WO2023157673A1 - エレクトロポレーションデバイス - Google Patents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
- C12M1/42—Apparatus for the treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
Definitions
- the present invention relates to electroporation devices.
- Electroporation is a method of introducing substances into cells by opening holes in the cell membrane with electric pulses, and is also called electroporation. For example, by applying an electric field to a cell suspension using a pair of electrodes, micropores are opened in the cell membrane and DNA (deoxyribonucleic acid) is introduced into the cell, thereby transforming the cell.
- DNA deoxyribonucleic acid
- Batch type is widely used.
- a suspension containing a biological substance and a bioactive substance is placed in a container having an electrode pair installed on the inner surface thereof, and an electric field is applied by the electrode pair.
- micropores are formed in the membrane covering the surface of the biological material, and the permeability of the membrane is increased.
- the bioactive substance is introduced into the biological substance by passing through the membrane with increased permeability by diffusion or electrophoresis.
- flow-type electroporation has also been developed in which a suspension containing a biological substance and a bioactive substance is circulated in a channel in which an electrode pair is installed (for example, Patent Document 1).
- the flow type is suitable for processing a large amount of suspension.
- biological substances such as cells may be damaged by the application of an electric field, heat generation of the suspension, poisoning by the materials that make up the electroporation device, etc. Such damage may lead to the death of the biologically-derived substance or the bioactive substance, and as a result, may lead to a decrease in the efficiency of introduction (the ratio of the bioactive substance introduced into the biologically-derived substance subjected to electroporation).
- an object of the present invention is to provide an electroporation device in which introduction efficiency is less likely to decrease.
- the present inventor has earnestly studied the above problem. Specifically, flow-type electroporation and repeated batch-type electroporation were performed using various electrode pairs, and changes over time in the survival rate and transfection efficiency of biological substances such as cells were investigated. .
- various electrodes such as an electrode plated with Pt (platinum) (Pt film electrode) and an electrode plated with Au (gold) (Au film electrode) whose viability is unlikely to decrease
- Pt film electrode platinum
- Au film electrode gold
- the present inventors have found that when an electrode having a boron-doped diamond film at a site is used, not only the survival rate is less likely to decrease, but also the introduction efficiency is less likely to specifically decrease, leading to the present invention. That is, the inventors have found that the above problems can be solved by the following configuration.
- An electroporation device that introduces the biologically active substance into the biologically derived substance by applying an electric field to a suspension containing the biologically derived substance and the biologically active substance using a pair of electrodes. hand, An electroporation device, wherein each electrode of the electrode pair has a boron-doped diamond film on the surface portion in contact with the suspension.
- the metal material of the metal substrate contains at least one selected from the group consisting of Mo, Nb, W and Ti.
- the electroporation device according to any one of the above (1) to (9) which has a boron-doped diamond film.
- the electroporation device according to any one of (1) to (10) above comprising a cooling mechanism for cooling each of the electrodes.
- the electroporation device according to any one of (1) to (11), which is used for repeated batch-type electroporation, A container for containing the suspension, An electroporation device, wherein the electrode pairs are placed on the inner surface of the container such that the boron-doped diamond films of each electrode face each other.
- the electroporation device according to any one of (1) to (11) above, which is used for flow-type electroporation, Equipped with a flow path for flowing the suspension, The electroporation device, wherein the pair of electrodes are placed across the channel so that the boron-doped diamond films of the electrodes face each other.
- FIG. 1 is a top view showing an example of an electroporation device according to the first embodiment
- FIG. FIG. 1B is a cross-sectional view taken along line 1B-1B in FIG. 1A
- 4 is a cross-sectional view of an upper electrode 41a and a lower electrode 41b
- FIG. FIG. 4 is a top view showing a modification of the electroporation device according to the first embodiment
- FIG. 1E is a cross-sectional view taken along line 1E-1E in FIG. 1D
- FIG. 4B is a cross-sectional view of an upper electrode 42a and a lower electrode 42b of an example of electroporation according to the second embodiment
- FIG. 11 is a cross-sectional view of an upper electrode 43a and a lower electrode 43b of an example of electroporation according to the third embodiment;
- FIG. 11 is a cross-sectional view of an upper electrode 44a and a lower electrode 44b of an example of electroporation according to the fourth embodiment;
- FIG. 11 is a cross-sectional view showing an example of an electroporation device according to a fifth embodiment;
- the electroporation device of the present invention will be described below.
- the first to fifth embodiments apply to devices used for flow-type electroporation
- the sixth embodiment applies to devices used for batch-type electroporation.
- the electroporation device of the present invention is particularly useful for flow-type electroporation for processing a large amount of suspension, since the introduction efficiency is unlikely to decrease.
- a numerical range represented by “to” means a range including the numerical values before and after “to” as lower and upper limits.
- the "suspension containing a biologically derived substance and a bioactive substance” may be simply referred to as a “suspension”
- the "boron-doped diamond film” may be referred to as a "BDD film”.
- Surface part is also called “liquid contact part”
- electrowetting is also called “EP”
- electroroporation device is also called an "EP device”.
- the fact that the introduction efficiency is difficult to decrease and the initial introduction efficiency is high are also collectively referred to as "the effects of the present invention are excellent.”
- the electroporation device comprises It is used for flow-type electroporation, in which the bioactive substance is introduced into the biological substance by applying an electric field to the suspension containing the biological substance and the bioactive substance using a pair of electrodes.
- an electroporation device comprising: each electrode of the electrode pair has a boron-doped diamond film on a surface portion in contact with the suspension; Equipped with a flow path for flowing the suspension, In the electroporation device, the pair of electrodes are placed across the flow channel so that the boron-doped diamond films of the electrodes face each other.
- FIG. 1A is a top view showing an example of an electroporation device according to a first embodiment
- FIG. 1B is a cross-sectional view along line 1B-1B in FIG. 1A
- FIG. 1C is a cross-sectional view of the upper electrode 41a and the lower electrode 41b.
- the electroporation device 100 includes an upper electrode holding plate 10, a channel plate 30, and a lower electrode holding plate 20 in this order.
- the channel plate 30 has openings 32 that serve as channels.
- the upper electrode holding plate 10 has an inlet 50 and an outlet 52 communicating with the opening 32 of the channel plate 30 .
- the opening 32 of the channel plate 30 and the inlet 50 and outlet of the upper electrode holding plate 10 52 form the flow path 32 .
- suspension is injected through inlet 50 , through channel 32 , and discharged through outlet 52 .
- Suspension tubes may be connected to the inflow port 50 and the outflow port 52 .
- the lower electrode holding plate 20 may have the inlet 50 and the outlet 52 instead of the upper electrode holding plate 10.
- the upper electrode holding plate 10 has one and the lower electrode holding plate 20 has the other. It's okay. Between the upper electrode holding plate 10 and the flow channel plate 30 and between the lower electrode holding plate 20 and the flow channel plate 30, it is preferable to provide an O-ring for preventing liquid leakage of the suspension.
- the upper electrode 41a is fitted in the upper electrode holding plate 10.
- a lower electrode 41b is fitted in the lower electrode holding plate 20.
- the upper electrode 41 a and the lower electrode 41 b constitute an electrode pair 41 .
- the surface portion a1 of the upper electrode and the surface portion b1 of the lower electrode face each other with the channel 32 interposed therebetween. That is, the electrode pair 41 is installed with the flow path 32 interposed therebetween.
- the surface portions a1 and b1 are surface portions in contact with the channel 32, and are surface portions in contact with the suspension when the EP device is used.
- the method of fixing the upper electrode holding plate 10, the channel plate 30, and the lower electrode holding plate 20 is not particularly limited, but a method of forming through-holes for assembly in each plate and fixing with screws, or fixing with an adhesive. methods and the like.
- the upper electrode holding plate 10 has a through hole (not shown) for electrically connecting to the back surface portion a2, which is the surface portion opposite to the surface portion a1 of the upper electrode 41a.
- the lower electrode holding plate 20 has a through-hole (not shown) for electrical connection to the back surface portion b2, which is the surface portion opposite to the surface portion b1 of the lower electrode 41b.
- the upper electrode 41a and the lower electrode 41b are connected to an external power source (not shown) through through holes.
- the upper electrode 41a and the lower electrode 41b are composed of a support m11 and a BDD film m12 which is a coating layer covering the support m11.
- the upper electrode 41a and the lower electrode 41b have BDD films m12 on surface portions a1 and b1 in contact with the channel 32 . That is, each electrode (upper electrode 41a, lower electrode 41b) of the electrode pair 41 has the BDD film m12 on the surface portion (liquid contact portion) in contact with the suspension.
- Electrode length L is not particularly limited, it is preferably 1 to 100 mm, more preferably 10 to 50 mm, for the reason that the effects of the present invention are more excellent.
- the electrode width W which is the width of the upper electrode 41a and the width of the lower electrode 41b, is not particularly limited. is more preferred, and 5 to 25 mm is particularly preferred. It is preferably 5 to 25 mm for the reason that the initial introduction efficiency is excellent. Note that the width of the upper electrode 41 a and the lower electrode 41 b does not mean the actual width of the electrodes, but the width of the portion of the electrodes that contacts the channel, which corresponds to the width of the channel 32 .
- the interelectrode distance D (the distance between the upper electrode 41a and the lower electrode 41b) of the electrode pair 41 is preferably 1 to 10 mm, more preferably 2 to 5 mm, for the reason that the effects of the present invention are more excellent. preferable. Since the BDD membrane electrode generally has a high generation efficiency of reactive oxygen species due to a high oxygen overvoltage and a wide potential window, if the distance D between the electrodes becomes too small, the electrode surface area/electrode space volume ratio becomes large, and the activity , and the impact of oxygen species on the suspension may be increased, reducing the viability of biologics such as cells. Also, from the viewpoint of the processing flow rate, it is preferably 3 to 6 mm.
- the inter-electrode distance D becomes too large, an excessive electric field is generated, causing heat generation and concentration of the electric field at the end of the electrode, causing boiling and discharge, and reducing the survival rate and introduction efficiency.
- the inter-electrode distance D corresponds to the thickness of the channel plate 30 .
- the inter-electrode distance D is also referred to as inter-electrode gap or gap.
- a voltage for example, pulse voltage
- an external power source not shown
- an electric field is formed between the upper electrode 41a and the lower electrode 41b.
- the suspension is injected from the inflow port 50
- the injected suspension passes through the channel 32 and is discharged from the outflow port 52 .
- an electric field is applied, so that micropores are formed in the membrane covering the surface of the biological material in the suspension, increasing the permeability of the membrane.
- the bioactive substance in suspension is introduced into the biological material by diffusion or electrophoresis.
- Suspensions used for electroporation contain biologics and bioactive substances.
- the biological material is not particularly limited, but specific examples include cells, organelles, intracellular granules, vesicles, bacteria, and the like. Among them, cells are preferred, animal cells are more preferred, mammalian cells are even more preferred, and human-derived cells are most preferred, because the effects of the present invention are more excellent. Specific examples of cells include human T cells, HEK (Human Embryonic Kidney) 293 cells, A549, SF9, EB66, Daudi, Hela, Vero, MDCK, BHK (Baby Hamster Kidney), CHO (Chinese Hamster Ovary), NS0 , SP2/0, hybridomas, and the like. In terms of pharmaceutical production, gene transfer in HEK293 cells and CHO cells is most used.
- a biologically active substance is a substance such as DNA, RNA, or protein that, when introduced into a biological substance, exerts some action on the biological substance.
- plasmids there are plasmids, linear DNA, mRNA, and proteins, with plasmids, mRNA, and linear DNA being preferred, and plasmids being particularly preferred.
- the voltage is set according to the inter-electrode gap so that the electric field applied to the suspension between the electrodes has a desired electric field strength.
- the electric field strength applied to the suspension between the electrodes is the value obtained by dividing the voltage applied from the external power supply by the thickness of the gap between the electrodes. A uniform electric field is formed regardless of the position of the liquid surface.
- the electrical resistance in the thickness direction and in-plane direction of the electrode is high, part of the voltage applied from the external power source is consumed in the electrode portion, and the effective applied electric field strength to the suspension is reduced.
- an electric field intensity distribution occurs within the wetted surface, causing a decrease in electroporation efficiency.
- the optimum value of the electric field varies depending on the type of biological material, etc., but is usually about 1000 to 2000 V/cm.
- the voltage is a pulse voltage.
- Bipolar pulses (alternating positive and negative) may also be used in order to equalize electrode reactions (gas generation due to electrolysis, electrode deterioration, etc.).
- the pulse period should be synchronized (integer multiple) with the time (determined by the flow rate and the cross-sectional area of the flow path (electrode width W ⁇ inter-electrode distance D)) for the biological substance to pass through the electrode (electrode length L).
- the pulse voltage is applied 1 to 5 times, preferably 1 time on average, while the biological substance passes through the electrode (electrode length L).
- FIG. 1D is a top view showing a modification of the electroporation device according to the first embodiment
- FIG. 1E is a cross-sectional view along line 1E-1E in FIG. 1D.
- the back surface portion a2 of the upper electrode 41a and the back surface portion b2 of the lower electrode 41b are connected to the external power source through the through-holes.
- an external power supply (not shown) is connected through the through hole 70 to the surface portion a1 of the upper electrode 41a, and similarly through the through hole 72 to the surface portion b1 of the lower electrode 41b.
- a power supply (not shown) is connected.
- the upper electrode 41a and the lower electrode 41b have the BDD film m12 on the surface portions a1 and b1. That is, in the electroporation device 110, the external power supply is directly connected to the BDD films m12 of the upper electrode 41a and the lower electrode 41b. Electroporation device 110 is useful, for example, when support m11 is a material other than metal (eg, Si).
