WO2023022623A1 - Средство для профилактики и лечения инфекционно-воспалительных заболеваний - Google Patents

Средство для профилактики и лечения инфекционно-воспалительных заболеваний Download PDF

Info

Publication number
WO2023022623A1
WO2023022623A1 PCT/RU2022/050178 RU2022050178W WO2023022623A1 WO 2023022623 A1 WO2023022623 A1 WO 2023022623A1 RU 2022050178 W RU2022050178 W RU 2022050178W WO 2023022623 A1 WO2023022623 A1 WO 2023022623A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
lipids
pheophytin
agent
liposomes
vaccinated
Prior art date
Application number
PCT/RU2022/050178
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Андрей Валентинович РЕШЕТНИКОВ
Алексей Олегович КАЛИЧКИН
Лариса Анатольевна ПАНИНА
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Инмед Маркет"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Инмед Маркет" filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Инмед Маркет"
Publication of WO2023022623A1 publication Critical patent/WO2023022623A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/409—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil having four such rings, e.g. porphine derivatives, bilirubin, biliverdine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/04—Drugs for disorders of the respiratory system for throat disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals

Definitions

  • the invention relates to the chemistry of biologically active compounds, in particular, to an agent containing natural porphyrin, for example, pheophytin a of formula (1)
  • the invention also relates to the field of pharmaceuticals, in particular, the preparation of compositions, lotions, sprays, aerosols or liquids for inhalation containing natural porphyrins (pheophytin a, or b, or their derivatives), and as lipids - phospholipids (phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine and others ), cholesterol and other polar lipids that form multilamellar liposomes (MLL) as a means of effectively delivering the active ingredient to the affected tissue or cell.
  • natural porphyrins pheophytin a, or b, or their derivatives
  • lipids - phospholipids phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine and others
  • MDL multilamellar liposomes
  • the invention also relates to the field of medicine, in particular, photodynamic therapy (PDT), using photosensitizers (PS) and light sources to generate active oxygen particles in treated tissue areas.
  • PDT photodynamic therapy
  • PS photosensitizers
  • These compounds forming MLL can be used as a PS for PDT of a new type of coronavirus infection - SARS CoV-2, since, when irradiated with light, they lead to the formation of active oxygen particles that are stable for several hours in biological media.
  • These particles under certain conditions, are able to interact with the microenvironment, causing its photochemomodification [Method of photoimmunotherapy with a photosensitizer activated by wave energy outside the human body. 11/30/2006. RF patent No. 2006142366. N. E. Vasiliev, A.
  • barrier type for example, masks [Aerosol Science and Technology. 2021 Vol. 55, Iss. 4, P. 449-457. Efficacy of face masks, neck gaiters and face shields for reducing the expulsion of simulated cough-generated aerosols. WG Lindsley, FM Blachere, BF Law, DH Beezhold & JD Noti] used to protect against such infection.
  • the advantages of such products are their ease of use, availability, and the disadvantages are their low environmental friendliness, the need to replace every two hours, harm to the cardiopulmonary system of people due to increased respiratory resistance, their low efficiency due to the fact that the pore diameter of the vast majority of such barrier agents exceeds the size of viral particles.
  • barrier agents in general is that they provide only passive protection without the formation of active specific immunity.
  • tissue dendritic cells capture it, synthesize proteins on its template, and expose them on the surface of their membrane in the MHC II complex for presentation to T-killers.
  • Other cells can also present these proteins, but in combination with MHC I. In both cases, they can be recognized as “foreign”, and the vaccine will target T-killers to normal cells of the body, primarily cells responsible for local immunity functions. .
  • the vaccinated begin to develop autoimmune diseases. This can cause complications, even death.
  • VAERS United States Vaccine Adverse Effects Reporting System
  • the ratio of the number of cases of moderate disease and death to the number of vaccinated for the UK was twice as good as for Ukraine, and 1.5 and 5.5 times, respectively, better than for Montenegro, but Iceland, in terms of severe morbidity among vaccinated it was 2 times ahead of Ukraine, 3 times ahead of Montenegro, and 10 times ahead of Slovenia, while Israel lost twice to Egypt in this indicator, and only in terms of the “number of deaths to the number of vaccinated” parameter it was twice ahead of it. But at the same time, Egypt, according to the same indicator, turned out to be comparable with Great Britain (Table 1). So, with statements about the reduction in mortality among the vaccinated, not everything was so clear.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Table 2. The incidence of coronavirus vaccinated and unvaccinated in Israel in the week from 25 to 31.07.2021 by age group.
  • This drug includes a combination of sodium salts of chlorin eb, chlorin rb, purpurin 5 in the amount of 3.5 mg, with meglumine 0.2 g in 1 ml of water.
  • the described method is also analogous and taken as a prototype of the present invention.
  • the advantage of its use is selectivity, high specificity, low cytotoxicity, environmental friendliness and the ability to positively influence immunity.
  • the disadvantages - the effect is proven only in vitro, the active ingredient is water-soluble - it is easily washed off from healthy mucous membranes and, thus, cannot be effectively used for the prevention of coronavirus infection in healthy people, since it is selective, in fact, only for tissues , in which an inflammatory process has already developed, and the specificity of the antiviral action has been proven only in laboratory experiments in a culture of virus-infected cells.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) use by the clinic, while the prophylactic use of the PDT method implies the wide prevalence and availability of the source of their photoactivation among the population. Activation by non-laser sources (LED, broadband, fluorescent, and daylight) is not mentioned in the instructions for medical use of these drugs, while they are available to almost every person.
  • An agent for the prevention and treatment of infectious and inflammatory diseases of the oral cavity, nasopharynx and upper respiratory tract by photodynamic therapy is proposed, containing a photosensitizer of a porphyrin nature, characterized in that pheophytin a (13,15-[15'-methoxycyclopentane-13') is used as a porphyrin.
  • the agent of the invention comprises lipids for solubilizing the active component from the group of phosphatidylcholines and other lipids derived from cyanobacteria of the genus Spirulina. In another embodiment, the agent comprises lipids for solubilization of the active component from the group of phosphatidylcholines and other lipids derived from plants of the genus Urtica.
  • the agent includes lipids to solubilize the active component in the form of individual lecithin and 9
  • the agent comprises pheophytins with phosphatidylcholine in the form of multilamellar liposomes.
  • these liposomes can be obtained using other lipids, such as phosphatidylinositol or phosphatidylethanolamine.
  • the agent according to the invention can be manufactured and used in the form of a spray lotion, a dosable aerosol, an oral rinse, an inhalation liquid.
  • the agent When used, the agent can be activated by light with UV-A and visible wavelengths to provide a photodynamic effect on the pathogenic microflora of the oral cavity and nasopharynx and prevent their diseases.
  • the objective of the present invention is to develop an agent effective in vivo, with the ability to provide passive protection against infection in the form of a lipid film in the nasopharynx, the active component of which is lipophilic, for good penetration into healthy mucous membranes, activation by incoherent radiation sources (LED, broadband, luminescent, as well as daylight), preventive action in relation to the pathogen, to vaccinations leading to the phenomenon of AZUI, and other types of heterologous immune responses associated with cross-reactions of T-killers [Eur J Immunol. 1980 May; 10(5):396-401. Cross-protection and cross-reactive cytotoxic T cells induced by influenza virus vaccines in mice. R.G. Webster, B.A. Askonas], that is, to create protection for both barrier and direct antiviral and activating natural phagocytic immunity action.
  • the PDT effect of the proposed agent is the most benign in relation to the human immune system, proceeds from the principle of "do no harm", helps to modulate the immune response in relation to current, rather than obsolete strains of the virus and is based on the idea that it is simpler not to get sick than to cure later.
  • the proposed tool mechanically prevents the penetration of the virus into the mucous membrane.
  • the proposed tool when irradiated with light, it inactivates the virus particles accumulated in the lipid film.
  • these fragments of viral particles can achieve the effect of immunomodulation up to the appearance of specific "neutralizing" antibodies without the use of vaccines.
  • the task is to maintain the normal function of the local phagocytic link of immunity in healthy people and its recovery in those who have been ill and vaccinated, especially in the face of the threat of new "waves" of the pandemic.
  • the task was solved by the proposed tool - a preparation containing PS - a derivative of the porphyrin series (chlorine of natural origin) and lipids, characterized in that the derivatives of the porphyrin series are hydrophobic PS, and the drug is made in the form of an emulsion, lotion - spray, aerosol, solution for inhalations, MLL.
  • the proposed solution also includes a method for obtaining an active substance and a finished form and a method of application, in which irradiation of the drug in the nasopharynx with light from any source induces the inactivation of viral particles, and the lipid film mechanically prevents their penetration into the mucous membranes.
  • PDT activates macrophages and can modulate the immune response with fragments of viral particles resulting from a photochemical reaction, up to the appearance of specific “neutralizing” antibodies, can overcome the effect of ASD by activating macrophages and switching their type back towards their normal function and, thus, compensate the damage caused by it by the action of an increased titer of antibodies in the blood of people who have been ill and re-infected within 7 months or/and repeatedly vaccinated/sick within 6 months after being vaccinated against coronavirus.
  • this invention proposes a lotion containing a PS of a porphyrin nature, characterized in that hydrophobic pheophytin a (13,15-[15'-methoxycyclopentan-13'-one]yl-17-[2- carboxyphenylethyl] - 15 - carboxymethyl-17,18-/ and ⁇ tns-dihydro-3-vinyl-8-ethyl-2,7,12,18-tetramethylporphyrin (SHPAC), 1,3,5,8-tetramethyl-4 propionic acid -ethyl-2-vinyl-9-oxo-10-carbmethoxy-forbin-7-phenyl ester (systematic)) (Example 1) in an amount of 0.001-1%, and as an emulsifier - lipids in an amount of 0.01-10%, and acceptable auxiliary components, flavoring additives and water in an amount - the rest so that these components form MLL and / or e
  • lipids for the active component can be represented by natural mixtures of phospholipids obtained from cyanobacteria of the genus Spirulina or from plants of the genus Urtica (Example 2), or commercial lecithin in compositions with cholesterol to obtain MLL, porphyrin with lipids form MLL or emulsions, and the lotion can be prepared and applied in the form of an emulsion, oral spray, aerosol or inhalation solution and activated with visible light, such as a UVA fluorescent or mercury lamp, a smartphone flashlight (flashlight) LED, daylight before or after application to provide photodynamic (PD-) effects on the pathogenic microflora of the oral cavity and nasopharynx and prevent their diseases.
  • visible light such as a UVA fluorescent or mercury lamp, a smartphone flashlight (flashlight) LED, daylight before or after application to provide photodynamic (PD-) effects on the pathogenic microflora of the oral cavity and nasopharynx and prevent their diseases.
  • the degree of incorporation of feoftin into liposomes (the ratio of active substance/lipids) and the efficiency of incorporation (the ratio of the amount of substance included in liposomes to its total amount) were determined in 2 parallel experiments: gel chromatography and equilibrium lotion dialysis (Example 3).
  • the rate of release of pheophytin from liposomes was estimated by determining the amount of pheophytin in the external solution at fixed intervals and relating it to the total amount of pheophytin incorporated into liposomes.
  • the photostability of pheophytin enclosed in liposomes was evaluated in a "blank" experiment.
  • Dialysis of the lotion showed (Example 3) that the steady-state concentration is 26.8 ⁇ 2.5 ⁇ g/ml.
  • 10% of pheophytin was lost through the outer bilayer membrane, and in the presence of pheophytin in the external solution, this process slowed down even more, so its diffusion from the lipid membrane into the solution was neglected.
  • the calculation gives an incorporation efficiency of 69 ⁇ 3%, which is in good agreement with the gel filtration data (Example 3).
  • the present invention contains a description of a method for obtaining the active substance of porphyrins of natural origin, dosage forms based on this substance, their physicochemical, biological properties, experiments confirming the effectiveness of these pharmaceutical formulations by direct tests on cells, animals and in the clinic, as well as a description of the light sources used in the practical implementation of the FDT method using these dosage forms.
  • the PS preparation method includes extraction, acid treatment to remove the magnesium ion, washing with organic solvents (hexane, acetone), hydrochloric acid and citrate buffer solution, and drying over phosphorus pentoxide in vacuum, differing by the use of flash chromatography in combination with traditional column chromatography to increase efficiency.
