WO2023033638A1 - Alcaloide indólico como agente antineoplásico - Google Patents
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Classifications
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- C07D491/048—Ortho-condensed systems with only one oxygen atom as ring hetero atom in the oxygen-containing ring the oxygen-containing ring being five-membered
Definitions
- the present invention relates to an indole alkaloid as an antineoplastic agent, and more particularly relates to the alkaloid (3S,3aR,BaS ⁇ -3-butyl-5-hydroxy-3,3a,8a-trimethyl-3,3a,8, 8a-tetrahydro-2H- furo [ 2 , 3-b ] -indol-2-one as an antineoplastic agent against neoplastic cells of mammalian cancer, presenting marked inhibitory activity on the growth of said neoplastic cells, causing cell death induced by alteration of the cytoplasmic membrane of cancer cells.
- antineoplastic compounds tend to be very aggressive for the normal cells of the organism, for which reason their administration must be constantly monitored in order to be able to face the adverse effects caused by them.
- conventional antineoplastic agents have shown to be useful only with specific cell lineages , and it is difficult for them to control the growth of very resistant cell lineages such as those tumors . generated from tissue of the central nervous system, which have ineffective treatment with available antineoplastic compounds such as cis-platinum, which, it should be noted, is used in high doses in order to inhibit the growth of neoplastic cells capable of producing remission of tumor masses.
- Andranone is a compound that has been described not long ago in the patent application MX/a/2020/007930. Said compound is an antifungal agent that causes the membrane disruption of the fungal cells of the main phytopathogenic agents, by irreversibly binding to the sterols present in the cytoplasmic membrane.
- Said compound has a strong inhibitory activity on the growth and development of phytopathogenic fungi such as Fusarium spp, Rh ⁇ zocton ⁇ a spp, Mon ⁇ l ⁇ oph tora spp, Al ternla spp, Coll etotr ⁇ churn l ⁇ ndemunth ⁇ anum, Coll etotr ⁇ chum gl osporo ⁇ des , B ⁇ opolar ⁇ s spp, Vert ⁇ c ⁇ ll ⁇ um spp and Mycosphaerella f ⁇ j ⁇ ens ⁇ s and to date it has not been reported to have any other type of effect on animal cells, and in the studies presented in the aforementioned Patent application, it was shown that Andranone is harmless against free living organisms.
- phytopathogenic fungi such as Fusarium spp, Rh ⁇ zocton ⁇ a spp, Mon ⁇ l ⁇ oph tora spp, Al ternla spp, Coll
- the present invention aims to provide a new anticancer agent against neoplastic animal cells, with a specific and novel mechanism of action, achieving a concentration minimal inhibitory of the growth and development of cancer cells lower with respect to those deployed by the current conventional treatments and finally, whose adverse effects on the administered organisms are null.
- Another objective of the present invention is to provide an anticancer drug against mammalian neoplastic cells that is specifically effective in hominids, preferably in humans.
- a further object of the present invention is to provide an antineoplastic medicament adapted to be intravenously or intradermally administrable.
- One more objective of the present invention is to provide antineoplastic compositions that can be stored for long periods of time at room temperature, without presenting degradation of its active component.
- Figure 1 shows the results of a fluorescence analysis of the effect of Andranone and cis-platinum on the cell membrane of cells from the U-251 cell line.
- Figure 2 shows the graphs obtained from the Annexin-V and propidium iodide model assessed by flow cytometry, of the effect of Andranone and cisplatin on cultures of the U-251 cell line.
- FIG. 4 shows a graph in which the changes in the expression of the cytokines (A) TNF-a, (B) are observed.
- TGF-py(C) the RelA subunit of the transcription factor NF-KB in cultures of human peripheral blood lymphocytes exposed in vitro to various concentrations of Andranone.
- the present invention refers to a new antineoplastic agent against neoplastic animal cells and more specifically, it provides an indole alkaloid that causes cell death induced by alteration of the cell membrane at low doses on cell lines resistant to other conventional anticancer compounds such as the s-platinum cf.
- the indole alkaloid (3S,3aR,8aS)-3-butyl-5-hydroxy-3,3a,8a-trimethyl-3,3a,8,8a-tetrahydro-2H-furo [2,3-b] is known to -indol-2-one represented by formula I, known generically as Andranone, has been shown to have a specific fungicidal effect.
- This alkaloid has proven to be effective as an antifungal compound, causing membrane disruption by irreversibly binding to the sterols present in the cytoplasmic membrane. Therefore , said compound has only been shown to be able to bind to a specific component present only in fungal cells , so in no way would it have been expected to present any type of specific interaction with other types of eukaryotic cells.
- the Andranone of the present invention can be used as a medicament or in the manufacture of medicaments for the treatment of cancer, adapted to be administered intravenously or intradermally, and to provide preferential plasma concentrations of between 0.1 and 1.0 pM, more specifically between 0.10 and 0.6 pM and more preferably between 0.1 and 0.3 pM.
- the Andranone compound of the present invention is used in compositions comprising carbopol to increase the solubility of Andranone, so that the active ingredient increases its bioavailability in the body.
- Said compositions comprise between 10 and 40% (w/v) of Andranone, and between 0.05 and 0.1% (w/v) of carbopol, dissolved in deionized water.
- the compositions are placed inside vials that can be stored at a temperature between -4 and 25 ° C for a period of time up to 12 months . In this way, the Andranone compositions of the present invention can provide effective Andranone plasma concentrations for the control of tumor masses.
