WO2023153614A1 - 환자 유래 뇌수막종 오가노이드 및 이의 제조 방법 - Google Patents

환자 유래 뇌수막종 오가노이드 및 이의 제조 방법 Download PDF

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WO2023153614A1
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meningioma
medium
organoid
patient
organoids
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안스데반
박준성
김도경
정연준
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가톨릭대학교 산학협력단
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
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    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds

Definitions

  • the present invention provides a method for preparing patient-derived meningioma organoids; a biobanking method of organoids prepared by the above method; and a screening method for a therapeutic agent for meningioma using the organoid prepared by the above method.
  • Meningioma is a generic term for tumors arising from the meninges surrounding the brain, and is histologically divided into benign and malignant tumors. Most meningiomas are benign, and malignant cases account for 2-12%. Meningioma can occur in various sites, and different symptoms appear depending on the anatomical characteristics of the site of occurrence. These meningiomas are diagnosed by conducting a neurological examination and then performing brain computed tomography (CT) or brain magnetic resonance imaging (MRI). Treatment of meningioma is performed through surgical removal or radiation therapy, and no specific drug has been developed for meningioma patients.
  • CT brain computed tomography
  • MRI brain magnetic resonance imaging
  • Organoid is a three-dimensional cell aggregate formed through self-renewal and self-organization from adult stem cells, embryonic stem cells, and induced pluripotent stem cells. Since these organoids are designed to closely mimic the complex structure and functionality of human organs and enable improved modeling of human tissues, they are becoming increasingly important in the fields of cancer research, neurobiology, stem cell research, and drug development. In particular, it can be suitable for personalized drug screening or genome-based precision medicine research through organoids.
  • the organoid market was applied in the order of developmental biology (29%), drug discovery and personalized medicine (22.9%), infection pathology (16.6%), regenerative medicine (14.4%), and drug toxicity and efficacy evaluation (12.8%).
  • developmental biology (30.4%), drug discovery and personalized medicine (25.3%), infection pathology (15.7%), regenerative medicine (13%), and drug toxicity and efficacy evaluation (12.3%) in that order.
  • the organoid market for drug discovery and personalized medicine is expected to gradually expand.
  • Patent Document 1 Korean Patent Publication No. 10-2020-0061235
  • An object of the present invention is to (a) insert a medium into meningioma tissue isolated from a meningioma patient and cut it finely; (b) treating the cut tissue with a red blood cell (RBC) lysis buffer; and (c) adding a culture medium to the tissue treated with the lysis buffer and culturing the tissue.
  • RBC red blood cell
  • Another object of the present invention is to provide patient-derived meningioma organoids prepared by the above production method.
  • Another object of the present invention is to treat the meningioma organoid with a candidate substance; and measuring the amount of expression or release of lactate dehydrogenase (LDH) protein or a gene encoding the same in the organoid or its culture medium.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • Another object of the present invention is to treat the meningioma organoid with a candidate substance; and measuring the expression level of a meningioma diagnostic marker in the organoid or its culture medium.
  • Another object of the present invention is to provide a method for biobanking patient-derived meningioma organoids, comprising the step of adding banking medium to the meningioma organoids and freezing them at -80°C.
  • Another object of the present invention is to recover the patient-derived meningioma organoid biobanked by the above method; treating the recovered organoid with a candidate substance; and measuring the amount of expression or release of lactate dehydrogenase (LDH) protein or a gene encoding the same in the organoid or its culture medium.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • the present invention provides a method comprising the steps of (a) putting a medium into meningioma tissue isolated from a meningioma patient and cutting it finely; (b) treating the cut tissue with a red blood cell (RBC) lysis buffer; and (c) adding a culture medium to the tissue treated with the lysis buffer and culturing the tissue.
  • a medium into meningioma tissue isolated from a meningioma patient and cutting it finely
  • RBC red blood cell
  • the present invention provides patient-derived meningioma organoids prepared by the above preparation method.
  • the present invention comprises the steps of treating the meningioma organoid with a candidate substance; and measuring the amount of expression or release of lactate dehydrogenase (LDH) protein or a gene encoding the same in the organoid or its culture medium.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • the present invention comprises the steps of treating the meningioma organoid with a candidate substance; and measuring the expression level of a meningioma diagnostic marker in the organoid or its culture medium.
  • the present invention provides a method for biobanking patient-derived meningioma organoids, comprising the step of adding banking medium to the meningioma organoids and freezing them at -80°C.
  • the present invention includes the steps of recovering patient-derived meningioma organoids biobanked by the above method; treating the recovered organoid with a candidate substance; and measuring the amount of expression or release of lactate dehydrogenase (LDH) protein or a gene encoding the same in the organoid or its culture medium.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • the patient-derived meningioma organoid prepared by the method according to the present invention can maintain the tumor-specific function and structure of meningioma, and can be used to screen a meningioma treatment agent, in particular, a personalized meningioma treatment agent. It can be usefully used in the treatment of cancer.
  • Figure 2 shows the results of measuring the growth rate (a) and size (b) of three types of organoids.
