WO2023118748A1 - Production d'un implant de valvule et son utilisation - Google Patents

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WO2023118748A1
WO2023118748A1 PCT/FR2022/052464 FR2022052464W WO2023118748A1 WO 2023118748 A1 WO2023118748 A1 WO 2023118748A1 FR 2022052464 W FR2022052464 W FR 2022052464W WO 2023118748 A1 WO2023118748 A1 WO 2023118748A1
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WO
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valve
sheet
cells
tissue
biological
Prior art date
Application number
PCT/FR2022/052464
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Inventor
Fabien KAWECKI
Nicolas L'heureux
Jean-Benoît Thambo
François ROUBERTIE
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Université De Bordeaux
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Centre Hospitalier Universitaire De Bordeaux
Fondation Bordeaux Université
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    • A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
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    • A61F2/2412—Heart valves ; Vascular valves, e.g. venous valves; Heart implants, e.g. passive devices for improving the function of the native valve or the heart muscle; Transmyocardial revascularisation [TMR] devices; Valves implantable in the body with soft flexible valve members, e.g. tissue valves shaped like natural valves
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    • A61F2250/00—Special features of prostheses classified in groups A61F2/00 - A61F2/26 or A61F2/82 or A61F9/00 or A61F11/00 or subgroups thereof
    • A61F2250/0058—Additional features; Implant or prostheses properties not otherwise provided for
    • A61F2250/0082—Additional features; Implant or prostheses properties not otherwise provided for specially designed for children, e.g. having means for adjusting to their growth

Definitions

  • the present invention relates to the production of a valve implant and its use in the treatment of congenital heart disease, cardiac, venous and lymphatic valve disease, in particular tetralogy of Fallot.
  • references in parentheses [ ] refer to the list of references presented at the end of the text.
  • Congenital heart disease is a malformation of the heart present at birth. Its severity can vary, from a very minor form that will never cause heart problems, to a very serious form that requires treatment. Congenital heart disease occurs when the chambers, walls, or valves of the heart - or the blood vessels near the heart - do not develop normally before birth. The majority of congenital heart diseases can be classified into two main categories: cyanogenic and non-cyanogenic (the word cyanogenic resulting from the bluish color of the skin of affected patients). These attacks vary in severity depending on the case.
  • Non-cyanotic congenital heart disease can result from different malformations: holes in the heart or septal malformations (ASD septal defect, VSD ventricular septal defect) and blood circulation obstruction (stenosis, atresia, insufficiency). While in some cases medication may be sufficient to treat a patient, however, in many cases faulty heart valves need to be repaired.
  • the availability of human heart valves being extremely limited (source: cadaver), or even non-existent in children for size reasons, repairs generally consist of the use of valves made from biological materials, in particular animal pericardium (in particular bovine) and generally chemically treated (eg fixation with glutaraldehyde) to avoid rejection and rapid degradation.
  • This strategy is the basis of the design of all so-called biological valves currently marketed because of animal origin, and mounted on a synthetic support structure, often including a type of stent [20].
  • this attachment causes a chronic non-specific inflammatory reaction known as a “foreign body reaction” (FBR) of the same nature as that observed during the implantation of synthetic biomaterials, and the leading cause of implant complications.
  • FBR foreign body reaction
  • the FBR is much less intense than the specific rejection directed towards intact animal tissues, hence the interest of fixation.
  • the fixation by denaturing the proteins, renders them insensitive to host enzymes which are normally capable of rapidly degrading them.
  • tetralogy of Fallot is one of the most common forms. It represents 7 to 10% of newborns suffering from congenital heart disease [1 , 2], It combines pulmonary valve stenosis, right ventricular hypertrophy, ventricular septal defect (VSD), and aortic dextroposition. These abnormalities will affect the heart's structure and pulsatile capacities, which will cause stenosis on the right ventricular outflow tract (RVOT), and ultimately oxygen desaturation in the arterial blood.
  • Surgical repair consists of closing the VSD and removing the RVOT stenosis around the age of 6 months of the patient's life.
  • RVOT stenosis is corrected by positioning a transannular patch, which unfortunately leads to pulmonary valve leakage [3, 4]. If left untreated, this pulmonary valve leakage causes dilation and dysfunction of the right ventricle, which will be associated with ventricular arrhythmias and an increased risk of sudden death in adulthood.
  • stent-mounted biological valves or industry-supplied mechanical valves in this infant population remains completely impractical [5]. Techniques have been developed to limit these leaks from the pulmonary valve, such as the use of a monocuspid valve [6].
  • This valve can be made from biological materials, in particular by using bovine pericardium chemically treated to prevent rejection [5] or synthetic polytetrafluoroethylene (PTFE) membranes [6].
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • these materials are subject to limitations. Although relatively flexible, extremely strong, and easy to handle, glutaraldehyde-treated bovine pericardium and synthetic membranes are associated with thromboembolic complications and/or infective endocarditis [7-9]. Furthermore, these materials are recognized as foreign bodies that cause chronic inflammatory reactions. Polytetrafluoroethylene (PTFE) membranes, like all synthetic materials, are also a cause of serious infections. Finally, current options have shown ineffective results in the short and medium term to limit pulmonary valve leakage.
  • the inventors propose to use a completely biological biomaterial composed of an extracellular matrix (ECM) secreted by human dermal fibroblasts, which is truly biocompatible [10-13]. Its remarkable biocompatibility comes from the structure of the MEC which represents a different advantage which is added to that of the biological or human nature of the proteins which compose it. Indeed, during implantation, the body's immune system can recognize the foreign origin of a protein thanks to its so-called “adaptive” immune system, but it can also recognize an abnormal (or "distorted") organization of the MEC thanks to its innate immune system.
  • ECM extracellular matrix
  • the organism when the ECM is damaged by a physical, thermal or infectious trauma, the organism will be able to quickly digest the damaged ECM, thanks to macrophage-like cells, to allow specialized cells, of the fibroblast type, to reconstruct an ECM. It is this mechanism that comes into play when a collagen matrix produced by physicochemical methods is implanted in an organism. This will be quickly degraded by the innate immune system because it does not have a "physiological" organization but rather a denatured structure [23-25].
  • the sheet produced in vitro is much more homogeneous, from the point of view of structure and composition, than a tissue taken from in vivo. This can have mechanical and biological advantages.
  • the sheet offers greater reproducibility, which may have advantages from the point of view of quality control in a commercial production context.
  • the structure of this material is very particular and distinguishes it from other materials used so far to produce valves.
  • This biomaterial having a puncture resistance that can reach 2 to 6 kgf [26] has also been used in the construction of a valve implant comprising a tubular structure and at least two pieces of MEC sheet (cusps or valves) connected to said structure; the sheet being as defined above (cf. “single-layer tissue sheet” of international application WO 20123/142879) [19].
  • This biological implant has never been proposed for the repair of valves in children suffering from congenital heart disease, in particular suffering from tetralogy of Fallot.
  • the present invention responds precisely to this need by proposing a biological implant comprising or consisting of the association of a sheet of tissue consisting of an extracellular matrix (ECM) secreted by cells, preferably human, in culture and optionally cells themselves (hereafter also referred to as MEC sheet), with biologically modified yarns or ribbons, synthetic and/or derived from the same biological material.
  • ECM extracellular matrix
  • MEC sheet biologically modified yarns or ribbons, synthetic and/or derived from the same biological material.
  • a completely biological valve implant ( Figure 1) from a sheet of MEC as defined above, from which they cut a piece which was folded over it once. - even to form a pocket-like valve.
  • MEC sheets were also cut into ribbons to produce organic MEC yarns.