- compositions of the present invention have been shown to increase the bioavailability of Andranone at the plasmatic level , which is why they are useful as a treatment for aggressive cancers such as brain cancer , since a constant effective concentration of the active compound can be maintained , easily with small doses.
- the present invention provides a cancer treatment method, which allows reducing the size of pre-existing tumor masses in mammals, which consists of administering, intravenously or intradermally, a therapeutically effective amount of Andranone or Andranone composition. with carbopol, said therapeutically effective amount being such an amount as to provide a plasma concentration of between 0. 1 to 1 . 0 pM Andranone at the plasmatic level.
- Example 1 Andranone antineoplastic activity
- HCT-15 colon
- MCF-7 breast
- K-562 leukemia
- U-251 central nervous system
- PC-3 prostate
- SKUL lung
- COST-7 cervix uterine
- Andranone cytotoxicity was determined in sextuplicate microcultures using preferable Andranone concentrations between 0.1 and 1.0 pM, more specifically between 0.1 and 0.6 pM and mostly between 0.1 and 0.3 pM.
- Cell viability and growth were indirectly measured by the sulforhodamine B method according to NCI-validated procedures, using salicylic acid and mezalasin as negative control compounds, and Cisplatin at concentrations of 100 pm. Table 1 describes the results obtained.
- cytotoxic activity was weighted by the IC50 of Andranone on 12 cell lines of neuronal origin, PFSK-1 (brain, cerebral hemisphere); A-172 (53-year-old patient glioblastoma) ; SW1088 (Brain fibroblast); Daoy (Brain, Cerebellum) ; 1321N1 (Normal brain cells); HT-29 (Colorectal carcinoma) ; SW-620 (Colorectal carcinoma ) ; H-358 (Lung carcinoma) ; A-549 (Lung carcinoma) ; LA-N-5 (Neuroblastoma) ; SK-N-SH (Neuroblastoma) ; and L-929 (Mouse Fibrosarcoma) using Bevacizumab as a control.
- the determination of the IC50 of Andranone was performed in microcultures in sextuplicate. The results of the IC50 assessment are shown in Table 2. Table 2. Cellular cytotoxicity data, represented by the minimum inhibitory concentration in
- Andranone compound has a marked cytotoxic effect on cancer cell lines, which is much greater than that observed when using Cis-platinum.
- Andranone is capable of inhibiting the cell growth of highly resistant neoplastic cell lines, such as the U-251 brain cancer cell line, which has been shown not to be efficiently treated with conventional anticancer compounds such as Cis- platinum.
- cytochalasin B (4.5 pg/mL) was added to all the cultures and at 72 hours the lymphocytes were harvested by centrifugation at 1500 rpm for 10 min.
- the cell button was divided into 2 parts, one to perform the micronucleus test and the other was kept in PBS (pH 7.5) at -80 °C to perform the RT-qPCR tests.
- the first part of the cell button was prefixed with 1 mL of Carnoy's fixative (3:1) and centrifuged at 1500 rpm for 10 min. The supernatant was removed and the cell button was resuspended. 5 mL of Carnoy's fixative were added and centrifuged again at 1500 rpm for 10 min. This step was repeated 2 more times. Slides were made on slides by the drip technique and allowed to air dry. The samples were stained in 5% Giemsa stain and analyzed in the light microscope at 40X to determine the frequency of micronuclei in 1000 cells (in duplicate). The results are shown in Figure 3.
- Table 3 shows the averages of the cell division indices IDC of proliferation with cytokinesis blocks (IPBC) as well as the percentage of relative cytotoxicity, calculated from the micronucleus assay for the lymphocyte cultures exposed to different concentrations of Andranone.
- RNA of the second part of human peripheral lymphocytes previously exposed to 5 hours was extracted. Andranone concentrations using the Trizol reagent. 100 pL of Trizol were added to each cell button and left to settle for 5 min at room temperature. 60 pL of chloroform were added, shaken and allowed to incubate for 3 min at room temperature. Subsequently, the samples were centrifuged. The aqueous phase was transferred to a tube with 150 pL of isopropanol and 1 pL of glycogen. It was incubated for 24 hours at 4 °C.
- RNA concentration in 1 pL of each sample was quantified using a spectrophotometer using the 260/280 and 260/230 nm absorbance ratios to obtain purity.
- RNA synthesis was performed from 200 ng of total RNA in a final volume of 200 pL following the Thermo Scientific kit protocol in a BIORAD "Thermal cycler MJ mini" thermocycler with the following conditions: 37 °C for 60 minutes , 70 °C for 10 minutes and 20 °C for 1 minute.
- Real-time ORP was performed with the kit in a Stratagen MX300SP Agilent Technologies equipment, following the Thermo Scientific Máxima SYBR Green QPCR master mix kit protocol, using SYBR Green as the main fluorochrome and ROX as the reference passive dye.
- the specific primers for each gene were used to prepare the reaction mixtures.
- the following temperature profile was used: 95°C for 10 minutes, 50 cycles of 95°C for 15 seconds and 58°C for 1 minute. To end with a cycle of 95°C for 1 minute, 58°C for 30 seconds and 95°C for 30 seconds.
- NTC non-tempered control
- ANOVA Newman-KEULS multiple comparison analysis of variance
- Figure 4 shows the averages of TNF- ⁇ expression in cultures of human peripheral blood lymphocytes exposed in vitro to different concentrations of Andranone.
- the expression of TNF-a, TGF-p and the RelA subunit of the transcription factor NF-KB did not change in human peripheral lymphocytes exposed to any of the Andranone concentrations used in relation to the negative control value.
