WO2023145754A1 - 膀胱癌の存在を検出するためのプライマー及びプローブ - Google Patents

膀胱癌の存在を検出するためのプライマー及びプローブ Download PDF

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崇 松元
真己 塩田
正俊 江藤
東天 康
啓輔 兒玉
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Denka Co Ltd
Kyushu University NUC
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer

Definitions

  • the present invention broadly relates to primers, probes, etc. for detecting the presence of bladder cancer.
  • Liquid biopsy which detects tumor-derived genetic mutations in blood-circulating DNA (cell-free DNA: cfDNA), is a minimally invasive test, and has been reported in recent years to be effective in postoperative follow-up and assessment of therapeutic effects.
  • cfDNA analysis methods include the use of next-generation sequencing (NGS) and digital PCR.
  • NGS next-generation sequencing
  • Digital PCR has the advantage that it can be analyzed at a lower cost than NGS.
  • TERT telomerase reverse transcriptase
  • a primer set for detecting the presence of bladder cancer in a specimen comprising: a pair of primers, which are oligonucleotides with a length of 16 bases or more and 21 bases or less, targeting mutations in the PLEKHS1 promoter; one or more pairs of primers that target mutations in the TERT promoter; A primer set, including (2)
  • the PLEKHS1 promoter mutation is a G to A substitution at chromosome 10, position 115,511,590, a C to T substitution at chromosome 10, position 115,511,593, or both (1) Primer set described in .
  • a kit comprising the primer set according to any one of (1) to (4).
  • the kit according to (7) further comprising the probe according to (5) or (6).
  • a method for detecting the presence of bladder cancer in a specimen wherein the primer set according to any one of (1) to (4) or the probe according to (5) or (6) is used to detect the PLEKHS1 promoter.
  • the method according to (9), wherein the nucleic acid amplification method used in the detection step is digital PCR.
  • (11) The method according to (9) or (10), wherein the specimen is a liquid specimen.
  • Mutations in the PLEKHS1 promoter include G to A substitution at position 115,511,590 of chromosome 10 and C to T substitution at position 115,511,593 of chromosome 10.
  • the present inventors set the positions corresponding to these mutations near the center of the probe so as to maximize the Tm value.
  • the probe is usually designed as a 20-mer, 18-mer at the shortest, and 25-mer at the longest. bottom.
  • the primer was also designed with a different concept than usual.
  • the length of primers is designed to be about 20-25 mers. If the length of the primer is less than 20-mer, there is a possibility that the sequence that non-specifically binds to the base sequence other than the target increases, but the forward primer that detects the mutation of the PLEKHS1 promoter is a 16-mer. designed. This is in consideration of the need to lower the Tm value compared to wild-type/mutant probes.
  • the region containing the hotspot of the PLEKHS1 promoter region is an AT-rich sequence, but the primer design region is a sequence that cannot be said to be AT-rich, so the Tm value becomes high, and it is necessary to shorten the sequence. There is Furthermore, trying to avoid GC, for example, designing an A or T at the 3' end of the primer may reduce specificity for the template DNA. However, by conducting verification experiments, it was possible to design a shorter length with a lower Tm value than general designs.
  • the Tm value of the mutant probe is lower than that of the forward primer.
  • the annealing order is wild-type probe (53.92), forward primer (52.61), mutant probe (52.28), reverse primer (50.66).
  • the size of the amplicon to be amplified was designed to be less than 200 bp.
  • primers that target mutations in the PLEKHS1 promoter that are designed under a different concept as described above can be used to detect bladder cancer. It will be possible to cover patients who did not have it.
  • FIG. 2 shows the results of quantification of positive/negative droplets in mutation-positive patients.
  • Ch1 indicates Mut droplets
  • Ch2 indicates WT droplets
  • the lower left frame is WT and Mut negative droplets
  • the lower right frame is WT positive droplets
  • the upper left frame is Mut positive droplets
  • the upper right frame is WT. and Mut-positive droplets.
  • FIG. 1 shows detection accuracy (upper) and mutation rate (lower) of validation plasmids (wild-type (WT) and mutant-type (Mut)).
  • FIG. 2 shows the results of quantification of positive/
  • FIG. 3 shows changes over time in MAF: Mutation Allele Frequency after initial treatment (transurethral bladder tumor resection) of mutation-positive patients.
  • the arrows in the figure indicate mutations (or indicates the specific stage of the sample containing it).
  • the left figure shows the results of patient number 03 (Pt03), and the right figure shows the results of patient number 21 (Pt21).
  • Pt03 the results of patient number 03
  • Pt21 patient number 21
  • FIG. 4 illustrates the coverage of bladder cancer patients by the primers/probes of the present invention.
  • a primer set for detecting the presence of bladder cancer in a specimen comprising: a pair of primers, which are oligonucleotides with a length of 16 bases or more and 21 bases or less, targeting mutations in the PLEKHS1 promoter; one or more pairs of primers that target mutations in the TERT promoter;
  • a primer set comprising:
  • the specimen is not particularly limited as long as it can detect PLEKHS1 promoter mutation and TERT promoter mutation suggesting the presence of bladder cancer.
  • Fluid specimens containing cfDNA are preferred, such as blood or other bodily fluids. More specifically, the specimen is preferably blood, serum, plasma, urine, stool, saliva, sputum, interstitial fluid, cerebrospinal fluid, bodily fluids such as swabs, or dilutions thereof, particularly plasma.
  • Specimens are collected from subjects suspected of having bladder cancer.
  • Bladder cancer may be non-muscle invasive or muscle invasive.
  • the sample may be collected once or multiple times for purposes such as prognosis observation after bladder cancer treatment.
  • ctDNA bladder cancer-derived DNA
  • the PLEKHS1 promoter mutation is a G to A substitution (hereinafter also referred to as “590G>A”) at position 115,511,590 on chromosome 10, 115,511,593 on chromosome 10. It may be a C to T substitution at the position (hereinafter also referred to as “593C>T”) or both.
  • a primer is an oligonucleotide with a length of 16 bases or more and no more than 21 bases. Among them, those having a low Tm value are preferable. Specifically, by setting the Tm value of the reverse primer to be 1 to 3° C. higher than that of the probe, the probe is annealed to the template DNA first, and then the reverse primer is annealed.
  • the primers can be designed so that the amplicon size to be amplified is less than 200 bp.
  • SEQ ID NO: 1 having a base length of 16 bases
  • examples include the forward primer (gacctcttggcttcca) described above and the reverse primer (ctgcaaattttccatttcca) described in SEQ ID NO: 2, which has a base length of 21 bases. It is preferable to use a primer set consisting of the sequences set forth in SEQ ID NOS: 1 and 2. These primers may be combined with known primer sets that amplify the PLEKHS1 promoter region.
  • the TERT promoter mutation is a C to T substitution (hereinafter also referred to as “228C>T”) at position 1,295,228 on chromosome 5, 1,295,250 on chromosome 5 It may be a C to T substitution at the position (hereinafter also referred to as “250C>T”) or both.
  • 228C>T is known to be highly detectable in bladder cancer and 250C>T in non-muscle invasive bladder cancer.
  • Primers that amplify sequences containing probes that detect both the 228C>T and 250C>T mutations should be within 113 bp upstream or downstream of each mutation, i.e., primers targeting the former mutation. and within the region of positions 1,295,115 to 1,295,341 for the probe and within the region of positions 1,295,237 to 1,295,363 for primers and probes targeting the latter mutation. can be designed.