  • organic solvents hexane, acetone
  • hydrochloric acid and citrate buffer solution hydrochloric acid and citrate buffer solution
  • drying over phosphorus pentoxide in vacuum differing by the use of flash chromatography in combination with traditional column chromatography to increase efficiency.
  • they first elute with hexane (to remove non-polar impurities), then with a 35:25:4 hexane-chloroform-acetone system on alumina, and enriched fractions are obtained, which are subjected to 3-fold rechromatography on a 25x200 mm column, for which The present invention provides a hexane-chloroform-acetone 35:25
  • LDL multilamellar
  • BOL large unilamellar
  • MOL small unilamellar
  • MOL multilamellar
  • MLL large unilamellar
  • MOL small unilamellar
  • the choice of the type of liposomes used (MLL, BOL or MOL) is usually made depending on the expected biological effect.
  • the type of liposomes determines the degree of incorporation of the substance.
  • the size of liposomes affects their penetration from the bloodstream into tissues (including the rate of excretion from the body), the biodistribution and pharmacological action of the substance included in them. Since the release of a solute from the internal volume of liposomes is limited by the permeability of the lipid bilayer, MLLs, due to their structure, have the highest retention ability.
  • MLLs are also better suited due to their relatively higher content of the lipid phase.
  • the internal volume of MLL reaches 30 ⁇ l/( ⁇ mol lipids).
  • MLL preparations can be formulated with a higher lipid concentration than MOL, which also improves loading efficiency.
  • this solution involves mixing an alcoholic solution of PS (1) with a water-lipid-alcohol mixture (2) with the obligatory use of glycerol or tizol, while adding the first to the second in a turbulent mixing mode.
  • This new technological solution proposed by the present invention is simpler and more convenient for industry than the traditional method of extruding lipids through the aqueous phase of the drug substance or shaking it with a lipid film [Biotechnology. No. 11. 1984. R. 979 - 984. G. Gregoriadis, S. Kirby], methods of ultrasonic dispersion. It is technologically advanced, which is of fundamental importance for the industry.
  • a positive result is achieved through the use of optical radiation sources with a spectrum in the range of 350 - 750 nm with a lower limit in the spectral region above 380 nm (UV-A), and PS based on substances of plant origin, with the most intense absorption in this range, and also means of introducing the latter into the body.
  • sources of optical radiation can operate at a power density of more than 0.1 mW/cm 2
  • the means of introducing the PS are made in the form of a device for dosed oral and intranasal administration with the possibility of additional efficient transport. drug deep into the mucous membranes.
  • the means of introduction contain an additional element for active transport based on ethanol, glycerol or tizol.
  • the practical result of the application of the invention is the provision of a preventive, therapeutic and reparative effect in relation to local immunity cells (macrophages, monocytes) during a controlled procedure at reduced light loads, ensuring its speed, accessibility, comfort, good hiding power through the use of the selected form - spray - the formation of a lipid monolayer on mucous membranes, increased penetration of PS into the tissue due to its hydrophobicity.
  • local immunity cells macrophages, monocytes
  • Fig.1 absorption spectrum of the PS
  • Fig. 2 emission spectra of the light sources used
  • fig.3 example 1 - characteristics of the active substance of the FS and lotion
  • table 1 the relative number of vaccinated, sick, daily increase in morbidity and mortality as of 05.08.21 in regionally close states with different policies in relation to vaccination
  • table 2 the incidence of coronavirus vaccinated and unvaccinated in Israel for the week from 25 to 31.07.21 by age groups
  • table 3 data on the storage of the lotion
  • table 4 the antimicrobial effect of the lotion before and after it use in humans by throat swabs.
  • FIG. 1 shows the absorption spectrum of pheophytin a in the composition according to the invention.
  • FIG. 2 shows the emission spectra of light sources: in Fig. 2a shows the emission spectrum of a mercury lamp with a UV cutoff filter of less than 370 nm; in FIG. 26 shows the spectrum with a luminescent radiation source; in FIG. 2c shows the spectrum for LED light sources used in smartphones.
  • FIG. 3 shows the NMR spectrum of pheophytin a from nettle.
  • Example 1 Obtaining a porphyrin.
  • Example 1.1 Feofitin a from nettle phytomass. Dry nettles were crushed to a powder in a blender and sifted through a sieve. 6.25 liters of 0.0003 and an aqueous solution of sodium dihydrogen phosphate were added to 1.25 kg of minced nettle, the resulting mixture was stirred and left to swell for 2 hours at room temperature. The resulting mixture after swelling was placed in a freezer for freezing for 12 hours. Then the mixture was dosed into centrifuge cups and centrifuged for 10 min at 0°C. The supernatant water-protein fraction was decanted.
  • the precipitate was taken out and treated with acetone (3x2.5 l) until the mixture of chlorophyll a and b was completely extracted.
  • the phytomass was centrifuged, the supernatant (extract) was poured into a flat-bottomed flask. The entire extract obtained was combined and filtered from mechanical impurities. The volume of the obtained extract was determined.
  • 20 ml of concentrated hydrochloric acid was poured into the obtained extract of chlorophylls a and b with vigorous stirring to remove the magnesium ion from the chlorophyll molecule.
  • the excess acid was neutralized with a 20% sodium hydroxide solution to a pH value of 6-8.
  • the pH of the suspension was determined using universal indicator paper.
  • the precipitated mixture of pheophytins was separated by adsorption on a layer of cotton wool.
  • Cotton wool with pheophytin was transferred into a glass using tweezers, and the mixture of pheophytins was extracted with acetone in portions of 50 ml (the total volume of acetone was about 300 ml).
  • the combined extract was filtered through a glass funnel with a layer of cotton wool, poured into a graduated cylinder and then into a weighed round bottom flask.
  • the solvent was evaporated on a rotary evaporator at a bath temperature of (60 ⁇ 2)°C.
  • the flask was placed in a vacuum desiccator with phosphorus pentoxide, the air was evacuated using a vacuum water jet pump for 10 min. The residue was dried in a flask for 12 hours.
  • the flask was weighed on a balance, the mass was determined by difference.
  • Feofytin a from a mixture of pheophytins a and b.
  • a mixture of pheophytins was chromatographed on a 27x100 mm column with alumina (2nd grade according to Brockmann), eluting first with hexane (to remove non-polar impurities), then with a 35:25:4 hexane-chloroform-acetone system, and enriched fractions were obtained, which were subjected to 3-fold rechromatography on a 25x200 mm column.
  • the eluates combined by fractions were filtered through a glass funnel with a layer of cotton wool, poured into a graduated cylinder and measured the volume, then poured into a weighed round-bottom flask.
  • the solvent was evaporated on a rotary evaporator at a bath temperature of (40 ⁇ 2)°C. After evaporation, the flask was placed in a vacuum desiccator with phosphorus pentoxide, the air was evacuated using a vacuum water jet pump for 10 min. The residue was dried in a flask for 12 hours. The flask was weighed on a balance, the mass was determined by difference.
  • the eluates combined by fractions were filtered through a glass funnel with a layer of cotton wool, poured into a graduated cylinder and then into a weighed round bottom flask.
  • the solvent is evaporated on a rotary evaporator at a bath temperature of (40 ⁇ 2)°C.
  • the flask was placed in a vacuum desiccator with phosphorus pentoxide, the air was evacuated using a vacuum water jet pump for 10 min.
  • the residue was dried in a flask for 12 hours.
  • the flask was weighed on a balance, the mass was determined by difference.
  • Example 1.2 Feofitin a from the biomass of Spirulina Platensis.
  • pure pheophytin a was obtained from the biomass of the cyanobacterium Spirulina platensis, without chromatographic separation of the mixture of pheophytins, since it does not contain 6-series derivatives.
  • the yield of pheophytin a was 7.55 ⁇ 0.24 g, which amounted to 0.60 ⁇ 0.02% of the mass of the loaded raw material.
  • Liposomal dosage form Liposomal dosage form.
  • Example 2.1 An alcoholic solution of lecithin (phosphatidylcholine) with intensive stirring in a turbulent mode was added dropwise to a solution of porphyrin in ethyl alcohol mixed with purified water and glycerin (20%), so as to obtain an emulsion containing 0.001% porphyrin and 0.01% lecithin. Flavor was added at the end additive.
  • lecithin phosphatidylcholine
  • Example 2.2 An alcohol solution of lecithin and cholesterol in a molar ratio of 7:3 with vigorous stirring in a turbulent mode was added dropwise to a solution of porphyrin in ethyl alcohol mixed with purified water and tizol (20%), so as to obtain an emulsion containing 0.01% porphyrin and 0 .1% lipids. At the end, a flavoring agent was added.
  • Example 2.3 An alcoholic solution of lipids of the cyanobacterium Spirulina Platensis was added dropwise to a solution of porphyrin in ethyl alcohol mixed with purified water and glycerol (20%) with intensive stirring in turbulent mode, so as to obtain an emulsion containing 0.1% porphyrin and 1% lipids. At the end, a flavoring agent was added.
  • Example 2.4 An alcoholic solution of lipids from stinging nettle with intensive stirring in a turbulent mode was added dropwise to a solution of porphyrin in ethyl alcohol mixed with purified water and glycerin (20%), so as to obtain an emulsion containing 1% porphyrin and 10% lipids. At the end, a flavoring agent was added.
  • Authenticity the emulsion was shaken, an aliquot (0.2e-2 ml) was added to 8.03-9.8 ml of distilled ethyl alcohol, 95%, medical or higher purity, and the optical density was measured at a wavelength of 668 nm (D).
  • the solution in ethanol was yellow-green in color.
  • Quantitative determination an example of porphyrin is pheophytin a
  • the emulsion was shaken, a sample (1 g) was dissolved in 9 g (11.5 ml) of distilled ethyl alcohol, 95%, medical or higher purity, and the optical density was measured at a wavelength of 668 nm (D) .
  • Stability was studied by storage in the dark in hermetically sealed bottles at two temperature conditions: refrigerator (0+5°C) and room (+20+25°C). Every 2 months, 1 ml aliquots were taken in 9 ml of ethanol and the optical density was measured at wavelengths of 509, 538 and 668 nm. The measurements were carried out on a Hitachi 557 writing spectrophotometer. The 509/538 ratio for pure pheophytin was 1.15.
  • the concentration of PS in liposomes and the degree of incorporation of the substance into them were calculated from the measurement of optical density at 414 nm after adding 0.1 ml of a 5.4% SDC solution to 2 ml of the fraction containing liposomes and to the fraction containing unincorporated PS to destroy liposomes and shift absorption from 405 to 414 nm.
  • Dialyzed free feofitin 0.6 ml of an alcohol solution of feofitin with a concentration of 0.8 mg/ml (500 ⁇ g), against phosphate buffer; lotion, 0.6 ml of lotion with a concentration of pheophytin 0.8 mg / ml (600 ⁇ g), - against phosphate buffer; feofitin together with lotion, 0.32 ml of the preparation of unloaded liposomes and 0.28 ml of an alcoholic solution of feofitin with a concentration of 1.7 mg / ml (600 ⁇ g), against phosphate buffer.
  • the lotion was applied as follows: PS was applied with dosing agents to the mucous membranes of the mouth (three presses on the dispenser - 0.12 ml) and nose (one dose in each nostril - 0.04 ml), if necessary, a preliminary fluorescent diagnosis was performed (observation fluorescence) using separate technical means that are not the subject of the present invention, and then for 20 s in each nostril and 40 s in the mouth - treatment with radiation from light sources, with the above spectral-energy parameters. Processing could be accompanied by fluorescence control (monitoring) using fluorescence registration and efficiency evaluation tools (photobleaching, evaluation of the generation of active oxygen particles, which in principle is feasible as a separate technical solution).
  • Antiviral efficacy against coronavirus infection was assessed using a standard rapid PCR test before and 30 minutes after applying the lotion. The second test was negative. The subjects were swabbed from the throat according to the Instructions for the NADAL® COVID 19 Ag test. Sensitivity: 97.56% (Kt range 20-30) / Specificity: > 99.9%.
  • the resulting lotion (liposome preparation) is easy to use (Example 4) and effective in achieving the therapeutic goal (Examples 5-7). It can be used in the form of an aerosol (spray) for the prevention and treatment of a wide range of inflammatory and infectious diseases of the nasopharynx [RF Patent No. 2228775 dated 01.10.2002, Method for photodynamic treatment of acute and chronic purulent sinusitis. Nasedkin A.N., Reshetnikov A.V., et al.], broncho-pulmonary infections in the form of an inhalation form (ultrasonic inhalers) [RF Patent No. 2359711 of 04.25.2007. A device for creating and photoactivating an aerosol.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение относится к химии биологически активных соединений, конкретно, к средству, содержащему производное ряда природных порфиринов формулы (1) и липиды с образованием липосомной формы или эмульсии. Изобретение также относится к фармацевтике, в частности, к производству ингаляционных средств, содержащих природные порфирины, например, феофитин а, феофитин b, или их производные, а в качестве липидов – фосфатидилхолин, холестерин, фосфатидилэтаноламин и прочие, образующие мультиламеллярные липосомы. Изобретение также относится к фотодинамической терапии с применением фотосенсибилизаторов и источников света для генерации активных кислородных частиц в пораженных тканях и патологических клетках.