- In human lymphocytes exposed in vitro to the compound there was no increase in any of the previously described transcription factors. Therefore, it is demonstrated that exposure to Andranone does not cause changes in the expression of cytokines in peripheral blood lymphocytes.
- the female Sprague-Dawley rats were divided into six groups, each group consisting of 10 animals. Animals in group I (normal) received no treatment. Rats from groups II (negative control) and III to VI were injected with NMU (N-nitroso-N-methylurea from Sigma Chemical Co), to induce mammary cancer at 50, 80 and 110 days of age. Furthermore, group III (vehicle) received vehicle only, while groups IV, V and VI received treatment with 10, 20 and 40 mg/kg of body weight of the composition of the present invention (ANR), respectively. Treatments were started when the first tumors had a diameter > 5 mm. All rats received their specific treatment every 2 days until 30 days after detection of the first tumor.
- NMU N-nitroso-N-methylurea from Sigma Chemical Co
- mice Female Sprague-Dawley rats were divided into five groups, each group consisting of 30 animals. Animals in group I (normal) received no treatment. Animals in Groups II to IV were injected IV with 50 mg/kg of NMU (N-nitroso-N-methylurea from Sigma Chemical Co) to induce mammary cancer at 50, 80 and 110 days of age. Group II (control) received a mixture of distilled water and Tween-80 (vehicle). Groups III, IV and V were treated with vehicle (group III) and the composition of Andranone (ANR) at 10 and 20 mg/kg of body weight (groups IV and V respectively), 14 days after the first application. from NMU.
- NMU N-nitroso-N-methylurea from Sigma Chemical Co
- Groups II, III and IV were treated three times a week for 76 days. Tumor size, body weight and clinical signs were observed and recorded. All rats were sacrificed at the end of the experiment. The wet tumor and organs such as lung, liver, kidney, heart and gastric tissues were measured and weighed. The relationship between the weight of the organs and the final body weight and their values were expressed as a percentage. For paired organs, the mean weight of the two organs was used to calculate the organ weight/body weight ratio. Blood samples were obtained from the rats by cardiac puncture for hematological and biochemical analysis. The results of the antineoplastic and preventive effect tests are shown in Table 4.
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Abstract
La presente invención se refiere a un alcaloide indólico, específicamente el alcaloide ( (33, 3aR, 8aS) -3-butil-5- hidroxi-3, 3a, 8a-trimetil-3, 3a, 8, 8a-tetrahidro-2H-furo [2, 3- b] indol-2-ona, denominado de forma genérica como Andranona, como agente antineoplásico contra células neoplásicas de cáncer de colon, cáncer de mama, leucemia, cáncer de sistema nervioso central, cáncer de próstata, cáncer de pulmón y cáncer cérvico uterino.
Description
ALCALOIDE INDÓLICO COMO AGENTE ANTINEOPLÁSICO
Campo de la Invención
La presente invención se refiere a un alcaloide indólico como agente antineoplásico , y más particularmente se refiere al alcaloide ( 3S, 3aR, BaS} -3-butil-5-hidroxi-3 , 3a, 8a- trimetil-3 , 3a, 8 , 8a-tetrahidro-2H- furo [ 2 , 3-b ] -indol-2-ona como agente antineoplásico contra células neoplásicas de cáncer de mamí feros , presentando marcada actividad inhibitoria sobre el crecimiento de dichas células neoplásicas , provocando la muerte celular inducida por la alteración de la membrana citoplasmática de las células cancerígenas .
Antecedentes de la Invención
La búsqueda de nuevos agentes antineoplásicos se ha vuelto una carrera por descubrir alternativas a las terapias existentes , las cuales , si bien es cierto que han demostrado ser efectivas para algunos tipos de cánceres , siguen provocando varios efectos adversos en el organismo , y no en todos los casos tratados provocan la remisión de los tumores ni mucho menos causan la muerte celular completa de las células neoplásicas tratadas .
La mayoría de los compuestos antineoplásicos disponibles , tienden a ser muy agresivos para las células normales del organismo , por lo que su administración debe ser monitoreada de forma constante para poder hacer frente a los efectos adversos causados por los mismos . Asimismo , los agentes antineoplásicos convencionales han demostrado ser solo útiles con linaj es celulares especí ficos , y es di fícil que éstos controlen el crecimiento de linaj es celulares muy resistentes como pueden ser aquellos tumores
generados a partir de tej ido del sistema nervioso central , los cuales tienen un tratamiento poco efectivo con los compuestos antineoplásicos disponibles como el cí s-platino , el cual cabe señalar se usa en dosis elevadas para poder generar una inhibición del crecimiento de las células neoplásicas capaz de producir una remisión de las masas tumorales .
Muchas de las lineas de investigación actuales , se han dirigido a probar compuestos usados comúnmente en seres humanos , diseñados para otras patologías como fuente de materia prima para la obtención de nuevos compuestos antineoplásicos . Sin embargo , la mayoría de los compuestos evaluados resultan ser muy poco potentes como agentes citotóxicos , por lo que uso se limita a fungir como coadyuvantes de las quimioterapias disponibles .
Uno de los enfoques de búsqueda de nuevos compuestos antineoplásicos , que menos ha avanzado es el de buscar nuevos candidatos a fungir como compuestos antineoplásicos entre los compuestos biocidas destinados a fines no terapéuticos . Esto se debe en gran medida a que estos compuestos son desestimados de primera entrada, porque están diseñados para el control de organismos parásitos con un origen filogenético distinto al de los mamí feros y primates . Por ello es muy poco probable que entre estos compuestos se encuentre un candidato adecuado a servir como agente antineoplásico en mamí feros , ya que los mecanismos de acción de estos están ligados a rutas metabólicas y estructuras que no están presentes en las células animales de los vertebrados .
