WO2023116951A1 - Proteínas de fusión compuestas por un anticuerpo y una muteina - Google Patents

Proteínas de fusión compuestas por un anticuerpo y una muteina Download PDF

Info

Publication number
WO2023116951A1
WO2023116951A1 PCT/CU2022/050012 CU2022050012W WO2023116951A1 WO 2023116951 A1 WO2023116951 A1 WO 2023116951A1 CU 2022050012 W CU2022050012 W CU 2022050012W WO 2023116951 A1 WO2023116951 A1 WO 2023116951A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fusion protein
seq
mutein
cells
protein according
Prior art date
Application number
PCT/CU2022/050012
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ana Victoria CASADESÚS PAZOS
Tays HERNÁNDEZ GARCÍA
Kalet LEÓN MONZÓN
Original Assignee
Centro De Inmunologia Molecular
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centro De Inmunologia Molecular filed Critical Centro De Inmunologia Molecular
Publication of WO2023116951A1 publication Critical patent/WO2023116951A1/es

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3084Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated gangliosides
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • C07K2319/33Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Definitions

  • the present invention relates to the field of Biotechnology and Immuno-oncology.
  • it describes fusion proteins composed of non-alpha agonist muteins of interleukin 2 (IL-2) fused to specific antibodies for antigens expressed in the tumor and capable of recruiting effector functions.
  • IL-2 interleukin 2
  • Immunocytokines are biopharmaceutical products formed by a cytokine fused to an antibody or antibody fragment, are attractive immunotherapeutic tools for the treatment of cancer, although their use has been extended to other diseases.
  • IL-2 is a potent activator of T lymphocytes and stimulator of NK cells and their ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) (Hank et al. (1990) J Biol Response Mod. 9:5-14). For this reason, it has become one of the most widely used cytokines in obtaining this type of fusion protein. In fact, most of the clinical progress made with ICs has been obtained with those that fuse IL-2 to antibodies specific for tumor antigens (Sondel, PM and SD Gillies. (2012) Antibodies. 1 (2): 149-171 ). Despite the fact that these molecules have shown promising results in phase II clinical trials (Albertini, MR et al. (2012) Cancer Immunollmmunother.
  • a group can be distinguished that includes those based on the IL-2v mutein, characterized by the presence of the F42A, Y45A, and L72G mutations, which determine non-binding to the alpha chain of the receptor. This favors the expansion of TCD8 + and NK effector cells, and favors the preferential non-expansion of regulatory T cells.
  • These fusion proteins are in full length IgG (IgG 1 ) format, do not possess classic antibody effector functions such as CDC (Complement Dependent Cytotoxicity) and ADCC (Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity), while being monovalent or monofunctional with respect to the cytokine.
  • CEA-IL2v IC cergutuzumab amunaleukin
  • CEA-IL2v IC cergutuzumab amunaleukin
  • FAP-IL2v Simlukafusp alfa
  • FAP-IL2v specific for the fibroblast activation protein a
  • HF Erb-Sum-IL2 appears, specific for EGFR (epidermal growth factor receptor), which contains a variant of IL-2 (sum-IL-2) characterized by L80F, R81D, L85V, I86Y, I92F.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • sum-IL-2 IL-2
  • L80F, R81D, L85V, I86Y, I92F IL-2
  • This set of changes with respect to the wild type cytokine determines a reduced binding and greater interaction of the mutein with the alpha and beta chains of the receptor, respectively.
  • the inventors of the present application generated a type of IC for cancer therapy, whose design It is based on the fusion of an IL-2 agonist mutein (IL2no-alpha) to the carboxyl end of the heavy chains of an IgG antibody with the capacity to recruit effector functions of the antibodies, to yield a bifunctional molecule with respect to the binding site for IL-2. antigen and cytokine.
  • this type of molecule has superior properties to other similar ones based on non-alpha muteins, by conserving or simultaneously improving the ability of antibodies to do direct lysis, ADCC and/or CDC and, in addition, activating NK and CD8 + T cells, without expand regulatory T cells.
  • fusion proteins with antitumor properties superior to the parental antibodies, and even to the combination of these with IL2no-alpha.
  • the format and composition of the fusion proteins listed in the present invention do not interfere with the biological activities associated with the variable region of the antibody portion. Such is the case of the capacity to induce apoptosis or to induce cytotoxicity independent of effector functions.
  • the present invention relates to a fusion protein characterized in that it comprises an IL-2 agonist mutein (non-alpha mutein) bound to an immunoglobulin of the IgG1 or IgG3 isotype and said immunoglobulin recognizes Fe ganma receptors and molecules of the complement.
  • This immunocytokine is characterized by being a bivalent molecule with respect to the antigen and cytokine binding site.
  • Said mutein and said immunoglobulin are linked through a linker.
  • the mutein is affected by at least two orders of magnitude, its ability to bind to the alpha chain of the IL-2 receptor and binds to immunoglobulin through the carboxyl end of each heavy chain of said immunoglobulin.
  • the non-alpha mutein has a sequence that is selected from the group consisting of SEQ ID NO. 16-43.
  • the linker is composed of the amino acid sequence selected from the group comprising: (Gly4Ser)nThrGly (SEQ ID NO. 44) and (Gly4Ser)n (SEQ ID NO. 45), where n is the amount of repeats of the Gly4Ser fragment and has a value from 1 to 5.
  • the immunoglobulin heavy chain belongs to the human lgG1 or lgG3 subclass and comprises the sequences SEQ ID NO. 11 or 12 or has greater than 97% identity with said 11 or 12 sequences.
  • the immunoglobulin light chain is characterized by belonging to the human kappa isotype and has a sequence that corresponds to SEQ ID NO. 9.
  • the light chain of the immunoglobulin is characterized by belonging to the human lambda isotype and has a sequence that corresponds to SEQ ID NO. 10.
  • the immunocytokine of the present invention is additionally characterized by recognizing tumor antigens among which are: CD20, CD19, NGcGM3, PDL1, Her ⁇ , Her2 and Epcam.
  • the present invention relates to pharmaceutical compositions that comprise the fusion proteins described herein in a concentration range of 0.5 mg/ml to 20 mg/ml and a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the present invention relates to the use of the fusion proteins disclosed in the present invention in the treatment of cancer.
  • the nucleic acid molecules, encoding the fusion proteins of the present invention for subcutaneous, intramuscular or intratumoral injection.
  • the present invention relates to a treatment method for a subject in need that comprises the subcutaneous, intravenous, intradermal, intramuscular or intraperitoneal administration of the pharmaceutical compositions of the present invention in a dose range between 0.01 mg/Kg - 0.6 mg/Kg of weight.
  • the administration of said pharmaceutical compositions is carried out from one to 30 cycles between one and three times a week and the time between the cycles is between seven days and eight weeks.
  • the object of the present invention is fusion proteins or ICs based on an IL-2 agonist non-alpha mutein (non-alpha mutein), which has at least two orders of reduced binding affinity to the alpha chain of the receptor.
  • non-alpha mutein non-alpha mutein
  • fusion protein refers to a polypeptide that comprises an amino acid sequence of an antibody and an amino acid sequence of a heterologous polypeptide or protein, that is, a polypeptide or protein that is not normally part of the antibody, linked through a peptide linker.
  • immunocytokine refers to an antibody format which is bound to a cytokine. Said cytokine is fused to the antibody by means of a linker at the carboxy terminus of the heavy chain.
  • fusion protein and IC are used interchangeably in the present invention.
  • the mutein that is part of the ICs described in the present invention is affected by at least two orders of magnitude, its binding capacity to the high-affinity receptor constitutively expressed in regulatory T cells, specifically, to the alpha chain.
  • the fusion protein of the present invention exhibits a property that other non-alpha mutein-based ICs do not have: the ability to activate NK and CD8 + T without expanding regulatory T, while recruiting effector functions such as direct lysis, ADCC, and/or or CDC. These muteins will be referred to herein as non-alpha muteins.
  • the IC antibody portion is a human IgG 1 or IgG3 subclass immunoglobulin whose amino acid sequence corresponds to natural or modified allelic variants of IgG1 or IgG3 that have greater than 97% identity with those identified as SEQ ID NO . 11 and SEQ ID NO. 13, respectively, and that bind to Fcy receptors and complement molecules. Therefore, they are compatible with the activities of ADCC and CDC.
  • the constant region of the light chain of the antibodies that form part of the fusion proteins of the present invention is of the human kappa or lambda isotype and their sequences are described in SEQ ID NO. 9 and SEQ ID NO. 10.
  • variable regions of the antibody portion can be mouse, humanized or completely human and come from immunoglobulins with the capacity to make ADCC and CDC.
  • the variable regions of the antibody portion of the ICs of the present invention recognize antigens expressed in human tumors, such as: CD20, CD19, NGcGM3 ganglioside, PDL1, Her ⁇ , Her2 and Epcam.
  • non-alpha muteins described in the present invention are attached to the carboxyl terminus of each antibody heavy chain through a flexible linker peptide (Gly4Ser)nThrGly (SEQ ID NO. 44) or (Gly4Ser)n (SEQ ID NO 45), where n is the number of repeats of the Gly4Ser fragment, and has the ability to preferentially expand effector CD8 + and NK T cells, to the detriment of the expansion of regulatory T cells.
  • Non-alpha muteins can be any of those described in SEQ ID NO. 16-43 previously disclosed in US 9,206,243 B2 and US patent 2019/0315826 A1, or IL-2v, previously disclosed in patent WQ2012107417 (SEQ ID NO.
  • SEQ ID NO. 16-21 generated at the Center for Molecular Immunology, are IL-2 agonists and their binding capacity to the high-affinity receptor constitutively expressed in regulatory T cells is affected in at least two orders.
  • SEQ ID NO. 16-21 generated at the Center for Molecular Immunology, are IL-2 agonists and their binding capacity to the high-affinity receptor constitutively expressed in regulatory T cells is affected in at least two orders.
  • they are able to preferentially expand effector populations of memory and NK CD8 + T cells, have an agonist action on native IL-2, and have a greater antitumor effect than in animal models. (US 9,206,24309).
  • the IL2no-alpha K35E, IL2no-alpha K35Q and IL2no-alpha K35D muteins are variants of the IL2no-alpha obtained with the method described in US patent 9,206,243, which contain a point mutation that favors expression in different host systems and is compatible with the interaction profile of the non-alpha mutein with the different chains of the IL-2 receptor (Rojas, G., et al. (2015) J Mol Recognit. 28(4): 261-268).
  • the IL-2v mutant and its variants (SEQ ID NO.
  • the format of the fusion proteins of the present invention guarantees the maintenance or improvement of the classic effector functions of antibodies (direct lysis, ADCC and CDC), which coincide with the particular immunomodulatory properties of non-alpha muteins, consisting of induction of mayohtaha proliferation of effector cells relative to regulatory T cells.
  • the ICs object of the present invention can be found as an active ingredient, forming part of different appropriate pharmaceutical compositions for the same, and a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • Concentrations of the active ingredient in said pharmaceutical compositions are in the range of 0.5 mg/ml to 20 mg/ml, preferably 1 mg/ml to 10 mg/ml, or lyophilized.
  • compositions of the present invention include, but are not limited to: saline, pH neutral phosphate buffered saline, and the like.
  • Other buffering agents, dispersing agents, and non-toxic inert substances suitable for delivery to a patient may be included in the compositions of the present invention.
  • the compositions may be solutions suitable for administration, and are normally sterile and free of undesirable particles.
  • the novelty of the ICs described in the present invention consists of the convergence in a bifunctional fusion protein based on an IgG 1 or IgG3 immunoglobulin and a non-alpha mutein, with the ability to preferentially expand and activate effector cells such as TCD8 + memory and NK on regulatory T cells, and to maintain or enhance effector functions typical of antibodies, such as direct lysis, ADCC, and CDC.
  • This concurrency has not been described for any of the ICs based on non-alpha muteins described to date.
  • the presence of two non-alpha IL-2 mutein molecules per IC molecule allows for increased immunomodulatory activity. intrinsic of the fusion protein.
  • the Fe region offers the possibility of obtaining it highly purified by affinity chromatography for protein A, among others, which allows it to be administered as a soluble protein by different routes (subcutaneous, intravenous, intradermal, intramuscular, intraperitoneal), while increasing the times half-life of this agent in circulation and with it, the therapeutic effectiveness.
  • the ICs of the present invention will be applied to subjects (said subjects are vertebrates, such as humans), preferably subcutaneously, or intravenously, in a dose range between 0.01 mg/Kg of weight and 0.6 mg/Kg of weight. , which correspond between 0.7 and 42 mg total, respectively.
  • the IC will be administered between one to 30 cycles with a frequency of one to three times per week to the patient.
  • the time between administration cycles will be between seven days and eight weeks.
  • the delivery strategies employed in the present invention for these ICs may also include injection of the product, through gene therapy approaches such as injection of mRNA and transducer particles encoding the same.
  • the systemic immunostimulation capacity supports the possible combination with target therapies in patients with various types of cancer.
  • its combination with other immunomodulators and with classic oncotherapies such as chemotherapy and radiotherapy is possible.
  • this type of biopharmaceutical could be used in the treatment of B-cell lymphoproliferative disorders, such as non-Hodgkin lymphoma (NHL), chronic lymphocytic leukemia (CLL), diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL), Burkitt lymphoma.
  • NHL non-Hodgkin lymphoma
  • CLL chronic lymphocytic leukemia
  • DLBCL diffuse large B-cell lymphoma
  • Burkitt lymphoma Burkitt lymphoma
  • BL Mantle Cell Lymphoma
  • MCL Mantle Cell Lymphoma
  • Follicular Lymphoma Indolent Lymphomas
  • MZL Marginal Zone Lymphoma
  • PL Critical Lymphoplasmacytic Lymphoma
  • B-Cell Lymphoproliferative Syndrome Advanced Stage Solid Tumors, Head and Neck Tumors neck, brain tumors, adult and pediatric gliomas, pancreatic cancer, esophagus, non-small cell lung cancer, and nasopharyngeal tumors.
  • the aforementioned ICs are intended to constitute a therapeutic front that enhances the therapeutic action of antibodies and IL-2, currently used in the treatment of cancer.
  • This effect would be associated with the generation of fusion proteins that can simultaneously have ADCC and CDC activity, important antitumor mechanisms, and preferentially expand cytotoxic and NK T cells, and not regulatory T cells, leading to a more efficient antitumor immune response. , and therefore, to a delay in tumor growth and a greater survival of the patients. treated individuals. Added to this are the lower levels of toxicity guaranteed by the IL-2 muteins used, which increases the probability of success compared to therapies with wild cytokines. All this translates into greater life expectancy and quality of life in treated patients.
