WO2023085716A1 - 난치성 분자아형 암 치료 표적으로서 고atp친화성 단백질 및 이의 억제제 - Google Patents

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Definitions

  • cancer stem cells or tumor initiating cells that maintain and regenerate cancer tissues like normal organs in cancer tissues
  • these cancer stem cells are presumed to be involved in the cancerization process as the first initiation of cancer.
  • it has also been reported to be involved in angiogenesis (neovascularization) in cancer tissue.
  • it has been reported that it has a profound effect on recurrence or metastasis of cancer and induction of resistance to chemotherapy by being involved in the regeneration of reduced cancer cells after cancer treatment by accelerating cancer cell invasion.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating gastric cancer comprising, as an active ingredient, a pharmaceutical composition selective for epithelial-to-mesenchymal transition (EMT).
  • EMT epithelial-to-mesenchymal transition
  • the kit in order to diagnose or predict the diagnosis or prognosis of cancer or gastric cancer, includes the CAST, EEF1D, HNRNPA2B1, LIG1, MARCKS, MTA2, PFAS, PNPO, REXO2, YWHAZ, HNRNPA0, TPM2, TXNDC17, ASS1, RANBP1, HAT1, It can be used for measuring the expression levels of mRNAs of CYB5B, GANAB and PSMD9 genes or proteins expressed therefrom.
  • -associated protein MTA2 Phosphoribosylformylglycinamidine synthase, Pyridoxine-5'-phosphate oxidase, Oligoribonuclease, mitochondrial, 14-3-3 protein zeta/delta, Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A0, Tropomyosin beta chain, Thioredoxin domain-containing protein 17, Argininosuccinate synthase, -specific GTPase-activating protein, Histone acetyltransferase type B catalytic subunit, Cytochrome b5 type B, neutral alpha-glucosidase AB, and 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 9.
  • peroxidase and alkaline phosphatase may be used, and the fluorescent material may be, but is not particularly limited to, FITC, RITC, etc., and the color-developing substrate solution is not particularly limited thereto, but ABTS (2, 2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) or OPD (o-phenylenediamine), TMB (tetramethyl benzidine).
  • ABTS 2, 2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)
  • OPD o-phenylenediamine
  • TMB tetramethyl benzidine
  • normal subject refers to an individual who has not been diagnosed with gastric cancer, and mRNA or expression thereof of the gene in a sample isolated from a normal individual and a sample isolated from an individual whose diagnosis or prognosis of gastric cancer is to be predicted.
  • mRNA or expression thereof of the gene in a sample isolated from a normal individual and a sample isolated from an individual whose diagnosis or prognosis of gastric cancer is to be predicted.
  • the "combination" should be understood to denote simultaneous, separate or sequential administration.
  • the interval between administrations of the second components should be such that the beneficial effects of the combination are not lost.
  • examples of carriers, excipients and diluents suitable for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose , methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil, and the like can be used.
  • fillers, anti-agglomerating agents, lubricants, wetting agents, flavoring agents, emulsifiers, preservatives, and the like may be further included.
  • step (a) measuring the mRNA level of a gene encoding an ATP affinity protein present in a biological sample or the expression level of an ATP affinity protein; And (b) comparing the measurement result of step (a) with the mRNA level of a gene encoding an ATP affinity protein or the expression level of an ATP affinity protein in a control sample.
  • a method for providing information for predicting and diagnosing gastric cancer is provided.
  • the ATP affinity protein is Calpastatin, Elongation factor 1-delta, Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1, DNA ligase 1, Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate, Metastasis-associated protein MTA2, Phosphoribosylformylglycinamidine synthase, Pyridoxine-5'-phosphate oxidase, Oligoribonuclease, mitochondrial, 14-3-3 protein zeta/delta, Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A0, Tropomyosin beta chain, Thioredoxin domain-containing protein 17, Argininosuccinate synthase, Ran-specific
  • the gastric cancer is a stem-like, epithelial-to-mesenchymal transition and mesenchymal (SEM) subunit gastric cancer, and a device for predicting and diagnosing gastric cancer is provided.
  • SEM epithelial-to-mesenchymal transition and mesenchymal
  • the ATP affinity protein is Calpastatin, Elongation factor 1-delta, Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1, DNA ligase 1, Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate, Metastasis-associated protein MTA2, Phosphoribosylformylglycinamidine synthase, Pyridoxine-5'-phosphate oxidase, Oligoribonuclease, mitochondrial, 14-3-3 protein zeta/delta, Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A0, Tropomyosin beta chain, Thioredoxin domain-containing protein 17, Argininosuccinate synthase, Ran-specific An agent for preventing or treating gastric cancer, containing at least one protein selected from the group consisting of GTPase-activating protein, Histone acetyltransferase type B catalytic subunit, Cytochrome b5 type
  • Figure 4 is a result of confirming that the protein labeling was performed well as the labeled protein was confirmed after labeling the Desthiobiotin-ATP probe according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5 is a result of dot blotting (dot blot) to confirm the Desthiobiotin-labeled protein according to an embodiment of the present invention, confirming that the labeled peptide is eluted.
  • the desthiobiotin-ATP probe binds to the pocket of the ATP binding protein, and the acyl group present in the desthiobiotin-ATP probe It comes in close proximity to the lysine sequence of the protein that binds to this ATP. Accordingly, a nucleophilic reaction occurs between the amino group of the lysine of the protein that binds to ATP and the acyl group of the desthiobiotin-ATP probe, and as a result, the amide bond is formed. It is made between a desthiobiotin-ATP probe and a protein that binds to ATP. Therefore, ATP-binding proteins can be classified by performing LC-MS/MS liquid chromatography using tags present in probes covalently bound to ATP-binding proteins.
  • 2Desthiobiotin-ATP probe To confirm the labeled protein, after labeling the probe, 20 ug of protein was loaded and western blotting was performed. After diluting the HRP-conjugated streptavidin antibody in TBS-0.05% Tween 20 containing 2% BSA at a ratio of 1:40000 and reacting at room temperature for 1 hour, the ECL solution (Thermo fisher) was dispensed and the Chemi-luminescent Image Analyzer ( LAS4000, Fujifilm) was used for detaxation, and it is shown in FIG. 4 . Through this, as the probe concentration increased, the signal intensity of the western blot band increased, confirming that the protein labeling was performed well.

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Abstract

본 발명은 SEM(stem-like, epithelial-to-mesenchymal transition and mesenchymal) 하위유형(subunit) 암에 대한 치료 표적 및 그 억제제에 관한 것으로, 본 발명에서는 세포 내의 ATP 농도가 SEM(stem-like, epithelial-to-mesenchymal transition and mesenchymal) 하위유형(subunit) 암에서 높은 점에 착안하여 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준을 측정하여 위암의 예방 또는 치료용 제제를 효과적으로 스크리닝 할 수 있고, 위암을 예측 및 진단을 위한 정보를 제공할 수 있으며, 위암 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공하며, 위암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 효과적으로 제공할 수 있다.

Description

난치성 분자아형 암 치료 표적으로서 고ATP친화성 단백질 및 이의 억제제
본 발명은 SEM(stem-like, epithelial-to-mesenchymal transition and mesenchymal) 하위유형(subunit) 암에 대한 치료 표적 및 그 억제제에 관한 것이다.
위암은 특히 아시아에서 높은 발생빈도를 보이며 암 관련 사망의 주된 원인이 되고 있다. 우리나라에서는 암 환자의 16.2% (남성 암 환자의 20.3% 및 여성 암 환자의 11.2%)가 위암 환자인 것으로 추정된다. 위암의 증상은 전혀 증상이 없는 경우에서부터 격심한 통증에 이르기까지 다양한 양상을 나타내고 있으며, 위암의 증상이 어떤 특성을 갖는 것이 아니라 일반적인 소화기 증상을 보이며, 위암의 초기에는 증상이 없는 경우가 대부분이며, 증상이 있다 하더라도 비교적 경미하여 약간의 소화불량이나 상복부 불편감을 느끼는 정도이므로 대부분의 사람 이를 간과하기 쉬워 위암의 사망률을 높이는 원인이 되기도 한다.
최근 위암 환자 조직의 Microarray 분석에서 유전자들의 발현 패턴 특징에 따라 장형(intestinal), 줄기형(stem-like), 혼합형(mixed stromal), 염증형(inflammatory)으로 분자아형을 분류할 수 있음이 확인되었으며, 앞서 언급된 바와 같이 장형은 줄기형, 혼합형 및 염증형에 비해 치료가 쉬운 위암으로 알려져 있으며 줄기형은 치료가 어렵고 예후가 매우 나쁜 위암군에 속하는 것으로 보고되어 있다.
또한, 암 조직에도 일반 장기처럼 암 조직을 유지하고 재생하는 암 줄기세포(cancer stem cells or tumor initiating cells)가 존재하며, 이들 암 줄기세포는 암의 최초 시작으로 암화과정에 관여하는 것으로 추측되고 있을 뿐 아니라, 암 조직내의 신생혈관형성(angiogenesis, neovascularization)에도 관여하는 것으로도 보고되어 있다. 또한 암세포 침윤 등을 가속화시켜 암 치료 후 줄어든 암세포의 재생하는 데 관여함으로써 암의 재발이나 전이 및 항암치료 내성 유발에 깊은 영향을 미친다고 보고된 바 있다. 따라서 암을 근본적으로 진단 및 치료하기 위해서는 암 조직의 극히 일부만 차지하면서도 암의 발병과 유지, 항암제 내성, 재발에 핵심 구실을 하는 암 줄기세포에 초점을 맞추어야 하며, 암 줄기세포에 대한 더 많은 이해는 조기 진단을 위한 진단용 마커 및 치료용 마커 개발에 도움이 될 것이다.
본 발명자들은 SEM(stem-like, epithelial-to-mesenchymal transition and mesenchymal) 하위유형(subunit) 암에서 대부분의 악성 세포가 높은 생체 에너지 상태를 이용한다는 점에 착안하여, 특히 난치성 SEM(stem-like, epithelial-to-mesenchymal transition and mesenchymal) 하위유형(subunit) 암에 대해 새로운 치료 표적을 제안하고자 하였다.
따라서, 본 발명의 일 목적은 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 위암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는, 위암 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 생물학적 시료에 존재하는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 (a) 단계의 측정 결과를 대조군 시료의 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 위암을 예측 및 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 위암 세포에 위암 치료 후보 물질을 처리하는 단계; 상기 후보 물질이 처리된 분리된 위암 세포에서 존재하는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 (b) 단계에서 측정된 존재하는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준이 후보 물질이 처리되지 않은 분리된 위암 세포에 비해 낮은 수준을 나타내는 경우, 상기 후보 물질을 위암 예방 또는 치료용 제제로서 사용할 수 있을 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 위암 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 EMT(Epithelial-to-mesenchymal transition)에 선택적인 약학 조성물을 유효성분으로 포함하는 위암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본 발명에 대해 보다 자세히 설명한다.
본 발명에서 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)을 코딩하는 유전자는, CAST, EEF1D, HNRNPA2B1, LIG1, MARCKS, MTA2, PFAS, PNPO, REXO2, YWHAZ, HNRNPA0, TPM2, TXNDC17, ASS1, RANBP1, HAT1, CYB5B, GANAB 및 PSMD9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 말하며, 그러므로 본 발명의 위암 진단 또는 예후 예측용 조성물, 위암 진단 또는 예후 예측용 키트, 위암을 예측 및 진단을 위한 정보를 제공하는 방법, 위암 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법에는 상기 유전자들 중에서 1종의 유전자 또는 2종, 3종, 4종, 5종, 6종, 7종, 8종, 9종, 10종, 11종, 12종, 13종, 14종, 15종, 16종, 17종, 18종 또는 19종의 유전자 조합을 포함할 수 있다. 본 발명에서, "mRNA의 수준을 측정하는 방법 또는 제제"는 시료에 포함된 본 발명의 19종의 유전자의 발현 여부를 확인하기 위하여, 상기 유전자로부터 전사된 mRNA의 수준을 측정하는 방법 또는 이에 사용되는 제제를 의미한다. 구체적으로 상기 방법 또는 제제는 RT-PCR, 정량 실시간 PCR(quantified real time PCR), 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), DNA 칩 분석법 등의 방법 또는 이에 사용되는 표적 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 "단백질의 수준을 측정하는 방법 또는 제제"는 시료에 포함된 본 발명의 19종의 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법 또는 이에 사용되는 제제를 의미한다. 상기 19종의 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)에 속하는 Calpastatin, Elongation factor 1-delta, Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1, DNA ligase 1, Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate, Metastasis-associated protein MTA2, Phosphoribosylformylglycinamidine synthase, Pyridoxine-5'-phosphate oxidase, Oligoribonuclease, mitochondrial, 14-3-3 protein zeta/delta, Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A0, Tropomyosin beta chain, Thioredoxin domain-containing protein 17, Argininosuccinate synthase, Ran-specific GTPase-activating protein, Histone acetyltransferase type B catalytic subunit, Cytochrome b5 type B, Neutral alpha-glucosidase AB 및 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 9가 될 수 있다. 구체적으로, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체, 또는 앱타머를 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 방법 또는 제제는 웨스턴 블럿(western blotting), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS(fluorescence-activated cell sorting analysis) 및 단백질 칩 분석법(protein chip technology assay) 등의 방법 또는 이에 사용되는 항체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 키트는 암 또는 위암의 진단 또는 예후를 예측하기 위하여, 상기 CAST, EEF1D, HNRNPA2B1, LIG1, MARCKS, MTA2, PFAS, PNPO, REXO2, YWHAZ, HNRNPA0, TPM2, TXNDC17, ASS1, RANBP1, HAT1, CYB5B, GANAB 및 PSMD9 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 용도로 사용될 수 있다. 상기 19종의 유전자에 의해 발현되는 단백질은 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)에 속하는 Calpastatin, Elongation factor 1-delta, Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1, DNA ligase 1, Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate, Metastasis-associated protein MTA2, Phosphoribosylformylglycinamidine synthase, Pyridoxine-5'-phosphate oxidase, Oligoribonuclease, mitochondrial, 14-3-3 protein zeta/delta, Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A0, Tropomyosin beta chain, Thioredoxin domain-containing protein 17, Argininosuccinate synthase, Ran-specific GTPase-activating protein, Histone acetyltransferase type B catalytic subunit, Cytochrome b5 type B, Neutral alpha-glucosidase AB 및 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 9가 될 수 있다.