Si bien es cierto que es poco probable generar nuevos agentes antineoplásicos a partir de compuestos biocidas
destinados al sector agrícola, existen algunos nuevos compuestos que podrían ser sometidos a pruebas , dado que hasta el momento no han reportado tener algún tipo de efecto adverso sobre células animales . Por ej emplo , la Andranona es un compuesto que ha sido descrito no hace mucho tiempo en la solicitud de Patente MX/a/2020/ 007930 . Dicho compuesto , es un agente anti fúngico que provoca la disrupción membranal de las células fúngicas de los principales agentes f itopatógenos , al unirse a los esteróles presentes en la membrana citoplasmática de forma irreversible . Dicho compuesto tiene una fuerte actividad inhibitoria sobre el crecimiento y desarrollo de hongos f itopatógenos como Fusari um spp, Rhí zoctonía spp, Monílí oph tora spp, Al ternarla spp, Coll etotrí churn líndemunthíanum, Coll etotrí chum gl osporoídes , Bí opolarí s spp, Vertí cíllí um spp y Mycosphaerella fíjí ensí s y hasta la fecha no ha sido reportado que tenga ningún otro tipo de efecto sobre las células animales , y en los estudios presentados en la solicitud de Patente arriba citada, se demostró que la Andranona es inocua frente a organismos de vida libre . Así , con estos datos , es posible deducir que dicho compuesto es inofensivo sobre células animales y/o vegetales . Sin embargo , debido a su mecanismo de acción como agente fungicida tan especí fico , derivado de su interacción con los esteróles de la membrana celular de los hongos , es muy poco probable que fuera tomado como punto de partida para la obtención de un nuevo agente antineoplásico .
En vista de lo anterior, es claro que los compuestos anticancerígenos disponibles en el mercado , no son del todo eficaces como agentes antineoplásicos contra la mayoría de los canceres resistentes , tales como los del sistema nervioso central . Asimismo , la mayoría de los compuestos disponibles
en el mercado requieren de dosis elevadas para provocar una disminución apreciable en el crecimiento celular de las células neoplásicas tratadas .
En vista de la problemática anterior, resulta necesario el proporcionar compuestos alternativos para el tratamiento del cáncer en mamí feros , en particular en humanos , que produzcan una remisión activa del crecimiento de células cancerosas . Además , existe la necesidad de proporcionar alternativas para el tratamiento de diversos cánceres , que sean especí ficos , con mecanismos de acción novedosos y, que cuyas concentraciones requeridas para lograr una inhibición y/o detención del crecimiento de células cancerígenas sean menores con respecto a las requeridas por los tratamientos convencionales empleados actualmente .
Sumario de la Invención
Con el fin de superar las limitantes de los compuestos convencionales para el tratamiento de cáncer en células animales , la presente invención tiene por obj etivo proporcionar un nuevo agente anticancerigeno contra células animales neoplásicas , con un mecanismo de acción especi fico y novedoso , logrando una concentración minima inhibitoria del crecimiento y desarrollo de células cancerígenas menor con respecto a las desplegadas por los tratamientos convencionales actuales y finalmente , cuyos efectos adversos sobre los organismos administrados sean nulos .
Otro obj etivo de la presente invención es proporcionar un medicamento anticancerigeno contra células neoplásicas de mamí feros , que sea especí ficamente efectivo en homínidos , preferentemente en humanos .
Un obj etivo adicional de la presente invención es proporcionar un medicamento antineoplásico adaptado para ser administrable de forma intravenosa o intradérmica .
Un obj etivo más de la presente invención es proporcionar composiciones antineoplásicas que se puedan almacenar durante periodos de tiempo prolongados a temperatura ambiente , sin presentar degradación de su componente activo .
Los obj etivos antes citados , asi como otros y las ventaj as de la presente invención, vendrán a ser aparentes de la siguiente descripción detallada de la misma .
Descripción de las Figuras de la Invención
La Figura 1 , muestra los resultados de un análisis por fluorescencia del efecto de la Andranona y el ci s-platino sobre la membrana celular de células de la linea celular U- 251 .
La Figura 2 , muestra las gráficas obtenidas a partir de modelo de Anexina-V y Yoduro de propidio valorado por citometria de fluj o , del efecto de la Andranona y el ci s- platino sobre cultivos de la linea celular U-251 .
La Figura 3 , muestra una gráfica en la que se observa la frecuencia promedio de micronúcleos en el cultivo de linfocitos de sangre peri férica humana expuestos in vi tro a di ferentes concentraciones de Andranona, en la que cada barra representa la media ± SD de 3 experimentos independientes (N= 15 ) .
La Figura 4 , muestra una gráfica en la que se observan los cambios de expresión de las citocinas (A) TNF-a, (B )
TGF- p y ( C ) la subunidad RelA del factor de transcripción NF-KB en cultivos de linfocitos de sangre peri férica humana expuestos in vi tro a distintas concentraciones de Andranona .
Descripción Detallada de la Invención
La presente invención se refiere a un nuevo agente antineoplásico contra células animales neoplásicas y más especí ficamente , proporciona un alcaloide indólico que provoca la muerte celular inducida por alteración de la membrana celular a dosis baj as sobre lineas celulares resistentes a otros compuestos anticancerigenos convencionales tales como el cf s-platino .