  • FIG. 4 Western blot immunoidentification of IC1 and simple controls, with a specific antibody for human IgG under non-reducing (A) and reducing (B) conditions and with a specific antibody for IL-2 under non-reducing conditions (C). ).
  • Figure 5. HPLC size exclusion chromatography analysis of IC1 (A) and rituximab (B) on a TSK gel 3000 column.
  • Figure 7 Western blot immunoidentification of IC7 and simple controls, with a specific antibody for IL-2 under non-reducing conditions.
  • Figure 8 Analysis of IC7 by size exclusion chromatography using HPLC on a TSKgel 3000 column.
  • Figure 9 SDS-PAGE of IC anti-NGcGM3-IL2no-alpha (IC8) under non-reducing (A) and reducing (B) conditions.
  • FIG. 10 Western blot immunoidentification of IC8 and the simple controls, with a specific antibody for IL-2, under non-reducing conditions.
  • Figure 14 Recognition of the CD20 molecule on tumor cells (A) by IC1, (B) ratio of mean fluorescence intensity (MFI) of RTX and IC1 over the MFI of the conjugate.
  • FIG. 16 Induction of apoptosis by IC1
  • A Early apoptosis
  • B Apoptosis (sum of all Annexin V+ cells)
  • C caspase 3 activation in IC1-treated Ramos cells.
  • FIG. 1 Induction of ADCC by IC1 (A). In vitro depletion of B cells (CD19+) from a healthy donor (B) and a patient with Diffuse Large B-Cell Lymphoma (C) due to HF1.
  • Figure 18 Recognition of the ganglioside NGcGM3 by IC8 by (A) ELISA and (B) Flow cytometry.
  • Figure 20 IL-2no-alpha type activity by proliferation assay of the CTLL-2 line of (A) IC1 and (B) IC7 and IC8.
  • Figure 21 Measurement of surface markers of NK cell activation by IC1, (A) CD16, (B) CD69 and (C) CD107a.
  • FIG 22 Antitumor effect of IC7 in the EL4-huCD20+ model (A) comparison with the parental antibody at high doses (B) comparison with the combination of the parental antibody and the IL2no-alpha mutein. (in equimolar amounts).
  • FIG. 23 Antitumor effect of IC1 in the EL4-huCD20+ model (A) comparison with high-dose rituximab, (B) comparison with equimolar amounts of rituximab, (C) long-lasting protective effect of IC1 in surviving animals challenged again with tumor cells and (D) antitumor effect of IC8 with respect to equimolar amounts of antibody and IL2no-alpha mutein in the 3LL-D122 model Figure 24. In vivo immunomodulation by IC1 in C57BI6 mice bearing EL4-hCD20 tumor .
  • A-B Absolute numbers of (A) CD8+ T cells, (B) NK1.1+CD3-, (C-D) proportion of cells (C) FOXP3+CD4+/CD8+, (D) FOXP3+CD4+/NK1 .1 + CD3+ and (E) absolute numbers of FOXP3+CD4+ T cells.
  • Example 1 Design and obtaining of the CIs.
  • IC1, IC2, IC3, IC4, IC5 and IC6 correspond to a format like the one represented in Figure 1 (A-B).
  • IC1 and IC2 are specific for the human CD20 molecule and the sequences of their variable regions are those of rituximab, a leading monoclonal antibody in passive therapy. against B-cell lymphoproliferative disorders (Pierpont, TM, et al. (2016) Front Oncol. 8: 163; Sehn, LH and G. Salles. (2021) N Engl J Med. 384(9): 842-858).
  • the light chain of each of these ICs is formed by a VL variable region (SEQ ID NO. 1) and a human C kappa constant region (SEQ ID NO. 9).
  • the heavy chain is constituted by the VH variable region of sequence SEQ NO.
  • IC3 and IC4 are specific for the ganglioside NGcGM3, which is absent or detected only in small amounts in normal tissues (Varki, A. (2009) Glycoconj J 26(3): 231-245).
  • the sequences of its variable regions are those of the 14F7hT antibody, currently in a clinical trial for the treatment of advanced-stage solid tumors (EC-IICRDEC168.).
  • the light chain of both ICs is formed by a VL variable region (SEQ ID NO. 3) and a human C kappa constant region (SEQ ID NO. 9).
  • the heavy chain is made up of the VH variable region of sequence SEQ ID NO. 4, followed by a human IgG1 constant region (SEQ ID NO.
  • IC5 and IC6 recognize the EGFR receptor and the sequences of their variable regions correspond to those of the antibody nimotuzumab (US 5,891,996 B2), widely used in the therapy of tumors of epithelial origin (Crombet T, et al. (2002 ) Int J Cancer.101 (6):567-75, Ramos-Suzarte M et al. (2012) Cancer BiolTher., 13(8):600-5, Suarez Martinez G and BencomoYanes A. (2014) Biotecnol APL [ Internet] 31 (2):159-167, Crombet T. (2014) Handbook of therapeutic antibodies. 1679-94.).
  • the light chain is formed by a VL variable region (SEQ ID NO.
  • the heavy chain is made up of the VH variable region of sequence SEQ ID NO. 6, followed by a constant region of human IgG 1 (SEQ ID NO. 11) that has a connecting peptide (Gly4Ser) 3 ThrGly (SEQ ID NO. 44) fused to the carboxyl terminus and then, an IL2no-alpha molecule (SEQ ID NO. 21, for IC5; SEQ ID NO. 37 for IC6).
  • IC7 is specific for the human CD20 molecule and the sequences of its variable regions are those of rituximab.
  • the light chain is formed by a VL variable region (SEQ ID NO. 1) and a C kappa mouse constant region (SEQ ID NO. 13).
  • the heavy chain is made up of the VH variable region of sequence SEQ ID NO. 2, followed by a constant region of mouse IgG2a (SEQ ID NO. 15) that has a connecting peptide (Gly4Ser)3ThrGly (SEQ ID NO. 44) fused to the carboxyl terminus and then the IL2no-alpha molecule (SEQ ID NO.21).
  • IC8 is specific for the ganglioside NGcGM3.
  • the sequences of its variable regions are those of the 14F7 antibody (US 6,429,295 B1 ), murine ancestor of 14F7hT.
  • the light chain is made up of a VL variable region (SEQ ID NO. 7) and a C kappa mouse constant region (SEQ ID NO. 13).
  • the heavy chain is made up of the VH variable region of sequence SEQ ID NO. 8., followed by a mouse IgG 1 constant region (SEQ ID NO. 14) fused to the carboxy terminus by a linker peptide (Gly4Ser) 3 ThrGly (SEQ ID NO. 44) and then by an IL2no-alpha molecule (SEQ ID NO. 21).
  • the genes encoding the variable region of the light chain of the rituximab, nimotuzumab or 14F7hT antibodies were cloned into the vector pFUSE (Ckh) containing the human C kappa constant region gene, thus obtained the genes encoding the respective light chains.
  • the gene segment encoding the IL2no-alpha mutein (SEQ ID NO. 21 or SEQ ID NO. 37) fused by its N terminal to the linker peptide (Gly4Ser)3ThrGly ( SEQ ID NO. 44), and EcoRV/Xbal was cloned into the pFUSE vector (lgG1 h) previously modified for the insertion of an EcoRV site.
  • the IC EcoRI/Nhel, the corresponding VH gene previously amplified by PCR, was cloned over the resulting genetic constructs.
  • the IC1 heavy and light chain genes were independently cloned into the pLV-CMV-IRES-Neo vector, to generate the respective transfer vectors with which we proceeded to obtain the lentiviral transducer particles. .
  • CHO-K1 cells were transduced with the previously obtained lentiviral particles for the generation of recombinant stable clones.
  • the IC1 (anti-CD20) fusion protein was detected in the supernatant of transduced CHOK1 cells ( Figure 2A).
  • IC2 anti-CD20 was obtained by transient expression from the plasmid DNA corresponding to the genetic constructs encoding the light and heavy chains in the pFUSE vectors ( Figure 2B).
  • IC3 and IC4 were obtained by transient expression from the plasmid DNA corresponding to the genetic constructs encoding the chains. light and heavy in the pFUSE vectors. HEK293 cells were transiently transfected with these genetic constructs and IC expression was verified 7 days later, using a specific ELISA for the human Fe region (Figure 2C).
  • IC5 and IC6 were obtained by transient expression from plasmid DNA corresponding to the genetic constructs encoding the heavy and light chains in the pFUSE vectors.
  • the genes encoding the variable region of the light chain of the rituximab antibodies, or 14F7, were cloned into the vector pFUSE (Ckh) containing the mouse C kappa constant region gene and thus were constructed the genes encoding the respective light chains.
  • the heavy chain gene was obtained from PCR assembly of the gene segments encoding the VH region of rituximab (SEQ ID NO. 2.), from the CH region of lgG2a mouse (SEQ ID NO.15), of the connecting peptide (Gly 4 Ser) 3 ThrGly (SEQ ID NO. 44) and of the IL2no-alpha molecule (SEQ ID NO. 21).
  • the resulting heavy chain gene and the light chain gene contained in the pFUSE vector were amplified by PCR and independently cloned into the pLV-CMV-IRES-Neo vector.
  • the transfer vectors were generated with which the lentiviral particles used later for the transduction of CHO-K1 cells were made.
  • the IC7 (anti-CD20) fusion protein was detected in the supernatant of transduced CHOK1 cells ( Figure 2E).
  • IC8 anti-NGcGM3
  • the gene segment encoding the IL2no-alpha mutein (SEQ ID NO. 21) fused by its N-terminal to the linker peptide (Gly4Ser) 3 ThrGly was amplified by PCR, and EcoRV/Xbal was cloned. in the vector pFUSE (lgG1 r) previously modified for the insertion of an EcoRV site.
  • the EcoRI/Nhel gene VH14F7 previously amplified by PCR was cloned onto the resulting genetic construct.
  • the heavy chain and light chain genes contained in the pFUSE vectors were amplified by PCR and independently cloned into the pLV-CMV-IRES-Neo vector. In this way, the transfer vectors were generated with which the lentiviral particles used later in the co-transduction of CHO-K1 cells were made. Using an ELISA specific for the mouse Fe region, the fusion protein IC8 (anti-NGcGM3) was detected in the supernatant of transduced CHOK1 cells ( Figure 2E).
  • Example 2 ICs are expressed as intact and functional proteins.
  • Example 3 ICs preserve and enhance in vitro the biological activities corresponding to the antibody portion.
  • Apoptosis on tumor cells is another of the mechanisms proposed to explain the therapeutic action of rituximab in the clinic (Smith, MR (2003) Oncogene. 22(47): 7359-7368; Seyfizadeh, N., et al. (2016). Crit Rev OncolHematoL 97: 275-290).
  • Phosphatidylserine exposure is an event that characterizes early stages of apoptosis (Koopman, G., et al. (1994) Blood. 84(5): 1415-1420). The exposure of this phospholipid in the outer monolayer of the plasma membrane was evaluated in Ramos cells treated with IC1.
  • the phosphatidylserine level was measured by flow cytometry by labeling with Annexin V. The average values ⁇ standard deviation obtained for three samples were represented.
  • Cells in early apoptosis were considered those that presented the AnnexinV+/IP- marking ( Figure 16A), cells in late apoptosis when they are AnnexinV + /IP + , and apoptosis was defined as the sum of the two populations ( Figure 16B).
  • IC1 had a superior effect to rituximab ( Figure 16A-B). Because phosphatidylserine exposure can occur in non-apoplectic events, caspase 3 activation as a marker of late apoptosis was evaluated next.
  • the 17/19 kDa active fragment was determined by flow cytometry with an Alexa Fluor-488 conjugated rabbit antiserum. The average values ⁇ standard deviation obtained for three independent samples of the average percentage of caspase 3 active cells were represented. Incubation of Ramos cells with IC1 at 6nM for 48 h induced activation of this enzyme (Figure 16C). ADCC is another of the mechanisms responsible for the antitumor action of rituximab (Smith, MR (2003) Oncogene. 22(47): 7359-7368; Seyfizadeh, N., et al. (2016) Crit Rev OncolHematol. 97: 275 -290).
  • IC1 The capacity of IC1 to mediate ADCC was determined, for which the activity of the LDH enzyme released by the target cells (Ramos) was measured, as a measure of the damage caused.
  • This experiment was done in a suboptimal scenario for rituximab in terms of effector cell:target cell ratio (10:1), and the use of non-activated effector cells.
  • Peripheral blood mononuclear cells (PMBC) were used as effector cells and Ramos as target cells.
  • PMBC Peripheral blood mononuclear cells
  • IC1 induced a higher percentage of specific lysis with respect to rituximab and the combination of rituximab and IL2no-alpha.
  • the induced cytotoxicity was concentration dependent.
  • IC1 in the induction of ADCC, its ability to eliminate, in vitro, malignant cells (CD19+) from a Non-Hodgkin Lymphoma patient was studied, with PBMC being the source of target cells and effector cells.
  • PBMC being the source of target cells and effector cells.
  • the PBMCs were incubated with the ICs and rituximab (18nM) for 24 hours and the percentage of B cells within the PBMCs was measured by flow cytometry.
  • IC1 and rituximab were able to kill normal B cells from a healthy donor.
  • IC1 significantly reduced the percentages of CD19+ cells within the PBMCs of a diffuse large B-cell lymphoma patient ( Figure 17B). This indicates the possibility of using this IC1 in patients whose resistance to rituximab is related to failure or non-optimal ADCC.
  • Mouse immunocytokine anti-NGcGM3-IL2no-alpha recognized the ganglioside NGcGM3, by ELISA, similarly to the parental antibody 14F7. The specificity of the binding is supported by the non-reactivity of the irrelevant mAb used as isotype control ( Figure 18A).
  • Figure 18A As a complement to the solid phase immunoenzymatic assay, a flow cytometry experiment was carried out. L1210 mouse tumor cells were used, which express high levels of the ganglioside NGcGM3 (Roque-Navarro, L., et al. (2008) Mol Cancer Ther. 7(7): 2033-2041). IC8 was able to bind to the tumor line, as does the 14F7 antibody ( Figure 18B).
  • NK cells Activation of NK cells is a critical step for ADCC and, furthermore, these cells have been shown to be important mediators of the antitumor function of the IL2no-alpha mutein (Carménate, T., et al. (2013) J Immunol. 190 (12): 6230-6238). Twenty hours after setting up the assay, the capacity of IC1 to activate NK cells was determined, at 6.6nM, in the presence of target (Ramos) and effector (PMBSC) cells in a 1:10 ratio.
  • target Ramos
  • PMBSC effector
  • Example 6 ICs have a superior antitumor effect.
  • mice were inoculated intravenously with 2.5x10 5 EL4-huCD20 + cells. and later they were treated intraperitoneally with three injections of 20pg of IC7 (days 1, 4 and 7) or five doses of 200 ug of the parental anti-CD20 lgG2a antibody (days 1, 4, 7, 10 and 13), with demonstrated effect. therapy in previous research (Abes, R., et al.
  • mice Due to cross-reactivity between human antibodies and mouse effector cells, as well as human IL-2 and mouse IL-2 receptors (Arenas-Ramirez, N., et al. (2015) Trendslmmunol. 36 (12): 763-777), we evaluated the efficacy of IC1 in immunocompetent mice.
  • C57BL/6 mice were inoculated intravenously with 5x10 5 EL4-huCD20 + cells and later treated intraperitoneally on days 1, 4 and 7 with 20 pg of IC1 and 150 ug of rituximab, with a proven therapeutic effect in previous studies ( Di Gaetano, N., et al. (2003) J Immunol.
  • C57BL/6 mice were inoculated on day 0 with 2x10 5 cells of 3LL-D122, in a volume of 200 pL subcutaneously. (SC).
  • SC subcutaneously.
  • equimolar amounts of antibody, cytokine, and IC 85 pg for antibodies, 16.6 pg for IL2no-alpha, and 100 pg for IC8 were administered intraperitoneally. Treatments were repeated on days 8 and 10.
  • IC8 was able to reduce tumor volume in treated animals, unlike the control antibody 14F7 ( Figure 23D).
  • ICs preferentially expand NK and CD8 + cells over regulatory T cells.
  • C57BL/6 mice bearing EL4hu-CD20 + tumor and treated with anti-CD20-IL2no-alpha were studied ( IC1), as described in Example 6. 10 days after tumor challenge, the spleen was removed and different cell populations were analyzed by flow cytometry. For IC1, a significant increase in TCD8 + ( Figure 24A) and NK1,1 + ( Figure 24B) cells was observed, which was not verified for treatment with rituximab or PBS.
  • IC1 favored the expansion of effector cells over regulatory T cells, as indicated by the FOXP3+CD4+/TCD8 + and FOXP3 + CD4 + /NK1.1+ ratio (Figure 24C-D). It is noteworthy that not only were effector cells expanded more, but no increase in regulatory T cells was observed ( Figure 24E). This result demonstrates that IC1 achieves immunomodulation in favor of effector cells, to the detriment of regulatory T cells, which could contribute to the superior antitumor effect observed.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