  • cusps or valves of native pulmonary valves containing live cells were extracted, particularized and positioned in the valve in the form of a pocket. Then, the pocket was closed and the construct was sutured at the level of the pulmonary exit tract using biological or synthetic threads or tapes.
  • valve implant that can be readily accepted by the host, can be colonized by host cells, remodeled after implantation (eg by the growing child treated for tetralogy of Fallot), and which can evolve with the patient.
  • this valve implant has the potential to grow, which differs from art implants (eg with stent, attached animal pericardium, polymer film or bioengineered film made from isolated and reconstituted proteins) which require their removal and replacement via open-heart surgery associated with a high mortality rate.
  • the valve implant according to the invention therefore has potential for pediatric applications.
  • ECM Human nature and the quasi-native organization of this ECM avoids the need for fixation to avoid its degradation or to reinforce it, which allows the valve implant according to the invention to be accepted by the recipient patient, without rejection. or chronic inflammation with visible vascularization at 2 weeks; which promises superior efficiency and durability to valves or valves made from materials of animal or synthetic origin. Use of reconstituted ECM would lead to complete degradation within weeks and device failure or would require chemical treatments which would render it a source of chronic inflammation which is a source of complication and device failure valves.
  • ECM extracellular matrix
  • the cells are seeded on a substrate with a culture medium to generate an MEC sheet after a long period of culture.
  • the MEC sheet is optionally processed for storage.
  • the MEC sheet can be detached, or not, from the substrate using an anchor device. This device avoids tissue contraction during culture and processing for storage. Finally, the MEC sheet is cut into a piece of MEC sheet.
  • the cells can be of human origin.
  • Cells can be autologous or allogeneic.
  • the type of cells can be for example: stem cells mesenchymal cells, induced pluripotent stem cells, adult primary mesenchymal cells (such as skin fibroblasts), immortalized cells, or a mixture thereof.
  • the seeding concentration depends on the cell type and can be between 1000 cells/cm 2 and 100,000 cells/cm 2 .
  • the substrate can be chosen from: a standard plastic bottle treated for culture, a heat-sensitive culture bottle, a different or similar MEC (e.g. an autologous human, allogenic human, xenogenic, etc.) MEC, a treated biological membrane (e.g. chemically treated pericardium of various origins, an amniotic membrane, etc...), a synthetic membrane (e.g. polytetrafluoroethylene, dacron, silicone, etc...), a hydrogel (e.g. collagen, alginate, fibrin, etc... ), a hybrid of the previous substrates.
  • the substrate can be coated with, among other things, adhesion proteins (e.g. RGD peptides, fibrin, etc.) or gelatin to facilitate cell adhesion.
  • the substrate can have different shapes (e.g. custom, round, rectangular, square, triangular, octagonal, pentagonal, etc%) in order to obtain the desired MEC sheet format.
  • the culture medium contains, but is not limited to, ascorbic compounds and serum for ECM production and assembly. Its composition depends on the cell type and is typically changed three times a week.
  • the culture period varies between 4 and 24 weeks, preferably from 16 to 20 weeks, preferably from 6 to 8 weeks.
  • the MEC can be untreated, dehydrated, devitalized (process consisting of freezing the MEC sheet at -80°C, thawing it at room temperature, dehydrating it preferably overnight at room temperature under sterile flow fume hood and finally rehydrate it at room temperature before use), decellularized, treated with a glutaraldehyde solution, or a combination of these.
  • Decellularized ECM can be recellularized with the cells described above, or endothelialized using autologous or allogeneic cells (e.g. umbilical cord vein endothelial cells (HUVECs), adipose tissue-derived stromal vascular fraction (SVF) cells , microvascular cells, etc.).
  • autologous or allogeneic cells e.g. umbilical cord vein endothelial cells (HUVECs), adipose tissue-derived stromal vascular fraction (SVF) cells , microvascular cells, etc.
  • MEK can be stored at -80°C, -20°C, 4°C or at room temperature.
  • the anchoring device can be a sterile stainless steel holder, a sterile plastic holder, a sterile paper holder, and depends on the culture bottle.
  • This MEC sheet is neither a natural fabric nor a synthetic fabric produced from proteins extracted from natural tissue and reconstituted into a tissue bio-engineered fabric.
  • This MEC sheet is assembled by cells in culture. It results a sheet of human MEC, not fixed, and which presents a physiological organization. For these reasons, MEC sheet possesses significant mechanical strength, does not cause immune/inflammatory reactions, and can interact normally with recipient cells to allow slow remodeling and not a degradative process.
  • the MEC sheet is cut into ribbons which can be twisted (eg 0 to 10 turns/cm) to form threads.
  • the MEC sheet can be cut using a machine having spaced circular blades, a laser system, an ultrasonic system, an electric arc system, a scalpel blade, or of scissors.
  • the ribbons can have a width of approximately 0.1 to 10 mm, their length depending on the substrate used. Ribbons can be formed directly on culture flasks in the desired format. Ribbons can be twisted to change their properties. Two or more ribbons can be joined together using a twist method, bio-glue, cultured MEC deposition, or a combination thereof, to improve mechanical properties . Then, the threads or ribbons can be mounted on a surgical needle (e.g. tied at the level of the eye; the eye can be crimped in order to fix the thread or ribbon on the needle).
  • a surgical needle e.g. tied at the level of the eye; the eye can be crimped in order to fix the thread
  • the yarns or ribbons may be untreated, dehydrated, devitalized, decellularized, treated with glutaraldehyde, or a combination thereof.
  • the decellularized threads or ribbons can be recellularized with the cells described above, or endothelialized using autologous or allogeneic cells (e.g. HUVECs, cells of the stromal vascular fraction of blood, microvascular cells, etc).
  • autologous or allogeneic cells e.g. HUVECs, cells of the stromal vascular fraction of blood, microvascular cells, etc.
  • the yarns or tapes can be stored at -80°C, -20°C, 4°C or at room temperature.
  • Particles containing living cells can be particularized and positioned inside the pocket-like valve implant.
  • particles can originate from: native pulmonic valve leaflet, native dermis (autologous, allogeneic or xenogeneic), tissue engineered ECM, any tissue engineered matrix, cell suspension (primary cells, mesenchymal stem cells, stem cells induced pluripotent cells (iPSCs), etc.), cellular aggregate (eg spheroids, organoids), extracellular vesicle or active principle (eg drug), or a combination thereof.
  • native pulmonic valve leaflet native dermis (autologous, allogeneic or xenogeneic)
  • tissue engineered ECM any tissue engineered matrix
  • cell suspension primary cells, mesenchymal stem cells, stem cells induced pluripotent cells (iPSCs), etc.
  • cellular aggregate eg spheroids, organoids
  • extracellular vesicle or active principle eg drug
  • the particles can be obtained using a machine having spaced circular blades, a laser system, an ultrasound system, an electric arc system, a scalpel blade, a grid, scissors or a grinder.
  • the particles can be placed inside the bag using a spoon (surgical material), a pipette or a syringe.
  • the invention relates to a pocket-type valve implant comprising: a piece of a sheet of tissue consisting of an extracellular matrix secreted by cells, preferably human, in culture and optionally cells themselves themselves, folded over on itself once so as to form a pocket area, in which all or part of the opposite edges of said folded piece are joined together.
  • valve is meant within the meaning of the present invention, the part of a valve which consists of a sheet of tissue which moves with a fluid (preferably blood) to allow it to circulate in one direction and which prevents it from circulating in the other.
  • a fluid preferably blood
  • pocket-type valve within the meaning of the present invention means a valve comprising a hollow structure which makes it possible to retain one or more objects which can be placed therein, for example cells, small pieces of tissue, particles of biomaterials, etc.