  • sequence shown in SEQ ID NO: 7 is obtained by converting the sequence into the sequence on the sense strand side and reflecting both the 228C>T and 250C>T mutations.
  • primers and probes that detect 228C>T the 227 bp sequence from positions 1,295,341 to 1,295,115 corresponding to positions 1,295,115 to 1,295,341 in SEQ ID NO: 7
  • Desired primers and probes can be appropriately designed from (SEQ ID NO: 8).
  • primers and probes for detecting 250C>T which can be designed from the 127 bp sequence (SEQ ID NO: 9) from positions 1,295,363 to 1,295,237.
  • a primer made by BioRad (TERT C228T_113: DHSAEXD72405942, TERT C250T_113: DHSAEXD466675715) (Ampuri Conto) (J Mol Diagn. 2019 MAR. 2019 MAR. See 21 (2) 274-285 ).
  • Such primers may be combined with known primer sets that amplify the TERT promoter region.
  • SEQ ID NO:6 GCCGGGGCCAGGGCTTCCCACGTGCAGCAGGACGCAGCGCTGCCTGAAACTCGCGCCGCGAGGAGAGGGCGGGGCCGCGGAAAGGAAGGGGAGGGGCTGGGAGGGCCCGGAGGGGGCTGGGCCGGGGACCCGGGAGGGGTCGGGACGGGGGGCGGGGTCCGCGCGGAGGAGGCGGAGCTGGAAGGTGAAGGGGCAGGACGGGTGCCCGGGTCCCCAGTCCCTCCGCCACGTGGGAAGCGCGGT CCTGGGMore SEQ ID NO: 7 CCCAGGACCGCGCTTCCCACGTGGCGGAGGGACTGGGGACCCCGGGCACCCGTCCTGCCCCTTCACCTTCCAGCTCCCGTCCCGGGTCCCCCCTCCGGGCCCTCCCTCCTCCGGGCCCTCCCTCCTCCGGGCCCTCCCTCCCCTCCGGGCCCTCCCTCCCCTCCGGGCCCTCCCTCCCCTCCGGGCCCTCCCTCCCTCCTCCGGGCCCTCCCTCCCTCCTCCGGGCCCTCC
  • the nucleotides that make up the base sequences of primers and the like may be either ribonucleotides or deoxyribonucleotides. These oligonucleotides can be synthesized by known methods, for example, by any nucleic acid synthesis method such as solid-phase phosphoramidite method and triester method, according to the base sequence.
  • a nucleic acid amplification reaction using the above primers makes it possible to amplify sequences containing hotspot regions associated with bladder cancer.
  • Nucleic acid amplification methods include PCR methods, and in addition to normal PCR, digital PCR, multiplex PCR, LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) method, ICAN (Isothermal and Chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids) method, RCA ( Rolling Circle Amplification) method, LCR (Ligase Chain Reaction) method, SDA (Strand Displacement Amplification) method, and the like.
  • the nucleic acid amplification method is preferably digital PCR.
  • digital PCR it is possible to determine the ratio of mutant to normal types (MAF: Mutation Allele Frequency) for oncogenes.
  • Digital PCR may be droplet digital PCR.
  • a probe for detecting the presence of bladder cancer in a specimen is provided, the probe targeting mutations in the PLEKHS1 promoter.
  • the sequence that constitutes the probe is not limited as long as it can detect mutations in the PLEKHS1 promoter.
  • probes that can detect the 590G>A mutation or the 593C>T mutation are preferred.
  • the probe that detects the 590G>A mutation has the sequence set forth in SEQ ID NO: 4 (tgcaattgtttaattgcaaaaagc).
  • the probe consists of the sequence set forth in SEQ ID NO:4.
  • the probe that detects the 593C>T mutation has the sequence set forth in SEQ ID NO:5.
  • the probe preferably consists of the sequence (tgcaattattcaattgcaaaaagc) set forth in SEQ ID NO:5.
  • the probe may be partially modified, examples of which include those whose ends are aminated and those whose bases are partially modified with linker bases.
  • another base may be inserted into part of the base sequence, a part of the base sequence may be deleted, replaced with another base, or substituted with a substance other than a base. .
  • the probe may be modified with a labeling substance or the like, and may have, for example, a fluorescent dye and its quencher.
  • a fluorescent dye and its quencher Commercially available products can be used as such labeling substances.
  • the quencher is not particularly limited as long as it can quench the fluorescence from the fluorescent dye.
  • the nucleotide residues constituting the probe may themselves be modified, for example, substituted with artificially modified nucleotide residues.
  • kits in a second aspect, includes a primer set for detecting the presence of bladder cancer in a specimen.
  • the primer set described above can be used.
  • the kit may further contain probes targeting mutations in the PLEKHS1 promoter.
  • Probes for detecting the 590G>A and 593C>T mutations include those having the base sequences of SEQ ID NOS: 4 and 5, respectively.
  • the kit may further include one or more pairs of primers and probes targeting mutations in the TERT promoter.
  • Mutations in the TERT promoter include 228C>T and 250C>T. within the region of positions 1,295,115 to 1,295,341 for primers and probes targeting 228C>T; It can be designed within the region of 295,363 positions.
  • a reaction solution containing the above primer set, probe, sample, and DNA polymerase is prepared. After being distributed to wells or droplets, the reaction solution is subjected to an amplification reaction.
  • a labeling substance that can specifically recognize the amplification product may be used to detect the amplification product obtained in the nucleic acid amplification reaction.
  • labeling substances include fluorescent dyes, biotin, digoxigenin and the like.
  • fluorescence can be detected using a fluorescence microscope, a fluorescence plate reader, or the like.
  • a substance that intercalates with the amplification product can also be used as a labeling substance.
  • the intercalator is not particularly limited as long as it is a substance that intercalates with the double-stranded DNA and emits fluorescence.
  • detection may be performed by known methods such as electrophoresis using polyacrylamide or agarose gel.
  • electrophoresis the presence of an amplification product can be identified from the mobility of the amplification product relative to the mobility of a marker of known molecular weight.
  • Detection method In a third aspect, a method for detecting the presence of bladder cancer in a specimen is provided, comprising detecting mutations in the PLEKHS1 promoter using the primer set or kit described above.
  • the primer set includes primers that target mutations in the TERT promoter, and that mutations in the TERT promoter are also detected in the detection process.
  • Other steps may be included before or after the detection step, for example, a specimen may be obtained from a subject suspected of having bladder cancer. The detection step may be performed multiple times, for example, specimens derived from the same subject may be collected periodically and subjected to the detection step each time they are collected.
  • a mutation in the PLEKHS1 promoter is detected, it is determined that bladder cancer is present in the specimen. This can assist doctors in diagnosing bladder cancer and determining subsequent treatment methods.
  • surgery such as transurethral bladder tumor resection, radical cystectomy, preoperative chemotherapy, postoperative chemotherapy, chemotherapy such as recurrent chemotherapy (anti-cancer drug therapy) and radiotherapy can be performed.
  • transurethral bladder tumor resection it will be possible to diagnose muscle invasion from the results of transurethral bladder tumor resection. If the tumor does not invade the muscle layer, treatment is completed with only transurethral resection of the bladder tumor, followed by follow-up.