  • the present invention comprises the steps of (a) putting a medium into meningioma tissue isolated from a meningioma patient and cutting it finely; (b) treating the cut tissue with a red blood cell (RBC) lysis buffer; and (c) adding a culture medium to the tissue treated with the lysis buffer and culturing the tissue.
  • RBC red blood cell
  • the medium in step (a) may be a cold Hibernate-A medium containing 1% Glutamax, 1% Penicillin/streptomycin and 2.5 ⁇ g/ml of amphotericin B.
  • the culture medium in step (c) is 50% DMEM/F12 medium, 50% Neurobasal medium, 1X Glutamax, 1X MEM NEAAs, 1X Penstrep, 1X N-2 supplement, 1X B27 w/ o Vitamin A, 1X 2-mercaptoethanol, and 2.5 ⁇ g/ml Insulin solution may be included.
  • the culturing in step (c) may be culturing at 120 rpm in an orbital shaker in an incubator.
  • the incubator may be a generally used 37°C 5% CO 2 incubator.
  • a step of washing with a medium mixed with DMEM/F12 medium and Neurobasal medium in a ratio of 1:1 may be further included.
  • a medium in which the DMEM/F12 medium and the Neurobasal medium are mixed at a ratio of 1:1 may be referred to as a medium for washing.
  • the present invention provides patient-derived meningioma organoids prepared by the above preparation method.
  • the present invention comprises the steps of treating the meningioma organoid with a candidate substance; and measuring the amount of expression or release of lactate dehydrogenase (LDH) protein or a gene encoding the same in the organoid or its culture medium.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • a step of determining a candidate substance in which the expression level or release amount of the LDH protein or the gene encoding the same is increased from a reference value may be further included as a treatment for meningioma.
  • the present invention comprises the steps of treating the meningioma organoid with a candidate substance; and measuring the expression level of a meningioma diagnostic marker in the organoid or its culture medium.
  • the meningioma diagnostic marker may be EMA (epithelial membrane antigen), but is not limited thereto.
  • the step of determining the candidate substance whose expression level of the EMA is lower than the reference value as a meningioma treatment may be further included.
  • the present invention provides a method for biobanking patient-derived meningioma organoids, comprising the step of adding banking medium to the meningioma organoids and freezing them at -80°C.
  • the banking medium is 50% DMEM/F12 medium, 50% Neurobasal medium, 1X Glutamax, 1X MEM NEAAs, 1X Penstrep, 1X N-2 supplement, 1X B27 w/o vitamin A, It may contain 1X 2-mercaptoethanol, 2.5 ⁇ g/ml Insulin solution, 10 ⁇ M Y-27632 and 10% DMSO. Preferably, 10 ⁇ M Y-27632 and 10% DMSO may be added to the organoid culture medium.
  • the present invention includes the steps of recovering the patient-derived meningioma organoid biobanked by the above method; treating the recovered organoid with a candidate substance; and measuring the amount of expression or release of lactate dehydrogenase (LDH) protein or a gene encoding the same in the organoid or its culture medium.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • a step of determining a candidate substance in which the expression level or release amount of the LDH protein or the gene encoding the same is increased from a reference value may be further included as a treatment for meningioma.
  • Tissues were obtained from three meningioma patients (Grade I: MNO21-01; Grade 2: MNO21-04,05), and meningioma organoid culture was performed. Fresh meningioma tissues obtained from patients were washed with cold PBS (phosphate buffer saline), and after washing, 1% Glutamax (Gibco), 1% Penicillin/streptomycin (Gibco) and 2.5 ⁇ g/ml amphotericin B ( Gibco) was applied, and the tissue was cut into 0.5-1 mm pieces with surgical scissors.
  • PBS phosphate buffer saline
  • the cut meningioma tissue pieces were collected in a conical tube, washed three times with PBS at room temperature, and then applied with red blood cell (RBC) lysis buffer for 5-10 minutes. Thereafter, the RBC lysis buffer was removed, washed three times in a washing medium containing a 1:1 mixture of DMEM/F12 medium and Neurobasal medium, and the sliced tissues were distributed in equal amounts in a 6-well plate.
  • RBC red blood cell
  • Pre-warmed meningioma culture medium (50% DMEM/F12 medium (Thermofisher), 50% Neurobasal medium (Thermofisher), 1X Glutamax, 1X MEM NEAAs (Gibco), 1X Penstrep (Gibco), 1X N-2 supplement (Gibco), 1X B27 w/o vitamin A (Gibco), 1X 2-mercaptoethanol (Gibco), 2.5 ⁇ g/ml Insulin solution human (Sigma-aldrich)) was added to a 6-well plate and placed in an orbital shaker (Orbital Shaker) in a 37°C 5% CO 2 incubator. shaker) at 120 rpm.
  • orbital shaker Orbital Shaker
  • a single organoid was cut to a size within 0.1 to 0.5 mm using surgical scissors and tweezers. Organoids cut to smaller sizes were washed with washing medium (50% DMEM/F12 medium, 50% Neurobasal medium), then 10 ⁇ M Y-27632 (Tocris) was added to the meningioma culture medium and placed on an orbital shaker. incubated for 1 hour. Then, a banking medium (freezing medium; meningioma culture medium, 10 ⁇ M Y-27632, 10% DMSO (Sigma-aldrich)) was applied and stored in a deep freezer at -80 °C.
