do it. That is, the prediction method of the present invention can be rephrased as a method for assisting in predicting prognosis.
  • the prognosis of a subject suffering from CAEBV can be determined. Therefore, the prediction method of the present invention can be used as an auxiliary judgment when selecting a treatment method or formulating a treatment plan for the subject according to the prognosis, and these judgments may be made in conjunction with other findings as the case may be. In combination, it can ultimately be done by a doctor.
  • the prediction method of the present invention is also advantageous in that appropriate treatment can be given to the patient.
  • the prognosis of a subject developing CAEBV is determined by measuring Flt3-L in a biological sample in combination with measurement of other clinical information, similar to the detection method of the present invention. can do.
  • a method for determining the therapeutic effect on CAEBV developed in a subject is provided.
  • the therapeutic efficacy of CAEBV can be determined using Flt3-L in a target biological sample as an index. That is, the method for determining disease activity of the present invention is characterized by correlating the amount or concentration of Flt3-L in a biological sample of a subject with the therapeutic effect of CAEBV on the subject.
  • the step (G) of measuring the amount or concentration of Flt3-L in the target biological sample is carried out.
  • the amount or concentration of Flt3-L can be measured in the same manner as in the detection method of the present invention.
  • the method for determining therapeutic efficacy of the present invention measures the amount or concentration of Flt3-L in a biological sample collected from a subject, and therefore can be referred to as an in vitro method for determining therapeutic efficacy for CAEBV.
  • the subject can be a subject after or during treatment.
  • Treatments for CAEBV whose therapeutic effects can be determined by the method for determining therapeutic effects of the present invention include drug therapy (examples of therapeutic agents for CAEBV include corticosteroids, cyclosporine, etoposide, ruxolitinib, medicines such as bortezomib, alentuzumab, and emapalumab) and allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.
  • the degree of therapeutic effect on CAEBV developed in the treated subject is evaluated based on the amount or concentration of Flt3-L measured in step (H) (G).
  • the method may further include the step of evaluating.
  • Step (H) includes (H-1) a step of comparing the amount or concentration of Flt3-L in the biological sample with a predetermined reference value, and (H-2) a step of comparing the amount or concentration of Flt3-L in the biological sample with a predetermined reference value, and (H-2) comparing the amount or concentration of Flt3-L in the biological sample from the subject.
  • the therapeutic effect can be determined by determining that there is a therapeutic effect if the amount or concentration of Flt3-L is less than or lower than a reference value. Note that "having a therapeutic effect” includes improvement or alleviation of the pathological condition or symptoms of CAEBV.
  • step (H-2) of the method for determining therapeutic efficacy of the present invention for example, the amount or concentration of Flt3-L in the biological sample of the subject from whom the biological sample was collected is a subject who has not developed CAEBV (normal subject). 1.3 times or less, about 1.2 times or less, about 1.1 times or less, or about 1.05 times or less compared to the average value of the amount or concentration of Flt3-L in the biological sample.
  • it can be a step of determining that there is a therapeutic effect (for example, there is a possibility that the CAEBV that the subject has developed has been completely cured) when it is below the average value.
  • the reference value used in the method for determining therapeutic effect of the present invention can be set in the same manner as in the detection method of the present invention, but in addition to this, in the method for determining therapeutic effect of the present invention, Measurements of the amount or concentration of Flt3-L in a sample can be used as a reference value.
  • the method for determining the therapeutic effect of the present invention can be carried out for several hours before or after the start of the treatment for CAEBV that the subject has developed (preferably immediately after the start, for example, within 1 to 2 hours). or within one day), the method may further include measuring the amount or concentration of Flt3-L in the biological sample of the test subject.
  • step (H-2) if the amount or concentration of Flt3-L in the biological sample of the subject from which the biological sample was collected is below the measured value before treatment, or lower than the measured value before treatment, , it can be determined that there is a therapeutic effect (it tends to improve or alleviate the pathological condition or symptoms of CAEBV that the subject has developed).
  • the "subject" to be treated in the method for determining therapeutic efficacy of the present invention can preferably be a subject who has developed or is suspected of having developed CAEBV, and more preferably has been diagnosed by a doctor with these diseases or pathological conditions. Subjects may be diagnosed as having developed.
  • the method for determining therapeutic efficacy of the present invention can be used as an auxiliary method for determining the effectiveness of treatment for CAEBV that a subject has developed. In combination, it can ultimately be done by a doctor. That is, the method for determining therapeutic effect of the present invention can be rephrased as a method for assisting in determining therapeutic effect.
  • the therapeutic effect can be determined in a subject who has undergone treatment for CAEBV in which the subject has developed.
  • the effectiveness of treatment can be verified. If no therapeutic effect is observed, the treatment can be discontinued and another treatment plan can be established. Therefore, the method for determining therapeutic efficacy of the present invention can be used supplementarily to determine the effectiveness of treatment for CAEBV that a subject has developed, and in some cases, determining whether or not the treatment is effective In combination with the findings, the doctor can finally do it.
  • the method for determining therapeutic efficacy of the present invention is also advantageous in that it can prevent unnecessary medication, and in turn contribute to reducing medical costs and reducing the burden on patients.
  • the therapeutic efficacy of CAEBV developed in a subject is determined by measuring Flt3-L in a biological sample and other clinical information, as in the detection method of the present invention. can be implemented in combination.
  • a pharmaceutical composition for the treatment of chronic active Epstein-Barr virus infection (CAEBV).
  • CAEBV chronic active Epstein-Barr virus infection
  • the pharmaceutical composition of the present invention is characterized by containing a Flt3 inhibitor.
  • the Flt3 inhibitor may be any agent that acts on Flt3 and inhibits its function, such as gilteritinib, quizartinib, sunitinib, cabozantinib, midostaurin, sorafenib, ilolasertib, FF-10101 and ENMD. -2076, etc., with gilteritinib and quizartinib being preferred.
  • the dosage, administration interval, and number of administrations of the pharmaceutical composition of the present invention can be arbitrarily set according to the constitution, physical condition, symptoms, etc. of the subject, and administration methods include oral administration and intravenous drip administration. etc.
  • the active ingredient Flt3 inhibitor is administered at a dose of 0.1 mg to 1000 mg once to twice a day for 1 to 7 days (preferably once or twice a day).
  • the active ingredient Flt3 inhibitor is administered at a dose of 0.1 mg to 1000 mg, for example, once every 1 to 180 days (preferably once a week). ⁇ once every 4 weeks).
  • the dosage, administration interval, and number of administrations of the pharmaceutical composition of the present invention can be arbitrarily set according to the constitution, physical condition, symptoms, etc. of the subject, and administration methods include oral administration and intravenous drip administration. etc.
  • administration methods include oral administration and intravenous drip administration. etc.
  • gilteritinib is used as a Flt inhibitor
  • a single dose of 1 mg to 200 mg can be orally administered once a day.
  • quizartinib a single dose of 1 mg to 100 mg (preferably 17.7 mg to 53 mg) can be orally administered once a day.
  • Epstein-Barr virus (EBV)-infected cells can be targeted for treatment, and from the viewpoint of enhancing the therapeutic effect of CAEBV, preferably, the EBV-infected cells are T cells and NK cells. I can do it.
  • EBV Epstein-Barr virus
  • Treatment for CAEBV can be performed on a subject in which CAEBV is detected by the detection method of the present invention or a subject diagnosed with CAEBV by the diagnostic method of the present invention.
  • another aspect of the present invention also includes the steps of: (A) measuring the amount or concentration of Flt3-L in a biological sample of interest; The method includes a step of determining the presence or absence of the onset of CAEBV using the amount or concentration as an index, and (N) a step of administering treatment against CAEBV to the subject determined to have developed CAEBV in step (B).
  • a method of treating CAEBV is provided.
  • the CAEBV detection step and determination step ie, steps (A) and (B)
  • steps (A) and (B) can be performed according to the description of the detection method of the present invention and the diagnosis method of the present invention.
  • treatment against CAEBV can be carried out according to the method for determining therapeutic efficacy of the present invention and the pharmaceutical composition of the present invention.
  • a marker comprising Flt3-L for use in diagnosis or detection of CAEBV, a marker for use in determining disease activity of CAEBV, and a marker for use in predicting prognosis of CAEBV. or a marker for use in determining the therapeutic effect of CAEBV.
  • the present invention also provides use of Flt3-L as a diagnostic or detection marker for CAEBV, use of Flt3-L as a marker for determining disease activity of CAEBV, use of Flt3-L as a prognostic marker for CAEBV, or Use of Flt3-L as a marker for determining therapeutic efficacy of CAEBV is provided.
  • a diagnostic marker or a detection marker a marker for determining disease activity, a marker for predicting prognosis, or a marker for determining therapeutic effect is defined by the presence and amount of the diagnostic marker or detection marker, marker for determining disease activity, prognosis prediction marker, or marker for determining therapeutic effect.
  • a marker for determining disease activity a marker for predicting prognosis
  • a marker for determining therapeutic effect is defined by the presence and amount of the diagnostic marker or detection marker, marker for determining disease activity, prognosis prediction marker, or marker for determining therapeutic effect.
  • are substances that serve as indicators for predicting the prognosis of CAEBV or determining therapeutic efficacy for CAEBV are substances that serve as indicators for predicting the prognosis of CAEBV or determining therapeutic efficacy for CAEBV, and can be used as markers for diagnosis and detection of CAEBV, determining disease activity, predicting prognosis, determining therapeutic efficacy, etc. It is.
  • Flt3-L can be used as a marker for diagnosing or detecting CAEBV, a marker for predicting the prognosis of CAEBV, and a marker for determining the therapeutic effect of CAEBV.
  • FLT3-L may be FLT3-L in a biological sample of a subject or FLT3-L derived from a biological sample of a subject.
  • the marker of the present invention can be carried out according to the description of the detection method, method of determining disease activity, method of predicting prognosis, and method of determining therapeutic effect of the present invention.
  • the diagnosis or detection of CAEBV, the determination of disease activity of CAEBV, the prognosis prediction of CAEBV, or the method of quantifying the amount or concentration of Flt3-L in a biological sample comprises a means for quantifying the amount or concentration of Flt3-L in a biological sample.
  • a kit is provided for use in determining the therapeutic effect of.
  • the kit of the present invention typically includes diagnosis or detection of CAEBV, disease activity of CAEBV, which is performed according to the detection method, method of determining disease activity, method of predicting prognosis, and method of determining therapeutic effect, respectively, of the present invention. This is a kit for determining the prognosis of CAEBV, or determining the therapeutic effect of CAEBV. Quantification of the amount or concentration of Flt3-L can be carried out according to the measurement method described in the detection method of the present invention.