  • preoperative chemotherapy will be started, and if recurrence or metastasis is found after completion of treatment, recurrent chemotherapy will be introduced.
  • Preoperative chemotherapy can improve the prognosis, but it may not be given depending on the histology of the tumor and the patient's wishes.
  • Postoperative chemotherapy is often added when intraoperative findings suggest residual disease. If radical cystectomy is considered difficult due to age or general condition, radiation may be performed instead.
  • primer dimer evaluation is performed by PCR electrophoresis, PCR efficiency for each primer pair was confirmed by quantitative PCR. Since cfDNA was the target, the amplicon was within the range of 80 to 150 mers, and the Tm value calculated from the probe was taken into consideration for the sequence and number of bases of the primers. Taking into account PCR efficiency, primer dimers, and non-specific bands, the most efficient primer pair was determined, and correct amplification of the target region was confirmed by Sanger sequencing.
  • tDNA tumor tissue-derived DNA
  • gDNA tumor tissue-derived DNA
  • gDNA tumor tissue-derived DNA
  • gDNA tumor tissue-derived DNA
  • gDNA tumor tissue-derived DNA
  • plasmids for validation were prepared in the following order.
  • the vector is introduced into Escherichia coli, and about 10 to 20 colonies are isolated and cultured in large quantities.
  • Vectors were recovered by mini prep, and whether each vector was WT or Mutant was confirmed by Sanger sequencing.
  • the primer/probe detection accuracy was confirmed using the validation plasmid in the following order.
  • the forward primer for detecting wild-type PLEKHS1 and mutant PLEKHS1 consists of the sequence (gacctcttggcttcca) set forth in SEQ ID NO: 1, and the reverse primer consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 2 (ctgcaaaattttccatttcca). used something.
  • a probe consisting of the sequence (tgcaattgttcaattgcaaaaagc) set forth in SEQ ID NO: 3 was used as a probe for detecting wild-type PLEKHS1.
  • the 590G>A mutant probe consists of the sequence (tgcaattgtttaattgcaaaaagc) set forth in SEQ ID NO: 4, and the probe for detecting the 593C>T mutation consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 5 (tgcaattattcaattgcaaaaagc). It was used.
  • (ii) Generation of 0.1% mutant plasmids at a ratio of wild-type:mutant 999:1.
  • primers and probes exist within a range of 113 bp upstream or downstream from C228 or C250. It may be designed within the range of 50 to 200 bp upstream or downstream from the mutation site.
  • Method 1. Prepare ⁇ 50 ng/well (up to 7 ⁇ L) DNA solution (15 ng can be added for 10-50 copies) 2. Thaw at room temperature, vortex, centrifuge, and protect from light. 3. Prepare Mix (restriction enzyme undiluted solution 10 U/ ⁇ L) 4. Vortex/centrifuge and leave at room temperature for 3 minutes5. Add 20 ⁇ L of mix to the sample well of the DG8® cartridge and 70 ⁇ L of Droplet Generation Oil to the oil well. 6. 7. Place in Droplet Generator to create droplets in solution. Put 40 ⁇ L of Droplet into PCR 96well and seal (aluminum foil) 8. Analysis with Droplet Reader
  • dPCR was used to detect tumor DNA from 26 specimens, and the TERT promoter and PLEKHS1 promoter were positive in 50.0% (13/26) and 42.3% (11/26) of the patients, respectively. rice field.
  • one patient with multiple PLEKHS1 promoter mutations was counted. With the TERT promoter alone, 50.0% of target patients could be observed, whereas the addition of the PLEKHS1 promoter improved to 57.7% (15/26). Also, multiple mutations could not be observed in the same patient with the TERT promoter alone, i.e., 0.0% (0/26), compared to 34.6% (9/26) with the addition of the PLEKHS1 promoter. Patients can now be observed with multiple mutations.