Description

СРЕДСТВО ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Область техники
Изобретение относится к химии биологически активных соединений, конкретно, к средству, содержащему природный порфирин, например, феофитин а формулы (1)
Figure imgf000002_0001
(1) и природные или модифицированные липиды, в смеси или в виде индивидуальных веществ, так что указанные соединения образуют липосомную форму или эмульсию.
Изобретение также относится к области фармацевтики, в частности, получению композиций, лосьонов-спреев, аэрозолей или жидкостей для ингаляций, содержащих природные порфирины (феофитин а, либо Ь, либо их производные), а в качестве липидов - фосфолипиды (фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и другие), холестерин и прочие полярные липиды, образующие мультиламеллярные липосомы (МЛЛ), как средства эффективной доставки активного компонента в пораженную ткань или клетку.
Изобретение относится также к области медицины, в частности, фотодинамической терапии (ФДТ), с применением фотосенсибилизаторов (ФС) и источников света для генерации активных кислородных частиц в обработанных участках тканей. Указанные соединения, образующие МЛЛ, могут найти применение в качестве ФС для ФДТ коронавирусной инфекции нового типа - SARS CoV-2, поскольку при облучении светом приводят к образованию стабильных в течение нескольких часов в биологических средах активных кислородных частиц. Эти частицы, при определенных условиях, способны взаимодействовать с микроокружением, вызывая его фотохемомодификацию [Способ фотоиммунотерапии фотосенсибилизатором, активируемым волновой энергией вне организма человека. 30.11.2006. Патент РФ № 2006142366. Васильев Н.Е., Решетников А.В., с соавт.], приводящую к эффектам иммуностимуляции и иммуномодуляции. Данные эффекты впоследствии приводят к улучшению работы иммунной системы человека, выражающемуся в усилении ее общего и специфического действия на патогенные факторы, такие как атипичные клетки [Novel TLR2-binding adjuvant induces enhanced T cell responses and tumor eradication. 2018. J. Immunother. Cancer 6: 146. G.G. Zom, M.M.J.H.P. Willems, S. Khan, T.C. van der Sluis, J.W. Kleinovink, M.G.M. Camps, G.A. van der Marel, D.V. Filippov, C.J.M. Melief, and F. Ossendorp], на бактерии, грибки и вирусы, по отношению к циркулирующим иммунным комплексам при аутоиммунных заболеваниях, и также влияющему на медиаторы процесса воспаления в тканях (гистамин и простагландины типа II).
Предшествующий уровень техники
Существуют такие вирусные заболевания, при которых возбудитель проникает через слизистую оболочку, например, носоглотки в клетки, реплицируется в них, выходит в межклеточную среду и разносится с кровью, может впоследствии приводить к поражению кровеносных сосудов и легких, дальнейшим серьезным аутоиммунным патологиям органов и систем человека, - это коронавирусная инфекция нового типа, SARS CoV-2.
Известны средства барьерного типа, например, маски [Aerosol Science and Technology. 2021. Vol. 55, Iss. 4, P. 449-457. Efficacy of face masks, neck gaiters and face shields for reducing the expulsion of simulated cough-generated aerosols. W.G. Lindsley, F.M. Blachere, B.F. Law, D.H. Beezhold & J.D. Noti], используемые для защиты от подобной инфекции. Преимуществами таких средств является простота их применения, доступность, а недостатками - их низкая экологичность, необходимость замены каждые два часа, вред для сердечно-легочной системы людей, ввиду повышенного респираторного сопротивления, их низкая эффективность в связи с тем фактом, что диаметр пор подавляющего большинства подобных барьерных средств превышает размер вирусных частиц.
Известен продукт «Taffix®» в виде порошка, предложенный с целью преодоления недостатков, указанных выше средств, распыляемый в носоглотке для формирования пленки кислого геля, который, подобно маске, защищает слизистую оболочку от проникновения частиц вируса [Taffix® Nasal Powder forms an Effective Barrier against SARS-CoV-2. 2021. Biomed J. Sci. & Tech. Res. 33(3). B.J. Mann, G.B. Moreau, T. Lapidot, D. Megiddo]. Это решение является аналогом настоящего изобретения. Его недостатком является необходимость применения каждые несколько часов, поскольку пленка геля легко разрушается, а также то, что она снижает сенсорные возможности человека и недостаточно активно воздействует на возбудителя, подавляя его лишь за счет своей повышенной кислотности и не влияя на активность фагоцитов, не формируя против вирусных частиц долгосрочной системной устойчивости. Так, недостатком барьерных средств в целом является обеспечение ими лишь пассивной защиты без формирования активного специфического иммунитета.
Известно также использование вакцин для формирования специфического Т-В-клеточного иммунитета в отношении коронавируса нового типа - SARS CoV-2 [Neutralizing Antibody Response of Vaccinees to SARS-CoV-2 Variants. 2021. Vaccines (Basel). 9(5). G. Anichini, C. Terrosi, G.S. Gori, C. Gandolfo, F.Franchi, M.G.Cusi]. Широкая вакцинация населения была призвана выработать «коллективный иммунитет» в отношении возбудителя. Но, во-первых, мутации нового коронавируса опережали разработчиков таких вакцин [NIH National Library of Medicine National Center for Biotechnology Information. 2021, Jun 1. doi: 10.1101/2021.05.26.21257441. Preprint. Emerging SARS-CoV-2 variants of concern evade humoral immune responses from infection and vaccination. T.G. Caniels, et. al.], во-вторых, эффект АЗУИ (антителозависимого усиления инфекции), ранее описанный для предполагаемого технического предшественника вируса SARS CoV-1 [Investigation of antibodydependent enhancement (ADE) of SARS coronavirus infection and its role in pathogenesis of SARS. 2011. BMC Proc. V. 5 (Suppl. 1). P. 80. Yip M.S., Cheung C.Y., Li P.H. et al.], детально не был клинически изучен для большинства вакцин от SARS CoV-2, и, в-третьих, привитыми оказались и те, кто не должен был бы быть привит во время эпидемии по медицинским противопоказаниям. Например, в случае вакцин, основанных на мРНК, тканевые дендритные клетки захватывают ее, синтезируют на ее матрице белки и экспонируют их на поверхности своей мембраны в комплексе МНС II для презентации Т- киллерам. Другие клетки также могут презентовать эти белки, но в комплексе с МНС I. В обоих случаях они могут быть распознаны, как «чужие», и вакцина сориентирует Т-киллеры на нормальные клетки организма, в первую очередь, клетки, отвечающие за функции местного иммунитета. При этом, если в организме имеется воспалительный процесс или произошла чрезмерная активация иммунитета, то у привитых начинают развиваться аутоиммунные заболевания. Это может вызывать осложнения, вплоть до смертельного исхода. По данным «Системы сообщений о неблагоприятных эффектах прививок США (VAERS) на 09.07.21 2939 чел. скончались после прививки вакциной MODERNA и 7366 чел. - вакциной PFIZER.
То, что вакцинация - не лучшее средство, подтверждалось актуальной на время подачи данного патента информацией из общедоступных авторитетных источников (отчеты Министерств здравоохранения стран и ВОЗ на заданную дату) (Табл.1).
Табл.1. Относительное число вакцинированных, больных, суточный прирост заболеваемости и смертности на 05.08.21 в регионально близких государствах с различной политикой по отношению к вакцинации**.
Figure imgf000006_0001
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
Figure imgf000007_0001
* жирным курсивом выделены страны с «жесткой» политикой вакцинации
**за критерий принят 50%-ный порог вакцинации
В Израиле, где первой дозой было вакцинировано 62% населения страны (85% взрослых), а второй - 58% (79% взрослых), где 4% населения страны, 5% взрослого населения и 29% граждан старше 60 лет были привиты третьей дозой, был в 8 раз больше процент больных, чем в соседнем Египте, где 1,3% населения получили две дозы вакцины, 3,6% - одну. Аналогичная ситуация складывалась в почти полностью привитых (70-80%) Великобритании, Исландии и Швеции с тяжело заболевшими и умершими во время «третьей волны». Там, по сравнению с близкими, в региональном Европейском смысле, Украиной, Словенией и Черногорией, где было лишь 10-45% привитых, процент заболеваемости был в 8-50 раз выше, и только между Исландией и Черногорией - сопоставим, но не в пользу Исландии (Табл.1). При этом, надо отметить закрытость Исландии от туристов и более высокий уровень медицины. Аналогичная корреляция по числу вакцинированных и заболевших в «третью волну» прослеживалась и по российским регионам. Лидирующие по вакцинации лидировали и по заболеваемости, и наоборот.
В этой связи, была впоследствии высказана такая точка зрения, что вакцинация уменьшает не заболеваемость, а число госпитализаций (средних и тяжелых случаев) и, наконец, летальность. Однако, и она в дальнейшем не нашла своего подтверждения. «Напротив, те остаточные количества антител к эпитопам белка S, которые будут присутствовать в сыворотке крови вакцинированных на протяжении десятилетий, станут своего рода триггером, запускающим тяжелый инфекционный процесс при повторной встрече иммунной системы человека с CoV» [Вестник войск РХБ защиты. 2020. Т. 4. № 1. С. 32-65. Новый коронавирус SARSCoV-2 в аспекте глобальной эпидемиологии коронавирусных инфекций. Супотницкий М.В.]. Таким образом, прирост числа тяжело больных в наиболее вакцинированных Европейских странах шел в 1,5-18,5 раз быстрее, чем в наименее привитых. В Ближневосточных странах разница в нормированном на 10 млн населения числе тяжело больных тоже была в 30 раз не в пользу Израиля (Табл.1), при закрытой границе и всевозможных ограничениях (в то время, как Египет был открыт для