La presente invención se relaciona con el campo de la Biotecnología y la Inmuno- oncología. Se describen proteínas de fusión que comprenden una muteína agonista de interleucina 2 unida a una inmunoglobulina por medio de un enlazador. Estas proteínas de fusión son útiles en el tratamiento del cáncer dadas sus propiedades superiores a otras similares basadas en muteína IL-2 no alfa, al conservar simultáneamente la capacidad de los anticuerpos de hacer ADCC y CDC y, además activar células NK y TCD8+, sin expandir células T reguladoras. La convergencia de estas propiedades resulta en proteínas de fusión con propiedades antitumorales superiores a los anticuerpos parentales, e incluso, a la combinación de estos con la muteína no alfa.

Description

PROTEÍNAS DE FUSIÓN COMPUESTAS POR UN ANTICUERPO Y UNA MUTEINA
NO ALFA DE INTERLEUCINA 2
CAMPO DE LA TÉCNICA
La presente invención se relaciona con el campo de la Biotecnología y la Inmuno- oncología. Particularmente, describe proteínas de fusión compuestas por muteínas no alfa agonistas de la interleucina 2 (IL-2) fusionadas a anticuerpos específicos por antígenos expresados en el tumor y con capacidad de reclutar funciones efectoras.
ANTECEDENTES
Las inmunocitocinas (ICs), son productos biofarmacéuticos formados por una citocina fusionada a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, son atractivas herramientas inmunoterapéuticas para el tratamiento del cáncer, aunque su uso se ha extendido a otras enfermedades.
La IL-2 es un potente activador de los linfocitos T y estimulador de las células NK y su ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo) (Hank y cois. (1990) J Biol Response Mod. 9:5-14). Por esta razón, se ha convertido en una de las citocinas más utilizadas en la obtención de este tipo de proteínas de fusión. De hecho, la mayoría de los progresos clínicos realizados con ICs se ha obtenido con aquellas que fusionan la IL-2 a anticuerpos específicos por antígenos tumorales (Sondel, P. M. y S. D. Gillies. (2012) Antibodies. 1 (2): 149-171 ). A pesar de que estas moléculas han mostrado resultados prometedores en los ensayos clínicos fase II (Albertini, M. R. y cois. (2012) Cancer Immunollmmunother. 61 (12): 2261 -2271 ; Danielli, R., y cois. (2015) Cancer Immunollmmunother. 64(8): 999-1009; Kaufman, L. (2014) Journal of ClinicalOncology. 32(15); Lansigan, F. y cois. (2016) Blood. 128 (22): 620), mantienen efectos adversos similares a los de la IL-2 recombinante, como su perfil de alta toxicidad (Panelli, M. C. y cois. (2004) J Transí Med. 2(1 ): 17; Skrombolas, D. y J. G. Frelinger. (2014) Expert Rev Clinlmmunol. 10(2): 207-217; Klein, C., y cois. (2017) Oncoimmunology. 6(3): e1277306) y la expansión mayoritaria de células T reguladoras, potencialmente capaces de inhibir la capacidad antitumoral (Ahmadzadeh, M. y S. A. Rosenberg. (2006) Blood. 107(6): 2409- 2414; Jensen, H. K., y cois. (2009) Clin Cancer Res. 15(3): 1052-1058; Fournier, P., y cois. (201 1 ) Int J Oncol. 38(6): 1719-1729; Gubbels, J. A., y cois. (201 1 ) Cancer Immunollmmunother. 60(12): 1789-1800; Pretto, F., y cois. (2014) Cancer Immunollmmunother. 63(9): 901 -910; Sim, G. C., y cois. (2014) J Clin Invest. 124(1 ): 99- 110; Lansigan, F. y cois. (2016) Blood. 128 (22):620). A esta limitación se suma una subóptima biodistribución y direccionalización al tumor por la interacción con los receptores IL-2 de alta afinidad (Klein, C., y cols. (2017) Oncoimmunology. 6(3): e1277306; Waldhauer, I., y cols. (2021 ) Mabs. 13(1 ): 1913791 ). Este escenario ha estimulado el desarrollo de ICs basadas en vahantes mutadas de IL-2 (muteínas no alfa) racionalmente diseñadas con capacidad reducida de unión o para no unirse a la cadena alfa del receptor, y con esto estimular subsets específicos de células inmunes, así como reducir toxicidad (Runbeck, E., y cois. (2021 ) Antibodies. (Basel) 10(1 )).
Entre estas ICs se puede distinguir un grupo que abarca aquellas basadas en la muteína IL-2v, caracterizada por la presencia de las mutaciones F42A, Y45A, L72G, lo que determina la no unión a la cadena alfa del receptor. Esto favorece la expansión de células efectoras TCD8+ y NK, y propicia la no expansión preferencial de células T reguladoras. Estas proteínas de fusión tienen un formato de IgG completa ( IgG 1 ), no poseen funciones efectoras clásicas de los anticuerpos como la CDC (citotoxicidad dependiente de complemento) y la ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo), a la vez que son monovalentes o monofuncionales respecto a la citocina. Dentro de este grupo figura la IC cergutuzumab amunaleukin (CEA-IL2v), que consiste en un anticuerpo específico por el antígeno carcinoembhogénico (CEA) fusionado por el C-terminal de una de sus cadenas pesadas a una molécula de la mutante IL-2v (Klein, C., y cois. (2017) Oncoimmunology. 6(3): e1277306). Se incluyen también en este conjunto las ICs Simlukafusp alfa (FAP-IL2v), específica por la proteína a de activación de fibroblastos (Waldhauer, I., y cois. (2021 ) Mabs. 13(1 ): 1913791 ) y la IC anti-PD1 -IL2v (Klein, C., y cois. (2019) Cancer Res. 79(13 Suppl): Abstractnr 1552), que reconoce la molécula de muerte programada 1 (PD-1 ) (Klein, C., y cois. (2019) Cancer Res. 79(13 Suppl): Abstractnr 1552).
Por otra parte, aparece la IC Erb-Sum-IL2, específica por el EGFR (siglas del inglés, epidermal growth factor receptor), la cual contiene una vahante de IL-2 (sum-IL-2) caracterizada por las mutaciones L80F, R81 D, L85V, I86Y, I92F. Este juego de cambios respecto a la citocina salvaje determina una unión reducida y mayor interacción de la muteína con las cadenas alfa y beta del receptor, respectivamente. Esto condiciona la unión favorable a células T CD8+ activadas y no a las células T reguladoras. Se presenta como una proteína de fusión a Fe heterodimérica, que contiene en un brazo un monómero de sum-IL2, y en el otro, un Fab anti-EGFR. Para esta IC monovalente respecto al sitio de unión al antígeno y respecto a la citocina, se ha descrito una expansión preferencial de células T CD8+ respecto a las T reguladoras en el microambiente tumoral, mientras no se ha informado de capacidad de reclutar funciones efectoras clásicas de los anticuerpos como la ADCC y la CDC (Sun, Z., y cois. (2019) Nat Commun. 10(1 ): 3874). Teniendo en cuenta el conjunto de antecedentes anteriormente descritos, los inventores de la presente solicitud generaron un tipo de IC para la terapia del cáncer, cuyo diseño se sustenta en la fusión de una muteína agonista de IL-2 (IL2no-alfa) al extremo carboxilo de las cadenas pesadas de un anticuerpo IgG con capacidad de reclutar funciones efectoras de los anticuerpos, para rendir una molécula bifuncional respecto al sitio de unión al antígeno y a la citocina. Este tipo de molécula tiene sorprendentemente, propiedades superiores a otras similares basadas en muteínas no alfa, al conservar o mejorar simultáneamente la capacidad de los anticuerpos de hacer lisis directa, ADCC y/o CDC y, además activar células NK y T CD8+, sin expandir células T reguladoras. La convergencia de estas propiedades resulta en proteínas de fusión con propiedades antitumorales superiores a los anticuerpos parentales, e incluso, a la combinación de estos con la IL2no-alfa. Finalmente, el formato y composición de las proteínas de fusión relacionadas en la presente invención no interfieren con las actividades biológicas asociadas a la región variable de la porción de anticuerpo. Tal es el caso de la capacidad de inducción de apoptosis o de inducción de citotoxicidad independiente de funciones efectoras.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En una realización la presente invención se relaciona con una proteína de fusión caracterizada porque comprende una muteína agonista de IL-2 (muteína no alfa) unida a una inmunoglobulina del ¡sotipo lgG1 o lgG3 y dicha inmunoglobulina reconoce a los receptores Fe ganma y a las moléculas del complemento. Esta inmunocitocina se caracteriza por ser una molécula bivalente respecto al sitio de unión al antígeno y a la citocina. Dicha muteína y dicha inmunoglobulina se unen a través de un enlazador. Particularmente, la muteína tiene afectada en al menos dos órdenes de magnitud, su capacidad de unión a la cadena alfa del receptor de IL-2 y se une a la inmunoglobulina por el extremo carboxilo de cada cadena pesada de dicha inmunoglobulina. En particular, la muteína no alfa tiene una secuencia que se selecciona del grupo que comprende SEQ ID NO. 16-43.
En una realización particular el enlazador está compuesto por la secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que comprende: (Gly4Ser)nThrGly (SEQ ID NO. 44) y (Gly4Ser)n (SEQ ID NO. 45), donde n es la cantidad de repeticiones del fragmento Gly4Ser y tiene un valor de 1 a 5.
En una realización particular la cadena pesada de la inmunoglobulina pertenece a la subclase lgG1 o lgG3 humana y comprende las secuencias SEQ ID NO. 11 o 12 o tiene más de un 97% de identidad con dichas secuencias 11 o 12.
En una realización particular la cadena ligera de la inmunoglobulina se caracteriza por pertenecer al ¡sotipo kappa humano y tiene una secuencia que se corresponde con la SEQ ID NO. 9. En una realización particular la cadena ligera de la inmunoglobulina se caracteriza por pertenecer al ¡sotipo lambda humano y tiene una secuencia que se corresponde con la SEQ ID NO. 10.
La inmunocitocina de la presente invención adicionalmente se caracteriza por reconocer antígenos tumorales entre los que se encuentran: CD20, CD19, NGcGM3, PDL1 , Herí , Her2 y Epcam.
En una realización adicional la presente invención se relaciona con las composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas de fusión aquí descritas en un rango de concentración de 0.5 mg/ml a 20 mg/ml y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Adicionalmente, la presente invención se relaciona con el uso de las proteínas de fusión divulgadas en la presente invención en el tratamiento del cáncer. En particular con el uso de las moléculas de ácido nucleico, que codifican las proteínas de fusión de la presente invención, para la inyección subcutánea, intramuscular o intratumoral.
En una realización adicional la presente invención se relaciona con un método de tratamiento a un sujeto que lo necesite que comprende la administración por vía subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular o intraperitoneal de las composiciones farmacéuticas de la presente invención en un rango de dosis entre 0.01 mg/Kg - 0.6 mg/Kg de peso. Particularmente, la administración de dichas composiciones farmacéuticas se realiza de uno a 30 ciclos entre una a tres veces por semana y el tiempo entre los ciclos es entre siete días y ocho semanas.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Descripción de las ICs
En una realización son objeto de la presente invención proteínas de fusión o ICs basadas en una muteína no alfa agonista de IL-2 (muteína no alfa), que tiene al menos dos órdenes de reducción de la afinidad de unión a la cadena alfa del receptor (León y cois. (2018) Semin Oncol. 45(1 -2): 95-104), unida a las cadenas pesadas de una inmunoglobulina con capacidad de reclutar funciones efectoras clásicas de los anticuerpos, para rendir una molécula bifuncional respecto al sitio de unión al antígeno y a la citocina.
El término proteína de fusión que se emplea en la presente invención se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo y una secuencia de aminoácidos de un polipéptido o proteína heteróloga, es decir, un polipéptido o proteína que normalmente no es parte del anticuerpo, unidas a través de un péptido enlazador.
El término inmunocitocina (IC) que se emplea en la presente invención se refiere a un formato de anticuerpo el cual está unido a una citocina. Dicha citocina está fusionada al anticuerpo por medio de un enlazador por el extremo carboxilo de la cadena pesada. Los términos proteína de fusión e IC se utilizan intercambiablemente en la presente invención.
La muteína que forma parte de las ICs descritas en la presente invención tiene afectada en al menos dos órdenes de magnitud, su capacidad de unión al receptor de alta afinidad expresado constitutivamente en células T reguladoras, específicamente, a la cadena alfa. La proteína de fusión de la presente invención exhibe una propiedad que no tienen otras ICs basadas muteínas no alfa: la capacidad de activar NK y T CD8+ sin expandir T reguladoras, y a la vez, reclutar funciones efectoras como la lisis directa, ADCC y/o CDC. Estas muteínas se referirán en la presente invención como muteína no alfa.