  • sheet of tissue consisting of an extracellular matrix secreted by cells, preferably human, in culture
  • the deposit of insoluble proteins which accumulates on the inner surface of the bottom wall a container in which cells are cultured under conditions that promote this deposition. It is more particularly a sheet of tissue when this deposit is detached from the surface.
  • pocket zone within the meaning of the present invention means the empty space (hollow structure) created by the folding of a piece of an MEC sheet and the closing of all or part of the opposite edges of said piece.
  • opposite edges within the meaning of the present invention, the edges of a piece of MEC sheet whose adjacent flat parts are essentially parallel and affixed against each other in such a way as to be able to join them.
  • all or part of the opposite edges of said folded piece are joined together by suturing with thread or modified biological ribbon (silk, chitosan, collagen, animal intestinal wall, etc.), synthetic and/or derived from a sheet of tissue as defined in the present invention.
  • thread or modified biological ribbon suturing with thread or modified biological ribbon (silk, chitosan, collagen, animal intestinal wall, etc.), synthetic and/or derived from a sheet of tissue as defined in the present invention.
  • (synthetic) thread or tape within the meaning of the present invention means a thread or tape made of a material resulting from chemical synthesis used for surgery or the preparation of medical devices.
  • said implant comprises inside the pocket zone a biological sample and/or an active principle.
  • biological sample is meant within the meaning of the present invention, preferably, a part of the dysfunctional valve of the patient taken and cut into small pieces in the operating room using a common surgical tool (scissors for example). Piece size may vary. These pieces are the biological samples that will be placed in the valve pocket area to provide a cell population to recolonize the tissue. Other tissues can be used such as dermis, connective tissue, bone marrow, blood vessel, blood, adipose tissue, etc. Other sources of cells are envisaged as cells from the same patient but which will have been cultured in vitro and may have undergone different treatments such as, for example, differentiation or dedifferentiation. These cells can come from different parts of the body.
  • the cells can be assembled in more or less large clusters (organoids). Several cell types can be combined. The cells can also be combined with one or more biomaterials (biological or synthetic) to promote their survival or functions according to numerous delivery strategies. The cells can also come from another individual (allogenic) or from another species (xenogenic). The options mentioned above can be combined.
  • active ingredient within the meaning of the present invention, a (non-living) pharmacological agent which will have a positive effect on the function of the valve by, for example, promoting the migration or proliferation of the patient's cells to obtain a more rapid or efficient tissue recolonization.
  • the pharmacological agent could also have an anti-thrombotic effect.
  • the biological sample comes from at least one valve of a valve of a subject.
  • valve is meant within the meaning of the present invention, a tubular structure which has, in its lumen, one or more valves which allow a fluid to flow in one direction but not the other.
  • the present invention relates to a method of manufacturing a valve implant according to the present invention, said method comprising: a) culturing a sheet of tissue as defined above; b) cutting a piece of said sheet of fabric obtained in step a); c) folding said piece of step b), on itself, once, so as to form a pocket area; d) the joining of all or part of the opposite edges of said folded piece of step c).
  • step d) is carried out by suturing with biologically modified thread or ribbon, synthetic and/or derived from a sheet of tissue as defined herein. invention.
  • said method further comprises a step of) filling the pocket area with a biological sample and/or an active principle, before the complete joining of step d ).
  • the sample of biological tissue comes from at least one valve of a valve of a subject.
  • valve implant according to the present invention is for use as a medicine.
  • the valve implant according to the present invention is for use in the treatment of a pathology chosen from congenital heart disease, cardiac, venous and lymphatic valve disease.
  • the congenital heart disease is tetralogy of Fallot.
  • Figure 1 shows the method of manufacturing a valve implant according to the invention.
  • Figure 2 shows the pattern used to cut the biological tape with a length of 2.4m and a width of 5mm.
  • Figure 3 shows the steps leading to the crimping of the biological suture.
  • the hydrated biological ribbon is twisted at 5 revolutions/cm over approximately 2 cm in length at one of its ends to form a thread.
  • the twisted area is gently massaged until completely dry to distribute the twists and obtain a dry yarn with a uniform diameter. This homogeneous area is then inserted into the eye of a surgical needle to be crimped.
  • Figure 4 shows a hydrated, ready-to-use biological suture.
  • Figure 5 shows the steps necessary to obtain the valve in the form of a pocket.
  • A The sheet of tissue consisting of an ECM secreted by cells in culture (hydrated) is placed on a cutting surface including a pattern (solid line of black color) of oval shape (length: 8 cm and width: 3 cm) to be dried.
  • B Once dry, the fabric sheet is cut following the pattern.
  • C The tissue is rehydrated using a sterile water solution.
  • DE Once rehydrated, the piece of tissue sheet can be peeled off the cutting mat and folded on itself along the black dotted line to form the pocket-like valve.
  • Figure 6 shows the closure of the valve in the form of a pocket made using an overlock made with the biological suture of Figure 4.
  • EXAMPLE 1 METHOD FOR MANUFACTURING A COMPLETELY BIOLOGICAL VALVE IMPLANT AND ITS CHARACTERISTICS
  • This example describes an approach to fabricating a completely biological valve implant.
  • the resulting valve is composed of non-living (devitalized) tissue and produced under sterile conditions, precluding the use of a terminal sterilization or fixation step.
  • all assembly steps are carried out in a sterile environment, with sterile liquids and instruments.
  • This description is not intended to limit the scope of this invention with respect to valve production method, cell types, cell source, cell age, cell line, culture conditions, shape sheet or sheet piece, number of sheets or sheet pieces, suturing material, suturing method, or intended use of the valve.
  • Those skilled in the art will easily understand that various modifications can be made to the process without departing from the scope and spirit of the invention.
  • the tissue sheets were obtained by culturing normal human skin fibroblasts in T-225 cm 2 flasks. For each flask, the cells were seeded at a density of 10,000 cells/cm 2 and cultured in a culture medium composed of DMEM-F12, bovine serum (20%) and sodium ascorbate (500 mM) . The whole was placed in an incubator with an atmosphere at 37° C. composed of 5% CO2 and 95% air. The culture medium was changed 3 times a week. After about three days, rods made of 304 stainless steel in an L shape.
  • the culture flask was cut in half lengthwise with a hot wire and the leaf was taken out of the bottle using the inner frame (anchoring system which is also used for handling the sheet) to be used in the manufacture of the biological wire and the pocket-shaped valve.
  • anchoring system which is also used for handling the sheet
  • a sheet of wet tissue was placed on a cutting surface including a double spiral pattern allowing to make a ribbon with a width of 5 mm and a length of 2.4 m (Figure 2).
  • the fabric sheet was then dried on the cut surface for at least 2 hours under a laminar flow hood.
  • the tape was then cut manually using curved surgical scissors and then rehydrated to separate it from the cut surface.
  • One end of the ribbon was then twisted on itself with a rotary motor at a value of 5 revolutions per cm over a length of 2 cm to form a thread (Figure 3). This twisted area was gently massaged during twisting and until the end was completely dry, thus reducing the diameter of the yarn as much as possible (Figure 4).
  • the native valves of the patient's pulmonary valve were surgically resected and then particularized using a scalpel blade. The particles were then drawn into a syringe which allowed their delivery into the pocket-like valve.
  • a sheet of wet tissue was placed on a cutting surface including an oval-shaped pattern (length: 8 cm and width: 3 cm) and dried under a laminar flow hood for at least 2 hours. The dried sheet was then cut according to the pattern using curved scissors. Once cut, the tissue was rehydrated with water for at least 30 minutes and the particles containing living cells were placed on half the surface of the sheet piece forming the pocket-shaped valve using of the syringe. Finally, the piece of sheet was folded back on itself along the minor axis (3 cm) of the oval shape to give a pocket-like valve with the following dimensions: height of 4 cm and width of 3 cm.