Se conoce que el alcaloide indólico ( 3S, 3aR, 8aS) -3- butil-5-hidroxi-3 , 3a, 8a-trimetil-3 , 3a, 8 , 8a-tetrahidro-2H- furo [ 2 , 3-b ] -indol-2-ona representado por la formula I , conocido de forma genérica como Andranona, ha demostrado tener un efecto fungicida especi fico .
Este alcaloide ha demostrado ser e fectivo como compuesto anti fúngico provocando la disrupción membranal al unirse a los esteróles presentes en la membrana citoplasmática de forma irreversible . Por lo tanto , dicho compuesto únicamente ha demostrado poder unirse a un componente especi fico presente solo en células fúngicas , por lo que de ninguna manera se hubiera esperado que fuera a presentar algún tipo
de interacción especifica con otro tipo de células eucariotas .
En los estudios realizados en la presente invención, se ha encontrado que, contrario a toda expectativa razonable, de forma sorprendente las células neoplásicas animales, en particular las células cancerígenas de homínidos tales como el humano, han resultado ser susceptibles a la acción de la Andranona, la cual provoca la muerte celular inducida por alteración de la membrana celular. La Andranona, a diferencia de otros compuestos usados como agentes antineoplásicos , presenta una alta citotoxicidad en dosis bajas sobre lineas celulares resistentes a otros compuestos anticancerigenos convencionales tales como el cis-platino, el cual ha demostrado no ser efectivo en el tratamiento de cánceres resistentes tales como el cáncer de cerebro.
La Andranona de la presente invención se puede usar como medicamento o en la fabricación de medicamentos para el tratamiento del cáncer, adaptados para ser administradles por via intravenosa o intradérmica, y para proporcionar concentraciones plasmáticas preferentes de entre 0.1 y 1.0 pM, más específicamente de entre 0.10 y 0.6 pM y más preferiblemente de entre 0.1 y 0.3 pM.
Preferentemente, el compuesto Andranona de la presente invención se usa en composiciones que comprenden carbopol para aumentar la solubilidad de la Andranona, de forma que el principio activo aumente su biodisponibilidad en el organismo. Dichas composiciones comprenden entre 10 y 40 % (p/v) de Andranona, y entre 0.05 y 0.1 % (p/v) de carbopol, disueltos en agua desionizada. Las composiciones se colocan dentro de viales que se pueden almacenar a una temperatura
de entre - 4 y 25 ° C por un periodo de tiempo de hasta 12 meses . De esta forma, las composiciones de Andranona de la presente invención, pueden proporcionar concentraciones plasmáticas de Andranona eficaces para el control de masas tumorales .
Adicionalmente , las composiciones de la presente invención han demostrado aumentar la biodisponibilidad de la Andranona a nivel plasmático , por lo que resultan útiles como tratamiento para cánceres agresivos tales como el cáncer de cerebro , ya que se puede mantener una concentración efectiva constante del compuesto activo , de forma fácil con pequeñas dosis .
Asimismo , la presente invención proporciona un método de tratamiento de cáncer, que permite disminuir el tamaño de las masas tumorales prexistentes en mamí feros , que consiste en administrar, por via intravenosa o intradérmica, una cantidad terapéuticamente efectiva de Andranona o de la composición de Andranona con carbopol , siendo dicha cantidad terapéuticamente efectiva, una cantidad tal que permite proporcionar una concentración plasmática de entre 0 . 1 a 1 . 0 pM de Andranona a nivel plasmático .
Para demostrar el efecto antineoplásico de la Andranona, se reali zaron pruebas para valorar la citotoxicidad del compuesto sobre lineas celulares de cáncer y para dilucidar su mecanismo de acción, como se muestra en los ej emplos descritos a continuación .
Ejemplo 1 . Actividad antineoplásica de la Andranona
Para la evaluación del efecto citotóxico de la Andranona sobre células neoplásicas se emplearon 6 lineas celulares :
HCT-15 (colon) , MCF-7 (mama) , K-562 (leucemia) , U-251 (sistema nervioso central) , PC-3 (próstata) , SKUL (pulmón) y COST-7 (Cérvico uterino) provenientes del Nacional Cancer Institute (NCI) de Estados Unidos. La citotoxicidad de la Andranona fue determinada en microcultivos por sextuplicado usando concentraciones de Andranona preferibles de entre 0.1 y 1.0 pM, más específicamente entre 0.1 y 0.6 pM y mayormente entre 0.1 y 0.3 pM. La viabilidad y crecimiento celular se midió indirectamente por el método de la sulforrodamina B de acuerdo con los procedimientos validados por el NCI, usando como compuestos de control negativos el ácido salicilico y Mezalasina, y como fármaco antineoplásico de control el Cis- platino en concentraciones de 100 pM. En la Tabla 1, se describen los resultados obtenidos.
Tabla 1. Determinación del efecto citotóxico de la Andranona sobre distintas lineas celulares neoplásicas.
NC : no citotóxico
Como se puede apreciar en los resultados mostrados en la Tabla 1, la Andranona presenta una alta citotoxicidad en todas las lineas celulares cancerígenas evaluadas, observándose que a una concentración de 0.2 pM, todas las lineas celulares tratadas presentaron una mayor inhibición
en su crecimiento respecto al cis-platino que se usó como fármaco antineoplásico de control. En todos los casos la Andranona demostró presentar una mayor citotoxicidad que el cis-platino sobre todas las lineas celulares, aún a concentraciones más bajas que las usadas convencionalmente para el compuesto antineoplásico de control.