  • washing medium 50% DMEM/F12 medium, 50% Neurobasal medium
  • 10 ⁇ M Y-27632 Tocris
  • the growth rate was analyzed to confirm the functional characteristics of the constructed patient-derived meningioma organoids.
  • the growth rate of organoids was performed through WST analysis (Cell Counting Kit-8, Dojindo). A single organoid was dispensed in a 96-well plate, cultured for 3 weeks, and followed. At 0, 1, and 3 weeks, each well was replaced with a medium containing 1/10 of tetrazolium salt, incubated for 1 hour and 30 minutes, and absorbance was measured at 450 nm. Organoid size was photographed with Bright field.
  • Invasion capacity was analyzed to confirm the functional characteristics of the constructed patient-derived meningioma organoids.
  • matrigel Matrigel, Corning
  • collagen I collagen type I, Wako
  • 1X Ham's F12 medium and Reconstitution buffer NaHCO3, NaOH, HEPES
  • 100 ⁇ l of each mixed solution was dispensed into each 96-well plate, and single organoids were transplanted into a Matrigel-collagen matrix. After 1 hour incubation in a 37° C.
  • Meningioma organoids were fixed with 4% paraformaldehyde solution and then additionally fixed with 30% sucrose. Thereafter, after freezing using an optimal cutting temperature (OCT) compound (Sakura Finetek), the frozen sections were cut into 20 ⁇ m using a microtome at -20 ° C to prepare slides.
  • OCT optimal cutting temperature
  • fluorescently-conjugated secondary antibodies corresponding to each primary antibody were applied for 1 hour at room temperature, and after washing with TBST, stained with Hoechst for 10 minutes at room temperature to stain nuclei. Thereafter, the tissue slide was encapsulated by dropping the encapsulant and observed under a fluorescence microscope.
  • EMA a clinical diagnostic marker for meningioma
  • Iba1 and CD68 which are markers of phagocytes
  • CD31 which is a marker of vascular endothelial cells
  • LDH (lactate dehydrogenase) assay was performed to test the cytotoxicity of organoids according to the application of 4 meningioma treatment candidates.
  • a single organoid was dispensed into a 96-well plate, and four candidate substances, such as Hydroxycarbamide or hydroxyurea (HU), Everolimus, Mifepristone, and Temozolomide, were each singled.
  • HU Hydroxycarbamide or hydroxyurea
  • Everolimus Mifepristone
  • Temozolomide Temozolomide
  • the present inventors can screen drugs exhibiting anticancer efficacy using patient-derived meningioma organoids, and also screen personalized anticancer drugs, which can be usefully used for cancer treatment.

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Abstract

본 발명은 환자 유래 뇌수막종 오가노이드의 제조 방법; 상기 방법으로 제조된 오가노이드의 바이오뱅킹 방법; 및 상기 방법으로 제조된 오가노이드를 이용한 뇌수막종 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 본 발명으로 제조된 환자 유래 뇌수막종 오가노이드를 이용하여 뇌수막종 치료제를 스크리닝할 수 있고, 특히, 개인 맞춤형 뇌수막종 치료제를 스크리닝할 수 있어, 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

환자 유래 뇌수막종 오가노이드 및 이의 제조 방법
본 발명은 환자 유래 뇌수막종 오가노이드의 제조 방법; 상기 방법으로 제조된 오가노이드의 바이오뱅킹 방법; 및 상기 방법으로 제조된 오가노이드를 이용한 뇌수막종 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
한편, 본 출원은 하기 Research Fund of Seoul St. Mary's Hospital, Catholic University of Korea (ZC21BISI0795)사업에 의해 지원받았다.
뇌수막종(meningioma)은 뇌를 둘러싸고 있는 수막에서 발생하는 종양을 총칭하며, 조직학적으로 양성 종양과 악성 종양으로 구분된다. 뇌수막종은 대부분 양성 뇌수막종이며, 악성은 2~12% 정도이다. 뇌수막종은 다양한 부위에서 발생할 수 있고, 발생 부위의 해부학적 특성에 따라 각기 다른 증상이 나타난다. 이러한 뇌수막종은 신경학적 검진을 시행한 이후, 뇌 전산화 단층촬영(CT)이나 뇌 자기공명영상(MRI)을 진행하여 진단한다. 뇌수막종의 치료는 수술을 통한 제거 또는 방사선 치료를 통해 이루어지고 있고, 뇌수막종 환자를 대상으로 한 명확한 약제가 개발되지 못한 상태이다.
2007~2016년 10년간 국내에서 11만 5,000명의 원발성 뇌종양이 발생했고 10만 명당 환자가 22명 발생한 것으로 파악된다. 이중 절반 정도만 수술에 의한 조직 진단으로 확인된 점을 감안하면, 국내에서는 연간 6,000명 정도의 환자가 원발성 뇌종양 수술을 받는 것으로 추정된다. 또한, 미국신경종양학회(2019)의 보고에 따르면, 뇌종양의 5년 생존율은 신경초종(99.3%), 뇌하수체 선종(96.8%), 양성 뇌수막종(88.0%), 악성 뇌수막종(68.2%) 및 악성 교모세포종(6.8%)이며, 이 중 뇌수막종은 생존 가능성이 상대적으로 높기 때문에 적극적인 치료가 필요한 실정이다.