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Abstract

La présente invention concerne la production d'un implant de valvule et son utilisation dans le traitement de cardiopathies congénitales, de valvulopathies cardiaques, veineuses et lymphatiques, en particulier de la tétralogie de Fallot.

Description

PRODUCTION D’UN IMPLANT DE VALVULE ET SON UTILISATION
DESCRIPTION
Domaine technique de l’invention
La présente invention concerne la production d’un implant de valvule et son utilisation dans le traitement de cardiopathies congénitales, de valvulopathies cardiaques, veineuses et lymphatiques, en particulier de la tétralogie de Fallot.
Dans la description ci-dessous, les références entre parenthèses [ ] renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte.
Etat de la technique
Une cardiopathie congénitale correspond à une malformation du cœur présente à la naissance. Sa gravité peut varier, allant d’une forme tout à fait mineure qui ne causera jamais de problème cardiaque, à une forme très grave nécessitant un traitement. Une cardiopathie congénitale survient lorsque les cavités, les parois ou les valvules du cœur - ou les vaisseaux sanguins près du cœur - ne se développent pas normalement avant la naissance. On peut classer la majorité des cardiopathies congénitales en deux grandes catégories : cyanogènes et non cyanogènes (le mot cyanogène découlant de la couleur bleuâtre de la peau des patients atteints). Ces atteintes sont de gravité variable selon les cas.
Les cardiopathies congénitales non cyanogènes peuvent résulter de différentes malformations : trous dans le cœur ou malformations septales (communication interauriculaire CIA, communication interventriculaire CIV) et l’obstruction de la circulation sanguine (sténose, atrésie, insuffisance). Si dans certains cas, une médication peut être suffisante pour traiter un patient, cependant, dans de nombreux cas, les valves cardiaques défectueuses doivent être réparées. La disponibilité de valves cardiaques humaines étant extrêmement limitée (source : cadavre), voire inexistantes chez les enfants pour des raison de taille, les réparations consistent généralement en l’utilisation de valves réalisées à partir de matériaux biologiques, notamment de péricarde animal (en particulier bovin) et généralement traité chimiquement (e.g. fixation par le glutaraldéhyde) pour éviter le rejet et une dégradation rapide. Cette stratégie est à la base du design de toutes les valves dites biologiques actuellement commercialisées car d’origine animale, et montées sur une structure synthétique de soutient, incluant souvent un type de stent [20]. Cependant, cette fixation provoque une réaction inflammatoire chronique non-spécifique dite « réaction à corps étrangers » (foreign body reaction ou FBR) de même nature que celle observée lors de l’implantation de biomatériaux synthétiques, et la principale cause des complications des implants. Toutefois, la FBR est beaucoup moins intense que le rejet spécifique dirigé vers les tissus animaux intacts, d’où l’intérêt de la fixation. De plus, la fixation, en dénaturant les protéines, rend ces dernières insensibles aux enzymes de l’hôte qui sont normalement capables de les dégrader rapidement. L’utilisation d’un tissu humain obtenu du péricarde du patient, donc qui ne nécessite pas de fixation chimique, est une possibilité qui a été explorée [21], Celle-ci semble très prometteuse mais la disponibilité, la variation de qualité et la qualité elle-même, la fragilité, le temps opératoire additionnel, et les conséquences de la transplantation pour le site donneur sont autant de variables qui peuvent compliquer cette approche. Toutes ces compilations seraient éliminées en utilisant une membrane biologique produite par ingénierie tissulaire comme celle proposé dans cette invention.
L’utilisation d’un « film de bio-ingénierie », obtenu a priori à partir d’un matériau polymérique biodégradable ou de protéines purifiées puis reconstituées en matrice, a été également évoqué dans le cas de [20]. Tout d’abord, l’utilisation du terme film suggère à l’homme de l’art un recouvrement très fin (Le petit Robert : « Couche très mince (d'une matière) »). Une revue de littérature dans PubMed confirme que l’utilisation de ce terme réfère généralement à de très petites couches de matériel. Il ne semble pas que de tels films soient appropriés car beaucoup trop fins par rapport à un feuillet de tissu pour avoir une résistance à la perforation suffisante. En outre, ce type de matériau est utilisé suivant une approche basée sur la délicate balance entre les phénomènes de dégradation du matériau et la création d’un nouveau tissu. Cette balance est très difficile à contrôler, sachant que ces phénomènes sont très variables d’un individu à l’autre. Mais plus important est le fait que l’homme de l’art comprendra « de bio-ingénierie » comme voulant dire : une structure faite soit de tissu animal (ou même de cadavre) chimiquement traité ou une structure faite de protéines solubilisée/purifiées à partir de matrice extracellulaire de tissu animal/humain qui sont ensuite réassemblées par divers processus physico-chimiques. Cette perception est confirmée à la lecture de la Demande de Brevet US20030229394A1 [22] où les auteurs divisent les matrices faites de protéines de matrice extracellulaire (surtout du collagène) comme étant 1 ) un tissu naturel ou 2) une matrice « synthétique » faite à base de collagène. Ici, « synthétique » ne veut pas dire « faite de polymère » comme c’est souvent le cas mais bien « faite à partir de protéines extraites de tissus naturels» comme cela est décrit en paragraphe 79 où sont décrits les « synthetic tissue matrices ».
Parmi les cardiopathies congénitales cyanogènes, la tétralogie de Fallot est l’une des formes les plus communes. Elle représente 7 à 10% des nouveau-nés souffrant d’une cardiopathie congénitale [1 , 2], Elle associe une sténose de la valve pulmonaire, une hypertrophie du ventricule droit, une communication interventriculaire (CIV), et une dextroposition de l'aorte. Ces anomalies affecteront la structure et les capacités cardiaques pulsatiles, qui provoqueront une sténose sur la voie de sortie ventriculaire droite (Right Ventricular Outflow Tract ou RVOT), et finalement une désaturation en oxygène dans le sang artériel. La réparation chirurgicale consiste à fermer la CIV et à enlever la sténose de la RVOT vers l'âge de 6 mois de la vie du patient. Dans plus de 70% des cas, la sténose de la RVOT est corrigée en positionnant un patch transannulaire, qui malheureusement conduit à une fuite de la valve pulmonaire [3, 4], En l'absence de traitement, cette fuite de la valve pulmonaire entraîne une dilatation et un dysfonctionnement du ventricule droit, qui seront associés à des arythmies ventriculaires et à une augmentation des risques de mort subite à l'âge adulte. L’utilisation de valves biologiques montées sur un stent ou de valves mécaniques fournies par l'industrie dans cette population de nourrissons reste totalement impossible [5]. Des techniques ont été développées afin de limiter ces fuites de la valve pulmonaire, comme l'utilisation d'une valve monocuspide [6]. Cette valve peut être réalisée à partir de matériaux biologiques, notamment par l'utilisation de péricarde bovin traité chimiquement pour éviter le rejet [5] ou de membranes de polytétrafluoroéthylène (PTFE) synthétiques [6]. Cependant ces matériaux sont sujets à des limitations. Bien que relativement flexibles, extrêmement solides et faciles à manipuler, le péricarde bovin traité au glutaraldéhyde et les membranes synthétiques sont associés à des complications thromboemboliques et/ou à une endocardite infectieuse [7-9]. En outre, ces matériaux sont reconnus comme des corps étrangers qui causent des réactions inflammatoires chroniques. Les membranes de polytétrafluoroéthylène (PTFE), comme tous matériaux synthétiques sont aussi une cause d’infections graves. Enfin, les options actuelles ont montré des résultats inefficaces à court et moyen terme pour limiter la fuite de la valve pulmonaire.
Il existe donc un réel besoin clinique de développer un nouveau matériau permettant de réparer les valves telles que les valves cardiaques, et ne présentant pas les effets indésirables décrits.
Les inventeurs proposent d’utiliser un biomatériau complètement biologique composé d’une matrice extracellulaire (MEC) sécrétée par des fibroblastes dermiques humains, qui est véritablement biocompatible [10-13]. Sa remarquable biocompatibilité provient de la structure de la MEC qui représente un avantage différent qui s’ajoute à celui de la nature biologique ou humaine des protéines qui la composent. En effet, lors d’une implantation, le système immunitaire de l’organisme peut reconnaître l’origine étrangère d’une protéine grâce à son système immunitaire dit « adaptatif » mais il peut aussi reconnaître une organisation anormale (ou « dénaturée ») de la MEC grâce à son système immunitaire dit « inné ». Ainsi, lorsque la MEC est endommagée par un traumatisme physique, thermique ou infectieux, l’organisme pourra rapidement digérer la MEC endommagée, grâce à des cellules de type macrophage, pour permettre à des cellules spécialisées, de type fibroblaste, de reconstruire une MEC. C’est ce mécanisme qui entre en jeu lorsqu’une matrice de collagène produite par des méthodes physicochimiques est implantée dans un organisme. Celle-ci sera rapidement dégradée par le système immunitaire inné car elle n’a pas une organisation « physiologique » mais plutôt une structure dénaturée [23-25]. Le fait de faire produire la MEC par des cellules en culture en laboratoire, et de ne pas la traiter chimiquement par la suite, permet d’obtenir une organisation de la MEC qui est assez proche de la structure physiologique pour permettre qu’elle soit « acceptée » par l’hôte, ou, en d’autres termes, qu’elle ne déclenche pas une réaction immunitaire innée qui la détruirait. C’est cette particularité organisationnelle qui la différencie de toutes les autres matrices produites par des méthodes physico-chimiques à partir de protéines extraites de tissu (humains ou animal). De plus, cette MEC, produite sous forme de feuille à la surface du flacon de culture, est manipulable et mécaniquement robuste après 6 à 8 semaines de culture [13,14], Cette robustesse, obtenue sans traitement chimique (comme de la réticulation par exemple), est également attribuable à l’organisation de la MEC par les cellules en culture qui produisent une matrice faites de fibrilles de collagène très densément organisés et combinées avec de nombreuses autres protéines matricielles [26-27], Enfin, il faut noter que la structure de cette MEC produite par des cellules en laboratoire est également différence de celle de la MEC obtenue à partir d’un tissu prélevé directement d’un mammifère. En effet, les tissus prélevés in situ possèdent de nombreuses structures (poils, nerfs, vaisseaux sanguins et lymphatiques, glandes, membranes, limitantes, etc.) qui sont absentes des feuillets de MEC produit in vitro. De plus, ces tissus prélevés contiennent de nombreux type cellulaire alors que les feuillets de MEC produits in vitro ne contiennent qu’un seul type de cellules (typiquement des fibroblaste). Par conséquent, le feuillet produit in vitro est beaucoup plus homogène, au point de vue structure et composition, qu’un tissu prélevé in vivo. Ceci peut avoir des avantages mécaniques et biologiques. De plus, de son mode de préparation in vitro, le feuillet offre une plus grande reproductibilité ce qui peut présenter des avantages au point de vue du contrôle de qualité dans un contexte de production commerciale. Ainsi, la structure de ce matériau est très particulière et le distingue des autres matériaux utilisés jusqu’ici pour produire des valvules.
Ce biomatériau a déjà été utilisé dans des applications vasculaires chez l’Homme [15-18], Dans ce contexte, des feuilles de MEC ont été enroulées et fusionnées pour former des vaisseaux, qui ont ensuite été implantées chez des patients souffrant d'insuffisance rénale terminale [17, 18]. Les résultats d’implantation ont montré un taux élevé de perméabilité transluminale (jusqu'à 3 ans) [17, 18]. En outre, ce travail a démontré que la feuille de MEC construite sans composants synthétiques peut réellement s'intégrer au tissu natif, être remodelée par les cellules hôtes et être résistante aux infections. Sa structure biologique, son origine humaine, et l’absence de traitements chimiques (par exemple, la fixation au glutaraldéhyde) a permis à ce biomatériau d’être accepté par le patient sans risque de rejet, de dégradation rapide, ou d’inflammation chronique contrairement aux MEC issues de tissus animaux qui sont toujours traitées chimiquement pour masquer l’origine xénogénique et ralentir l’action dégradatives des enzymes me l’hôte qui sont sécrétées pour détruire les matrices dénaturées. En outre, les données ont montré que le biomatériau produit par des fibroblastes allogéniques (à partir d’un donneur diffèrent du receveur) n’induit pas de réponse immunitaire adaptative spécifique [15]. En outre, une nouvelle génération de fils biologiques a été produite, en coupant une feuille de MEC en plusieurs rubans. Ces rubans peuvent être torsadés pour former des fils plus denses avec des propriétés mécaniques différentes des rubans [14], De récents travaux ont démontré la faisabilité d’utiliser ces fils ou rubans de MEC comme suture pour la fermeture de plaies cutanées [14],
Ce biomatériau ayant une résistance à la perforation qui peut atteindre 2 à 6 kgf [26] a également été utilisé dans la construction d’un implant de valve comprenant une structure tubulaire et au moins deux morceaux de feuille de MEC (cuspides ou valvules) connectés à ladite structure ; la feuille étant telle que définie ci-dessus (cf. « single-layer tissue sheet » de la Demande internationale WO 20123/142879) [19]. Cet implant biologique n’a jamais été proposé pour la réparation de valvules chez les enfants souffrant d’une cardiopathie congénitale, en particulier atteints de la tétralogie de Fallot.
Description de l’invention
La présente invention répond précisément à ce besoin en proposant un implant biologique comprenant ou constitué de l’association d’une feuille de tissu constituée d’une matrice extracellulaire (MEC) secrétée par des cellules, de préférence humaines, en culture et éventuellement des cellules elles-mêmes (ci-après également dénommée feuille de MEC), avec des fils ou rubans biologiques modifiés, synthétiques et/ou issus du même matériau biologique. Cet implant biologique sert à la constitution d’un implant de valvule de type poche dans lequel un échantillon biologique et/ou un principe actif peu(ven)t être inséré(s) avant implantation, afin d’optimiser la régénération tissulaire.
Pour ce faire, les Inventeurs ont développé un procédé de fabrication d’un implant de valvule complètement biologique (Figure 1 ) à partir d’une feuille de MEC telle que définie précédemment dont ils ont découpé un morceau qui a été plié une fois sur lui- même afin de former une valvule de type poche. En parallèle, des feuilles de MEC ont également été découpées en rubans pour produire des fils de MEC biologiques. Une fois le morceau et les fils ou rubans de MEC obtenus, optionnellement, des cuspides ou valvules de valves pulmonaires natives contenant des cellules vivantes ont été extraites, particularisées et positionnées dans la valvule en forme de poche. Puis, la poche a été fermée et la construction a été suturée au niveau de la voie de sortie pulmonaire en utilisant les fils ou rubans biologiques ou synthétiques. L’espace entre les deux couches de feuille formé par la fermeture de la poche n’a pas été scellé/fusionné afin de permettre son remplissage par des cellules, des fragments de tissus ou des principes actifs. Cette association innovante a permis la production d’un implant de valvule entièrement biologique qui peut être facilement accepté par l’hôte, peut être colonisé par les cellules de l’hôte, remodelé après implantation (e.g. par l’enfant en croissance traité pour une tétralogie de Fallot), et qui peut évoluer avec le patient. En d’autres termes, cet implant de valvule a le potentiel de croitre, ce qui diffère des implants de l’art (e. g. avec stent, péricarde animal fixé, film de polymère ou film issu de la bioingénierie fait de protéines isolées et reconstitué) qui nécessitent leur enlèvement et remplacement via une opération à cœur ouvert associée à un taux de mortalité important. L’implant de valvule selon l’invention a donc un potentiel pour des applications pédiatriques.