본 발명의 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 발명의 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 상기 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩 분석법을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 분석용 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
아울러, 본 발명의 키트는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질의 수준을 측정하기 위한 단백질 칩 분석용 키트가 될 수 있는데, 상기 키트는 특별히 이에 제한되지 않으나, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충 용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기 기재는 특별히 이에 제한되지 않으나 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 특별히 이에 제한되지 않으나 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있으며, 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나 FITC, RITC 등이 될 수 있고, 발색 기질액은 특별히 이에 제한되지 않으나 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 생물학적 시료에 존재하는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 측정 결과를 대조군 시료의 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 위암을 예측 및 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 용어, 상기 "개체"는 위암을 진단하거나 위암의 예후를 예측하고자 하는 대상을 의미한다. 이때, 상기 개체는 사람을 비롯하여, 개, 말, 소, 쥐, 염소, 토끼, 닭, 오리, 거위 등의 위암이 발병될 수 있는 동물이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
본 발명의 용어, "시료"란 이에 제한되는 것은 아니나, 위암 발병이 의심되는 개체로부터 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장 외에도, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하며, 구체적으로는 상기 조직은 위 점막(GM) 조직 또는 장상피화생(IM) 조직일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "정상 개체"란 위암으로 진단되지 않은 개체를 의미하며, 정상 개체로부터 분리된 시료와 위암의 진단 또는 예후를 예측하고자 하는 개체로부터 분리된 시료에서 상기 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 발현 수준을 측정하고, 비교함으로써, 위암 발병이 의심되는 개체의 위암 발병 여부 또는 위암의 예후를 정확하게 예측할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 생물학적 시료에 존재하는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준을 측정하는 측정부; 상기 측정 결과를 대조군 시료의 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준과 비교하는 비교부;를 포함하는, 위암 예측 및 진단을 위한 기기를 제공한다.
본 발명의 상기 진단기기는 목적하는 개체로부터 얻어진 생물학적 시료로부터 CAST, EEF1D, HNRNPA2B1, LIG1, MARCKS, MTA2, PFAS, PNPO, REXO2, YWHAZ, HNRNPA0, TPM2, TXNDC17, ASS1, RANBP1, HAT1, CYB5B, GANAB 및 PSMD9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 이에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 측정부; 및 상기 측정부에서 측정된 유전자 또는 이에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준으로부터 스코어 값을 계산하는 연산부를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 진단기기의 연산부는 상기 측정부에서 측정된 유전자 또는 단백질의 발현 수준의 로그 강도 값의 평균 (average of log intensity)으로 스코어 값을 계산하는 기능을 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 진단기기의 연산부에서 도출된 스코어 값으로부터 목적하는 개체의 암의 치료 예후를 예측할 수 있다. 보다 상세하게는 상기 연산부에서는 도출된 SMC 스코어의 값에 따라 암의 예후 예측에 관한 정보를 생성하여 분류함으로써 악성 암으로서 줄기세포의 특성을 가진 암으로 좋지 않은 예후가 예견되는 목적하는 개체를 결정할 수 있다.
본 발명의 일 예시에서, 상기 연산부에서는 계산된 스코어 값이 5 내지 15의 값 이상인 경우, 바람직하게는 10 내지 12의 값 이상인 경우, 보다 바람직하게는 11 이상인 경우 암 줄기세포를 포함하는 악성 암의 발병 또는 발병 가능성이 높아 암 환자의 치료 예후가 좋지 않을 것으로 예측하여 출력하는 출력부를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 예시에서, 상기 연산부에서는 계산된 SMC 스코어 값이 5 내지 15의 값 미만인 경우, 바람직하게는 10 내지 12의 값 미만인 경우, 보다 바람직하게는 11 미만인 경우 암 환자의 치료 예후가 좋을 것으로 예측하여 출력할 수 있다.
본 발명의 상기 진단기기는 연산부에서 예측된 목적하는 개체의 암의 예후를 출력하는 출력부를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 위암 세포에 위암 치료 후보 물질을 처리하는 단계; 상기 후보 물질이 처리된 분리된 위암 세포에서 존재하는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 (b) 단계에서 측정된 존재하는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준이 후보 물질이 처리되지 않은 분리된 위암 세포에 비해 낮은 수준을 나타내는 경우, 상기 후보 물질을 위암 예방 또는 치료용 제제로서 사용할 수 있을 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 위암 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 스크리닝 방법에서 이용되는 단백질은 세포 표면에 전시(displaying)되어 있는 형태, 바이러스(예컨대, 박테리오파아지) 표면에 전시되어 있는 형태, 분리된(isolated) 형태 또는 정제된(purified) 형태일 수 있다. 세포 표면 또는 바이러스 표면에 전시되어 있는 단백질을 이용하는 경우, 스크리닝의 신속화 또는 자동화를 위하여 상기 세포 또는 바이러스는 고상의 기질에 고정화시키는 것이 바람직하다. 또한, 분리된(isolated) 또는 정제된(purified) 형태의 단백질도 고상의 기질에 고정화시키는 것이 바람직하다. 기질로서 이용 가능한 것은, 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 가능하며, 예를 들어, 폴리스틸렌과 폴리프로필렌과 같은 탄화수소 폴리머, 유리, 금속 및 젤을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 고상의 기질은 딥스틱, 마이크로타이터 플레이트, 입자(예컨대, 비드), 친화성 컬럼 및 면역블롯 막(예컨대, 폴리비닐리덴 플루오라이드 막)의 형태로 제공될 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 고상 기질은 마이크로타이터 플레이트이다.
본 발명의 스크리닝 방법은 다양한 방식으로 실시할 수 있으며, 특히 당업계에 공지된 다양한 결합 분석(binding assay)에 따라 고속(high throughput) 방식으로 실시할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 시험물질 또는 상기 단백질들은 검출가능한 표지(detectable label)로 레이블링 될 수 있다. 예를 들어, 상기 검출가능한 표지(detectable label)는, 화학적 표지(예컨대, 바이오틴), 효소 표지(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼린 포스파타아제, 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제, β-갈락토시다아제 및 β-글루코시다아제), 방사능 표지(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광 표지[예컨대, 쿠마린, 플루오레세인, FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민 6G(rhodamine 6G), 로다민 B(rhodamine B), TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), Cy-3, Cy-5, Texas Red, Alexa Fluor, DAPI(4,6-diamidino-2phenylindole), HEX, TET, Dabsyl 및 FAM], 발광 표지, 화학발광(chemiluminescent) 표지, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 또는 금속 표지(예컨대, 금 및 은)이다.
검출가능한 표지가 레이블링된 단백질 또는 시험물질을 이용하는 경우, 단백질과 시험물질 사이의 결합 발생 여부는 표지로부터 나오는 시그널을 검출하여 분석할 수 있다. 예를 들어, 표지로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질을 이용하여 시그널을 검출한다. 표지로서 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌와 같은 기질을 이용하여 시그널을 검출한다.
택일적으로, 시험물질의 단백질로의 결합 여부는 상호작용물(interactants)의 레이블링 없이 분석할 수도 있다. 예를 들어, 마이크로피지오미터(microphysiometer)를 이용하여 시험물질이 QP-C에 결합하는 지 여부를 분석할 수 있다. 마이크로피지오미터는 LAPS(light-addressable potentiometric sensor)를 이용하여 셀이 그의 환경을 산성화하는 속도를 측정하는 분석 도구이다. 산성화 속도의 변화는, 시험물질과 QP-C 사이의 결합에 대한 지시자(indicator)로 이용될 수 있다.
시험물질의 단백질과의 결합 능력은 실시간 이분자 상호작용 분석(BIA)를 이용하여 분석할 수 있다. BIA는 실시간으로 특이적 상호작용을 분석하는 기술로서, 상호작용물(interactants)의 레이블링 없이 실시할 수 있다(예컨대, BIAcore쪠). 표면 플라즈몬 공명(SPR)에서의 변화는 분자들 사이의 실시간 반응에 대한 지시자(indicator)로 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 스크리닝 방법은, 투-하이브리드 분석 또는 쓰리-하이브리드 분석 방법에 따라 실시할 수 있다. 이 경우, 상기 단백질을 베이트(bait) 단백질로 이용할 수 있다. 이 방법에 따르면, 상기 단백질에 결합하는 물질, 특히 단백질을 스크리닝 할 수 있다. 투-하이브리드 시스템은 분할 가능한 DNA-결합 및 활성화 도메인으로 구성된 전사인자의 모듈 특성에 기초한다. 간단하게는 이 분석 방법은 두 가지 DNA 컨스트럭트를 이용한다.
본 발명에서 이용되는 시료는 상술한 단일 화합물 또는 화합물들의 혼합물 이외에, 펩타이드, 항체, 펩타이드 앱타머, 어드넥틴(AdNectin), 어피바디(affibody), 아비머(Avimer) 또는 쿠니쯔 도메인(Kunitz domain) 등을 포함한다.
상기 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 동정되는 암 치료제는 암 조직의 대부분을 차지하는 일반 암세포만를 타겟으로 하는 것이 아니라, 암 조직의 극히 일부만 차지하면서도 암의 발병과 유지, 재발에 핵심 구실을 하는 암 또는 암 줄기세포를 그 타겟으로 하므로, 암 또는 암의 근본적인 치료를 가능하게 한다. 또한, 난치성 SEM 하위유형 암에 선택적으로 작용하는 암 치료제를 스크리닝 할 수 있다.
본 발명에서 "위암"은 위에 생기는 암을 두루 이르는 말로서, 위암의 대부분을 차지하는 위선암(胃腺癌)은 위점막의 선세포(샘세포)에서 발생한 것이며 현미경에서 관찰되는 모양에 따라 다시 여러 종류로 나눌 수 있다. 그 외에 림프조직에서 발생하는 림프종, 위의 신경 및 근육 조직에서 발생하는 간질성 종양, 육종(肉腫, 비상피성 조직에서 유래하는 악성 종양), 그리고 호르몬을 분비하는 신경내분비암 등이 모두 위암에 포함될 수 있다. 발명에서 위암은 바람직하게 줄기형 아형 및/또는 혼합형 아형, 보다 바람직하게 줄기형 아형이다.
위암은 분자 아형에 따라 분류될 수 있다. 예를 들어, 위암 검체에서 전장 유전체 수준의 mRNA 발현을 Microarray 기법으로 조사하고 군집 분석을 통해 위암에 내재적인 아형 (subtype)을 확인한 후 각 아형에 특이적인 유전자들을 통계적 검증을 통해 선별할 수 있다. 이렇게 선별된 유전자 발현량을 기반으로 상피세포 특징적인 유전자 발현이 높은 아형을 장형 (intestinal subtype), 발생 단계 신호전달 (EMT) 및 간질(stroma) 유래 유전자 발현이 높은 아형을 줄기형 (stem-like subtype), 장형 및 줄기형의 특징을 모두 발현하는 혼합형(mixed stromal subtype), 그리고 면역조절 관련 유전자 발현이 높은 염증형 (inflammatory subtype)으로 분류할 수 있다. 각각의 아형은 기존에 잘 규명된 임상 및 병리조직학적 소견과 연관된 차별적인 특성을 가지고 있는 것이 확인되었다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 목적하는 개체에 본 발명의 조성물을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방, 개선 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "목적하는 개체"란, 암이 발병하였거나, 발병 가능성이 높은 개체를 의미한다.
한편, 본 발명에서, "예방"은 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 질환의 증상을 차단하거나, 그 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "억제"는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 상기 암 전이를 억제시키는 모든 행위를 말한다.
또한, 본 발명에서, "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것 또는 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위해 개체의 상태를 모니터링 하는 것을 포함한다. 본 발명의 목적상, 진단은 암 또는 위암의 발병 여부 또는 위암의 발병 단계를 확인하는 것이다.
또한 본 발명에서, "예후"는 의학적 귀추(예컨대, 장기 생존 가능성, 무병생존율 등)에 대한 예상을 의미하며, 양성적 예후(긍정적 예후) 또는 음성적 예후(부정적 예후)를 포함하며, 상기 음성적 예후는 재발, 종양 성장, 전이, 약 저항성 등의 병의 진행 또는 치명성(mortality)을 포함하고, 양성적 예후는 질병이 없는 상태 등의 질병의 차도, 종양 퇴행 등의 질병의 개선 또는 안정화(stabilization)를 포함한다. 본 발명의 목적상, 예후는 암 또는 위암으로 진단받은 환자의 병의 경과(병의 진행, 개선, 위암의 재발, 종양 성장, 약 저항성)를 미리 짐작하는 것이다.
또한, 본 발명에서, "치료"는 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 질환의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
한편, 이에 제한되지 않으나, 상기 질환의 예방 또는 치료 방법은 하나 이상의 질환에 대한 치료적 활성을 가지는 화합물 또는 물질을 투여하는 것을 더 포함하는 병용 요법일 수 있다.