  • the advantage of being able to analyze mutations by dPCR not only in the TERT promoter but also in the PLEKHS1 promoter is that the number of patients who can be analyzed with the same assay increases. Since tumor mutations in bladder cancer are diverse, the mainstream method is to analyze mutations that differ from patient to patient over time. Compared to this method, hotspot detection is advantageous in terms of reducing analysis costs. Second, by analyzing multiple MAFs, it is possible to more accurately assess the disease state of the patient. Multiple events in which MAF could not be detected were observed despite the diagnosis of systemic metastasis, suggesting the risk of being judged as false negative when follow-up is performed for a single mutation. be. It is believed that observing multiple MAFs can reduce the possibility of a false negative evaluation.

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Abstract

本発明は、検体における膀胱癌の存在を検出するためのプライマーセットであって、ＰＬＥＫＨＳ１プロモーターの変異を標的とする、１６塩基長以上で且つ２１塩基長以下のオリゴヌクレオチドである１対のプライマーと、ＴＥＲＴプロモーターの変異を標的とする、１又は複数の対のプライマーと、を含む、プライマーセット、を提供する。

Description

膀胱癌の存在を検出するためのプライマー及びプローブ
　本発明は広く、膀胱癌の存在を検出するためのプライマー及びプローブ等に関する。
　腫瘍由来の遺伝子変異を血中循環ＤＮＡ（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ　ＤＮＡ：ｃｆＤＮＡ）で検出するリキッドバイオプシーは低侵襲な検査であり、術後の経過観察や治療効果判定において有効であることが近年報告されている。
　ｃｆＤＮＡの分析手法として、次世代シーケンサー（ＮＧＳ）とデジタルＰＣＲの利用が挙げられる。デジタルＰＣＲはＮＧＳよりも低いコストで分析できるという利点がある。
Clinical significance of hotspot mutation analysis of urinary cell-free DNA in urothelial bladder cancer(Frontiers in oncology, 2020)
　膀胱癌等の多くの癌では、ＴＥＲＴ（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）のプロモーター領域に点変異が起きており、そのような点変異を検出するためのプライマーが知られている。
　膀胱癌では、ＴＥＲＴのみならずＰＬＥＫＨＳ１（ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｓ１）のプロモーター領域の遺伝子変異がホットスポット、つまり複数の患者に共通で見られる変異である可能性があるが、ｃｆＤＮＡを検体としたとき、定量ＰＣＲでの検出は難しい。また、従来のプライマーやプローブではｃｆＤＮＡを十分な精度で検出できないという問題もあった。
　膀胱癌の存在を検出するために、ＴＥＲＴプロモーターの変異に加え、ＰＬＥＫＨＳ１プロモーターの変異を標的とするプライマー等を、通常とは異なる思想で設計した結果、従来のＴＥＲＴプロモーター変異を対象とした検出では４０％程度であった検出カバー率が増大した。
　すなわち、本願は以下の発明を包含する。
（１）
　検体における膀胱癌の存在を検出するためのプライマーセットであって、
　ＰＬＥＫＨＳ１プロモーターの変異を標的とする、１６塩基長以上で且つ２１塩基長以下のオリゴヌクレオチドである１対のプライマーと、
　ＴＥＲＴプロモーターの変異を標的とする、１又は複数の対のプライマーと、
を含む、プライマーセット。
（２）
　ＰＬＥＫＨＳ１プロモーターの変異が、１０番染色体の１１５，５１１，５９０位におけるＧからＡへの置換、１０番染色体の１１５，５１１，５９３位におけるＣからＴへの置換又はその両方である、（１）に記載のプライマーセット。
（３）
　ＰＬＥＫＨＳ１プロモーターの変異を標的とするプライマーが配列番号１及び／又は２に記載の塩基配列を有する、（１）又は（２）に記載のプライマーセット。
（４）
　ＴＥＲＴプロモーターの変異を標的とするプライマーが、５番染色体の１，２９５，２２８位におけるＣからＴへの置換、５番染色体の１，２９５，２５０位におけるＣからＴへの置換又はその両方である、（１）～（３）のいずれかに記載のプライマーセット。
（５）
　検体における膀胱癌の存在を検出するためのプローブであって、ＰＬＥＫＨＳ１プロモーターの変異を標的とする、プローブ。
（６）
　プローブが配列番号４又は５に記載の塩基配列を有する、（５）に記載のプローブ。
（７）
　（１）～（４）のいずれかに記載のプライマーセットを含む、キット。
（８）
　（５）又は（６）に記載のプローブを更に含む、（７）に記載のキット。
（９）
　検体における膀胱癌の存在を検出するための方法であって、（１）～（４）のいずれかに記載のプライマーセット、あるいは（５）又は（６）に記載のプローブを用いてＰＬＥＫＨＳ１プロモーターの変異を検出する工程を含む、方法。
（１０）
　検出工程で使用される核酸増幅法がデジタルＰＣＲである、（９）に記載の方法。
（１１）
　検体が液性検体である、（９）又は（１０）に記載の方法。
（１２）
　検体が血中循環ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む、（９）～（１１）のいずれかに記載の方法。
　ＰＬＥＫＨＳ１プロモーターの変異として、１０番染色体の１１５，５１１，５９０位におけるＧからＡへの置換や１０番染色体の１１５，５１１，５９３位におけるＣからＴへの置換がある。本発明者らは、プローブの設計にあたり、これらの変異に相当する位置がプローブの中心付近となるようにし、最もＴｍ値が高くなるようにした。具体的には、プローブは通常２０量体で設計され、短くても１８量体であり、長くても２５量体であるところ、本願発明ではＴｍ値が最大限高値となるよう２５量体とした。
　プライマーも通常とは異なる思想で設計した。一般的に、プライマーの長さは２０～２５量体程度となるよう設計される。プライマーの長さを２０量体未満とすると標的以外の塩基配列に対する非特異的に結合してしまう配列が増える可能性があるが、ＰＬＥＫＨＳ１プロモーターの変異を検出するフォワードプライマーは１６量体のものを設計した。これは、野生型・変異体用のプローブよりＴｍ値を下げる必要があることを考慮したものである。ＰＬＥＫＨＳ１プロモーター領域のホットスポットを含む領域がＡＴリッチな配列となっているがプライマー設計領域はＡＴリッチとはいえない配列であることからＴｍ値が高くなってしまい、通常よりも配列を短くする必要がある。さらにＧＣを避けようとすると、例えば、プライマーの３’末端にＡまたはＴを設計すると、鋳型ＤＮＡに対する特異性が落ちる可能性がある。しかしながら、検証実験をすることで、一般的な設計よりもＴｍ値が低く、短い長さで設計することを達成した。