오가노이드(organoid)는 성체줄기세포, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포로부터 자가 재생 및 자가 조직화를 통해 형성된 3차원 세포집합체이다. 이러한 오가노이드는 인간 장기의 복잡한 구조와 기능성을 근접하게 모방하기 위해 설계되었고, 인간 조직에 대한 향상된 모델링이 가능하므로, 암 연구, 신경생물학, 줄기세포 연구, 신약 개발 분야에서 점점 중요해지고 있다. 특히, 오가노이드를 통한 개인 맞춤형 약물 스크리닝 또는 유전체 기반 정밀 의학연구에 적합할 수 있다.
2019년 오가노이드 시장은 발달생물학(29%), 약물 탐색 및 맞춤의약(22.9%), 감염 병리학(16.6%), 재생의료(14.4%), 약물 독성 및 효능 평가(12.8%)의 순으로 적용된 것으로 파악되고, 2027년에는 발달생물학(30.4%), 약물 탐색 및 맞춤의약(25.3%), 감염 병리학(15.7%), 재생의료(13%), 약물 독성 및 효능 평가(12.3%)의 순서로 시장 점유를 예상하여 약물 탐색 및 맞춤의약을 이루기 위한 오가노이드 시장이 점차 확대될 것으로 예상된다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) 한국공개특허 제10-2020-0061235호
본 발명의 목적은 (a) 뇌수막종 환자로부터 분리된 뇌수막종 조직에 배지를 넣고 잘게 자르는 단계; (b) 상기 잘게 자른 조직에 RBC(red blood cell) 용해 완충액을 처리하는 단계; 및 (c) 상기 용해 완충액이 처리된 조직에 배양 배지를 넣은 후 배양하는 단계를 포함하는 환자 유래 뇌수막종 오가노이드의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 제조 방법으로 제조된 환자 유래 뇌수막종 오가노이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 뇌수막종 오가노이드에 후보 물질을 처리하는 단계; 및 상기 오가노이드 또는 이의 배양액에서 LDH(lactate dehydrogenase) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량 또는 방출량을 측정하는 단계를 포함하는 뇌수막종 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 뇌수막종 오가노이드에 후보 물질을 처리하는 단계; 및 상기 오가노이드 또는 이의 배양액에서 뇌수막종 진단 마커의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 뇌수막종 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 뇌수막종 오가노이드에 뱅킹용 배지를 넣고 -80 ℃에서 동결시키는 단계를 포함하는 환자 유래 뇌수막종 오가노이드의 바이오뱅킹(biobanking) 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 바이오뱅킹된 환자 유래 뇌수막종 오가노이드를 회복(recovery)시키는 단계; 상기 회복된 오가노이드에 후보 물질을 처리하는 단계; 및 상기 오가노이드 또는 이의 배양액에서 LDH(lactate dehydrogenase) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량 또는 방출량을 측정하는 단계를 포함하는 개인 맞춤형 뇌수막종 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 뇌수막종 환자로부터 분리된 뇌수막종 조직에 배지를 넣고 잘게 자르는 단계; (b) 상기 잘게 자른 조직에 RBC(red blood cell) 용해 완충액을 처리하는 단계; 및 (c) 상기 용해 완충액이 처리된 조직에 배양 배지를 넣은 후 배양하는 단계를 포함하는 환자 유래 뇌수막종 오가노이드의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조 방법으로 제조된 환자 유래 뇌수막종 오가노이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 뇌수막종 오가노이드에 후보 물질을 처리하는 단계; 및 상기 오가노이드 또는 이의 배양액에서 LDH(lactate dehydrogenase) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량 또는 방출량을 측정하는 단계를 포함하는 뇌수막종 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 뇌수막종 오가노이드에 후보 물질을 처리하는 단계; 및 상기 오가노이드 또는 이의 배양액에서 뇌수막종 진단 마커의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 뇌수막종 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 뇌수막종 오가노이드에 뱅킹용 배지를 넣고 -80 ℃에서 동결시키는 단계를 포함하는 환자 유래 뇌수막종 오가노이드의 바이오뱅킹(biobanking) 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 바이오뱅킹된 환자 유래 뇌수막종 오가노이드를 회복(recovery)시키는 단계; 상기 회복된 오가노이드에 후보 물질을 처리하는 단계; 및 상기 오가노이드 또는 이의 배양액에서 LDH(lactate dehydrogenase) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량 또는 방출량을 측정하는 단계를 포함하는 개인 맞춤형 뇌수막종 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법으로 제조된 환자 유래 뇌수막종 오가노이드는 뇌수막종의 종양 특이적 기능 및 구조를 유지할 수 있어, 이를 이용하여 뇌수막종 치료제를 스크리닝할 수 있고, 특히, 개인 맞춤형 뇌수막종 치료제를 스크리닝할 수 있어, 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 바이오 뱅킹 후 회복된 오가노이드를 배양한 후 1주 및 3주째에 성장율을 측정한 결과이다.
