WO2023090355A1 - 血管新生材料、骨再生促進材料、血管新生材料の製造方法及び骨再生促進材料の製造方法 - Google Patents

血管新生材料、骨再生促進材料、血管新生材料の製造方法及び骨再生促進材料の製造方法 Download PDF

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WO2023090355A1
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ocp
bone
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angiogenesis
regeneration
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PCT/JP2022/042537
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治 鈴木
瞭 濱井
由香利 塩飽
香織 土屋
慎騎 高山
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国立大学法人東北大学
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    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system

Definitions

  • the present invention relates to an angiogenesis material, a bone regeneration-promoting material using the same, and a method for producing them.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2021-187111 filed in Japan on November 17, 2021, the contents of which are incorporated herein.
  • Bone grafting is usually performed for patients with bone defects associated with bone tumor surgery, cleft lip and palate, and comminuted fractures. Bone grafting is sometimes performed to repair bone defects caused by surgery in areas such as neurosurgery, orthopedics, and dentistry.
  • autologous bone for bone grafting.
  • the use of autologous bones is quantitatively limited, and there are problems such as disorders that remain after the autologous bones are taken out. For this reason, artificial bones that can replace autologous bones are being developed as bones to be used for bone grafting.
  • HA hydroxyapatite
  • ⁇ -TCP ⁇ -tricalcium phosphate
  • Octacalcium phosphate (Ca 8 H 2 (PO 4 ) 6.5H 2 O, hereinafter sometimes referred to as “OCP”), which is a precursor of HA, has many functions superior to HA. It has been known. For example, it is excellent in osteoconductivity, absorption by osteoclasts, and dose-dependent promotion of differentiation of osteoblasts.
  • amorphous calcium phosphate (Ca 3 (PO 4 ) 2.nH 2 O)
  • calcium hydrogen phosphate calcium hydrogen phosphate (calcium hydrogen phosphate anhydride (CaHPO 4 ) or calcium hydrogen phosphate dihydrate (CaHPO 4 .2H 2 O)) is also reported to have properties similar to those of OCP. Therefore, expectations are high for HA precursors such as OCP as artificial aggregates, rather than HA.
  • OCP OCP granules and collagen
  • OCP/Col a composite of OCP granules and collagen
  • OCP/Col promotes the excellent osteoconductivity of OCP, but when used as an artificial bone material, the artificial bone components are absorbed by the surrounding tissue, the artificial bone disappears, and the bone regenerates while replacing it. In the process, the disappearance rate of artificial bone becomes slower than the regeneration rate of bone. This is a property that occurs because the OCP granules are not completely absorbed in vivo. Sufficient replacement of regenerated bone with artificial bone and complete filling of bone defects with new bone is a very important issue in this field.
  • Patent Document 1 by the present inventors discloses a bone regeneration material containing a thermally dehydrated crosslinked coprecipitate of octacalcium phosphate and gelatin. Patent Document 1 also discloses a step of dropping or adding an aqueous solution containing calcium into an aqueous solution containing gelatin and phosphorus to obtain a coprecipitate of octacalcium phosphate and gelatin, and heating the coprecipitate. Disclosed is a method for producing a bone regeneration material including a step of obtaining a thermally dehydrated crosslinked product. By using a coprecipitate of OCP and gelatin (OCP/Gel), this technique has good physical strength and has the same shape as the bone before the defect, and is sufficiently compatible with the new bone. The object is to provide a bone regeneration material that can be used as a substitute.
  • OCP/Gel coprecipitate of OCP and gelatin
  • Non-Patent Document 1 bone regeneration when using a composite of OCP granules mixed with gelatin (OCP/Gel) as a bone regeneration material was verified using rats, and OCP/Gel It is disclosed that it contributes to angiogenesis.
  • Angiogenesis is thought to promote bone regeneration through blood flow in surrounding tissues.
  • OCP/Gel is excellent as a bone regeneration material in terms of physical properties and replacement with new bone, and it has been shown to be suitable for bone regeneration in terms of contributing to angiogenesis.
  • Non-Patent Document 1 if the bone regeneration material has a surface that contributes to angiogenesis, it becomes a material suitable for bone regeneration.
  • the bone regeneration material has a surface that contributes to angiogenesis, it becomes a material suitable for bone regeneration.
  • a material strongly endowed with a function of promoting angiogenesis or a material with a strong combination of functions of promoting angiogenesis and bone regeneration there have been no reports on a material strongly endowed with a function of promoting angiogenesis or a material with a strong combination of functions of promoting angiogenesis and bone regeneration.
  • the present invention has been made in view of the circumstances as described above, and an object of the present invention is to provide an angiogenic material that particularly improves angiogenic potential, has both high angiogenic potential and osteogenic potential, and is particularly effective for bone regeneration, An object of the present invention is to provide a bone regeneration-promoting material, a method for producing an angiogenic material, and a method for producing a bone regeneration-promoting material.
  • An angiogenic material comprising a composite of a metal-octacalcium phosphate-containing material containing octacalcium phosphate and a metal element, and a bioabsorbable polymer.
  • the angiogenesis material wherein the metal element is Cu or Zn.
  • the angiogenesis material wherein the bioabsorbable polymer is gelatin.
  • a bone regeneration-promoting material containing the angiogenesis material.
  • a method for producing an angiogenic material comprising mixing an aqueous solution containing phosphorus, an aqueous solution containing calcium, a solution containing a metal element, and a bioabsorbable polymer to contain octacalcium phosphate and the metal element.
  • a method for producing an angiogenic material comprising obtaining an angiogenic material comprising a composite of a metal-octacalcium phosphate-containing material and the bioabsorbable polymer.
  • the step of obtaining the material containing metal-octacalcium phosphate includes mixing the aqueous solution containing phosphorus, the aqueous calcium solution, and the solution containing the metal element by dropping or adding, and A method for producing an angiogenic material as described above, obtaining an object.
  • the method for producing an angiogenic material, wherein the bioabsorbable polymer is gelatin.
  • a method for producing a bone regeneration-promoting material comprising the step of obtaining the angiogenic material in the method for producing an angiogenic material, and obtaining a bone regeneration-promoting material containing the angiogenic material.
  • an angiogenic material a material for promoting bone regeneration, a method for producing an angiogenic material, and a method for promoting bone regeneration, which are particularly effective for bone regeneration having both high angiogenic ability and osteogenic ability and particularly improved angiogenic ability.
  • a method of manufacturing the material can be provided.
  • FIG. 3 is a graph showing Cu elution behavior from Cu-OCP of this example.
  • FIG. 2 is a graphical representation on another scale for low-Cu-OCP in a test similar to FIG. 1;
  • angiogenesis material the bone regeneration promoting material, and the method for producing them according to the present invention will be described with reference to embodiments.
  • the present invention is not limited to the following embodiments.
  • the angiogenic material of the present embodiment contains a complex containing octacalcium phosphate (OCP) and a metal-octacalcium phosphate containing material (M-OCP) containing a metal element, and a bioabsorbable polymer. do.
  • OCP octacalcium phosphate
  • M-OCP metal-octacalcium phosphate containing material
  • the metal element can be selected as appropriate, but it is preferable to select one that has no or little adverse effect on biological tissues. In particular, it is preferably a metal that can form a divalent metal ion.
  • the metal element is preferably Cu or Zn. Cu or Zn is considered a metallic element involved in angiogenesis. It is particularly preferable that the metal element is Cu. Cu is involved in angiogenesis and is widely known as an essential mineral for living organisms.