La nature humaine et l’organisation quasi native de cette MEC évite le besoin de fixation pour éviter sa dégradation ou pour la renforcer, ce qui permet à l’implant de valvule selon l’invention d’être accepté par le patient receveur, sans rejet ou inflammation chronique avec une vascularisation visible à 2 semaines ; ce qui promet une efficacité et une durabilité supérieure aux valves ou valvules faites à partir de matériaux d’origine animale ou synthétique. L’utilisation d’une MEC reconstituée mènerait à une dégradation complète en quelques semaines et l’échec du dispositif ou demanderait des traitements chimiques qui rendraient celle-ci une source d’inflammation chronique qui est une source de complication et d’échec des dispositifs valvulaires.
Production d’une feuille de matrice extracellulaire (MEC) sécrétée par les cellules
Les cellules sont ensemencées sur un substrat avec un milieu de culture afin de générer une feuille de MEC après une longue période de culture. La feuille de MEC est, optionnellement, traitée pour le stockage. La feuille de MEC peut être détachée, ou pas, du substrat en utilisant un dispositif d’ancrage. Ce dispositif évite la contraction tissulaire pendant la culture et le traitement pour le stockage. Enfin, la feuille de MEC est découpée en un morceau de feuille de MEC.
Les cellules peuvent être d’origine humaine. Les cellules peuvent être autologues ou allogéniques. Le type de cellules peut être par exemple : cellules souche mésenchymateuses, cellules souche pluripotentes induites, cellules mésenchymateuses primaires adultes (comme des fibroblastes de peaux), cellules immortalisées, ou un mélange de celles-ci.
La concentration d’ensemencement dépend du type cellulaire et peut être comprise entre 1000 cellules/cm2 à 100000 cellules/cm2.
Le substrat peut être choisi parmi : un flacon en plastique standard traité pour la culture, un flacon de culture thermosensible, une MEC différente ou similaire (e.g. une MEC humaine autologue, humaine allogénique, xénogénique, etc...), une membrane biologique traitée (e.g. péricarde de diverses origines traités chimiquement, une membrane amniotique, etc...), une membrane synthétique (e.g. polytétrafluoroéthylène, dacron, silicone, etc...), un hydrogel (e.g. collagène, alginate, fibrine, etc...), un hybride des substrats précédents. Le substrat peut être recouvert, entre autres, de protéines d'adhésion (e.g. peptides RGD, fibrine, etc...) ou de gélatine pour faciliter l'adhésion des cellules. Le substrat peut avoir différentes formes (e.g. personnalisée, ronde, rectangulaire, carrée, triangulaire, octogonale, pentagonale, etc...) afin d’obtenir le format de feuille de MEC souhaité.
Le milieu de culture contient, sans y être limité, des composés ascorbiques et du sérum pour la production de la MEC et son assemblage. Sa composition dépend du type cellulaire et est changée typiquement trois fois par semaine. La période de culture varie entre 4 et 24 semaines, de préférence de 16 à 20 semaines, préférentiellement de 6 à 8 semaines.
Pour son stockage, la MEC peut être non-traitée, déshydratée, dévitalisée (procédé consistant à congeler la feuille de MEC à -80°C, la décongeler à température ambiante, la déshydrater de préférence durant la nuit à température ambiante sous le flux stérile d'une hotte et enfin la réhydrater à température ambiante avant son utilisation), décellularisée, traitée avec une solution de glutaraldéhyde, ou une combinaison de ceux-ci. La MEC décellularisée peut être recellularisée avec les cellules décrites ci-dessus, ou endothélialisée en utilisant des cellules autologues ou allogéniques (e.g. cellules endothéliales de la veine du cordon ombilical (HUVECs), cellules de la fraction vasculaire stromale (FVS) dérivées du tissu adipeux, cellules microvasculaires, etc...). Selon le traitement, la MEC peut être stockée à -80°C, -20°C, 4°C ou à température ambiante. Le dispositif d'ancrage peut être un support stérile en acier inoxydable, un support stérile en plastique, un support stérile en papier, et dépend du flacon de culture.
Cette feuille de MEC n’est ni un tissu naturel ni un tissu synthétique produit à partir de protéines extraites de tissu naturel et reconstitué en un tissu issu de la bio-ingénierie tissulaire. Cette feuille de MEC est assemblée par des cellules en culture. Il en résulte une feuille de MEC humaine, non fixée, et qui présente une organisation physiologique. Pour ces raisons, la feuille de MEC possède une force mécanique importante, ne cause pas de réactions immunitaires/inflammatoires, et peut interagir normalement avec les cellules du receveur pour permettre un remodelage lent et non un processus dégradatif.
Production de fils ou rubans à partir de la MEC
La feuille de MEC est découpée en rubans qui peuvent être torsadés (par exemple de 0 à 10 tours/cm) pour former des fils. La feuille de MEC peut être découpée à l’aide d’une machine possédant des lames circulaires espacées, d’un système laser, d’un système à ultrasons, d’un système à arc électrique, d’une lame de scalpel, ou de ciseaux. Les rubans peuvent avoir une largeur d’environ 0,1 à 10 mm, leur longueur dépendant du substrat utilisé. Les rubans peuvent être formés directement sur les flacons de culture au format désiré. Les rubans peuvent être torsadés pour modifier leurs propriétés. Au moins deux rubans peuvent être assemblés ensemble à l’aide d’une méthode de torsion, d’une colle biologique, d’un dépôt de la MEC en culture, ou d’une combinaison de ceux-ci, pour améliorer les propriétés mécaniques. Puis, les fils ou rubans peuvent être montés sur une aiguille chirurgicale (e.g. noués au niveau du chas ; le chas pouvant être serti afin de fixer le fil ou ruban sur l’aiguille).
Pour leur stockage, les fils ou rubans peuvent être non-traités, déshydratés, dévitalisés, décellularisés, traités au glutaraldéhyde, ou une combinaison de ceux-ci. Les fils ou rubans décellularisés peuvent être recellularisés avec les cellules décrites ci- dessus, ou endothélialisés en utilisant des cellules autologues ou allogéniques (e.g. HUVECs, cellules de la fraction vasculaire stromale du sang, cellules microvasculaires, etc...). Selon le traitement, les fils ou rubans peuvent être stockés à -80°C, -20°C, 4°C ou à température ambiante.
Ces fils ou rubans ne risquent pas d’entrainer de réaction inflammatoire et sont remodelables. Cela peut éviter des complications et permet une croissance avec l’enfant, contrairement aux sutures traditionnelles généralement faites de plastiques permanents (e.g. polypropylène).
Production et insertion des particules
Des particules contenant des cellules vivantes peuvent être particularisées et positionnées à l’intérieur de l’implant de valvule en forme de poche.
Par exemple, les particules peuvent provenir de : valvule de valve pulmonaire native, derme natif (autologue, allogénique ou xénogénique), MEC d’ingénierie tissulaire, toute matrice d’ingénierie tissulaire, suspension cellulaire (cellules primaires, cellules souches mésenchymateuses, cellules souches pluripotentes induites (iPSCs), etc...), agrégat cellulaire (e.g. sphéroïdes, organoïdes), vésicule extracellulaire ou principe actif (e.g. médicament), ou une combinaison de ceux-ci.