도 2는 3종의 오가노이드의 성장율(a) 및 크기(b)를 측정한 결과이다.
도 3은 3종의 오가노이드의 침윤능을 측정한 결과이다.
도 4는 3종의 오가노이드에 대해 H&E 염색을 수행한 결과이다.
도 5는 뇌수막종 오가노이드에 대한 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry)을 수행한 결과이다.
도 6은 뇌수막종 오가노이드에 4종의 약물을 처리한 후 LDH 분석을 수행한 결과이다 (Hydroxyurea, HU; Everolimus, Evero; Mifepristone, Mife; 및 Temozolomide, TMZ).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 (a) 뇌수막종 환자로부터 분리된 뇌수막종 조직에 배지를 넣고 잘게 자르는 단계; (b) 상기 잘게 자른 조직에 RBC(red blood cell) 용해 완충액을 처리하는 단계; 및 (c) 상기 용해 완충액이 처리된 조직에 배양 배지를 넣은 후 배양하는 단계를 포함하는 환자 유래 뇌수막종 오가노이드의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 (a) 단계의 배지는 1% Glutamax, 1% Penicillin/streptomycin 및 2.5 μg/ml의 amphotericin B가 포함된 차가운 Hibernate-A 배지인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 (c) 단계의 배양 배지는 50% DMEM/F12 배지, 50% Neurobasal 배지, 1X Glutamax, 1X MEM NEAAs, 1X Penstrep, 1X N-2 supplement, 1X B27 w/o vitamin A, 1X 2-mercaptoethanol 및 2.5 μg/ml Insulin solution이 포함된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 (c) 단계의 배양은 배양기 내 오비탈 쉐이커(Orbital shaker)에서 120 rpm으로 배양하는 것일 수 있다. 상기 배양기는 일반적으로 사용되는 37℃ 5% CO2 배양기인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 (b) 단계 후, DMEM/F12 배지와 Neurobasal 배지를 1:1로 혼합한 배지로 세척하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에서, 상기 DMEM/F12 배지와 Neurobasal 배지를 1:1로 혼합한 배지는 세척용 배지로 칭할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조 방법으로 제조된 환자 유래 뇌수막종 오가노이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 뇌수막종 오가노이드에 후보 물질을 처리하는 단계; 및 상기 오가노이드 또는 이의 배양액에서 LDH(lactate dehydrogenase) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량 또는 방출량을 측정하는 단계를 포함하는 뇌수막종 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 LDH 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량 또는 방출량이 기준치보다 증가한 후보 물질을 뇌수막종 치료제로 판단하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 뇌수막종 오가노이드에 후보 물질을 처리하는 단계; 및 상기 오가노이드 또는 이의 배양액에서 뇌수막종 진단 마커의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 뇌수막종 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 뇌수막종 진단 마커는 EMA(epithelial membrane antigen)인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 EMA의 발현량이 기준치보다 감소한 후보 물질을 뇌수막종 치료제로 판단하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 뇌수막종 오가노이드에 뱅킹용 배지를 넣고 -80 ℃에서 동결시키는 단계를 포함하는 환자 유래 뇌수막종 오가노이드의 바이오뱅킹(biobanking) 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 뱅킹용 배지는 50% DMEM/F12 배지, 50% Neurobasal 배지, 1X Glutamax, 1X MEM NEAAs, 1X Penstrep, 1X N-2 supplement, 1X B27 w/o vitamin A, 1X 2-mercaptoethanol, 2.5 μg/ml Insulin solution, 10 μM Y-27632 및 10% DMSO가 포함된 것일 수 있다. 바람직하게는, 오가노이드의 배양 배지에 10 μM Y-27632 및 10% DMSO가 추가된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 바이오뱅킹된 환자 유래 뇌수막종 오가노이드를 회복(recovery)시키는 단계; 상기 회복된 오가노이드에 후보 물질을 처리하는 단계; 및 상기 오가노이드 또는 이의 배양액에서 LDH(lactate dehydrogenase) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량 또는 방출량을 측정하는 단계를 포함하는 개인 맞춤형 뇌수막종 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 LDH 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량 또는 방출량이 기준치보다 증가한 후보 물질을 뇌수막종 치료제로 판단하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 환자-유래 뇌수막종 오가노이드(Meningioma organoid)의 제조 및 배양 방법
총 3명의 뇌수막종 환자(Grade I: MNO21-01; Grade 2: MNO21-04,05)로부터 조직을 얻어, 뇌수막종 오가노이드 배양을 수행하였다. 환자에게서 얻은 신선한 뇌수막종 조직(Fresh meningioma tissues)은 차가운 PBS(phosphate buffer saline)로 세척하였으며, 세척 후, 1% Glutamax (Gibco), 1% Penicillin/streptomycin (Gibco) 및 2.5 μg/ml의 amphotericin B (Gibco)이 포함된 차가운 Hibernate-A 배지를 적용시킨 상태에서 조직을 외과용 가위와 0.5~1mm 크기로 잘게 조각내었다. 잘려진 뇌수막종 조직 조각은 Conical tube에 모아 실온의 PBS로 3회 세척한 후, RBC(red blood cell) 용해 완충액(lysis buffer)로 5-10분간 적용시켰다. 이후, RBC 용해 완충액을 제거하고, DMEM/F12 배지와 Neurobasal 배지를 1:1로 섞은 세척용 배지에서 3회 세척하고, 6 웰 플레이트에 조각된 조직을 동등한 양으로 분배하였다. 예열된 뇌수막종 배양 배지 (50% DMEM/F12 배지 (Thermofisher), 50% Neurobasal 배지 (Thermofisher), 1X Glutamax, 1X MEM NEAAs (Gibco), 1X Penstrep (Gibco), 1X N-2 supplement (Gibco), 1X B27 w/o vitamin A (Gibco), 1X 2-mercaptoethanol (Gibco), 2.5 μg/ml Insulin solution human (Sigma-aldrich))를 6 웰 플레이트에 넣어주고 37℃ 5% CO2 배양기 내 오비탈 쉐이커(Orbital shaker)에서 120 rpm으로 배양하였다.