- FIG. 2 is a cross-sectional view of an upper electrode 42a and a lower electrode 42b of an example of electroporation according to the second embodiment.
- the upper electrode 42a and the lower electrode 42b are composed of a support m21 and a BDD film m22 which is a coating layer covering the support m21.
- the upper electrode 42 a and the lower electrode 42 b constitute an electrode pair 42 .
- the upper electrode 42a and the lower electrode 42b have BDD films m22 on surface portions a1 and b1 in contact with the channel 32 . That is, each electrode (upper electrode 42a, lower electrode 42b) of the electrode pair 42 has the BDD film m22 on the surface portion (liquid contact portion) in contact with the suspension.
- the upper electrode 42a and the lower electrode 42b are continuous from the surface portions a1 and b1, and extend from the side portions a3 and b3 in the electrode thickness direction (from one electrode of the electrode pair 42).
- the BDD film m22 is also present in a half or more portion or a portion of 0.5 mm or more (preferably 2 mm or more) in the direction toward the other electrode. It is preferable that 60% or more of the area of the side portion is covered, more preferably 80% or more is covered, and more preferably 95% or more is covered.
- FIG. 3 is a cross-sectional view of an upper electrode 43a and a lower electrode 43b of an example of electroporation according to the third embodiment.
- the upper electrode 43a and the lower electrode 43b are composed of a support m31 and a BDD film m32 which is a coating layer covering the support m31.
- the upper electrode 43 a and the lower electrode 43 b constitute an electrode pair 43 .
- the upper electrode 43a and the lower electrode 43b have BDD films m32 on surface portions a1 and b1 in contact with the channel 32 . That is, each electrode (upper electrode 43a, lower electrode 43b) of the electrode pair 43 has the BDD film m32 on the surface portion (liquid contact portion) that contacts the suspension.
- the upper electrode 43a and the lower electrode 43b have BDD films m32 on the side portions a3 and b3 continuously from the surface portions a1 and b1. Therefore, compared with the above-described first embodiment, the effect that the introduction efficiency is less likely to decrease can be obtained.
- FIG. 4 is a cross-sectional view of an upper electrode 44a and a lower electrode 44b of an example of electroporation according to the fourth embodiment.
- the upper electrode 44a and the lower electrode 44b are composed of a support m41 and a BDD film m42 which is a coating layer covering the support m41.
- the upper electrode 44 a and the lower electrode 44 b constitute an electrode pair 44 .
- the upper electrode 44a and the lower electrode 44b have BDD films m42 on the surface portions a1 and b1 in contact with the channel 32 . That is, each electrode (upper electrode 44a, lower electrode 44b) of the electrode pair 44 has the BDD film m42 on the surface portion (liquid contact portion) in contact with the suspension.
- the upper electrode 44a and the lower electrode 44b also have a BDD film m42 on the side surface portions a3 and b3 and the back surface portions a2 and b2 continuously from the surface portions a1 and b1. Therefore, compared with the above-described first embodiment, the effect that the introduction efficiency is less likely to decrease can be obtained.
- FIG. 5 is a cross-sectional view showing an example of an electroporation device according to the fifth embodiment.
- Electroporation device 500 shown in FIG. 5 is the same as electroporation device 100 shown in FIGS. 1A and 1B except that upper electrode cooling channel 60 and lower electrode cooling channel 62 are added.
- an upper electrode cooling channel 60 is formed on the back surface portion a2 side of the upper electrode 41a.
- a lower electrode cooling channel 62 is formed on the back surface portion b2 side of the lower electrode 41b. Coolant tubes may be attached to the inlets and outlets of the upper electrode cooling channel 60 and the lower electrode cooling channel 62, respectively.
- the electrode pair When using the EP device, the electrode pair generates heat. As a result, damage to biological substances and bioactive substances in the suspension progresses, which may lead to a decrease in survival rate and introduction efficiency.
- heat generation of the electrode pair can be suppressed by flowing a coolant (cooling water, etc.) through the upper electrode cooling channel 60 and the lower electrode cooling channel 62, the survival rate and the introduction rate can be reduced. A decrease in efficiency can be further suppressed.
- the electroporation device comprises It is used for batch-type electroporation in which the bioactive substance is introduced into the biological material by applying an electric field to the suspension containing the biological material and the biologically active substance using a pair of electrodes.
- an electroporation device comprising: each electrode of the electrode pair has a boron-doped diamond film on a surface portion in contact with the suspension; A container for containing the suspension, An electroporation device, wherein the electrode pairs are placed on the inner surface of the container such that the boron-doped diamond films of each of the electrodes face each other.
- the electroporation device according to the sixth embodiment may be of a single batch type or a repeated batch type, but is preferably of a repeated batch type.
- BDD membrane electrode As described above, in the present invention, an electrode (BDD film electrode) having a boron-doped diamond film (BDD film) in the wetted portion is used.
- the BDD membrane electrode preferably includes a support and the BDD membrane covering the support because the effects of the present invention are more excellent.
- a BDD film is a diamond film doped with boron and has electrical conductivity.
- the boron content of the BDD film (hereinafter also referred to as "B content") is preferably 100 to 10000 ppm, more preferably 1000 to 40000 ppm, more preferably 2000 ppm, for the reason that the effects of the present invention are more excellent. More preferably ⁇ 10000 ppm.
- the resistivity of the BDD film is reduced, and as a result, the electric field applied to the suspension is increased, the ohmic loss (heat generation) at the electrode is reduced, and the in-plane voltage distribution of the electrode is suppressed.
- the B content is preferably 100 ppm or more. Also, from the viewpoint of film strength and durability, the B content is preferably 10000 ppm or less.
- the boron content of the BDD film can be calculated from the elemental ratio of C and B measured by X-ray electron spectroscopy (XPS) after cutting the substrate formed in the same film formation batch into small pieces.
- XPS X-ray electron spectroscopy
- the film thickness of the BDD film is preferably 2 to 20 ⁇ m, more preferably 5 to 10 ⁇ m, for the reason that the effects of the present invention are more excellent. From the viewpoint of durability against pinholes and the like, it is preferable that the thickness of the BDD film is 2 ⁇ m or more. In addition, from the viewpoint of suppressing film stress and improving adhesion of the BDD film, the thickness is preferably 20 ⁇ m or less.
- the film thickness of the BDD film can be calculated from the difference in mass before and after film formation, assuming that the specific gravity of diamond is 3.52 g/cm 3 .
- the resistivity of the BDD film is preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 3 to 1 ⁇ 10 ⁇ 1 ⁇ cm, more preferably 2 ⁇ 10 ⁇ 3 to 1 ⁇ 10 ⁇ 2 ⁇ cm, for the reason that the effects of the present invention are more excellent. - It is more preferable that it is cm. As the electric field applied to the suspension increases, the ohmic loss (heat generation) at the electrode decreases, and the voltage distribution in the electrode surface is suppressed, so the resistivity is 1 ⁇ 10 -1 ⁇ cm or less. is preferably In terms of film strength and durability, the resistivity is preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 3 ⁇ cm or more.
- the resistivity of the BDD film can be calculated by dividing the measured sheet resistance of the BDD film on the high resistance silicon substrate formed in the same film formation batch by the film thickness.
- the support is not particularly limited, and may be a substrate other than metal (for example, Si (silicon) substrate, SiC substrate) or a metal substrate.
- a substrate is preferred.
- the metal material of the metal substrate is not particularly limited. ), W (tungsten) or Ti (titanium), and more preferably Mo.
- the thickness of the support is not particularly limited, it is preferably 0.5 to 10 mm, more preferably 1 to 5 mm, for the reason that the effects of the present invention are more excellent.
- the thickness of the BDD membrane electrode is not particularly limited, it is preferably 0.5 to 10 mm, more preferably 1 to 5 mm, because the effects of the present invention are more excellent.
- the method for forming the BDD film on the support is not particularly limited, and a known method for forming a diamond film can be used. Examples thereof include a hot filament CVD (chemical vapor deposition) method, a microwave plasma CVD method, an ion beam irradiation method, and a plating method. Among them, the hot filament CVD method is preferable because the effect of the present invention and the like for the obtained electroporation device are more excellent.
- a specific method for producing a BDD film using the hot filament CVD method for example, a mixed gas of high-purity hydrogen, a carbon source, and a boron source is supplied using a hot filament CVD apparatus.
- Carbon sources include, for example, methane and ethane.
- Boron sources include, for example, trimethylborate (B(OCH 3 ) 3 ), triethylborate (B(OC 2 H 5 ) 3 ), diborane, and the like.
- Electrode holding member Materials for the upper electrode holding member and the lower electrode holding member are not particularly limited, but a material that has high workability and withstands autoclave sterilization at 121° C. for 20 minutes or more is preferable. Examples of such materials include polycarbonate, polypropylene, and the like.
- the material of the channel plate is not particularly limited, a fluorine resin material such as Teflon (registered trademark) is preferable from the viewpoint of reducing adhesion of biological substances such as cells and preventing damage due to heat generation and discharge during electroporation. If it is difficult to prevent liquid leakage with an O-ring, such as in the case of the modified example described above, it is possible to use a flexible and slightly sticky material (for example, PDMS (polydimethylsiloxane)) for the flow path plate. It can also be used as a sealing member.
- PDMS polydimethylsiloxane
- Each electroporation device was manufactured as follows.
- the upper electrode holding plate and the lower electrode holding plate were manufactured using polycarbonate. A groove for fitting the upper electrode and a through hole for electrically connecting to the upper electrode were formed in the upper electrode holding plate.
- the lower electrode holding plate was formed with a groove for fitting the lower electrode and a through hole for electrical connection to the lower electrode.
- the upper electrode holding plate was formed with through holes for the inlet and the outlet. Flow tubes were attached to the inlet and outlet. Electrode cooling channels were formed in both the upper electrode holding plate and the lower electrode holding plate. A cooling water tube was attached to the electrode cooling channel. Both the upper electrode holding plate and the lower electrode holding plate were formed with through holes for assembly and grooves for O-rings for preventing liquid leakage.
- the channel plate was manufactured using Teflon (registered trademark).
- the channel plate was formed with openings (width: 20 mm) to serve as channels and through holes for assembly.
- the thickness of the channel plate is 2 mm.
- Example 4 An EP device was fabricated in the same procedure as in Example 3, except that the deposition conditions (deposition time) were changed so that the thickness of the BDD film was 10 ⁇ m in fabricating the electrode.
- Example 5 An EP device was fabricated according to the same procedure as in Example 4, except that in fabricating the electrodes, the substrate was processed before the formation of the BDD film.
- the upper electrode and the lower electrode are Mo substrates (BDD film electrodes) coated with a BDD film from one surface to side surfaces as shown in FIG.
- the obtained BDD membrane electrode consisted of a support and a BDD membrane covering the support, and in addition to one surface portion, the side surface portion was also covered with a coating layer continuously from the surface portion as shown in FIG. It has a certain BDD film.
- Example 6 An EP device was fabricated according to the same procedure as in Example 5, except that the thickness of the channel plate was changed to 4 mm.
- Example 1 An EP device was fabricated as shown in FIGS. 1D and 1E. As in Example 3, polycarbonate was used for the upper electrode holding plate and the lower electrode holding plate. On the other hand, since it is difficult to prevent liquid leakage with an O-ring, PDMS (polydimethylsiloxane), which is flexible and slightly sticky, was used for the channel plate (the width of the opening serving as the channel: 2 mm). PDMS doubles as a channel plate and a sealing member.
- a BDD film electrode was fabricated according to the same procedure as in Example 3, except that a Si substrate (thickness: 0.7 mm) was used as the support instead of the Mo substrate.
- Example 2 An EP device was fabricated according to the same procedure as in Example 1, except that the width of the opening of the flow path plate, which serves as the flow path, was changed to 20 mm.
- Example 1 An EP device was fabricated according to the same procedure as in Example 3, except that the width of the opening serving as the flow channel was changed to 2 mm and the following Pt film electrodes were used as the upper and lower electrodes. In the obtained EP device, the electrode pairs are placed across the channel so that the Pt films of each electrode face each other.
- ⁇ Pt film electrode> A Cu substrate (support) (thickness: 2 mm) was processed into an electrode shape, followed by deburring and surface cleaning. Then, a 10 ⁇ m-thick Cu plating layer was formed as an underlayer smoothing layer, a 0.1 ⁇ m-thick Au plating layer was formed as an adhesion improving layer, and a 2 ⁇ m-thick Pt plating layer (Pt film) was formed as a surface layer.
- Example 6 An EP device was fabricated according to the same procedure as in Example 3, except that the following diamond film electrodes were used as the upper and lower electrodes. In the resulting EP device, the electrode pairs are placed across the channel so that the diamond films of each electrode face each other.
- a diamond film is formed from one surface of a Mo substrate (support) (length in the direction of flow: 20 mm, thickness: 2 mm) to a side surface by hot filament CVD (chemical vapor deposition) using a mixed gas of hydrogen and methane. was deposited (deposition temperature: 1000° C.).
- the obtained diamond film electrode consists of a support and a diamond film covering the support, and in addition to one surface portion, the diamond film as a coating layer is also present on the side surface portion continuously from the surface portion. .
- Electrode length L 20 mm, thickness: 2 mm .
- Electrode coating layer (type, coating site, B content, resistivity, film thickness)
- ⁇ Support electrode support (material, thickness)
- Electrode electrode length L, electrode width W, gap (inter-electrode distance D) of each electrode (upper electrode, lower electrode)
- the widths of the upper and lower electrodes are not the actual widths of the electrodes, but the widths of the portions of the electrodes that are in contact with the flow channel, and correspond to the width of the flow channel.
- Electroporation was performed using the resulting electroporation device.