  • the composite containing M-OCP and a bioabsorbable polymer contains a metal element that promotes angiogenesis, so that the bone that a conventional composite of OCP such as OCP/Gel and a bioabsorbable polymer has
  • OCP/Gel and a bioabsorbable polymer has The interaction of physical and chemical properties suitable for regeneration and promotion of bone regeneration by angiogenesis in tissues surrounding the regenerated bone produces an effect of particularly promoting bone regeneration.
  • the metal-octacalcium phosphate containing material may be in any form as long as the OCP and a metal element are combined.
  • Metal elements may be present in the form of elements, ions, or compounds containing metal elements or ions.
  • Metal elements or ions may be present by partially substituting for calcium ions (Ca 2+ ) in the crystal structure of OCP.
  • the metal element and the OCP may be chemically bonded, or may form a complex by physically interacting with each other.
  • copper (II) gluconate [HOCH 2 (HCOH) 4 COO] 2 Cu, molecular weight 453.85), copper (II) nitrate (Cu(NO 3 ) 2 ), or copper (II) chloride (CuCl 3 )), copper (II) chloride dihydrate (CuCl 3 .2H 2 O), copper (II) citrate (Cu 2 (C 6 H 4 O 7 )) are used as sources of copper.
  • Copper (II) gluconate is preferred as a source of copper in terms of its effect on organisms and its affinity for OCP.
  • the content ratio of the metal element and OCP varies depending on the conditions for bone regeneration.
  • the content of the metal element is preferably 0.001 to 0.50 wt% relative to the total mass of M-OCP, and can promote angiogenesis and bone regeneration without exhibiting cytotoxicity. It is preferably 0.005 to 0.2 wt%.
  • M-OCP can be produced by the production method described later, or can be produced by any means of adding a metal element to other conventionally known OCP production methods. You can use things.
  • the bioabsorbable polymer of this embodiment is a polymer that can be absorbed by the body.
  • bioabsorbable natural polymers such as gelatin, collagen, alginic acid, hyaluronic acid, chitosan, etc.
  • bioabsorbable synthetic polymers polylactic acid, polylactic acid-glycolic acid copolymer, polycaprolactone, etc.
  • a wide range of bioabsorbable polymers can be selected as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • gelatin as the bioabsorbable synthetic polymer.
  • the gelatin is not particularly limited. It is usually obtained by heat-treating collagen. It may be commercially available gelatin.
  • the collagen is not particularly limited. Examples include collagen derived from porcine and bovine skin, bones, and tendons. Preferred is enzyme-solubilized collagen from which telopeptides have been removed by solubilization with a proteolytic enzyme (eg, pepsin, pronase). Preferred collagen types are, for example, type I and type I+type III. Since collagen is a component derived from a living body, it is highly safe, and enzyme-solubilized collagen is particularly preferred because of its low allergenicity. Commercially available collagen may be used.
  • the angiogenic material is a composite of M-OCP and gelatin (M-OCP/Gel).
  • M-OCP/Gel is a composite in which gelatin, which is denatured collagen, and OCP crystals containing a metal element are in a mixed state, and it is believed that the OCP crystals containing a metal element are uniformly dispersed. .
  • Phosphorus is not particularly limited as long as it is a compound that produces HPO 4 2- and PO 4 3- in an aqueous solution.
  • Such compounds include, for example, phosphates such as sodium hydrogen phosphate, ammonium phosphate, and orthophosphoric acid.
  • Calcium is not particularly limited as long as it is a compound that generates Ca 2+ in an aqueous solution.
  • Such compounds include, for example, calcium acetate, calcium chloride and calcium nitrate.
  • the ratio of phosphorus and calcium is not particularly limited, but the molar ratio is preferably 0.71 to 1.10, more preferably 0.73 to 1.00, of phosphoric acid to 1 part of calcium.
  • the ratio of M-OCP to the bioabsorbable polymer is not particularly limited, but preferably the mass ratio of M-OCP to 1 part of the bioabsorbable polymer is 0.1 to 9, more preferably 0.1. 67-4.
  • the M-OCP is less than 0.1 with respect to the bioabsorbable polymer 1, the bone regeneration ability of the obtained bone regeneration material is inferior, and when it exceeds 9, the shaping property is deteriorated.
  • the bone regeneration material of the present embodiment may contain a thermally dehydrated crosslinked composite of the M-OCP and a bioabsorbable polymer.
  • a thermally dehydrated crosslinked product is a structure in which the bioabsorbable polymers forming the above-mentioned composite are crosslinked by a dehydration condensation reaction. Since the thermally dehydrated crosslinked product has a crosslinked structure, it has high physical strength and is absorbed in vivo at an appropriate rate.
  • the bone regeneration-promoting material of this embodiment contains the aforementioned angiogenic material.
  • the bone regeneration-promoting material may be the above-described angiogenic material added with other components or processed to facilitate its use in bone regeneration.
  • an aqueous solution containing phosphoric acid, an aqueous calcium solution, and a solution containing a metal element are mixed to synthesize a metal-octacalcium phosphate-containing material containing a metal element, and get Also, a bone regeneration material containing a composite obtained by mixing a metal-octacalcium phosphate-containing material containing octacalcium phosphate and a metal element with a bioabsorbable polymer is obtained.
  • the aqueous solution containing phosphorus and the aqueous solution containing calcium preferably have a pH of 4.5 to 7.5.
  • a buffering component may be included in order not to change the pH by mixing an aqueous calcium solution or an aqueous solution containing phosphorus.
  • other components may be contained in the aqueous solution containing phosphorus, the aqueous solution containing calcium, or the other solution.
  • Other components may contain bioabsorbable polymers.
  • a solution containing a metal element is a solution containing the above-mentioned metal element or a compound containing it.
  • the solution containing the metal element may have a pH similar to that of the above aqueous solution containing phosphorus or calcium, may contain a buffer component and the like, and may be added dropwise or added under similar conditions.
  • the aforementioned aqueous solution of copper (II) gluconate is used.
  • the bioabsorbable polymer can be selected from those mentioned above. Gelatin is used in this embodiment.
  • an aqueous solution containing phosphorus, an aqueous solution containing calcium, and a solution containing a metal element are mixed to obtain a metal-octacalcium phosphate-containing material containing octacalcium phosphate and a metal element (M- OCP), and mixing the metal-octacalcium phosphate-containing material and the bioabsorbable polymer to obtain a composite of the metal-octacalcium phosphate-containing material and the bioabsorbable polymer. obtaining an angiogenic material.
  • the step of obtaining the metal-octacalcium phosphate-containing material includes mixing the aqueous solution containing phosphorus, the aqueous solution containing calcium, and the solution containing the metal element, mixing by dropping or adding, It is preferred to obtain an octacalcium acid inclusion.
  • dropping means adding droplets of one solution to the other solution
  • adding means using a hollow tube such as a tube to add one solution to the other solution. means to add
  • Dropping or adding may be performed by dropping or adding another aqueous solution to any one of the aqueous solution containing phosphorus, the aqueous solution containing calcium, and the solution containing the metal element.
  • Other aqueous solutions may be added dropwise or added to, eg, buffer solutions.
  • the dropping or pouring is preferably performed at 50°C to 80°C, more preferably about 60°C to 75°C. If the temperature is lower than 50°C or higher than 80°C, M-OCP is difficult to form.
  • the dropping or adding is preferably performed while stirring the aqueous solution.
  • the M-OCP obtained as granules which will be described later, has a uniform particle size.
  • the rate of dropping or adding is preferably 30-120, more preferably 35-82. If it is less than 30 or more than 120, it is difficult to generate M-OCP.
  • M-OCP precipitates as crystals or aggregates of crystals by the dropping or adding step, and can be recovered from the aqueous solution by filtration, drying, or the like.