　なお、フォワードプライマーのＴｍ値より変異体プローブのＴｍ値の方が低い。その結果、アニーリングの順番は野生型プローブ（５３．９２）、フォワードプライマー（５２．６１）、変異体プローブ（５２．２８）、リバースプライマー（５０．６６）となる。
　更に、ｃｆＤＮＡの断片は２００ｂｐ未満とされていることから、増幅するアンプリコンのサイズが２００ｂｐ未満になるように工夫して設計した。
　ＴＥＲＴプロモーターの変異を標的とする従来のプライマーに加え、上記のとおり通常とは異なる思想のもと設計したＰＬＥＫＨＳ１プロモーターの変異を標的とするプライマー等を用いることにより、膀胱癌の検出において従来カバーできなかった患者についてもカバーすることができるようになる。
図１は、バリデーション用のプラスミド（野生型（ＷＴ）、変異型（Ｍｕｔ））の検出精度（上）と、変異率（下）を示す。変異率はプラスミド（ＷＴ／Ｍｕｔ）を９９９：１に混合して算出した（ｎ＝３）。 図２は、変異型陽性である患者について陽性・陰性ドロップレットを定量した結果を示す。各図のＣｈ１はＭｕｔのドロップレット、Ｃｈ２はＷＴのドロップレットを示し、左下枠はＷＴ及びＭｕｔ陰性ドロップレット、右下枠はＷＴ陽性ドロップレット、左上枠はＭｕｔ陽性ドロップレット、右上枠はＷＴ及びＭｕｔ陽性ドロップレットを示す。 図３は、変異型陽性である患者の初回治療（経尿道的膀胱腫瘍切除術）以降についてのＭＡＦ：Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ａｌｌｅｌｅ　Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙの経時的な変化を示す。図中の矢印は、再発している段階、つまり「ｃｔＤＮＡ：cｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　ｔｕｍｏｒ　ＤＮＡがあり他変異で陽性と判定できる」にもかかわらず、ＭＡＦが０．００％と検出されてしまっている変異（又はそれを含む試料）の特定の段階を示す。左図は患者番号０３（Ｐｔ０３）の結果を、右図は患者番号２１（Ｐｔ２１）の結果を示す。参考として膀胱癌で変異を示すことがある遺伝子ＤＣＣ（左図）又はＦＧＦＲ３（右図）の経時的な変化も併せて示す。 図４は、本発明のプライマー／プローブによる膀胱癌患者のカバー率を図示したものである。
　以下、本発明の実施の形態（以下、「本実施形態」という。）について説明するが、本発明の範囲は以下の実施形態に限定して解釈されない。
（プライマーセット）
　第一の態様において、検体における膀胱癌の存在を検出するためのプライマーセットであって、
　ＰＬＥＫＨＳ１プロモーターの変異を標的とする、１６塩基長以上で且つ２１塩基長以下のオリゴヌクレオチドである１対のプライマーと、
　ＴＥＲＴプロモーターの変異を標的とする、１又は複数の対のプライマーと、
を含む、プライマーセットが提供される。
　検体は、膀胱癌の存在を示唆するＰＬＥＫＨＳ１プロモーターの変異とＴＥＲＴプロモーターの変異を検出できるものであれば特に限定されないが、本発明のプライマーセット等はリキッドバイオプシーにおいて好適に使用されるため、検体はｃｆＤＮＡを含む液性検体、例えば血液やその他の体液であることが好ましい。より具体的には、検体は血液、血清、血漿、尿、便、唾液、喀痰、組織液、髄液、ぬぐい液等の体液等又はその希釈物等、特に血漿であることが好ましい。
　検体は、膀胱癌を有すると疑われる被験者から採取される。膀胱癌は筋層非浸潤性又は筋層浸潤性のいずれでもよい。採取回数は１回でもよいし、膀胱癌治療後の予後観察等の目的のために複数回であってもよい。
　リキッドバイオプシーで得られるｃｆＤＮＡ中に含まれる膀胱癌由来のＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の割合は非常に少ないため、検体の種類によって、核酸増幅前に検体からｃｔＤＮＡを抽出する工程や、夾雑物等を除去する工程を実施してもよい。血液を例に説明すると、血漿分離交換法等の公知の手段を行うによりｃｔＤＮＡの回収率を増大させることができる。
　一実施形態において、ＰＬＥＫＨＳ１プロモーターの変異は、１０番染色体の１１５，５１１，５９０位におけるＧからＡへの置換（以下、「５９０Ｇ＞Ａ」ともいう。）、１０番染色体の１１５，５１１，５９３位におけるＣからＴへの置換（以下、「５９３Ｃ＞Ｔ」ともいう。）又はその両方であってもよい。
　プライマーは１６塩基長以上で且つ２１塩基長以下のオリゴヌクレオチドである。中でも、Ｔｍ値が低いものが好ましい。具体的には、リバースプライマーのＴｍ値をプローブより１～３℃高く設定することで、鋳型ＤＮＡに対して先にプローブがアニールし、その後、リバースプライマーがアニールするようになる。
　更に、プライマーは増幅するアンプリコンのサイズが２００ｂｐ未満になるように設計され得る。
　上記のような設計思想に基づくプライマーであって、５９０Ｇ＞Ａと５９３Ｃ＞Ｔの両方の変異を検出するプローブを含む配列を増幅するプライマーの例として、塩基長が１６塩基である配列番号１に記載のフォワードプライマー（gacctcttggcttcca）、塩基長が２１塩基である配列番号２に記載のリバースプライマー（ctgcaaaattttccatttcca）が挙げられる。プライマーセットは、配列番号１及び２に記載の配列から成るものを使用することが好ましい。これらのプライマーを、ＰＬＥＫＨＳ１プロモーター領域を増幅する公知のプライマーセットと組み合わせてもよい。
　一実施形態において、ＴＥＲＴプロモーターの変異は、５番染色体の１，２９５，２２８位におけるＣからＴへの置換（以下、「２２８Ｃ＞Ｔ」ともいう。）、５番染色体の１，２９５，２５０位におけるＣからＴへの置換（以下、「２５０Ｃ＞Ｔ」ともいう。）又はその両方であってもよい。２２８Ｃ＞Ｔは膀胱癌において、そして２５０Ｃ＞Ｔは筋層非浸潤性膀胱癌において検出率が高いことが知られている。
　２２８Ｃ＞Ｔと２５０Ｃ＞Ｔの両方の変異を検出するプローブを含む配列を増幅するプライマーは、、それぞれの変異を起点として、その上流もしくは下流に１１３ｂｐ内、つまり、前者の変異を標的とするプライマー及びプローブについては１，２９５，１１５位から１，２９５，３４１位の領域内、後者の変異を標的とするプライマー及びプローブについては１，２９５，２３７位から１，２９５，３６３位の領域内で設計され得る。ＧｅｎＢａｎｋに開示されているＴＥＲＴプロモーター領域のコーディング鎖の５’上流にある配列（配列番号６）（ref|NC_000005.9|:1295115-1295374 Homo sapiens chromosome 5, GRCh37.p13 Primary Assembly）を参照して設計方法の例について説明すると、当該配列をセンス鎖側の配列に変換し、また、２２８Ｃ＞Ｔと２５０Ｃ＞Ｔの両方の変異を反映させると配列番号７に示す配列となる。２２８Ｃ＞Ｔを検出するプライマー、プローブについては、配列番号７における、１，２９５，１１５位から１，２９５，３４１位に対応する１，２９５，３４１位～１，２９５，１１５位の２２７ｂｐの配列（配列番号８）から適宜所望とするプライマー、プローブを設計することができる。２５０Ｃ＞Ｔを検出するプライマー、プローブについても同様であり、１，２９５，３６３から１，２９５，２３７位の１２７ｂｐの配列（配列番号９）から設計され得る。そのようなプライマーの例として、ＢｉｏＲａｄ社製のプライマー（ＴＥＲＴ　Ｃ２２８Ｔ＿１１３：ｄＨｓａＥＸＤ７２４０５９４２，ＴＥＲＴ　Ｃ２５０Ｔ＿１１３：ｄＨｓａＥＸＤ４６６７５７１５）（アンプリコンサイズ：１１３ｂｐ）（J Mol Diagn. 2019 Mar;21(2)274-285も参照のこと。）が挙げられる。このようなプライマーを、ＴＥＲＴプロモーター領域を増幅する公知のプライマーセットと組み合わせてもよい。