- a cell suspension (concentration: 40 M ( ⁇ 10 6 ) cells/mL) of proliferated and cultured HEK293 cells (corresponding to a biological product) was prepared.
- a pmaxGFP plasmid (corresponding to a bioactive substance) manufactured by Lonza was added to the resulting cell suspension to a concentration of 30 ⁇ g/mL.
- a suspension containing HEK293 cells and the GFP plasmid was thus obtained.
- the resulting EP device was packed in an autoclave bag and autoclave sterilized (121° C. for 20 to 60 minutes). Inside a safety cabinet (sterile environment), the inlet of the sterilized EP device was connected to the suspension supply system and the outlet was connected to the collection system. Also, the electrode pairs of the EP device were connected to a pulse power supply.
- the suspension prepared as described above was fed from the inlet at the flow rate shown in Table 1 to carry out electroporation.
- the reason for changing the flow rate is to keep the average flow velocity constant.
- the flow rate was changed according to the cross-sectional area of the channel.
- the electroporation voltage and pulse width were adjusted so that the electric field was 1375 V/cm.
- the pulse period was synchronized with the central flow velocity so that the electric field was applied once to the suspension. Specifically, it is as shown in Table 2 below.
- a bipolar pulse (alternating positive and negative) was used in order to homogenize the electrode reaction.
- pure water (4° C.) was supplied to the electrode cooling channel (100 mL/min) in order to cool the electrodes.
- the collected suspension was diluted to 2M ( ⁇ 10 6 ) cells/mL, seeded in 2 mL on a well plate, and placed in an incubator with a CO 2 concentration of 8% and an ambient temperature of 37° C., Static culture was carried out for 24 hours.
- Table 1 shows the introduction efficiency for the 1st to 25th pulses (for 25 pulses). The higher the initial introduction efficiency, the better, and from a practical standpoint, it is preferably 20% or more.
- the maximum cumulative pulse number (endurance pulse number) at which the introduction efficiency was maintained at 90% or more of the initial introduction efficiency was determined.
- the maintenance rate introduction efficiency/initial introduction efficiency
- the number of endurance pulses was set to 800.
- the endurance pulse number was not determined (Comparative Examples 3, 5 to 6 and 8). Table 1 shows the results. The larger the endurance pulse number, the more difficult it is for the introduction efficiency to decrease. Practically, the durability pulse number is preferably 1000 or more.
- the number of introduced cells is obtained by multiplying the initial introduction efficiency by the number of treated cells.
- E represents a power of ten.
- Comparative Example 5 The initial introduction efficiency was insufficient in Comparative Example 5, in which the electrode was a copper substrate, and Comparative Example 6, in which the electrode was a diamond film electrode. Moreover, in Comparative Examples 7 and 8, in which the electrode is a conductive polymer, the durability pulse number or the initial introduction efficiency was insufficient.
- Example 2 From the comparison between Example 2 and Example 3 (comparison between aspects in which the support is different), the example in which the electrode support is a Mo substrate is compared with Example 2 in which the electrode support is a silicon substrate. 3 had a higher initial introduction efficiency (by changing the silicon substrate with high electrical resistance to a metal Mo substrate, the electrical resistance in the electrode in-plane direction decreased, , the electric field strength was uniformed, and the introduction efficiency was improved).
- Example 4 in which the BDD film thickness is 5 ⁇ m or more, had a larger endurance pulse number ( As the film thickness increases, the size and density of pinholes in the BDD film caused by the surface unevenness and particle defects of the underlying substrate are reduced.As a result, the BDD film is damaged with an increase in the cumulative number of applied pulses. It is presumed that this is because the BDD film sufficiently maintains the coverage of the underlying metal even when the erosion progresses, thereby suppressing the elution of the metal derived from the underlying substrate).
- Example 4 the BDD membrane electrode, in addition to the liquid contact part, is continuously from the liquid contact part, and the side part Examples 5 and 6, which have a BDD film on both sides, had a greater number of pulses (in Example 4, the BDD film at the electrode corners disappeared after 10,000 pulses were applied, and the base substrate was exposed. On the other hand, even if 50000 pulses were applied in Example 5 (also 6), the exposure of the base substrate at the corners of the electrode did not occur and the efficiency of gene introduction decreased. did not).
- Example 6 the gap was larger (the number of treated cells was larger) than in Example 5, and the conditions were stricter, but the number of endurance pulses was maintained by cooling the electrodes.
- Electrode holding plate 10 upper electrode holding plate 20 lower electrode holding plate 30 channel plate 32 opening (channel) 41 Electrode pair 41a Upper electrode 41b Lower electrode 42 Electrode pair 42a Upper electrode 42b Lower electrode 43 Electrode pair 43a Upper electrode 43b Lower electrode 44 Electrode pair 44a Upper electrode 44b Lower electrode 50 Inlet 52 Outlet 60 Upper electrode cooling channel 62 Lower electrode cooling channel 70 Through hole 72 Through hole 100 Electroporation device 110 Electroporation device 500 Electroporation device a1 Surface portion a2 of upper electrode Back surface portion a3 of upper electrode Side portion b1 of upper electrode Surface of lower electrode Part b2 Back part b3 of lower electrode Side part m11 Support m12 BDD film m21 Support m22 BDD film m31 Support m32 BDD film m41 Support m42 BDD film L Electrode length W Electrode width (channel width) D Inter-electrode distance (gap)
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Abstract
本発明は、導入効率が低下し難いエレクトロポレーションデバイスを提供することを課題とする。本発明のエレクトロポレーションデバイスは、生体由来物と生体活性物質とを含有する懸濁液に対して、電極対によって電界を印加することで、上記生体由来物に上記生体活性物質を導入する、エレクトロポレーションデバイスであって、上記電極対の各電極は、上記懸濁液に接する表面部分に、ホウ素ドープダイヤモンド膜を有する、エレクトロポレーションデバイスである。
Description
本発明は、エレクトロポレーションデバイスに関する。
電気穿孔法は、電気パルスにより細胞膜に孔をあけることにより細胞内に物質を導入する手法であり、エレクトロポレーションとも呼ばれる。例えば、細胞懸濁液に電極対によって電界を印加することで細胞膜に微小な孔を開け、DNA(deoxyribonucleic acid)を細胞内部に導入することで、細胞の形質転換を行うことが可能である。