실시예 2. 환자-유래 뇌수막종 오가노이드의 바이오뱅킹(Biobanking) 및 회복(Recovery)
2주 내지 3주 동안 배양된 뇌수막종 오가노이드를 바이오 뱅킹하기 위해 외과용 가위와 핀셋을 이용하여 단일 오가노이드를 0.1~0.5 mm 이내의 크기로 잘라주었다. 더 작은 크기로 잘려진 오가노이드는 세척용 배지(50% DMEM/F12 배지, 50% Neurobasal 배지)로 세척한 후, 뇌수막종 배양 배지에 10 μM Y-27632(Tocris)를 추가하여 오비탈 쉐이커(Orbital shaker)에서 1시간 배양하였다. 이후, 뱅킹용 배지(freezing medium; 뇌수막종 배양배지, 10 μM Y-27632, 10% DMSO (Sigma-aldrich))를 적용하여 -80 ℃의 deep freezer에 보관하였다.
동결 보관된 오가노이드를 다시 실험에 사용하기 위해서는 37℃ bath에 Cryotube를 빠르게 녹인 후, 10 μM Y-27632가 포함된 뇌수막종 배양 배지를 적용시켜 오비탈 쉐이커(Orbital shaker)가 없는 37℃ 5% CO2 배양기 내에서 밤샘 배양하였다. 다음 날, 10 μM Y-27632 포함되지 않은 새로운 뇌수막종 배양 배지로 교체하고, 37℃ 5% CO2 배양기 내 오비탈 쉐이커(Orbital shaker)에서 120 rpm으로 배양하였다. 바이오 뱅킹-회복된 오가노이드는 3주 배양한 이후 평균 O.D 값이 0.364로서 오가노이드의 성장이 완전히 회복되어 안정화되었다 (도 1).
실시예 3. 환자 유래 뇌수막종 오가노이드의 기능적 특성 확인
3.1. 오가노이드 성장율 측정(Proliferation assay)
구축된 환자 유래 뇌수막종 오가노이드의 기능적 특성을 확인을 위해 성장율을 분석하였다. 오가노이드의 성장율은 WST 분석법(Cell Counting Kit-8, Dojindo)을 통해 수행하였다. 96 웰 플레이트에 단일 오가노이드를 분주하고, 3주간 배양하며 추적 관찰하였다. 0, 1, 3주째에 각 웰에 테트라졸리움 염(Tetrazolium)을 1/10로 첨가한 배지로 교체하고, 1시간 30분 동안 인큐베이션한 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 오가노이드 크기는 Bright field로 촬영하였다.
그 결과, 3종의 오가노이드 모두 첫 측정 시점에 비해 성장율이 각각 3.89 배(MNO21-01), 2.63 배(MNO21-04) 및 5.33 배(MNO21-05)로 증가하였으며 (도 2a), 오가노이드의 크기도 3주째 더욱 커진 것을 확인하였다 (도 2b).
3.2. 오가노이드의 침윤능 측정(Invasion assay)
구축된 환자 유래 뇌수막종 오가노이드의 기능적 특성을 확인을 위해 침윤능을 분석하였다. 3차원 침윤 분석을 위해 마트리겔(Matrigel, Corning)과 콜라겐 I (Collagen type I, Wako)을 1:1 비율로 섞고, 1X Ham's F12 배지와 Reconstitution buffer(NaHCO3, NaOH, HEPES)를 혼합하여 매트릭스(matrix) 구축을 위한 혼합 용액을 만들었다. 혼합 용액은 사용 전까지 4℃에서 혼합 및 유지시켰으며, 각 혼합용액 100 μl를 각 96 웰 플레이트에 분주하고, 단일 오가노이드를 마트리겔-콜라겐 매트릭스 내에 이식하였다. 37℃및 5% CO2 배양기에 1시간 인큐베이션한 후, 뇌수막종 배양 배지 50 μl를 매트릭스 상층에 첨가하였다. 이식 당일과 72시간 배양 후 Bright field로 오가노이드를 촬영하였고, 72시간이 경과한 시점에서 오가노이드가 차지하는 면적을 이식 당일 초기 면적과 비교하여 침윤능을 분석하였다.