Particularmente, la porción de anticuerpo de la IC es una inmunoglobulina de subclase IgG 1 o lgG3 humana cuya secuencia aminoacídica se corresponde con variantes alélicas naturales o modificadas de lgG1 o lgG3 que tienen más de un 97% de identidad con las identificadas como SEQ ID NO. 11 y SEQ ID NO. 13, respectivamente, y que se unen a receptores Fcy y a moléculas del complemento. Por lo tanto, son compatibles con las actividades de ADCC y CDC. La región constante de la cadena ligera de los anticuerpos que forman parte de las proteínas de fusión de la presente invención es de ¡sotipo kappa o lambda humanas y sus secuencias se describen en SEQ ID NO. 9 y SEQ ID NO. 10. Por su parte, las regiones variables de la porción de anticuerpo pueden ser de ratón, humanizadas o completamente humanas y provienen de inmunoglobulinas con capacidad de hacer ADCC y CDC. Las regiones variables de la porción de anticuerpo de las ICs de la presente invención reconocen antígenos expresados en tumores humanos, tales como: CD20, CD19, gangliósido NGcGM3, PDL1 , Herí , Her2 y Epcam.
Las muteínas no alfa que se describen en la presente invención, se unen al extremo carboxilo de cada cadena pesada de anticuerpo a través de un péptido conector flexible (Gly4Ser)nThrGly (SEQ ID NO. 44) o (Gly4Ser)n (SEQ ID NO. 45), donde n es la cantidad de repeticiones del fragmento Gly4Ser, y tiene la capacidad de expandir preferencialmente células efectoras T CD8+ y NK, en detrimento de la expansión de células T reguladoras. Las muteínas no alfa pueden ser cualquiera de las descritas en SEQ ID NO. 16-43 previamente divulgadas en US 9,206,243 B2 y la patente US 2019/0315826 A1 , o la IL- 2v, previamente divulgada en la patente WQ2012107417 (SEQ ID NO. 40) y sus variantes descritas en SEQ ID NO 41 -43. Las muteínas descritas en la SEQ ID NO. 16-21 , generadas en el Centro de Inmunología Molecular, son agonistas de IL-2 y presentan afectada en al menos dos órdenes su capacidad de unión al receptor de alta afinidad expresado constitutivamente en células T reguladoras. Como resultado de sus modificaciones respecto a la IL-2 salvaje, son capaces de expandir preferencialmente poblaciones efectoras de células T CD8+ de memoria y NK, tienen acción agonista de la IL-2 nativa y mayor efecto antitumoral que esta en modelos animales. (US 9,206,24309). Las muteínas IL2no-alfa K35E, IL2no-alfa K35Q y IL2no-alfa K35D (SEQ ID NO. 22-39) son variantes de las IL2no-alfa obtenidas con el método descrito en la patente US 9,206,243, que contienen una mutación puntual que favorece la expresión en diferentes sistemas hospederos y es compatible con el perfil de interacción de la muteína no alfa con las diferentes cadenas del receptor de IL-2 (Rojas, G., y cois. (2015) J Mol Recognit. 28(4): 261 -268). La mutante IL-2v y sus vahantes (SEQ ID NO. 40-43) contienen mutaciones respecto a la IL-2 salvaje que impiden la unión a la cadena alfa del receptor, lo que evita la expansión preferencial de células T reguladoras y favorece la expansión de células efectoras TCD8+ y NK (Klein, C., y cois. (2017) Oncoimmunology. 6(3): e1277306).
En resumen, el formato de las proteínas de fusión de la presente invención garantiza el mantenimiento o mejoramiento de las funciones efectoras clásicas de los anticuerpos (lisis directa, ADCC y CDC), que concurren con las propiedades inmunomoduladoras particulares de muteínas no alfa, consistentes en inducción de proliferación mayohtaha de células efectoras respecto a células T reguladoras.
Composiciones farmacéuticas
Las ICs objeto de la presente invención se pueden encontrar como ingrediente activo, formando parte de diferentes composiciones farmacéuticas apropiadas para las mismas, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las concentraciones del ingrediente activo en dichas composiciones farmacéuticas se encuentran en el rango de 0.5 mg/ml a 20 mg/ml, preferiblemente de 1 mg/ml a 10 mg/ml, o liofilizado.
Entre los vehículos farmacéuticamente aceptables se incluyen, pero no se limitan a: solución salina, salina amortiguada con fosfato pH neutro, y otros parecidos. Otros agentes de amortiguación, agentes dispersos, y sustancias inertes no tóxicas apropiadas para entregar a un paciente podrán ser incluidas en las composiciones de la presente invención. Las composiciones podrán ser soluciones apropiadas para la administración, y son normalmente estériles y libres de partículas indeseables.
Aplicación terapéutica y métodos de tratamiento
La novedad de las ICs que se describen en la presente invención consiste en la convergencia en una proteína de fusión bifuncional basada en una inmunoglobulina IgG 1 o lgG3 y una muteína no alfa, de la capacidad de expandir y activar preferencialmente células efectoras como las TCD8+ de memoria y las NK sobre las células T reguladoras, y de mantener o mejorar funciones efectoras típicas de los anticuerpos, como lisis directa, ADCC y CDC. Esta concurrencia no se ha descrito para ninguna de las ICs basadas en muteínas no alfa descritas hasta la fecha. Además, la presencia de dos moléculas de muteína IL-2 no alfa por molécula de IC permite aumentar la actividad inmunomoduladora intrínseca de la proteína de fusión. Esto contribuye adicionalmente a una disminución potencial de la toxicidad por la no interacción con receptores de alta afinidad en células endoteliales. La región Fe brinda la posibilidad de obtenerla altamente purificada por cromatografía de afinidad por proteína A, entre otras, lo cual permite administrarla como proteína soluble por diferentes vías (subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal), a la vez que aumenta los tiempos de vida media de este agente en circulación y con ello, la efectividad terapéutica.
Las ICs de la presente invención se aplicarán a los sujetos (dichos sujetos son vertebrados, tales como los humanos), preferentemente por vía subcutánea, o intravenosa, en un rango de dosis entre 0.01 mg/Kg de peso y 0.6 mg/Kg de peso, que se corresponden entre 0.7 y 42 mg totales, respectivamente. La IC se administrará entre uno a 30 ciclos con una frecuencia de una a tres veces por semana al paciente. El tiempo entre los ciclos de administración estará entre siete días y ocho semanas.
Adicionalmente, las estrategias de administración empleadas en la presente invención para estas ICs pueden incluir también la inyección del producto, mediante enfoques de terapia génica tales como la inyección de ARNm y partículas transductoras codificantes de las mismas.
Dadas las propiedades inmunomoduladoras de estas moléculas, además de la potenciación de la respuesta antitumoral antígeno específica, la capacidad de inmunoestimulación sistémica sustenta la posible combinación con terapias blanco en pacientes con diversos tipos de cáncer. De igual manera, es posible su combinación con otros inmunomoduladores y con oncoterapias clásicas como quimioterapia y radioterapia. En particular, este tipo de biofarmacéutico podría ser utilizado en el tratamiento de desórdenes linfoproliferativos de células B, como el linfoma no Hodgkin (LNH) , la leucemia linfocítica crónica (LLC), el linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), Linfoma Burkitt (BL), linfoma de células de manto (MCL), linfoma folicular, linfomas indolentes, linfoma de zona marginal (MZL), linfoma linfoplasmocítico crítico (PL), síndrome linfoproliferativo de células B, tumores sólidos de estadio avanzado, tumores de cabeza y cuello, tumores cerebrales, gliomas adulto y pediátrico, cáncer de páncreas, esófago, cáncer de pulmón de células no pequeñas y tumores nasofaríngeos.
De este modo, las ICs mencionadas pretenden constituir un frente terapéutico que potencia la acción terapéutica de los anticuerpos y la IL-2, actualmente empleados en el tratamiento del cáncer. Este efecto estaría asociado a la generación de proteínas de fusión que pueden simultáneamente tener actividad de ADCC y CDC, importantes mecanismos antitumorales, y expandir preferencialmente células T citotóxicas y NK, y no células T reguladoras, lo cual conlleva a una respuesta inmune antitumoral más eficiente, y por tanto, a un retardo en el crecimiento tumoral y una mayor supervivencia de los individuos tratados. A esto se suman los menores niveles de toxicidad que garantizan las muteínas de IL-2 empleadas, lo cual aumenta la probabilidad de éxito respecto a las terapias con las citocinas salvajes. Todo esto se traduce en una mayor esperanza y calidad de vida en los pacientes tratados.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Representación de las ICs lgG-IL2no-alfa (A) Esquema (B) Formato
Figura 2. Evaluación de la expresión de las ICs en el sobrenadante de células CHO transducidas (A, E, F) y en células HEK en suspensión transfectadas de manera transitoria (B, C, D).
Figura 3. Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) de la IC anti-CD20-lgG1 h-IL2no-alfa (IC1 ) en condiciones no reductoras (A) y reductoras (B).
Figura 4. Inmunoidentificación mediante Western blot, de la IC1 y los simples controles, con un anticuerpo específico por IgG humanas en condiciones no reductoras (A) y reductoras (B) y con un anticuerpo específico por IL-2 en condiciones no reductoras (C). Figura 5. Análisis por cromatografía de exclusión molecular mediante HPLC de IC1 (A) y el rituximab (B) en una columna TSK gel 3000.
Figura 6. SDS-PAGE de la IC anti-CD20-lgG2a-IL2no-alfa (IC7) en condiciones no reductoras (A) y reductoras (B).
Figura 7. Inmunoidentificación mediante Western blot de la IC7 y los simples controles, con un anticuerpo específico por IL-2 en condiciones no reductoras.
Figura 8. Análisis de IC7 por cromatografía de exclusión molecular mediante HPLC en una columna TSKgel 3000.
Figura 9. SDS-PAGE de la IC anti-NGcGM3-IL2no-alfa (IC8) en condiciones no reductoras (A) y reductoras (B).
Figura 10. Inmunoidentificación mediante Western blot, de IC8 y los simples controles, con un anticuerpo específico por IL-2, en condiciones no reductoras.
Figura 11. Análisis por cromatografía de exclusión molecular mediante HPLC de IC8 (1 ) y 14F7m (2) en una columna TSKgel 3000.
Figura 12. Inmunoidentificación mediante Western blot de IC4 y los simples controles, con un anticuerpo específico por IgG humanas en condiciones no reductoras
Figura 13. Reconocimiento de la línea EL4-huCD20+ (A) por el anticuerpo RTX y la IC1 y (B) por el anticuerpo de ratón RTX-lgG2a y la IC7.
Figura 14. Reconocimiento de la molécula CD20 sobre células tumorales (A) por la IC1 , (B) relación de intensidad media de fluorescencia (IMF) de RTX y la IC1 sobre la IMF del conjugado. Figura 15. Inducción de CDC por la IC1 .
Figura 16. Inducción de apoptosis por la IC1 (A) Apoptosis temprana, (B) Apoptosis (suma de todas las células Anexina V+) y (C) activación de caspasa 3 en las células Ramos tratadas con la IC1 .
Figura 17. Inducción de ADCC por la IC1 (A). Depleción in vitro de células B (CD19+) de donante sano (B) y paciente de Linfoma Difuso de Células B grandes (C) por la IC1 .
Figura 18. Reconocimiento del gangliósido NGcGM3 por la IC8 mediante (A) ELISA y (B) Citometría de flujo.
Figura 19. Inducción de citotoxicidad independiente de complemento por la IC8.
Figura 20. Actividad tipo IL-2no-alfa mediante ensayo de proliferación de la línea CTLL- 2 de (A) IC1 y (B) IC7 e IC8.
Figura 21. Medición de los marcadores de superficie de activación de células NK por la IC1 , (A) CD16, (B) CD69 y (C) CD107a.
Figura 22. Efecto antitumoral de IC7 en el modelo EL4-huCD20+ (A) comparación con el anticuerpo parental a altas dosis (B) comparación con la combinación del anticuerpo parental y la muteina IL2no-alfa. (en cantidades equimolares).
Figura 23. Efecto antitumoral de IC1 en el modelo EL4-huCD20+ (A) comparación con el rituximab a altas dosis, (B) comparación con cantidades equimolares del rituximab, (C) efecto protector de larga duración de la IC1 en animales supervivientes retados nuevamente con células tumorales y (D) efecto antitumoral de la IC8 con respecto a cantidades equimolares del anticuerpo y la muteina IL2no-alfa en el modelo 3LL-D122 Figura 24. Inmunomodulación ¡n vivo por la IC1 en ratones C57BI6 portadores de tumor EL4-hCD20. (A-B) Números absolutos de células (A) T CD8+, (B) NK1.1+CD3-, (C-D) proporción de células (C) FOXP3+CD4+/CD8+, (D) FOXP3+CD4+/NK1 .1 + CD3+ y (E) números absolutos de células T FOXP3+CD4+.
La presente invención queda aún más elaborada con los siguientes ejemplos y dibujos. Sin embargo, estos ejemplos no deberían ser interpretados como una limitación del ámbito de la invención.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Diseño y obtención de las ICs.