  • the particle size of M-OCP may be uniformed (particle size regulation) after adjustment.
  • the particle size of OCP granules obtained by sizing is preferably 10 to 1000 ⁇ m, more preferably 300 to 500 ⁇ m.
  • a filter or the like can be used as means for sizing.
  • the metal-octacalcium phosphate-containing material (M-OCP) is recovered, and then a bioabsorbable polymer is mixed to obtain the metal-octacalcium phosphate-containing material and bioabsorbable. It includes a step of obtaining a bone regeneration material that is a complex with a soluble polymer.
  • the bioabsorbable polymer may be, for example, an aqueous solution. At this time, drying, freeze-drying, or the like may be used for the step of recovering the component of the composite of M-OCP and the bioabsorbable polymer.
  • the M-OCP recovered as crystal aggregates may be pulverized to facilitate formation of a complex with bioabsorbable polymers.
  • the pulverization diameter is preferably nano-sized.
  • the particle size is usually 5 to 1000 nm, preferably 100 to 400 nm. If it exceeds 1000 nm, the bioabsorbability of the bone regeneration material based on the physicochemical solubility of Nano-OCP is reduced.
  • the method of pulverization is not particularly limited, but a method of mechanically pulverizing OCP is preferred.
  • Means for mechanical pulverization are not particularly limited. Examples thereof include means using a hard tissue crusher (bead shocker), ball mill, and disintegrator.
  • the phosphorus-containing aqueous solution and the calcium-containing aqueous solution, both or the other of which contain a bioabsorbable polymer, and the solution containing the metal element are mixed, mixed by dropping or adding, and the metal- A mixture of the octacalcium phosphate-containing material and the bioabsorbable polymer may be obtained, and the composite of M-OCP and the bioabsorbable polymer may be directly recovered by drying, freeze-drying, or the like.
  • the production method of the present embodiment includes thermal dehydration cross-linking in which the bioabsorbable polymer in the composite is cross-linked by thermal dehydration condensation, chemical cross-linking in which covalent bonds are cross-linked by a chemical reaction, electron beam or radiation irradiation.
  • the cross-linking may include a step of obtaining a cross-linked product.
  • a thermally dehydrated crosslinked product is obtained by heating M-OCP/Gel. This heat treatment is carried out at a temperature of 50° C. to 200° C., preferably 100° C. to 150° C., for 3 hours to 240 hours, preferably 24 hours to 100 hours.
  • a thermally dehydrated crosslinked product is preferably obtained by heating a composite of M-OCP and a bioabsorbable polymer under reduced pressure.
  • the reduced pressure condition is not particularly limited, but is, for example, 200 Pa or less, preferably 133 Pa or less.
  • the thermally dehydrated crosslinked product is more preferably obtained by drying the composite of M-OCP and the bioabsorbable polymer and then heating it under reduced pressure.
  • the drying method is not particularly limited, but includes, for example, a freeze-drying method and a natural drying method (air drying). Before drying, the M-OCP/bioabsorbable polymer complex may be allowed to stand, and then the supernatant may be removed to appropriately reduce the water content, thereby making the drying process more efficient.
  • the angiogenic material of the present invention may contain components generally contained in bone regeneration materials within a range in which the effects of the present invention are not impaired.
  • Such components include, for example, those used as the composite or other bioabsorbable natural polymers (gelatin, collagen, alginic acid, hyaluronic acid, chitosan, etc.), bioabsorbable synthetic polymers (polylactic acid, poly lactic acid-glycolic acid copolymer, polycaprolactone, etc.), bioabsorbable calcium phosphate ( ⁇ -TCP ceramics, etc.), bionon-absorbable materials (HA ceramics, etc.).
  • a method for producing a bone regeneration-promoting material of the present embodiment includes a step of obtaining the above-described angiogenic material, and obtains a bone regeneration-promoting material containing the angiogenic material.
  • the method for producing the bone regeneration-promoting material may be the above-mentioned angiogenic material as it is as a bone regeneration-promoting material, or may include a step of adding other ingredients as appropriate so that it is easy to use for bone regeneration, or may be formed. It may include a step of performing processing such as.
  • the bone regeneration-promoting material of the present invention is appropriately molded according to the shape of the bone defect, and is implanted into the bone defect after sterilization by electron beam irradiation, high-pressure steam sterilization, or the like.
  • autoclave sterilization affects the crystalline phase of OCP, so in that case, the application site of the bone defect should be considered.
  • the concentration and amount of the copper (II) gluconate aqueous solution is such that the Cu content in the synthesized Cu-OCP granules is about 0.014 wt% relative to the total mass of the Cu-OCP, as the amount of Cu element charged.
  • the granules synthesized in Example 1 were low-Cu-OCP.
  • an aqueous solution containing 3% (w/v) of gelatin manufactured by Sigma, Type A Gelatin (derived from pig skin) was prepared as a bioabsorbable polymer.
  • a precipitate of Cu-OCP was added to the aqueous gelatin solution so that the content of Cu-OCP was 44 wt % in the total mass of Cu-OCP/Gel.
  • the precipitate suspension was transferred to a polypropylene container and mixed at 4°C to gel the gelatin, then frozen to -20°C and lyophilized to obtain a complex of M-OCP and gelatin (Cu -OCP/Gel) was obtained.
  • Cu-OCP/Gel was formed into a disk shape with a diameter of 9 mm and a thickness of 1 mm, and heated in vacuum at 150° C. for 24 hours to crosslink the gelatin. This material was used as an angiogenic material for testing of angiogenesis and bone regeneration.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, except that copper (II) gluconate was added as the amount of Cu element charged so that the Cu content in the synthesized M-OCP granules was about 0.13 wt%. Cu-OCP was prepared. The granules synthesized in Example 2 were high-Cu-OCP.
  • Example 2 A copper-containing gelatin (Cu/Gel) was prepared in the same manner as in Example 1, except that copper (II) gluconate was added instead of Cu-OCP or OCP. Copper (II) gluconate was added so that the copper content of Cu/Gel was the same as that of low-Cu-OCP/Gel.
  • Cu content of Cu-OCP During the preparation of Examples 1 and 2, 20 mg of each Cu-OCP was dissolved in 20 mL of 0.1 M HNO 3 and an inductively coupled plasma-atomic emission spectrometer (ICP-AES) was used to determine the amount of Cu in the sample. Content was measured. Table 1 shows the results. It was confirmed that the Cu-OCP contained an amount corresponding to the amount of Cu charged as a target in Examples 1 and 2, respectively.
  • ICP-AES inductively coupled plasma-atomic emission spectrometer
  • Table 2 shows the comparison results of the average values of cross-linking points.
  • the average value of cross-linking points in the luminal structure formed by human umbilical vein endothelial cells increased in OCP (Comparative Example 1) and low-Cu-OCP (Example 1) than in Control.
  • the cross-linking points of the luminal structure were particularly increased in low-Cu-OCP (Example 1) compared to OCP (Comparative Example 1) or high-Cu-OCP (Example 2).
  • the amount of Cu in Cu-OCP is particularly excellent when it is equivalent to low-Cu-OCP, and the content of Cu element is, for example, 0.005 to 0.1 with respect to the total mass of Cu-OCP. was considered to be particularly effective.
  • Table 3 shows the volumes of new blood vessels obtained with the contrast medium.
  • Low-Cu-OCP/Gel Example 1
  • OCP/Gel Comparative Example 1
  • Cu/Gel Comparative Example 2
  • the volume was large.
  • low-Cu-OCP/Gel showed a further increase in the volume of new blood vessels after 4 weeks than after 2 weeks.
  • Table 4 shows the volume of mineralized matter, that is, the volume of newly formed bone.