電気穿孔法を用いて、細胞、細胞誘導体、細胞小器官、細胞内顆粒及び小胞等の生体由来物に、DNA、RNA(ribonucleic acid)及びタンパク質等の生体活性物質を導入するエレクトロポレーションとして、バッチ式が広く用いられている。バッチ式においては、例えば、内面に電極対が設置された容器に、生体由来物及び生体活性物質を含む懸濁液が収容され、電極対によって電界が印加される。これにより生体由来物の表面を覆う膜に微小な孔が開き、膜の透過性が高くなる。また、ここで、生体活性物質が拡散や電気泳動により、透過性が高まった膜を通過することで、生体活性物質が生体由来物へ導入される。
一方、電極対が設置された流路中に、生体由来物及び生体活性物質を含む懸濁液を流通させるフロー式のエレクトロポレーションも開発されている(例えば、特許文献1)。フロー式は大量の懸濁液の処理に適している。
エレクトロポレーションにおいては、電界の印加、懸濁液の発熱、エレクトロポレーションデバイスを構成する材料による被毒等によって、細胞等の生体由来物が損傷する場合がある。このような損傷は、生体由来物や生体活性物質の死滅等に繋がり、結果として、導入効率(エレクトロポレーションを行った生体由来物のうち生体活性物質が導入された割合)の低下に繋がる場合がある。
本発明者が従来のバッチ式のエレクトロポレーションデバイスやフロー式のエレクトロポレーションデバイスについて検討したところ、エレクトロポレーションデバイスを繰り返し使用した場合に、徐々に導入効率が低下する場合があることが明らかになった。特に、大量の懸濁液を処理するフロー式のエレクトロポレーションの場合に顕著な問題となることが明らかになった。
そこで、本発明は、上記実情を鑑みて、導入効率が低下し難いエレクトロポレーションデバイスを提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題について鋭意検討した。具体的には、種々の電極対を用いて、フロー式のエレクトロポレーションや、繰り返しのバッチ式のエレクトロポレーションを行い、細胞等の生体由来物の生存率や導入効率の経時変化を調べた。その結果、Pt(白金)がメッキされた電極(Pt膜電極)やAu(金)がメッキされた電極(Au膜電極)等、生存率が低下し難い種々の電極を見出す中で、特定の部位にホウ素ドープダイヤモンド膜を有する電極を用いた場合に、生存率が低下し難いだけでなく、導入効率が特異的に低下し難いことを見出し、本発明に至った。
すなわち、本発明者は、以下の構成により上記課題が解決できることを見出した。
すなわち、本発明者は、以下の構成により上記課題が解決できることを見出した。
(1) 生体由来物と生体活性物質とを含有する懸濁液に対して、電極対によって電界を印加することで、上記生体由来物に上記生体活性物質を導入する、エレクトロポレーションデバイスであって、
上記電極対の各電極は、上記懸濁液に接する表面部分に、ホウ素ドープダイヤモンド膜を有する、エレクトロポレーションデバイス。
(2) 上記ホウ素ドープダイヤモンド膜のホウ素含有率が、100~10000ppmである、上記(1)に記載のエレクトロポレーションデバイス。
(3) 上記ホウ素ドープダイヤモンド膜の抵抗率が、1×10-3~1×10-1Ω・cmである、上記(1)又は(2)に記載のエレクトロポレーションデバイス。
(4) 上記ホウ素ドープダイヤモンド膜の膜厚が、2~20μmである、上記(1)~(3)のいずれかに記載のエレクトロポレーションデバイス。
(5) 上記電極対の電極間距離が、1~10mmである、上記(1)~(4)のいずれかに記載のエレクトロポレーションデバイス。
(6) 上記各電極が、支持体と上記支持体を被覆する上記ホウ素ドープダイヤモンド膜とを含む、上記(1)~(5)のいずれかに記載のエレクトロポレーションデバイス。
(7) 上記支持体の厚みが、0.5~10mmである、上記(6)に記載のエレクトロポレーションデバイス。
(8) 上記支持体が、金属基板である、上記(6)又は(7)に記載のエレクトロポレーションデバイス。
(9) 上記金属基板の金属材料が、Mo、Nb、W及びTiからなる群より選択される少なくとも1種を含む、上記(8)に記載のエレクトロポレーションデバイス。
(10) 上記懸濁液に接する表面部分に加えて、上記表面部分から連続して、側面部分のうち電極の厚み方向に半分以上若しくは0.5mm以上の部分、又は、側面部分の全面にも、ホウ素ドープダイヤモンド膜を有する、上記(1)~(9)のいずれかに記載のエレクトロポレーションデバイス。
(11) 上記各電極を冷却する冷却機構を備える、上記(1)~(10)のいずれかに記載のエレクトロポレーションデバイス。
(12) 繰り返しバッチ式のエレクトロポレーションに使用される上記(1)~(11)のいずれかに記載のエレクトロポレーションデバイスであって、
上記懸濁液を収容するための容器を備え、
上記電極対が、上記各電極のホウ素ドープダイヤモンド膜が対向するように、上記容器の内面に設置されている、エレクトロポレーションデバイス。
(13) フロー式のエレクトロポレーションに使用される上記(1)~(11)のいずれかに記載のエレクトロポレーションデバイスであって、
上記懸濁液を流すための流路を備え、
上記電極対が、上記各電極のホウ素ドープダイヤモンド膜が対向するように、上記流路を挟んで設置されている、エレクトロポレーションデバイス。
上記電極対の各電極は、上記懸濁液に接する表面部分に、ホウ素ドープダイヤモンド膜を有する、エレクトロポレーションデバイス。
(2) 上記ホウ素ドープダイヤモンド膜のホウ素含有率が、100~10000ppmである、上記(1)に記載のエレクトロポレーションデバイス。
(3) 上記ホウ素ドープダイヤモンド膜の抵抗率が、1×10-3~1×10-1Ω・cmである、上記(1)又は(2)に記載のエレクトロポレーションデバイス。
(4) 上記ホウ素ドープダイヤモンド膜の膜厚が、2~20μmである、上記(1)~(3)のいずれかに記載のエレクトロポレーションデバイス。
(5) 上記電極対の電極間距離が、1~10mmである、上記(1)~(4)のいずれかに記載のエレクトロポレーションデバイス。
(6) 上記各電極が、支持体と上記支持体を被覆する上記ホウ素ドープダイヤモンド膜とを含む、上記(1)~(5)のいずれかに記載のエレクトロポレーションデバイス。
(7) 上記支持体の厚みが、0.5~10mmである、上記(6)に記載のエレクトロポレーションデバイス。
(8) 上記支持体が、金属基板である、上記(6)又は(7)に記載のエレクトロポレーションデバイス。
(9) 上記金属基板の金属材料が、Mo、Nb、W及びTiからなる群より選択される少なくとも1種を含む、上記(8)に記載のエレクトロポレーションデバイス。
(10) 上記懸濁液に接する表面部分に加えて、上記表面部分から連続して、側面部分のうち電極の厚み方向に半分以上若しくは0.5mm以上の部分、又は、側面部分の全面にも、ホウ素ドープダイヤモンド膜を有する、上記(1)~(9)のいずれかに記載のエレクトロポレーションデバイス。
(11) 上記各電極を冷却する冷却機構を備える、上記(1)~(10)のいずれかに記載のエレクトロポレーションデバイス。
(12) 繰り返しバッチ式のエレクトロポレーションに使用される上記(1)~(11)のいずれかに記載のエレクトロポレーションデバイスであって、
上記懸濁液を収容するための容器を備え、
上記電極対が、上記各電極のホウ素ドープダイヤモンド膜が対向するように、上記容器の内面に設置されている、エレクトロポレーションデバイス。
(13) フロー式のエレクトロポレーションに使用される上記(1)~(11)のいずれかに記載のエレクトロポレーションデバイスであって、
上記懸濁液を流すための流路を備え、
上記電極対が、上記各電極のホウ素ドープダイヤモンド膜が対向するように、上記流路を挟んで設置されている、エレクトロポレーションデバイス。
以下に示すように、本発明によれば、導入効率が低下し難いエレクトロポレーションデバイスを提供することができる。
以下、本発明のエレクトロポレーションデバイスの各実施態様について説明する。
ここで、第1~5の実施態様はフロー式のエレクトロポレーションに使用されるデバイスに該当し、第6の実施態様はバッチ式のエレクトロポレーションに使用されるデバイスに該当する。なお、本発明のエレクトロポレーションデバイスは、導入効率が低下し難いため、大量の懸濁液を処理するフロー式のエレクトロポレーションに特に有用である。
ここで、第1~5の実施態様はフロー式のエレクトロポレーションに使用されるデバイスに該当し、第6の実施態様はバッチ式のエレクトロポレーションに使用されるデバイスに該当する。なお、本発明のエレクトロポレーションデバイスは、導入効率が低下し難いため、大量の懸濁液を処理するフロー式のエレクトロポレーションに特に有用である。
また、本明細書において「~」を用いて表される数値範囲は、「~」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
また、「生体由来物と生体活性物質とを含有する懸濁液」を単に「懸濁液」とも言い、「ホウ素ドープダイヤモンド膜」を「BDD膜」とも言い、「電極の懸濁液に接する表面部分」を「接液部分」とも言い、「接液部分にBDD膜を有する電極」を「BDD膜電極」とも言い、「エレクトロポレーション」を「EP」とも言い、「エレクトロポレーションデバイス」を「EPデバイス」とも言う。
また、導入効率が低下し難いこと、初期導入効率が高いことを、まとめて「本発明の効果等が優れる」とも言う。
また、「生体由来物と生体活性物質とを含有する懸濁液」を単に「懸濁液」とも言い、「ホウ素ドープダイヤモンド膜」を「BDD膜」とも言い、「電極の懸濁液に接する表面部分」を「接液部分」とも言い、「接液部分にBDD膜を有する電極」を「BDD膜電極」とも言い、「エレクトロポレーション」を「EP」とも言い、「エレクトロポレーションデバイス」を「EPデバイス」とも言う。
また、導入効率が低下し難いこと、初期導入効率が高いことを、まとめて「本発明の効果等が優れる」とも言う。
[第1の実施態様]
本発明の第1の実施態様に係るエレクトロポレーションデバイスは、
生体由来物と生体活性物質とを含有する懸濁液に対して、電極対によって電界を印加することで、上記生体由来物に上記生体活性物質を導入する、フロー式のエレクトロポレーションに使用されるエレクトロポレーションデバイスであって、
上記電極対の各電極は、上記懸濁液に接する表面部分に、ホウ素ドープダイヤモンド膜を有し、
上記懸濁液を流すための流路を備え、
上記電極対が、上記各電極のホウ素ドープダイヤモンド膜が対向するように、上記流路を挟んで設置されている、エレクトロポレーションデバイスである。
本発明の第1の実施態様に係るエレクトロポレーションデバイスは、
生体由来物と生体活性物質とを含有する懸濁液に対して、電極対によって電界を印加することで、上記生体由来物に上記生体活性物質を導入する、フロー式のエレクトロポレーションに使用されるエレクトロポレーションデバイスであって、
上記電極対の各電極は、上記懸濁液に接する表面部分に、ホウ素ドープダイヤモンド膜を有し、
上記懸濁液を流すための流路を備え、
上記電極対が、上記各電極のホウ素ドープダイヤモンド膜が対向するように、上記流路を挟んで設置されている、エレクトロポレーションデバイスである。
以下、本発明の第1の実施態様に係るエレクトロポレーションデバイスについて、図面を用いて説明する。
図1Aは、第1の実施態様に係るエレクトロポレーションデバイスの一例を示す上面図である。図1Bは、図1Aにおける1B-1B線に沿った断面図である。図1Cは、上部電極41a及び下部電極41bの断面図である。
図1Aは、第1の実施態様に係るエレクトロポレーションデバイスの一例を示す上面図である。図1Bは、図1Aにおける1B-1B線に沿った断面図である。図1Cは、上部電極41a及び下部電極41bの断面図である。
図1Bに示すように、エレクトロポレーションデバイス100は、上部電極保持板10と、流路板30と、下部電極保持板20とをこの順に備える。
流路板30には、流路となる開口部32が空いている。上部電極保持板10は、流路板30の開口部32に連通する流入口50及び流出口52を有する。上述のとおり、流路板30は上部電極保持板10及び下部電極保持板20によって挟まれているため、流路板30の開口部32、並びに、上部電極保持板10の流入口50及び流出口52によって、流路32が形成されている。EPデバイス使用時には、懸濁液は、流入口50から注入されて、流路32を通って、流出口52から排出される。流入口50及び流出口52には、懸濁液用のチューブが接続されていてもよい。なお、上部電極保持板10の代わりに下部電極保持板20が流入口50及び流出口52を有するのでもよく、上部電極保持板10が一方を有し、下部電極保持板20が他方を有するのでもよい。上部電極保持板10と流路板30との間、及び、下部電極保持板20と流路板30との間には、懸濁液の液漏れ防止用のOリングがあることが好ましい。
上部電極保持板10には上部電極41aが嵌め込まれている。また、下部電極保持板20には下部電極41bが嵌め込まれている。上部電極41a及び下部電極41bは電極対41を構成する。上部電極の表面部分a1と下部電極の表面部分b1とは流路32を介して対向している。すなわち、電極対41が流路32を挟んで設置されている。表面部分a1及びb1は、流路32に接する表面部分であり、EPデバイス使用時には、懸濁液に接する表面部分となる。
上部電極保持板10と流路板30と下部電極保持板20とを固定する方法は特に制限されないが、各板に組み付け用の貫通孔を形成してネジで固定する方法、接着剤で固定する方法等が挙げられる。
上部電極保持板10には、上部電極41aの表面部分a1とは反対側の表面部分である裏面部分a2に通電接続するための貫通孔(図示せず)がある。同様に、下部電極保持板20には、下部電極41bの表面部分b1とは反対側の表面部分である裏面部分b2に通電接続するための貫通孔(図示せず)がある。上部電極41a及び下部電極41bは貫通孔を通して外部電源(図示せず)に接続されている。
図1Cに示すように、上部電極41a及び下部電極41bは、支持体m11と支持体m11を被覆する被覆層であるBDD膜m12とからなる。
上部電極41a及び下部電極41bは、流路32に接する表面部分a1及びb1にBDD膜m12を有する。すなわち、電極対41の各電極(上部電極41a、下部電極41b)は、懸濁液に接する表面部分(接液部分)にBDD膜m12を有する。
上部電極41a及び下部電極41bは、流路32に接する表面部分a1及びb1にBDD膜m12を有する。すなわち、電極対41の各電極(上部電極41a、下部電極41b)は、懸濁液に接する表面部分(接液部分)にBDD膜m12を有する。
〔電極長L〕
電極長Lは特に制限されないが、本発明の効果等がより優れる理由から、1~100mmであることが好ましく、10~50mmであることがより好ましい。
電極長Lは特に制限されないが、本発明の効果等がより優れる理由から、1~100mmであることが好ましく、10~50mmであることがより好ましい。