Por otro lado, el efecto citotóxico de la Andranona, se vio corroborado al analizar la muerte total de las células en un modelo de Anexina-V y Yoduro de propidio valorado por citometria de flujo, en el que observaron células de U-251 tratadas con Cis-platino 10, 50 y 100 pM, y tratadas con 0.15, 0.16, 0.18, 0.19 y 0.20 pM de Andranona. Como se puede constatar en la Figura 1, se observa un desplazamiento marcado de las fases de mayor a menor y del cuadrante 3 al cuadrante 2 y 4, lo que indica que las células de U-251 tratadas con Andranona, están completamente muertas y no moribundas en todas las concentraciones valoradas.
Actividad citotóxica in vitro de la Andranona
Adicionalmente, se ponderó la actividad citotóxica mediante la IC50 de la Andranona sobre 12 lineas celulares de origen neuronal, PFSK-1 (cerebro, hemisferio cerebral) ; A-172 (Glioblastoma paciente de 53 años) ; SW1088 (Fibroblasto de cerebro) ; Daoy (Cerebro, Cerebelo) ; 1321N1 (Células normales de cerebro) ; HT-29 (Carcinoma colorrectal ) ; SW-620 (Carcinoma colorrectal ) ; H-358 (Carcinoma de pulmón) ; A-549 (Carcinoma de pulmón) ; LA-N-5 (Neuroblastoma) ; SK-N-SH (Neuroblastoma) ; y L-929 (Fibrosarcoma de ratón) usando Bevacizumab como control. La determinación de la IC50 de la Andranona fue realizada en microcultivos por sextuplicado. Los resultados de la valoración de la IC50 se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2 . Datos de citotoxicidad celular, representada por la concentración mínima inhibitoria en las di ferentes líneas celulares .
Los resultados muestran que la Andranona tiene una IC50 más pequeña que la obtenida con el Bevaci zumab, por lo que se puede constatar que la Andranona es mucho mas potente contra las líneas celulares valoradas .
Ejemplo 2 . Determinación del mecanismo de acción de la Andranona .
Para determinar el mecanismo de acción de la Andranona sobre células neoplásicas , se reali zó un análisis de fluorescencia a células de la línea celular U-251 tratadas con 10 y 100 pM de cis-platino y con 0 . 1 y 0 . 2 pM de Andranona .
Como se puede observar en la Figura 2 , en los testigos sin aplicación (Normal ) se aprecia un color azul sostenido , indicando la integridad celular en ambos tratamientos . En la
concentración alta y baja de Cis-platino se observa una alteración de la coloración indicando que existió una alteración de la membrana celular sin ser tan evidente. Sin embargo, para la Andranona en la concentración alta (0.2 pM) se observa un color marcado rojo, indicando la muerte total de la célula cancerígena, lo que es observado en células que han sufrido un proceso de muerte celular inducida por alteración de la membrana celular.
De los resultados obtenidos en los ejemplos antes descritos, se puede concluir que el compuesto Andranona presenta un marcado efecto citotóxico sobre lineas celulares cancerígenas, que es mucho mayor que el observado al usar Cis-platino. Además, se observa que la Andranona es capaz de inhibir el crecimiento celular de lineas celulares neoplásicas muy resistentes como lo es la linea celular de cáncer de Cerebro U-251, la cual ha demostrado no ser tratada eficientemente con compuestos anticancerigenos convencionales como el Cis-platino.
Evaluación in vitro de la toxicidad de la Andranona en linfocitos periféricos humanos.
Se incubaron 500 pL de sangre periférica heparinizada de un donador joven y sano con medio RPMI 1640 suplementado con f itohemaglutinina (2%) y penicilina-estreptomicina (0.5%) a un volumen final de 2.5 mL con diferentes concentraciones de Andranona (2 x 10~6, 4 x 10~6, 8 x 10~6, 12 x 10~6, y 16 x 10~ 6 mM) , asi como los testigos positivos (Bleomicina, 3.2 pg/mL) y el testigo negativo (linfocitos sin Andranona) en las mismas condiciones. A las 44 h, a todos los cultivos se les adicionó citocalasina B (4.5 pg/mL) y a las 72 horas se cosecharon los linfocitos mediante centrifugación a 1500 rpm por 10 min. El botón celular se dividió en 2 partes, una
para realizar la prueba de micronúcleos y la otra se mantuvo en PBS (pH 7.5) a -80 °C para realizar las pruebas de RT- qPCR.
Para la prueba de micronúcleos, la primera parte del botón celular se prefijó con 1 mL de fijador Carnoy (3:1) y se centrifugó a 1500 rpm por 10 min. Se retiró el sobrenadante y se resuspendió el botón celular. Se agregaron 5 mL de fijador Carnoy y se volvió a centrifugar a 1500 rpm por 10 min. Este paso se repitió 2 veces más. Se realizaron laminillas en portaobjetos por la técnica de goteo y se dejaron secar al aire. Las muestras se tiñeron en colorante Giemsa al 5% y se analizaron en el microscopio óptico a 40X para determinar en 1000 células (por duplicado) la frecuencia de micronúcleos. Los resultados se muestran en la Figura 3. Como se observa en la gráfica, las concentraciones de 2 x ICñ6, 4 x ICñ6, 8 x ICñ6, 12 x ICñ6, y 16 x ICñ6 mM de Andranona no incrementaron significativamente la frecuencia de células vinculadas con micronúcleos comparadas con el testigo negativo (p<0.05) . Sin embargo, la Bleomicina usada como testigo positivo aumentó de manera significativa la frecuencia de MN.
En la Tabla 3 se muestran los promedios de los indices de división celular IDC de proliferación con bloques de las citocinesis (IPBC) asi como el porcentaje de citotoxicidad relativa, calculado a partir del ensayo de micronúcleos para los cultivos de linfocitos expuestos a diferentes concentraciones de Andranona.