6
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) туристов и вводил минимальные рестрикции для населения). Двое умерших в день на пике «третьей волны» на небольшую по населению Черногорию (при нулевой смертности в Исландии, но и нулевой же и в 2 раза менее вакцинированной Словении) выбивались из общей картины, в которой Великобритания в 3,5 раза опережала по летальности от коронавируса Украину, а Израиль - в 10 раз - Египет. Отношение числа случаев среднетяжелого течения заболевания и смертности к количеству привитых для Великобритании было в два раза лучше, чем для Украины, и в 1,5 и 5,5 раз, соответственно, лучше, чем для Черногории, но Исландия по показателю тяжелой заболеваемости среди привитых в 2 раза опередила Украину, в 3 - Черногорию, и в 10 - Словению, а Израиль по этому показателю в два раза проиграл Египту, и только по параметру «число умерших к числу вакцинированных» - в два раза опередил его. Но при этом Египет по тому же показателю оказался сопоставим с Великобританией (Табл.1). Так что и с заявлениями по поводу уменьшения смертности у вакцинированных не все было так однозначно. Так, по данным Британского Минздрава на 25.06.21, непривитых заболело 53822 чел., из которых умерло 44 чел. или 0,08%. Вакцинированных заболело 27192 чел., из них умерло 70 чел. или 0,26%, что в три раза больше, чем в группе невакцинированных.
При этом, наблюдалось множество осложнений и даже смертей от вакцин (например, при ИБС и аллергиях). Это вносило не учитываемый в официальной статистике вклад в косвенную заболеваемость и смертность от осложнений, от неоказания своевременной помощи плановым и экстренным больным, а не собственно от COVID-19. Кроме того, по причине АЗУИ, недоисследованности противопоказаний и ограничений к применению вакцин при сплошной вакцинации (например, у лиц, страдающих заболеваниями аллергической природы, нарушениями функций слизистых оболочек, заболеваниями хронического и воспалительного характера, такими как тонзиллиты, риниты, фарингиты, лейкоцитопенией различного генеза и прочими проблемами не только местного, но и системного иммунитета), у привитой части населения могло развиваться значительное количество разнообразных осложнений.
В эпидемиологическом популяционном исследовании, основанном на открытых данных, ежедневно публикуемых Министерством здравоохранения Израиля, процент полностью вакцинированных среди новых заболевших в большинстве возрастных групп старше 20 лет в «третью волну» пандемии превысил процент таковых среди взрослого населения страны в целом (Табл.2) [07.08.2021. Rafael Zioni. Личная коммуникация] и составил в среднем 86% при 85% вакцинированных двумя дозами совершеннолетних граждан.
7
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Табл.2. Заболеваемость коронавирусом привитых и непривитых в Израиле на неделе с 25 по 31.07.2021 по возрастным группам.
Figure imgf000009_0001
Известно применение ФДТ для ирадикации коронавируса нового типа - SARS CoV 2 - in vitro, с ФС «Радахлорин®» [Патент РФ №2183956. Фотосенсибилизатор и способ его получения. Решетников А.В., с соавт.] и источником лазерного излучения с длиной волны 662±3 нм (красный свет) [Photodiagnosis Photodyn. Ther. 2021 Mar; 33: 102112. Antiviral photodynamic therapy: Inactivation and inhibition of SARS-CoV-2 in vitro using methylene blue and Radachlorin. V. A. Svyatchenko, S.D. Nikonov, A.P. Mayorov, M.L. Gelfond and V.B. Loktev], Данный препарат включает комбинацию натриевых солей хлорина еб, хлорина рб, пурпурина 5 в количестве 3.5 мг, с меглюмином 0,2 г в воде объемом 1 мл.
Описанный способ также является аналогом и принят за прототип настоящего изобретения. Преимуществом его использования является селективность, высокая специфичность, низкая цитотоксичность, безвредность для окружающей среды и способность положительно влиять на иммунитет. Среди недостатков - эффект -доказан только in vitro, активный компонент является водорастворимым - легко смывается со здоровых слизистых оболочек и, таким образом, не может быть эффективно применен для профилактики коронавирусной инфекции у здоровых людей, так как является селективным, по сути, только для тканей, в которых уже развился воспалительный процесс, а специфичность противовирусного действия доказана только в лабораторных экспериментах в культуре зараженных вирусом клеток. Еще одним недостатком препарата «Радахлорин®», а также аналогичных ему по основному водорастворимому действующему компоненту, хлорину ев (70-90%), препаратов «Фотолон®», «Фоторан» и «Фотодитазин®», является необходимость активировать их лазерным излучением, что ограничивает их
8
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) использование клиникой, в то время, как профилактическое использование метода ФДТ подразумевает широкую распространенность и доступность источника их фотоактивации у населения. Активация нелазерными источниками (светодиодными, широкополосными, люминесцентными, а также дневным светом) не упоминается в инструкциях по медицинскому применению данных лекарственных средств, в то время как именно они имеются в распоряжении почти у каждого человека.
Раскрытие изобретения
Предложено средство для профилактики и лечения инфекционно-воспалительных заболеваний полости рта, носоглотки и верхних дыхательных путей методом фотодинамической терапии, содержащее фотосенсибилизатор порфириновой природы, отличающееся тем, что в качестве порфирина используется феофитин а (13,15-[15’- метоксициклопентан- 13 ’ -он] ил- 17- [2-карбоксифитилэтил] - 15 -карбоксиметил- 17, 18- /7?/ ///с-дигидро-3-винил-8-этил-2,7, 12, 18-тетраметилпорфирин) формулы
Figure imgf000010_0001
или феофитин Ъ или их производное в количестве 0,001-1%, в форме препарата с природными или модифицированными липидами в количестве 0,01-10%, в смеси или в виде индивидуальных веществ, при этом указанные соединения образуют липосомы или эмульсию в композиции с приемлемыми вспомогательными компонентами, вкусоароматическими добавками и водой в количестве - остальное.
В одном из вариантов реализации средство согласно изобретению включает липиды для солюбилизации активного компонента из группы фосфатидилхолинов и других липидов, полученных из цианобактерий рода Spirulina. В другом варианте реализации средство включает липиды для солюбилизации активного компонента из группы фосфатидилхолинов и других липидов, полученных из растений рода Urtica.
В еще одном варианте реализации средство включает липиды для солюбилизации активно компонента в виде индивидуального лецитина и 9
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) холестерина в мольном соотношении 7:3. В еще одном варианте реализации средство включает феофитины с фосфатидилхолином в виде мультиламеллярных липосом.
При этом, эти липосомы могут быть получены с применением других липидов, например, фосфатидилинозитола или фосфатидилэтаноламина.
Средство согласно изобретению может быть изготовлено и применено в форме лосьона-спрея, аэрозоля с возможностью дозирования, ополаскивателя для полости рта, жидкости для ингаляций.
При применении средство может быть активировано светом с длиной волн УФ- А и видимого диапазона для оказания фотодинамического воздействия на патогенную микрофлору полости рта и носоглотки и профилактики их заболеваний.
Задачей настоящего изобретения является разработка средства, эффективного in vivo, с возможностью обеспечения пассивной защиты от инфицирования в виде липидной пленки в носоглотке, активный компонент которого является липофильным, для хорошего проникновения в здоровые слизистые оболочки, активации некогерентными источниками излучения (светодиодными, щирокополосными, люминесцентными, а также дневным светом), превентивного действия по отношению к возбудителю, к прививкам, приводящим к феномену АЗУИ, и других видам гетерологичных иммунных ответов, связанных с перекрестными реакциями Т-киллеров [Eur J Immunol. 1980. May; 10(5):396-401. Cross-protection and cross-reactive cytotoxic T cells induced by influenza virus vaccines in mice. R.G. Webster, B.A.Askonas], то есть создать защиту как барьерного, так и прямого противовирусного и активирующего естественный фагоцитарный иммунитет действия.
ФДТ-воздействие предлагаемого средства является наиболее щадящим по отношению к иммунной системе человека, исходит из принципа «не навреди», способствует модулированию иммунного ответа по отношению к актуальным, а не устаревшим штаммам вируса и опирается на идею, что проще не заболеть, чем потом вылечить. Во-первых, предлагаемое средство механически препятствует проникновению вируса в слизистую оболочку. Во- вторых, при облучении светом, оно инактивирует скопившиеся в липидной пленке частицы вируса. В-третьих, этими фрагментами вирусных частиц может достигаться эффект иммуномодуляции вплоть до появления специфических «нейтрализующих» антител без применения вакцин. Формирование антител без применения экзовакцины было описано для случаев ФДТ рака с аналогичными производными порфиринового ряда [Specific anti-tumor immune response with photodynamic therapy mediated by benzoporphyrin derivative and chlorin (e6). 2003. Proc. SPIE 4961, 1-9. A.P. Castano, F. Gad, T. Zahra, M.R. Hamblin]. В экспериментах по ФДТ рака для данного метода воздействия на ткань был также описан его высокий потенциал активировать макрофаги, переключать их тип с толерантных к раку обратно в направлении их нормальной функции и, таким образом, компенсировать ущерб, наносимый клеткам местного иммунитета действием повышенного титра антител в крови людей, переболевших и снова заразившихся или многократно повторно вакцинируемых от коронавируса (эффект АЗУИ) [Clin. Cancer Res. 2016 Mar 15. 22(6): 1459-68. Combination of Photodynamic Therapy and Specific Immunotherapy Efficiently Eradicates Established Tumors. J.W. Kleinovink, P.B. van Driel, T.J. Snoeks, N. Prokopi, M.F. Fransen, L.J. Cruz, L. Mezzanotte, A. Chan, C.W. Lowik, F. Ossendorp], Именно местный иммунитет слизистых оболочек является естественной преградой на пути любой инфекции. Подрыв этой функции у вакцинированных, как было показано выше, делает их более уязвимыми не только к новым, более заразным и тяжелым формам самой коронавирусной инфекции, но и к прочим патогенам, раковым клеткам и токсичным продуктам жизнедеятельности организма.