  • Cu—OCP/Gel (Example 1) had a higher volume and more lime after 4 weeks than after 2 weeks than OCP/Gel (Comparative Example 1) or Cu/Gel (Comparative Example 2). An increase in compound volume was observed.
  • FIG. 1 shows the concentration of Cu contained in the supernatant for each elution time (incubation time). Concentrations of low-Cu-OCP and high-Cu-OCP synthesized in the same manner as in Example 2 are shown on a scale of 0 to 8.0 ⁇ M. FIG. 2 shows the concentrations of low-Cu-OCP measured in the same manner as in FIG. 1 on a scale of 0 to 1.0 ⁇ M.
  • the Cu concentration continued to increase until at least the elution time of 168 hours. It was shown that Cu-OCP is a material from which Cu can be eluted regardless of the Cu content. In addition, since the low-Cu-OCP has a lower Cu concentration than the high-Cu-OCP at each elution time, a small amount of Cu continues to be eluted from the low-Cu-OCP granules for a long time. , low-Cu-OCP was shown to be less likely to induce cytotoxicity and promote angiogenesis. In addition, when the material of the present embodiment is used for bone regeneration, bone regeneration takes place over a long period of time. Therefore, the effect of promoting angiogenesis in bone regeneration due to interaction with the angiogenic action of the present embodiment. Continuing for a long time is considered effective.
  • the bone regeneration-promoting material using the same, and the production method thereof an angiogenic material with particularly improved angiogenic potential can be obtained.
  • this angiogenic material for bone regeneration or as a bone regeneration-promoting material it is possible to provide a bone regeneration-promoting material that has both high angiogenic and osteogenic abilities and is particularly effective for bone regeneration, and a method for producing the same.
  • it can be expected to be applied not only to bone regeneration but also to regeneration of various tissues that require angiogenesis.

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Abstract

血管新生能を特に向上させ、高い血管新生能と骨新生能を併せ持ち骨再生に特に有効であり、骨再生に限定せず、血管新生が求められる様々な組織再生への応用が期待できる、血管新生材料、骨再生促進材料、血管新生材料の製造方法及び骨再生促進材料の製造方法を提供する。リン酸八カルシウムと金属元素とを含む金属－リン酸八カルシウム含有物と、生体吸収性高分子と、の複合体を含む血管新生材料、それを用いた骨再生促進材料及びそれらの製造方法である。

Description

血管新生材料、骨再生促進材料、血管新生材料の製造方法及び骨再生促進材料の製造方法
　本発明は、血管新生材料、それを用いた骨再生促進材料及びそれら製造方法に関する。
　本願は、２０２１年１１月１７日に日本に出願された特願２０２１－１８７１１１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　骨腫瘍の手術、唇顎口蓋裂、粉砕骨折などに伴う骨欠損を有する患者に対しては、通常、骨移植が行われる。骨移植は、脳外科、整形外科、歯科などの領域における手術に伴って生じる骨欠損を修復するために行われる場合もある。
　骨移植には、自家骨を用いることが好ましい。しかし、自家骨を用いるには量的な制限があり、自家骨を取り出した後に残る障害などの問題もある。このため、骨移植に用いる骨として、自家骨に代わり得る人工骨の開発が行われている。
　人工骨材としては、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２：以下、「ＨＡ」と記載する場合がある）セラミックス、β－リン酸三カルシウム（β－ＴＣＰ）セラミックスなどが提案されている。
　ＨＡの前駆体であるリン酸八カルシウム（Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ：以下、「ＯＣＰ」と記載する場合がある）は、ＨＡよりも優れた多くの機能を有することが知られている。例えば、骨伝導能、破骨細胞による吸収性、用量依存的な骨芽細胞の分化促進に優れている。また、ＨＡの前駆体である非晶質リン酸カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２・ｎＨ２Ｏ）やリン酸水素カルシウム（リン酸水素カルシウム無水物（ＣａＨＰＯ４）あるいはリン酸水素カルシウム二水和物（ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ））についてもＯＣＰと同様の性質を有することが報告されている。したがって、人工骨材としては、ＨＡよりはむしろ、ＯＣＰなどのＨＡ前駆体に対する期待が大きい。
　しかし、ＯＣＰは人工骨材として用いるには非常に脆く、また賦形性が低い。ＯＣＰの賦形性の低さを補う観点から、ＯＣＰと高分子材料との複合体が検討されている。例えば、ＯＣＰの顆粒とコラーゲンとの複合体（以下、「ＯＣＰ／Ｃｏｌ」と記載する場合がある）が知られている。ＯＣＰ／Ｃｏｌは、ＯＣＰの優れた骨伝導能を促進するが、人工骨材として用いた場合、人工骨成分が周辺の組織に吸収されて人工骨が消失し、これに置き換わりながら骨が再生する過程において、人工骨の消失速度が骨の再生速度よりも遅くなる。これは、生体内でＯＣＰの顆粒が完全には吸収されにくいために生じる性質である。再生骨が人工骨と十分に置換し、骨の欠損が完全に新生骨で満たされることは、この分野で求められているきわめて重要な課題である。
　本発明者らによる特許文献１では、リン酸八カルシウムとゼラチンとの共沈物の熱脱水架橋体を含む骨再生材料を開示している。特許文献１はまた、ゼラチンおよびリンを含む水溶液に、カルシウムを含む水溶液を滴下または注加して、リン酸八カルシウムとゼラチンとの共沈物を得る工程、および該共沈物を加熱して熱脱水架橋体を得る工程を含む骨再生材料の製造方法を開示している。この技術は、ＯＣＰとゼラチンの共沈物（ＯＣＰ／Ｇｅｌ）を用いることで、良好な物理的強度を有し、かつ欠損する前の骨の形状と同じ形状を有し、新生骨と十分に置換し得る骨再生材料を提供しようとするものである。
　また、本発明者らによる非特許文献１では、ＯＣＰ顆粒をゼラチンに混合した複合体（ＯＣＰ／Ｇｅｌ）を骨再生材料として用いた際の骨再生についてラットを用いて検証し、ＯＣＰ／Ｇｅｌが血管新生に寄与することを開示している。血管新生は、周辺組織の血流により骨再生を促進させると考えられる。ＯＣＰ／Ｇｅｌは上述のように物理的性質や新生骨との置換において、骨再生材料として優れているが、血管新生に寄与する面でも骨再生に適することが示されている。
特開２０１１－２３４７９９号公報
Ｓｕｚｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｃｔａ　Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ，　８８　（２０１９），　５１４－５２６
　一般に骨再生において、血管新生が促進されると、骨の生成や新生骨との置換も促進される。また、非特許文献１が示すように、骨再生材料が血管新生に寄与する面を有していると、骨再生に適する材料となる。しかしながら、さらに血管新生を促進する機能を強く付与された材料や、血管新生と骨再生促進の機能を強くあわせもつ骨再生促進材料については報告されていない。
　本発明は上記のような事情を鑑みてなされたものであり、その目的は、血管新生能を特に向上させ、高い血管新生能と骨新生能を併せ持ち骨再生に特に有効な、血管新生材料、骨再生促進材料、血管新生材料の製造方法及び骨再生促進材料の製造方法を提供することにある。
　上記課題を解決するため、本発明は以下の態様を有する。
［１］　リン酸八カルシウムと金属元素とを含む金属－リン酸八カルシウム含有物と、生体吸収性高分子と、の複合体を含む血管新生材料。
［２］　前記金属元素がＣｕ又はＺｎである、前記の血管新生材料。
［３］　前記生体吸収性高分子がゼラチンである、前記の血管新生材料。
［４］　前記の血管新生材料を含む、骨再生促進材料。
［５］　血管新生材料の製造方法であって、リンを含む水溶液、カルシウムを含む水溶液、金属元素を含む溶液、及び生体吸収性高分子を混合して、リン酸八カルシウムと金属元素とを含む金属－リン酸八カルシウム含有物と、前記生体吸収性高分子と、の複合体を含む血管新生材料を得る、血管新生材料の製造方法。
［６］　リンを含む水溶液、カルシウムを含む水溶液、及び金属元素を含む溶液を混合して、リン酸八カルシウムと金属元素とを含む金属－リン酸八カルシウム含有物を得る工程と、前記金属－リン酸八カルシウム含有物と生体吸収性高分子とを混合して、前記金属－リン酸八カルシウム含有物と生体吸収性高分子との複合体である血管新生材料を得る工程と、を含む、前記の血管新生材料の製造方法。
［７］　前記金属－リン酸八カルシウム含有物を得る工程は、前記リンを含む水溶液、前記カルシウム水溶液、及び前記金属元素を含む溶液を滴下または注加によって混合し、金属－リン酸八カルシウム含有物を得る、前記の血管新生材料の製造方法。
［８］　前記金属元素がＣｕ又はＺｎである、前記の血管新生材料の製造方法。
［９］　前記生体吸収性高分子がゼラチンである、前記の血管新生材料の製造方法。
［１０］　前記の血管新生材料の製造方法における、前記血管新生材料を得る工程を含み、前記血管新生材料を含む骨再生促進材料を得る、骨再生促進材料の製造方法。
　本発明によれば、血管新生能を特に向上させ、高い血管新生能と骨新生能を併せ持ち骨再生に特に有効な、血管新生材料、骨再生促進材料、血管新生材料の製造方法及び骨再生促進材料の製造方法を提供することができる。
本実施例のＣｕ－ＯＣＰからのＣｕ溶出挙動を示すグラフ図である。 図１と同様の試験のｌｏｗ－Ｃｕ－ＯＣＰに関する別スケールのグラフ図である。
　以下、本発明に係る血管新生材料、骨再生促進材料及びそれら製造方法について、実施形態を示して説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　（血管新生材料）
　本実施形態の血管新生材料は、リン酸八カルシウム（ＯＣＰ）と金属元素とを含む金属－リン酸八カルシウム含有物（Ｍ－ＯＣＰ）と、生体吸収性高分子と、を含む複合体を含有する。
　金属元素は、適宜選択できるが、特に生物組織に悪い影響の無い又は少ないものを選択することが好ましい。特に、２価の金属イオンを構成できる金属であることが好ましい。金属元素は、Ｃｕ又はＺｎであることが好ましい。Ｃｕ又はＺｎは血管新生に関与する金属元素と考えられている。金属元素は、Ｃｕであることが特に好ましい。Ｃｕは血管新生に関与し、生物に必須のミネラルとして広く知られている。
　Ｍ－ＯＣＰと生体吸収性高分子とを含む複合体は、血管新生を促進する金属元素を含んでいることで、従来のＯＣＰ／Ｇｅｌ等のＯＣＰと生体吸収性高分子の複合体が有する骨再生に適した物理的及び化学的性質と、再生する骨の周辺の組織における血管新生による骨再生の促進の相互作用により、骨の再生が特に促進される効果を奏する。
　金属－リン酸八カルシウム含有物（Ｍ－ＯＣＰ）は、ＯＣＰと金属元素が複合しているものであれば、どのような形態であってもよい。金属元素は、元素、イオン、又は金属元素やイオンを含む化合物の形で存在していてもよい。金属元素またはイオンは、ＯＣＰの結晶構造中のカルシウムイオン（Ｃa２＋）と部分的に置換して存在していても良い。金属元素とＯＣＰは、例えば化学的に結合していても、物理的に相互作用することにより複合体を形成していてもよい。
　本実施形態では、グルコン酸銅（ＩＩ）（［ＨＯＣＨ２（ＨＣＯＨ）４ＣＯＯ］２Ｃｕ、分子量４５３．８５）、硝酸銅（ＩＩ）（Ｃｕ(ＮＯ３)２）、又は塩化銅（ＩＩ）（ＣｕＣｌ３)）、塩化銅（ＩＩ）二水和物（ＣｕＣｌ３・２Ｈ２Ｏ）、クエン酸銅（ＩＩ）（Ｃｕ２(Ｃ６Ｈ４Ｏ７)）を銅の供給源として用いる。生物に対する影響やＯＣＰに対する親和性の点から、グルコン酸銅（ＩＩ）が銅の供給源として好ましい。
　Ｍ－ＯＣＰにおいて、金属元素とＯＣＰの含有量の比率は、骨再生を行う条件によって適宜変わってくるが、目安として、例えば後述する製造方法でゼラチンと複合体を形成する前のＭ－ＯＣＰの固体物において、Ｍ－ＯＣＰの全体質量に対して、金属元素の含有量が０．００１～０．５０ｗｔ％であることが好ましく、特に細胞毒性を示さず血管新生及び骨再生を促進し得る、０．００５～０．２ｗｔ％であることが好ましい。
　Ｍ－ＯＣＰは、後述する製造方法によって製造されてなるものを用いることができる他、従来知られた他のＯＣＰの製造法に、金属元素を含有させるいずれかの手段を用いて製造されてなるものを用いても良い。
　本実施形態の生体吸収性高分子は、生体に吸収され得る高分子である。例えば生体吸収性天然高分子（ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キトサンなど）又は、生体吸収性合成高分子（ポリ乳酸、ポリ乳酸－グリコール酸共重合体、ポリカプロラクトンなど）を広く用いることができる。生体吸収性高分子は、本発明の効果が阻害されない範囲内で広く選択することができる。
　本実施形態では、生体吸収性合成高分子として特にゼラチンを用いることが好ましい。
　ゼラチンとしては、特に限定されない。通常、コラーゲンを熱処理して得られる。市販のゼラチンであってもよい。
　コラーゲンとしては、特に限定されない。例えば、豚、牛の皮膚、骨、腱に由来するコラーゲンが挙げられる。好ましくは、蛋白分解酵素（例えば、ペプシン、プロナーゼ）により可溶化され、テロペプチドが除去された酵素可溶化コラーゲンである。コラーゲンのタイプとしては、例えば、タイプＩ、タイプＩ＋タイプＩＩＩが好ましい。コラーゲンは生体由来成分であるので、安全性が高く、特に酵素可溶化コラーゲンがアレルゲン性も低く好ましい。市販のコラーゲンであってもよい。
　本実施形態では、前記ゼラチンを用いた場合、血管新生材料はＭ－ＯＣＰとゼラチンとの複合体（Ｍ－ＯＣＰ／Ｇｅｌ）となっている。前記のＭ－ＯＣＰ／Ｇｅｌは、変性コラーゲンであるゼラチンと、金属元素を含むＯＣＰの結晶が混合状態にある複合体であり、金属元素を含むＯＣＰの結晶が均一に分散していると考えられる。
　リンとしては、水溶液中でＨＰＯ４ ２－、ＰＯ４ ３－、を生じる化合物であれば、特に限定されない。このような化合物としては、例えば、リン酸水素ナトリウム、リン酸アンモニウムなどのリン酸塩および正リン酸が挙げられる。
　カルシウムとしては、水溶液中でＣａ２＋を生じる化合物であれば、特に限定されない。このような化合物としては、例えば、酢酸カルシウム、塩化カルシウムおよび硝酸カルシウムが挙げられる。
　リンとカルシウムとの割合は、特に限定されないが、好ましくは、モル比で、カルシウム１に対してリン酸が０．７１～１．１０、より好ましくは０．７３～１．００である。
　Ｍ－ＯＣＰと生体吸収性高分子との割合は、特に限定されないが、好ましくは、質量比で、生体吸収性高分子１に対してＭ－ＯＣＰが０．１～９、より好ましくは０．６７～４である。生体吸収性高分子１に対してＭ－ＯＣＰが０．１未満であると、得られる骨再生材料の骨再生能が劣り、９を超えると、形状付与性が低下する。
　本実施形態の骨再生材料は、前記Ｍ－ＯＣＰと生体吸収性高分子の複合体の熱脱水架橋体を含んでいてもよい。熱脱水架橋体は、前記複合体を形成する生体吸収性高分子同士が脱水縮合反応により架橋した構造体である。熱脱水架橋体は、架橋構造を有するため、物理的強度が高く、生体内で適切な速度で吸収される。
　（骨再生促進材料）
　本実施形態の骨再生促進材料は、前述の血管新生材料を含んでいる。骨再生促進材料は、前述の血管新生材料を骨再生に使用しやすいよう適宜、他の成分を添加したものであっても、加工を行ったものでもよい。
　（血管新生材料の製造方法）
　本実施形態の血管新生材料の製造方法は、リン酸を含む水溶液、カルシウム水溶液、金属元素を含む溶液を混合して、金属元素を含む金属－リン酸八カルシウム含有物を合成し、血管新生材料を得る。又、リン酸八カルシウムと金属元素とを含む金属－リン酸八カルシウム含有物と、生体吸収性高分子と、を混合した複合体を含む骨再生材料を得る。
　リンを含む水溶液ならびにカルシウムを含む水溶液は、好ましくはｐＨが４．５～７．５である。カルシウム水溶液またはリンを含む水溶液を混合することによってｐＨを変動させないために、緩衝成分を含んでもよい。又、リンを含む水溶液又はカルシウムを含む水溶液または、どちらか他方の溶液に他の成分が含まれていてもよい。他の成分は生体吸収性高分子が含まれていても良い。
　金属元素を含む溶液は、上述の金属元素又はそれを含む化合物を含む溶液である。金属元素を含む溶液は、上述のリン又はカルシウムを含む水溶液と同様のｐＨで、緩衝成分その他を含んでいてもよく、同様の条件で滴下または注加してもよい。本実施形態では、前述のグルコン酸銅（ＩＩ）の水溶液を用いている。
　生体吸収性高分子は、前述したものから選択できる。本実施形態では、ゼラチンを用いている。
　本実施形態の製造方法は、リンを含む水溶液、カルシウムを含む水溶液、及び金属元素を含む溶液を混合して、リン酸八カルシウムと金属元素とを含む金属－リン酸八カルシウム含有物（Ｍ－ＯＣＰ）を得る工程と、前記金属－リン酸八カルシウム含有物と生体吸収性高分子、とを混合して、前記金属－リン酸八カルシウム含有物と生体吸収性高分子との複合体である血管新生材料を得る工程と、を含むことが好ましい。
　また、前記金属－リン酸八カルシウム含有物を得る工程は、前記リンを含む水溶液、前記カルシウムを含む水溶液、及び前記金属元素を含む溶液を混合し、滴下または注加によって混合し、金属－リン酸八カルシウム含有物を得ることが好ましい。
　ここで、「滴下」とは、一方の溶液の液滴を他方の溶液に加えることをいい、「注加」とは、チューブなどの中空管を用いて、一方の溶液を他方の溶液に加えることをいう。
　滴下または注加は、前記リンを含む水溶液、前記カルシウムを含む水溶液、及び前記金属元素を含む溶液のいずれかの水溶液に対して、他の水溶液を滴下または注加してもよく、他の水溶液、例えば緩衝液等に対して、他の水溶液を滴下または注加してもよい。
　前記滴下または注加は、好ましくは５０℃～８０℃、より好ましくは約６０℃～７５℃で行われる。５０℃未満または８０℃を超えると、Ｍ－ＯＣＰが生成しにくい。
　滴下または注加は、前記水溶液を攪拌しながら行うことが好ましい。攪拌することで、後述する顆粒として得られるＭ－ＯＣＰが均一な粒径となる。
　滴下または注加の速度（ｍＬ／分）は、好ましくは３０～１２０、より好ましくは３５～８２である。３０未満または１２０を超えると、Ｍ－ＯＣＰが生成しにくい。
　生成したＭ－ＯＣＰは、固体として回収することも好ましい。固体とは、例えば結晶や結晶の凝集体などの形状が含まれる。前記滴下または注加の工程によって、Ｍ－ＯＣＰは結晶または結晶の凝集体として沈殿するので、水溶液から濾過や乾燥等によって回収することができる。
　なお、Ｍ－ＯＣＰの粒径は調整後、均一に（整粒）しておいてもよい。整粒して得られるＯＣＰ顆粒の粒径は、好ましくは１０～１０００μｍ、より好ましくは３００～５００μｍである。整粒する手段としては、フィルタなどを用いることができる。
　本実施形態の製造方法は、前記金属－リン酸八カルシウム含有物（Ｍ－ＯＣＰ）を回収し、その後に生体吸収性高分子を混合して、前記金属－リン酸八カルシウム含有物と生体吸収性高分子との複合体である骨再生材料を得る工程を含む。生体吸収性高分子は、例えば水溶液であってもよい。このときＭ－ＯＣＰと生体吸収性高分子との複合体の成分を回収する工程は乾燥、凍結乾燥などを用いても良い。
　結晶の凝集体として回収されたＭ－ＯＣＰを、生体吸収性高分子との複合体を形成しやすいよう粉砕してもよい。粉砕する径はナノサイズであることが好ましい。粒径としては、通常５～１０００ｎｍ、好ましくは１００～４００ｎｍである。１０００ｎｍを超えると、Ｎａｎｏ－ＯＣＰの物理化学的溶解性に基づく骨再生材料の生体内吸収性が低下する。粉砕する方法としては、特に限定されないが、好ましくはＯＣＰを機械的に粉砕する方法が挙げられる。機械的に粉砕する手段としては、特に限定されない。例えば、硬組織破砕装置（ビーズショッカー）、ボールミル、解砕機を用いる手段が挙げられる。