Tabla 3. Efecto citotóxico en cultivos de linfocitos de sangre periférica humana expuestos in vitro a Andranona.
Ambos indices IDN e IPBC de los linfocitos en cultivos expuestos a 2 x ICR6, 4 x ICR6, 8 x ICR6, 12 x ICR6, y 16 x ICR 6 mM de Andranona no mostraron diferencias significativas al compararse con los valores del testigo negativo, lo que demuestra poca citotoxicidad de la Andranona sobre los linfocitos de sangre periférica.
Para la evaluación de la expresión de TNF-a, TGF-p y de la subunidad RelA del factor de transcripción NF-KB, por RT- qPCR, se extrajo el RNA total de la segunda parte de linfocitos periféricos humanos expuestos previamente a las 5 concentraciones de Andranona mediante el reactivo de Trizol. A cada botón celular se le agregaron 100 pL de Trizol y se dejaron reposar por 5 min a temperatura ambiente. Se le añadieron 60 pL de cloroformo, se agitó y dejó incubar 3 min a temperatura ambiente. Posteriormente se centrifugaron las muestras. La fase acuosa se transfirió a un tubo con 150 pL de isopropanol y 1 pL de glucógeno. Se incubó durante 24 horas a 4 °C. Transcurrido ese tiempo, se centrifugó a 10,000 rpm por 10 minutos. Se decantó el sobrenadante y se realizó un lavado con 100 pL de etanol (75%) centrifugando 5 min a 7500 rpm. Se decantó el sobrenadante y las muestras se dejaron secar en baño seco a 40 °C. Finalmente, se resuspendió el botón en 10 pL de agua libre de nucleasas y se guardó a -80 °C hasta su uso.
Una vez extraído el RNA, se cuantificó en 1 pL de cada muestra la concentración de RNA usando un espectrof otómetro utilizando los cocientes 260/280 y 260/230 nm de las absorbencias para obtener la pureza. Posteriormente, se realizaron los cálculos para tener 200 ng de RNA en cada 3 mi de muestra. La síntesis de CDNA se realizó a partir de 200 ng de RNA total en un volumen final de 200 pL siguiendo el protocolo del kit Thermo Scientific en un termociclador "Thermal cycler MJ mini" BIORAD con las siguientes condiciones: 37 °C por 60 minutos, 70 °C por 10 minutos y 20 °C por 1 minuto.
La POR en tiempo real se realizó con el kit en un equipo de la marca Stratagen MX300SP Agilent Technologies, siguiendo el protocolo del kit Máxima SYBR Green QPCR master mix de Thermo Scientific, utilizando SYBR Green como fluorocromo principal y ROX como colorante pasivo de referencia. Se emplearon los iniciadores específicos para cada gen para preparar las mezclas de reacción. Para el ensayo de amplificación llevado a cabo en un termociclador Stratagen MX300SP Agilent Technologiesse , se utilizó el siguiente perfil de temperatura: 95°C por 10 minutos, 50 ciclos de 95°C por 15 segundos y 58 °C por 1 minuto. Para finalizar con un ciclo de 95°C por 1 minuto, 58 °C por 30 segundos y 95 °C por 30 segundos. Cada muestra se realizó por triplicado incluyendo un testigo sin templado (NTC) y se analizaron los niveles de expresión relativos con el algoritmo 2 utilizando como gen endógeno la expresión de p - actina. Los valores promedio de 3 (N=15) experimentos independientes se compararon entre sí mediante las pruebas de análisis de varianza (ANOVA) , de comparación múltiple de Newman-KEULS para las diferencias estadísticas entre los promedios de los grupos experimentales y los testigos
positivo y negativo, y un análisis de regresión lineal para establecer la relación de concentración-efecto .
La Figura 4, muestra los promedios de la expresión de TNF-a en los cultivos de linfocitos de sangre periférica humana expuestas in vitro a diferentes concentraciones de Andranona. La expresión de TNF-a, TGF-p y de la subunidad RelA del factor de transcripción NF-KB no cambió en los linfocitos periféricos humanos expuestos a cualquiera de las concentraciones empleadas de Andranona con relación al valor testigo negativo. En los linfocitos humanos expuestos ín vitro al compuesto, no hubo un incremento en ninguno de los factores de transcripción anteriormente descritos. Por lo tanto, queda demostrado que la exposición a la Andranona no causa cambios en la expresión de las citocinas de los linfocitos de sangre periférica.
Evaluación de la actividad antineoplásica in vivo
Para demostrar el efecto antineoplásico in vivo de la Andranona, se utilizaron ratas Sprague-Dawley hembra del Bioterio del Instituto de Fisiología Celular de la UNAM. Se seleccionaron ratas de 50 dias de edad con un peso de entre 150 y 180 g. Todos los animales se alojaron en una habitación con temperatura controlada a 25 ± 1°C con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas en las instalaciones de animales de laboratorio. Los animales fueron alimentados con alimento y agua ad libitum. Antes de los experimentos, las ratas se aclimataron durante 7 dias para adaptarse al entorno del laboratorio. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética en Experimentación con Animales (Ref. 30/55 y Ref. 19/57) , Universidad Prince of Songkla, Tailandia. El estudio se dividió en dos partes, por un lado, se valoró el efecto antineoplásico de la composición de
Andranona con carbopol en masas tumorales ya inducidas, y por el otro se valoró el efecto preventivo de la composición al ser administrada en conjunto con la inducción de las masas tumorales .