　配列番号６～９の配列を以下に示す。
配列番号６：
GCCGGGGCCAGGGCTTCCCACGTGCGCAGCAGGACGCAGCGCTGCCTGAAACTCGCGCCGCGAGGAGAGGGCGGGGCCGCGGAAAGGAAGGGGAGGGGCTGGGAGGGCCCGGAGGGGGCTGGGCCGGGGACCCGGGAGGGGTCGGGACGGGGCGGGGTCCGCGCGGAGGAGGCGGAGCTGGAAGGTGAAGGGGCAGGACGGGTGCCCGGGTCCCCAGTCCCTCCGCCACGTGGGAAGCGCGGTCCTGGG
配列番号：７
CCCAGGACCGCGCTTCCCACGTGGCGGAGGGACTGGGGACCCGGGCACCCGTCCTGCCCCTTCACCTTCCAGCTCCGCCTCCTCCGCGCGGACCCCGCCCCGTCCCGACCCCTCCCGGGTCCCCGGCCCAGCCCCCTCCGGGCCCTCCCAGCCCCTCCCCTTCCTTTCCGCGGCCCCGCCCTCTCCTCGCGGCGCGAGTTTCAGGCAGCGCTGCGTCCTGCTGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCCCCGGC
配列番号８：
GGCGGAGGGACTGGGGACCCGGGCACCCGTCCTGCCCCTTCACCTTCCAGCTCCGCCTCCTCCGCGCGGACCCCGCCCCGTCCCGACCCCTCCCGGGTCCCCGGCCCAGCCCCCTCCGGGCCCTCCCAGCCCCTCCCCTTCCTTTCCGCGGCCCCGCCCTCTCCTCGCGGCGCGAGTTTCAGGCAGCGCTGCGTCCTGCTGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCCCCGGC
配列番号９：
CCCAGGACCGCGCTTCCCACGTGGCGGAGGGACTGGGGACCCGGGCACCCGTCCTGCCCCTTCACCTTCCAGCTCCGCCTCCTCCGCGCGGACCCCGCCCCGTCCCGACCCCTC CCGGGTCCCCGGC
　プライマー等の塩基配列を構成するヌクレオチドは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれでもよい。これらのオリゴヌクレオチドは、既知の方法で合成することができ、例えば、塩基配列に従って、固相ホスホルアミダイト法及びトリエステル法等の任意の核酸合成法により合成され得る。
　上記プライマーを用いる核酸増幅反応により、膀胱癌に関連するホットスポット領域を含む配列を増幅することが可能になる。
　核酸増幅法としてはＰＣＲ法があり、通常のＰＣＲに加え、デジタルＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ＡＭＰｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｎｄ　Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｐｒｉｍｅｒ－ｉｎｉｔｉａｔｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ）法、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ　Ｃｉｒｃｌｅ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ　Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等を挙げることができる。
　ｃｆＤＮＡ中の変異を対象とする場合、核酸増幅方法はデジタルＰＣＲであることが好ましい。デジタルＰＣＲを使用することで、癌遺伝子について変異型と正常型の割合（ＭＡＦ：Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ａｌｌｅｌｅ　Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）を決定することができる。デジタルＰＣＲはドロップレットデジタルＰＣＲであってもよい。
（プローブ）
　第二の態様において、検体における膀胱癌の存在を検出するためのプローブであって、ＰＬＥＫＨＳ１プロモーターの変異を標的とする、プローブ、が提供される。
　プローブを構成する配列はＰＬＥＫＨＳ１プロモーターの変異を検出できるものであれば限定されず、例えば５９０Ｇ＞Ａの変異又は５９３Ｃ＞Ｔの変異を検出できるプローブが好ましい。
　一実施形態において、５９０Ｇ＞Ａの変異を検出するプローブは配列番号４に記載の配列（tgcaattgtttaattgcaaaaaagc）を有する。プローブは配列番号４に記載の配列から成るものが好ましい。
　一実施形態において、５９３Ｃ＞Ｔの変異を検出するプローブは配列番号５に記載の配列を有する。プローブは配列番号５に記載の配列（tgcaattattcaattgcaaaaaagc）から成るものが好ましい。
　プローブはその一部が修飾されていてもよく、その例として、末端がアミノ化されたものや、一部の塩基がリンカーとなる塩基で修飾されたもの等が挙げられる。また、塩基配列の一部へ別の塩基を挿入したり、その塩基配列の一部の塩基を欠失させたり、又は別の塩基に置換したり、あるいは塩基以外の物質に置換してもよい。
　更に、プローブは標識物質等で修飾されていてもよく、例えば蛍光色素とそのクエンチャーを有してもよい。そのような標識物質は市販のものを使用することができる。クエンチャーは蛍光色素からの蛍光をクエンチできるものであれば特に制限されない。プローブを構成するヌクレオチド残基自体に修飾が施されていてもよく、例えば、人工的に修飾されたヌクレオチド残基に置換されていてもよい。
（キット）
　第二の態様において、検体における膀胱癌の存在を検出するためのプライマーセットを含むキットが提供される。プライマーセットは上述したものを使用することができる。
　キットはＰＬＥＫＨＳ１プロモーターの変異を標的とするプローブを更に含んでもよい。５９０Ｇ＞Ａ及び５９３Ｃ＞Ｔの変異を検出するプローブとして、それぞれ配列番号４及び５に記載の塩基配列を有するものが挙げられる。
　キットは更に、ＴＥＲＴプロモーターの変異を標的とする、１又は複数の対のプライマーとプローブを含んでもよい。ＴＥＲＴプロモーターの変異としては２２８Ｃ＞Ｔと２５０Ｃ＞Ｔがある。２２８Ｃ＞Ｔを標的とするプライマー及びプローブについては１，２９５，１１５位から１，２９５，３４１位の領域内、２５０Ｃ＞Ｔを標的とするプライマー及びプローブについては１，２９５，２３７位から１，２９５，３６３位の領域内で設計され得る。
　デジタルＰＣＲで核酸を増幅する場合、上記プライマーセット、プローブ、検体、及びＤＮＡポリメラーゼを含む反応溶液が調製される。反応溶液は、ウェルやドロップレットに分配された後、増幅反応にかけられる。
　核酸増幅反応で得られる増幅産物の検出には、増幅産物を特異的に認識することができる標識物質を利用してもよい。そのような標識物質としては蛍光色素、ビオチン、ジゴキシゲニン等が挙げられる。標識体として蛍光を用いた場合には、その蛍光を蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダー等を用いて検出することができる。
　標識物質として、増幅産物にインターカレートする物質を使用することもできる。インターカレーターは、二本鎖ＤＮＡにインターカレートして蛍光を発する物質であれば特に限定されない。
　あるいは、ポリアクリルアミド又はアガロースゲルを用いた電気泳動法など、既知の方法で検出を行ってもよい。例えば、電気泳動では、分子量が既知のマーカーの移動度に対する増幅産物の移動度から、増幅産物の存在を同定することができる。
（検出方法）
　第三の態様において、検体における膀胱癌の存在を検出するための方法であって、上記プライマーセット、あるいは上記キットを用いてＰＬＥＫＨＳ１プロモーターの変異を検出する工程を含む、方法、が提供される。
　プライマーセットにはＴＥＲＴプロモーターの変異を標的とするプライマーを含め、検出工程においてＴＥＲＴプロモーターの変異も併せて検出することが好ましい。検出工程の前後に他の工程を含んでもよく、例えば、検体は、膀胱癌を有すると疑われる被験者から採取され得る。検出工程は複数回行ってもよく、例えば同一の被験者に由来する検体を定期的に採取して、それらを採取の都度検出工程にかけることもできる。
　ＰＬＥＫＨＳ１プロモーターの変異が検出された場合、検体において膀胱癌が存在することが決定される。これにより、医師等による膀胱癌の診断やその後の治療方法の決定を補助することができる。膀胱癌と診断された被験者に対しては、経尿道的膀胱腫瘍切除術、根治的膀胱摘出術等の手術（外科治療）、術前化学療法、術後化学療法、再発化学療法等の化学療法（抗癌剤治療）、放射線治療を行うことができる。
　例えば、経尿道的膀胱腫瘍切除術の結果から筋層浸潤かどうかの診断が可能になる。筋層非浸潤であれば経尿道的膀胱腫瘍切除術のみで治療は終了し、その後経過観察となる。
　経尿道的膀胱腫瘍切除術の手術結果より筋層浸潤と診断されると術前化学療法に進み、治療完遂後に再発転移を認められた場合、再発化学療法が導入される。
　術前化学療法を行うことで予後が改善され得るが、腫瘍の組織型や患者の希望次第で行わない場合もある。術後化学療法は術中の所見から残存病変が疑われる際に追加される場合が多い。年齢や全身状態によって根治的膀胱摘出術が難しいと考えられる場合、代わりに放射線照射が行われる場合もある。
　以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
１．１．プライマー／プローブの設計
１）プローブの認識部位の決定
　ＰＬＥＫＨＳ１　１１５，５１１，５９０及び１１５，５１１，５９３周辺の塩基配列をＮＣＢＩ等で取得し、変異を含む箇所に検出用プローブの認識部位を設定した。プローブの認識位置・塩基長は、ＧＣ含有率とＴｍ値を考慮して決定した。
２）プライマー設計
　プローブを含む配列を増幅するようなプライマーペアを複数設計し、ｇＤＮＡ、ｃｆＤＮＡにおける非特異的なアンプリコン形成の有無、プライマーダイマー評価をＰＣＲの電気泳動で、プライマーペアごとのＰＣＲ効率を定量ＰＣＲで確認した。ｃｆＤＮＡを対象とするため、アンプリコンは８０～１５０量体の範囲内とし、プライマーの配列・塩基数はプローブから算出されるＴｍ値を考慮した。ＰＣＲ効率、プライマーダイマー、非特異的なバンドを考慮し最も効率的なプライマーペアを決定し、ターゲットとしている領域が正しく増幅されていることをサンガーシーケンシングによって確認した。
３）プローブ配列の決定
　それぞれのプライマーのＴｍ値とプローブのＴｍ値を比較し、センス鎖側に結合させるかアンチセンス鎖側に結合させるかプローブの塩基配列を決定した。
　上記の手順で決定した配列を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
２．検体の調製
　膀胱癌（筋層非浸潤・筋層浸潤を問わない）患者における腫瘍組織・血液検体を対象検体として採取した（２６検体）。なお、膀胱癌は治療既往のない初発のものを対象とした。筋層浸潤性膀胱癌と診断された患者においては治療後も血液検体を３ヶ月毎に採取した。
　血液検体のサンプリングは、通常採血（ＥＤＴＡ採血管）にて末梢白血球、血漿を回収することで行った。腫瘍組織は手術にて摘出された腫瘍組織を冷凍保存した。いずれのサンプルも抽出・解析まで－８０℃で冷凍保存とした。
　得られたサンプルについて、腫瘍組織由来のＤＮＡをｔＤＮＡ（ｔｕｍｏｒ　ＤＮＡ）、体細胞（末梢白血球）由来のＤＮＡをｇＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｅ　ＤＮＡ）、血漿中の血中循環ＤＮＡをｃｆＤＮＡとしてそれぞれ解析を行なった。
３．実験方法
３．１．実験のフロー
　以下の順序で設計したプライマーの妥当性をチェックした。
（ｉ）　ＰＣＲによる断片の増幅。
（ｉｉ）　ＤＮＡ精製。
（ｉｉｉ）　電気泳動による目的断片の確認とプライマーダイマーの確認。
（ｉｖ）　断片のサンガーシーケンシングによる配列確認。
　続いて、以下の順序でバリデーション用プラスミドを作製した。
（ｉ）　患者の腫瘍サンプルからゲノムＤＮＡの抽出。
（ｉｉ）　野生型ＰＬＥＫＨＳ１の１１５，５１１，５９０～１１５，５１１，５９３領域を含むＤＮＡ断片のＰＣＲによる増幅。
（ｉｉｉ）　ベクターへＰＬＥＫＨＳ１断片の挿入。
（ｉｖ）　ベクターを大腸菌に導入し、１０～２０程度のコロニーを分離し大量培養。
（ｖ）　ベクターをｍｉｎｉ　ｐｒｅｐで回収し、それぞれのベクターがＷＴかＭｕｔａｎｔかサンガーシーケンシングで確認。
（ｖｉ）　ＷＴのみ回収された場合、野生型ＰＬＥＫＨＳ１導入プラスミドを鋳型にしたＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットによる５９０Ｇ＞Ａ及び５９３Ｃ＞Ｔ変異の導入。
（ｖｉｉ）　変異型ＰＬＥＫＨＳ１導入プラスミドの取得。
　以下の順序によりバリデーション用プラスミドを用いてプライマー／プローブの検出精度を確認した。
（ｉ）　野生型ＰＬＥＫＨＳ１導入プラスミドと変異型ＰＬＥＫＨＳ１導入プラスミドそれぞれに対し、野生型プライマー／プローブセット、並びに変異型プライマー／プローブセットを用いたｄＰＣＲによる検出精度の確認。
　なお、野生型ＰＬＥＫＨＳ１及び変異型ＰＬＥＫＨＳ１を検出するためのフォワードプライマーとして、配列番号１に記載の配列（gacctcttggcttcca）から成るものを、そして、リバースプライマーとして配列番号２に記載の配列（ctgcaaaattttccatttcca）から成るものを使用した。野生型ＰＬＥＫＨＳ１を検出するためのプローブとして、配列番号３に記載の配列（tgcaattgttcaattgcaaaaaagc）から成るものを使用した。５９０Ｇ＞Ａの変異型のプローブとしては配列番号４に記載の配列（tgcaattgtttaattgcaaaaaagc）から成るものを、そして、５９３Ｃ＞Ｔの変異を検出するプローブは配列番号５に記載の配列（tgcaattattcaattgcaaaaaagc）から成るものを使用した。（ｉｉ）　野生型：変異型＝９９９：１の割合での０．１％変異プラスミドの作製。
（ｉｉｉ）　０．１％変異プラスミドの検出精度の確認。
　患者サンプルを用いて、ｄＰＣＲによりＴＥＲＴ及びＰＬＥＫＨＳ１変異を検出した。
（ｉ）　検証済み野生型ＰＬＥＫＨＳ１プライマー／プローブ及び変異型ＰＬＥＫＨＳ１プライマー／プローブを用いた、ｔＤＮＡおよびｇＤＮＡ（各２６検体）をサンプルとした変異検出確認。
（ｉｉ）　同様にＴＥＲＴのプライマー／プローブを用いた、ｔＤＮＡおよびｇＤＮＡ（各２６検体）をサンプルとした変異検出確認。なお、ＴＥＲＴのプライマー／プローブは市販品（ＢｉｏＲａｄ社製のプライマー／プローブのセット（ＴＥＲＴ　Ｃ２２８Ｔ＿１１３：ｄＨｓａＥＸＤ７２４０５９４２，ＴＥＲＴ　Ｃ２５０Ｔ＿１１３：ｄＨｓａＥＸＤ４６６７５７１５）（アンプリコンサイズ：１１３ｂｐ））を使用した。それらの配列は不明であるが、アンプリコンサイズが２種とも１１３ｂｐとなっており、また、一般的には変異箇所を中心にプライマーを設計し、変異箇所にプローブが当たるようにプローブを設計することから、Ｃ２２８もしくはＣ２５０を起点にして、上流もしくは下流の１１３ｂｐの範囲内にプライマーとプローブがあると考えられる。上記変異箇所から上流もしくは下流に５０～２００ｂｐの範囲内で設計を行ってもよい。
（ｉｉｉ）　ｔＤＮＡにおいて変異型陽性かつｇＤＮＡで変異型陰性であることが確認できた症例において、ｃｆＤＮＡをサンプルとした変異検出・ＭＡＦの算出。腫瘍において低頻度である場合、血中での検出が困難であることが予想されたため、ｔＤＮＡにおいて変異率が１０％以上のものを変異型陽性とした。
　デジタルＰＣＲに用いた材料と方法を以下に記載する。
材料：
サンプルＤＮＡ（－２０℃）　
２ｘ　ｄｄＰＣＲ　Ｓｕｐｅｒｍｉｘ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｂｅｓ（Ｎｏ　ｄＵＴＰ）　（４℃）
２０ｘ　プライマー／プローブ：
制限酵素：　ＨａｅＩＩＩ
方法：
１．＜５０ｎｇ／ウェル（７μＬまで）のＤＮＡ溶液を調整（１０－５０コピーの場合は１５ｎｇ追加可）
２．室温で溶解し、ボルテックスし、遠心し、遮光しておく。
３．Ｍｉｘを調製（制限酵素は原液１０Ｕ／μＬ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 ４．Ｖｏｒｔｅｘ・遠心し室温で３分放置
５．ＤＧ８（登録商標）カートリッジのサンプルウェルに２０μＬのｍｉｘを、オイルウェルに７０μＬのＤｒｏｐｌｅｔ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　Ｏｉｌを添加。
６．Ｄｒｏｐｌｅｔ　Ｇｅｎｅｒａｔｏｒに入れて溶液中のドロップレットを作成する
７．Ｄｒｏｐｌｅｔ　４０μＬをＰＣＲ　９６ｗｅｌｌに入れてシーリング（アルミホイル）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 ８．Ｄｒｏｐｌｅｔ　Ｒｅａｄｅｒで解析
４．結果
　バリデーション用のプラスミド（ＷＴ、Ｍｕｔ）を作成し検出精度を確認した。結果を図１に示す。ＰＬＥＫＨＳ１　５９０Ｇ＞Ａの検出に関してはＷＴとＭｕｔの検出精度はそれぞれ９９．９８％、１００．００％だった。ＰＬＥＫＨＳ１　５９３Ｃ＞Ｔの検出に関してはＷＴとＭｕｔの検出精度はそれぞれ９９．９９％、１００．００％だった。また、ＷＴでＭｕｔを１０００倍希釈したＤＮＡ溶液を検出したところ有意に０．１％の変異を検出できた（５９０Ｇ＞Ａ：ｐ＝０．００３１、５９３Ｃ＞Ｔ：ｐ＜０．００１）。
　変異型陽性患者サンプル（ｔＤＮＡ、ｃｆＤＮＡ）を対象にｄＰＣＲを試行したところＷＴ、Ｍｕｔとも検出シグナルは良好であり、いずれのサンプルでも陽性ドロップレットと陰性ドロップレットを明確に分離できた（図２）。
　図３に示すとおり、変異型陽性である患者のｃｆＤＮＡのＭＡＦを経時的に解析したところ、画像による転移診断より前にＭＡＦの増加を検出できた。また、同じ検体をＰＬＥＫＨＳ１以外にＴＥＲＴプロモーターでも解析したところ変異によって異なる変動を見ることがあった。例えば、図３中の矢印は、再発している段階、つまり「ｃｔＤＮＡがあり他変異で陽性と判定できる」にもかかわらず、ＭＡＦが０．００％と検出されてしまっている変異（又はそれを含む試料）の特定の段階を示しており、この結果から、膀胱癌の術後を経過観察においては複数の変異の経過を観察する必要があることが分かる。
　図４に示すとおり、２６検体の腫瘍ＤＮＡをｄＰＣＲで検出したところ、ＴＥＲＴプロモーターとＰＬＥＫＨＳ１プロモーターはそれぞれ５０．０％（１３／２６）、４２．３％（１１／２６）の患者が陽性であった。なお、ＰＬＥＫＨＳ１プロモーターの変異が重複している患者は１とカウントした。ＴＥＲＴプロモーターのみでは５０．０％の対象患者を観察できるのに対し、ＰＬＥＫＨＳ１プロモーターの追加によって５７．７％（１５／２６）に改善した。また、ＴＥＲＴプロモーターのみでは同一患者において複数の変異を観察できなかった、つまり０．０％（０／２６）であったのに対し、ＰＬＥＫＨＳ１プロモーターの追加によって３４．６％（９／２６）の患者を複数の変異で観察できるようになった。
５．考察
　従来の方法で検出できるＴＥＲＴプロモーターと同様に、今回検出したＰＬＥＫＨＳ１プロモーターの変異も複数の患者で陽性であり、ホットスポットとして有用であった。これをｃｆＤＮＡのＭＡＦとして検出することにより患者の病勢を評価できることが可能であると考えられる。ＰＬＥＫＨＳ１プロモーターの変異検出精度はＷＴ、Ｍｕｔとも高精度でありｃｆＤＮＡのＭＡＦ解析のような低頻度の解析においても利用可能である。
　ＷＴで軽微なミスアニーリングが起こる原因としては、変異によってＧＣ％が変動しプローブのＴｍ値が変わることが原因であると考えられる。患者サンプルを用いた検討でもｔＤＮＡとｃｆＤＮＡは類似したシグナル検出能でありｃｆＤＮＡを対象とした解析にも有用であると判断できた。
　ＴＥＲＴプロモーターだけでなくＰＬＥＫＨＳ１プロモーターにおいてもｄＰＣＲでの変異解析ができる利点として、第一に同一アッセイで解析可能な患者が増えることが挙げられる。膀胱癌の腫瘍変異は多岐に富むため患者ごとに異なる変異を経時的に解析する方法が主流であり、この方法に比してホットスポットを検出することは解析コストの改善において有利である。第二に複数のＭＡＦを解析することによって患者の病勢評価をより正確に行うことが可能となる。全身転移が診断されているにも関わらずＭＡＦが検出できない事象を複数回認めたが、これは単一の変異で経過観察を行なった場合に偽陰性と判断される危険性を示唆するものである。複数のＭＡＦを観察することで偽陰性と評価される可能性を減少させることができると考えられる。
　複数検出による臨床的な意義としては、安価にモニタリングができるため病勢の早期評価に有用だが、ＮＧＳと異なり単一の変異をみるｄＰＣＲにおいては偽陰性による誤った病勢評価の影響を受けやすく、いずれの変異検出においても単一変異での評価は誤評価の危険性を伴うため、複数での検出評価が望ましい。

Claims (12)

  1. 　検体における膀胱癌の存在を検出するためのプライマーセットであって、
    　ＰＬＥＫＨＳ１プロモーターの変異を標的とする、１６塩基長以上で且つ２１塩基長以下のオリゴヌクレオチドである１対のプライマーと、
    　ＴＥＲＴプロモーターの変異を標的とする、１又は複数の対のプライマーと、
    を含む、プライマーセット。
  2. 　ＰＬＥＫＨＳ１プロモーターの変異が、１０番染色体の１１５，５１１，５９０位におけるＧからＡへの置換、１０番染色体の１１５，５１１，５９３位におけるＣからＴへの置換又はその両方である、請求項１に記載のプライマーセット。
  3. 　ＰＬＥＫＨＳ１プロモーターの変異を標的とするプライマーが配列番号１及び／又は２に記載の塩基配列を有する、請求項１又は２に記載のプライマーセット。
  4. 　ＴＥＲＴプロモーターの変異を標的とするプライマーが、５番染色体の１，２９５，２２８位におけるＣからＴへの置換、５番染色体の１，２９５，２５０位におけるＣからＴへの置換又はその両方である、請求項１～３のいずれか一項に記載のプライマーセット。
  5. 　検体における膀胱癌の存在を検出するためのプローブであって、ＰＬＥＫＨＳ１プロモーターの変異を標的とする、プローブ。
  6. 　プローブが配列番号４又は５に記載の塩基配列を有する、請求項５に記載のプローブ。
  7. 　請求項１～４のいずれか一項に記載のプライマーセットを含む、キット。
  8. 　請求項５又は６に記載のプローブを更に含む、請求項７に記載のキット。
  9. 　検体における膀胱癌の存在を検出するための方法であって、請求項１～４のいずれか一項に記載のプライマーセット、あるいは請求項５又は６に記載のプローブを用いてＰＬＥＫＨＳ１プロモーターの変異を検出する工程を含む、方法。
  10. 　検出工程で使用される核酸増幅法がデジタルＰＣＲである、請求項９に記載の方法。
  11. 　検体が液性検体である、請求項９又は１０に記載の方法。
  12. 　検体が血中循環ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
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BAXTER L., GORDON N. S., OTT S., WANG J., PATEL P., GOEL A., PIECHOCKI K., SILCOCK L., SALE C., ZEEGERS M. P., CHENG K. K., JAMES : "Properties of non-coding mutation hotspots as urinary biomarkers for bladder cancer detection", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 13, no. 1, XP093080486, DOI: 10.1038/s41598-023-27675-4 *
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