Se diseñaron ICs humanas que consisten en moléculas bivalentes en cuanto al sitio de unión al antígeno, bifuncionales respecto a la porción de IL-2 mutada y basadas en un formato de IgG completa. Específicamente, la IC1 , IC2, IC3, IC4, IC5 e IC6 se corresponden con un formato como el que se representa en la Figura 1 (A-B).
La IC1 y la IC2 son específicas por la molécula CD20 humana y las secuencias de sus regiones variables son las del rituximab, anticuerpo monoclonal líder en la terapia pasiva contra desórdenes linfoproliferativos de células B (Pierpont, T. M., y cois. (2018) Front Oncol. 8: 163; Sehn, L. H. y G. Salles. (2021 ) N Engl J Med. 384(9): 842-858). La cadena ligera de cada una de estas ICs está formada por una región variable VL (SEQ ID NO. 1 ) y una región constante humana C kappa (SEQ ID NO. 9). La cadena pesada está constituida por la región variable VH de secuencia SEQ NO. 2, seguida de una región constante de lgG1 humana (SEQ ID NO. 11 ), que tiene fusionado en el carboxi terminal un péptido conector (Gly4Ser)3ThrGly (SEQ ID NO. 44) y a continuación, una molécula IL2no-alfa (SEQ ID NO. 21 para IC1 , y SEQ ID NO. 37 para IC2). No se han descrito hasta la fecha ICs de esta especificidad que contengan vahantes mutadas de IL-2.
La IC3 y la IC4 son específicas por el gangliósido NGcGM3, que está ausente o se detecta solo en pequeñas cantidades en los tejidos normales (Varki, A. (2009) Glycoconj J 26(3): 231 -245). Las secuencias de sus regiones variables son las del anticuerpo 14F7hT, actualmente en ensayo clínico para el tratamiento de tumores sólidos en estadio avanzado (EC-IICRDEC168.). La cadena ligera de ambas ICs está formada por una región variable VL (SEQ ID NO. 3) y una región constante humana C kappa (SEQ ID NO. 9). La cadena pesada está constituida por la región variable VH de secuencia SEQ ID NO. 4, seguida de una región constante de lgG1 humana (SEQ ID NO. 1 1 ) que tiene fusionado en el extremo carboxilo un péptido conector (Gly4Ser)3ThrGly (SEQ ID NO. 44) y a continuación, una molécula IL2no-alfa (SEQ ID NO. 21 para IC3, y SEQ ID NO. 37 para IC4). Hasta la fecha no se ha obtenido ninguna IC basada en este anticuerpo, ni otro específico por el gangliósido NGcGM3.
La IC5 y la IC6 reconocen el receptor EGFR y las secuencias de sus regiones variables se corresponden con las del anticuerpo nimotuzumab (US 5,891 ,996 B2), ampliamente utilizado en la terapia de tumores de origen epitelial (Crombet T, y cois. (2002) Int J Cancer. 101 (6) :567-75; Ramos-Suzarte M y cois. (2012) Cancer BiolTher.; 13(8):600-5; Suarez Martinez G y BencomoYanes A. (2014) Biotecnol APL [Internet]. 31 (2):159-167, Crombet T. (2014) Handbook of therapeutic antibodies. 1679-94.). La cadena ligera está formada por una región variable VL (SEQ ID NO. 5) y una región constante humana C kappa (SEQ ID NO. 9). La cadena pesada está constituida por la región variable VH de secuencia SEQ ID NO. 6, seguida de una región constante de IgG 1 humana (SEQ ID NO. 11 ) que tiene fusionado en el extremo carboxilo un péptido conector (Gly4Ser)3ThrGly (SEQ ID NO. 44) y a continuación, una molécula IL2no-alfa (SEQ ID NO. 21 , para la IC5; SEQ ID NO. 37 para la IC6).
Se diseñaron en paralelo otras dos ICs bivalentes en cuanto al sitio de unión al antígeno, y bifuncionales respecto a la porción de IL-2 mutada, basadas en un formato de IgG completa de ratón (Figura 1 A-B). La IC7 es específica por la molécula CD20 humana y las secuencias de sus regiones variables son las del rituximab. La cadena ligera está formada por una región variable VL (SEQ ID NO. 1 ) y una región constante de ratón C kappa (SEQ ID NO. 13). La cadena pesada está constituida por la región variable VH de secuencia SEQ ID NO. 2, seguida de una región constante de lgG2a de ratón (SEQ ID NO. 15) que tiene fusionado en el extremo carboxilo un péptido conector (Gly4Ser)3ThrGly (SEQ ID NO. 44) y a continuación, la molécula IL2no-alfa (SEQ ID NO. 21 ).
La IC8 es específica por el gangliósido NGcGM3. Las secuencias de sus regiones variables son las del anticuerpo 14F7 (US 6,429,295 B1 ), antecesor múrido del 14F7hT. La cadena ligera está formada por una región variable VL (SEQ ID NO. 7) y una región constante de ratón C kappa (SEQ ID NO. 13). La cadena pesada está constituida por la región variable VH de secuencia SEQ ID NO. 8., seguida de una región constante de IgG 1 de ratón (SEQ ID NO. 14) que tiene fusionado en el carboxi terminal un péptido conector (Gly4Ser)3ThrGly (SEQ ID NO. 44) y a continuación, una molécula IL2no-alfa (SEQ ID NO. 21 ).
Para la obtención de las ICs humanas, los genes codificantes de la región variable de la cadena ligera de los anticuerpos rituximab, nimotuzumab o 14F7hT se clonaron en el vector pFUSE (Ckh) contentivo del gen de la región constante C kappa humana, y así se obtuvieron los genes codificantes de las respectivas cadenas ligeras.
Posteriormente, se amplificó mediante Reacción en cadena de la Polimerasa (RCP) el segmento génico codificante de la muteína IL2no-alfa (SEQ ID NO. 21 o SEQ ID NO. 37) fusionada por su N terminal al péptido enlazador (Gly4Ser)3ThrGly (SEQ ID NO. 44), y se clonó EcoRV/Xbal en el vector pFUSE (lgG1 h) previamente modificado para la inserción de un sitio EcoRV. Según la IC, sobre las construcciones genéticas resultantes se clonó EcoRI/Nhel, el gen VH correspondiente previamente amplificado por RCP.
Los genes de las cadenas ligera y pesada de la IC1 (anti-CD20) se clonaron de manera independiente en el vector pLV-CMV-IRES-Neo, para generar los respectivos vectores de transferencia con los que se procedió a obtener las partículas transductoras lentivirales. Se realizó la transducción de células CHO-K1 con las partículas lentivirales previamente obtenidas para la generación de clones estables recombinantes. Mediante un ELISA específico por la región Fe humana se detectó la proteína de fusión IC1 (anti-CD20) en el sobrenadante de células CHOK1 transducidas (Figura 2A).
La IC2 (anti-CD20) se obtuvo por expresión transitoria a partir del ADN plasmídico correspondiente a las construcciones genéticas codificantes de las cadenas ligera y pesada en los vectores pFUSE (Figura 2B).
La IC3 y la IC4 (anti-NGcGM3) se obtuvieron por expresión transitoria a partir del ADN plasmídico correspondiente a las construcciones genéticas codificantes de las cadenas ligera y pesada en los vectores pFUSE. Con estas construcciones genéticas se transfectaron de manera transiente células HEK293 y se verificó a los 7 días la expresión de la IC, mediante un ELISA específico por la región Fe humana (Figura 2C).
La IC5 y la IC6 (anti-EGFR) se obtuvieron por expresión transitoria a partir del ADN plasmídico correspondiente a las construcciones genéticas codificantes de las cadenas ligera y pesada en los vectores pFUSE. Los sobrenadantes de células HEK293 en suspensión transfectadas con PEI, se evaluaron mediante un ELISA específico por la región Fe humana y se comprobó la presencia de las proteínas de fusión (Figura 2D).
Para la obtención de las ICs de ratón, los genes codificantes de la región variable de la cadena ligera de los anticuerpos rituximab, o 14F7 se clonaron en el vector pFUSE (Ckh) contentivo del gen de la región constante C kappa de ratón y así se construyeron los genes codificantes de las respectivas cadenas ligeras.
En el caso de la IC7 (anti-CD20) se obtuvo el gen de la cadena pesada a partir del ensamblaje por RCP de los segmentos génicos codificantes de la región VH de rituximab (SEQ ID NO. 2.), de la región CH de ratón lgG2a (SEQ ID NO.15), del péptido conector (Gly4Ser)3ThrGly (SEQ ID NO. 44) y de la molécula IL2no-alfa (SEQ ID NO. 21 ). El gen resultante de cadena pesada y el gen de cadena ligera contenido en el vector pFUSE se amplificaron por RCP y se clonaron de manera independiente en el vector pLV-CMV- IRES-Neo. Se generaron así los vectores de transferencia con los que se hicieron las partículas lentivirales usadas posteriormente para la transducción de células CHO-K1. Mediante un ELISA específico por la región Fe de ratón se detectó la proteína de fusión IC7 (anti-CD20) en el sobrenadante de células CHOK1 transducidas (Figura 2E).
Para la IC8 (anti-NGcGM3), se amplificó mediante RCP el segmento génico codificante de la muteína IL2no-alfa (SEQ ID NO. 21 ) fusionada por su N terminal al péptido enlazador (Gly4Ser)3ThrGly, y se clonó EcoRV/Xbal en el vector pFUSE (lgG1 r) previamente modificado para la inserción de un sitio EcoRV. Sobre la construcción genética resultante se clonó EcoRI/Nhel el gen VH14F7 previamente amplificado por RCP. Los genes de cadena pesada y cadena ligera contenidos en los vectores pFUSE, se amplificaron por RCP y se clonaron de manera independiente en el vector pLV-CMV- IRES-Neo. Se generaron así los vectores de transferencia con los que se hicieron las partículas lentivirales usadas posteriormente en la co-transducción de células CHO-K1. Mediante un ELISA específico por la región Fe de ratón se detectó la proteína de fusión IC8 (anti-NGcGM3) en el sobrenadante de células CHOK1 transducidas (Figura 2E).
Ejemplo 2. Las ICs se expresan como proteínas íntegras y funcionales.
A partir de los sobrenadantes del cultivo de los clones CHO-K1 recombinantes se procedió a la purificación de las ICs anti-CD20-IL2no-alfa (lgG1 h) (IC1 ), anti-CD20-IL2 no-alfa (lgG2a ratón) (IC7) y anti NGcGM3-IL2no-alfa (lgG1 r) (IC8). Una vez realizado el paso de captura por proteína A y posterior cromatografía de exclusión molecular a escala preparativa, mediante filtración en gel, se procedió a evaluar la talla e identidad inmunoquímica de cada una de las proteínas purificadas. Se verificó que las ICs se expresaron como una proteína cuya migración electroforética corresponde con la talla teórica aproximada de 180 kDa, para condiciones no reductoras (Figura 3A, Figura 6A y Figura 9A), y en condiciones reductoras se observó la presencia de ambas cadenas de la molécula recombinante, con una migración correspondiente a las tallas teóricas: aproximadamente 65 kDa para la cadena pesada, debido a la presencia de la muteína IL2no-alfa (15kDa), y 25 kDa para la cadena ligera (Figura 3B, Figura 6B y Figura 9B). Al realizar un ensayo de Western blot específico por IgG humanas (Figura 4A-B y Figura 12), se comprobó la identidad de las porciones de anticuerpo y mediante un anticuerpo específico por la IL-2 humana (Figura 4C, Figura 7 y Figura 10), se verificó la presencia de la citocina en la estructura de las ICs. Se analizó el grado de pureza de las proteínas de fusión por una cromatografía de exclusión molecular a escala analítica, mediante HPLC, con una columna TSK3000 (Figura 5A, Figura 8 y Figura 1 1 ). Debido a que tienen un peso molecular mayor respecto a un anticuerpo IgG (150kDa), mostraron un tiempo de retención menor que el de AcMs de referencia (Figura 5A-B, y Figura 11 ). Se observó además un alto porciento de especies monoméricas (>95%), indicativo de su alta pureza (Figura 5A, Figura 8 y Figura 11 ).
Ejemplo 3. Las ICs conservan y mejoran in vitro las actividades biológicas correspondientes a la porción de anticuerpo.
Para determinar si la porción de anticuerpo era activa en la estructura de las ICs anti- CD20 obtenidas, se realizaron experimentos in vitro en cantidades equimolares respecto a la molécula parental o de referencia. El reconocimiento de la molécula CD20 humana por las ICs anti-CD20-IL2no-alfa ( IgG 1 h) (IC1 ) y anti-CD20-IL2no-alfa (lgG2a ratón) (IC7) se determinó mediante citometría de flujo, empleando la línea tumoral murina EL4- huCD20+, que expresa altos niveles de CD20 humano en su membrana (Di Gaetano, N., y cois. (2003) J Immunol. 171 (3): 1581 -1587). Los niveles de reconocimiento de la línea EL4-huCD20+ por la IC1 y el rituximab (control positivo) así como de la IC7 y su anticuerpo parental (Rtx-lgG2a) fueron similares (Figura 13A-B). Los resultados anteriores demuestran la capacidad de ambas ICs de unirse y reconocer a la molécula CD20 humana. El reconocimiento de la línea parental EL4 con los tratamientos fue negativo, lo que avala la especificidad del mareaje observado sobre la línea EL4-huCD20+ de linfoma de ratón (Figura 13A-B). Se evaluaron además, dos líneas celulares humanas de Linforma de Burkitt, que expresan el CD20. Como indican las figuras 14A y B, no se apreciaron diferencias en el patrón de reconocimiento de IC1 en comparación con el rituximab para cada una de estas líneas. La especificidad del mareaje está sustentada por el no reconocimiento de una IC irrelevante y la incapacidad de IC1 de unirse a células Jurkat, linfoma T que no expresa el CD20 (Figura 14A-B).