그 결과, 각 마트리겔-콜라겐 매트릭스 내 이식된 오가노이드는 72시간 째에 주변 매트릭스로 침윤하는 것을 확인하였다 (도 3).
실시예 4. 환자 유래 뇌수막종 오가노이드의 구조적 특성 확인
구축된 환자 유래 뇌수막종 오가노이드의 구조적 특성을 확인하기 위해, H&E 염색(Hematoxyin & Eosin)을 통해 실제 뇌수막종 진단 환자의 조직과의 차이를 비교하였으며, 뇌수막종 오가노이드 내부에 존재하는 다양한 종류의 세포를 확인하기 위해 면역조직화학염색(Immunohistochemistry, IHC)을 시행하였다.
뇌수막종 오가노이드는 4% 파라포름 알데하이드 용액으로 고정한 후, 30% 수크로오스(sucrose)로 추가 고정하였다. 이후, 최적 절단 온도(OCT) 화합물 (Sakura Finetek)을 이용하여 동결시킨 후, -20℃에서 마이크로톰(microtome)을 사용하여 냉동 절편을 20 μm로 절단하여 슬라이드 제작하였다.
H&E 염색에서는 제작된 냉동절편 슬라이드를 TBST로 3회 세척한 후, 헤마톡실린과 에오신 용액(Sigma-aldrich)으로 염색하였다. 그 결과, 3종의 오가노이드 모두에서는 실제 뇌수막종 진단 환자의 조직 슬라이드와 유사한 조직학적 형태를 띄는 것을 관찰할 수 있었다 (도 4).
이후, 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry)에 있어, DAB을 위해 냉동절편 슬라이드를 TBST(Tris buffered saline, 0.1% Tween)로 3회 세척한 후, Citrate buffer 또는 Tris-EDTA 용액 등을 이용하여 항원 복구(Antigen retrieval)를 시행하였다. 이후, 내인성 과산화효소 억제(endogenous peroxidase blocking)와 세포 표면에 구멍을 내어주기 위해 메탄올 용매에 30% 과산화수소 용액 1/10의 비율로 섞어 상온에서 10분간 조직 슬라이드에 처리하였다. 이후, 5% 소혈청(Bovine serum)을 실온에서 1시간 동안 적용시킨 후, 1% 소혈청과 1차 항체를 함께 적용하여 4℃에서 밤새 적용시켰다. 1차 항체는 EMA(Dako), Ki67(Abcam), Vimentin(Cell signaling technology), CD3(Abcam), Iba1(Abcam), CD68(Abcam), CD31(Abcam), SOX2(Abcam)를 사용하였다. 다음 날, 각 1차 항체에 상응하는 2차 항체들을 30분 이상 적용하였으며, TBST 세척 후, DAB 적용하여 발색시켰다. 이후, 봉입제를 이용하여 슬라이드를 봉입한 후, 현미경으로 관찰하였다.
또한, 형광 염색을 위해 냉동절편 슬라이드를 TBST로 3회 세척한 후, Citrate buffer 또는 Tris-EDTA 용액 등을 이용하여 항원 복구(Antigen retrieval)을 시행하였다. 이후, 세포 표면에 구멍을 내어주기 위해 0.01% 트리톤 x-100 용액을 상온에서 10분간 처리하였다. 이후, 5% 소혈청(Bovine serum)을 실온에서 1시간 동안 적용시킨 후, 1% 소혈청과 1차 항체를 함께 적용하여 4℃에서 밤새 적용시켰다. 1차 항체는 EMA(Dako), Ki67(Abcam), Vimentin(Cell signaling technology), CD3(Abcam), Iba1(Abcam), CD68(Abcam), CD31(Abcam), SOX2(Abcam)를 사용하였다. 다음 날, 각 1차 항체에 상응하는 형광-접합된 2차 항체들을 실온에서 1시간 동안 적용하였으며, TBST 세척 후, 핵을 염색하기 위해 Hoechst로 상온에서 10분간 염색하였다. 이후, 조직 슬라이드에서 봉입제를 떨어뜨려 봉입한 후 형광 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 환자 유래 오가노이드 내부에는 뇌수막종의 임상적 진단 표지자인 EMA의 발현이 강하게 나타났고, 이외에도 지주막 세포(Arachnoid cell)의 표지자 중 하나인 Vimentin, 면역세포 T 세포의 표지자인 CD3, Microglia (대식세포)의 표지자인 Iba1와 CD68, 혈관내피세포 표지자인 CD31의 마커가 강하게 발현한 것을 확인하였다 (도 5).