Para el estudio de la actividad antineoplásica las ratas hembra Sprague-Dawley se dividieron en seis grupos, cada grupo constaba de 10 animales. Los animales del grupo I (normales) no recibieron tratamiento. A las ratas de los grupos II (control negativo) y III a VI se les inyectó NMU (N-nitroso-N-metilurea de Sigma Chemical Co) , para inducir el cáncer de mama a los 50, 80 y 110 dias de edad. Además, el grupo III (vehículo) recibió solo el vehículo, mientras que los grupos IV, V y VI recibieron tratamiento con 10, 20 y 40 mg/kg de peso corporal de la composición de la presente invención (ANR) , respectivamente. Los tratamientos se iniciaron cuando los primeros tumores presentaban un diámetro > 5 mm. Todas las ratas recibieron su tratamiento especifico cada 2 dias hasta 30 dias después de la detección del primer tumor.
Para el estudio de actividad preventiva del cáncer, Las ratas hembra Sprague-Dawley se dividieron en cinco grupos, cada grupo constaba de 30 animales. Los animales del grupo I (normales) no recibieron tratamiento. A los animales de los Grupos II a IV se les inyectaron por via I.V. 50 mg/kg de NMU (N-nitroso-N-metilurea de Sigma Chemical Co) para inducir cáncer de mama a los 50, 80 y 110 dias de edad. El grupo II (control) recibió una mezcla de agua destilada y Tween-80 (vehículo) . Los grupos III, IV y V fueron tratados con vehículo (grupo III) y la composición de Andranona (ANR) a 10 y 20 mg/kg de peso corporal (grupos IV y V respectivamente) , 14 dias después de la primera aplicación
de NMU. Los grupos II, Ill y IV fueron tratados tres veces por semana durante 76 días. Se observó y registró el tamaño del tumor, el peso corporal y los signos clínicos. Todas las ratas fueron sacrificadas al final del experimento. Se midieron y pesaron el tumor húmedo y los órganos, tales como pulmón, hígado, riñón, corazón y tejidos gástricos. La relación entre el peso de los órganos y el peso corporal final y sus valores se expresaron como porcentaje. Para órganos emparejados, se usó el peso medio de los dos órganos para calcular la relación peso de órganos/peso corporal. Se obtuvieron muestras de sangre de las ratas por punción cardíaca para el análisis hematológico y bioquímico. Los resultados de las pruebas del efecto antineoplásico y preventivo se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4. Resultados de la evaluación antineoplásica y preventiva de la composición de Andranona con carbopol en un modelo en ratas Sprague-Dawley
Los resultados mostraron una reducción signi ficativa del peso y del tamaño de las masas tumorales en los grupos tratados . Asimismo , en las pruebas de prevención se observa un tamaño mucho más pequeño de las masas tumorales inducidas que en los grupos de control , asi como una menor incidencia de crecimientos neoplásicos . Lo anterior, demostró que , con la administración de la Andranona es posible provocar la regresión ín vi vo de las masas tumorales y, asimismo evitar la aparición de nuevas masas tumorales .
La presente invención se ha descrito de acuerdo con una modalidad preferida ; sin embargo , será aparente para un técnico con conocimientos medios en la materia, que podrán hacerse modi ficaciones a la invención, sin apartarse de su espíritu y alcance .
Claims
1. Un compuesto de formula general I,
como agente antineoplásico .
2. El compuesto de fórmula general I, caracterizado porque tiene actividad antineoplásica .
3. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, como medicamento.
4. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para el tratamiento de cáncer en mamíferos .
5. El compuesto antineoplásico de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque el mamífero es un homínido .
6. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque el mamífero homínido en un humano.
7. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo consistente en cáncer de colon, cáncer de mama, leucemia, cáncer de sistema nervioso central, cáncer de próstata, cáncer de pulmón y cáncer cérvico uterino.
8. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque el cáncer es cáncer del sistema nervioso central .
9. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque está adaptado para ser administradle de forma intravenosa o intradérmica .
10. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque está adaptado para proporcionar concentraciones del compuesto de entre 0.1 y 1.0 pM, preferiblemente de entre 0.1 y 0.6 pM y más preferiblemente de entre 0.1 y 0.3 pM.
11. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque altera la membrana citoplasmática de células cancerígenas, induciendo su muerte celular.
12. Una composición antineoplásica caracterizada porque comprende entre 10 y 40 % (p/v) del compuesto de las reivindicaciones 1 o 2; entre 0.05 y 0.1 % (p/v) de carbopol; y agua desionizada.
13. La composición antineoplásica de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque está adaptada para proporcionar concentraciones plasmáticas del compuesto de fórmula general (I) de entre 0.1 y 0.6 pM y más preferiblemente de entre 0.1 y 0.3 pM.
14. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13, como medicamento para el tratamiento de cáncer.
15. La composición de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizada porque el medicamento es un medicamento de aplicación intravenosa o intradérmica.
16. La composición de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizada porque el cáncer se selecciona del grupo consistente en cáncer de colon, cáncer de mama, leucemia, cáncer de sistema nervioso central, cáncer de próstata, cáncer de pulmón y cáncer cérvico uterino.
17. Un método para el tratamiento de cáncer en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar por via intravenosa o intradérmica, una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de las reivindicaciones 1 o 2, o de la composición de la reivindicación 12.
18. El método de tratamiento de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad suficiente para proporcionar una concentración plasmática de entre 0.1 y 1.0 pM del compuesto de formula general I, preferiblemente de entre 0.1 y 0.6 pM, y más preferiblemente de entre 0.1 y 0.3 pM.
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