Les particules peuvent être obtenues à l’aide d’une machine possédant des lames circulaires espacées, d’un système laser, d’un système à ultrasons, d’un système à arc électrique, d’une lame de scalpel, d’une grille, de ciseaux ou d’un broyeur.
Les particules peuvent être placées à l’intérieur de la poche à l’aide d’une cuillère (matériel chirurgical), une pipette ou d’une seringue.
Ainsi, selon un aspect, l’invention concerne un implant de valvule de type poche comprenant : un morceau d'une feuille de tissu constituée d’une matrice extracellulaire secrétée par des cellules, de préférence humaines, en culture et éventuellement des cellules elles- mêmes, replié sur lui-même une fois de manière à former une zone de poche, dans lequel tout ou partie des bords opposés dudit morceau plié sont joints ensemble.
On entend par « valvule » au sens de la présente invention, la partie d’une valve qui est constituée d’un feuillet de tissu qui se déplace avec un fluide (de préférence du sang) pour lui permettre de circuler dans une direction et qui l’empêche de circuler dans l’autre. Il peut y avoir une, mais plus habituellement deux ou trois, ou même un nombre plus élevé de valvules dans une valve.
On entend par « valvule de type poche » au sens de la présente invention, une valvule comprenant une structure creuse qui permet de retenir un ou plusieurs objets qui peuvent y être placés, par exemple des cellules, des petits morceaux de tissus, des particules de biomatériaux, etc.
On entend par « feuille de tissu constituée d’une matrice extracellulaire secrétée par des cellules, de préférence humaines, en culture » au sens de la présente invention, le dépôt de protéines insolubles qui s’accumule à la surface intérieure de la paroi du fond d’un contenant dans lequel on cultive des cellules dans des conditions qui favorise ce dépôt. Il s’agit plus particulièrement d’une feuille de tissu lorsque ce dépôt est détaché de la surface.
On entend par « zone de poche » au sens de la présente invention, l’espace vide (structure creuse) créé par le repliement d’un morceau d’une feuille de MEC et la fermeture de toute ou partie des bords opposés dudit morceau.
On entend par « bords opposés » au sens de la présente invention, les bords d’un morceau de feuille de MEC dont les parties planes adjacentes sont essentiellement parallèles et apposées l’une contre l’autre de tel façon à pouvoir les joindre.
Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, tout ou partie des bords opposés dudit morceau plié sont joints ensemble par suture avec du fil ou ruban biologique modifié (soie, chitosane, collagène, paroi intestinale animale, etc...), synthétique et/ou issu d’une feuille de tissu telle que définie dans la présente invention.
On entend par « fil ou ruban (synthétique) » au sens de la présente invention, un fil ou ruban fait d’un matériau issu de synthèse chimique utilisé pour la chirurgie ou la préparation de dispositifs médicaux.
Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, ledit implant comprend à l’intérieur de la zone de poche un échantillon biologique et/ou un principe actif.
On entend par “échantillon biologique” au sens de la présente invention, de préférence, une partie de la valvule dysfonctionnelle du patient prélevée et coupée en petits morceaux dans la salle d’opération en utilisant un outil chirurgical commun (des ciseaux par exemple). La taille des morceaux peut varier. Ces morceaux sont les échantillons biologiques qui seront placés dans la zone de poche de la valve pour fournir une population cellulaire pour recoloniser le tissu. D’autres tissus peuvent être utilisés comme le derme, le tissu conjonctif, la moelle osseuse, un vaisseau sanguin, du sang, le tissu adipeux, etc. D’autres source de cellules sont envisagées comme des cellules du même patient mais qui auront été cultivées in vitro et peuvent avoir subi différents traitements comme, par exemple, une différentiation, ou une dédifférenciation. Ces cellules peuvent venir de différentes parties du corps. Elles peuvent être assemblées en amas plus ou moins gros (organoïdes). Plusieurs types de cellules peuvent être combinés. Les cellules peuvent aussi être combinées à un ou plusieurs biomatériaux (biologique ou synthétique) pour favoriser leur survie ou fonctions selon de nombreuses stratégies de délivrance. Les cellules peuvent aussi venir d’un autre individu (allogénique) ou d’une autre espèce (xénogénique). Les options mentionnées plus haut peuvent être combinés.
On entend par “principe actif” au sens de la présente invention, un agent pharmacologique (non-vivant) qui aura un effet positif sur la fonction de la valvule en, par exemple, favorisant la migration ou prolifération des cellules du patient pour obtenir une recolonisation du tissu plus rapide ou efficace. L’agent pharmacologique pourrait aussi avoir un effet anti-thrombotique.
Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, l’échantillon biologique provient d’au moins une valvule d’une valve d’un sujet.
On entend par “valve” au sens de la présente invention, une structure tubulaire qui possède, dans sa lumière, une ou plusieurs valvules qui permet à un fluide de circuler dans une direction mais pas l’autre.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne un procédé de fabrication d’un implant de valvule selon la présente invention, ledit procédé comprenant : a) la culture d’une feuille de tissu telle que définie ci-dessus ; b) la découpe d’un morceau de ladite feuille de tissu obtenue à l’étape a) ; c) le pliage dudit morceau de l’étape b), sur lui-même, une fois, de sorte à former une zone de poche ; d) la jonction de tout ou partie des bords opposés dudit morceau plié de l’étape c).
Selon un mode de réalisation particulier du procédé de la présente invention, la jonction de l’étape d) est réalisée par suture avec du fil ou ruban biologique modifié, synthétique et/ou issu d’une feuille de tissu telle que définie dans la présente invention.
Selon un mode de réalisation particulier du procédé de la présente invention, ledit procédé comprend en outre une étape d’) de remplissage de la zone de poche avec un échantillon biologique et/ou un principe actif, avant la jonction complète de l’étape d).
Selon un mode de réalisation particulier du procédé de la présente invention, l’échantillon de tissu biologique provient d’au moins une valvule d’une valve d’un sujet.
Selon encore un autre aspect de la présente invention, l’implant de valvule selon la présente invention est pour une utilisation comme médicament.
Selon encore un autre aspect de la présente invention, l’implant de valvule selon la présente invention est pour une utilisation dans le traitement d’une pathologie choisie parmi les cardiopathies congénitales, les valvulopathies cardiaques, veineuses et lymphatiques.
Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, la cardiopathie congénitale est la tétralogie de Fallot.
Des avantages autres que ceux décrits dans la présente Demande pourront encore apparaître à l’homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous donnés à titre illustratif.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 représente le procédé de fabrication d’un implant de valvule selon l’invention. La Figure 2 représente le patron utilisé pour découper le ruban biologique d’une longueur de 2,4m et d’une largeur de 5mm.
La Figure 3 représente les étapes conduisant au sertissage du fil de suture biologique. Le ruban biologique hydraté est torsadé à 5 révolutions/cm sur environ 2 cm de longueur à l’une de ses extrémités pour former un fil. Durant cette étape, la zone torsadée est délicatement massée jusqu’à son séchage complet pour répartir les torsades et obtenir un fil sec avec un diamètre homogène. Cette zone homogène est ensuite insérée dans le chas d’une aiguille chirurgical pour être sertie.
La Figure 4 représente un fil de suture biologique hydraté et prêt à l’emploi. La Figure 5 représente les étapes nécessaires à l’obtention de la valvule en forme de poche. (A) La feuille de tissu constituée d’une MEC secrétée par des cellules en culture (hydratée) est placée sur une surface de découpe incluant un patron (ligne pleine de couleur noire) de forme ovale (longueur : 8 cm et largeur : 3 cm) pour être séchée. (B) Une fois sèche, la feuille de tissu est découpée en suivant le patron. (C) Le tissu est réhydratée à l’aide d’une solution d’eau stérile. (D-E) Une fois réhydratée, le morceau de feuille de tissu peut être détachée du support de découpe et pliée sur lui-même en suivant la ligne noire en pointillé pour former la valvule en forme de poche.