  • kit of the present invention can be implemented in accordance with the descriptions of the detection method, method of determining disease activity, method of predicting prognosis, and method of determining therapeutic efficacy of the present invention.
  • Example 1 Examination of CAEBV biomarkers (1)
  • blood samples collected from healthy subjects (control group) and patients suffering from CAEBV (CAEBV group) were used to examine biomarkers that serve as indicators of CAEBV.
  • IFN- ⁇ concentration in the plasma of the blood sample was measured using MILLIPLEX (registered trademark) MAP Kit (EMD Millipore Corporation).
  • CAEBV activity +
  • CAEBV activity -
  • Further classification Regarding the presence or absence of disease activity, patients who observed any of the inflammatory symptoms shown in Table 1 were classified as having "disease activity.”
  • Example 2 Investigation of therapeutic targets for CAEBV (1) In Example 2, molecules serving as therapeutic indicators for CAEBV were investigated using peripheral blood mononuclear cells collected from CAEBV patients.
  • Peripheral blood mononuclear cells of CAEBV patients Peripheral blood containing EBV-infected cells was determined by density gradient centrifugation using Lymphoprep (trademark) (Abbott Diagnostics Technologies AS) from the whole blood of CAEBV patients before treatment. Mononuclear cells (PBMC: peripheral blood mononuclear cells) were separated.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • CAEBV patients are classified according to the cell type infected with EBV, and the PBMCs from each patient isolated above are T cell-infected type CD4-infected type, CD8-infected type, and NK cell-infected type. It was the CD56 infection type.
  • Gilteritinib treatment The isolated peripheral blood mononuclear cells were treated with Gilteritinib (product code S7754, Selleck), an Flt3 inhibitor, for 24 hours and 48 hours at 37°C.
  • the concentrations of gilteritinib were 0 ⁇ M (control), 1 ⁇ M, and 2 ⁇ M.
  • qRT-PCR was performed using TaqMan (registered trademark) Gene Expression Assays (TNF- ⁇ (assay ID: Hs01113624_g1), IFN- ⁇ (assay ID: Hs00989291_m1), IL-6 (assay ID: Hs00985639_m1), GAPDH (Assay ID: Hs99999905_m1 )) (Thermo Fisher Scientific) on a Light Cycler 480® (Roche Diagnostics).
  • TNF- ⁇ assay ID: Hs01113624_g1
  • IFN- ⁇ assay ID: Hs00989291_m1
  • IL-6 assay ID: Hs00985639_m1
  • GAPDH Assay ID: Hs99999905_m1
  • Example 3 Examination of CAEBV biomarkers (2)
  • a CAEBV model mouse was used to examine biomarkers that serve as indicators of CAEBV.
  • CAEBV model mouse The CAEBV mouse model was created by injecting peripheral blood mononuclear cells of CAEBV patients into NOD/Shi-scid, IL-2R ⁇ null (NOG) mice (Imadome et.al., PLoS Pathog. 2011;7(10):e1002326).
  • the proteasome inhibitor bortezomib (Millennium Pharmaceuticals) (1.67 mg/kg dissolved in 300 ⁇ L of PBS) was intraperitoneally administered twice a week to the CAEBV mouse model (bortezomib group), and the Blood (plasma) was collected from the group to which PBS was intraperitoneally administered twice a week (control group) before administration, on the 1st week of administration, on the 2nd week of administration, and on the 3rd week of administration.
  • Example 4 Examination of CAEBV biomarkers (3)
  • blood samples collected from healthy subjects (control group) and patients suffering from CAEBV (CAEBV group) were used to further examine biomarkers that serve as indicators of CAEBV.
  • Example 5 Examination of therapeutic targets for CAEBV (2) In Example 5, the effect of using a Flt3 inhibitor at a lower concentration than in Example 2 on improving the pathology of CAEBV was investigated.
  • Gilteritinib treatment was performed in the same manner as described in Example 2 (1) B, except that the concentrations of Gilteritinib were 0 ⁇ M (control), 0.1 ⁇ M, 0.2 ⁇ M, 0.5 ⁇ M, and 1 ⁇ M.
  • Cytokine RNA expression levels were measured in the same manner as described in Example 2 (1) d.
  • Example 6 Investigation of therapeutic targets for CAEBV (3) In Example 6, the effect of using a Flt3 inhibitor different from the Flt3 inhibitors used in Examples 2 and 5 on improving the pathology of CAEBV was investigated.
  • Iquizartinib treatment The separated peripheral blood mononuclear cells were treated with Quizartinib (trade name: Vanfrita, Daiichi Sankyo Co., Ltd.), an Flt3 inhibitor, at 37°C for 24 and 48 hours.
  • the concentration of quizartinib was 0 ⁇ M (control), 0.25 ⁇ M, and 0.5 ⁇ M.
  • Cytokine RNA expression levels were measured in the same manner as described in Example 2 (1) d.
  • Example 7 Investigation of therapeutic targets for CAEBV (4) In Example 7, the correlation between the therapeutic effect on CAEBV patients and the concentration of Flt3-L was investigated.

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Abstract

本発明は、新規な慢性活動性ＥＢＶ感染症（ＣＡＥＢＶ）の検出方法ならびに新規なＣＡＥＢＶの治療用医薬組成物の提供を目的とする。本発明によれば、対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を測定する工程を含んでなる、ＣＡＥＢＶの検出方法が提供される。本発明によれば、Ｆｌｔ３阻害剤を含んでなる、ＣＡＥＢＶの治療用医薬組成物が提供される。本発明によれば、ＣＡＥＢＶの検出を簡便かつ的確に実施できる点で有利である。本発明によればまた、Ｆｌｔ３を標的とする、ＣＡＥＢＶの新たな治療剤が提供される点でも有利である。

Description

慢性活動性Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス感染症（ＣＡＥＢＶ）の検出方法 関連出願の参照
　本願は、先行する日本国出願である特願２０２２－４８１３９（出願日：２０２２年３月２４日）の優先権の利益を享受するものであり、その開示内容全体は引用することにより本明細書の一部とされる。
　本発明は、慢性活動性Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス感染症（ＣＡＥＢＶ）の検出方法に関する。本発明はまた、ＣＡＥＢＶの疾患活動性の判定方法およびＣＡＥＢＶの予後の予測方法ならびにＣＡＥＢＶの治療効果の判定方法に関する。本発明はさらに、ＣＡＥＢＶの治療用医薬組成物に関する。
　Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルスとは、全世界のほぼすべてのヒトが感染している身近なウイルスである。多くのヒトにおいてＥＢＶは幼少時に不顕性感染し、一生体内から排除されることなく主にＢ細胞や上皮細胞に潜伏感染し続ける。ＥＢＶは一部のヒトでは初感染時に伝染性単核症を発症し、重篤化することがある。さらに、潜伏感染中のＥＢＶは宿主の免疫状態により、ＥＢＶ感染リンパ系腫瘍（Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫、ＥＢＶ感染Ｂ細胞リンパ腫、ＥＢＶ感染Ｔ細胞リンパ腫、ＥＢＶ感染Ｈｏｄｇｋｉｎリンパ腫、慢性活動性ＥＢＶ感染症（ＣＡＥＢＶ）等）や上皮性腫瘍（上咽頭癌、ＥＢＶ感染胃癌等）の発症に関わっているが、これらの疾患はいずれも難治性である。
　ＥＢＶ感染リンパ系腫瘍の１つであるＣＡＥＢＶは、小児から８０歳台までの幅広い年齢層に患者が存在し、本邦での年間発症数は２３．８人（推定患者数は全国に１００人）の希少疾患である。ＣＡＥＢＶの発症機序は解明されておらず、唯一の根治療法は造血幹細胞移植であり、病態の解明と治療薬の開発は喫緊の課題といえる。また、ＣＡＥＢＶはＥＢＶに感染したＴ細胞またはＮＫ細胞が活性化し全身の持続性の炎症が生じると同時に、それらの感染細胞が腫瘍性に増殖していくことが知られている。このように炎症症状が多岐にわたることや、腫瘍でありながらも「かたまり、腫瘤」を作ることが少ないことから、病変組織の病学的検査は困難であり診断が難しく、また病態を客観的に評価するバイオマーカーも未確立という状況にあった（非特許文献１および２）。
Kimura H, et al., Front Immunol. 2017; 8: 1867. Arai A. et al., Front Pediatr. 2019; 7: 14.