Таким образом, стоит задача поддержания нормальной функции местного фагоцитарного звена иммунитета у здоровых людей и ее восстановления у переболевших и вакцинированных, особенно, перед угрозой новых «волн» пандемии.
Поставленная задача была решена предлагаемым средством - препаратом, содержащим ФС - производное порфиринового ряда (хлорин природного происхождения) и липиды, отличающимся тем, что, производные порфиринового ряда представлены гидрофобными ФС, а препарат изготовлен в форме эмульсии, лосьона - спрея, аэрозоля, раствора для ингаляций, МЛЛ. В предлагаемое решение также входит способ получения активного вещества и готовой формы и способ применения, при котором облучение препарата в носоглотке светом от любого источника индуцирует инактивацию вирусных частиц, а липидная пленка механически препятствует их проникновению в слизистые оболочки. ФДТ активирует макрофаги и может модулировать иммунный ответ возникающими в результате фотохимической реакции фрагментами вирусных частиц, вплоть до появления специфических «нейтрализующих» антител, может преодолевать эффект АЗУИ за счет активации макрофагов и переключения их типа обратно в направлении их нормальной функции и, таким образом, компенсировать ущерб, наносимый им действием повышенного титра антител в крови людей, переболевших и повторно заразившихся в течение 7 месяцев или/и неоднократно вакцинированных/заболевших в течение 6 мес после прививки от коронавируса.
При решении поставленной задачи, в данном изобретении предложен лосьон, содержащий ФС порфириновой природы, отличающийся тем, что в качестве порфирина взят гидрофобный феофитин а (13,15-[15’- метоксициклопентан- 13 ’ -он]ил- 17- [2-карбоксифитилэтил] - 15 - карбоксиметил-17,18-/и <тнс-дигидро-3-винил-8-этил-2,7,12,18- тетраметилпорфирин (ШРАС), 1,3,5,8-тетраметил-4-этил-2-винил-9-оксо-10- карбметокси-форбин-7-фитиловый эфир пропионовой кислоты (систематическая)) (Пример 1)
Figure imgf000014_0001
в количестве 0,001-1%, а в качестве эмульгатора - липиды в количестве 0,01-10%, и приемлемые вспомогательные компоненты, вкусо-ароматические добавки и вода в количестве - остальное так, что указанные компоненты образуют МЛЛ и/или эмульсии.
При этом липиды для активного компонента могут быть представлены природными смесями фосфолипидов, полученных из цианобактерий рода Spirulina или из растений рода Urtica (Пример 2), либо коммерческим лецитином в композициях с холестерином для получения МЛЛ, порфирин с липидами образуют МЛЛ или эмульсии, а лосьон может быть изготовлен и применен в форме эмульсии, спрея для полости рта, аэрозоля или раствора для ингаляций и активирован светом с длиной волны видимого диапазона, например, УФА-люминесцентной или ртутной лампой, светодиодом лампы- вспышки (фонарика) смартфона, дневным светом до или после нанесения для оказания фотодинамического (ФД-) воздействия на патогенную микрофлору полости рта и носоглотки и профилактики их заболеваний.
При концентрации феофитина менее 0,001% выраженного противовирусного и антимикробного эффекта не наблюдается (Табл.4). При концентрации феофитина более 1% наблюдается повреждение здоровых тканей при облучении, экранирование излучения, и его плохое проникновение в ткани. При содержании липидов менее 0,01% образуемые липосомы не стабильны и не обеспечивают транспорта феофитина в глубь слизистой оболочки, также не формируют достаточной толщины и протяженности пленку для обеспечения пассивной защиты от вируса. При содержании липидов более 10% указанная композиция превращается в плотную эмульсию, мало пригодную для нанесения способом распыления, забиваются дозаторы, ухудшаются коллоидные свойства системы (Пример 2).
Степень включения феофтина в липосомы (отношение активное вещество/липиды) и эффективность включения (отношение количества вещества, включившегося в липосомы, к его общему количеству) определяли в 2-х параллельных экспериментах: гель-хроматографией и равновесным диализом лосьона (Пример 3). Состав лосьона можно представить следующим образом: несвязанный ФС/мембраносвязанный ФС/внутрилипосомный ФС = 280/>460/<120 ±35 мкг = 31/>54/<14 ±4% в 1 мл.
Скорость выхода феофитина из липосом оценивали, определяя через фиксированные промежутки времени количество феофитина во внешнем растворе и относя его к общему количеству феофитина, включившемуся в липосомы. Фотостабильность заключенного в липосомы феофитина оценивали в "холостом" опыте.
Диализ лосьона показал (Пример 3), что равновесная концентрация составляет 26,8 ± 2,5 мкг/мл. За 10 суток через внешнюю бислойную мембрану терялось 10% феофитина, а в присутствии феофитина во внешнем растворе этот процесс еще более замедлялся, поэтому его диффузией из липидной мембраны в раствор пренебрегли. Расчет дает эффективность включения 69±3%, что хорошо согласовывалось с данными гель-фильтрации (Пример 3).
Настоящее изобретение содержит описание способа получения активной субстанции порфиринов природного происхождения, лекарственных форм на основе данной субстанции, их физико-химических, биологических свойств, экспериментов, подтверждающих эффективность данных фармацевтических готовых форм прямыми тестами на клетках, животных и в клинике, а также описание световых источников, используемых при практической реализации метода Ф ДТ с применением этих лекарственных форм.
Способ получения ФС включает экстракцию, обработку кислотой для удаления иона магния, промывку органическими растворителями (гексаном, ацетоном), соляной кислотой и цитратным буферным раствором и сушку над пятиокисью фосфора в вакууме, отличаясь применением флэш- хроматографии в сочетании с традиционной колоночной для повышения эффективности. Согласно предложенному способу, элюируют сначала гексаном (для удаления неполярных примесей), затем системой гексан- хлороформ-ацетон 35:25:4 на окиси алюминия, и получают обогащенные фракции, которые подвергают 3-х кратной рехроматографии на колонке 25x200 мм, для чего в настоящем изобретении предложена система гексан- хлороформ-ацетон 35:25:4. Это позволяет на промышленном этапе не только очистить до необходимой фармацевтической степени чистоты 95% сырой феофитин а из цианобактерии Spirulina platensis, разделив его на фракции липидов, каротины и ксантофилы, но и разделить феофитины а и b в случае применения сырья из высших растений, например, крапивы двудомной (Urtica). (Пример 1.1).
По типу липосомы бывают мультиламеллярные (МЛЛ), большие однослойные (БОЛ), маленькие однослойные (МОЛ). Выбор типа используемых липосом (МЛЛ, БОЛ или МОЛ) обычно осуществляется в зависимости от ожидаемого биологического эффекта. Тип липосом определяет степень включения вещества. Размер липосом влияет на их проникновение из кровотока в ткани (в т.ч. на скорость выведения из организма), на биораспределение и фармакологическое действие включенного в них вещества. Поскольку выход растворенного вещества из внутреннего объема липосом ограничен проницаемостью липидного бислоя, МЛЛ, благодаря своей структуре, обладают наибольшей удерживающей способностью. Для крупных липофильных молекул также лучше подходят МЛЛ, ввиду относительно большего содержания в них липидной фазы. Внутренний объем МЛЛ достигает 30 мкл/(мкмоль липидов). Препараты МЛЛ могут быть приготовлены с более высокой концентрацией липидов, чем МОЛ, что также способствует увеличению эффективности загрузки.
Итак, в данном изобретении был остановлен выбор на МЛЛ, полагая, что предложенный ФС, как крупная и липофильная молекула, должен, по сравнению с другими типами липосом, включаться в них лучше и удерживаться дольше. Кроме того, МЛЛ получать просто, что немаловажно для промышленной реализации изобретения и экономического эффекта. Таким образом, данное решение подразумевает перемешивание спиртового раствора ФС (1) с водно-липидно-спиртовой смесью (2) при обязательном применении глицерина или тизоля, при добавлении первого ко второму в турбулентном режиме смешивания. Это новое технологическое решение, предлагаемое настоящим изобретением, проще и удобнее для промышленности, чем традиционная методика экструзии липидов через водную фазу лекарственной субстанции или встряхивания ее с липидной пленкой [Biotechnology. №11. 1984. Р. 979 — 984. G. Gregoriadis, С. Kirby], способы ультразвукового диспергирования. Оно технологично, что имеет принципиальное значение для промышленности.
Положительный результат достигается за счет использования источников оптического излучения со спектром в диапазоне 350 - 750 нм с нижней границей в спектральной области свыше 380 нм (УФ- А), и ФС на основе веществ растительного происхождения, с наиболее интенсивным поглощением именно в этом диапазоне, а также средств введения последнего в организм. При этом, источники оптического излучения могут работать при плотности мощности свыше 0,1 мВт/см2, а средства введения ФС выполнены в форме устройства для дозированного перорального и интраназального введения с возможностью дополнительного эффективного транспорта препарата в глубь слизистых оболочек. Средства введения содержат дополнительный элемент для активного транспорта на основе этанола, глицерина или тизоля.