La activación de la cascada del complemento es uno de los mecanismos propuestos para la actividad terapéutica in v/vo del rituximab (Smith, M. R. (2003) Oncogene. 22(47): 7359- 7368; Seyfizadeh, N., y cois. (2016) Grit Rev Oncol Hematol. 97: 275-290). Por tal motivo, se evaluó por citometría de flujo mediante la incorporación de loduro de Propidio (IP), la capacidad de las IC1 de ejercer CDC sobre la línea tumoral Ramos. Como fuente de complemento se empleó suero AB humano a una dilución final 1 :5. Se representaron los valores promedio ± desviación típica obtenidos para tres muestras independientes del promedio del porcentaje (%) de células IP positivas (Figura 15). La IC1 a 6nM retuvo el efecto citotóxico observado con el rituximab. La IC irrelevante no indujo citotoxicidad a la concentración evaluada (Figura 15). Este resultado evidencia la no afectación de esta actividad para esta molécula, como sí ha ocurrido para otras ICs de similar formato (Gillies, S. D., y cois. (2005) Blood. 105(10): 3972-3978; Gillies, S. D., y cois. (1999) Cancer Res. 59(9): 2159-2166).
La apoptosis sobre células tumorales es otro de los mecanismos propuestos para explicar la acción terapéutica del rituximab en la clínica (Smith, M. R. (2003) Oncogene. 22(47): 7359-7368; Seyfizadeh, N., y cois. (2016) Crit Rev OncolHematoL 97: 275-290). La exposición de fosfatidilserina es un evento que caracteriza etapas tempranas de la apoptosis (Koopman, G., y cois. (1994) Blood. 84(5): 1415-1420). Se evaluó en células Ramos tratadas con la IC1 la exposición de este fosfolípido en la monocapa externa de la membrana plasmática. El nivel de fosfatidilserina se midió mediante citometría de flujo por mareaje con Anexina V. Se representaron los valores promedio ± desviación típica obtenidos para tres muestras. Se consideraron como células en apoptosis temprana aquellas que presentaron el mareaje AnexinaV+/IP-(Figura 16A), células en apoptosis tardía cuando son AnexinaV+/IP+, y se definió como apoptosis, la suma de las dos poblaciones (Figura 16B). Sorprendentemente, la IC1 tuvo un efecto superior al rituximab (Figura 16A-B). Debido a que la exposición de fosfatidilserina puede ocurrir en eventos no apopléticos, se evaluó a continuación la activación de la caspasa 3, como un marcador de apoptosis tardía. El fragmento activo de 17/19 kDa se determinó por citometría de flujo con un antisuero de conejo conjugado a Alexa Fluor-488. Se representaron los valores promedio ± desviación típica obtenidos para tres muestras independientes del promedio del porciento de células caspasa 3 activa. La incubación de las células Ramos con la IC1 a 6nM durante 48 h indujo activación de esta enzima (Figura 16C). La ADCC es otro de los mecanismos responsables de la acción antitumoral del rituximab (Smith, M. R. (2003) Oncogene. 22(47): 7359-7368; Seyfizadeh, N., y cois. (2016) Crit Rev OncolHematol. 97: 275-290). Se determinó la capacidad de la IC1 de mediar ADCC, para lo cual se midió la actividad de la enzima LDH liberada por las células diana (Ramos), como una medida del daño provocado. Este experimento se hizo en un escenario subóptimo para el rituximab en cuanto a la razón células efectoras: células diana (10:1 ), y el uso de células efectoras no activadas. Como células efectoras se usaron células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y como células diana, las Ramos. Como se muestra en la figura 17A, la IC1 indujo mayor porcentaje de lisis específica con respecto al rituximab y la combinación de rituximab e IL2no-alfa. La citotoxicidad inducida fue dependiente de la concentración.
Considerando la superioridad de la IC1 en la inducción de ADCC, se estudió su capacidad de eliminar, in vitro, células malignas (CD19+) de un paciente de Linfoma No Hodgkin, siendo las CMSP la fuente de células diana y células efectoras. En este experimento las CMSP se incubaron con las ICs y el rituximab (18nM) durante 24 horas y el porcentaje de células B dentro de las CMSP se midió por citometría de flujo. Como se muestra en la figura 17B, la IC1 y el rituximab fueron capaces de eliminar células B normales de un donante sano. De manera notable, solo la IC1 redujo significativamente los porcentajes de células CD19+ dentro las CMSP de un paciente de Linfoma difuso de células B grandes (figura 17B). Esto indica la posibilidad de uso de esta IC1 en pacientes cuya resistencia a rituximab esté relacionada con un fallo o no óptima ADCC.
La inmunocitocina de ratón anti-NGcGM3-IL2no-alfa (IC8) reconoció el gangliósido NGcGM3, mediante ELISA, de manera similar al anticuerpo parental 14F7. La especificidad de la unión está avalada por la no reactividad del AcM irrelevante usado como control de ¡sotipo (Figura18A). Como complemento al ensayo inmunoenzimático en fase sólida, se procedió a realizar un experimento de citometría de flujo. Se emplearon las células tumorales de ratón L1210, que expresan altos niveles del gangliósido NGcGM3 (Roque-Navarro, L., y cois. (2008) Mol Cancer Ther. 7(7): 2033-2041 ). La IC8 fue capaz de unirse a la línea tumoral, como lo hace el anticuerpo 14F7 (Figura 18B).
Seguidamente se procedió a evaluar la actividad citotóxica independiente de funciones efectoras en las células L1210, descrita previamente para el 14F7 (Roque-Navarro, L., y cois. (2008) Mol Cancer Ther. 7(7): 2033-2041 ). Para ello se analizó el aumento de la permeabilidad de la membrana al mareaje del ADN nuclear con IP como índice de la muerte celular. Sorprendentemente, el porcentaje de células no viables fue mayor para la IC anti-NeuGcGM3-IL2no-alfa con respecto a las células sin tratamiento y el anticuerpo parental (Figura 19). Ejemplo 4. Las ICs conservan la funcionalidad de la porción IL-2 no alfa.
La actividad biológica in vitro correspondiente a la porción IL2no-alfa de las ICs se evaluó en ensayos de proliferación de la línea celular murina CTLL-2, dependiente de IL-2, que expresa la vahante de alta afinidad del IL-2R (Figura 20A-B). Se emplearon concentraciones de cada molécula que garantizaran cantidades equimolares de muteína. Los valores de concentración que aparecen en la Figura 19, se refieren a la porción IL- 2no alfa, contenida en cada muestra.
La incubación de las células CTLL-2 con la muteína y cada una de las ICs, resultó en la estimulación de su proliferación. En todos los casos, la magnitud de la proliferación presentó un comportamiento dependiente de la concentración. Este resultado demuestra que la porción IL2no-alfa mantiene su funcionalidad en el contexto de la proteína de fusión (Figura 20A-B).
Ejemplo 5. Las ICs promueven la activación de células NK
La activación de células NK es un paso crítico para la ADCC y además, se ha demostrado que estas células son mediadores importantes de la función antitumoral de la muteína IL2no-alfa (Carménate, T., y cois. (2013) J Immunol. 190(12): 6230-6238). A las 20 horas de montado el ensayo, se determinó la capacidad de la IC1 de activar las NK, a 6.6nM, en presencia de células diana (Ramos) y efectoras (CMSP) en una razón 1 :10. En la población de células NK de las muestras tratadas con la IC se observó una mayor disminución de la expresión del marcador de superficie CD16 respecto al rituximab (Figura 21 A), lo cual es indicativo de una mayor activación de este tipo de células a partir de su interacción con la molécula diana a través de un anticuerpo (Bowles, J. A. and G. J. Weiner. (2005) J Immunol Methods. 304(1 -2): 88-99). Igualmente, se verificó el aumento de la expresión de CD69 como muestra de activación de las NK, efecto también observado en presencia del rituximab (Figura 21 B). La expresión del CD107a, marcador de superficie asociado a la desgranulación lisosomal, aumentó tres veces en las células incubadas con la inmunocitocina respecto a los demás tratamientos (Figura 21 C). De conjunto, estos resultados demuestran una mayor activación de las células NK asociada a la actividad ADCC en las células tratadas con la proteína de fusión, respecto al anticuerpo rituximab, lo que puede deberse probablemente a un efecto potenciador aportado por la IL2no-alfa.
Ejemplo 6. Las ICs tienen un efecto antitumoral superior.
Para demostrar el concepto de que la fusión de muteínas no alfa a un anticuerpo puede resultar en un efecto antitumoral superior, se comparó la actividad antitumoral de una versión lgG2a de rituximab y la correspondiente IC basada en IL2no-alfa (IC7). Para ello, ratones C57BL/6 se inocularon por vía intravenosa con 2.5x105 de células EL4-huCD20+ y posteriormente se trataron vía intraperitoneal con tres inyecciones de 20pg de IC7 (días 1 ,4 y 7) o cinco dosis de 200 ug del anticuerpo parental anti-CD20 lgG2a (días 1 , 4, 7,10 y 13), de demostrado efecto terapéutico en investigaciones anteriores (Abes, R., y cois. (2010) Blood. 1 16(6): 926-934; Casadesus, A. V., y cois. (2020) Oncoimmunology. 9(1 ): 1770565.). De manera interesante, el tratamiento con IC7 a bajas dosis (20ug), permitió igual supervivencia que la obtenida en ratones que recibieron altas dosis de la versión lgG2a de rituximab. (Figura 22A). Sin embargo, dosis equimolares de anticuerpo respecto a los 20ug de la IC7 y su combinación con cantidades equimolares de la muteína IL2no- alfa, no tuvieron efecto antitumoral (Figura 22B).
Debido a la reactividad cruzada entre los anticuerpos humanos y las células efectoras de ratón, así como de la IL-2 humana y los receptores de IL-2 de ratón (Arenas-Ramirez, N., y cois. (2015) Trendslmmunol. 36(12): 763-777), evaluamos la eficacia de la IC1 en ratones inmunocompetentes. Ratones C57BL/6 se inocularon por vía intravenosa con 5x105 células EL4-huCD20+ y posteriormente se trataron por vía intraperitoneal los días 1 ,4 y 7 con 20pg de la IC1 y 150 ug de rituximab, de probado efecto terapéutico en estudios anteriores (Di Gaetano, N., y cois. (2003) J Immunol. 171 (3): 1581 -1587) (Figura 23A.). Se observó que una dosis 7,5 veces más baja de IC1 respecto al rituximab, tuvo igual efecto antitumoral que el anticuerpo (Figura 23A). Incluso, el rituximab en cantidades equimolares a la IC1 (20ug) no tuvo efecto antitumoral, a diferencia de la IC (Figura 23B). Además, después de retar a los 65 días con las células tumorales EL4-huCD20+ los ratones supervivientes al tratamiento anterior con IC1 , se comprobó que la IC a bajas dosis mantiene el efecto protector de larga duración descrito para una vahante lgG2a de rituximab a altas dosis (Abes, R., y cois. (2010) Blood. 1 16(6): 926-934) (Figura 23C).
Para la comparación del efecto antitumoral de la anti-NGcGM3-IL2no-alfa (IC8) respecto a los controles, ratones C57BL/6 se inocularon el día 0 con 2x105 células de 3LL-D122, en un volumen de 200 pL por vía subcutánea (SC). Seis días después, y previa comprobación de su prendimiento, se administraron cantidades equimolares de anticuerpo, citocina e IC (85 pg para los anticuerpos, 16.6 pg de IL2no-alfa y 100 pg de IC8), por vía intraperitoneal. Los tratamientos se repitieron los días 8 y 10. La IC8 fue capaz de reducir el volumen tumoral en los animales tratados, a diferencia del anticuerpo de referencia 14F7 (Figura 23D).
Ejemplo 7. Las ICs expanden preferencialmente las células NK y CD8+ sobre las T reguladoras. Con el objetivo de evaluar el efecto de las ICs basadas muteínas no alfa sobre determinadas poblaciones de células inmunes en el escenario tumoral, se estudiaron ratones C57BL/6 portadores de tumor EL4hu-CD20+ y tratados con la anti-CD20-IL2no- alfa (IC1 ), según se describe en el ejemplo 6. A los 10 días del reto tumoral, se extrajo el bazo y se analizaron diferentes poblaciones celulares por citometría de flujo. Para la IC1 , se observó un significativo incremento de células TCD8+ (Figura 24A) y NK1 ,1 + (Figura 24B), que no se verificó para el tratamiento con el rituximab ni el PBS. Vale destacar que la IC1 favoreció la expansión de células efectoras sobre células T reguladoras, según indica la razón FOXP3+CD4+/ TCD8+ y FOXP3+CD4+/ NK1.1 + (Figura 24C-D). Es destacable que no solo se expandieron más las células efectoras, sino que no se observó incremento de células T reguladoras (Figura 24E). Este resultado demuestra que la IC1 logra una inmunomodulación a favor de células efectoras, en detrimento de células T reguladoras, lo que pudiera contribuir al efecto antitumoral superior observado.
De conjunto, los resultados anteriores apuntan a la superioridad terapéutica de una IC basada en muteínas no alfa con el formato previamente descrito, e indican que la unión de anticuerpos anti-CD20 de probado efecto de lisis directa, ADCC y/o CDC a muteínas de IL-2 no alfa, conlleva a la activación de mecanismos moleculares y celulares cualitativa o cuantitativamente diferentes, que provocan una respuesta antitumoral potenciada, de mayor magnitud que la obtenida con los controles de anticuerpo e muteínas no alfa.