〔電極幅W〕
上部電極41aの幅、及び、下部電極41bの幅である電極幅Wは特に制限されないが、本発明の効果等がより優れる理由から、1~100mmであることが好ましく、2~30mmであることがより好ましく、5~25mmであることが特に好ましい。
初期導入効率が優れる理由から、5~25mmであることが好ましい。
なお、上部電極41a及び下部電極41bの幅とは、電極の実際の幅ではなく、電極のうち流路に接する部分の幅であり、流路32の幅に相当する。
上部電極41aの幅、及び、下部電極41bの幅である電極幅Wは特に制限されないが、本発明の効果等がより優れる理由から、1~100mmであることが好ましく、2~30mmであることがより好ましく、5~25mmであることが特に好ましい。
初期導入効率が優れる理由から、5~25mmであることが好ましい。
なお、上部電極41a及び下部電極41bの幅とは、電極の実際の幅ではなく、電極のうち流路に接する部分の幅であり、流路32の幅に相当する。
〔電極間距離D〕
電極対41の電極間距離D(上部電極41aと下部電極41bとの距離)は、本発明の効果等がより優れる理由から、1~10mmであることが好ましく、2~5mmであることがより好ましい。
BDD膜電極は一般的に高い酸素過電圧と広い電位窓に起因して活性酸素種の生成効率が高いため、電極間距離Dが小さくなり過ぎると、電極表面積/電極空間体積比が大きくなり、活性、及び、懸濁液に対する酸素種の影響が増大し、細胞等の生体由来物の生存率が低下する場合がある。また、処理流量の点からは3~6mmであることが好ましい。
一方、電極間距離Dが大きくなり過ぎると、必要以上の電界が発生し、発熱や、電極端部への電界集中が生じ、沸騰や放電が発生して、生存率や導入効率が低下する場合がある。発熱を防ぐ点からは、1~3mmであることが好ましい。
なお、電極間距離Dは、流路板30の厚みに相当する。
本明細書において、電極間距離Dを、電極間ギャップ、ギャップともいう。
電極対41の電極間距離D(上部電極41aと下部電極41bとの距離)は、本発明の効果等がより優れる理由から、1~10mmであることが好ましく、2~5mmであることがより好ましい。
BDD膜電極は一般的に高い酸素過電圧と広い電位窓に起因して活性酸素種の生成効率が高いため、電極間距離Dが小さくなり過ぎると、電極表面積/電極空間体積比が大きくなり、活性、及び、懸濁液に対する酸素種の影響が増大し、細胞等の生体由来物の生存率が低下する場合がある。また、処理流量の点からは3~6mmであることが好ましい。
一方、電極間距離Dが大きくなり過ぎると、必要以上の電界が発生し、発熱や、電極端部への電界集中が生じ、沸騰や放電が発生して、生存率や導入効率が低下する場合がある。発熱を防ぐ点からは、1~3mmであることが好ましい。
なお、電極間距離Dは、流路板30の厚みに相当する。
本明細書において、電極間距離Dを、電極間ギャップ、ギャップともいう。
〔エレクトロポレーション〕
次に、第1の実施態様のエレクトロポレーションデバイスを用いたエレクトロポレーションについて、エレクトロポレーションデバイス100を用いて説明する。
次に、第1の実施態様のエレクトロポレーションデバイスを用いたエレクトロポレーションについて、エレクトロポレーションデバイス100を用いて説明する。
エレクトロポレーションデバイス100において、電極対41には外部電源(図示せず)によって電圧(例えば、パルス電圧)が印加されている。これにより、上部電極41aと下部電極41bとの間には、電界が形成されている。
流入口50から懸濁液を注入すると、注入された懸濁液は流路32を通って、流出口52から排出される。懸濁液が流路32を通るとき、電界が印加されるため、懸濁液中の生体由来物の表面を覆う膜に微小な孔が開き、膜の透過性が高くなる。結果として、懸濁液中の生体活性物質が拡散や電気泳動により生体由来物中に導入される。
流入口50から懸濁液を注入すると、注入された懸濁液は流路32を通って、流出口52から排出される。懸濁液が流路32を通るとき、電界が印加されるため、懸濁液中の生体由来物の表面を覆う膜に微小な孔が開き、膜の透過性が高くなる。結果として、懸濁液中の生体活性物質が拡散や電気泳動により生体由来物中に導入される。
<懸濁液>
エレクトロポレーションに使用される懸濁液は、生体由来物と生体活性物質とを含有する。
エレクトロポレーションに使用される懸濁液は、生体由来物と生体活性物質とを含有する。
(生体由来物)
生体由来物は特に制限されないが、具体例としては、細胞、細胞小器官、細胞内顆粒及び小胞や菌等が挙げられる。なかでも、本発明の効果等がより優れる理由から、細胞であることが好ましく、動物細胞であることがより好ましく、哺乳類細胞であることがさらに好ましく、ヒト由来細胞であることが最も好ましい。細胞の具体例としては、ヒトT細胞、HEK(Human Embryonic Kidny)293 cell、A549、SF9、EB66、Daudi、Hela、Vero、MDCK、BHK(Baby Hamster Kidney)、CHO(Chinese Hamster Ovary)、NS0、SP2/0、ハイブリドーマ等が挙げられる。医薬品製造の点では、HEK293細胞やCHO細胞での遺伝子導入が最も使われる。
生体由来物は特に制限されないが、具体例としては、細胞、細胞小器官、細胞内顆粒及び小胞や菌等が挙げられる。なかでも、本発明の効果等がより優れる理由から、細胞であることが好ましく、動物細胞であることがより好ましく、哺乳類細胞であることがさらに好ましく、ヒト由来細胞であることが最も好ましい。細胞の具体例としては、ヒトT細胞、HEK(Human Embryonic Kidny)293 cell、A549、SF9、EB66、Daudi、Hela、Vero、MDCK、BHK(Baby Hamster Kidney)、CHO(Chinese Hamster Ovary)、NS0、SP2/0、ハイブリドーマ等が挙げられる。医薬品製造の点では、HEK293細胞やCHO細胞での遺伝子導入が最も使われる。
(生体活性物質)
生体活性物質は、DNA、RNA及びタンパク質等の、生体由来物に導入されることにより、生体由来物に何らかの作用をもたらす物質である。例えば、プラスミド、線形DNA、mRNA、タンパク質があり、プラスミド、mRNA、線形DNAが好ましく、プラスミドが特に好ましい。
生体活性物質は、DNA、RNA及びタンパク質等の、生体由来物に導入されることにより、生体由来物に何らかの作用をもたらす物質である。例えば、プラスミド、線形DNA、mRNA、タンパク質があり、プラスミド、mRNA、線形DNAが好ましく、プラスミドが特に好ましい。
<電圧>
通常、電圧は、電極間の懸濁液に印加される電界が、所望の電界強度になるように、電極間ギャップに応じて設定する。
電極の厚み方向及び面内方向の電気抵抗が十分小さい場合、電極間の懸濁液に印加される電界強度は、外部電源からの印加電圧を電極間ギャップの厚みで除した値であり、接液面の位置に関係なく均一な電界が形成される。
一方で、電極の厚み方向及び面内方向の電気抵抗値が高い場合は、外部電源から印加された電圧の一部が電極部分で消費され、懸濁液への実効印加電界強度の低下や、接液面内での電界強度分布が発生し、エレクトロポレーション効率の低下を引き起こす。
電界の最適値は、生体由来物の種類等によって変わるが、通常、1000~2000V/cm程度である。
電圧はパルス電圧であることが好ましい。また、電極反応(電気分解によるガスの発生、電極劣化等)を均一化するためにバイポーラパルス(プラスとマイナスを交互)としてもよい。
通常、電圧は、電極間の懸濁液に印加される電界が、所望の電界強度になるように、電極間ギャップに応じて設定する。
電極の厚み方向及び面内方向の電気抵抗が十分小さい場合、電極間の懸濁液に印加される電界強度は、外部電源からの印加電圧を電極間ギャップの厚みで除した値であり、接液面の位置に関係なく均一な電界が形成される。
一方で、電極の厚み方向及び面内方向の電気抵抗値が高い場合は、外部電源から印加された電圧の一部が電極部分で消費され、懸濁液への実効印加電界強度の低下や、接液面内での電界強度分布が発生し、エレクトロポレーション効率の低下を引き起こす。
電界の最適値は、生体由来物の種類等によって変わるが、通常、1000~2000V/cm程度である。
電圧はパルス電圧であることが好ましい。また、電極反応(電気分解によるガスの発生、電極劣化等)を均一化するためにバイポーラパルス(プラスとマイナスを交互)としてもよい。
<パルス幅>
パルス幅の最適値は、生体由来物の種類等によって変わるが、通常0.1~100ms(ミリ秒)、好ましくは1~10ms程度である。
パルス幅の最適値は、生体由来物の種類等によって変わるが、通常0.1~100ms(ミリ秒)、好ましくは1~10ms程度である。
<パルス周期(パルス間隔)>
パルス周期は、生体由来物が電極(電極長L)を通過する時間(流量と流路断面積(電極幅W×電極間距離D)とによって決まる)に同期させる(整数倍にする)のが好ましい。例えば、生体由来物が電極(電極長L)を通過する間に平均して1~5回、好ましくは1回のパルス電圧を印加する。
パルス周期は、生体由来物が電極(電極長L)を通過する時間(流量と流路断面積(電極幅W×電極間距離D)とによって決まる)に同期させる(整数倍にする)のが好ましい。例えば、生体由来物が電極(電極長L)を通過する間に平均して1~5回、好ましくは1回のパルス電圧を印加する。
〔変形例〕
図1Dは、第1の実施態様に係るエレクトロポレーションデバイスの変形例を示す上面図である。図1Eは、図1Dにおける1E-1E線に沿った断面図である。
上述のとおり図1A及び図1Bに示すエレクトロポレーションデバイス100では上部電極41aの裏面部分a2及び下部電極41bの裏面部分b2に貫通孔と通して外部電源に接続されているが、図1D及び図1Eに示すエレクトロポレーションデバイス110においては、貫通孔70を通して上部電極41aの表面部分a1に外部電源(図示せず)が接続され、同様に、貫通孔72を通して下部電極41bの表面部分b1に外部電源(図示せず)が接続されている。
ここで、上述のとおり、上部電極41a及び下部電極41bは、表面部分a1及びb1にBDD膜m12を有する。すなわち、エレクトロポレーションデバイス110においては、上部電極41a及び下部電極41bのBDD膜m12に直接、外部電源が接続されている。
エレクトロポレーションデバイス110は、例えば、支持体m11が金属以外の材料(例えば、Si)である場合に有用である。
図1Dは、第1の実施態様に係るエレクトロポレーションデバイスの変形例を示す上面図である。図1Eは、図1Dにおける1E-1E線に沿った断面図である。
上述のとおり図1A及び図1Bに示すエレクトロポレーションデバイス100では上部電極41aの裏面部分a2及び下部電極41bの裏面部分b2に貫通孔と通して外部電源に接続されているが、図1D及び図1Eに示すエレクトロポレーションデバイス110においては、貫通孔70を通して上部電極41aの表面部分a1に外部電源(図示せず)が接続され、同様に、貫通孔72を通して下部電極41bの表面部分b1に外部電源(図示せず)が接続されている。
ここで、上述のとおり、上部電極41a及び下部電極41bは、表面部分a1及びb1にBDD膜m12を有する。すなわち、エレクトロポレーションデバイス110においては、上部電極41a及び下部電極41bのBDD膜m12に直接、外部電源が接続されている。
エレクトロポレーションデバイス110は、例えば、支持体m11が金属以外の材料(例えば、Si)である場合に有用である。
[第2の実施態様]
次に、本発明の第2の実施態様に係るエレクトロポレーションデバイスについて説明する。
第2の実施態様は、電極対を変更した点以外、上述した第1の実施態様と同じである。
図2は、第2の実施態様に係るエレクトロポレーションの一例の上部電極42a及び下部電極42bの断面図である。
次に、本発明の第2の実施態様に係るエレクトロポレーションデバイスについて説明する。
第2の実施態様は、電極対を変更した点以外、上述した第1の実施態様と同じである。
図2は、第2の実施態様に係るエレクトロポレーションの一例の上部電極42a及び下部電極42bの断面図である。
図2に示すように、上部電極42a及び下部電極42bは、支持体m21と支持体m21を被覆する被覆層であるBDD膜m22とからなる。上部電極42a及び下部電極42bは電極対42を構成する。
上部電極42a及び下部電極42bは、流路32に接する表面部分a1及びb1にBDD膜m22を有する。すなわち、電極対42の各電極(上部電極42a、下部電極42b)は、懸濁液に接する表面部分(接液部分)にBDD膜m22を有する。
さらに、上部電極42a及び下部電極42bは、表面部分a1及びb1に加えて、表面部分a1及びb1から連続して、側面部分a3及びb3のうち電極の厚み方向(電極対42の一方の電極から他方の電極への方向に相当)に半分以上又は0.5mm以上(好ましくは2mm以上)の部分にもBDD膜m22を有する。側面部分の面積の60%以上が被覆されていることが好ましく、80%以上が被覆されていることがより好ましく、95%以上被覆されていることがより好ましい。
上部電極42a及び下部電極42bは、流路32に接する表面部分a1及びb1にBDD膜m22を有する。すなわち、電極対42の各電極(上部電極42a、下部電極42b)は、懸濁液に接する表面部分(接液部分)にBDD膜m22を有する。
さらに、上部電極42a及び下部電極42bは、表面部分a1及びb1に加えて、表面部分a1及びb1から連続して、側面部分a3及びb3のうち電極の厚み方向(電極対42の一方の電極から他方の電極への方向に相当)に半分以上又は0.5mm以上(好ましくは2mm以上)の部分にもBDD膜m22を有する。側面部分の面積の60%以上が被覆されていることが好ましく、80%以上が被覆されていることがより好ましく、95%以上被覆されていることがより好ましい。
EPデバイス使用時、BDD膜電極の角部分や側面部分に電界や発熱が集中し易い。第2の実施態様では、このような電界や発熱が集中し易い部位にBDD膜を有するため、上述した第1の実施態様と比較して、より導入効率が低下し難いという効果が得られる。
[第3の実施態様]
次に、本発明の第3の実施態様に係るエレクトロポレーションデバイスについて説明する。
第3の実施態様は、電極対を変更した点以外、上述した第1の実施態様と同じである。
図3は、第3の実施態様に係るエレクトロポレーションの一例の上部電極43a及び下部電極43bの断面図である。
次に、本発明の第3の実施態様に係るエレクトロポレーションデバイスについて説明する。
第3の実施態様は、電極対を変更した点以外、上述した第1の実施態様と同じである。
図3は、第3の実施態様に係るエレクトロポレーションの一例の上部電極43a及び下部電極43bの断面図である。
図3に示すように、上部電極43a及び下部電極43bは、支持体m31と支持体m31を被覆する被覆層であるBDD膜m32とからなる。上部電極43a及び下部電極43bは電極対43を構成する。