La Figure 6 représente la fermeture de la valvule en forme de poche réalisée à l’aide d’un surjet fait avec le fil de suture biologique de la Figure 4.
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : PROCEDE DE FABRICATION D’UN IMPLANT DE VALVULE COMPLETEMENT BIOLOGIQUE ET SES CARACTERISTIQUES
Cet exemple décrit une approche pour fabriquer un implant de valvule complètement biologique. Dans cet exemple, la valvule résultante est composée d’un tissu non vivant (dévitalisé) et produit stérilement, ce qui exclut l'utilisation d'une étape de stérilisation terminale ou de fixation. Ainsi, toutes les étapes d'assemblage sont réalisées dans un environnement stérile, avec des liquides et des instruments stériles. Cette description n'est pas destinée à limiter la portée de cette invention en ce qui concerne la méthode de production de la valvule, les types cellulaires, la source cellulaire, l’âge cellulaire, la lignée cellulaire, les conditions de culture, la forme de la feuille ou du morceau de feuille, le nombre de feuilles ou de morceaux de feuille, le matériel de suture, la méthode de suture ou l’utilisation prévue de la valvule. L’homme du métier comprendra aisément que diverses modifications peuvent être apportées au procédé sans sortir du cadre et de l’esprit de l'invention.
Dans cet exemple, les feuilles de tissu ont été obtenues en cultivant des fibroblastes de peau humaine normale dans des flacons T- 225 cm2. Pour chaque flacon, les cellules ont été ensemencées à une densité de 10 000 cellules/cm2 et cultivées dans un milieu de culture composé de DMEM-F12, du sérum bovin (20%) et de l’ascorbate de sodium (500 mM). L’ensemble a été placé dans un incubateur avec une atmosphère à 37°C composée de 5% CO2 et 95% d'air. Le milieu de culture a été changé 3 fois par semaine. Après environ trois jours, des tiges composées d’acier inoxydable 304 en forme de L. Après une période de culture de 16 semaines, le flacon de culture a été coupé en deux parties dans sa longueur avec un fil chaud et la feuille a été sortie du flacon à l'aide du cadre intérieur (système d’ancrage qui sert aussi à la manipulation de la feuille) pour être utilisée dans la fabrication du fil biologique et de la valvule en forme de poche. Une étude mécanique a permis d’établir que cette feuille était capable de résister à une force de perforation d’environ 2300 grammes-force.
Pour la fabrication du fil de suture biologique, une feuille de tissu humide a été posée sur une surface de découpe incluant un patron de forme double spirale permettant de faire un ruban d’une largeur de 5 mm et d’une longueur de 2,4 m (Figure 2). La feuille de tissu a ensuite été séchée sur la surface de découpe durant au moins 2 heures sous une hotte à flux laminaire. Une fois séché, le ruban a alors été découpé manuellement à l’aide de ciseaux courbés chirurgicaux et ensuite réhydraté afin de le séparer de la surface de découpe. Une extrémité du ruban a alors été torsadé sur lui-même avec un moteur rotatif à une valeur de 5 révolutions par cm sur une longueur de 2 cm pour former un fil (Figure 3). Cette zone torsadée a été massée doucement durant le torsadage et jusqu’au séchage complet de l’extrémité réduisant alors au maximum le diamètre du fil (Figure 4). Cette zone sèche et fine a alors été introduite dans le chas d’une aiguille chirurgical et l’encastrement a été serti grâce à une sertisseuse pneumatique (Figure 4). Le fil biologique serti a ensuite été enroulé sec autour d’un tube en silicone et placé dans un tube Eppendorf pour être préservé à -80°C jusqu’à son utilisation. Pour son utilisation, le fil de suture biologique a été réhydraté avec de l’eau durant au moins 10 minutes (Figure 5).
Pour l’obtention des particules contenant des cellules vivantes, les valvules natives de la valve pulmonaire du patient ont été réséquées chirurgicalement puis particularisées à l’aide d’une lame de scalpel. Les particules ont ensuite été aspirées dans une seringue qui a permis leur délivrance dans la valvule en forme de poche.
Pour la formation de la valvule en forme de poche, une feuille de tissu humide a été posée sur une surface de découpe incluant un patron de forme ovale (longueur : 8 cm et largeur : 3 cm) et séchée sous une hotte à flux laminaire durant au moins 2 heures. La feuille séchée a ensuite été découpée suivant le patron à l’aide de ciseaux incurvés. Une fois découpé, le tissu a été réhydraté avec de l’eau durant au moins 30 minutes et les particules contenant des cellules vivantes ont été disposées sur la moitié de la surface du morceau de feuille formant la valvule en forme de poche à l’aide de la seringue. Enfin, le morceau de feuille a été replié sur lui-même le long du petit axe (3 cm) de la forme ovale pour donner une valvule de type poche avec les dimensions suivantes : hauteur de 4 cm et largeur de 3 cm. Un fil biologique a alors été utilisé pour fermer les bords libres de la valvule de type poche à l’aide d’une méthode de suture dite de « surjet » (Figure 6). Afin de prévenir la fuite pulmonaire du patient créée suite à l’élargissement de la voie de sortie pulmonaire lors de la correction chirurgicale de la tétralogie de Fallot, la valvule serait finalement suturée environ 1 cm au-dessus de l’anneau pulmonaire à l’aide d’un fil ou ruban de suture biologique similaire à celui utilisé pour fermer la poche ou un fil ou ruban synthétique.
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Claims

REVENDICATIONS
1 ) Implant de valvule de type poche comprenant : un morceau d'une feuille de tissu constituée d’une matrice extracellulaire secrétée par des cellules, de préférence humaines, en culture et éventuellement des cellules elles- mêmes, replié sur lui-même une fois de manière à former une zone de poche, dans lequel tout ou partie des bords opposés dudit morceau plié sont joints ensemble, attendu que lesdites cellules ne sont pas des cellules souches embryonnaires humaines, génétiquement modifiées ou non.
2. Implant de valvule selon la revendication 1 , où tout ou partie des bords opposés dudit morceau plié sont joints ensemble par suture avec du fil ou ruban biologique modifié, synthétique et/ou issu de la feuille de tissu.
3. Implant de valvule selon la revendication 1 ou 2, ledit implant comprenant à l’intérieur de la zone de poche un échantillon biologique et/ou un principe actif, attendu que l’échantillon biologique ne sont pas des cellules souches embryonnaires humaines, génétiquement modifiées ou non.
4. Implant de valvule selon la revendication 3, où l’échantillon biologique provient d’au moins une valvule d’une valve d’un sujet.
5. Procédé de fabrication d’un implant de valvule selon la revendication 1 , ledit procédé comprenant : a) la culture de la feuille de tissu telle que définie dans la revendication 1 ; b) la découpe d’un morceau de ladite feuille de tissu obtenue à l’étape a) ; c) le pliage dudit morceau de l’étape b), sur lui-même, une fois, de sorte à former une zone de poche ; d) la jonction de tout ou partie des bords opposés dudit morceau plié de l’étape c).
6. Procédé selon la revendication 5 où la jonction de l’étape d) est réalisée par suture avec du fil ou ruban biologique modifié, synthétique et/ou issu de la feuille de tissu.
7. Procédé selon la revendication 5 ou 6, ledit procédé comprenant en outre une étape d’) de remplissage de la zone de poche avec un échantillon biologique préalablement prélevé et/ou un principe actif, avant la jonction complète de l’étape d).
8. Procédé selon la revendication 7, où l’échantillon de tissu biologique préalablement prélevé provient d’au moins une valvule d’une valve d’un sujet.
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