Claims

PROTEÍNAS DE FUSIÓN COMPUESTAS POR UN ANTICUERPO Y UNA MUTEINA AGONISTA DE INTERLEUCINA 2 REIVINDICACIONES
1 . Una proteína de fusión caracterizada porque comprende una muteína agonista de interleucina 2 (IL-2) unida a una inmunoglobulina del ¡sotipo lgG1 o lgG3 y dicha inmunoglobulina reconoce a los receptores Fe ganma y a las moléculas del complemento.
2. La proteína de fusión según la reivindicación 1 caracterizada por ser una molécula bivalente respecto al sitio de unión al antígeno y a la citocina.
3. La proteína de fusión según la reivindicación 1 caracterizada porque la muteína tiene afectada en al menos dos órdenes de magnitud, su capacidad de unión a la cadena alfa del receptor de IL-2.
4. La proteína de fusión según la reivindicación 1 caracterizada porque la muteína está unida a la inmunoglobulina por un enlazador.
5. La proteína de fusión según la reivindicación 1 caracterizada porque la muteína se une a las cadenas pesadas de la inmunoglobulina.
6. La proteína de fusión según la reivindicación 5 donde la muteína se une al extremo carboxilo de la inmunoglobulina.
7. La proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 -6 caracterizada porque la muteína de IL-2 tiene una secuencia que se selecciona del grupo que comprende SEQ ID NO 16-43.
8. La proteína de fusión según la reivindicación 4 caracterizada porque el enlazador está compuesto por la secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que comprende: (Gly4Ser)nThrGly (SEQ ID NO. 44) y (Gly4Ser)n (SEQ ID NO. 45), donde n es la cantidad de repeticiones del fragmento Gly4Ser y tiene un valor de 1 a 5.
9. La proteína de fusión según la reivindicación 1 donde los ¡sotipos lgG1 o lgG3 comprenden las secuencias SEQ ID NO. 11 o 12 respectivamente o tienen más de un 97% de identidad con dichas secuencias 11 o 12.
10. La proteína de fusión según la reivindicación 1 donde la cadena ligera de la inmunoglobulina se caracteriza por pertenecer al ¡sotipo kappa humano y tiene una secuencia que se corresponde con la SEQ ID NO. 9.
11 . La proteína de fusión según la reivindicación 1 donde la cadena ligera de la inmunoglobulina se caracteriza por pertenecer al ¡sotipo lambda humano y tiene una secuencia que se corresponde con la SEQ ID NO. 10.
12. La proteína de fusión según la reivindicación 1 caracterizada porque reconoce antígenos tumorales que se seleccionan del grupo que comprende: CD20, CD19, NGcGM3, PDL1 , Herí , Her2 y Epcam.
13. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 -12 en un rango de concentración de 0.5 mg/ml a 20 mg/ml y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
14. Uso de la composición farmacéutica de la reivindicación 13 en el tratamiento del cáncer.
15. Uso de la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 -12 para la inyección subcutánea, intramuscular o intratumoral.
16. Un método de tratamiento a un sujeto que lo necesite que comprende la administración por vía subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, o intraperitoneal de la composición farmacéutica de la reivindicación 13 en un rango de dosis entre 0.01 mg/Kg - 0.6 mg/Kg de peso.
17. El método de tratamiento de la reivindicación 16 donde la administración de la composición farmacéutica se realiza de uno a 30 ciclos entre una a tres veces por semana y el tiempo entre los ciclos es entre siete días y ocho semanas.
PCT/CU2022/050012 2021-12-21 2022-12-09 Proteínas de fusión compuestas por un anticuerpo y una muteina WO2023116951A1 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CU2021-0104 2021-12-21
CU2021000104A CU20210104A7 (es) 2021-12-21 2021-12-21 Proteínas de fusión compuestas por un anticuerpo y una muteína agonista de interleucina 2

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023116951A1 true WO2023116951A1 (es) 2023-06-29

Family

ID=85121950

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CU2022/050012 WO2023116951A1 (es) 2021-12-21 2022-12-09 Proteínas de fusión compuestas por un anticuerpo y una muteina