본 발명에서 상기 "병용"은 동시, 개별 또는 순차 투여를 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 상기 투여가 순차 또는 개별적인 경우, 2차 성분 투여의 간격은 상기 병용의 이로운 효과를 잃지 않도록 하는 것이어야 한다.
본 발명에서 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사 용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항 응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 상기 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 안구에 직접 투여하거나, 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 안구에 직접 투여하는 것이 더 바람직하다.
본 발명에서 상기 "비경구"란, 안구에 직접 투여하거나, 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다. 안구에 직접 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물의 "용법 및 용량"은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 위암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)을 코딩하는 유전자는, CAST, EEF1D, HNRNPA2B1, LIG1, MARCKS, MTA2, PFAS, PNPO, REXO2, YWHAZ, HNRNPA0, TPM2, TXNDC17, ASS1, RANBP1, HAT1, CYB5B, GANAB 및 PSMD9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA를 포함하는, 위암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)은 Calpastatin, Elongation factor 1-delta, Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1, DNA ligase 1, Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate, Metastasis-associated protein MTA2, Phosphoribosylformylglycinamidine synthase, Pyridoxine-5'-phosphate oxidase, Oligoribonuclease, mitochondrial, 14-3-3 protein zeta/delta, Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A0, Tropomyosin beta chain, Thioredoxin domain-containing protein 17, Argininosuccinate synthase, Ran-specific GTPase-activating protein, Histone acetyltransferase type B catalytic subunit, Cytochrome b5 type B, Neutral alpha-glucosidase AB 및 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는, 위암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)을 코딩하는 유전자의 mRNA 수준은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RTPCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA칩 분석법(DNA chip technology assay), 메틸화된 DNA 결합 도메인 시퀀싱(MBD-seq: Methylated DNA binding domain sequencing) 분석 방법 또는 중아황산염 처리 시퀀싱(RRBS: Reduced representation bisulfite sequencing) 분석 방법에 의하여 측정되는 것인, 위암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescence-activated cell sorting analysis) 및 단백질 칩 분석법(protein chip technology assay)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 이용하여 측정되는 것인, 위암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 위암은 SEM(stem-like, epithelial-to-mesenchymal transition and mesenchymal) 하위유형(subunit) 위암인 위암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 것인, 위암 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 키트 또는 단백질 칩 키트인 것인, 위암 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 위암은 SEM(stem-like, epithelial-to-mesenchymal transition and mesenchymal) 하위유형(subunit) 위암인 위암 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, (a) 생물학적 시료에 존재하는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 측정 결과를 대조군 시료의 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 위암을 예측 및 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)을 코딩하는 유전자는, CAST, EEF1D, HNRNPA2B1, LIG1, MARCKS, MTA2, PFAS, PNPO, REXO2, YWHAZ, HNRNPA0, TPM2, TXNDC17, ASS1, RANBP1, HAT1, CYB5B, GANAB 및 PSMD9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA를 포함하는, 위암을 예측 및 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)은 Calpastatin, Elongation factor 1-delta, Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1, DNA ligase 1, Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate, Metastasis-associated protein MTA2, Phosphoribosylformylglycinamidine synthase, Pyridoxine-5'-phosphate oxidase, Oligoribonuclease, mitochondrial, 14-3-3 protein zeta/delta, Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A0, Tropomyosin beta chain, Thioredoxin domain-containing protein 17, Argininosuccinate synthase, Ran-specific GTPase-activating protein, Histone acetyltransferase type B catalytic subunit, Cytochrome b5 type B, Neutral alpha-glucosidase AB 및 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는, 위암을 예측 및 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)을 코딩하는 유전자의 mRNA 수준은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RTPCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA칩 분석법(DNA chip technology assay), 메틸화된 DNA 결합 도메인 시퀀싱(MBD-seq: Methylated DNA binding domain sequencing) 분석 방법 또는 중아황산염 처리 시퀀싱(RRBS: Reduced representation bisulfite sequencing) 분석 방법에 의하여 측정되는 것인, 위암을 예측 및 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescence-activated cell sorting analysis) 및 단백질 칩 분석법(protein chip technology assay)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 이용하여 측정되는 것인, 위암을 예측 및 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 위암은 SEM(stem-like, epithelial-to-mesenchymal transition and mesenchymal) 하위유형(subunit) 위암인, 위암을 예측 및 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 생물학적 시료에 존재하는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준을 측정하는 측정부; 상기 측정 결과를 대조군 시료의 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준과 비교하는 비교부;를 포함하는, 위암 예측 및 진단을 위한 기기를 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)을 코딩하는 유전자는, CAST, EEF1D, HNRNPA2B1, LIG1, MARCKS, MTA2, PFAS, PNPO, REXO2, YWHAZ, HNRNPA0, TPM2, TXNDC17, ASS1, RANBP1, HAT1, CYB5B, GANAB 및 PSMD9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA를 포함하는, 위암 예측 및 진단을 위한 기기를 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)은 Calpastatin, Elongation factor 1-delta, Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1, DNA ligase 1, Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate, Metastasis-associated protein MTA2, Phosphoribosylformylglycinamidine synthase, Pyridoxine-5'-phosphate oxidase, Oligoribonuclease, mitochondrial, 14-3-3 protein zeta/delta, Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A0, Tropomyosin beta chain, Thioredoxin domain-containing protein 17, Argininosuccinate synthase, Ran-specific GTPase-activating protein, Histone acetyltransferase type B catalytic subunit, Cytochrome b5 type B, Neutral alpha-glucosidase AB 및 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는, 위암 예측 및 진단을 위한 기기를 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 위암은 SEM(stem-like, epithelial-to-mesenchymal transition and mesenchymal) 하위유형(subunit) 위암인, 위암 예측 및 진단을 위한 기기를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, (a) 위암 세포에 위암 치료 후보 물질을 처리하는 단계; (b) 상기 후보 물질이 처리된 분리된 위암 세포에서 존재하는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 존재하는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준이 후보 물질이 처리되지 않은 분리된 위암 세포에 비해 낮은 수준을 나타내는 경우, 상기 후보 물질을 위암 예방 또는 치료용 제제로서 사용할 수 있을 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 위암 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)을 코딩하는 유전자는, CAST, EEF1D, HNRNPA2B1, LIG1, MARCKS, MTA2, PFAS, PNPO, REXO2, YWHAZ, HNRNPA0, TPM2, TXNDC17, ASS1, RANBP1, HAT1, CYB5B, GANAB 및 PSMD9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA를 포함하는, 위암 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)은 Calpastatin, Elongation factor 1-delta, Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1, DNA ligase 1, Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate, Metastasis-associated protein MTA2, Phosphoribosylformylglycinamidine synthase, Pyridoxine-5'-phosphate oxidase, Oligoribonuclease, mitochondrial, 14-3-3 protein zeta/delta, Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A0, Tropomyosin beta chain, Thioredoxin domain-containing protein 17, Argininosuccinate synthase, Ran-specific GTPase-activating protein, Histone acetyltransferase type B catalytic subunit, Cytochrome b5 type B, Neutral alpha-glucosidase AB 및 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는, 위암 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)을 코딩하는 유전자의 mRNA 수준은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RTPCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA칩 분석법(DNA chip technology assay), 메틸화된 DNA 결합 도메인 시퀀싱(MBD-seq: Methylated DNA binding domain sequencing) 분석 방법 또는 중아황산염 처리 시퀀싱(RRBS: Reduced representation bisulfite sequencing) 분석 방법에 의하여 측정되는 것인, 위암 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescence-activated cell sorting analysis) 및 단백질 칩 분석법(protein chip technology assay)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 이용하여 측정되는 것인, 위암 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 위암은 SEM(stem-like, epithelial-to-mesenchymal transition and mesenchymal) 하위유형(subunit) 위암인, 위암 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, EMT(Epithelial-to-mesenchymal transition)에 선택적인 약학 조성물을 유효성분으로 포함하는 위암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 EMT(Epithelial-to-mesenchymal transition)에 선택적인 약학 조성물은 Niclosamide(Niclocide), TAE684(NVP-TAE684), MLN2238, Bortezomib(Velcade), MLN9708, Carfilzomib(PR-171), Crystal violet, Cetylpyridinium Chloride, Alexidine HCl, WP1130, Pyrithione zinc, BAY 11-7082(BAY 11-7821), Dronedarone HCl(Multaq), Penfluridol, Thonzonium Bromide, LDN193189, Obatoclax mesylate(GX15-070), LY2603618(IC-83), Terfenadine, Vorinostat(SAHA), PCI-24781, AR-42(HDAC-42), Belinostat(PXD101), Trichostatin A(TSA), CUDC-101, SB939(Pracinostat), JNJ-26481585, Fenbendazole(Panacur), BKM120(NVP-BKM120), YM155, Mitoxantrone Hydrochloride, Teniposide(Vumon), Doxorubicin(Adiriamycin), Daunorubicin HCl(Daunomycin HCl), Triptolide, PIK-75, Ouabain, Topotecan HCl, Camptothecin, Gemcitabine(Gemzar), Fludarabine Phosphate(Fludara), GSK2126458, AZD77662, Torin 2, INK 128(MLN0128), BEZ235(NVP-BEZ235), Neratinib(HKI-272), AT9283, Danusertib(PHA-739358), Oxibendazole, Nocodazole, BI6727(Volasertib), BI2536, Vincristine, Vinblastine, Epothilone A, Cephalomannine, Paclitaxel(Taxol), Cabazitaxel(Jevtana), SB743921, Ispinesib(SB-715992), APO866(FK866) 중 어느 하나인 위암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 위암은 SEM(stem-like, epithelial-to-mesenchymal transition and mesenchymal) 하위유형(subunit) 위암인, 위암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
미토콘드리아의 기능이 증가되면 더 많은 ATP를 생산한다. 이와 같이 생산된 ATP는 대사, 합성, 능동 수송, 세포 신호 전달, 이동 및 세포 구조 유지와 같은 대부분의 세포 과정에서 중추적인 역할을 하는 수많은 단백질에 결합한다. 현재 알려진 ATP 결합 단백질로는 1500개의 단백질이 알려져 있는데 스트레스 조건에서는 ATP 요구가 높아져 세포가 생체 에너지적으로 손상되는 경우 ATP는 먼저 세포 적합성에 중요한 생명 기능의 단백질에 의해 사용되어야 한다. 그러므로 이러한 높은 ATP 친화성 단백질은 SEM 하위 유형 암에서 새로운 암 치료를 위한 표적이 될 수 있다.
본 발명에서는 이와 같이 세포 내의 ATP 농도가 SEM(stem-like, epithelial-to-mesenchymal transition and mesenchymal) 하위유형(subunit) 암에서 높다는 점에 착안하여 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준을 측정하여 위암의 예방 또는 치료용 제제를 효과적으로 스크리닝 할 수 있고, 위암을 예측 및 진단을 위한 정보를 제공할 수 있으며, 위암 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공하며, 위암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 효과적으로 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 실시예에 따르면 비-SEM 암에서 보다 SEM(stem-like, epithelial-to-mesenchymal transition and mesenchymal) 하위유형(subunit) 암에서 ATP-친화성 단백질의 뚜렷한 농축 프로필(profile)을 나타냄을 알 수 있었다. 결국 ATP 친화도가 높은 단백질을 표적으로 하여 세포 적합성을 위한 생체 에너지 체크포인트의 억제는 약물 내성 암에 대한 취약성을 제공할 수 있다. 결국 본원발명에 따를 때 ATP 친화성 단백질에 대한 SEM 하위 유형 암의 유전적 의존성은 게놈 분석만으로는 약학적 표적이 거의 없는, 임상적으로 불응성인 암을 선택적으로 표적화하는 새로운 치료 기회를 얻을 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 non-SEM 하위유형 세포주 보다 SEM 하위유형 위암세포주에서 ATP의 농도가 높은 것을 나타낸 것이다.
도 2는 Desthiobiotin-ATP probe로 표지한 ATP 결합단백질의 LC-MS/MS 분석 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 ATP 프로브 라벨링 프로세스(ATP probe labeling process) 중 탈염 과정에서 실험의 정확도를 위하여 탈염 전후 단백질 10ug을 품질 관리(quality control)한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 Desthiobiotin-ATP probe 표지 후 표지단백질을 확인한 것으로서 단백질 표지가 잘 수행되었음을 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 Desthiobiotin 표지단백질을 확인하기 위해 닷블랏(dot blot)한 결과로서 표지된 펩타이드가 용출됨을 확인할 결과이다.
도 6는 본 발명의 일 실시예에 따라 LC-MS/MS 크로마토그래피 결과 각 세포주 별로 단백질의 히트 수를 나타낸 것이다.
도 7은 확인한 총 1009개의 단백질을 non-SEM 하위유형 위암 세포주와 SEM 하위유형 위암 세포주에서 발견한 단백질로 분리한 벤 다이어그램을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 MAOB(monoamine oxidase B) 단백질을 타겟으로 하여 플루다라빈(Fludarabine Phosphate), 테니포시드 (Teniposide)가 EMT(Epithelial-to-mesenchymal transition)와의 상관관계를 나타낸 것이다.
도 9은 본 발명의 일 실시예에 따라 CRISPR-Cas9 생존성 실험(CRISPR-Cas9 viability screening)을 통하여 SEM 하위유형 세포주에서 선택적으로 잠재적 위암의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 될 수 있는 화학물질을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1] 각 유형별 위암 세포주의 배양
1. 위암 세포주의 배양
연세대학교 의과대학 평가위원회 (Institutional Review Board, IRB)의 승인을 얻어 모든 실험을 수행하였다. 실험 진행을 위하여 미국 세포주 은행(American Type Culture Collection; ATCC)으로부터 인간 위암 세포주인 Hs746T, MKN45, YCC7 및 YCC11을 수득하였으며, 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank)으로부터 인간 위암 세포주인 AGS, SNU216, SK4, SNU484, SNU668 및 SNU1750를 수득하여, 미국 또는 한국 세포주 은행의 가이드에 따라 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지에 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco)을 추가하여 37℃ 5% CO2 incubator(HERAcell 150i, Thermo Scientific)에서 배양하여 실험에 이용하였다.
2. non-SEM 하위유형 위암 세포주와 SEM 하위유형 위암 세포주의 준비
상기 1.과 같이 배양하여 non-SEM 하위유형 위암 세포주로는 AGS, MKN45, SNU216, YCC7을 준비하였고, SEM 하위유형 위암 세포주로는 Hs746T, SK4, SNU484, SNU668, SNU1750, YCC11을 준비하였다.
[실시예 2] non-SEM 하위유형 위암 세포주와 SEM 하위유형 위암 세포주에서 ATP의 농도 비교
1. ATP assay 진행
상기 실시예 1에서 준비한 각 유형별 위암 세포주를 이용하여 치료가 쉬운 non-SEM 하위유형 세포주(AGS부터 YCC7까지)와 난치성 SEM 하위유형(Hs746T부터 YCC11까지) 위암 세포주에서 에너지 수준 차이를 확인하고자 ATP 농도를 ATP 측정 키트(ATP determination kit, Invitrogen)를 사용하여 측정하였다. 높은 ATP 양은 난치암의 특성을 보여줄 수 있는 척도가 될 수 있다.
96웰 화이트 마이크로플레이트(SPL)에 표준곡선 생성을 위한 8개 농도의 ATP 용액과 각 세포주의 단백질 10ug을 10ul씩 분주한 뒤, 90ul의 표준 반응 용액 (standard reaction solution, Invitrogen)을 넣고 빛을 차단한 뒤 15분 동안 배양 후 luminometer(EG&G Berthold)를 사용하여 발광(luminescence)을 측정하였다.
2. 통계학적 분석
측정값에서 배경 발광(background luminescence)값을 뺀 뒤 표준곡선에 따라 수치를 정량 후 단백질 1mg의 예측 ATP 농도를 구하였다.
3. 결론
도면 상의 수치는 평균±표준오차범위(standard error of the mean; SEM)로 나타내었다. 도 1에서 보는 것과 같이, non-SEM 하위유형 세포주(AGS, MKN45, SNU216, YCC7) 보다 SEM 하위유형 위암세포주(Hs746T, SK4, SNU484, SNU668, SNU1750, YCC11)에서 ATP의 농도가 최소 5배에서 최대 10배까지 높은 것을 알 수 있었다. 이는 ATP 친화 단백질이 SEM 하위유형 암에서 암 세포의 대사과정 등에 작용하여 암 세포의 생존에 필요한 단백질임을 시사하는 것으로서 ATP 친화 단백질들이 새로운 암 치료제를 위한 타겟이 될 수 있다는 점을 시사한다.
[실시예 3] 데스티오비오틴 ATP 프로브(desthiobiotin-ATP probe)로 표지한 ATP 결합단백질의 LC-MS/MS 분석
1. 기본 원리
데스티오비오틴 ATP 프로브(desthiobiotin-ATP probe)는 ATP에 결합하는 단백질(ATP binding protein)의 포켓(pocket)에 결합하여 데스티오비오틴 ATP 프로브(desthiobiotin-ATP probe)에 존재하는 아실기(Acyl group)이 ATP에 결합하는 단백질의 Lysine 서열과 매우 근접하게 된다. 이에 ATP에 결합하는 단백질의 Lysine의 아미노 그룹(amino group)이 데스티오비오틴 ATP 프로브(desthiobiotin-ATP probe)의 아실기(Acyl group)에 친핵성 반응이 일어나고 그 결과 아마이드 결합(amide bond)가 데스티오비오틴 ATP 프로브(desthiobiotin-ATP probe)과 ATP에 결합하는 단백질 사이에 이루어진다. 그러므로 ATP에 결합하는 단백질에 공유결합된 프로브에 존재하는 태그(Tag)를 이용하여 LC-MS/MS 액채 크로마토그래피를 진행하면 ATP에 결합하는 단백질을 분류할 수 있다.
2. 구체적인 실험 방법
각 위암 세포주의 ATP 결합 단백질(ATP binding protein)을 프로파일링하기 위해 desthiobiotin이 태그된 ATP 프로브를 이용해 단백질 농축 분석(protein enrichment assay)를 진행하였다. 개략적인 시험방법은 도 2에 나타내었다.
약 5Х108개의 세포를 차가운 PBS로 2회 세척 후 Complete protease inhibitor cocktail(Roche)와 PhosSTOP phosphatase inhibitor(Roche)를 포함한 IP lysis buffer(Thermo fisher)에 용해시켰다. Cell lysate는 4℃에서 16000g로 30분 원심분리 시킨 후 상층액은 내부의 저분자물질을 제거하기 위해(desalting과정) Zeba spin column(7K MWCO, Pierce)를 사용해 gel filtration을 시켰다. 이후 Halt protease/phosphatase inhibitor cocktail(Thermo fisher)을 샘플에 추가하였다.
단백질 농도는 BCA protein assay(Pierce)로 정량 후 reaction buffer(20mM Hepes, pH 7.5, 150mM NaCl, 0.1% Triton-X-100)으로 희석해 4mg/ml을 맞췄다. 한 샘플 당 1mg의 단백질을 사용하였고, MgCl2를 추가해 상온에서 1분 동안 반응시킨 후 desthiobiotin-ATP probe 농도를 각각 5, 10, 20, 40, 80, 100uM를 사용해 상온에서 10분 동안 흔들며 단백질을 표지하였다. desthiobiotin-ATP probe 표지 후 표지 단백질의 환원과 알칼리화를 진행하였다. 10M Urea/IP lysis buffer와 500mM DTT를 추가해 65℃에서 30분 동안 반응시켰다. 그 후 상온에서 샘플을 식힌 뒤 1M iodoacetamide(IAA)를 추가 후 암실에서 30분 동안 상온에서 반응시켰다. 다음 digestion buffer(2M Urea/20mM Tris, pH8.0)로 gel filtration을 진행시킨 후 시퀀싱 그레이드 트립신을 효소/기질을 1:100 비율로 추가해서 37℃에서 오버나이트 시켜 단백질을 펩타이드로 절단시켰다. 다음 아가로오스 레진을 사용하여 표지된 펩타이드를 1시간 동안 상온에서 캡쳐하였다. 잔여 펩타이드를 제거하기 위해 순차적으로 washing buffer(25mM Tris-HCl, pH7.4, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1% NP-40, 5% glycerol), PBS와 순수 물로 세척한 후, 75ul elution buffer(50% Acetonitrile;ACN, 0.1% trifluoroacetic acid;TFA)로 세 번 용출하였다. 그 뒤 펩타이드 용출액을 Speed Vacuum system(Savant Instruments Inc.)을 이용해 건조시킨 후 50ul의 1% TFA에 녹인 후 LC-MS/MS(Liquid chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry)를 수행했다. 데이터베이스 서치는 LC-MS/MS로 읽은 펩타이드 서열을 mascot 알고리즘(Matrixscience, USA)을 통해 현존 프로틴 서열 데이터베이스를 사용하였으며 각 변수는 ①분류학; 호모 사피엔스, ②fixed modification; 시스테인 잔기의 carbamidomethylation, ③variable modification; 메티오닌 잔기의 oxidation과 라이신 잔기의 desthiobiotinylation, ④최대 허용 missed cleavage; 2개, ⑤MS tolerance; 100ppm과 ⑥MS/MS tolerance; 0.Da를 적용시켜 단백질 식별을 하였다.
desthiobiotin-ATP probe를 이용하여 LC-MS/MS를 한 결과 세포주 별로 ATP 결합 단백질의 종류와 개수를 확인하였다.
3. 세 번의 샘플 품질 관리(quality control)
①Zeba spin column(7K MWCO, Pierce)를 사용해 gel filtration을 시킨 후 ATP 제거 여부를 확인하기 위해 ATP 측정 키트(Invitrogen)를 사용하여 ATP 농도를 측정하였다. 96웰 화이트 마이크로플레이트(SPL)에 desalting 전과 후의 단백질을 10ul씩 분주한 뒤, 90ul의 standard reaction solution(Invitrogen)을 넣고 빛을 차단한 뒤 15분 동안 배양 후 luminometer(EG&G Berthold)를 사용하여 발광(luminescence)을 측정하였다. 이때, 측정값에서 배경 발광(background luminescence)값을 뺀 뒤 desalting 전후의 발광도 차이를 비교하여 도 3에 나타내었다. 그 결과 발광도를 비교하였을 때 desalting 후 ATP가 제거됨을 확인할 수 있었다.
②desthiobiotin-ATP probe 표지단백질을 확인하기 위해 probe 표지 후 단백질 20ug을 로딩하여 웨스턴블랏을 수행하였다. HRP가 컨쥬게이트된 streptavidin 항체를 1:40000 비율로 2% BSA가 포함된 TBS-0.05% Tween 20에 희석하여 상온에서 1시간 반응시킨 후 ECL 용액(Thermo fisher)을 분주해 Chemi-luminescent Image Analyzer(LAS4000, Fujifilm)을 이용하여 디택션하여 도 4에 나타내었다. 이를 통해 probe 농도가 높아질수록 웨스턴블랏 밴드의 시그널 강도가 높아져 단백질 표지가 잘 수행되었음을 확인할 수 있었다.
③desthiobiotin 표지 단백질을 트립신으로 digestion후 아가로오스 레진을 이용해 캡쳐한 표지펩타이드를 확인하기 위해 닷블랏(dot blot)을 수행하였다.
표지펩타이드 용출액 2ul를 나이트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane, Amersham)에 분주하여 1시간 동안 상온에서 건조시킨 뒤 HRP가 컨주게이트된 streptavidin 항체를 1:20000 비율로 2% BSA가 포함된 TBS-0.05% Tween 20에 희석하여 상온에서 1시간 반응시킨 후 ECL 용액(Thermo fisher)을 분주해 X-ray 필름을 이용하여 디택션하여 도 5에 나타내었다. 이를 통해 probe 농도가 높아질수록 닷블랏 점의 시그널이 증가하는 것으로 보아 표지된 펩타이드가 용출됨을 확인할 수 있었다.
4. 결론
그 결과 도 6에서 보는 것과 같이 non-SEM 하위유형 위암 세포주와 SEM 하위유형 위암 세포주에서 각각 다양한 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)들을 획득할 수 있었고 그 구체적인 단백질의 종류는 아래 표 1에 표시하였다.
총 1009개의 단백질을 확인할 수 있었으며 각 세포주에서 확인한 단백질을 분석하여 도 7에 벤 다이어그램으로 표시하였다. 총 1009개의 단백질 중 non-SEM 하위유형 위암 세포주에서 확인한 단백질은 631개이고 SEM 하위유형 위암 세포주에서 확인한 단백질은 857개였다. 그 중 non-SEM 하위유형과 SEM 하위유형 위암 세포주에서 공통적으로 확인된 단백질은 479개였다.
Non-SEM subunit 위암 세포주(631개)
CA2,CHEK1,COPS3,CPS1,CSRP1,CYP4F11,DCAF1,DLD,EIF3G,ETFB,FAM83C,FASTK,FKBP10,G6PD,GATB,GCLC,GSR,H2AC4,HINT1,HNRNPA0,HNRNPA1L2,HNRNPA2B1,HSP90AA5P,HSPA4,IQSEC2,ITGA4,ITPRIP,KIF23,KYNU,LIG1,MAP3K2,MARK3,MDH2,MSH2,MTMR12,MYH7B,MYOF,NEK7,NQO1,NSUN2,NUDT1,NUP205,OGDH,OR56A4,PAPSS1,PBRM1,PC,PDCD6IP,PDIA6,PDPK1,PFAS,PFKP,PGM2L1,PHKG2,PIKFYVE,PPA1,PRAMEF14,PRDX6,PRKCD,PRKDC,PROCR,PSMD1,PSMD9,PTMA,PTPN21,RAN,RIMS2,ROCK1,RPL29,RRBP1,RRP36,RRS1,SAMD9,SCCPDH,SEC61A1,SF3B6,SGTA,SLC9A3R1,SNCA,SPAG5,SUB1,SUCLA2,TBCD,TMEM232,TOR1B,TP53RK,TPD52,TPM2,TPM4,TRBV11-2,UCHL1,VKORC1,VPS29,ACAP3,AHNAK,AHNAK2,ALDOC,ARHGAP12,ARPP21,ATP5IF1,CACYBP,CCDC68,DICER1,DTD2,ECI1,ERCC5,HEATR1,ITGB1,LASP1,MAP3K8,MARCKS,MRGBP,OR4K15,POGK,PSMA7,SDHAF4,SERBP1,SNX6,SYNE1,TIAM2,TMSB4X,TPD52L2,UBE2I,YWHAQ,ZRANB1
SEM 서브유닛 위암 세포주(857개)
1,XRCC6,XRN2,YARS1,YBX1,YBX3,YWHAB,YWHAE,YWHAZ,ZDHHC8,ZNF106,ZNF212,ZNF347,ZNF418,ZNF630
[실시예 4] ATP 결합 단백질들의 유전적 의존성 확인 - Depmap 분석
1. 기본 원리
상기 실시예 3에서 획득한 non-SEM 하위유형 위암 세포주와 SEM 하위유형 위암 세포주의 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)을 통하여 해당 단백질을 코딩하는 유전자들을 확인하기 위해서 Depmap에서 유전적 의존성을 확인하였다. Depmap은 MIT/Harvard의 Broad institute(https://depmap.org/portal/)에서 접속이 가능하며, 해당 사이트에서는 유전자 가위인 CRISPR-Cas9을 이용한 넉아웃(knockout) 스크리닝을 통하여 어떤 유전자가 생존에 필수적인지 알 수 있다. 의존성 점수(dependency score)가 낮을수록 해당 유전자가 해당 세포주에서 생존에 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다
2. 전체 세포주의 유전적 의존성 분석
DepMap score를 -0.5 기준으로 삼아, -0.5이하의 유전자를 유전적 의존성이 높아 치료표적이 될 수 있는 유전자로 선택하였다. DepMap 데이터베이스에서 가용 가능한 non-SEM 하위유형 세포주인 AGS, MKN45, SNU216과 SEM 하위유형 세포주인 Hs746T와 SNU668의 DepMap score를 얻은 후, non-SEM 세포주는 모두 -0.5 이상인 유전자와 SEM 세포주는 한 세포주에서 -0.5 이하인 유전자를 추출하여 총 25개 유전자를 찾았다.
2. GES-1(normal gastric cell)과 중복값 제거
Depmap에서 일반 위 세포의 치료독성(normal toxicity filter)을 제거하기 위해 일반 위 세포(GES-1)에서 중복되는 유전자 GART, GPI, HSPA8, PI4KB, PSME2, UBQLN1을 제외하고 총 19개의 SEM 하위유형 암의 진단, 예방 및 치료에 타겟이 될 수 있는 유전자들을 분석하였는데 해당 19개의 유전자를 각 세포주 별로 의존성 점수(dependency score)로 아래 표 2에 나타내었고, 표 3에는 해당 유전자가 발현하는 단백질을 기재하였다.
Gene Cell line
Non-SEM 하위유형 세포주 SEM 하위유형 세포주
AGS MKN45 SNU216 HS746T SNU668
ASS1 -0.42544 -0.12717 -0.49589 -0.33269 -0.61997
RANBP1 -0.42024 -0.25317 -0.32304 -0.40195 -0.56543
HAT1 -0.12042 -0.19767 0.03069 -0.03981 -0.55673
CYB5B -0.14665 -0.07314 -0.13083 -0.51927 -0.38912
GANAB -0.40079 -0.37345 -0.40021 -0.05349 -0.50057
CAST -0.19854 -0.30569 -0.25432 -0.44698 -0.53813
EEF1D -0.31564 -0.17606 -0.21115 -0.09485 -0.60652
LIG1 -0.38159 -0.42532 -0.05163 -0.40179 -0.5706
PFAS -0.14391 -0.44756 -0.25214 -0.32370 -0.68244
PSMD9 -0.39316 -0.40107 -0.37932 -0.50605 -0.56145
MTA2 0.30066 -0.23785 -0.23793 -0.56731 -0.58012
MARCKS -0.22396 -0.42313 0.09197 -0.21598 -0.50902
REXO2 -0.29240 -0.19861 -0.2944 -0.40980 -0.51803
TPM2 -0.48756 -0.46425 -0.4334 -0.54367 -0.33900
YWHAZ -0.09929 -0.23304 -0.43824 -0.44870 -0.52129
PNPO -0.16640 -0.16875 -0.17748 0.04405 -0.59051
HNRNPA2B1 -0.03189 -0.39877 -0.19111 -0.98767 -0.92858
TXNDC17 -0.24125 -0.31647 -0.29967 -0.98732 -0.28553
HNRNPA0 -0.11053 -0.45805 -0.28298 -0.71579 -0.20778
Genename Entry Protein name
1 CAST P20810 Calpastatin
2 EEF1D P29692 Elongation factor 1-delta
3 HNRNPA2B1 P22626 Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1
4 LIG1 P18858 DNA ligase 1
5 MARCKS P29966 Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate
6 MTA2 O94776 Metastasis-associated protein MTA2
7 PFAS O15067 Phosphoribosylformylglycinamidine synthase
8 PNPO Q9NVS9 Pyridoxine-5'-phosphate oxidase
9 REXO2 Q9Y3B8 Oligoribonuclease, mitochondrial
10 YWHAZ P63104 14-3-3 protein zeta/delta
11 HNRNPA0 Q13151 Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A0
12 TPM2 P07951 Tropomyosin beta chain
13 TXNDC17 Q9BRA2 Thioredoxin domain-containing protein 17
14 ASS1 P00966 Argininosuccinate synthase
15 RANBP1 P43487 Ran-specific GTPase-activating protein
16 HAT1 O14929 Histone acetyltransferase type B catalytic subunit
17 CYB5B O43169 Cytochrome b5 type B
18 GANAB Q14697 Neutral alpha-glucosidase AB
19 PSMD9 O00233 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 9
3. CRISPR/Cas9 실험 결과에 따른 상관관계 검토
Depmap에서 이미 데이터베이스화 되어 있는 CRISPR/Cas9 실험(CRISPR/Cas9 Viability Screen) 결과를 이용하여 in silico로 MAOB(monoamine oxidase B) 단백질을 타겟으로 하여 특히 플루다라빈(Fludarabine Phosphate), 테니포시드 (Teniposide)와 EMT(Epithelial-to-mesenchymal transition)과의 상관관계를 도 8에 나타내었다.
4. 62종의 SEM에 선택적인 위암 진단, 예방 및 치료 물질 스크리닝
FDA 승인 소분자 약리학적 화합물(#L1300) 및 연구용 항암 화합물(#L2000)은 Selleckchem에서 구입하여 DMSO에 10mM 용액으로 준비하였다. 상기 7개의 EMT 위암 세포주의 세포 생존율을 테스트한 화합물은 총 1,345개이다.
세포 기반 약물 분석(Cell-based drug assay)을 위해 배양된 세포를 웰당 5X103 세포로 96웰 백색 광학 플레이트(Corning)에 접종하였다. 접종 후 24시간 후, DMSO에 포함된 약리학적 화합물의 2.5mM(1차 스크린) 또는 half-log 12-serial 희석액(2차 스크린)을 BioMek FXp 액체 처리기(Beckman)를 사용하여 로봇으로 세포에 추가하여, 50mM에서 0.5nM 범위의 최종 약물 농도 및 DMSO 대조군(0.5%)을 산출하였다. 이어서 CellTiter-Glo 분석 키트(Promega)를 사용하여 세포 생존력을 측정하기 전에 세포를 72시간 동안 5% CO 인큐베이터에서 37℃에서 추가로 인큐베이션하였다. 플레이트 스태커가 장착된 SpectraMax Paradigm 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 실온에서 15분 인큐베이션 후 발광성을 측정하였다. DMSO 대조군에 대해 정규화된 생존력(Viability)을 측정하여 각 약리학적 화합물에 대한 세포주 특이적 12-포인트 용량-반응 곡선을 생성한 다음 사다리꼴 방법을 사용하여 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하였다. AUC(average area under the viability curve)는 약물에 대한 높은 세포주 민감성을 나타내는 값이다. 중복 실험의 결과를 평균하여 각 화합물에 대한 세포주별 AUC 값을 생성하였다. 그 결과를 도 9 및 표 4 내지 표 12에 나타내었다.
AZD7762 Cabazitaxel (Jevtana) Danusertib (PHA-739358) INK 128 (MLN0128) MLN9708 PCI-24781 TAE684 (NVP-TAE684)
SK4 -0.96959 -0.72984 -0.66774 -2.93099 0.40776 0.45102 -0.65724
SNU668 1.53671 0.4109 1.04925 1.08497 1.23248 0.52999 1.00892
SNU484 0 -0.72784 -1.53715 -1.08939 -1.06877 0.15333 -0.61817
SNU1750 -0.9031 0.60578 -2.3091 -1.07908 -2.16067 -1.49924 -0.94102
YCC11 -0.97566 -1.18917 -1.35668 -2.64831 -1.82448 -0.09531 -1.4836
MKN1 -0.01906 -1.26587 -0.8271 -0.74437 0.06734 0.65806 0
Hs746T 1.37623 1.08466 1.56452 -1.82054 -1.54738 -0.03183 1.03945
AGS -0.44033 -2.20138 -1.03361 -1.24411 -0.69884 -1.16146 -1.32629
SNU638 1.40403 -0.1608 -0.21452 0.23868 0.0059 -0.06055 0.40708
SNU719 3.77086 6.20873 3.93493 3.8255 1.30434 1.42811 1.05145
NCC24 1.10699 -1.07721 0.98786 0.75018 -0.90855 -0.27657 1.66186
NCC20 -0.41669 -0.85509 -4.08194 -2.56833 -1.52705 -1.06517 -2.65881
SNU1967 -0.36261 1.22763 0.03541 -0.47275 -1.55646 -1.12621 -1.41193
MKN45 -0.3384 2.13796 2.10321 -0.59353 0.25811 2.25891 2.60112
MKN74 -0.47726 0.43188 0.13208 -0.48826 -0.40082 0.21277 -0.04126
MKN28 -0.31308 -2.21296 1.24506 1.19513 0.1368 -0.37804 -0.41772
YCC3 1.63754 3.38425 0.79491 0.85345 2.71673 0.84261 1.70841
YCC2 0.45099 0.20727 -0.99006 0 0.33774 0.00064 -0.55122
NCI_N87 0.84046 -1.71241 2.12232 0.70815 1.9321 -0.38027 2.00312
NCC19 2.79573 0 1.88453 0.30218 -0.79134 0.32816 1.94362
SNU1 -0.20255 -3.45074 -2.27449 1.28142 0.02493 0.34291 -0.11849
SNU620 0.22575 -3.50061 -2.61551 0.08832 -0.70355 -0.69661 0.46365
NCC59 2.10683 3.93854 1.63173 1.54134 -0.34722 0.97658 1.27316
KATO3 2.89068 4.94965 -0.30456 1.63301 0.55904 -0.21112 0.26725
SNU16 -1.11884 -2.75865 -3.76037 -0.87335 -2.25873 -1.23299 -3.18034
SNU601 -0.95704 -1.68818 2.87723 1.34567 0 0.61406 1.06167
FU97 -0.7616 0.30606 -2.48769 -2.85716 -1.56756 -1.78622 -1.58701
OCUM1 0.51097 3.08628 0.87419 0.03105 2.09708 0 -0.21947
SNU216 0.70035 2.33498 0 -0.90819 0.14158 0.03042 0.52052
BAY 11-7082 (BAY 11-7821) Camptothecin Daunorubicin HCl (Daunomycin HCl) Fludarabine Phosphate (Fludara) Ispinesib (SB-715992) Neratinib (HKI-272) Penfluridol
SK4 -0.76588 -0.88232 0 -1.65271 -0.82668 -1.28205 -0.50755
SNU668 0.8081 -1.20186 -0.91418 -1.51064 0.10008 0.8456 0.00275
SNU484 -0.45038 1.04736 -1.29932 1.30916 -0.95095 -1.2895 -0.39575
SNU1750 -1.01204 0.02348 -0.77953 1.97191 0.22654 -0.41235 -0.03209
YCC11 -1.53808 -0.57179 -1.74218 -0.64169 -1.38089 -1.33339 -0.51645
MKN1 -0.32482 -0.64196 -0.28772 0.97476 -1.17815 -0.49849 -0.01646
Hs746T -0.5796 0.3026 0.14844 1.97034 1.04625 -0.22041 0.28215
AGS -0.5085 -1.98865 -1.2278 -2.78252 -2.13137 -0.93145 -0.69168
SNU638 -1.49699 -0.93655 -1.22938 0.50061 -0.20302 0 -1.32035
SNU719 1.37741 3.07877 3.41631 2.04643 2.54219 1.89357 0.3303
NCC24 0.83571 0.52733 -0.88006 1.03684 -0.83483 1.20488 0.50232
NCC20 -0.82871 -1.82853 -0.77365 -2.50704 -0.99388 -1.6785 -0.84708
SNU1967 -0.80276 -1.85951 -1.48144 2.18583 1.56163 0.83812 -0.08879
MKN45 0.19396 0.12032 2.94926 -1.02931 1.83317 3.02852 0.9981
MKN74 0.03633 -0.08807 1.21514 -0.17305 0 -1.14443 -1.13276
MKN28 -0.19868 0.38815 2.14551 0.00328 -1.95588 0.18644 -0.60969
YCC3 0.71162 1.3493 2.69895 0 2.00727 0.30133 0.4477
YCC2 0 0 1.12717 -0.7765 0.79868 -0.17485 -0.07658
NCI_N87 0.50726 0.72611 4.5372 -0.06169 -0.0052 -5.05094 0.3682
NCC19 -0.07527 0.98541 0.93573 2.41081 1.11079 2.05245 0.62388
SNU1 1.33024 -2.18172 -0.76053 -0.76442 -1.68 1.03788 0.84791
SNU620 -0.19225 -1.86656 -1.23899 -2.28897 -1.25459 1.11678 0.04726
NCC59 1.03064 1.20816 -0.51608 1.47865 2.6543 1.9785 0.34391
KATO3 0.72294 4.76878 6.28841 1.16487 2.99855 1.50538 0
SNU16 -0.67151 -1.52878 -1.06545 -0.43997 -1.93529 -1.491 -1.2587
SNU601 0.72182 -1.85259 1.20701 -0.5439 -1.37063 0.80204 0.67479
FU97 0.0931 1.09653 0.39653 2.92809 1.3405 -0.2016 0.09295
OCUM1 0.74911 -0.50334 0.70658 -0.39673 1.29694 1.05627 0.2066
SNU216 0.38649 1.3094 0.45068 1.77139 1.80082 -2.1011 -0.50693
Teniposide (Vumon) Vinblastine Alexidine HCl Belinostat (PXD101) Carfilzomib (PR-171) Doxorubicin (Adriamycin) JNJ-26481585
SK4 -0.2681 -1.0813 -0.90233 -0.3048 -0.24149 0.21297 -0.32583
SNU668 -0.61746 -1.03703 -0.13749 0.69077 1.89863 -0.39086 1.48608
SNU484 -1.21094 -1.19408 -1.21174 0.99658 -0.76023 -0.84178 0
SNU1750 -0.56177 0.64969 -0.63305 -0.90196 -0.9787 -0.95764 -0.85964
YCC11 -1.34153 -0.61594 -1.34704 -0.55558 -0.76069 -1.87689 0.08841
MKN1 -1.95464 -0.9285 0.86874 0.9981 0.17712 -0.20162 0.55802
Hs746T 0.62607 1.1779 -0.25966 0.55979 -1.39924 -0.08449 0.29058
AGS -2.04166 -1.12929 -0.44398 -0.93715 -0.13102 -1.08077 -1.07273
SNU638 -0.35845 0.26525 -0.61203 -0.50115 0.14636 -0.33421 0.1995
SNU719 2.89859 4.16203 1.19955 2.32905 0.51783 4.66047 3.52667
NCC24 -0.57665 -0.9438 -0.47448 -1.09498 -0.8995 -0.61259 -1.59203
NCC20 -0.87155 -1.61429 0.69634 0 -2.00228 -0.48795 -1.39619
SNU1967 -0.7519 -0.94114 0.18277 -0.31218 -0.55865 -0.87867 -1.0365
MKN45 1.93269 1.84439 0.04553 2.49342 0.55529 2.50486 2.74332
MKN74 0.39926 0.66387 -0.34328 -0.18352 -0.31622 1.52242 -0.06428
MKN28 0.10085 -0.818 0 -0.39525 -0.70651 2.97966 -0.53115
YCC3 2.1949 4.54047 0.82726 1.06489 1.74674 2.8776 0.35609
YCC2 0.24899 2.05959 -0.00823 0.17063 0.85339 1.4121 -0.10178
NCI_N87 2.31934 -0.17212 2.53075 0.02343 0.50977 6.89113 -0.26494
NCC19 2.41523 2.90508 1.13183 1.20567 1.56176 2.86662 0.39122
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SNU620 0 -0.49087 0.0423 -1.0681 -0.42418 -0.20094 -1.2467
NCC59 1.58987 2.83336 1.33415 2.68319 0.85921 1.23071 3.68716
KATO3 1.85247 4.09597 0.541 0.75442 0.10045 7.9338 0.34816
SNU16 -0.81923 -1.30003 -1.84911 -1.57712 -1.3183 -0.0398 -0.78834
SNU601 -1.09439 0 1.89809 1.49489 1.48888 4.48116 1.50128
FU97 1.30852 0.37717 -0.9535 -0.97262 -0.16869 -1.23746 -0.63245
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SNU216 0.92958 2.53865 0.03777 -0.2541 0 0.74663 0.34242
Niclosamide (Niclocide) Terfenadine Vincristine APO866 (FK866) BEZ235 (NVP-BEZ235) Cephalomannine Dronedarone HCl (Multaq)
SK4 -1.03768 -0.87128 -1.28286 0.74033 -3.14195 -1.14434 -0.34878
SNU668 -0.90838 -0.56472 -1.31484 -3.30444 1.25801 -0.19115 0.41227
SNU484 -1.16377 0.06057 -1.96535 -6.82326 0 -0.7051 -0.24967
SNU1750 -0.89874 -0.05758 0 -3.76719 -1.12874 1.00866 0.06657
YCC11 -0.87526 -0.99605 -1.41982 -2.21518 -2.69815 -1.01251 -0.52095
MKN1 0.39914 -0.81275 -1.53038 -5.50199 -0.84497 -1.48574 0
Hs746T -0.68585 -0.32462 1.04359 -4.38171 -0.9926 0.44895 -0.03562
AGS -1.09355 -1.27816 -1.75048 0 -1.76804 -2.05472 -0.64154
SNU638 -1.10519 -0.80908 0.13479 0.60324 0.89791 -0.03958 -0.56488
SNU719 2.50346 1.05885 5.03615 1.27532 5.11866 4.89284 1.29094
NCC24 0.67997 -2.35459 -3.15623 -0.07585 0.08486 -0.77162 1.04449
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SNU1967 0.14186 -1.06535 -1.3653 -3.65274 -0.16999 0.65249 0.19188
MKN45 1.15938 -0.54412 2.22568 0.61912 1.88682 0 0.67723
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MKN28 -0.38089 -0.29012 -0.49305 -6.85466 2.00741 -1.69739 -0.1927
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YCC2 0.66277 0.48617 2.29757 1.33071 0.64029 0.38382 -0.08246
NCI_N87 2.80165 1.46517 1.61472 0.83429 0.75054 -1.25982 -0.08952
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SNU1 -1.67279 1.33992 -0.5253 0.97263 -1.12835 -2.05619 1.29453
SNU620 0.85178 0.49182 -0.37923 0.34879 -0.68933 -2.40264 -0.33527
NCC59 1.14057 2.3563 3.84746 0.79188 2.99705 2.73396 0.67691
KATO3 1.59054 0.49008 4.8981 1.55328 2.71695 4.17856 0.17208
SNU16 -3.06247 0 -1.52206 -4.56166 -0.98587 -1.73683 -0.21488
SNU601 4.91115 2.64114 0.93811 4.97639 2.66043 0.2225 3.84768
FU97 -1.79266 1.16326 -1.11525 -3.14919 -2.38238 0.41071 0.38071
OCUM1 0 1.03176 0.65483 0.94898 -0.37194 1.3887 0.02571
SNU216 -0.51854 1.49883 1.75519 -5.89656 -0.63506 1.8612 0.08211
Nocodazole PIK-75 Thonzonium Bromide Vorinostat (SAHA) AR-42 (HDAC-42) BI 2536 Cetylpyridinium Chloride
SK4 -0.37398 -1.00916 -1.03277 0.64343 -0.36166 -1.12752 -1.31206
SNU668 -0.1188 -0.42799 0.31512 0.43033 0.25146 -0.42108 -0.02952
SNU484 -0.81362 -0.94692 -0.90815 1.04054 0.12698 0 -0.74014
SNU1750 0.75023 0 0.06729 -0.57367 -1.40057 -0.80762 -0.36132
YCC11 -0.82792 -0.5398 -0.8304 -0.22846 -0.3298 -0.38175 -1.12912
MKN1 -0.65187 -0.03458 -0.24138 0.42818 0.9532 -0.21226 0.99937
Hs746T 1.27996 0.1171 0 -0.04774 0.3259 1.95082 0.2943
AGS -1.57279 -1.2576 -0.41051 -0.59466 -1.18563 -1.21971 -0.10439
SNU638 -0.18754 1.31203 -0.4973 -0.43133 -0.78036 0.18629 -0.31422
SNU719 4.97609 5.72582 1.90015 1.84324 2.16929 3.29061 1.71819
NCC24 0 -0.07825 -0.24645 -0.34214 -0.62174 -0.88322 0.06564
NCC20 -1.69461 -0.49134 -0.60416 -0.93283 0.06736 0.57219 -0.23178
SNU1967 -0.07292 -0.30481 0.01501 -0.25741 -0.91371 0.0237 -0.50013
MKN45 2.00497 1.16958 0.12127 2.41555 1.96173 0.09661 0
MKN74 0.70808 0.20524 -0.99665 -0.07666 0.17888 -0.6584 -0.41764
MKN28 -0.14781 0.05865 0.07021 -0.08142 0.07777 -1.69041 0.48765
YCC3 3.06603 1.72349 0.61631 1.03355 0.68754 3.31495 0.39005
YCC2 1.3363 1.28946 -0.42546 0.09328 -0.00569 -0.18755 0.14211
NCI_N87 -0.78432 -0.12381 0.41496 0.89861 -0.13445 -1.00571 1.07471
NCC19 0.87171 0.35347 0.29949 0.2993 1.02553 3.47544 1.20462
SNU1 -0.72421 -0.33973 1.47807 -0.21515 -0.31471 -1.06385 0.51714
SNU620 -0.73499 0.78819 -0.24037 0.08594 -1.19727 -1.07787 0.09525
NCC59 3.0345 -0.15646 0.60964 1.00996 2.10183 3.55559 1.49737
KATO3 3.18806 3.79267 -0.12702 0 0.73241 4.70426 1.07164
SNU16 -1.50716 -1.48525 -0.91283 -0.78753 -1.42669 0.02031 -0.15341
SNU601 1.74275 1.99904 2.22763 2.84015 1.87435 0.0215 2.32847
FU97 0.37972 -0.52672 -0.03008 0.29755 -1.35793 -0.4841 -2.03913
OCUM1 0.72477 0.51054 0.22087 -0.51657 -0.39363 2.22645 -0.14407
SNU216 2.03227 0.8132 0.27372 -0.04999 0 2.03806 -0.14827
Gemcitabine (Gemzar) LDN193189 Obatoclax mesylate (GX15-070) Topotecan HCl WP1130 AT9283 BI6727 (Volasertib)
SK4 -0.87645 -0.53392 -1.53083 -0.45152 -0.08364 -0.4441 -0.92628
SNU668 -1.31169 0.06394 -0.27152 -1.12816 0.16066 0.69683 0.15164
SNU484 -0.27565 -0.59991 -1.40038 1.12806 -0.89708 -1.87241 -0.03282
SNU1750 0 -0.46954 -0.87205 0.28185 -0.86017 -1.7502 -0.59616
YCC11 -1.64941 -0.73587 -0.84068 -0.57299 -0.21436 -1.46744 -0.79966
MKN1 -0.91691 0 0.78568 -0.99541 -0.42644 -2.315 -0.16202
Hs746T 1.70982 -0.29542 0 0.45868 -0.37378 0.9084 2.37838
AGS -2.36417 -0.18957 -0.90049 -2.15921 -0.69975 -0.93026 -1.0975
SNU638 -2.40365 -0.96995 -0.50945 -0.71325 -0.34846 0.01142 0.36259
SNU719 3.62772 0.60431 2.58471 3.06861 1.24502 3.01867 3.74048
NCC24 -1.10009 -0.14638 0.25109 0.0033 0.34748 -0.6909 -0.95023
NCC20 -0.90889 0.02059 -0.98675 -2.36704 -0.82472 -2.94101 0.55942
SNU1967 -4.70451 -1.41897 -0.40934 -2.64781 -0.71953 -0.12444 -0.16446
MKN45 1.05269 0.95163 0.93127 1.19453 1.02413 -0.19963 0.58753
MKN74 -1.40168 -1.24585 -1.05119 0 -0.19079 0.4728 -0.01134
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YCC2 0.11113 0.11632 -0.59155 0.1906 0.94002 0.07527 -0.09826
NCI_N87 1.32966 1.17156 0.63597 2.85714 2.15893 0.1418 -0.39292
NCC19 1.69737 0.06094 1.60427 2.89621 1.37612 2.24675 3.25648
SNU1 -0.33667 0.87058 0.52379 -0.61631 1.52716 -3.74346 -0.48702
SNU620 -1.63964 -2.13071 0.81287 -0.76112 1.33608 -4.05927 -0.40977
NCC59 3.02402 1.89232 2.5912 1.95697 0.75884 0.58817 3.19822
KATO3 4.1466 0.62048 1.38324 5.01014 1.45416 0.5115 3.3921
SNU16 0.51403 1.52496 1.84075 -0.52924 0 -3.80867 0
SNU601 0.24712 3.69936 2.79142 -0.55889 3.23969 1.64753 0.47568
FU97 1.88834 -0.14339 -1.5029 -0.84454 -0.7929 0.19243 0.30776
OCUM1 -1.40169 -1.11321 0.13024 -1.68063 -0.65197 0 2.40542
SNU216 1.83738 -0.78382 -0.13978 1.12337 0.11013 0.53227 1.86845
Epothilone A LY2603618 (IC-83) Ouabain Pyrithione zinc Torin 2 YM155 BKM120 (NVP-BKM120)
SK4 -0.95406 -1.69816 -1.41445 0 -2.72175 -1.31438 -1.24718
SNU668 -0.29093 0.17133 -1.02595 0.76814 0.43911 -0.2961 0.26885
SNU484 -0.43639 0.31413 -2.02983 -0.92867 -0.505 -2.55976 -0.47501
SNU1750 1.03899 -0.4819 -0.73744 0.10112 -0.78704 -2.62448 -0.43924
YCC11 -1.2702 -2.02695 -0.34942 -1.33727 -2.29864 -1.41945 -1.14691
MKN1 -1.13987 -1.02259 -1.22288 -0.49131 -1.57382 -2.0115 -0.18271
Hs746T 1.21714 -0.10702 0.30933 -0.54101 -0.75813 -1.37593 0
AGS -1.65509 -0.3593 -0.43512 -0.93555 -1.70136 -1.51172 -1.09389
SNU638 0.31182 -0.05048 1.054 -0.08685 0.3739 0.50985 0.01503
SNU719 4.48401 2.40356 5.03822 1.54675 3.84089 3.78941 3.31384
NCC24 -1.8431 -1.44478 -0.24166 -0.30898 0 -0.6903 -0.43906
NCC20 -0.54593 0.01673 0.23646 -0.78379 -1.59762 0 -0.07502
SNU1967 0.64772 -0.96158 0.98734 -0.50269 -0.55703 -0.20436 0.67599
MKN45 0.66045 -0.94724 -0.36649 -1.0871 0.67038 0.67918 1.07422
MKN74 0.29134 -0.90838 -0.94721 -1.14856 -0.18682 -1.30495 -0.05182
MKN28 -1.4393 -0.1902 -0.51826 0.14213 0.8861 -1.02102 -0.0925
YCC3 2.8742 0.23046 4.20868 0.65119 1.39941 1.32464 1.08466
YCC2 0.17839 0.04045 -0.67849 -0.08387 -0.06527 -0.42281 0.71694
NCI_N87 -1.50992 0.87711 0.91918 1.16121 0.30783 0.41677 -0.38005
NCC19 0 1.2209 0.38743 0.73363 1.61395 3.60768 0.68658
SNU1 -1.74991 -0.33995 -0.4741 1.43099 1.39165 1.21155 0.25564
SNU620 -2.26821 0 0 -0.78173 0.39651 1.29004 -0.08823
NCC59 3.58289 0.93261 1.56721 0.72882 1.58432 0.13858 1.23031
KATO3 4.76147 1.25634 4.78341 0.82189 2.65978 -0.30807 2.44864
SNU16 -1.12023 1.46675 2.22926 1.28045 0.9803 2.49675 -0.30757
SNU601 -0.20062 0.2367 2.70192 2.66622 0.41036 1.66053 0.97107
FU97 0.94544 0.71107 -0.38887 0.33441 -1.52612 1.30071 -1.3007
OCUM1 1.69909 -0.68305 0.11126 0.53552 -0.11271 1.68528 0.75609
SNU216 2.40328 0.24621 0.20093 -0.22721 -0.49637 0.09958 0.13416
Crystal violet Fenbendazole (Panacur) GSK2126458 Mitoxantrone Hydrochloride Oxibendazole SB 743921 Trichostatin A (TSA)
SK4 -1.01459 -0.29532 -2.46578 -0.61266 -0.14145 -0.97693 0.78971
SNU668 0.19369 0 1.58711 -0.65807 -0.36382 0 0.13439
SNU484 -0.71083 -0.08111 0.46406 -1.15828 -0.00299 -1.3076 0.45152
SNU1750 -0.55145 0.25963 -0.50708 -0.35869 0.4952 0.00014 -1.0771
YCC11 -0.89961 -0.73051 -1.37286 -1.25152 -0.29015 -1.35302 -0.26947
MKN1 0.42106 -0.0568 -1.1278 -1.19659 -0.58595 -1.40636 0.42233
Hs746T -0.20848 0.57281 -0.063 0.59247 1.20383 1.35856 0.66212
AGS -0.47692 -1.15953 -2.28613 -1.67098 -1.06391 -2.36598 -1.13749
SNU638 -0.49565 -0.36892 0.9531 -1.05993 -0.28076 -0.25718 -0.27578
SNU719 3.07583 3.38225 5.21129 3.64711 3.17002 2.11498 1.88329
NCC24 0.27433 -0.84877 -1.19745 -1.03812 -1.131 -2.23809 -1.30687
NCC20 -1.03062 -0.5211 -1.10669 -0.74225 -0.74664 -1.28847 -1.84165
SNU1967 0.34585 0.18401 1.04368 -1.34228 0 0.85722 -1.47245
MKN45 1.10103 1.40735 0.05353 2.014 2.18686 2.81808 2.21517
MKN74 -0.57212 -0.28025 0 -0.29145 0.44981 0.00599 0.30048
MKN28 0 -0.78769 0.15004 1.61564 -0.13066 -1.69905 -0.65155
YCC3 0.94374 1.37604 0.97454 2.27028 2.89651 2.42138 1.16995
YCC2 0.42893 0.56953 -0.92593 0.51257 0.7894 0.20477 0.20173
NCI_N87 0.49073 -1.12375 -1.3463 2.6755 -0.19275 -1.20548 -0.01232
NCC19 0.48728 -0.27791 0.46653 2.88363 1.21934 1.29576 -0.30257
SNU1 -0.53549 0.16291 -0.64916 0 -1.00691 -0.9587 -0.99459
SNU620 -0.76722 -1.425 -0.79455 -0.60117 -1.52778 -2.36575 -1.34254
NCC59 0.50975 1.9513 2.2975 1.00074 2.51829 2.28499 1.78447
KATO3 0.91103 2.34414 3.91116 4.80703 3.47172 3.18865 -0.15551
SNU16 -0.56685 1.2297 0.64936 1.60005 2.326 -1.45395 1.14131
SNU601 0.94416 0.59899 0.10472 -0.52507 1.09509 -1.70304 1.15459
FU97 -0.98502 -1.85427 -1.39298 0.4542 -0.35477 0.84069 -1.18131
OCUM1 0.77411 1.28281 1.22686 0.80785 1.05852 1.65279 0.14745
SNU216 -0.02818 1.005 -0.47751 1.1656 1.74368 2.43774 0
Bortezomib (Velcade) CUDC-101 MLN2238 Paclitaxel (Taxol) SB939 (Pracinostat) Triptolide
SK4 0.39441 -0.04342 0.5584 -0.87202 -0.45404 -1.23208
SNU668 1.35806 0.95079 1.1951 -0.02282 0.51901 -1.28431
SNU484 -0.63378 0.58306 -0.41249 -0.36037 0.208 -1.23432
SNU1750 -1.32572 -1.20297 -1.89594 0.81096 -1.15638 -0.42134
YCC11 -0.66493 0.34513 -1.69454 -0.83022 -0.768 0.41443
MKN1 0.3149 0.62674 0.39585 -1.25779 0.23196 0.67716
Hs746T -0.9394 0.4609 -1.18892 0.73422 0.70977 0.16997
AGS -0.1894 -0.95687 -0.80119 -1.83091 -1.79948 -1.26743
SNU638 0.06564 -0.88065 -0.57363 -0.38984 -0.27801 0.82796
SNU719 1.08149 0.93484 0.41685 4.87652 2.18718 4.57324
NCC24 -0.39113 0.18137 -1.21033 -1.61582 -1.13695 -1.65601
NCC20 -0.10784 -0.78848 -1.24668 0 -0.08068 0
SNU1967 -0.84527 -0.30099 -1.67628 0.05016 -0.45813 -0.49017
MKN45 0.16409 1.50017 0.40055 1.47343 1.67243 1.15654
MKN74 0 -0.54066 -0.22141 0.18599 0.38059 -0.82311
MKN28 -0.41601 -0.76633 0.52567 -0.27308 -0.58656 -0.03132
YCC3 2.79051 0.75618 2.80758 3.80989 1.40282 2.61978
YCC2 0.69533 -0.1991 0.04339 0.56726 -0.02045 0.63092
NCI_N87 1.56918 -0.42172 1.70782 -1.01263 -0.67244 -0.78676
NCC19 -0.69688 1.18709 -0.81661 1.90196 0.65384 -1.50739
SNU1 -0.30281 0 -0.5037 -1.77813 -1.39979 -0.12074
SNU620 -0.6115 -0.42889 -0.96426 -1.99824 -1.19909 -0.98604
NCC59 0.8821 1.8155 0.31796 3.63654 1.05279 0.35598
KATO3 1.08177 0.68296 0.71149 5.3572 0.21731 5.71479
SNU16 -0.0987 0.42696 0.77009 -0.51047 -1.06697 1.9544
SNU601 -0.07383 -0.1084 -0.2758 -1.10598 0.18267 0.38538
FU97 0.01494 -0.46879 0 0.98905 0 -0.62381
OCUM1 2.34559 0.3332 2.11757 2.90857 0.71951 1.99209
SNU216 0.42228 -0.57458 0.23313 2.14823 0.62168 1.18034
그 결과를 도 8에 나타내었으며, 4개 이상의 EMT 위암 세포주(EMT-selective)에서 독성(<50% 생존율)을 보인 63개의 화합물이 청록색으로 표시되었고, 그 외 화합물(n = 1,282)은 분홍색으로 표시하였다.
또한, 상기 도 8에서 청록색으로 표시한 EMT 위암 세포주에서 독성을 보인 63개 화합물의 AUC(average area under the viability curve)의 값을 다른 위암 세포주(non-SEM 하위유형 세포주)와 비교하여 그 결과를 도 9 및 표 4 내지 표 12에 나타내었다.
상기 63개 화합물은 니코사마이드(Niclosamide(Niclocide)), TAE684(NVP-TAE684), MLN2238, 보르테조밉(Bortezomib(Velcade)), MLN9708, 카르필조밉(Carfilzomib(PR-171)), 크리스탈 바이올렛(Crystal violet), 세틸피리디늄클로라이드(Cetylpyridinium Chloride), 염산 알렉시딘(Alexidine HCl), WP1130, 아연 피리치온(Pyrithione zinc), BAY 11-7082(BAY 11-7821), 염산 드론다론(Dronedarone HCl(Multaq)), 펜플루리돌(Penfluridol), 브롬화 톤조늄(Thonzonium Bromide), LDN193189, 오바토클락스 메실레이트(Obatoclax mesylate(GX15-070)), LY2603618(IC-83), 터페나딘(Terfenadine), 보리노스테트(Vorinostat(SAHA)), PCI-24781, AR-42(HDAC-42), 벨리노스테트(Belinostat(PXD101)), 트리초스타틴 A(Trichostatin A(TSA)), CUDC-101, SB939(Pracinostat), JNJ-26481585, 펜벤다졸(Fenbendazole(Panacur)), BKM120(NVP-BKM120), YM155, 염산 미토잔트론(Mitoxantrone Hydrochloride), 테니포시드(Teniposide(Vumon)), 독소루비신(Doxorubicin(Adiriamycin)), 염산 다우노루비신(Daunorubicin HCl(Daunomycin HCl)), 트립톨라이드(Triptolide), PIK-75, 오우바인(Ouabain), 염산 토포테칸(Topotecan HCl), 캄토테신(Camptothecin), 젬시타빈(Glemcitabine(Gemzar)), 인산 플루다라빈(Fludarabine Phosphate(Fludara)), GSK2126458, AZD7762, Torin 2, INK 128(MLN0128), BEZ235(NVP-BEZ235), 네라티닙(Neratinib(HKI-272)), AT9283, 다누서팁(Danusertib(PHA-739358)), 옥시벤다졸(Olxibendazole), 노코다졸(Nocodazole), BI6727(Volasertib), BI2536, 빈크리스틴(Vincristine), 빈블라스틴(Vinblastine), 에포틸론 A(Epothilone A), 세팔론만닌(Cephalomannine), 파클리탁셀(Paclitaxel(Taxol)), 카바지탁셀(Cabazitaxel(Jevtana)), SB743921, 이스피네십(Ispinesib(SB-715992)), APO866(FK866)이었다.
결국, 상기 실험결과에 따를 때 총 1,345개 약학적 화합물 중 SEM 하위유형 위암에서 독성을 나타내는 화합물은 총 63개 화합물이었으며, 이들 화합물은 SEM 하위유형 위암에서 더 발현되는 상기 19종의 유전자의 발현과정이나 상기 유전자가 발현된 ATP 친화 단백질을 특이적으로 억제 또는 경쟁적으로 억제하여 독성을 나타낼 것으로 예상되므로 이들 화합물은 SEM 하위유형 위암의 치료 및 예방에 특이적으로 효과적이다. 또한, 표 5 및 도 9의 화합물 중 SEM 하위유형 위암 세포주에서 1을 넘지 않는 낮은 AUC 값을 가지면서 non-SEM 하위유형 위암 세포주에서 높은 AUC 값을 가지는 INK 128, BAY 11-7082, Daunorubicin HCl, Neratinib, Penfluridol, Teniposide, Alexidine HCl, Doxorubicin, Niclosamide, Terfenadine, Vincristine, APO866, BEZ235, Dronedarone HCl, PIK-75, Thonzonium Bromide, Cetylpyridinium Chloride, LDN193189, Obatoclax mesylate, WP1130, AT9283, LY2603618, Ouabain, Pyrithione zinc, Torin 2, YM155, BKM120, Crystal violet, Fenbendazole, GSK2126458, Mitoxantrone Hydrochloride, Paclitaxel, Triptolide가 SEM 하위유형 위암의 치료 및 예방에 특이적으로 효과적임을 확인할 수 있었고, 그 중에서도 SEM 하위유형 위암에서 큰 음수 AUC 값을 가지거나 모든 SEM 하위유형 위암에서 음수 AUC 값을 가지는 APO866, BEZ235, AT9283, LY2603618, Ouabain, Torin 2, YM155, GSK2126458가 더욱더 SEM 하위유형 위암의 치료 및 예방에 특이적으로 효과적임을 확인하였다.
[실시예 5] ATP 결합 단백질들의 유전적 의존성 확인 - siRNA( small interfering RNA, siRNA ) viability screening
1. 구체적인 실험 방범
ATP 결합 단백질들의 유전적 의존성을 확인하기 위해 siRNA(small interfering RNA, siRNA)를 이용한 기능 상실(loss-of-function) 스크리닝을 진행하였다. Non-SEM 하위유형 세포주 (AGS, MKN45, SNU216과 YCC7)와 SEM 하위유형 세포주 (Hs746T, SK4, SNU484, SNU668, SNU1750와 YCC11)에 3개의 타겟 특이적인 19-25 뉴클레오타이드를 pooling한 siRNA (Santa Cruz Biotechnology, INC)를 트랜스팩션한 후 세포 생존성(cell viability)를 CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS, Promega corporation)을 사용하여 측정하였다. 각 세포주 (2Х103개/100ul)를 투명한 96웰 플레이트에 시딩한 후 다음 날 타겟 siRNA를 Trans-IT X2 Dynamic Delivery System (Mirus Bio)을 이용하여 트랜스팩션 한 후 72시간 뒤 20ul의 MTS 용액을 분주 후 37℃ 5% CO2 incubator (HERAcell 150i, Thermo Scientific)에서 3시간 동안 배양하였다. 490nm의 파장으로 VersaMax microplate reader (ELISA, Molecular Devices)를 이용해 비색 분석(colorimetric assay)를 진행하여 그 결과를 아래 표 13에 나타내었다.
　 Z-score
　 AGS MKN45 SNU216 YCC7 Hs746T SK4 SNU484 SNU668 SNU1750 YCC11
ASS1 1.4353 0.0164 0.2469 -0.4191 -1.5979 -0.5827 1.8193 0.0728 -0.4517 -0.5393
CYB5B 0.4391 -0.1577 -0.1528 0.0778 -1.2408 0.1783 -0.5746 -0.2937 2.4868 -0.7624
GANAB 0.8969 0.2775 0.8823 -1.9661 0.2623 -1.6324 0.1894 0.2813 0.7911 0.0178
HAT1 1.6937 0.5635 0.2865 0.5334 -1.1549 -0.2828 -1.8983 0.3769 0.3157 -0.4338
HNRNPA0 2.4017 0.1122 0.1994 0.6976 -0.3799 -0.3366 -0.5564 -0.3435 -0.4514 -1.3431
HNRNPA2B1 1.4951 0.6497 0.2122 1.0420 -1.6198 0.7558 -0.8532 -0.0806 -0.8196 -0.7815
MARCKS 0.6605 0.2559 0.2306 -0.7722 2.1508 -1.1570 -0.2485 0.3855 -1.2727 -0.2328
PNPO 1.4261 0.2735 0.1512 -0.0477 1.4400 -1.9548 -0.0704 -0.0551 -0.9604 -0.2024
RANBP1 -0.6849 0.2522 0.2322 -0.7360 0.9011 -0.7391 2.1902 -0.3308 -1.2562 0.1713
REXO2 1.2394 0.0109 0.9814 0.1512 -0.8119 -1.4628 1.2042 -0.0969 0.2526 -1.4681
TPM2 2.0271 0.7311 0.6557 -0.1702 -1.0640 -0.9679 -0.9236 0.2923 -0.8908 0.3104
TXNDC17 0.5487 1.0893 0.0004 0.2229 0.5339 -2.0250 0.5687 -0.5413 0.8924 -1.2901
YWHAZ -0.3250 0.9955 0.9389 0.3824 0.6076 -2.4580 0.0131 -0.2470 0.4931 -0.4006
2.결론
세포 생존성은 음수일수록 해당 유전자와 더 큰 유전적 의존성을 가지므로 표 4에 나타낸 것과 같이 유전자들을 knock-down하였을 때 non-SEM 세포주보다 SEM 세포주에서 세포 생존성이 떨어지는 경향을 나타내므로 상기 유전자들이 SEM 분자아형 특이적으로 유전적 의존성이 있음을 확인할 수 있었다.
이상에서 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

Claims (28)

  1. ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 위암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)을 코딩하는 유전자는,
    CAST, EEF1D, HNRNPA2B1, LIG1, MARCKS, MTA2, PFAS, PNPO, REXO2, YWHAZ, HNRNPA0, TPM2, TXNDC17, ASS1, RANBP1, HAT1, CYB5B, GANAB 및 PSMD9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA를 포함하는, 위암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)은 Calpastatin, Elongation factor 1-delta, Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1, DNA ligase 1, Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate, Metastasis-associated protein MTA2, Phosphoribosylformylglycinamidine synthase, Pyridoxine-5'-phosphate oxidase, Oligoribonuclease, mitochondrial, 14-3-3 protein zeta/delta, Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A0, Tropomyosin beta chain, Thioredoxin domain-containing protein 17, Argininosuccinate synthase, Ran-specific GTPase-activating protein, Histone acetyltransferase type B catalytic subunit, Cytochrome b5 type B, Neutral alpha-glucosidase AB 및 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는, 위암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  4. 제 2항에 있어서,
    상기 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)을 코딩하는 유전자의 mRNA 수준은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RTPCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA칩 분석법(DNA chip technology assay), 메틸화된 DNA 결합 도메인 시퀀싱(MBD-seq: Methylated DNA binding domain sequencing) 분석 방법 또는 중아황산염 처리 시퀀싱(RRBS: Reduced representation bisulfite sequencing) 분석 방법에 의하여 측정되는 것인, 위암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  5. 제 3항에 있어서,
    상기 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescence-activated cell sorting analysis) 및 단백질 칩 분석법(protein chip technology assay)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 이용하여 측정되는 것인, 위암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 위암은 SEM(stem-like, epithelial-to-mesenchymal transition and mesenchymal) 하위유형(subunit) 위암인 위암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  7. 제 6항의 조성물을 포함하는 것인, 위암 진단 또는 예후 예측용 키트.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 키트 또는 단백질 칩 키트인 것인, 위암 진단 또는 예후 예측용 키트.
  9. 제 7항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 위암은 SEM(stem-like, epithelial-to-mesenchymal transition and mesenchymal) 하위유형(subunit) 위암인 위암 진단 또는 예후 예측용 키트.
  10. (a) 생물학적 시료에 존재하는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 측정 결과를 대조군 시료의 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 위암을 예측 및 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)을 코딩하는 유전자는,
    CAST, EEF1D, HNRNPA2B1, LIG1, MARCKS, MTA2, PFAS, PNPO, REXO2, YWHAZ, HNRNPA0, TPM2, TXNDC17, ASS1, RANBP1, HAT1, CYB5B, GANAB 및 PSMD9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA를 포함하는, 위암을 예측 및 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)은 Calpastatin, Elongation factor 1-delta, Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1, DNA ligase 1, Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate, Metastasis-associated protein MTA2, Phosphoribosylformylglycinamidine synthase, Pyridoxine-5'-phosphate oxidase, Oligoribonuclease, mitochondrial, 14-3-3 protein zeta/delta, Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A0, Tropomyosin beta chain, Thioredoxin domain-containing protein 17, Argininosuccinate synthase, Ran-specific GTPase-activating protein, Histone acetyltransferase type B catalytic subunit, Cytochrome b5 type B, Neutral alpha-glucosidase AB 및 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는, 위암을 예측 및 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  13. 제 11항에 있어서,
    상기 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)을 코딩하는 유전자의 mRNA 수준은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RTPCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA칩 분석법(DNA chip technology assay), 메틸화된 DNA 결합 도메인 시퀀싱(MBD-seq: Methylated DNA binding domain sequencing) 분석 방법 또는 중아황산염 처리 시퀀싱(RRBS: Reduced representation bisulfite sequencing) 분석 방법에 의하여 측정되는 것인, 위암을 예측 및 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  14. 제 12항에 있어서,
    상기 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescence-activated cell sorting analysis) 및 단백질 칩 분석법(protein chip technology assay)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 이용하여 측정되는 것인, 위암을 예측 및 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  15. 제 10항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 위암은 SEM(stem-like, epithelial-to-mesenchymal transition and mesenchymal) 하위유형(subunit) 위암인, 위암을 예측 및 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  16. 생물학적 시료에 존재하는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준을 측정하는 측정부;
    상기 측정 결과를 대조군 시료의 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준과 비교하는 비교부;를 포함하는, 위암 예측 및 진단을 위한 기기.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)을 코딩하는 유전자는,
    CAST, EEF1D, HNRNPA2B1, LIG1, MARCKS, MTA2, PFAS, PNPO, REXO2, YWHAZ, HNRNPA0, TPM2, TXNDC17, ASS1, RANBP1, HAT1, CYB5B, GANAB 및 PSMD9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA를 포함하는, 위암 예측 및 진단을 위한 기기.
  18. 제 16항에 있어서,
    상기 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)은 Calpastatin, Elongation factor 1-delta, Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1, DNA ligase 1, Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate, Metastasis-associated protein MTA2, Phosphoribosylformylglycinamidine synthase, Pyridoxine-5'-phosphate oxidase, Oligoribonuclease, mitochondrial, 14-3-3 protein zeta/delta, Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A0, Tropomyosin beta chain, Thioredoxin domain-containing protein 17, Argininosuccinate synthase, Ran-specific GTPase-activating protein, Histone acetyltransferase type B catalytic subunit, Cytochrome b5 type B, Neutral alpha-glucosidase AB 및 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는, 위암 예측 및 진단을 위한 기기.
  19. 제 16항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 위암은 SEM(stem-like, epithelial-to-mesenchymal transition and mesenchymal) 하위유형(subunit) 위암인, 위암 예측 및 진단을 위한 기기.
  20. (a) 위암 세포에 위암 치료 후보 물질을 처리하는 단계;
    (b) 상기 후보 물질이 처리된 분리된 위암 세포에서 존재하는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 존재하는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준이 후보 물질이 처리되지 않은 분리된 위암 세포에 비해 낮은 수준을 나타내는 경우, 상기 후보 물질을 위암 예방 또는 치료용 제제로서 사용할 수 있을 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 위암 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법.
  21. 제 20항에 있어서,
    상기 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)을 코딩하는 유전자는,
    CAST, EEF1D, HNRNPA2B1, LIG1, MARCKS, MTA2, PFAS, PNPO, REXO2, YWHAZ, HNRNPA0, TPM2, TXNDC17, ASS1, RANBP1, HAT1, CYB5B, GANAB 및 PSMD9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA를 포함하는, 위암 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법.
  22. 제 20항에 있어서,
    상기 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)은 Calpastatin, Elongation factor 1-delta, Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1, DNA ligase 1, Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate, Metastasis-associated protein MTA2, Phosphoribosylformylglycinamidine synthase, Pyridoxine-5'-phosphate oxidase, Oligoribonuclease, mitochondrial, 14-3-3 protein zeta/delta, Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A0, Tropomyosin beta chain, Thioredoxin domain-containing protein 17, Argininosuccinate synthase, Ran-specific GTPase-activating protein, Histone acetyltransferase type B catalytic subunit, Cytochrome b5 type B, Neutral alpha-glucosidase AB 및 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는, 위암 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법.
  23. 제 21항에 있어서,
    상기 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)을 코딩하는 유전자의 mRNA 수준은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RTPCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA칩 분석법(DNA chip technology assay), 메틸화된 DNA 결합 도메인 시퀀싱(MBD-seq: Methylated DNA binding domain sequencing) 분석 방법 또는 중아황산염 처리 시퀀싱(RRBS: Reduced representation bisulfite sequencing) 분석 방법에 의하여 측정되는 것인, 위암 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법.
  24. 제 22항에 있어서,
    상기 ATP 친화 단백질(ATP affinity protein)의 발현 수준은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescence-activated cell sorting analysis) 및 단백질 칩 분석법(protein chip technology assay)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 이용하여 측정되는 것인, 위암 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법.
  25. 제 20항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 위암은 SEM(stem-like, epithelial-to-mesenchymal transition and mesenchymal) 하위유형(subunit) 위암인, 위암 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법.
  26. EMT(Epithelial-to-mesenchymal transition)에 선택적인 약학 조성물을 유효성분으로 포함하는 위암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  27. 제 26항에 있어서,
    상기 EMT(Epithelial-to-mesenchymal transition)에 선택적인 약학 조성물은 Niclosamide(Niclocide), TAE684(NVP-TAE684), MLN2238, Bortezomib(Velcade), MLN9708, Carfilzomib(PR-171), Crystal violet, Cetylpyridinium Chloride, Alexidine HCl, WP1130, Pyrithione zinc, BAY 11-7082(BAY 11-7821), Dronedarone HCl(Multaq), Penfluridol, Thonzonium Bromide, LDN193189, Obatoclax mesylate(GX15-070), LY2603618(IC-83), Terfenadine, Vorinostat(SAHA), PCI-24781, AR-42(HDAC-42), Belinostat(PXD101), Trichostatin A(TSA), CUDC-101, SB939(Pracinostat), JNJ-26481585, Fenbendazole(Panacur), BKM120(NVP-BKM120), YM155, Mitoxantrone Hydrochloride, Teniposide(Vumon), Doxorubicin(Adiriamycin), Daunorubicin HCl(Daunomycin HCl), Triptolide, PIK-75, Ouabain, Topotecan HCl, Camptothecin, Gemcitabine(Gemzar), Fludarabine Phosphate(Fludara), GSK2126458, AZD77662, Torin 2, INK 128(MLN0128), BEZ235(NVP-BEZ235), Neratinib(HKI-272), AT9283, Danusertib(PHA-739358), Oxibendazole, Nocodazole, BI6727(Volasertib), BI2536, Vincristine, Vinblastine, Epothilone A, Cephalomannine, Paclitaxel(Taxol), Cabazitaxel(Jevtana), SB743921, Ispinesib(SB-715992), APO866(FK866) 중 어느 하나인 위암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  28. 제 26항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 위암은 SEM(stem-like, epithelial-to-mesenchymal transition and mesenchymal) 하위유형(subunit) 위암인, 위암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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