Практическим результатом применения изобретения является обеспечение профилактического, терапевтического и репарационного в отношении клеток местного иммунитета (макрофагов, моноцитов) эффекта при контролируемой процедуре при пониженных световых нагрузках, обеспечивающих ее быстроту, доступность, комфортность, хорошую укрывистость за счет применения выбранной формы - спрея - формирование липидного монослоя на слизистых оболочках, увеличенное проникновение ФС в ткань за счет его гидрофобности.
Структура предлагаемого решения иллюстрирована рисунками: фиг.1 - спектр поглощения ФС, фиг. 2 - спектры излучения примененных источников света, фиг.З и пример 1 - характеристики активного вещества ФС и лосьона, а также таблицами: табл.1 - относительное число вакцинированных, больных, суточный прирост заболеваемости и смертности на 05.08.21 в регионально близких государствах с различной политикой по отношению к вакцинации, табл.2 - заболеваемость коронавирусом привитых и непривитых в Израиле за неделю с 25 по 31.07.21 по возрастным группам, табл.З - данные по хранению лосьона, табл.4 - антимикробный эффект лосьона до и после его применения у людей по мазкам из зева.
Краткое описание чертежей
На Фиг. 1 представлен спектр поглощения феофитина а в составе композиции согласно изобретению.
На Фиг. 2 представлены спектры излучения источников света: на Фиг. 2а представлен спектр излучения ртутной лампы с фильтром отсечки УФ менее 370 нм.; на Фиг. 26 представлен спектр при люминесцентном источнике излучения; на Фиг. 2в представлен спектр при светодиодных источниках излучения, используемых в смартфонах. На Фиг. 3 представлен спектр ПМР феофитина а из крапивы.
Варианты осуществления изобретения
Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения.
Пример 1. Получение порфирина.
Пример 1.1. Феофитин а из фитомассы крапивы. Сухую крапиву размельчали до состояния порошка в блендере и просеивали через сито. В 1,25 кг измельченной крапивы добавляли 6,25 литров 0,0003 и водного раствора дигидрофосфата натрия, полученную смесь перемешивали и оставляли для набухания на 2 часа при комнатной температуре. Полученную смесь после набухания ставили в морозильник для вымораживания на 12 ч. Затем смесь дозировали в центрифужные стаканы и центрифугировали 10 мин при 0°С. Надосадочную водно-белковую фракцию сливали. Осадок вынимали и обрабатывали ацетоном (3x2, 5л) до полного извлечения смеси хлорофилла а и Ь. Фитомассу центрифугировали, надосадочную жидкость (экстракт) сливали в плоскодонную колбу. Весь полученный экстракт объединяли и фильтровали от механических примесей. Определяли объем полученного экстракта.
Смесь феофитинов а и b из смеси хлорофиллов а и Ь. В полученный экстракт хлорофиллов а и b при интенсивном перемешивании приливали 20 мл концентрированной соляной кислоты для удаления из молекулы хлорофилла иона магния. Выдерживали 20 мин при комнатной температуре. Избыток кислоты нейтрализовали 20%-ным раствором натрия едкого до значения pH 6-8. Определяли pH суспензии с помощью универсальной индикаторной бумаги. Выпавшую смесь феофитинов отделяли адсорбцией на слое хлопковой ваты. Вату с феофитином переносили в стакан при помощи пинцета, и экстрагировали смесь феофитинов ацетоном порциями по 50 мл (общий объем ацетона около 300 мл). Объединенный экстракт профильтровывали через стеклянную воронку со слоем ваты, переливали в мерный цилиндр и затем во взвешенную круглодонную колбу. Растворитель упаривали на роторном испарителе при температуре бани (60±2)°С. После упаривания колбу помещали в вакуум-эксикатор с пятиокисью фосфора, откачивали воздух с помощью вакуумного водоструйного насоса в течение 10 мин. Остаток высушивали в колбе в течение 12 часов. Колбу взвешивали на весах, массу определяли по разности.
Феофитин а из смеси феофитинов а и Ь. Смесь феофитинов хроматографировали на колонке 27x100 мм с окисью алюминия (II ст. акт. по Брокманну), элюируя сначала гексаном (для удаления неполярных примесей), затем системой гексан-хлороформ-ацетон 35:25:4, и получали обогащенные фракции, которые подвергали 3-х кратной рехроматографии на колонке 25x200 мм. Объединенные по фракциям элюаты (контроль по ТСХ) профильтровывали через стеклянную воронку со слоем ваты, переливали в мерный цилиндр и измеряли объем, затем переливали во взвешенную круглодонную колбу. Растворитель упаривали на роторном испарителе при температуре бани (40±2)°С. После упаривания колбу помещали в вакуум - эксикатор с пятиокисью фосфора, откачивали воздух с помощью вакуумного водоструйного насоса в течение 10 мин. Остаток высушивали в колбе в течение 12 часов. Колбу взвешивали на весах, массу определяли по разности.
Спектр ПМР феофитина а (1,5 мг/мл, CDCI3): 9,55, 9,41, 8,58 (ЗН, все с, мезо-Н); 8,02 (т, СН=СН2); 6,29 (с, 10-Н); 6,26 (д, -СН=СН2); 5,15 (Р2, т, =СН- ), 4,49 (Р1, м, -СН2-); 4,47 (м, 8-Н); 4,23 (уд, 7-Н), 3,90 (с, Ю-СО2СН3); 3,74 (с, 5-СНз); 3,70 (к, 4-СН2СН3); 3,43 (с, 1-СН3); 3,26 (с, 3-СН3); 2,64 (м, 7-СН-СН-); 2,49 (м, 7-СН-СН-), 2,36 (м, 7-СН-СН-); 2,21 (м, 7-СН-СН-); 1,91 (ук, Р4, =ССН2-); 1,82 (д, 8-СНз); 1,72 (т, 4-СН2СН3); 1,60 (с, РЗ =ССН3-); 1,03-1,54 (16Н, м, Р5-Р14 -СН2- и ЗН, м, Р7, Р11, Р15 -СН-); 0,87, 0,82, 0,78 (12Н, д, Р7, РП, Р15, Р16- СНз); -1,42, -1,60, (2Н, ус, неравн. пит., 2х -NH-).
Спектр поглощения в видимой области, этанол 95%, X тах (Е*10‘3), НМ: 416 (115,8), 509 (12,7), 538 (11,0), 668 (55,5).
Наработка крупных партий феофитина а из фитомассы крапивы. Разработанная полупромышленная технология получения феофитина а из фитомассы крапивы отличается от описанной (см. выше) применением флэш- хроматографии на стадии очистки. Смесь феофитинов хроматографировали на фильтре 100x100 мм со стеклянной пористой пластинкой под давлением 2 атм с окисью алюминия (II ст. акт. по Брокманну), элюируя системой гексан- хлороформ-ацетон 35:25:4, и получали обогащенные фракции, которые подвергали 3-х кратной повторной флэш-хроматографии. Объединенные по фракциям элюаты (контроль по ТСХ) профильтровывали через стеклянную воронку со слоем ваты, переливали в мерный цилиндр и затем во взвешенную круглодонную колбу. Растворитель упаривают на роторном испарителе при температуре бани (40±2)°С. После упаривания колбу помещали в вакуум - эксикатор с пятиокисью фосфора, откачивали воздух с помощью вакуумного водоструйного насоса в течение 10 мин. Остаток высушивали в колбе в течение 12 часов. Колбу взвешивали на весах, массу определяли по разности.
Пример 1.2. Феофитин а из биомассы Spirulina Platensis.
Аналогично получали чистый феофитин а из биомассы цианобактерии Spirulina Platensis, без хроматографического разделения смеси феофитинов, так как в ней не содержится производных 6-ряда. При обработке спирулины выход феофитина а, при загрузке в 1,25 кг, составил 7,55 ± 0,24 г, что составило 0,60 ± 0,02 % от массы загруженного сырья. При обработке крапивы получали два продукта: феофитин а, при загрузке в 1,25 кг, его выход составил 2,25 ± 0,15 г, что составило 0,18 ± 0,01 % от общей загрузки; феофитин b (пример другого порфирина).
Пример 2.
Липосомная лекарственная форма.
Пример 2.1. Спиртовой раствор лецитина (фосфатидилхолина) при интенсивном перемешивании в турбулентном режиме прикапывали к раствору порфирина в спирте этиловом, смешанному с водой очищенной и глицерином (20%), так, чтобы получить эмульсию, содержащую 0,001% порфирина и 0,01% лецитина. В конце добавляли вкусоароматическую добавку.
Пример 2.2. Спиртовой раствор лецитина и холестерина в мольном соотношении 7:3 при интенсивном перемешивании в турбулентном режиме прикапывали к раствору порфирина в спирте этиловом, смешанному с водой очищенной и тизолем (20%), так, чтобы получить эмульсию, содержащую 0,01% порфирина и 0,1% липидов. В конце добавляли вкусоароматическую добавку.
Пример 2.3. Спиртовой раствор липидов цианобактерии Spirulina Platensis при интенсивном перемешивании в турбулентном режиме прикапывали к раствору порфирина в спирте этиловом, смешанному с водой очищенной и глицерином (20%), так, чтобы получить эмульсию, содержащую 0,1% порфирина и 1% липидов. В конце добавляли вкусоароматическую добавку.
Пример 2.4. Спиртовой раствор липидов из крапивы двудомной при интенсивном перемешивании в турбулентном режиме прикапывали к раствору порфирина в спирте этиловом, смешанному с водой очищенной и глицерином (20%), так, чтобы получить эмульсию, содержащую 1% порфирина и 10% липидов. В конце добавляли вкусоароматическую добавку.
Описание: устойчивая, не расслаивающаяся при хранении в течение 1 года эмульсия от желтоватого до желто-зеленого цвета, без запаха или с запахом водорослей или крапивы (без отдушки). Эмульсия не должна расслаиваться при центрифугировании 5 минут и 8000 об/мин.
Подлинность: эмульсию встряхивали, аликвоту (0,2э-2 мл) добавляли к 8,0з-9,8 мл спирта этилового ректификационного, 95%, медицинского или высшей очистки и измеряют оптическую плотность на длине волны 668 нм (D). Рассчитывали молекулярную экстинкцию Е (М_ |СМ_ | ) ПО формуле E=D*888/(0,0016-=-0,016). Полученное значение должно находиться в диапазоне 50000-55000.
Раствор в этиловом спирте имел желто-зеленый цвет. Количественное определение (пример порфирина - феофитин а) эмульсию встряхивали, навеску (1 г) растворяли в 9 г (11,5 мл) спирта этилового ректификационного, 95%, медицинского или высшей очистки и измеряли оптическую плотность на длине волны 668 нм (D). Рассчитывали содержание феофитина по формуле: c,%=(D*888*9*l l,2)/(55500*l).