실시예 5. 뇌수막종 치료제 후보물질 처리에 따른 오가노이드의 세포독성 분석(Cytotoxicity test)
뇌수막종 치료제 후보물질 4종의 적용에 따른 오가노이드의 세포독성 검사를 시행하기 위해, LDH(lactate dehydrogenase) assay (Promega)을 수행하였다. 96웰 플레이트에 단일 오가노이드를 분주하고, 하이드록시카바마이드(Hydroxycarbamide or hydroxyurea, HU), 에버롤리무스(Everolimus), 미페프리스톤(Mifepristone) 및 테모졸로마이드(Temozolomide) 등의 후보물질 4종을 각각 단일 오가노이드가 분주된 웰에 농도별로 처리한 후, 72시간 동안 37℃및 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 이후, 오가노이드 배양액 일부와 LDH 검출용액을 혼합하여 상온에서 빛이 차단된 상태로 1시간 동안 인큐베이션한 후, 발광값을 측정하였다.
그 결과, 미페프리스톤(Mifepristone) 및 테모졸로마이드(Temozolomide)이 처리된 2종의 뇌수막종 오가노이드(MNO21-04,05)에서는 농도-의존적으로 LDH 방출량(release)가 증가함으로써 세포독성이 증가하였음을 확인하였다 (도 6). 반면, 하이드록시카바마이드(Hydroxycarbamide or hydroxyurea) 및 에버롤리무스(Everolimus)가 처리된 뇌수막종 오가노이드에서는 농도-의존적인 반응이 나타나지 않았다 (도 6).
이로써, 본 발명자들은 환자 유래 뇌수막종 오가노이드를 이용하여 항암 효능을 나타내는 약물을 스크리닝할 수 있고, 더불어 개인 맞춤형 항암제를 스크리닝할 수 있어, 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (15)

  1. (a) 뇌수막종 환자로부터 분리된 뇌수막종 조직에 배지를 넣고 잘게 자르는 단계;
    (b) 상기 잘게 자른 조직에 RBC(red blood cell) 용해 완충액을 처리하는 단계; 및
    (c) 상기 용해 완충액이 처리된 조직에 배양 배지를 넣은 후 배양하는 단계를 포함하는 환자 유래 뇌수막종 오가노이드의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 배지는 1% Glutamax, 1% Penicillin/streptomycin 및 2.5 μg/ml의 amphotericin B가 포함된 차가운 Hibernate-A 배지인 것인, 제조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 배양 배지는 50% DMEM/F12 배지, 50% Neurobasal 배지, 1X Glutamax, 1X MEM NEAAs, 1X Penstrep, 1X N-2 supplement, 1X B27 w/o vitamin A, 1X 2-mercaptoethanol 및 2.5 μg/ml Insulin solution이 포함된 것인, 제조 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 배양은 배양기 내 오비탈 쉐이커(Orbital shaker)에서 120 rpm으로 배양하는 것인, 제조 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 (b) 단계 후, DMEM/F12 배지와 Neurobasal 배지를 1:1로 혼합한 배지로 세척하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것인, 제조 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 제조 방법으로 제조된 환자 유래 뇌수막종 오가노이드.
  7. 제 6 항에 따른 뇌수막종 오가노이드에 후보 물질을 처리하는 단계; 및
    상기 오가노이드 또는 이의 배양액에서 LDH(lactate dehydrogenase) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량 또는 방출량을 측정하는 단계를 포함하는 뇌수막종 치료제의 스크리닝 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 LDH 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량 또는 방출량이 기준치보다 증가한 후보 물질을 뇌수막종 치료제로 판단하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것인, 스크리닝 방법.
  9. 제 6 항에 따른 뇌수막종 오가노이드에 후보 물질을 처리하는 단계; 및
    상기 오가노이드 또는 이의 배양액에서 뇌수막종 진단 마커의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 뇌수막종 치료제의 스크리닝 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 뇌수막종 진단 마커는 EMA(epithelial membrane antigen)인 것인, 스크리닝 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 EMA의 발현량이 기준치보다 감소한 후보 물질을 뇌수막종 치료제로 판단하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것인, 스크리닝 방법.
  12. 제 6 항에 따른 뇌수막종 오가노이드에 뱅킹용 배지를 넣고 -80 ℃에서 동결시키는 단계를 포함하는 환자 유래 뇌수막종 오가노이드의 바이오뱅킹(biobanking) 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 뱅킹용 배지는 50% DMEM/F12 배지, 50% Neurobasal 배지, 1X Glutamax, 1X MEM NEAAs, 1X Penstrep, 1X N-2 supplement, 1X B27 w/o vitamin A, 1X 2-mercaptoethanol, 2.5 μg/ml Insulin solution, 10 μM Y-27632 및 10% DMSO가 포함된 것인, 바이오뱅킹 방법.
  14. 제 12 항에 따른 방법으로 바이오뱅킹된 환자 유래 뇌수막종 오가노이드를 회복(recovery)시키는 단계;
    상기 회복된 오가노이드에 후보 물질을 처리하는 단계; 및
    상기 오가노이드 또는 이의 배양액에서 LDH(lactate dehydrogenase) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량 또는 방출량을 측정하는 단계를 포함하는 개인 맞춤형 뇌수막종 치료제의 스크리닝 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 LDH 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량 또는 방출량이 기준치보다 증가한 후보 물질을 뇌수막종 치료제로 판단하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것인, 스크리닝 방법.
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