　本実施形態の製造方法では、両方または他方に生体吸収性高分子が含まれる前記リン含有水溶液ならびにカルシウム含有水溶液、及び前記金属元素を含む溶液を混合し、滴下または注加によって混合し、金属－リン酸八カルシウム含有物と生体吸収性高分子の混合物を得て、乾燥、凍結乾燥などを用いて直接Ｍ－ＯＣＰと生体吸収性高分子の複合体の成分を回収しても良い。
　なお、本実施形態の製造方法は、複合体中の生体吸収性高分子を、熱脱水縮合により架橋する熱脱水架橋、化学反応により共有結合を介して架橋する化学架橋、電子線または放射線照射による架橋で、架橋体を得る工程を含んでいてもよい。熱脱水架橋体は、Ｍ－ＯＣＰ／Ｇｅｌを加熱することにより得られる。この加熱処理は、５０℃～２００℃、好ましくは１００℃～１５０℃の温度で、３時間～２４０時間、好ましくは２４時間～１００時間行われる。
　熱脱水架橋体は、好ましくは、Ｍ－ＯＣＰと生体吸収性高分子の複合体を減圧下で加熱することにより得られる。減圧条件としては、特に限定されないが、例えば、２００Ｐａ以下、好ましくは１３３Ｐａ以下である。
　熱脱水架橋体は、より好ましくは、Ｍ－ＯＣＰと生体吸収性高分子の複合体を乾燥した後、減圧下で加熱することにより得られる。乾燥方法としては、特に限定されないが、例えば、凍結乾燥法および自然乾燥法（風乾）が挙げられる。乾燥前に、Ｍ－ＯＣＰと生体吸収性高分子の複合体を静置し、次いで上清を除去するなどして、適宜水分を少なくすることにより、乾燥工程を効率的にしてもよい。
　また、本発明の血管新生材料は、本発明の効果が阻害されない範囲内で、一般的に骨再生材料に含まれる成分を含んでいてもよい。このような成分としては、例えば、前記複合体として用いたもの又は他の生体吸収性天然高分子（ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キトサンなど）、生体吸収性合成高分子（ポリ乳酸、ポリ乳酸－グリコール酸共重合体、ポリカプロラクトンなど）、生体吸収性リン酸カルシウム（β－ＴＣＰセラミックスなど）、生体非吸収性材料（ＨＡセラミックスなど）から選択したものが挙げられる。
　（骨再生促進材料の製造方法）
　本実施形態の骨再生促進材料の製造方法は、前述の血管新生材料を得る工程を含み、前記血管新生材料を含む骨再生促進材料を得る。骨再生促進材料の製造方法は、前述の血管新生材料をそのまま用いて骨再生促進材料としても、骨再生に使用しやすいよう適宜、他の成分を添加する工程を含んでいても、又は、成形などの加工を行う工程を含んでいるものでもよい。
　本発明の骨再生促進材料は、骨欠損部の形状に応じて適宜成形され、電子線照射、高圧蒸気滅菌などにより滅菌処理後、骨欠損部に埋入される。ただし、高圧蒸気滅菌は、ＯＣＰの結晶相に影響を及ぼすので、その場合は骨欠損の適用部位を考慮する。
　以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず種々の変更を行うことができる。
　以下、実施例および比較例により、本発明の効果をより明らかなものとする。なお、本発明は、以下の実施例のみに限定されるものではなく、その要旨を変更しない範囲で適宜変更して実施できるものである。
　（Ｃｕ－ＯＣＰ／Ｇｅｌの合成）
　（実施例１）
　Ｍ－ＯＣＰとして、金属元素にＣｕを用いたＣｕ－ＯＣＰを、（Ｓｕｚｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｏｈｏｋｕ　Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　１６４　（１９９１）　３７－５０．）に基づいた湿式法により合成した。
　０．０４モル／Ｌの酢酸カルシウム水溶液１ＬとＣｕ２＋源としたグルコン酸銅（ＩＩ）（［ＨＯＣＨ２（ＨＣＯＨ）４ＣＯＯ］２Ｃｕ、分子量４５３．８５）の水溶液を混合し、その混合溶液をリン酸塩水溶液（０．０４モル/Ｌ リン酸２水素ナトリウム二水和物水溶液、室温でｐＨ４．５）１Ｌに対して１５分かけて滴下して混合した。グルコン酸銅（ＩＩ）水溶液の濃度及び量は、Ｃｕ元素の仕込み量として、合成されるＣｕ－ＯＣＰの顆粒において、Ｃｕ含有量がＣｕ－ＯＣＰの全体質量に対しておよそ０．０１４ｗｔ％となるように添加した。実施例１で合成した顆粒は、lｏｗ－Ｃｕ－ＯＣＰとした。
　滴下終了後、混合液をさらに６５℃にて数分間撹拌することにより、沈殿（共沈物）を形成させた。上清を除去し、３２～４８メッシュのフィルタを通して、Ｃｕ－ＯＣＰの顆粒（径３００－５００μｍ）を得た。
　ついで、生体吸収性高分子として、ゼラチン（シグマ社製、Ｔｙｐｅ　Ａ　Ｇｅｌａｔｉｎ（ブタ皮膚由来））を３％（w/v）含む水溶液を調製した。Ｃｕ－ＯＣＰ／Ｇｅｌの全体質量のうち、Ｃｕ－ＯＣＰの含有量が４４ｗｔ％となるようにゼラチン水溶液にＣｕ－ＯＣＰの沈殿を添加した。沈殿の懸濁液をポリプロピレン製の容器に移し、４℃で混合させてゼラチンをゲル化させた後、－２０℃に凍結し、凍結乾燥を行い、Ｍ－ＯＣＰとゼラチンとの複合体（Ｃｕ－ＯＣＰ／Ｇｅｌ）を含む血管新生材料を得た。Ｃｕ－ＯＣＰ／Ｇｅｌは直径９ｍｍ、厚さ１ｍｍのディスク状に形成し、１５０℃、２４時間真空加熱してゼラチンを架橋させた。この材料を血管新生材料として、血管新生及び骨再生の試験に用いた。
　（実施例２）
　グルコン酸銅（ＩＩ）を、Ｃｕ元素の仕込み量として、合成されるＭ－ＯＣＰの顆粒において、Ｃｕ含有量がおよそ０．１３ｗｔ％となるように添加した他は、実施例１と同様にしてＣｕ－ＯＣＰを調製した。実施例２で合成した顆粒は、ｈiｇh－Ｃｕ－ＯＣＰとした。
　（比較例１）
　グルコン酸銅（ＩＩ）を添加せず、すなわちＣｕ－ＯＣＰにかえてＯＣＰとしたほかは、実施例１と同様に調製した。
　（比較例２）
　Ｃｕ－ＯＣＰもしくはＯＣＰにかえてグルコン酸銅（ＩＩ）を添加したほかは、実施例１と同様の方法で銅含有ゼラチン（Ｃｕ／Ｇｅｌ）を調製した。なお、Ｃｕ／Ｇｅｌの銅含有量は、lｏｗ－Ｃｕ－ＯＣＰ／Ｇｅｌの銅含有量と同様となるように、グルコン酸銅（ＩＩ）を添加した。
　（Ｃｕ－ＯＣＰのＣｕ含有量）
　実施例１、２の調整の際に、それぞれＣｕ－ＯＣＰについて２０ｍｇを２０ｍＬの０．１Ｍ　ＨＮＯ３に溶解し，誘導結合プラズマ原子発光分光分析装置（ＩＣＰ－ＡＥＳ）を用いて、試料中のＣｕ含有量を測定した。結果を表１に示す。それぞれ、Ｃｕ－ＯＣＰのＣｕ含有量は、実施例１、２で目標としてＣｕの仕込みを行った量に相当する量が含有されていることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（Ｃｕ－ＯＣＰの血管新生能のｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価）
　ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＴＭ）Ｍａｔｒｉｘ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ, Ｂｅｄｆｏｒｄ, ＭＡ, ＵＳＡ）をコーティングした２４ウェルプレートに播種したヒト臍帯静脈内皮細胞を１ｍｇのＯＣＰ（比較例１）、lｏｗ－Ｃｕ－ＯＣＰ（実施例１）、ｈｉｇｈ－Ｃｕ－ＯＣＰ（実施例２）顆粒を共存させた状態で、２４時間、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ－2培地中で培養した。なお、顆粒が存在しない条件下での培養をCｏnｔｒｏｌとした。培養後、ヒト臍帯静脈内皮細胞の形態を光学顕微鏡により観察した。得られた光学顕微鏡像からヒト臍帯静脈内皮細胞が形成した管腔構造の架橋点の平均値を計測した。
　架橋点の平均値の比較結果を表２に示す。ヒト臍帯静脈内皮細胞が形成した管腔構造の架橋点の平均値は、CｏnｔｒｏｌよりもＯＣＰ（比較例１）、lｏｗ－Ｃｕ－ＯＣＰ（実施例１）で増加した。また、管腔構造の架橋点は、ＯＣＰ（比較例１）又は、ｈｉｇｈ－Ｃｕ－ＯＣＰ（実施例２）と比較して、lｏｗ－Ｃｕ－ＯＣＰ（実施例１）で特に増加した。このため、Ｃｕ－ＯＣＰにおけるＣｕの量はlｏｗ－Ｃｕ－ＯＣＰ相当量が特に優れており、Ｃｕ－ＯＣＰの全体質量に対して、Ｃｕ元素の含有量が例えば０．００５～０．１であると効果が特に高いと考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（Ｃｕ－ＯＣＰ／Ｇｅｌの血管新生能および骨新生能のｉｎ　ｖｉｖｏ評価）
　Ｗｉｓｔａｒ　ｒａｔ（雄性、１２週齢）の頭蓋冠に、直径９ｍｍの臨界径骨欠損を作製し、直径９ｍｍ、厚さ１ｍｍに形成した、ＯＣＰ／Ｇｅｌ（比較例１）、Ｃｕ／Ｇｅｌ（比較例２）、又はlｏｗ－Ｃｕ－ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体（実施例１）を埋入した。埋入２週または４週後に、血管造影剤（Ｍｉｃｒｏｆｉｌ（Ｒ））を灌流したのち，頭蓋冠組織を回収した。
　脱灰前後で頭蓋冠組織のμＣＴ像を撮影し、得られた像を３Ｄ画像解析ソフトウェアを用いて解析することで、石灰化組織および新生血管の体積を測定した。
　表３は造影剤により得られた新生血管の体積を示す。lｏｗ－Ｃｕ－ＯＣＰ／Ｇｅｌ（実施例１）の方が、ＯＣＰ／Ｇｅｌ（比較例１）もしくはＣｕ／Ｇｅｌ（比較例２）よりも、２週間後及び４週間後のいずれにおいても新生血管の体積が大きかった。また、lｏｗ－Ｃｕ－ＯＣＰ／Ｇｅｌは２週間後よりも４週間後でさらに新生血管の体積の増加が見られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表４は石灰化物の体積、すなわち新生した骨の体積を示す。Ｃｕ－ＯＣＰ／Ｇｅｌ（実施例１）の方が、ＯＣＰ／Ｇｅｌ（比較例１）もしくはＣｕ／Ｇｅｌ（比較例２）よりも、体積が大きく、また２週間後よりも４週間後でさらに石灰化物の体積の増加が見られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　これらの結果により、本実施形態の骨再生材料は血管新生能を大きく増大させ、また、骨再生も促進することが示された。
（Ｃｕ－ＯＣＰのＣｕ溶出挙動の評価）
　上述の実施例１と同様に合成したｌｏｗ－Ｃｕ－ＯＣＰと、実施例２と同様に合成したｈｉｇｈ－Ｃｕ－ＯＣＰをそれぞれ５ｍｇずつ準備した。顆粒径は３００－５００μｍであった。前記顆粒５ｍｇずつを、１５０ｍＭ　トリスヒドロキシメチルアミノメタン－塩酸（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）緩衝液（ｐＨ７．４，　３７℃）５ｍＬに浸漬し、転倒撹拌した。
　この浸漬開始からそれぞれ１、３、２４、７２または１６８時間の各溶出時間に，遠心分離を用いて上清を回収した。
　前記回収した上清中に含まれるＣｕ濃度を、誘導結合プラズマ発光分光分析装置（分析波長３２４．７ｎｍ）により測定した。
　図１に、溶出時間（ｉｎｃｕｖａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ）ごとの上清中に含まれるＣｕ濃度を示した。ｌｏｗ－Ｃｕ－ＯＣＰと、実施例２と同様に合成したｈｉｇｈ－Ｃｕ－ＯＣＰについて、濃度を０～８．０μＭのスケールで示した。
　図２に、図１と同じ測定のｌｏｗ－Ｃｕ－ＯＣＰについて、濃度を０～１．０μＭのスケールで示した。
　図１、２に示すように、ｌｏｗ－Ｃｕ－ＯＣＰとｈｉｇｈ－Ｃｕ－ＯＣＰのいずれについても少なくとも溶出時間が１６８時間までＣｕ濃度が増加し続けた。Ｃｕの含有量によらずＣｕ－ＯＣＰはＣｕが溶出可能な材料であることが示された。また、各溶出時間でｌｏｗ－Ｃｕ－ＯＣＰの方がｈｉｇｈ－Ｃｕ－ＯＣＰよりもＣｕ濃度が低いことから、ｌｏｗ－Ｃｕ－ＯＣＰの顆粒からは長時間にわたって微量のＣｕの溶出が継続することで、ｌｏｗ－Ｃｕ－ＯＣＰは細胞毒性を惹起する可能性がより低く、血管新生を促進することが示された。
　また、本実施形態の材料を骨再生に用いる場合、骨の再生は長期間に及び行われるので、本実施形態の血管新生作用との相互作用による骨再生には、血管新生を促進する効果が長時間にわたって継続することは有効であると考えられる。
　本発明の血管新生材料、それを用いた骨再生促進材料及びそれらの製造方法によれば、血管新生能を特に向上させた血管新生材料が得られる。この血管新生材料を骨再生に用い、又は骨再生促進材料とすることで、高い血管新生能と骨新生能を併せ持ち骨再生に特に有効な骨再生促進材料及びその製造方法を提供することができる。また、血管新生能に着目すると、骨再生に限定せず、血管新生が求められる様々な組織再生への応用が期待できる。

Claims (10)

  1. 　リン酸八カルシウムと金属元素とを含む金属－リン酸八カルシウム含有物と、生体吸収性高分子と、の複合体を含む血管新生材料。
  2. 　前記金属元素がＣｕ又はＺｎである、請求項１に記載の血管新生材料。
  3. 　前記生体吸収性高分子がゼラチンである、請求項１または２に記載の血管新生材料。
  4. 　請求項１から３のいずれか１項に血管新生材料を含む、骨再生促進材料。
  5. 　血管新生材料の製造方法であって、
    　リンを含む水溶液、カルシウムを含む水溶液、金属元素を含む溶液、及び生体吸収性高分子を混合して、
    　リン酸八カルシウムと金属元素とを含む金属－リン酸八カルシウム含有物と、前記生体吸収性高分子と、の複合体を含む血管新生材料を得る、血管新生材料の製造方法。
  6. 　リンを含む水溶液、カルシウムを含む水溶液、及び金属元素を含む溶液を混合して、リン酸八カルシウムと金属元素とを含む金属－リン酸八カルシウム含有物を得る工程と、
    　前記金属－リン酸八カルシウム含有物と生体吸収性高分子とを混合して、前記金属－リン酸八カルシウム含有物と生体吸収性高分子との複合体である血管新生材料を得る工程と、
    　を含む、請求項５に記載の血管新生材料の製造方法。
  7. 　前記金属－リン酸八カルシウム含有物を得る工程は、前記リンを含む水溶液、前記カルシウム水溶液、及び前記金属元素を含む溶液を滴下または注加によって混合し、金属－リン酸八カルシウム含有物を得る、請求項６に記載の血管新生材料の製造方法。
  8. 　前記金属元素がＣｕ又はＺｎである、請求項５から７のいずれか１項に記載の血管新生材料の製造方法。
  9. 　前記生体吸収性高分子がゼラチンである、請求項５または８のいずれか１項に記載の血管新生材料の製造方法。
  10. 　請求項５から９のいずれか１項に記載の血管新生材料の製造方法における前記血管新生材料を得る工程を含み、前記血管新生材料を含む骨再生促進材料を得る、骨再生促進材料の製造方法。
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