Country Status (2)

Country Link
CU (1) CU20210104A7 (es)
WO (1) WO2023116951A1 (es)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5891996A (en) 1972-09-17 1999-04-06 Centro De Inmunologia Molecular Humanized and chimeric monoclonal antibodies that recognize epidermal growth factor receptor (EGF-R); diagnostic and therapeutic use
US6429295B1 (en) 1998-02-05 2002-08-06 Centro De Inmunologia Molecular (Cim) Monoclonal antibody which recognizes the oligosaccharide N-glycolylated-galactose-glucose sialic acid in malignant tumors, and composition containing it
WO2012107417A1 (en) 2011-02-10 2012-08-16 Roche Glycart Ag Mutant interleukin-2 polypeptides
US9206243B2 (en) 2010-11-12 2015-12-08 Centro De Immunologia Molecular IL-2 derivative polypeptides
US20190315826A1 (en) 2016-11-15 2019-10-17 Centro De Inmunologia Molecular Method for Increasing the Secretion Levels of Interleukin 2 and Proteins Derived from it

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5891996A (en) 1972-09-17 1999-04-06 Centro De Inmunologia Molecular Humanized and chimeric monoclonal antibodies that recognize epidermal growth factor receptor (EGF-R); diagnostic and therapeutic use
US6429295B1 (en) 1998-02-05 2002-08-06 Centro De Inmunologia Molecular (Cim) Monoclonal antibody which recognizes the oligosaccharide N-glycolylated-galactose-glucose sialic acid in malignant tumors, and composition containing it
US9206243B2 (en) 2010-11-12 2015-12-08 Centro De Immunologia Molecular IL-2 derivative polypeptides
WO2012107417A1 (en) 2011-02-10 2012-08-16 Roche Glycart Ag Mutant interleukin-2 polypeptides
US20190315826A1 (en) 2016-11-15 2019-10-17 Centro De Inmunologia Molecular Method for Increasing the Secretion Levels of Interleukin 2 and Proteins Derived from it

Non-Patent Citations (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. M. TROTTA ET AL: "Prospective Evaluation of Cetuximab-Mediated Antibody-Dependent Cell Cytotoxicity in Metastatic Colorectal Cancer Patients Predicts Treatment Efficacy", CANCER IMMUNOLOGY RESEARCH, vol. 4, no. 4, 1 April 2016 (2016-04-01), US, pages 366 - 374, XP055624971, ISSN: 2326-6066, DOI: 10.1158/2326-6066.CIR-15-0184 *
ABES, R., BLOOD, vol. 116, no. 6, 2010, pages 926 - 934
AHMADZADEH, M.S. A. ROSENBERG, BLOOD, vol. 107, no. 6, 2006, pages 2409 - 2414
ALBERTINI, M. R., CANCER IMMUNOLLMMUNOTHER, vol. 61, no. 12, 2012, pages 2261 - 2271
ARENAS-RAMIREZ, N., TRENDSLMMUNOL, vol. 36, no. 12, 2015, pages 763 - 777
BOWLES, J. A.G. J. WEINER., J IMMUNOL METHODS, vol. 304, no. 1-2, 2005, pages 88 - 99
CARMENATE, T., J IMMUNOL., vol. 190, no. 12, 2013, pages 6230 - 6238
CASADESUS, A. V., ONCOIMMUNOLOGY, vol. 9, no. 1, 2020, pages 1770565
CHEN XI ET AL: "Therapeutic efficacy of an anti-PD-L1 antibody based immunocytokine in a metastatic mouse model of colorectal cancer", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, ELSEVIER, AMSTERDAM NL, vol. 480, no. 2, 5 October 2016 (2016-10-05), pages 160 - 165, XP029784153, ISSN: 0006-291X, DOI: 10.1016/J.BBRC.2016.10.011 *
CHRISTIAN KLEIN ET AL: "Cergutuzumab amunaleukin (CEA-IL2v), a CEA-targeted IL-2 variant-based immunocytokine for combination cancer immunotherapy: Overcoming limitations of aldesleukin and conventional IL-2-based immunocytokines", ONCOIMMUNOLOGY, vol. 6, no. 3, 11 January 2017 (2017-01-11), pages e1277306, XP055489779, DOI: 10.1080/2162402X.2016.1277306 *
CROMBET T, INT J CANCER, vol. 101, no. 6, 2002, pages 567 - 75
CROMBET T: "Handbook of therapeutic antibodies", 2014, pages: 1679 - 94
DANIELLI, R., CANCER IMMUNOLLMMUNOTHER, vol. 64, no. 8, 2015, pages 999 - 1009
DI GAETANO, N., J IMMUNOL, vol. 171, no. 3, 2003, pages 1581 - 1587
DI GAETANO, N., J IMMUNOL., vol. 171, no. 3, 2003, pages 1581 - 1587
FOURNIER, P., INT J ONCOL, vol. 38, no. 6, 2011, pages 1719 - 1729
GILLESSEN SILKE ET AL: "A phase I dose-escalation study of the immunocytokine EMD 521873 (Selectikine) in patients with advanced solid tumours", EUROPEAN JOURNAL OF CANCER, vol. 49, no. 1, 1 January 2013 (2013-01-01), Amsterdam NL, pages 35 - 44, XP093031081, ISSN: 0959-8049, DOI: 10.1016/j.ejca.2012.07.015 *
GILLIES STEPHEN D ET AL: "An anti-CD20-IL-2 immunocytokine is highly efficacious in a SCID mouse model of established human B lymphoma", BLOOD, AMERICAN SOCIETY OF HEMATOLOGY, US, vol. 105, no. 10, 15 May 2005 (2005-05-15), pages 3972 - 3978, XP002468216, ISSN: 0006-4971, DOI: 10.1182/BLOOD-2004-09-3533 *
GILLIES, S. D., BLOOD, vol. 105, no. 10, 2005, pages 3972 - 3978
GILLIES, S. D., CANCER RES, vol. 59, no. 9, 1999, pages 2159 - 2166
GUBBELS, J. A., CANCER IMMUNOLLMMUNOTHER, vol. 60, no. 12, 2011, pages 1789 - 1800
HANK, J BIOL RESPONSE MOD, vol. 9, 1990, pages 5 - 14
JENSEN, H. K., CLIN CANCER RES, vol. 15, no. 3, 2009, pages 1052 - 1058
KAUFMAN, L, JOURNAL OF CLINICALONCOLOGY, vol. 32, no. 15, 2014
KLEIN, C., CANCER RES, vol. 79, 2019
KLEIN, C., ONCOIMMUNOLOGY, vol. 6, no. 3, 2017, pages e1277306
KOOPMAN, G., BLOOD, vol. 84, no. 5, 1994, pages 1415 - 1420
LANSIGAN, F, BLOOD, vol. 128, no. 22, 2016, pages 620
PANELLI, M. C., J TRANSL MED, vol. 2, no. 1, 2004, pages 17
PIERPONT, T. M., FRONT ONCOL, vol. 8, 2018, pages 163
PRETTO, F., CANCER IMMUNOLLMMUNOTHER, vol. 63, no. 9, 2014, pages 901 - 910
RAMOS-SUZARTE M, CANCER BIOLTHER., vol. 13, no. 8, 2012, pages 600 - 5
ROJAS, G., J MOL RECOGNIT, vol. 28, no. 4, 2015, pages 261 - 268
ROQUE-NAVARRO, L., MOL CANCER THER, vol. 7, no. 7, 2008, pages 2033 - 2041
RUNBECK, E., ANTIBODIES. (BASEL, vol. 10, no. 1, 2021
SEHN, L. H.G. SALLES., N ENGL J MED, vol. 384, no. 9, 2021, pages 842 - 858
SEYFIZADEH, N., CRIT REV ONCOL HEMATOL, vol. 97, 2016, pages 275 - 290
SEYFIZADEH, N., CRIT REV ONCOLHEMATOL, vol. 97, 2016, pages 275 - 290
SHIELDS R L ET AL: "High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for FcgammaRI, FcgammaRII, FcgammaRIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the FcgammaR", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, US, vol. 276, no. 9, 2 March 2001 (2001-03-02), pages 6591 - 6604, XP002271092, ISSN: 0021-9258, DOI: 10.1074/JBC.M009483200 *
SIM, G. C., J CLIN INVEST, vol. 124, no. 1, 2014, pages 99 - 110
SKROMBOLAS, DJ. G. FRELINGER, EXPERT REV CLINLMMUNOL, vol. 10, no. 2, 2014, pages 207 - 217
SMITH, M. R., ONCOGENE, vol. 22, no. 47, 2003, pages 7359 - 7368
SONDEL, P. M. Y S. D. GILLIES., ANTIBODIES, vol. 1, no. 2, 2012, pages 149 - 171
SUAREZ MARTINEZ GBENCOMOYANES A, BIOTECNOL APL, vol. 31, no. 2, 2014, pages 159 - 167
SUN ZHICHEN ET AL: "A next-generation tumor-targeting IL-2 preferentially promotes tumor-infiltrating CD8+ T-cell response and effective tumor control", NATURE COMMUNICATIONS, vol. 10, no. 1, 1 December 2019 (2019-12-01), XP055851865, Retrieved from the Internet <URL:https://www.nature.com/articles/s41467-019-11782-w.pdf> [retrieved on 20230313], DOI: 10.1038/s41467-019-11782-w *
SUN, Z., NAT COMMUN, vol. 10, no. 1, 2019, pages 3874
VARKI, A, GLYCOCONJ J, vol. 26, no. 3, 2009, pages 231 - 245
WALDHAUER INJA ET AL: "Simlukafusp alfa (FAP-IL2v) immunocytokine is a versatile combination partner for cancer immunotherapy", MABS, vol. 13, no. 1, 1 January 2021 (2021-01-01), US, pages 1913791, XP055839709, ISSN: 1942-0862, DOI: 10.1080/19420862.2021.1913791 *
WALDHAUER, I., MABS, vol. 13, no. 1, 2021, pages 1913791
YAMANE BRETT H ET AL: "The development of antibody-IL-2 based immunotherapy with hu14.18-IL2 (EMD-273063) in melanoma and neuroblastoma", EXPERT OPINION ON INVESTIGATIONAL DRUGS, vol. 18, no. 7, 24 June 2009 (2009-06-24), UK, pages 991 - 1000, XP093030815, ISSN: 1354-3784, Retrieved from the Internet <URL:https://www.tandfonline.com/doi/pdf/10.1517/13543780903048911> [retrieved on 20230314], DOI: 10.1517/13543780903048911 *

Also Published As

Publication number Publication date
CU20210104A7 (es) 2023-07-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11060097B2 (en) Immunotherapy methods using anti-PD-L1 antibodies in combination with EGFR1 targeted-TGF-beta immunomodulatory fusion proteins
US11845801B2 (en) IL-15 prodrugs and methods of use thereof
ES2752248T3 (es) Heterodímero proteínico y uso del mismo
ES2704411T3 (es) Proteínas de fusión inmunomoduladoras y procedimientos de fabricación de las mismas
JP7133241B2 (ja) Ifnと抗pd-l1抗体の融合タンパク質およびその使用
ES2349781T3 (es) Composiciones polipeptídicas que se enlazan con el cd20.
JP6484634B2 (ja) Il−15ヘテロ二量体タンパク質及びその用途
CN112771072A (zh) Il2激动剂
US20220356221A1 (en) Cytokine prodrugs and dual-prodrugs
TW202033547A (zh) 異二聚體fc融合蛋白
WO2017000913A1 (zh) 用于肿瘤靶向治疗的白细胞介素15融合蛋白
US20200354458A1 (en) Bifunctional Fusion Protein Targeting CD47 and PD-L1
JP2021513570A (ja) サイトカインをコードするrnaを用いた治療
CA3197935A1 (en) Interleukin-2-fc fusion proteins and methods of use
WO2021122866A1 (en) Bifunctional molecules comprising an il-7 variant
CN114901679A (zh) 全新被掩蔽的细胞因子及其应用
WO2022155541A1 (en) Interferon prodrugs and methods of making and using the same
Ongaro et al. A novel format for recombinant antibody-interleukin-2 fusion proteins exhibits superior tumor-targeting properties in vivo
Di Trani et al. Overcoming the limitations of cytokines to improve cancer therapy
CN116848140A (zh) 双功能抗pd1/il-7分子
Penichet et al. Antibody-IL-2 fusion proteins: a novel strategy for immune potentiation
EP4077364A1 (en) Bifunctional molecules comprising an il-7 variant
AT500650B1 (de) Immunogener rekombinanter antikörper
WO2023046156A1 (en) Il-2 variants and fusion proteins thereof
WO2023116951A1 (es) Proteínas de fusión compuestas por un anticuerpo y una muteina

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22850571

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1