Полученное значение соответствовало заданному (0,08%).
Устойчивость изучали путем хранения в темноте в герметически укупоренных склянках при двух температурных режимах: холодильника (0+5°С) и комнаты (+20+25°С). Каждые 2 месяца отбирали аликвоты 1 мл в 9 мл этанола и измеряли оптическую плотность на длинах волн 509, 538 и 668 нм. Измерения проводились на пишущем спектрофотометре Hitachi 557. Соотношение 509/538 для чистого феофитина составляло 1,15. При распаде хлоринового макроцикла до линейных тетрапирролов уменьшалась величина поглощения на длине волны 668 нм (и, соответственно, уменьшалась удельная экстинкция) и одновременно уменьшалось соотношение 509/538 за счет одновременного роста поглощения на обеих длинах волн (росло фоновое поглощение в этом диапазоне длин волн). Изменение данных контрольных величин за 2 мес. и за год представлено в Табл.З.
Известно, что уменьшение экстинкции при хранении примерно на 5-10% в год для фармацевтических форм допустимо. В данном примере хранение в условиях холодильника ведет к уменьшению обоих показателей на 4-13% за год, а в условиях комнаты - на 15-16% за год. При этом сохраняется однородность эмульсии (не образуется осадка), что важно для фармацевтики.
Наряду с измерением оптических свойств лосьона в процессе хранения проводили анализ образцов методом тонкослойной хроматографии. Для этого брали аликвоты 0.1 мл, и проводили ТСХ на пластинках Kieselgel 60 F254 “Merck” в системе гексан/ацетон 7:3. Согласно этому анализу, во всех образцах заметное образование неполярных продуктов желтого цвета началось с 4-го месяца хранения и в наибольшей степени отмечалось в образцах, хранение которых осуществлялось при комнатной температуре. Этот процесс коррелирует с падением экстинкции. В результате исследования, предлагаемый срок хранения составил 1 год в условиях холодильника или 4 мес при комнатной температуре.
Табл.З. Данные по хранению лосьона.
Figure imgf000024_0001
Пример 3.
Определение параметров липосом
[Биоорганическая химия. 1999. №10. с.782-790. Получение и некоторые свойства липосомного препарата 2,4-ди(1-метил-3- гидроксибутил)дейтеропорфирина-1Х. Решетников А.В., и др.]. Лосьон (0.1 мл) наносили на колонку с 15 мл сефадекса G-50 в физиологическом растворе и элюировали физиологическим раствором со скоростью 2 мл/мин. Собирали две фракции, поглощающие при 405 и 414 нм, первая из которых содержала нагруженные липосомы, а вторая - свободный феофитин. Концентрацию ФС в липосомах и степень включения в них вещества рассчитывали по данным измерения оптической плотности при 414 нм после добавления к 2 мл фракции, содержащей липосомы, и к фракции, содержащей не включившийся ФС, по 0.1 мл 5.4% раствора SDC для разрушения липосом и сдвига поглощения с 405 к 414 нм.
Расчетная формула: Включение ФС в липосомы (%) =
DI*V!*100/(D 2*V2+D2*V2); где Di - оптическое поглощение фракции липосом после добавления SDC,
D2 - оптическое поглощение фракции не включившегося ФС после добавления SDC, V/ - суммарный объем фракции липосом, мл, V2 - суммарный объем фракции не включившегося ФС, мл.
Равновесный диализ. В пробирки со шлифами и пробками емкостью 25 мл помещали 5 мл фосфатного буфера, еще 4.5-5 мл вносили внутрь каждого диализного мешочка. Эксперименты проводили на качалке при 20 °C, в 3-х повторах каждый.
Диализовали свободный феофитин, 0,6 мл спиртового раствора феофитина с концентрацией 0,8 мг/мл (500 мкг), - против фосфатного буфера; лосьон, 0,6 мл лосьона с концентрацией феофитина 0,8 мг/мл (600 мкг), - против фосфатного буфера; феофитин совместно с лосьоном, 0,32 мл препарата незагруженных липосом и 0,28 мл спиртового раствора феофитина с концентрацией 1,7 мг/мл (600 мкг), - против фосфатного буфера. Для определения "захвата" феофитина из внешнего раствора незагруженными липосомами диализовали 0,32 мл препарата незагруженных липосом в буфере против раствора 0,6 мл (500 мкг) феофитина в этаноле с начальной концентрацией феофитина 0,8 мг/мл. При определении зависимости поправочного коэффициента к на нестабильность феофитина от времени к 9,4 мл буферного раствора прибавляли 0,6 мл спиртового раствора феофитина с концентрацией 0,8 мг/мл (500 мкг). Концентрацию феофитина (в мкг/мл) вычисляли по формуле С =11.2 х Dcp, где 11.2 - коэффициент пересчета, связывающий концентрацию и оптическую плотность (при 414 нм) эталона феофитина, Dcp - усредненное значение оптической плотности в эксперименте. Исправленные концентрации получали, умножая С на поправочный коэффициент к. Для определения концентраций на короткое время извлекали диализный мешочек, измеряли оптическую плотность раствора и возвращали мешочек на место. Диализ считали завершенным, когда изменение концентрации феофитина во внешнем растворе переставало детектироваться.
Пример 4.
Применение.
Лосьон применяли следующим образом: ФС с помощью дозирующих средств наносят на слизистые оболочки рта (три нажатия на дозатор - 0,12 мл) и носа (по одной дозе в каждую ноздрю - 0,04 мл), при необходимости проводили предварительную флуоресцентную диагностику (наблюдение флуоресценции) с помощью отдельных, не являющихся предметом настоящего изобретения, технических средств, и далее в течение 20 с в каждую ноздрю и 40 с в рот - обработку излучением источников света, при вышеприведенных спектро-энергетических параметрах. Обработка могла сопровождаться контролем (мониторингом) флуоресценции с помощью средств регистрации флуоресценции и оценки эффективности (фотообесцвечивание, оценка генерации активных кислородных частиц, что в принципе реализуемо, как отдельное техническое решение).
В качестве источников оптического облучения использованы:
- ртутные лампы (аппарат ОРК-2 на базе ртутной лампы ДРТ 400 с фильтром отсечки УФ менее 370 нм, лампа ртутная ДРВ Philips ML 160W, ОУФК-01 New «Солнышко» 380-450 нм);
- У ФА- люминесцентные лампы Philips;
- светодиодные источники (сверхъяркие светодиоды LUMILEDS HPWN МВ00-00000 430-470 устройства для создания и фотоактивации аэрозоля [ibid.] или аналогичные, применяемые в качестве фонариков и вспышек для смартфонов), а в качестве препарата использован лосьон - спрей на основе порфирина с фосфатидилхолином, образующих МЛЛ, средством нанесения служил дозатор типа механического поршневого насоса с распылителем, средством регистрации флуоресценции служили или очки с интерференционным покрытием 650-670 нм, или видеокамера с фильтром выделения диапазона 650-670 нм, подсоединенная либо к видеоустройству, либо к PC со специализированной программой обработки изображения и блоком, формирующим сигнал при спаде интенсивности флуоресценции в 10 раз.
Пример 5.
Оценка эффективности.
Противовирусную эффективность по отношению к коронавирусной инфекции оценивали с помощью стандартного экспресс -ПЦР-теста до и через 30 мин после применения лосьона. Повторный тест был отрицательным. У испытуемых брали мазок из горла согласно Инструкции к тесту NADAL® COVID 19 Ag. Чувствительность: 97,56 % (диапазон Кт 20-30)/ Специфичность : > 99,9 %.
Пример 6.
Оценка коэффициента активации макрофагов.
Проводили по стандартной методике in vitro, взяв 5 мл венозной крови испытуемого, прибавив 0,04 мл лосьона (1 нажатие на дозатор) и облучив образец, как указано выше, в течение 20 с в тонком слое (в лунке).
Пример 7.
Оценка иммунизирующего действия.
Проводили на трех добровольцах по способу и из групп, описанных в Примере 4, по случайной выборке, с дополнительным анализом на IgM и IgG до исследования, в середине и в конце месяца (три анализа). У одного испытуемого были обнаружены IgM + IgG в середине месяца, у одного - IgG в конце месяца и еще у одного - не обнаружено антител. При этом симптомов заболевания не наблюдалось, ПЦР-тест давал у всех отрицательный результат.
Пример 8. Оценка пассивного защитного действия.
Проводили на трех группах из 30 здоровых добровольцев каждая, возрастом от 12 до 65 лет. Лосьон применяли в период пиков трех волн пандемии коронавируса нового типа в 2020-2021 гг при посещении мест скопления людей, появлении симптомов ОРВИ, по желанию несколько раз в день, а также обязательно ежедневно на ночь в течение 1 мес, при условии отказа от ношения маски и от прочих защитных и профилактических средств. В группах испытуемых не наблюдалось заболевших с подтвержденным медицинским диагнозом, в то время, как таковые имелись в их непосредственном окружении.
Табл.4. Антимикробный эффект лосьона до и после его применения у людей по мазкам из зева.
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000029_0001
Промышленная применимость
Полученный лосьон (липосомный препарат) прост в применении (Пример 4) и эффективен в достижении поставленной терапевтической задачи (Примеры 5-7). Он может быть применен в форме аэрозоля (спрея) для профилактики и лечения широкого круга воспалительных и инфекционных заболеваний носоглотки [Патент РФ №2228775 от 01.10.2002 г. Способ фотодинамического лечения острого и хронического гнойного гайморита. Наседкин А.Н., Решетников А.В., с соавт.], бронхо -легочных инфекций в виде ингаляционной формы (ультразвуковые ингаляторы) [Патент РФ №2359711 от 25.04.2007. Устройство для создания и фотоактивации аэрозоля. Армичев А.В., Решетников А.В., с соавт.], а также дезинфекции и защиты кожных покровов тела и дезинфекции поверхностей за счет взаимодействия одного из его активных компонентов (ФС) со светом (эффект фотодинамической терапии) (Пример 9) [Патент РФ №2379073 от 11.09.2007. Способ лазерного лечения хронического тонзиллита с применением фотосенсибилизатора. Пыхтеева Е.Н., Решетников А.В., с соавт.].