　本発明は、ＣＡＥＢＶの新規な検出方法を提供することを目的とする。本発明はまた、ＣＡＥＢＶの新規な疾患活動性の判定方法およびＣＡＥＢＶの新規な予後の予測方法ならびにＣＡＥＢＶの新規な治療効果の判定方法を提供することを目的とする。本発明はさらに、ＣＡＥＢＶの新規な治療用医薬組成物を提供することを目的とする。
　本発明者らは今般、ＣＡＥＢＶを発症している対象の血液中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度が、ＣＡＥＢＶを発症していない対象の血液中の量または濃度とは異なることを見出した。本発明者らはまた、血液中の量または濃度がＣＡＥＢＶの病勢または疾患活動性の程度と相関することを見出した。本発明者らはさらに、Ｆｌｔ３を阻害することによりＣＡＥＢＶ患者のＥＢＶ感染細胞の増殖を抑制することおよび該ＥＢＶ感染細胞が産生するサイトカインの産生を抑制することを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
　本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を測定する工程を含んでなる、慢性活動性Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス感染症（ＣＡＥＢＶ）の検出方法または診断方法。
［２］対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を指標にして、ＣＡＥＢＶの発症の有無を判定する工程をさらに含む、上記［１］に記載の検出方法または診断方法。
［３］対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を参照値と比較する工程をさらに含む、上記［１］または［２］に記載の検出方法または診断方法。
［４］参照値が、ＣＡＥＢＶを罹患していない対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度に基づいて設定された値である、上記［３］に記載の検出方法または診断方法。
［５］対象の臨床情報をさらに指標にしてＣＡＥＢＶの罹患の有無を判定する、上記［１］～［４］のいずれかに記載の検出方法または診断方法。
［６］臨床情報が、生体試料中の炎症の指標となる因子の量または濃度である、上記［５］に記載の検出方法または診断方法。
［７］生体試料が血液試料である、上記［１］～［６］のいずれかに記載の検出方法または診断方法。
［８］ＣＡＥＢＶを検出または評価するための生体試料分析方法である、上記［１］～［７］のいずれかに記載の検出方法または診断方法。
［９］対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を測定する工程を含んでなる、慢性活動性Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス感染症（ＣＡＥＢＶ）の疾患活動性の判定方法またはＣＡＥＢＶの予後の予測方法。
［１０］対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を指標にして、ＣＡＥＢＶの疾患活動性またはＣＡＥＢＶの予後を評価する工程をさらに含む、上記［９］に記載の疾患活動性の判定方法または予後の予測方法。
［１１］対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を測定する工程を含んでなる、慢性活動性Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス感染症（ＣＡＥＢＶ）に対する治療効果の判定方法。
［１２］対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を指標にして、ＣＡＥＢＶに対する治療効果の程度を評価する工程をさらに含む、上記［１１］に記載の治療効果の判定方法。
［１３］対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度と参照値とを比較する工程をさらに含む、上記［１１］または［１２］に記載の治療効果の判定方法。
［１４］参照値が、治療前の対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度に基づいて設定された値である、上記［１３］に記載の治療効果の判定方法。
［１５］Ｆｌｔ３阻害剤を含んでなる、慢性活動性Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス感染症（ＣＡＥＢＶ）の医薬組成物。
［１６］Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）感染細胞を治療標的とする、上記［１５］に記載の医薬組成物。
［１７］ＥＢＶ感染細胞がＴ細胞またはＮＫ細胞である、上記［１６］に記載の医薬組成物。
［１８］ＣＡＥＢＶの診断もしくは検出マーカー、ＣＡＥＢＶの疾患活動性判定マーカー、ＣＡＥＢＶの予後予測マーカーまたはＣＡＥＢＶの治療効果判定マーカーとしての、Ｆｌｔ３－Ｌの使用。
［１９］生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度の定量手段を含んでなる、ＣＡＥＢＶの診断キット、ＣＡＥＢＶの疾患活動性判定キット、ＣＡＥＢＶの予後予測キットまたはＣＡＥＢＶの治療効果判定キット。
［２０］対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を測定する工程と、前記対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を指標にして、ＣＡＥＢＶの発症の有無を判定する工程と、ＣＡＥＢＶを発症していると判定された前記対象に、ＣＡＥＢＶに対する治療を実施する工程とを含んでなる、ＣＡＥＢＶの治療方法。
　本発明によれば、対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を測定することでＣＡＥＢＶの発症の有無を簡便に検出または評価できるとともに、ＣＡＥＢＶの病勢または疾患活動性の判定およびＣＡＥＢＶの予後の予測ならびにＣＡＥＢＶの治療効果の判定を簡便に実施できる点で有利である。本発明によればまた、Ｆｌｔ３を標的とする、ＣＡＥＢＶの新たな治療剤が提供される点でも有利である。
図１ＡおよびＢは、ＣＡＥＢＶを発症していない対象（対照群）とＣＡＥＢＶを発症している対象（ＣＡＥＢＶ群）の血液検体の血漿中のＦｌｔ３－ＬおよびＩＦＮ－γの濃度をそれぞれ示す。ｐ値はウィルコクソン符号付順位和検定により算出した。 図２ＡおよびＢは、ＣＡＥＢＶの患者のうち、疾患活動性ありの患者（ＣＡＥＢＶ（活動性＋）群）と疾患活動性なしの患者（ＣＡＥＢＶ（活動性－）群）の血液検体の血漿中のＦｌｔ３－ＬおよびＩＦＮ－γの濃度をそれぞれ示す。ｐ値はウィルコクソン符号付順位和検定により算出した。 図３は、ＣＡＥＢＶ患者から採取した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）（ＥＢＶ感染Ｔ細胞またはＥＢＶ感染ＮＫ細胞を含む）をＦｌｔ３阻害剤であるギルテリチニブで処理した時の、ＰＢＭＣ細胞数の経時的な変化をそれぞれ示す。ＰＢＭＣはＣＡＥＢＶ患者のうちＣＤ４陽性Ｔ細胞感染型（本明細書および図中、「ＣＤ４感染型」ということがある。）（１名）、ＣＤ８陽性Ｔ細胞感染型（本明細書および図中、「ＣＤ８感染型」ということがある。）（１名）およびＣＤ５６陽性ＮＫ細胞感染型（本明細書および図中、「ＣＤ５６感染型」ということがある。）（１名）からそれぞれ採取した。図３Ａにおいて、＊はｐ＝０．０１６９、＊＊はｐ＝０．００５８、＊＊＊はｐ＝０．０００１および＊＊＊＊はｐ＝０．００１０をそれぞれ示す。図３Ｂにおいて、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を示す。図３Ｃにおいて、＊＊＊はｐ＝０．０００１および＊＊＊＊はｐ＜０．０００１をそれぞれ示す。 図４は、ＣＡＥＢＶ患者から採取したＥＢＶに感染したＰＢＭＣ（ＥＢＶ感染Ｔ細胞またはＥＢＶ感染ＮＫ細胞を含む）をＦｌｔ３阻害剤であるギルテリチニブで処理した時の、ＰＢＭＣが産生するサイトカインの産生量を示す。ＰＢＭＣはＣＡＥＢＶ患者のうちＣＤ４感染型（１名）、ＣＤ８感染型（１名）およびＣＤ５６感染型（１名）からそれぞれ採取した。 図５は、ＣＡＥＢＶモデルマウスにＰＢＳを週に２回腹腔内投与した群（対照群）とプロテアソーム阻害剤であるボルテゾミブを週に２回腹腔内投与した群（ボルテゾミブ群）の血漿中のＦｌｔ３－Ｌの濃度をそれぞれ示す（各群ともｎ＝３）。 図６Ａは、ＣＡＥＢＶを発症している対象（ＣＡＥＢＶ群）とＣＡＥＢＶを発症していない対象（対照群）の血液検体の血漿中のＦｌｔ３－Ｌの濃度を示す。図６Ｂは、図６Ａの結果に基づいて作成したＲＯＣ曲線を示す。 図７は、ＣＡＥＢＶ患者から採取した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）（ＥＢＶ感染Ｔ細胞またはＥＢＶ感染ＮＫ細胞を含む）をＦｌｔ３阻害剤であるギルテリチニブで処理した時のＰＢＭＣ細胞数の経時的な変化をそれぞれ示す。ＰＢＭＣはＣＡＥＢＶ患者のうちＣＤ４感染型（１名）、ＣＤ８感染型（１名）、ＣＤ５６感染型（１名）およびＣＤ５６陰性ＮＫ細胞感染型（本明細書および図中、「ＣＤ５６（－）ＮＫ細胞感染型」ということがある。）（１名）からそれぞれ採取した。図６Ａ～Ｄにおいて、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１および＊＊＊＊はｐ＜０．０００１をそれぞれ示す。 図８Ａは、ＣＡＥＢＶ患者から採取したＥＢＶに感染したＰＢＭＣ（ＥＢＶ感染Ｔ細胞またはＥＢＶ感染ＮＫ細胞を含む）を各濃度のＦｌｔ３阻害剤であるギルテリチニブで処理した時のＴＮＦ－αの産生量を示す。ＰＢＭＣはＣＡＥＢＶ患者のうちＣＤ４感染型（１名）、ＣＤ８感染型（１名）、ＣＤ５６感染型（１名）およびＣＤ５６（－）ＮＫ細胞感染型（１名）からそれぞれ採取した。 図８Ｂは、ＣＡＥＢＶ患者から採取したＥＢＶに感染したＰＢＭＣ（ＥＢＶ感染Ｔ細胞またはＥＢＶ感染ＮＫ細胞を含む）を各濃度のＦｌｔ３阻害剤であるギルテリチニブで処理した時のＩＦＮ－γの産生量を示す。ＰＢＭＣはＣＡＥＢＶ患者のうちＣＤ４感染型（１名）、ＣＤ８感染型（１名）、ＣＤ５６感染型（１名）およびＣＤ５６（－）ＮＫ細胞感染型（１名）からそれぞれ採取した。 図８Ｃは、ＣＡＥＢＶ患者から採取したＥＢＶに感染したＰＢＭＣ（ＥＢＶ感染Ｔ細胞またはＥＢＶ感染ＮＫ細胞を含む）を各濃度のＦｌｔ３阻害剤であるギルテリチニブで処理した時のＩＬ－６の産生量を示す。ＰＢＭＣはＣＡＥＢＶ患者のうちＣＤ８感染型（１名）およびＣＤ５６感染型（１名）からそれぞれ採取した。 図９Ａは、ＣＡＥＢＶ患者（ＣＤ４感染型）１名から採取した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）（ＥＢＶ感染Ｔ細胞を含む）を各濃度のＦｌｔ３阻害剤であるキザルチニブで処理した時のＰＢＭＣ細胞数の経時的な変化を示す。図８Ａにおいて、＊はｐ＜０．０５を示す。 図９Ｂは、ＣＡＥＢＶ患者（ＣＤ８感染型）２名から採取した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）（ＥＢＶ感染Ｔ細胞）を各濃度のＦｌｔ３阻害剤であるキザルチニブで処理した時のＰＢＭＣ細胞数の経時的な変化を示す。図８Ｂにおいて、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１および＊＊＊＊はｐ＜０．０００１をそれぞれ示す。 図９Ｃは、ＣＡＥＢＶ患者（ＣＤ５６感染型）２名から採取した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）（ＥＢＶ感染ＮＫ細胞を含む）を各濃度のＦｌｔ３阻害剤であるキザルチニブで処理した時のＰＢＭＣ細胞数の経時的な変化を示す。図８Ｃにおいて、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１および＊＊＊＊はｐ＜０．０００１をそれぞれ示す。 図９Ｄは、ＣＡＥＢＶ患者（ＣＤ５６（－）ＮＫ細胞感染型）から採取した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）（ＥＢＶ感染ＮＫ細胞を含む）を各濃度のＦｌｔ３阻害剤であるキザルチニブで処理した時のＰＢＭＣ細胞数の経時的な変化を示す。図８Ｄにおいて、＊＊はｐ＜０．０１および＊＊＊はｐ＜０．００１をそれぞれ示す。 図１０Ａは、ＣＡＥＢＶ患者から採取したＥＢＶに感染したＰＢＭＣ（ＥＢＶ感染Ｔ細胞またはＥＢＶ感染ＮＫ細胞を含む）をＦｌｔ３阻害剤であるキザルチニブで処理した時のＴＮＦ－αの産生量を示す。ＰＢＭＣはＣＡＥＢＶ患者のうちＣＤ４感染型（１名）、ＣＤ８感染型（１名）、ＣＤ５６感染型（２名）およびＣＤ５６（－）ＮＫ細胞感染型（１名）からそれぞれ採取した。 図１０Ｂは、ＣＡＥＢＶ患者から採取したＥＢＶに感染したＰＢＭＣ（ＥＢＶ感染Ｔ細胞またはＥＢＶ感染ＮＫ細胞を含む）をＦｌｔ３阻害剤であるキザルチニブで処理した時のＩＦＮ－γの産生量を示す。ＰＢＭＣはＣＡＥＢＶ患者のうちＣＤ４感染型（１名）、ＣＤ８感染型（１名）、ＣＤ５６感染型（２名）およびＣＤ５６（－）ＮＫ細胞感染型（１名）からそれぞれ採取した。 図１０Ｃは、ＣＡＥＢＶ患者から採取したＥＢＶに感染したＰＢＭＣ（ＥＢＶ感染Ｔ細胞またはＥＢＶ感染ＮＫ細胞を含む）をＦｌｔ３阻害剤であるキザルチニブで処理した時のＩＬ－６の産生量を示す。ＰＢＭＣはＣＡＥＢＶ患者のうちＣＤ４感染型（１名）、ＣＤ８感染型（１名）、ＣＤ５６感染型（２名）およびＣＤ５６（－）ＮＫ細胞感染型（１名）からそれぞれ採取した。 図１１は、ＣＡＥＢＶ患者４名の治療前と治療後における血液検体の血漿中のＦｌｔ３－Ｌの濃度をそれぞれ示す。
発明の具体的説明
＜＜定義＞＞
　「慢性活動性ＥＢＶ感染症（ＣＡＥＢＶ：chronic active Epstein-Barr virus infection）」は、Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ：Epstein-Barr virus）の感染によるＥＢＶ感染Ｔ細胞およびＥＢＶ感染ＮＫ細胞のリンパ系腫瘍の１つであり、ＥＢＶに感染したＴ細胞やＮＫ細胞の活性化による全身の炎症と、感染細胞の腫瘍性増殖と浸潤による多臓器障害を来す「炎症」と「腫瘍」の側面を有し、以下の１）～４）の４項目を満たすことによりＣＡＥＢＶと診断される（慢性活動性ＥＢウイルス感染症（ＣＡＥＢＶ）診断基準（厚生労働省研究班、２０１５年））。
１）伝染性単核症様症状が３か月以上持続（連続的または断続的）
２）末梢血または病変組織におけるＥＢウイルスゲノム量の増加
３）Ｔ細胞あるいはＮＫ細胞にＥＢウイルス感染を認める
４）既知の疾患とは異なること
　「Ｆｌｔ３－リガンド（Ｆｌｔ３－Ｌ：Fms-like tyrosine kinase receptor-3-ligand）」は、造血サイトカインの一つであり、未分化な造血細胞に作用し、他のサイトカインと協調して血液細胞の分化に寄与する。Ｆｌｔ３－Ｌの受容体である「Ｆｌｔ３（Fms-like tyrosine kinase receptor-3）」は、受容体型チロシンキナーゼであり、造血前駆細胞で発現しておりその分化増殖に寄与する。
　本発明において「生体試料」は、生体から分離された試料を意味し、例えば、血液、骨髄液、脳脊髄液、胸水、腹水等の体液や、細胞（ＣＡＥＢＶ患者から単離した細胞を含む）であり、好ましくは血液試料（より好ましくは血漿試料もしくは血清試料、さらに好ましくは血漿試料）または細胞試料である。
　本発明における「対象」は、ヒトのみならず、ヒト以外の哺乳動物（例えば、モデル動物）を含む意味で用いられる。
＜＜検出方法＞＞
　本発明の第一の側面によれば、慢性活動性Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス感染症（ＣＡＥＢＶ）の検出方法が提供される。本発明の検出方法によれば、対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を指標にして、ＣＡＥＢＶを検出することができる。すなわち、本発明の検出方法は、対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を被験対象におけるＣＡＥＢＶの発症の有無と関連づけることを特徴とする。
　本発明の検出方法では、まず、（Ａ）対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を測定する工程を実施する。Ｆｌｔ３－Ｌの量または濃度の測定は、公知の方法により実施することができる。また、本発明の検出方法は、対象から採取した生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を測定するため、ＣＡＥＢＶの体外検出方法ということができる。
　Ｆｌｔ３－Ｌの量または濃度の測定方法としては、例えば、抗体やアプタマーを利用したイムノアッセイとして、エンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡやＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、化学発光イムノアッセイ等が挙げられ、少量のサンプルで高感度に検出する観点から、マルチプレックスアッセイやサイトメトリービーズアッセイ（ＣＢＡ）を用いることもできる。
　また、Ｆｌｔ３－Ｌの量または濃度は、そのタンパク質をコードするＲＮＡの量または濃度を測定することにより間接的に測定することもできる。ＲＮＡの量または濃度の測定方法としては、例えば、次世代シーケンサーを利用したＲＮＡ－ｓｅｑ、定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ、蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法、質量分析法等が挙げられるが、迅速かつ簡便な検出の観点からＲＴ－ｑＰＣＲおよびデジタルＰＣＲが好ましい。
　本発明の検出方法では、（Ｂ）工程（Ａ）で測定されたＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を指標にして、生体試料を採取した対象のＣＡＥＢＶの発症の有無を判定または評価する工程をさらに含むことができる。工程（Ｂ）は、（Ｂ－１）生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度とあらかじめ定めた参照値とを比較する工程と、（Ｂ－２）生体試料を採取した対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度が参照値以上であるか、または参照値よりも高い場合に、被験対象がＣＡＥＢＶを発症していると判定する工程により実施することができる。ここで、本発明において、「発症している」とは、ＣＡＥＢＶを発症していることに加え、発症している可能性がある場合も含む意味で用いられるものとする。
　本発明において、「参照値」は、ＣＡＥＢＶを発症していない対象（正常対象）の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度の測定値から算出し、決定することができる。このような対象は、治療中の疾患がない健康な対象が好ましいが、ＣＡＥＢＶ以外の疾患を有する対象であってもよい。上記の参照値の決定方法においては、正常対象群の平均値、パーセンタイル値、最大値または最小値を使用することができる。パーセンタイル値は任意の値を選択することができ、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０または９５とすることができる。参照値を算出する際の対象数は複数例が好ましく、例えば、２例以上、５例以上、１０例以上、２０例以上または５０例以上とすることができる。なお、参照値は本発明の検出方法を実施する上でＣＡＥＢＶの発症の有無を区別する数値であり、この意味においてカットオフ値または境界値といい得る。
　本発明の検出方法において、「参照値」は、ＣＡＥＢＶを発症していない対象（正常対象）を比較対象とし、ＣＡＥＢＶを発症している対象（発症対象）の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度から算出することもできる。例えば、正常対象群と、発症対象群について、生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を測定し、得られた測定値を用いてＲＯＣ解析等の統計解析を行うことによりカットオフ値を設定することができる。ＲＯＣ曲線（受信者動作特性曲線（ROC；Receiver Operatorating Charasteristic curve））の作成とＲＯＣ曲線に基づくカットオフ値の設定は周知であり、後記実施例（例４）に示すように、感度や特異度の観点から当業者が適宜設定することができる。
　本発明の検出方法では、対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの濃度が、例えば、２０ｐｇ／ｍＬ以上、３０ｐｇ／ｍＬ以上、４０ｐｇ／ｍＬ以上、５０ｐｇ／ｍＬ以上、６０ｐｇ／ｍＬ以上、７０ｐｇ／ｍＬ以上、８０ｐｇ／ｍＬ以上、９０ｐｇ／ｍＬ以上、１００ｐｇ／ｍＬ以上、１５０ｐｇ／ｍＬ以上または２００ｐｇ／ｍＬ以上の場合に、対象がＣＡＥＢＶを発症していると決定することができる。
　本発明の検出方法の工程（Ｂ）においては、例えば、被験対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度が正常対象群の当該タンパク質の量または濃度の平均値よりも高いか、あるいは該平均値と比較して約１．０５倍以上、約１．１倍以上、約１．２倍以上、約１．３倍以上、約１．４倍以上、約１．５倍以上、約１．６倍以上、約１．７倍以上、約１．８倍以上、約１．９倍以上、約２．０倍以上、約２．５倍以上または約３倍以上である場合に、被験対象がＣＡＥＢＶを発症している（あるいはＣＡＥＢＶを発症している可能性がある）と判定することができる。
　本発明の検出方法において、ＣＡＥＢＶの検出は、生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの測定に、他の臨床情報の測定を組み合わせて実施することができる。組み合わせる臨床情報には、少なくとも生体試料中の炎症の指標となる因子の量または濃度および生体試料中のＥＢＶ－ＤＮＡの量または濃度が含まれる。炎症の指標となる因子としては、例えば、ＩＦＮ－γ（interferon-gamma）、ＴＮＦ－α（tumor necrosis factor-alpha）、ＩＬ－６（interleukin-6）、血中フィブリノゲン、血中フェリチン、可溶性インターロイキン２受容体（ｓＩＬ－２Ｒ：soluble interleukin-2 receptor）、ヘモグロビン、乳酸脱水素酵素（ＬＤ）、Ｃ反応性タンパク（ＣＲＰ）、β２ミクログロブリン、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、白血球および血小板が挙げられ、好ましくは生体試料中のＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ｓＩＬ－２ＲおよびＬＤであり、より好ましくは生体試料中のＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αである。また、ＥＢウイルスゲノム量やＥＢウイルス関連抗体価、病変組織の病理組織学的および分子生物学的評価等についても臨床情報として用いることができる。本発明において、上記の臨床情報は、適宜組み合わせて用いることもできる。
　本発明の検出方法において、Ｆｌｔ３－Ｌをこのような臨床情報と組み合わせて使用することによりさらに検出精度を向上させることができる。ここで、検出精度が向上するとは、ＲＯＣ解析を利用した場合には、ＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）が向上することを意味する。
　本発明の検出方法によれば、対象のＣＡＥＢＶの発症の有無を検出することができる。したがって、本発明の検出方法は、対象がＣＡＥＢＶを発症しているか否かの診断に補助的に用いることができ、対象がＣＡＥＢＶを発症しているか否かの判断は、場合によっては他の所見と組み合わせて、最終的には医師が行うことができる。すなわち、本発明の検出方法は診断を補助する方法と言い換えることができる。
　本発明の検出方法によれば、対象から採取した生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度に基づいて、対象がＣＡＥＢＶを発症しているか否か（ＣＡＥＢＶの発症可能性の有無）を定量的に検出または評価することができる。このため本発明の検出方法は、ＣＡＥＢＶを検出または評価するための生体試料分析方法（好ましくは血液試料分析方法）と言い換えることができる。本発明の検出方法は、簡便かつ的確にＣＡＥＢＶの発症の有無を検出または評価できる点で有利である。
　本発明の別の側面によればまた、ＣＡＥＢＶの診断方法が提供される。本発明の診断方法によれば、生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を指標にしてＣＡＥＢＶを診断することができる。本発明の検出方法は、対象から採取した生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を測定するため、ＣＡＥＢＶの体外診断方法ということができる。本発明の診断方法においては、本発明の検出方法と同様に、（Ａ’）対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を測定する工程を実施する。本発明の診断方法においては、（Ｂ’）工程（Ａ’）で測定されたＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を指標にして、ＣＡＥＢＶの発症の有無を判定または評価する工程をさらに含むことができる。前記工程（Ａ’）および（Ｂ’）は、前記工程（Ａ）および（Ｂ）にそれぞれ対応し、本発明の検出方法の記載に従って実施することができる。
＜＜疾患活動性の判定方法＞＞
　本発明の第二の側面によれば、ＣＡＥＢＶの疾患活動性の判定方法が提供される。本発明の疾患活動性の判定方法によれば、対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌを指標にしてＣＡＥＢＶの疾患活動性を判定することができる。すなわち、本発明の疾患活動性の判定方法は、対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を対象におけるＣＡＥＢＶの疾患活動性と関連づけることを特徴とする。ここで、本発明において「疾患活動性」とは、対象のＣＡＥＢＶの病気の勢いの程度（例えば、対象における炎症状態の程度）を意味し、以下の項目の１つ以上に該当する場合と定義される。
・発熱
・施設基準値の上限２倍以上のＡＬＴ
・進行する皮膚病変
・血管炎
・ぶどう膜炎
　本発明の疾患活動性の判定方法において、「疾患活動性」は、ＣＡＥＢＶの病気の勢いの程度が、「高い（あり）」と「低い（なし）」に大別する、あるいは、「高い」、「普通」、「低い」、「なし（寛解）」といった段階別に決定することができる。
　本発明の疾患活動性の判定方法では、本発明の検出方法と同様に、（Ｃ）対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を測定する工程を実施する。Ｆｌｔ３－Ｌの量または濃度の測定は、本発明の検出方法と同様に行うことができる。また、本発明の疾患活動性の判定方法は、対象から採取した生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を測定するため、ＣＡＥＢＶの疾患活動性の体外判定方法ということができる。
　本発明の疾患活動性の判定方法では、（Ｄ）対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を指標にして、対象が発症しているＣＡＥＢＶの疾患活動性を評価する工程をさらに含むことができる。工程（Ｄ）は、（Ｄ－１）生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度とあらかじめ定めた参照値とを比較する工程と、（Ｄ－２）生体試料を採取した対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度と参照値との差の程度に応じて該対象が発症しているＣＡＥＢＶの疾患活動性を決定する工程により実施することができる。
　本発明の疾患活動性の判定方法の工程（Ｄ－２）は、例えば、生体試料を採取した対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を、その対象について以前に測定した生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度と比較して、その差の程度に応じて、該対象の疾患活動性を「高い（あり）」と「低い（なし）」と決定する工程とする、または該対象の疾患活動性を「高い」、「同等（普通）」、「低い」もしくは「なし（寛解）」と決定する工程とすることができ、あるいは、生体試料を採取した対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を、本発明における疾患等を発症していない対象（正常対象）の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度の平均値と比較して、その差の程度に応じて、該対象の疾患活動性を「高い（あり）」と「低い（なし）」と決定する工程とする、または該対象の疾患活動性を「高い」、「同等（普通）」、「低い」または「なし（寛解）」と決定する工程、とすることができる。ここで、本発明の疾患活動性の判定方法を実施する前の同一対象についての生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度の測定は、例えば、該対象について本発明における疾患等の診断時（診断の疑いのある時期を含む）や治療開始前、治療期間中、経過観察中等の時期に実施することができる。
　本発明の疾患活動性の判定方法において、「参照値」は、生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度をあらかじめ測定した被験者を本発明における疾患等の疾患活動性に応じて層別化し、「高い」、「同等（普通）」、「低い」、「なし（寛解）」の各群の前記Ｆｌｔ３－Ｌの量または濃度の平均値をもとにして決定することができる。また、前記参照値は、本発明の検出方法と同様に、ＲＯＣ解析等の統計解析を行うことによりカットオフ値を設定することにより決定することもできる。
　本発明の疾患活動性の判定方法の「対象」は、ＣＡＥＢＶを発症しているまたは発症していると疑われる対象とすることができ、好ましくは医師によりこれらの疾患または病態を発症しているとの診断を受けた対象とすることができる。
　本発明の疾患活動性の判定方法は、対象が発症しているＣＡＥＢＶの疾患活動性の診断に補助的に用いることができ、疾患活動性の診断は、場合によっては他の所見と組み合わせて、最終的には医師が行うことができる。すなわち、本発明の疾患活動性の判定方法は疾患活動性の判定を補助する方法と言い換えることができる。
　本発明の疾患活動性の判定方法によれば、対象が発症しているＣＡＥＢＶの疾患活動性を判定することができる。したがって、本発明の疾患活動性の判定方法は、その疾患活動性に応じて該対象の治療方法の選択や治療計画を立てる際の判断に補助的に用いることができ、これらの判断は、場合によっては他の所見と組み合わせて、最終的には医師が行うことができる。本発明の疾患活動性の判定方法はまた、無駄な投薬を抑制することができ、ひいては医療費削減や患者負担軽減に資することができる点で有利である。
　本発明の疾患活動性の判定方法において、対象が発症しているＣＡＥＢＶの疾患活動性の判定は、本発明の検出方法と同様に、生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの測定に、他の臨床情報の測定を組み合わせて実施することができる。
＜＜予後の予測方法＞＞
　本発明の第三の側面によれば、ＣＡＥＢＶの予後の予測方法が提供される。本発明の予後の予測方法によれば、対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌを指標にしてＣＡＥＢＶの予後を予測することができる。すなわち、本発明の予測方法は、対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を、ＣＡＥＢＶを発症している対象の予後と関連づけることを特徴とする。ここで、本発明において「予後」とは、ＣＡＥＢＶを発症している対象の生命予後を意味し、該対象が５年以内（あるいは３年以内）に生存しているか否かの意味で用いられる。
　本発明の予測方法において、「予後」は、ＣＡＥＢＶを発症している対象が、が５年以内（あるいは３年以内）に生存しているか否かを決定することができる。
　本発明の予測方法では、本発明の検出方法と同様に、（Ｅ）対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を測定する工程を実施する。Ｆｌｔ３－Ｌの量または濃度の測定は、本発明の検出方法と同様に行うことができる。また、本発明の予測方法は、対象から採取した生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を測定するため、ＣＡＥＢＶの予後の体外予測方法ということができる。
　本発明の予測方法では、（Ｆ）対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を指標にして、対象が発症しているＣＡＥＢＶの予後を判定する工程をさらに含むことができる。工程（Ｆ）は、（Ｆ－１）生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度とあらかじめ定めた参照値とを比較する工程と、（Ｆ－２）生体試料を採取した対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度と参照値との差の程度に応じてＣＡＥＢＶ発症している該対象の予後を判定する工程により実施することができる。
　本発明の予測方法の工程（Ｆ－２）は、例えば、生体試料を採取した対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を、その対象について以前に測定した生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度と比較して、その差の程度に応じて該対象の予後を「５年以内（あるいは３年以内）に生存している（生存している可能性がある）」または「５年以内（あるいは３年以内）に生存していない（生存していない可能性がある）」と決定する工程とすることができ、あるいは、生体試料を採取した対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を、本発明における疾患等を発症していない対象（正常対象）の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度の平均値と比較して、その差の程度に応じて該対象の予後を「５年以内（あるいは３年以内）に生存している（生存している可能性がある）」または「５年以内（あるいは３年以内）に生存していない（生存していない可能性がある）」と決定する工程、とすることができる。ここで、本発明の予測方法を実施する前の同一対象についての生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度の測定は、例えば、該対象について本発明における疾患等の診断時（診断の疑いのある時期を含む）や治療開始前、治療期間中、経過観察中等の時期に実施することができる。
　本発明の予測方法において、「参照値」は、生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度をあらかじめ測定した被験者をＣＡＥＢＶの予後に応じて層別化し、「５年以内（あるいは３年以内）に生存している群」または「５年以内（あるいは３年以内）に死亡した群」の各群の前記Ｆｌｔ３－Ｌの量または濃度の平均値をもとにして決定することができる。また、前記参照値は、本発明の検出方法と同様に、ＲＯＣ解析等の統計解析を行うことによりカットオフ値を設定することにより決定することもできる。
　本発明の予測方法の「対象」は、ＣＡＥＢＶを発症しているまたは発症していると疑われる対象とすることができ、好ましくは医師によりＣＡＥＢＶを発症しているとの診断を受けた対象とすることができる。
　本発明の予測方法は、ＣＡＥＢＶを発症している対象の予後の診断に補助的に用いることができ、予後の診断は、場合によっては他の所見と組み合わせて、最終的には医師が行うことができる。すなわち、本発明の予測方法は予後の予測を補助する方法と言い換えることができる。
　本発明の予測方法によれば、ＣＡＥＢＶを発症している対象の予後を判定することができる。したがって、本発明の予測方法は、その予後に応じて該対象の治療方法の選択や治療計画を立てる際の判断に補助的に用いることができ、これらの判断は、場合によっては他の所見と組み合わせて、最終的には医師が行うことができる。本発明の予測方法はまた、患者に適切な治療を行うことができる点で有利である。
　本発明の予測方法において、ＣＡＥＢＶを発症している対象の予後の判定は、本発明の検出方法と同様に、生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの測定に、他の臨床情報の測定を組み合わせて実施することができる。
＜＜治療効果の判定方法＞＞
　本発明の第四の側面によれば、対象が発症しているＣＡＥＢＶに対する治療効果の判定方法が提供される。本発明の治療効果の判定方法によれば、対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌを指標にしてＣＡＥＢＶの治療効果を判定することができる。すなわち、本発明の疾患活動性の判定方法は、対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を対象におけるＣＡＥＢＶの治療効果と関連づけることを特徴とする。
　本発明の治療効果の判定方法では、本発明の検出方法と同様に、（Ｇ）対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を測定する工程を実施する。Ｆｌｔ３－Ｌの量または濃度の測定は、本発明の検出方法と同様に行うことができる。また、本発明の治療効果の判定方法は、対象から採取した生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を測定するため、ＣＡＥＢＶの治療効果の体外判定方法ということができる。
　本発明の治療効果の判定方法は治療効果を判定するものであるため、対象は治療後の、あるいは治療中の被験対象とすることができる。
　本発明の治療効果の判定方法によって治療効果を判定できるＣＡＥＢＶに対する治療としては、薬物療法（ＣＡＥＢＶの治療薬の例として、本発明の医薬組成物に加え、副腎皮質ステロイド、シクロスポリン、エトポシド、ルキソリチニブ、ボルテゾミブ、アレンツズマブ、エマパルマブ等の医薬品）や、同種造血幹細胞移植が挙げられる。
　本発明の治療効果の判定方法においては、（Ｈ）工程（Ｇ）で測定されたＦｌｔ３－Ｌの量または濃度に基づいて、治療を受けた対象が発症しているＣＡＥＢＶに対する治療効果の程度を評価する工程をさらに含むことができる。工程（Ｈ）は、（Ｈ－１）生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度とあらかじめ定めた参照値とを比較する工程と、（Ｈ－２）生体試料を採取した対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度が参照値以下であるか、または参照値よりも低い場合に、治療効果があると決定する工程により実施することができる。なお、「治療効果がある」とは、ＣＡＥＢＶの病態もしくは症状の改善または緩和も含む。
　本発明の治療効果の判定方法の工程（Ｈ－２）は、例えば、生体試料を採取した対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度が、ＣＡＥＢＶを発症していない対象（正常対象）の生体試料中の当該Ｆｌｔ３－Ｌの量または濃度の平均値と比較して約１．３倍以下、約１．２倍以下、約１．１倍以下または約１．０５倍以下であるか、あるいは、該平均値以下である場合に、治療効果がある（例えば、対象が発症しているＣＡＥＢＶが完全に治癒した可能性がある）と決定する工程とすることができる。
　本発明の治療効果の判定方法において使用する参照値は、本発明の検出方法と同様に設定することができるが、本発明の治療効果の判定方法ではこれに加えて被験対象の治療前の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度の測定値を参照値として使用することができる。この場合、本発明の治療効果の判定方法は、対象が発症しているＣＡＥＢＶに対する治療を開始する前に、あるいは開始後（好ましくは開始後すみやかに、例えば、１～２時間以内に、数時間以内に、または１日以内に）、被験対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を測定する工程をさらに含んでいてもよい。また、工程（Ｈ－２）では、生体試料を採取した対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度が治療前の測定値以下であるか、または治療前の測定値よりも低い場合に、治療効果がある（対象が発症しているＣＡＥＢＶの病態もしくは症状の改善または緩和傾向にある）と決定することができる。
　本発明の治療効果の判定方法において治療を受ける「対象」は、好ましくはＣＡＥＢＶを発症しているまたは発症していると疑われる対象とすることができ、より好ましくは医師によりこれらの疾患または病態を発症しているとの診断を受けた対象とすることができる。
　本発明の治療効果の判定方法は、対象が発症しているＣＡＥＢＶに対する治療の有効性の判断に補助的に用いることができ、治療が有効か否かの判断は、場合によっては他の所見と組み合わせて、最終的には医師が行うことができる。すなわち、本発明の治療効果の判定方法は治療効果の判定を補助する方法と言い換えることができる。
　本発明の治療効果の判定方法によれば、対象が発症しているＣＡＥＢＶに対する治療を受けた対象において、当該治療効果を判定することができるため、被験対象に対して行った本発明における疾患等に対する治療の有効性を検証することができる。そして、治療効果が認められない場合にはその治療を中止し、別の治療計画を立てることができる。したがって、本発明の治療効果の判定方法は、対象が発症しているＣＡＥＢＶに対する治療の有効性の判断に補助的に用いることができ、治療が有効か否かの判断は、場合によっては他の所見と組み合わせて、最終的には医師が行うことができる。本発明の治療効果の判定方法はまた、無駄な投薬を抑制することができ、ひいては医療費削減や患者負担軽減に資することができる点で有利である。
　本発明の治療効果の判定方法において、対象が発症しているＣＡＥＢＶの治療効果の判定は、本発明の検出方法と同様に、生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの測定に、他の臨床情報の測定を組み合わせて実施することができる。
＜＜医薬組成物＞＞
　本発明の第五の側面によれば、慢性活動性Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス感染症（ＣＡＥＢＶ）の治療用医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物は、Ｆｌｔ３阻害剤を含んでなることを特徴とする。
　本発明の医薬組成物において、Ｆｌｔ３阻害剤は、Ｆｌｔ３に作用してその機能を阻害する剤であればよく、例えば、ギルテリチニブ、キザルチニブ、スニチニブ、カボザンチニブ、ミドスタウリン、ソラフェニブ、イロラセルチブ、ＦＦ－１０１０１およびＥＮＭＤ－２０７６等が挙げられ、好ましくはギルテリチニブおよびキザルチニブである。
　本発明の医薬組成物の投与量、投与間隔および投与回数は、投与対象の体質、体調、症状等に応じて任意に設定することができ、投与方法としては経口投与や静脈内への点滴投与等が挙げられる。経口投与する場合は、例えば、有効成分のＦｌｔ３阻害剤の１回当たりの投与量として０．１ｍｇ～１０００ｍｇを、１～７日に１～２回（好ましくは１日に１回または２回）とすることができ、静脈内に点滴投与する場合は、有効成分のＦｌｔ３阻害剤の１回当たりの投与量として０．１ｍｇ～１０００ｍｇを、例えば、１～１８０日に１回（好ましくは１週～４週に１回）とすることができる。
　本発明の医薬組成物の投与量、投与間隔および投与回数は、投与対象の体質、体調、症状等に応じて任意に設定することができ、投与方法としては経口投与や静脈内への点滴投与等が挙げられる。例えば、Ｆｌｔ阻害剤としてギルテリチニブを使用する場合は、１回当たりの投与量として１ｍｇ～２００ｍｇ（好ましくは４０ｍｇ～１２０ｍｇ）を１日に１回の間隔で経口投与することができ、Ｆｌｔ阻害剤としてキザルチニブを使用する場合は、１回当たりの投与量として１ｍｇ～１００ｍｇ（好ましくは１７．７ｍｇ～５３ｍｇ）を、１日に１回の間隔で経口投与することができる。
　本発明の医薬組成物において、Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）感染細胞を治療標的とすることができ、ＣＡＥＢＶの治療効果を高める観点から、好ましくは、ＥＢＶ感染細胞はＴ細胞およびＮＫ細胞とすることができる。
＜＜治療方法＞＞
　本発明の検出方法によりＣＡＥＢＶが検出された対象あるいは本発明の診断方法によりＣＡＥＢＶと診断された対象に対しては、ＣＡＥＢＶに対する治療を実施することができる。したがって、本発明の別の側面によればまた、（Ａ）対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を測定する工程と、（Ｂ）工程（Ａ）で測定されたＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を指標にして、ＣＡＥＢＶの発症の有無を判定する工程と、（Ｎ）工程（Ｂ）でＣＡＥＢＶを発症していると判定された対象に、ＣＡＥＢＶに対する治療を実施する工程とを含んでなる、ＣＡＥＢＶの治療方法が提供される。本発明の治療方法のうちＣＡＥＢＶの検出工程および判定工程（すなわち、工程（Ａ）および（Ｂ））は、本発明の検出方法および本発明の診断方法の記載に従って実施することができる。また、ＣＡＥＢＶに対する治療は、本発明の治療効果の判定方法および本発明の医薬組成物の記載に従って実施することができる。
＜＜マーカー＞＞
　本発明の第六の側面によれば、Ｆｌｔ３－Ｌを含んでなる、ＣＡＥＢＶの診断もしくは検出に用いるためのマーカー、ＣＡＥＢＶの疾患活動性の判定に用いるためのマーカー、ＣＡＥＢＶの予後予測に用いるためのマーカーまたはＣＡＥＢＶの治療効果判定に用いるためのマーカーが提供される。本発明によればまた、ＣＡＥＢＶの診断もしくは検出マーカーとしてのＦｌｔ３－Ｌの使用、ＣＡＥＢＶの疾患活動性の判定マーカーとしてのＦｌｔ３－Ｌの使用、ＣＡＥＢＶの予後予測マーカーとしてのＦｌｔ３－Ｌの使用またはＣＡＥＢＶの治療効果判定マーカーとしてのＦｌｔ３－Ｌの使用が提供される。本発明において、診断マーカーもしくは検出マーカー、疾患活動性の判定マーカー、予後予測マーカーまたは治療効果判定マーカーは、それらの存在および量がＣＡＥＢＶの発症の有無の診断もしくは検出、ＣＡＥＢＶの疾患活動性の判定、ＣＡＥＢＶの予後予測またはＣＡＥＢＶの治療効果判定の指標となる物質をそれぞれいい、ＣＡＥＢＶの診断や検出、疾患活動性の判定、予後予測、治療効果判定等のためのマーカーとしてそれぞれ用いることができるものである。すなわち、本発明によれば、Ｆｌｔ３－ＬをＣＡＥＢＶの診断もしくは検出用のマーカー、ＣＡＥＢＶの予後予測用のマーカー、ＣＡＥＢＶの治療効果判定用のマーカーとしてそれぞれ使用することができる。本発明のマーカーにおいてＦＬＴ３－Ｌは、対象の生体試料中のＦＬＴ３－Ｌまたは対象の生体試料に由来するＦＬＴ３－Ｌであってもよい。
　本発明のマーカーは、上記に加えて、本発明の検出方法、疾患活動性の判定方法、予後の予測方法および治療効果の判定方法の記載に従って実施することができる。
＜＜診断キット＞＞
　本発明の第七の側面によれば、生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度の定量手段を含んでなる、ＣＡＥＢＶの診断もしくは検出、ＣＡＥＢＶの疾患活動性の判定、ＣＡＥＢＶの予後予測またはＣＡＥＢＶの治療効果判定に用いるためのキットが提供される。本発明のキットは、典型的には、本発明の検出方法、疾患活動性の判定方法、予後の予測方法および治療効果の判定方法に従ってなされる、それぞれＣＡＥＢＶの診断もしくは検出、ＣＡＥＢＶの疾患活動性の判定、ＣＡＥＢＶの予後予測またはＣＡＥＢＶの治療効果判定用のキットである。Ｆｌｔ３－Ｌの量または濃度の定量は、本発明の検出方法に記載の測定方法に従って実施することができる。
　本発明のキットは、上記に加えて、本発明の検出方法、疾患活動性の判定方法、予後の予測方法および治療効果の判定方法の記載に従って実施することができる。
　以下の例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
例１：ＣＡＥＢＶのバイオマーカーの検討（１）
　例１では、健常者（対照群）とＣＡＥＢＶに罹患している患者（ＣＡＥＢＶ群）から採取した血液検体を使用して、ＣＡＥＢＶの指標となるバイオマーカーについて検討した。
（１）方法
ア　血液検体
　健常者８名（対照群）と聖マリアンナ医科大学病院を受診しているＣＡＥＢＶ患者１９名（ＣＡＥＢＶ群）から採取した血液検体を使用した。ＣＡＥＢＶ患者は、ＣＡＥＢＶ診断基準の前記４項目を満たすことによりＣＡＥＢＶと診断された患者であり、血液検体は治療開始前に採取した。
イ　Ｆｌｔ３－Ｌの測定方法
　血液検体の血漿中のＦｌｔ３－Ｌ濃度をＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）ＭＡＰ　Ｋｉｔ（EMD Millipore Corporation）を用いて測定した。
ウ　ＩＦＮ－γの測定方法
　血液検体の血漿中のＩＦＮ－γ濃度をＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）ＭＡＰ　Ｋｉｔ（EMD Millipore Corporation）を用いて測定した。
エ　ＣＡＥＢＶ群の分類
　ＣＡＥＢＶ群の患者は、疾患活動性の有無により、疾患活動性ありの患者（ＣＡＥＢＶ（活動性＋）群）と疾患活動性なしの患者（ＣＡＥＢＶ（活動性－）群）にさらに分類した。疾患活動性の有無は、表１に示す炎症症状のうちのいずれかを認める患者を「疾患活動性あり」とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
オ　統計学的解析
　「対照群」と「ＣＡＥＢＶ群」間および「ＣＡＥＢＶ（活動性＋）群」と「ＣＡＥＢＶ（活動性－）群」間における血漿中のＦｌｔ３－ＬおよびＩＦＮ－γの濃度について、ウィルコクソン（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）符号付順位和検定を用いてそれぞれ比較検討した。
（２）結果
　結果は、図１および図２に示す通りであった。ウィルコクソン符号付順位和検定の結果、ＣＡＥＢＶ群は、対照群に対して、Ｆｌｔ３－ＬおよびＩＦＮ－γの濃度がそれぞれ高いことが確認された（図１Ａ：Ｆｌｔ３－Ｌ、図１Ｂ：ＩＦＮ－γ）。この結果から、血液（血漿）中のＦｌｔ３－ＬおよびＩＦＮ－γの濃度を指標として、ＣＡＥＢＶの発症を検出できることが示された。
　また、ウィルコクソン符号付順位和検定の結果、ＣＡＥＢＶ（活動性＋）群は、ＣＡＥＢＶ（活動性－）群に対して、Ｆｌｔ３－ＬおよびＩＦＮ－γの濃度がそれぞれ高いことが確認された（図１Ａ：Ｆｌｔ３－Ｌ、図１Ｂ：ＩＦＮ－γ）。この結果から、血液（血漿）中のＦｌｔ３－ＬおよびＩＦＮ－γの濃度を指標として、ＣＡＥＢＶ患者の疾患活動性を評価できることが示された。
　さらに、ＣＡＥＢＶ患者１９名のうち、血液（血漿）中のＦｌｔ３－Ｌの濃度が７２６．１１および７９７．６１ｐｇ／ｍＬという高値だった２名はいずれも血液検体の採取後３か月以内に死亡していることが確認された（血液（血漿）中のＦｌｔ３－Ｌの濃度は、この２名以外のＣＡＥＢＶ患者１７名の平均値は４６．１４ｐｇ／ｍＬ、対照群の８名の平均値は８．２５）。この結果から、血液（血漿）中のＦｌｔ３－Ｌの濃度が、ＣＡＥＢＶ患者の予後を予測する因子となり得ることが示唆された。
例２：ＣＡＥＢＶの治療標的の検討（１）
　例２では、ＣＡＥＢＶ患者から採取した末梢血単核球を用いて、ＣＡＥＢＶの治療指標となる分子について検討した。
（１）方法
ア　ＣＡＥＢＶ患者の末梢血単核球
　治療前のＣＡＥＢＶ患者の全血からLymphoprep（商標）（Abbott Diagnostics Technologies AS）を用いた密度勾配遠心分離法により、ＥＢＶ感染細胞が含まれる末梢血単核球（ＰＢＭＣ：peripheral blood mononuclear cell）を分離した。ここで、ＣＡＥＢＶ患者は、ＥＢＶが感染している細胞型によりそれぞれ分類されるが、上記で分離した各患者由来のＰＢＭＣは、Ｔ細胞感染型のＣＤ４感染型およびＣＤ８感染型ならびにＮＫ細胞感染型のＣＤ５６感染型であった。
イ　ギルテリチニブ処理
　分離した末梢血単核球はＦｌｔ３阻害剤であるギルテリチニブ（製品コードＳ７７５４、Selleck）で２４時間と４８時間、３７℃で処理した。ギルテリチニブの濃度は０μＭ（対照）、１μＭ、２μＭとした。
ウ　細胞数測定
　細胞数はＸＴＴアッセイ（Cell Count Reagent SF、ナカライテスク）で測定した。また、対照と各濃度のギルテリチニブ処理の比較検討は、ｔ検定（GraphPad Prism 6）により行った。
エ　サイトカインの測定（ｑＲＴ－ＰＣＲ）
　２μＭのギルテリチニブで処理した２４時間後の末梢血単核球からＩＳＯＧＥＮ　ＩＩ（ニッポン・ジーン）を用いてＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（タカラバイオ）によりｃＤＮＡを合成した。そして、ｑＲＴ－ＰＣＲにより各サイトカインのＲＮＡ発現量を測定した。ｑＲＴ―ＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙｓ（ＴＮＦ－α（アッセイＩＤ：Ｈｓ０１１１３６２４＿ｇ１）、ＩＦＮ－γ（アッセイＩＤ：Ｈｓ００９８９２９１＿ｍ１）、ＩＬ－６（アッセイＩＤ：Ｈｓ００９８５６３９＿ｍ１）、ＧＡＰＤＨ（アッセイＩＤ：Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１））（Thermo Fisher Scientific）を用いて、Ｌｉｇｈｔ　Ｃｙｃｌｅｒ　４８０（登録商標）（Roche Diagnostics）により実施した。
（２）結果
　結果は、図３および図４に示す通りであった。ＥＢＶに感染したＰＢＭＣはＦｌｔ３阻害剤であるギルテリチニブの投与によりいずれも減少することが確認された（図３Ａ～Ｃ）。この結果から、Ｆｌｔ３の阻害によりＥＢＶ感染細胞の増殖が抑制されること、および、Ｆｌｔ３がＣＡＥＢＶ治療の分子標的となり得ることが示された。
　また、Ｆｌｔ３阻害剤であるギルテリチニブの投与によりＥＢＶに感染した各ＰＢＭＣが産生するＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－６のＲＮＡ発現量がいずれも減少することが確認された（図４Ａ～Ｃ）。この結果から、Ｆｌｔ３の阻害によりＣＡＥＢＶの病態形成に重要な役割を担うこれらのサイトカインが抑制されること、および、ＣＡＥＢＶの病態が改善され得ることが示された。この結果からまた、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞およびＣＤ５６陽性ＮＫ細胞のいずれの細胞型にＥＢＶが感染した場合もこれらの効果が確認されたため、ＣＡＥＢＶ患者の感染細胞の型を問わずにＦｌｔ３の阻害による効果が得られることも示された。
例３：ＣＡＥＢＶのバイオマーカーの検討（２）
　例３では、ＣＡＥＢＶモデルマウスを用いて、ＣＡＥＢＶの指標となるバイオマーカーについて検討した。
（１）方法
ア　ＣＡＥＢＶモデルマウス
　ＣＡＥＢＶマウスモデルは、ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＯＧ）マウスに、ＣＡＥＢＶ患者の末梢血単核球を注射して作製した（Imadome et.al., PLoS Pathog. 2011;7(10):e1002326）。次に、ＣＡＥＢＶマウスモデルに対し、プロテアソーム阻害剤であるボルテゾミブ（Millennium Pharmaceuticals）（１．６７ｍｇ／ｋｇを３００μＬのＰＢＳに溶解）を週に２回腹腔内投与した群（ボルテゾミブ群）と、３００μＬのＰＢＳを週に２回腹腔内投与した群（対照群）から、投与前、投与１週目、投与２週目、投与３週目の血液（血漿）を採取した。
イ　Ｆｌｔ３－Ｌの測定方法
　例１（１）イに記載の方法と同様にして血漿中のＦｌｔ３－Ｌを測定した（各群ともｎ＝３）。
（２）結果
　結果は、図５に示す通りであった。ボルテゾミブ群ではボルテゾミブの投与により血漿中のＦｌｔ３－Ｌが検出感度未満に抑制されたのに対し、対照群では時間の経過とともに病勢が進行し血漿中のＦｌｔ３－Ｌが上昇することが確認された。この結果から、ＣＡＥＢＶの病勢の進行と血漿中のＦｌｔ３－Ｌの濃度が相関することが示された。また、この結果と例２の結果から、血液（血漿）中のＦｌｔ３－Ｌの濃度が、ＣＡＥＢＶ患者の治療効果を判定する因子となり得ることが示唆された。
例４：ＣＡＥＢＶのバイオマーカーの検討（３）
　例４では、健常者（対照群）とＣＡＥＢＶに罹患している患者（ＣＡＥＢＶ群）から採取した血液検体を使用して、ＣＡＥＢＶの指標となるバイオマーカーについてさらに検討した。
（１）方法
ア　血液検体
　健常者４７名（対照群）と聖マリアンナ医科大学病院を受診しているＣＡＥＢＶ患者２１名（ＣＡＥＢＶ群）から採取した血液検体を使用した。ＣＡＥＢＶ患者は、ＣＡＥＢＶ診断基準の前記４項目を満たすことによりＣＡＥＢＶと診断された患者であり、血液検体は治療開始前に採取した。
イ　Ｆｌｔ３－Ｌの測定方法
　例１（１）イに記載の方法と同様の方法により、血液検体の血漿中のＦｌｔ３－Ｌ濃度を測定した。
ウ　統計学的解析
　「対照群」と「ＣＡＥＢＶ群」間における血漿中のＦｌｔ３－Ｌの濃度について、統計ソフトＥＺＲを用いてマン・ホイットニーのＵ検定（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ検定）により比較検討を行うともに、ＲＯＣ曲線を作成しカットオフ値を算出した。
（２）結果
　結果は、図６に示す通りであった。マン・ホイットニーのＵ検定の結果、ＣＡＥＢＶ群は、対照群に対して、Ｆｌｔ３－Ｌの濃度が有意に高いことが確認された（ｐ＝０．０００１８１）（図６Ａ）。また、ＲＯＣ曲線からＡＵＣは０．７８６であり、カットオフ値はＦｌｔ３―Ｌの濃度として３９．７０６ｐｇ／ｍＬと算出された（図６Ｂ）。
　上記の結果（例１および例４）の結果から、Ｆｌｔ３－ＬがＣＡＥＢＶのバイオマーカーとして有用であることが示された。
例５：ＣＡＥＢＶの治療標的の検討（２）
　例５では、例２よりも低い濃度でＦｌｔ３阻害剤を使用した場合のＣＡＥＢＶの病態改善に及ぼす影響について検討した。
（１）方法
ア　ＣＡＥＢＶ患者の末梢血単核球
　例２（１）アの記載と同様にして、ＣＡＥＢＶ患者のＰＭＢＣを分離した。分離した各患者由来のＰＢＭＣは、Ｔ細胞感染型のＣＤ４感染型およびＣＤ８感染型ならびにＮＫ細胞感染型のＣＤ５６感染型およびＣＤ５６（－）ＮＫ細胞感染型であった。
イ　ギルテリチニブ処理
　ギルテリチニブの濃度を０μＭ（対照）、０．１μＭ、０．２μＭ、０．５μＭおよび１μＭとしたこと以外は、例２（１）イの記載と同様にしてギルテリチニブ処理を行った。
ウ　細胞数測定
　例２（１）ウの記載と同様にして、細胞数を測定した。
エ　サイトカインの測定（ｑＲＴ－ＰＣＲ）
　例２（１）エの記載と同様にして、サイトカインのＲＮＡ発現量を測定した。
（２）結果
　結果は、図７および図８に示す通りであった。Ｆｌｔ３阻害剤であるギルテリチニブが０．５μＭ以下の低濃度である場合においても、ＥＢＶに感染したＰＢＭＣが減少するとともに（図７Ａ～Ｄ）、ＥＢＶに感染したＰＢＭＣが産生するＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－６のＲＮＡ発現量についても減少することが確認された（図８Ａ～Ｃ）。また、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ５６陽性ＮＫ細胞およびＣＤ５６陰性ＮＫ細胞のいずれの細胞型にＥＢＶが感染した場合においても、同様の効果が得られることが確認された。これらの結果から、オフターゲット効果がないと考えられる低濃度でＰＢＭＣの減少ならびにＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－６のＲＮＡ発現量抑制が認められたため、ギルテリチニブによる効果はＦｌｔ３の特異的な抑制であることが示された。
　また、ゾスパタ錠（アステラス製薬社）の添付文書によると、「再発又は難治性の日本人急性骨髄性白血病患者に本剤２０～２００ｍｇを１日１回反復経口投与したとき」の第２８日目における血漿中未変化体濃度の最大値は１０００ｎｇ／ｍＬ（１．８１μＭ（ギルテリチニブの分子量：５５２．７１））である。上記の結果（例１および例４）の結果から、ギルテリチニブが２μＭ以下の濃度において、ＰＢＭＣの増殖が抑制され、かつ、サイトカイン濃度が減少することから、生体内においても治療効果が期待できる。
例６：ＣＡＥＢＶの治療標的の検討（３）
　例６では、例２および例５で使用したＦｌｔ３阻害剤とは異なるものを使用した場合のＣＡＥＢＶの病態改善に及ぼす影響について検討した。
（１）方法
ア　ＣＡＥＢＶ患者の末梢血単核球
　例２（１）アの記載と同様にして、ＣＡＥＢＶ患者のＰＭＢＣを分離した。分離した各患者由来のＰＢＭＣは、Ｔ細胞感染型のＣＤ４感染型およびＣＤ８感染型ならびにＮＫ細胞感染型のＣＤ５６感染型およびＣＤ５６（－）ＮＫ細胞感染型であった。
イ　キザルチニブ処理
　分離した末梢血単核球はＦｌｔ３阻害剤であるキザルチニブ（商品名ヴァンフリタ、第一三共社）で２４時間と４８時間、３７℃で処理した。キザルチニブの濃度は０μＭ（対照）、０．２５μＭ、０．５μＭとした。
ウ　細胞数測定
　例２（１）ウの記載と同様にして、細胞数を測定した。
エ　サイトカインの測定（ｑＲＴ－ＰＣＲ）
　例２（１）エの記載と同様にして、サイトカインのＲＮＡ発現量を測定した。
（２）結果
　結果は、図９および図１０に示す通りであった。Ｆｌｔ３阻害剤としてキザルチニブを使用した場合においても、ギルテリチニブと同様に、ＥＢＶに感染したＰＢＭＣが減少するとともに（図９Ａ～Ｄ）、ＥＢＶに感染したＰＢＭＣが産生するＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－６のＲＮＡ発現量についても減少することが確認された（図１０Ａ～Ｃ）。また、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ５６陽性ＮＫ細胞およびＣＤ５６陰性ＮＫ細胞のいずれの細胞型にＥＢＶが感染した場合においても、同様の効果が得られることが確認された。これらの結果から、Ｆｌｔ３阻害剤の種類を問わず、Ｆｌｔ３はＣＡＥＢＶの治療標的として有用であることが示された。
　また、ヴァンフリタ錠（第一三共社）の添付文書によると「日本人の再発又は難治性の急性骨髄性白血病患者に本剤１７．７ｍｇ、２６．５ｍｇ又は５３ｍｇを１日１回反復経口投与したとき、投与１日目及び１５日目のキザルチニブの血漿中濃度」の最大値は３００ｎｇ／ｍＬ（０．５４μＭ（キザルチニブの分子量：５６０．６７））である。今回の結果から、キザルチニブが０．５μＭ以下の濃度において、ＰＢＭＣの増殖が抑制され、かつ、サイトカイン濃度が減少することから、生体内においても治療効果が期待できる。
例７：ＣＡＥＢＶの治療標的の検討（４）
　例７では、ＣＡＥＢＶ患者に対する治療効果とＦｌｔ３－Ｌの濃度との相関について検討した。
（１）方法
　ＣＡＥＢＶ患者４名に対し、表２に示す治療を行い、表３に示す基準により治療効果を判定した。また、例１（１）イに記載の方法と同様の方法により、治療前と治療後にＣＡＥＢＶ患者４名からそれぞれ採取した血液検体の血漿中のＦｌｔ３－Ｌ濃度を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（２）結果
　結果は、図１１に示す通りであった。ＣＡＥＢＶ患者４名のうち完全奏効が認められた２名は、治療前と比較して治療後のＦｌｔ３－Ｌの濃度が著しく低下することが確認された（図１１の患者Ａおよび患者Ｂ）。これに対し、不変であった２名は、治療前と比較して治療後のＦｌｔ３－Ｌの濃度が増加傾向にあった（図１１の患者Ｃおよび患者Ｄ）。これらの結果から、Ｆｌｔ３－ＬがＣＡＥＢＶに対する治療効果の指標となることが示された。

Claims (20)

  1. 　対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を測定する工程を含んでなる、慢性活動性Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス感染症（ＣＡＥＢＶ）の検出方法。
  2. 　対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を指標にして、ＣＡＥＢＶの発症の有無を判定する工程をさらに含む、請求項１に記載の検出方法。
  3. 　対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を参照値と比較する工程をさらに含む、請求項１または２に記載の検出方法。
  4. 　参照値が、ＣＡＥＢＶを罹患していない対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度に基づいて設定された値である、請求項３に記載の検出方法。
  5. 　対象の臨床情報をさらに指標にしてＣＡＥＢＶの罹患の有無を判定する、請求項１または２に記載の検出方法。
  6. 　臨床情報が、生体試料中の炎症の指標となる因子の量または濃度である、請求項５に記載の検出方法。
  7. 　生体試料が血液試料である、請求項１または２に記載の検出方法。
  8. 　ＣＡＥＢＶを検出または評価するための生体試料分析方法である、請求項１または２に記載の検出方法。
  9. 　対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を測定する工程を含んでなる、慢性活動性Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス感染症（ＣＡＥＢＶ）の疾患活動性の判定方法またはＣＡＥＢＶの予後の予測方法。
  10. 　対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を指標にして、ＣＡＥＢＶの疾患活動性またはＣＡＥＢＶの予後を評価する工程をさらに含む、請求項９に記載の疾患活動性の判定方法または予後の予測方法。
  11. 　対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を測定する工程を含んでなる、慢性活動性Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス感染症（ＣＡＥＢＶ）に対する治療効果の判定方法。
  12. 　対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を指標にして、ＣＡＥＢＶに対する治療効果の程度を評価する工程をさらに含む、請求項１１に記載の治療効果の判定方法。
  13. 　対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度と参照値とを比較する工程をさらに含む、請求項１１または１２に記載の治療効果の判定方法。
  14. 　参照値が、治療前の対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度に基づいて設定された値である、請求項１３に記載の治療効果の判定方法。
  15. 　Ｆｌｔ３阻害剤を含んでなる、慢性活動性Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス感染症（ＣＡＥＢＶ）の治療用医薬組成物。
  16. 　Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）感染細胞を治療標的とする、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 　ＥＢＶ感染細胞がＥＢＶ感染Ｔ細胞および／またはＥＢＶ感染ＮＫ細胞である、請求項１６に記載の医薬組成物。
  18. 　ＣＡＥＢＶの診断もしくは検出マーカー、ＣＡＥＢＶの疾患活動性判定マーカー、ＣＡＥＢＶの予後予測マーカーまたはＣＡＥＢＶの治療効果判定マーカーとしての、Ｆｌｔ３－Ｌの使用。
  19. 　生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度の定量手段を含んでなる、ＣＡＥＢＶの診断キット、ＣＡＥＢＶの疾患活動性判定キット、ＣＡＥＢＶの予後予測キットまたはＣＡＥＢＶの治療効果判定キット。
  20. 　対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を測定する工程と、前記対象の生体試料中のＦｌｔ３－Ｌの量または濃度を指標にして、ＣＡＥＢＶの発症の有無を判定する工程と、ＣＡＥＢＶを発症していると判定された前記対象に、ＣＡＥＢＶに対する治療を実施する工程とを含んでなる、ＣＡＥＢＶの治療方法。
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