上部電極43a及び下部電極43bは、流路32に接する表面部分a1及びb1にBDD膜m32を有する。すなわち、電極対43の各電極(上部電極43a、下部電極43b)は、懸濁液に接する表面部分(接液部分)にBDD膜m32を有する。
さらに、上部電極43a及び下部電極43bは、表面部分a1及びb1に加えて、表面部分a1及びb1から連続して、側面部分a3及びb3にBDD膜m32を有する。そのため、上述した第1の実施態様と比較して、さらに導入効率が低下し難いという効果が得られる。
上部電極43a及び下部電極43bは、流路32に接する表面部分a1及びb1にBDD膜m32を有する。すなわち、電極対43の各電極(上部電極43a、下部電極43b)は、懸濁液に接する表面部分(接液部分)にBDD膜m32を有する。
さらに、上部電極43a及び下部電極43bは、表面部分a1及びb1に加えて、表面部分a1及びb1から連続して、側面部分a3及びb3にBDD膜m32を有する。そのため、上述した第1の実施態様と比較して、さらに導入効率が低下し難いという効果が得られる。
[第4の実施態様]
次に、本発明の第4の実施態様に係るエレクトロポレーションデバイスについて説明する。
第4の実施態様は、電極対を変更した点以外、上述した第1の実施態様と同じである。
図4は、第4の実施態様に係るエレクトロポレーションの一例の上部電極44a及び下部電極44bの断面図である。
次に、本発明の第4の実施態様に係るエレクトロポレーションデバイスについて説明する。
第4の実施態様は、電極対を変更した点以外、上述した第1の実施態様と同じである。
図4は、第4の実施態様に係るエレクトロポレーションの一例の上部電極44a及び下部電極44bの断面図である。
図4に示すように、上部電極44a及び下部電極44bは、支持体m41と支持体m41を被覆する被覆層であるBDD膜m42とからなる。上部電極44a及び下部電極44bは電極対44を構成する。
上部電極44a及び下部電極44bは、流路32に接する表面部分a1及びb1にBDD膜m42を有する。すなわち、電極対44の各電極(上部電極44a、下部電極44b)は、懸濁液に接する表面部分(接液部分)にBDD膜m42を有する。
さらに、上部電極44a及び下部電極44bは、表面部分a1及びb1に加えて、表面部分a1及びb1から連続して、側面部分a3及びb3、並びに、裏面部分a2及びb2にBDD膜m42を有する。そのため、上述した第1の実施態様と比較して、さらに導入効率が低下し難いという効果が得られる。
上部電極44a及び下部電極44bは、流路32に接する表面部分a1及びb1にBDD膜m42を有する。すなわち、電極対44の各電極(上部電極44a、下部電極44b)は、懸濁液に接する表面部分(接液部分)にBDD膜m42を有する。
さらに、上部電極44a及び下部電極44bは、表面部分a1及びb1に加えて、表面部分a1及びb1から連続して、側面部分a3及びb3、並びに、裏面部分a2及びb2にBDD膜m42を有する。そのため、上述した第1の実施態様と比較して、さらに導入効率が低下し難いという効果が得られる。
[第5の実施態様]
次に、本発明の第5の実施態様に係るエレクトロポレーションデバイスについて説明する。
第5の実施態様は、電極対を冷却する冷却機構を備える点以外、上述した第1~第4の実施態様と同じである。上記冷却機構としては、冷媒循環装置、熱交換機等が挙げられる。
図5は、第5の実施態様に係るエレクトロポレーションデバイスの一例を示す断面図である。
次に、本発明の第5の実施態様に係るエレクトロポレーションデバイスについて説明する。
第5の実施態様は、電極対を冷却する冷却機構を備える点以外、上述した第1~第4の実施態様と同じである。上記冷却機構としては、冷媒循環装置、熱交換機等が挙げられる。
図5は、第5の実施態様に係るエレクトロポレーションデバイスの一例を示す断面図である。
図5に示すエレクトロポレーションデバイス500は、上部電極冷却用流路60及び下部電極冷却用流路62を追加した点以外、図1A及び図1Bに示すエレクトロポレーションデバイス100と同じである。
図5に示すように、エレクトロポレーションデバイス500には、上部電極41aの裏面部分a2側に上部電極冷却用流路60が形成されている。同様に、下部電極41bの裏面部分b2側に下部電極冷却用流路62が形成されている。上部電極冷却用流路60及び下部電極冷却用流路62の入口及び出口にはそれぞれ冷媒用のチューブを取り付けてもよい。
図5に示すように、エレクトロポレーションデバイス500には、上部電極41aの裏面部分a2側に上部電極冷却用流路60が形成されている。同様に、下部電極41bの裏面部分b2側に下部電極冷却用流路62が形成されている。上部電極冷却用流路60及び下部電極冷却用流路62の入口及び出口にはそれぞれ冷媒用のチューブを取り付けてもよい。
EPデバイス使用時、電極対は発熱する。その結果、懸濁液中の生体由来物や生体活性物質の損傷が進み、生存率や導入効率の低下に繋がる場合がある。第5の実施態様においては、上部電極冷却用流路60及び下部電極冷却用流路62に冷媒(冷却水等)を流すことで電極対の発熱を抑制することができるため、生存率や導入効率の低下をさらに抑えることができる。
[第6の実施態様]
本発明の第6の実施態様に係るエレクトロポレーションデバイスは、
生体由来物と生体活性物質とを含有する懸濁液に対して、電極対によって電界を印加することで、上記生体由来物に上記生体活性物質を導入する、バッチ式のエレクトロポレーションに使用されるエレクトロポレーションデバイスであって、
上記電極対の各電極は、上記懸濁液に接する表面部分に、ホウ素ドープダイヤモンド膜を有し、
上記懸濁液を収容するための容器を備え、
上記電極対が、上記各電極のホウ素ドープダイヤモンド膜が対向するように、上記容器の内面に設置されている、エレクトロポレーションデバイスである。
第6の実施態様に係るエレクトロポレーションデバイスは、単回バッチ式でも繰り返しバッチ式でも構わないが、繰り返しバッチ式であることが好ましい。
本発明の第6の実施態様に係るエレクトロポレーションデバイスは、
生体由来物と生体活性物質とを含有する懸濁液に対して、電極対によって電界を印加することで、上記生体由来物に上記生体活性物質を導入する、バッチ式のエレクトロポレーションに使用されるエレクトロポレーションデバイスであって、
上記電極対の各電極は、上記懸濁液に接する表面部分に、ホウ素ドープダイヤモンド膜を有し、
上記懸濁液を収容するための容器を備え、
上記電極対が、上記各電極のホウ素ドープダイヤモンド膜が対向するように、上記容器の内面に設置されている、エレクトロポレーションデバイスである。
第6の実施態様に係るエレクトロポレーションデバイスは、単回バッチ式でも繰り返しバッチ式でも構わないが、繰り返しバッチ式であることが好ましい。
[部材]
次に、本発明のエレクトロポレーションデバイスに使用される各部材について説明する。
次に、本発明のエレクトロポレーションデバイスに使用される各部材について説明する。
〔BDD膜電極〕
上述のとおり、本発明では、接液部分にホウ素ドープダイヤモンド膜(BDD膜)を有する電極(BDD膜電極)を使用する。
BDD膜電極は、本発明の効果等がより優れる理由から、支持体と上記支持体を被覆する上記BDD膜とを含むのが好ましい。
上述のとおり、本発明では、接液部分にホウ素ドープダイヤモンド膜(BDD膜)を有する電極(BDD膜電極)を使用する。
BDD膜電極は、本発明の効果等がより優れる理由から、支持体と上記支持体を被覆する上記BDD膜とを含むのが好ましい。
<BDD膜>
BDD膜は、ホウ素がドープされたダイヤモンド膜であり、導電性を有する。
BDD膜は、ホウ素がドープされたダイヤモンド膜であり、導電性を有する。
(B含有率)
BDD膜のホウ素含有率(以下、「B含有率」とも言う)は、本発明の効果等がより優れる理由から、100~10000ppmであることが好ましく、1000~40000ppmであることがより好ましく、2000~10000ppmであることがさらに好ましい。
BDD膜の抵抗率が小さくなり、結果として、懸濁液に印加される電界が増大するとともに、電極でのオーム損(発熱)が小さくなり、また、電極面内電圧分布が抑えられる点から、B含有率は100ppm以上であることが好ましい。また、膜強度及び耐久性の点から、B含有率は10000ppm以下であることが好ましい。
BDD膜のホウ素含有率は、同成膜バッチで成膜した基板を小片化し、X線電子分光(XPS)で測定したCとBの元素比から算出することができる。
BDD膜のホウ素含有率(以下、「B含有率」とも言う)は、本発明の効果等がより優れる理由から、100~10000ppmであることが好ましく、1000~40000ppmであることがより好ましく、2000~10000ppmであることがさらに好ましい。
BDD膜の抵抗率が小さくなり、結果として、懸濁液に印加される電界が増大するとともに、電極でのオーム損(発熱)が小さくなり、また、電極面内電圧分布が抑えられる点から、B含有率は100ppm以上であることが好ましい。また、膜強度及び耐久性の点から、B含有率は10000ppm以下であることが好ましい。
BDD膜のホウ素含有率は、同成膜バッチで成膜した基板を小片化し、X線電子分光(XPS)で測定したCとBの元素比から算出することができる。
(膜厚)
BDD膜の膜厚は、本発明の効果等がより優れる理由から、2~20μmであることが好ましく、5~10μmであることがより好ましい。
ピンホール等に起因する耐久性の観点から、BDD膜の膜厚は2μm以上であることが好ましい。また、膜応力を抑えてBDD膜の密着性を向上させる観点から20μm以下であることが好ましい。
BDD膜の膜厚は、成膜前後の質量差からダイヤモンドの比重を3.52g/cm3として算出することができる。
BDD膜の膜厚は、本発明の効果等がより優れる理由から、2~20μmであることが好ましく、5~10μmであることがより好ましい。
ピンホール等に起因する耐久性の観点から、BDD膜の膜厚は2μm以上であることが好ましい。また、膜応力を抑えてBDD膜の密着性を向上させる観点から20μm以下であることが好ましい。
BDD膜の膜厚は、成膜前後の質量差からダイヤモンドの比重を3.52g/cm3として算出することができる。
(抵抗率)
BDD膜の抵抗率は、本発明の効果等がより優れる理由から、1×10-3~1×10-1Ω・cmであることが好ましく、2×10-3~1×10-2Ω・cmであることがより好ましい。
懸濁液に印加される電界が増大するとともに、電極でのオーム損(発熱)が小さくなり、また、電極面内電圧分布が抑えられる点から、抵抗率は1×10-1Ω・cm以下であることが好ましい。また、膜強度及び耐久性の点から、抵抗率は1×10-3Ω・cm以上であることが好ましい。
BDD膜の抵抗率は、同成膜バッチで成膜した高抵抗シリコン基板上のBDD膜のシート抵抗計測値を膜厚で除することで計算することができる。
BDD膜の抵抗率は、本発明の効果等がより優れる理由から、1×10-3~1×10-1Ω・cmであることが好ましく、2×10-3~1×10-2Ω・cmであることがより好ましい。
懸濁液に印加される電界が増大するとともに、電極でのオーム損(発熱)が小さくなり、また、電極面内電圧分布が抑えられる点から、抵抗率は1×10-1Ω・cm以下であることが好ましい。また、膜強度及び耐久性の点から、抵抗率は1×10-3Ω・cm以上であることが好ましい。
BDD膜の抵抗率は、同成膜バッチで成膜した高抵抗シリコン基板上のBDD膜のシート抵抗計測値を膜厚で除することで計算することができる。
<支持体>
支持体は特に制限されず、金属以外の基板(例えば、Si(ケイ素)基板、SiC基板)であっても、金属基板であってもよいが、本発明の効果等がより優れる理由から、金属基板であることが好ましい。
支持体は特に制限されず、金属以外の基板(例えば、Si(ケイ素)基板、SiC基板)であっても、金属基板であってもよいが、本発明の効果等がより優れる理由から、金属基板であることが好ましい。
(金属材料)
上記金属基板の金属材料は特に制限されないが、膜質、BDD膜との密着性、及び、熱伝導率の観点、並びに、本発明の効果等がより優れる理由から、Mo(モリブデン)、Nb(ニオブ)、W(タングステン)又はTi(チタン)であることが好ましく、Moであることがより好ましい。
上記金属基板の金属材料は特に制限されないが、膜質、BDD膜との密着性、及び、熱伝導率の観点、並びに、本発明の効果等がより優れる理由から、Mo(モリブデン)、Nb(ニオブ)、W(タングステン)又はTi(チタン)であることが好ましく、Moであることがより好ましい。
(厚み)
支持体の厚みは特に制限されないが、本発明の効果等がより優れる理由から、0.5~10mmであることが好ましく、1~5mmであることがより好ましい。
支持体の厚みは特に制限されないが、本発明の効果等がより優れる理由から、0.5~10mmであることが好ましく、1~5mmであることがより好ましい。
<厚み>
BDD膜電極の厚みは特に制限されないが、本発明の効果等がより優れる理由から、0.5~10mmであることが好ましく、1~5mmであることがより好ましい。
BDD膜電極の厚みは特に制限されないが、本発明の効果等がより優れる理由から、0.5~10mmであることが好ましく、1~5mmであることがより好ましい。
<製造方法>
支持体上に、BDD膜を成膜する方法は特に制限されず、公知のダイヤモンド膜の成膜方法を用いることができる。例えば、熱フィラメントCVD(chemical vapor deposition)法、マイクロ波プラズマCVD法、イオンビーム照射法、めっき法等が挙げられる。なかでも、得られるエレクトロポレーションデバイスについて本発明の効果等がより優れる理由から、熱フィラメントCVD法が好ましい。
熱フィラメントCVD法を用いたBDD膜の具体的な製造方法としては、例えば、熱フィラメントCVD装置を用いて、高純度の水素に、炭素源と、ホウ素源とを混合した混合ガスを供給して、支持体上にBDD膜を成膜する方法が挙げられる。
炭素源としては、例えば、メタン、エタン等が挙げられる。また、ホウ素源としては、例えば、トリメチルボレート(B(OCH3)3)、トリエチルボレート(B(OC2H5)3)、ジボラン等が挙げられる。
支持体上に、BDD膜を成膜する方法は特に制限されず、公知のダイヤモンド膜の成膜方法を用いることができる。例えば、熱フィラメントCVD(chemical vapor deposition)法、マイクロ波プラズマCVD法、イオンビーム照射法、めっき法等が挙げられる。なかでも、得られるエレクトロポレーションデバイスについて本発明の効果等がより優れる理由から、熱フィラメントCVD法が好ましい。
熱フィラメントCVD法を用いたBDD膜の具体的な製造方法としては、例えば、熱フィラメントCVD装置を用いて、高純度の水素に、炭素源と、ホウ素源とを混合した混合ガスを供給して、支持体上にBDD膜を成膜する方法が挙げられる。
炭素源としては、例えば、メタン、エタン等が挙げられる。また、ホウ素源としては、例えば、トリメチルボレート(B(OCH3)3)、トリエチルボレート(B(OC2H5)3)、ジボラン等が挙げられる。
〔電極保持部材〕
上部電極保持部材及び下部電極保持部材の材料は特に制限されないが、加工性が高くかつ、121℃で20分以上のオートクレーブ滅菌に耐える材質が好ましい。そのような材料としては、例えば、ポリカーボネート、ポリプロピレン等が挙げられる。
上部電極保持部材及び下部電極保持部材の材料は特に制限されないが、加工性が高くかつ、121℃で20分以上のオートクレーブ滅菌に耐える材質が好ましい。そのような材料としては、例えば、ポリカーボネート、ポリプロピレン等が挙げられる。
〔流路板〕
流路板の材料は特に制限されないが、細胞等の生体由来物の付着低減、エレクトロポレーション時の発熱や放電による損傷を防ぐ観点から、フッ素樹脂材料、例えばテフロン(登録商標)が好ましい。
なお、上述した変形例の場合等、Oリングによる液漏れ防止が難しい場合には、流路板に、柔軟性及び微粘着性のある材料(例えば、PDMS(ポリジメチルシロキサン))を用いることでシーリング部材を兼用することもできる。
流路板の材料は特に制限されないが、細胞等の生体由来物の付着低減、エレクトロポレーション時の発熱や放電による損傷を防ぐ観点から、フッ素樹脂材料、例えばテフロン(登録商標)が好ましい。
なお、上述した変形例の場合等、Oリングによる液漏れ防止が難しい場合には、流路板に、柔軟性及び微粘着性のある材料(例えば、PDMS(ポリジメチルシロキサン))を用いることでシーリング部材を兼用することもできる。
以下、実施例により、本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
[エレクトロポレーションデバイスの製造]
以下のとおり、各エレクトロポレーションデバイスを製造した。
〔実施例3〕
図5に示すようなEPデバイスを製造した。
図5に示すようなEPデバイスを製造した。
<上部電極保持板及び下部電極保持板の作製>
上部電極保持板及び下部電極保持板は、ポリカーボネートを用いて製造した。
上部電極保持板には、上部電極を嵌め込むための溝、及び、上部電極に通電接続するための貫通孔を形成した。同様に、下部電極保持板には、下部電極を嵌め込むための溝、及び、下部電極に通電接続するための貫通孔を形成した。
また、上部電極保持板には、流入口及び流出口用の貫通孔を形成した。上記流入口及び流出口には流路チューブを取り付けた。
また、上部電極保持板及び下部電極保持板ともに、電極冷却用流路を形成した。上記電極冷却用流路には冷却水用のチューブを取り付けた。
また、上部電極保持板及び下部電極保持板ともに、組み付け用の貫通孔、及び、液漏れ防止用のOリングのための溝を形成した。
上部電極保持板及び下部電極保持板は、ポリカーボネートを用いて製造した。
上部電極保持板には、上部電極を嵌め込むための溝、及び、上部電極に通電接続するための貫通孔を形成した。同様に、下部電極保持板には、下部電極を嵌め込むための溝、及び、下部電極に通電接続するための貫通孔を形成した。
また、上部電極保持板には、流入口及び流出口用の貫通孔を形成した。上記流入口及び流出口には流路チューブを取り付けた。
また、上部電極保持板及び下部電極保持板ともに、電極冷却用流路を形成した。上記電極冷却用流路には冷却水用のチューブを取り付けた。
また、上部電極保持板及び下部電極保持板ともに、組み付け用の貫通孔、及び、液漏れ防止用のOリングのための溝を形成した。
<流路板の作製>
流路板は、テフロン(登録商標)を用いて製造した。
流路板には、流路となる開口部(幅:20mm)、及び、組付け用の貫通孔を形成した。流路板の厚みは、2mmである。
流路板は、テフロン(登録商標)を用いて製造した。
流路板には、流路となる開口部(幅:20mm)、及び、組付け用の貫通孔を形成した。流路板の厚みは、2mmである。
<電極の作製>
熱フィラメントCVD(chemical vapor deposition)法により、水素とメタンとトリメチルボレートとの混合ガスを用いて、Mo基板(支持体)(流通方向の長さ:20mm、厚み:2mm)の一方の表面から側面にかけてBDD膜を成膜した(成膜温度:1000℃)。これに外形加工を施すことで、図1Cに示すような、支持体の一方の表面のみBDD膜で被覆されたMo基板(BDD膜電極)を得た。得られたBDD膜電極は、支持体と支持体を被覆するBDD膜とからなり、図1Cのように一方の表面部分のみに被覆層であるBDD膜を有する(電極長L:20mm)。BDD膜の膜厚は2μmであった。
熱フィラメントCVD(chemical vapor deposition)法により、水素とメタンとトリメチルボレートとの混合ガスを用いて、Mo基板(支持体)(流通方向の長さ:20mm、厚み:2mm)の一方の表面から側面にかけてBDD膜を成膜した(成膜温度:1000℃)。これに外形加工を施すことで、図1Cに示すような、支持体の一方の表面のみBDD膜で被覆されたMo基板(BDD膜電極)を得た。得られたBDD膜電極は、支持体と支持体を被覆するBDD膜とからなり、図1Cのように一方の表面部分のみに被覆層であるBDD膜を有する(電極長L:20mm)。BDD膜の膜厚は2μmであった。
<デバイスの組み付け>
上部電極保持板の溝にBDD膜が露出するように上部電極を嵌め込んだ。また、溝にOリングを嵌め込んだ。同様に、下部電極保持板の溝にBDD膜が露出するように下部電極を嵌め込み、また、溝にOリングを嵌め込んだ。そして、上部電極のBDD膜と下部電極のBDD膜が対向するように、上部電極保持板及び下部電極保持板で流路板を挟んで、ネジで固定した。
このようにして、EPデバイスを作製した。得られたEPデバイスにおいて、電極対は各電極のBDD膜が対向するように、流路を挟んで設置されている。
上部電極保持板の溝にBDD膜が露出するように上部電極を嵌め込んだ。また、溝にOリングを嵌め込んだ。同様に、下部電極保持板の溝にBDD膜が露出するように下部電極を嵌め込み、また、溝にOリングを嵌め込んだ。そして、上部電極のBDD膜と下部電極のBDD膜が対向するように、上部電極保持板及び下部電極保持板で流路板を挟んで、ネジで固定した。
このようにして、EPデバイスを作製した。得られたEPデバイスにおいて、電極対は各電極のBDD膜が対向するように、流路を挟んで設置されている。
〔実施例4〕
電極の作製において、BDD膜の膜厚が10μmになるように成膜条件(成膜時間)を変更した点以外は、実施例3と同様の手順に従ってEPデバイスを作製した。
電極の作製において、BDD膜の膜厚が10μmになるように成膜条件(成膜時間)を変更した点以外は、実施例3と同様の手順に従ってEPデバイスを作製した。
〔実施例5〕
電極の作製において、基板の外形加工をBDD膜成膜前に施した点以外は、実施例4と同様の手順に従ってEPデバイスを作製した。実施例5において、上部電極及び下部電極は、図3に示すような、一方の表面から側面にかけてBDD膜で被覆されたMo基板(BDD膜電極)である。得られたBDD膜電極は、支持体と支持体を被覆するBDD膜とからなり、一方の表面部分に加えて、上記表面部分から連続して、図3のように側面部分にも被覆層であるBDD膜を有する。
電極の作製において、基板の外形加工をBDD膜成膜前に施した点以外は、実施例4と同様の手順に従ってEPデバイスを作製した。実施例5において、上部電極及び下部電極は、図3に示すような、一方の表面から側面にかけてBDD膜で被覆されたMo基板(BDD膜電極)である。得られたBDD膜電極は、支持体と支持体を被覆するBDD膜とからなり、一方の表面部分に加えて、上記表面部分から連続して、図3のように側面部分にも被覆層であるBDD膜を有する。
〔実施例6〕
流路板の厚みを4mmに変更した点以外は、実施例5と同様の手順に従ってEPデバイスを作製した。
流路板の厚みを4mmに変更した点以外は、実施例5と同様の手順に従ってEPデバイスを作製した。
〔実施例1〕
図1D及び図1Eに示すようなEPデバイスを製造した。
上部電極保持板及び下部電極保持板は実施例3と同様にポリカーボネートを用いた。
一方、Oリングによる液漏れ防止が難しいため、流路板(流路となる開口部の幅:2mm)には、柔軟性及び微粘着性のあるPDMS(ポリジメチルシロキサン)を用いた。PDMSは流路板とシーリング部材を兼用する。
BDD膜電極については、支持体としてMo基板の代わりにSi基板(厚み:0.7mm)を用いた点以外は、実施例3と同様の手順に従って作製した。
図1D及び図1Eに示すようなEPデバイスを製造した。
上部電極保持板及び下部電極保持板は実施例3と同様にポリカーボネートを用いた。
一方、Oリングによる液漏れ防止が難しいため、流路板(流路となる開口部の幅:2mm)には、柔軟性及び微粘着性のあるPDMS(ポリジメチルシロキサン)を用いた。PDMSは流路板とシーリング部材を兼用する。
BDD膜電極については、支持体としてMo基板の代わりにSi基板(厚み:0.7mm)を用いた点以外は、実施例3と同様の手順に従って作製した。
〔実施例2〕
流路板の流路となる開口部の幅を20mmに変更した点以外は、実施例1と同様の手順に従ってEPデバイスを作製した。
流路板の流路となる開口部の幅を20mmに変更した点以外は、実施例1と同様の手順に従ってEPデバイスを作製した。
〔比較例1〕
流路となる開口部の幅を2mmに変更するとともに、上部電極及び下部電極として下記Pt膜電極を用いた点以外は、実施例3と同様の手順に従ってEPデバイスを作製した。得られたEPデバイスにおいて、電極対は各電極のPt膜が対向するように、流路を挟んで設置されている。
流路となる開口部の幅を2mmに変更するとともに、上部電極及び下部電極として下記Pt膜電極を用いた点以外は、実施例3と同様の手順に従ってEPデバイスを作製した。得られたEPデバイスにおいて、電極対は各電極のPt膜が対向するように、流路を挟んで設置されている。
<Pt膜電極>
Cu基板(支持体)(厚み:2mm)を電極形状に加工し、バリ取り、表面洗浄を行った。そして、下地層平滑化層として厚み10μmのCuメッキ層、密着性改善層として厚み0.1μmのAuメッキ層、表面層として2μmのPtメッキ層(Pt膜)を形成した。
Cu基板(支持体)(厚み:2mm)を電極形状に加工し、バリ取り、表面洗浄を行った。そして、下地層平滑化層として厚み10μmのCuメッキ層、密着性改善層として厚み0.1μmのAuメッキ層、表面層として2μmのPtメッキ層(Pt膜)を形成した。
〔比較例2〕
流路となる開口部の幅を20mmに変更した点以外は、比較例1と同様の手順に従ってEPデバイスを作製した。
流路となる開口部の幅を20mmに変更した点以外は、比較例1と同様の手順に従ってEPデバイスを作製した。
〔比較例3~4〕
流路板の厚みを4mmに変更した点以外は、比較例1と同様の手順に従ってEPデバイスを作製した。
流路板の厚みを4mmに変更した点以外は、比較例1と同様の手順に従ってEPデバイスを作製した。
〔比較例5〕
上部電極及び下部電極としてCu基板(電極長L:20mm、厚み2mm、被覆層無し)を使用した点以外は、実施例3と同様の手順に従ってEPデバイスを作製した。
上部電極及び下部電極としてCu基板(電極長L:20mm、厚み2mm、被覆層無し)を使用した点以外は、実施例3と同様の手順に従ってEPデバイスを作製した。
〔比較例6〕
上部電極及び下部電極として下記ダイヤモンド膜電極を用いた点以外は、実施例3と同様の手順に従ってEPデバイスを作製した。得られたEPデバイスにおいて、電極対は各電極のダイヤモンド膜が対向するように、流路を挟んで設置されている。
上部電極及び下部電極として下記ダイヤモンド膜電極を用いた点以外は、実施例3と同様の手順に従ってEPデバイスを作製した。得られたEPデバイスにおいて、電極対は各電極のダイヤモンド膜が対向するように、流路を挟んで設置されている。
<ダイヤモンド膜電極>
熱フィラメントCVD(chemical vapor deposition)法により、水素とメタンとの混合ガスを用いて、Mo基板(支持体)(流通方向の長さ:20mm、厚み:2mm)の一方の表面から側面にかけてダイヤモンド膜を成膜した(成膜温度:1000℃)。得られたダイヤモンド膜電極は、支持体と支持体を被覆するダイヤモンド膜とからなり、一方の表面部分に加えて、上記表面部分から連続して、側面部分にも被覆層であるダイヤモンド膜を有する。
熱フィラメントCVD(chemical vapor deposition)法により、水素とメタンとの混合ガスを用いて、Mo基板(支持体)(流通方向の長さ:20mm、厚み:2mm)の一方の表面から側面にかけてダイヤモンド膜を成膜した(成膜温度:1000℃)。得られたダイヤモンド膜電極は、支持体と支持体を被覆するダイヤモンド膜とからなり、一方の表面部分に加えて、上記表面部分から連続して、側面部分にも被覆層であるダイヤモンド膜を有する。
〔比較例7〕
上部電極及び下部電極として下記導電ポリマー電極を用いた点以外は、実施例3と同様の手順に従ってEPデバイスを作製した。
上部電極及び下部電極として下記導電ポリマー電極を用いた点以外は、実施例3と同様の手順に従ってEPデバイスを作製した。
<導電ポリマー電極>
特開2005-526499号公報を参考に、ポリカーボネート80%とカーボンブラック20%と添加剤とを混合し、電極形状に成形して、導電ポリマー電極を得た(電極長L:20mm、厚み:2mm)。
特開2005-526499号公報を参考に、ポリカーボネート80%とカーボンブラック20%と添加剤とを混合し、電極形状に成形して、導電ポリマー電極を得た(電極長L:20mm、厚み:2mm)。
〔比較例8〕
上部電極及び下部電極として上記導電ポリマー電極を用いた点以外は、実施例6と同様の手順に従ってEPデバイスを作製した。
上部電極及び下部電極として上記導電ポリマー電極を用いた点以外は、実施例6と同様の手順に従ってEPデバイスを作製した。
得られたEPデバイスについて、以下の項目を表1に示す。
・被覆層:電極の被覆層(種類、被覆部位、B含有率、抵抗率、膜厚)
・支持体:電極の支持体(材料、厚み)
・電極:各電極(上部電極、下部電極)の電極長L、電極幅W、ギャップ(電極間距離D)
なお、上述のとおり、上部電極及び下部電極の幅とは、電極の実際の幅ではなく、電極のうち流路に接する部分の幅であり、流路の幅に相当する。
・被覆層:電極の被覆層(種類、被覆部位、B含有率、抵抗率、膜厚)
・支持体:電極の支持体(材料、厚み)
・電極:各電極(上部電極、下部電極)の電極長L、電極幅W、ギャップ(電極間距離D)
なお、上述のとおり、上部電極及び下部電極の幅とは、電極の実際の幅ではなく、電極のうち流路に接する部分の幅であり、流路の幅に相当する。
[エレクトロポレーション]
得られたエレクトロポレーションデバイスを用いてエレクトロポレーションを行った。
得られたエレクトロポレーションデバイスを用いてエレクトロポレーションを行った。
〔懸濁液の調製〕
増殖培養させたHEK293細胞(生体由来物に該当)の細胞懸濁液(濃度:40M(×106)cells/mL)を調製した。
得られた細胞懸濁液にLonza社製のpmaxGFPプラスミド(生体活性物質に該当)を濃度が30μg/mLになるように添加した。このようにして、HEK293細胞とGFPプラスミドとを含有する懸濁液を得た。
増殖培養させたHEK293細胞(生体由来物に該当)の細胞懸濁液(濃度:40M(×106)cells/mL)を調製した。
得られた細胞懸濁液にLonza社製のpmaxGFPプラスミド(生体活性物質に該当)を濃度が30μg/mLになるように添加した。このようにして、HEK293細胞とGFPプラスミドとを含有する懸濁液を得た。
〔エレクトロポレーション〕
得られたEPデバイスを、オートクレーブ用のバッグに梱包し、オートクレーブ滅菌(121℃20~60分)を実施した。
安全キャビネット内(無菌環境)で、滅菌済のEPデバイスの流入口を懸濁液供給系に接続し、流出口を回収系に接続した。また、EPデバイスの電極対をパルス電源に接続した。
得られたEPデバイスを、オートクレーブ用のバッグに梱包し、オートクレーブ滅菌(121℃20~60分)を実施した。
安全キャビネット内(無菌環境)で、滅菌済のEPデバイスの流入口を懸濁液供給系に接続し、流出口を回収系に接続した。また、EPデバイスの電極対をパルス電源に接続した。
上述のとおり調製した懸濁液を表1に記載の流量で流入口から送液して、エレクトロポレーションを行った。なお、流量を変えている理由は、平均流速を一定にするためである。具体的には、流路の断面積に合わせて流量を変えた。
また、エレクトロポレーションの電圧及びパルス幅は、電界が1375V/cmになるように調整した。また、パルス周期(パルス間隔)は、懸濁液に電界が1回印加されるように、中心流速に同期させた。具体的には下記表2のとおりである。なお、電極反応を均一化するためにバイポーラパルス(プラスとマイナスを交互)とした。
また、実施例6、比較例4、比較例7~8については、電極を冷却するために、電極冷却用流路に純水(4℃)を送液した(100mL/分)。
また、エレクトロポレーションの電圧及びパルス幅は、電界が1375V/cmになるように調整した。また、パルス周期(パルス間隔)は、懸濁液に電界が1回印加されるように、中心流速に同期させた。具体的には下記表2のとおりである。なお、電極反応を均一化するためにバイポーラパルス(プラスとマイナスを交互)とした。
また、実施例6、比較例4、比較例7~8については、電極を冷却するために、電極冷却用流路に純水(4℃)を送液した(100mL/分)。
[評価]
パルス1~25回目(25パルス分)(15秒)のエレクトロポレーション後の懸濁液を回収し、続く、パルス26~100回目(75パルス分)を廃棄した。パルス101回目以降、これを繰り返した。
回収した懸濁液については、2M(×106)cells/mLに希釈してから、ウェルプレートに2mL播種して、CO2濃度が8%、雰囲気温度が37℃のインキュベーター内に収容し、24時間静置培養した。
24時間培養後の細胞濃度XをVi-CELL XR(ベックマン・コールター)を用いて取得し、BD FACS Calibur(ベクトン・ディッキンソン)を用いて、遺伝子導入された細胞比率Yを取得した。
そして、エレクトロポレーション処理された細胞に対する、24時間培養後に得られた遺伝子導入細胞の比率として、導入効率(=細胞濃度X×細胞比率Y÷2Mcells/mL×100)(%)を算出した。
パルス1~25回目(25パルス分)(15秒)のエレクトロポレーション後の懸濁液を回収し、続く、パルス26~100回目(75パルス分)を廃棄した。パルス101回目以降、これを繰り返した。
回収した懸濁液については、2M(×106)cells/mLに希釈してから、ウェルプレートに2mL播種して、CO2濃度が8%、雰囲気温度が37℃のインキュベーター内に収容し、24時間静置培養した。
24時間培養後の細胞濃度XをVi-CELL XR(ベックマン・コールター)を用いて取得し、BD FACS Calibur(ベクトン・ディッキンソン)を用いて、遺伝子導入された細胞比率Yを取得した。
そして、エレクトロポレーション処理された細胞に対する、24時間培養後に得られた遺伝子導入細胞の比率として、導入効率(=細胞濃度X×細胞比率Y÷2Mcells/mL×100)(%)を算出した。
〔初期導入効率〕
パルス1~25回目(25パルス分)の導入効率を表1に示す。
初期導入効率は高い程好ましく、実用上、20%以上であることが好ましい。
パルス1~25回目(25パルス分)の導入効率を表1に示す。
初期導入効率は高い程好ましく、実用上、20%以上であることが好ましい。
〔耐久パルス数〕
導入効率が初期導入効率の90%以上に維持されていた最大の累積パルス数(耐久パルス数)を求めた。例えば、パルス801~825回目(25パルス分)までは維持率(導入効率/初期導入効率)が90%以上であったが、パルス901~925回目(25パルス分)の維持率が90%未満になった場合は、耐久パルス数を800とした。なお、初期導入効率が20%未満である場合には耐久パルス数を求めなかった(比較例3、5~6及び8)。
結果を表1に示す。耐久パルス数が大きい程、導入効率が低下し難いことを表す。耐久パルス数は、実用上、1000以上であることが好ましい。
導入効率が初期導入効率の90%以上に維持されていた最大の累積パルス数(耐久パルス数)を求めた。例えば、パルス801~825回目(25パルス分)までは維持率(導入効率/初期導入効率)が90%以上であったが、パルス901~925回目(25パルス分)の維持率が90%未満になった場合は、耐久パルス数を800とした。なお、初期導入効率が20%未満である場合には耐久パルス数を求めなかった(比較例3、5~6及び8)。
結果を表1に示す。耐久パルス数が大きい程、導入効率が低下し難いことを表す。耐久パルス数は、実用上、1000以上であることが好ましい。
なお、表1中、導入細胞数は初期導入効率に処理細胞数を乗じたものである。また、表1中、Eは、10のべき乗を表す。
電極がBDD膜電極である実施例1~6は、いずれも高い初期導入効率及び高い耐久パルス数を示した。
実施例1と比較例1との対比(電極幅:2mm、ギャップ:2mm)から、電極がPt膜電極である比較例1と比較して、電極がBDD膜電極である実施例1は、耐久パルス数が高かった。同様に、実施例2と実施例3と比較例2との対比(電極幅:20mm、ギャップ2mm)から、電極がPt膜電極である比較例2と比較して、電極がBDD膜電極である実施例2~3は、耐久パルス数が高かった。電極が銅基板である比較例5、及び、電極がダイヤモンド膜電極である比較例6は、初期導入効率が不十分であった。また、電極が導電ポリマーである比較例7~8は、耐久パルス数又は初期導入効率が不十分であった。
実施例1と比較例1との対比(電極幅:2mm、ギャップ:2mm)から、電極がPt膜電極である比較例1と比較して、電極がBDD膜電極である実施例1は、耐久パルス数が高かった。同様に、実施例2と実施例3と比較例2との対比(電極幅:20mm、ギャップ2mm)から、電極がPt膜電極である比較例2と比較して、電極がBDD膜電極である実施例2~3は、耐久パルス数が高かった。電極が銅基板である比較例5、及び、電極がダイヤモンド膜電極である比較例6は、初期導入効率が不十分であった。また、電極が導電ポリマーである比較例7~8は、耐久パルス数又は初期導入効率が不十分であった。
実施例2と実施例3との対比(支持体が異なる態様同士の対比)から、電極の支持体がシリコン基板である実施例2と比較して、電極の支持体がMo基板である実施例3は、初期導入効率がより高かった(電気抵抗が高いシリコン基板を金属Mo基板に変更することで、電極面内方向の電気抵抗が低下し、接液電極面積が広い場合でも接液面内の電界強度が均一化して、導入効率が向上した)。
また、実施例3と実施例4との対比(BDD膜の膜厚が異なる態様同士の対比)から、BDD膜の膜厚が5μm以上である実施例4は、耐久パルス数がより大きかった(膜厚が増加することで下地基板の表面凹凸やパーティクル欠陥に起因して発生するBDD膜のピンホールのサイズ及び密度が低減する。その結果、累積パルス印加数の増大に伴ってBDD膜の損傷が進行しても、下地金属に対するBDD膜の被覆性が十分維持され、下地基板由来の金属溶出を抑制したからと推定される)。
また、実施例4と実施例5と実施例6との対比(被覆部位が異なる態様同士の対比)から、BDD膜電極が、接液部分に加えて、接液部分から連続して、側面部分にもBDD膜を有する、実施例5及び6は、耐久パルス数がより大きかった(実施例4では10000パルス印加以降で電極角部のBDD膜が消失し、下地基板の露出が見られた。角部の下地露出はさらにパルス印加を続けることで拡大した。一方で実施例5(6も)では50000パルス印加しても電極角部の下地基板露出は発生せず、遺伝子導入効率も低下しなかった)。実施例6は実施例5よりもギャップが大きく(処理細胞数が多い)、より厳しい条件であるが、電極の冷却によって耐久パルス数が維持されていた。
また、実施例3と実施例4との対比(BDD膜の膜厚が異なる態様同士の対比)から、BDD膜の膜厚が5μm以上である実施例4は、耐久パルス数がより大きかった(膜厚が増加することで下地基板の表面凹凸やパーティクル欠陥に起因して発生するBDD膜のピンホールのサイズ及び密度が低減する。その結果、累積パルス印加数の増大に伴ってBDD膜の損傷が進行しても、下地金属に対するBDD膜の被覆性が十分維持され、下地基板由来の金属溶出を抑制したからと推定される)。
また、実施例4と実施例5と実施例6との対比(被覆部位が異なる態様同士の対比)から、BDD膜電極が、接液部分に加えて、接液部分から連続して、側面部分にもBDD膜を有する、実施例5及び6は、耐久パルス数がより大きかった(実施例4では10000パルス印加以降で電極角部のBDD膜が消失し、下地基板の露出が見られた。角部の下地露出はさらにパルス印加を続けることで拡大した。一方で実施例5(6も)では50000パルス印加しても電極角部の下地基板露出は発生せず、遺伝子導入効率も低下しなかった)。実施例6は実施例5よりもギャップが大きく(処理細胞数が多い)、より厳しい条件であるが、電極の冷却によって耐久パルス数が維持されていた。
また、生体由来物としてHEK293細胞の代わりにCHO細胞を用いて、上述した実施例及び比較例と同様に、エレクトロポレーションを行い、評価したところ、上述した実施例及び比較例と同様の傾向になった。
10 上部電極保持板
20 下部電極保持板
30 流路板
32 開口部(流路)
41 電極対
41a 上部電極
41b 下部電極
42 電極対
42a 上部電極
42b 下部電極
43 電極対
43a 上部電極
43b 下部電極
44 電極対
44a 上部電極
44b 下部電極
50 流入口
52 流出口
60 上部電極冷却用流路
62 下部電極冷却用流路
70 貫通孔
72 貫通孔
100 エレクトロポレーションデバイス
110 エレクトロポレーションデバイス
500 エレクトロポレーションデバイス
a1 上部電極の表面部分
a2 上部電極の裏面部分
a3 上部電極の側面部分
b1 下部電極の表面部分
b2 下部電極の裏面部分
b3 下部電極の側面部分
m11 支持体
m12 BDD膜
m21 支持体
m22 BDD膜
m31 支持体
m32 BDD膜
m41 支持体
m42 BDD膜
L 電極長
W 電極幅(流路幅)
D 電極間距離(ギャップ)
20 下部電極保持板
30 流路板
32 開口部(流路)
41 電極対
41a 上部電極
41b 下部電極
42 電極対
42a 上部電極
42b 下部電極
43 電極対
43a 上部電極
43b 下部電極
44 電極対
44a 上部電極
44b 下部電極
50 流入口
52 流出口
60 上部電極冷却用流路
62 下部電極冷却用流路
70 貫通孔
72 貫通孔
100 エレクトロポレーションデバイス
110 エレクトロポレーションデバイス
500 エレクトロポレーションデバイス
a1 上部電極の表面部分
a2 上部電極の裏面部分
a3 上部電極の側面部分
b1 下部電極の表面部分
b2 下部電極の裏面部分
b3 下部電極の側面部分
m11 支持体
m12 BDD膜
m21 支持体
m22 BDD膜
m31 支持体
m32 BDD膜
m41 支持体
m42 BDD膜
L 電極長
W 電極幅(流路幅)
D 電極間距離(ギャップ)
Claims (13)
- 生体由来物と生体活性物質とを含有する懸濁液に対して、電極対によって電界を印加することで、前記生体由来物に前記生体活性物質を導入する、エレクトロポレーションデバイスであって、
前記電極対の各電極は、前記懸濁液に接する表面部分に、ホウ素ドープダイヤモンド膜を有する、エレクトロポレーションデバイス。 - 前記ホウ素ドープダイヤモンド膜のホウ素含有率が、100~10000ppmである、請求項1に記載のエレクトロポレーションデバイス。
- 前記ホウ素ドープダイヤモンド膜の抵抗率が、1×10-3~1×10-1Ω・cmである、請求項1に記載のエレクトロポレーションデバイス。
- 前記ホウ素ドープダイヤモンド膜の膜厚が、2~20μmである、請求項1に記載のエレクトロポレーションデバイス。
- 前記電極対の電極間距離が、1~10mmである、請求項1に記載のエレクトロポレーションデバイス。
- 前記各電極が、支持体と前記支持体を被覆する前記ホウ素ドープダイヤモンド膜とを含む、請求項1に記載のエレクトロポレーションデバイス。
- 前記支持体の厚みが、0.5~10mmである、請求項6に記載のエレクトロポレーションデバイス。
- 前記支持体が、金属基板である、請求項6に記載のエレクトロポレーションデバイス。
- 前記金属基板の金属材料が、Mo、Nb、W及びTiからなる群より選択される少なくとも1種を含む、請求項8に記載のエレクトロポレーションデバイス。
- 前記懸濁液に接する表面部分に加えて、前記表面部分から連続して、側面部分のうち電極の厚み方向に半分以上若しくは0.5mm以上の部分、又は、側面部分の全面にも、ホウ素ドープダイヤモンド膜を有する、請求項1に記載のエレクトロポレーションデバイス。
- 前記各電極を冷却する冷却機構を備える、請求項1に記載のエレクトロポレーションデバイス。
- 繰り返しバッチ式のエレクトロポレーションに使用される請求項1~11のいずれか1項に記載のエレクトロポレーションデバイスであって、
前記懸濁液を収容するための容器を備え、
前記電極対が、前記各電極のホウ素ドープダイヤモンド膜が対向するように、前記容器の内面に設置されている、エレクトロポレーションデバイス。 - フロー式のエレクトロポレーションに使用される請求項1~11のいずれか1項に記載のエレクトロポレーションデバイスであって、
前記懸濁液を流すための流路を備え、
前記電極対が、前記各電極のホウ素ドープダイヤモンド膜が対向するように、前記流路を挟んで設置されている、エレクトロポレーションデバイス。
Applications Claiming Priority (2)
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