Claims

Формула изобретения
1. Средство для профилактики и лечения инфекционно -воспалительных заболеваний полости рта, носоглотки и верхних дыхательных путей методом фотодинамической терапии, содержащее фотосенсибилизатор порфириновой природы феофитин а (13,15-[15’-метоксициклопентан-13’-он]ил-17-[2- карбоксифитилэтил]-15-карбоксиметил-17,18-транс-дигидро-3-винил-8-этил- 2,7, 12,18-тетраметилпорфирин) формулы
Figure imgf000030_0001
или феофитин b или их производное в количестве 0,001-1%, природные или модифицированные липиды в количестве 0,01-10%, в смеси или в виде индивидуальных веществ, воду - до 100%, при этом указанные соединения образуют липосомы или эмульсию.
2. Средство по п.1, дополнительно содержащее фармацевтически приемлемые вспомогательные компоненты, вкусо-ароматические добавки.
3. Средство по п.1, отличающийся тем, что липиды для солюбилизации активного компонента представлены фосфатидилхолином и другими, полученными из цианобактерий рода Spirulina.
4. Средство по п.1, отличающееся тем, что липиды для солюбилизации активного компонента представлены фосфатидилхолином и другими, полученными из растений рода Urtica.
5. Средство по п.1, отличающееся тем, что липиды для солюбилизации активного компонента представлены индивидуальными лецитином и холестерином в мольном соотношении 7:3.
6. Средство по пи.1-5, отличающееся тем, что феофитины с фосфатидилхолином образуют мультиламеллярные липосомы.
7. Средство по пи.1-6, отличающееся тем, что для получения мультиламеллярных липосом могут быть дополнительно использованы другие липиды, например, фосфатидилинозитол или фосфатидилэтаноламин.
8. Средство по пи.1-7, отличающееся тем, что оно может быть изготовлено и применено в форме лосьона-спрея, аэрозоля с возможностью дозирования, ополаскивателя для полости рта, жидкости для ингаляций.
9. Средство по пи.1-8, отличающееся тем, что оно может быть активировано светом с длиной волн УФ-А и видимого диапазона для оказания фотодинамического воздействия на патогенную микрофлору полости рта и носоглотки и профилактики их заболеваний.
10. Применение средства по пи.1-9 для профилактики и лечения инфекционно-воспалительных заболеваний полости рта, носоглотки и верхних дыхательных путей методом фотодинамической терапии.
11. Применение по и. 10, отличающееся тем, что композицию применяют в виде спрея или лосьона.
12. Применение по и. 10, отличающееся тем, что средство по и. 1 используют для профилактики воспалений, вызванных патогенной микрофлорой ротовой полости.
13. Применение по и. 12, отличающееся тем, что патогенная микрофлора включает микроорганизмы из группы, включающей бактерии Enterococcus sp, Streptococcus sp., Staphilococcus sp., Micrococcus sp., Neisseria sp., дрожжи Candida sp.
30
PCT/RU2022/050178 2021-08-17 2022-06-08 Средство для профилактики и лечения инфекционно-воспалительных заболеваний WO2023022623A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021124324 2021-08-17
RU2021124324A RU2770517C1 (ru) 2021-08-17 2021-08-17 Средство на основе липосомной формы фотосенсибилизатора и способ его получения для профилактики и лечения инфекционно-воспалительных заболеваний полости рта, носоглотки и верхних дыхательных путей

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023022623A1 true WO2023022623A1 (ru) 2023-02-23

Family

ID=81212639

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2022/050178 WO2023022623A1 (ru) 2021-08-17 2022-06-08 Средство для профилактики и лечения инфекционно-воспалительных заболеваний

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2770517C1 (ru)
WO (1) WO2023022623A1 (ru)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2109518C1 (ru) * 1995-07-25 1998-04-27 Жинкова Надежда Михайловна Способ лечения заболеваний уха, горла, носа
RU2228775C1 (ru) * 2002-10-01 2004-05-20 Общество с ограниченной ответственностью "РАДА-ФАРМА" Способ фотодинамического лечения острого и хронического гнойного гайморита
CN101130082A (zh) * 2007-07-27 2008-02-27 许川山 具有携氧功能的新型光敏剂
WO2010070292A1 (en) * 2008-12-20 2010-06-24 Convatec Technologies Inc A composition for use on skin and wound
RU2454255C1 (ru) * 2011-05-30 2012-06-27 Виктор Александрович Борисов Способ фотодинамической терапии злокачественных новообразований
US20180243419A1 (en) * 2017-02-17 2018-08-30 Creighton University Liposomal compositions with light illumination-induced drug release
RU2728108C1 (ru) * 2019-11-27 2020-07-28 Андрей Владимирович Батомункуев Способ фотодинамической терапии заболеваний полости рта и стоматологический гель-фотосенсибилизатор

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2109518C1 (ru) * 1995-07-25 1998-04-27 Жинкова Надежда Михайловна Способ лечения заболеваний уха, горла, носа
RU2228775C1 (ru) * 2002-10-01 2004-05-20 Общество с ограниченной ответственностью "РАДА-ФАРМА" Способ фотодинамического лечения острого и хронического гнойного гайморита
CN101130082A (zh) * 2007-07-27 2008-02-27 许川山 具有携氧功能的新型光敏剂
WO2010070292A1 (en) * 2008-12-20 2010-06-24 Convatec Technologies Inc A composition for use on skin and wound
RU2454255C1 (ru) * 2011-05-30 2012-06-27 Виктор Александрович Борисов Способ фотодинамической терапии злокачественных новообразований
US20180243419A1 (en) * 2017-02-17 2018-08-30 Creighton University Liposomal compositions with light illumination-induced drug release
RU2728108C1 (ru) * 2019-11-27 2020-07-28 Андрей Владимирович Батомункуев Способ фотодинамической терапии заболеваний полости рта и стоматологический гель-фотосенсибилизатор

Also Published As

Publication number Publication date
RU2770517C1 (ru) 2022-04-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Li et al. Doxorubicin-polyglycerol-nanodiamond composites stimulate glioblastoma cell immunogenicity through activation of autophagy
US6592894B1 (en) Hydrogel-isolated cochleate formulations, process of preparation and their use for the delivery of biologically relevant molecules
KR100883927B1 (ko) 화합물
AU744523B2 (en) Methods and compositions for the protection of mitochondria
EP2648709B1 (en) Disulfiram formulation and uses thereof
Ibrahim et al. Nose-to-brain delivery of chrysin transfersomal and composite vesicles in doxorubicin-induced cognitive impairment in rats: Insights on formulation, oxidative stress and TLR4/NF-kB/NLRP3 pathways
Martins et al. Autophagy regulation and photodynamic therapy: insights to improve outcomes of cancer treatment
US20070231375A1 (en) Liposome combination and the use thereof
Siripong et al. Antitumor Activity of Liposomal Naphthoquinone Esters Isolated from Thai Medicinal Plant: Rhinacanthus nasutus K URZ.
JP7111795B2 (ja) 組合せｈｉｖ治療薬
Xu et al. Curcumin in osteosarcoma therapy: combining with immunotherapy, chemotherapeutics, bone tissue engineering materials and potential synergism with photodynamic therapy
JP2015502400A (ja) リポソームの亜塩素酸塩または塩素酸塩組成物
WO2014022414A1 (en) Cochleates made with soy phosphatidylserine
Nanavati Phytosome: a novel approach to enhance the bioavailability of phytoconstituent
WO2018172942A1 (en) Quercetin nanoparticles
Zhang et al. Reactive oxygen species-based nanotherapeutics for head and neck squamous cell carcinoma
EP2956131A1 (en) Treatment of klebsiella pneumoniae with liposomally formulated glutathione
RU2770517C1 (ru) Средство на основе липосомной формы фотосенсибилизатора и способ его получения для профилактики и лечения инфекционно-воспалительных заболеваний полости рта, носоглотки и верхних дыхательных путей
CN108619096A (zh) 声动力敏感脂质体、药物组合物及其用途
Upase et al. A review on Phytosome loaded with novel herbal drug and their formulation, standardization and applications
Li et al. Co-delivery of curcumin and chrysin through pH-sensitive hyaluronan-modified hollow mesoporous silica nanoparticles for enhanced synergistic anticancer efficiency against thyroid cancer cells
KR20180016347A (ko) 초-소형 지질 구조체의 생산을 위한 단일-단계 방법
Rahimi et al. Fungal Infected Adipose Stem Cells: The Effects of Novel Lipo-Niosome Nanoparticles Loaded with Amphotericin B and Thymus Essential Oil
Akhlaghi et al. Improving the Therapeutic Performance of Glycyrrhiza Glabra Hydroalcoholic Extract Using Liposomal Nano-carriers and Their Characterization
TW201946613A (zh) 用於治療增生性失調的劑量方案

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22858835

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE