WO2023013524A1 - 液体クロマトグラフィー用充填剤の評価方法 - Google Patents

液体クロマトグラフィー用充填剤の評価方法 Download PDF

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WO2023013524A1
WO2023013524A1 PCT/JP2022/029200 JP2022029200W WO2023013524A1 WO 2023013524 A1 WO2023013524 A1 WO 2023013524A1 JP 2022029200 W JP2022029200 W JP 2022029200W WO 2023013524 A1 WO2023013524 A1 WO 2023013524A1
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filler
column
evaluating
packing material
evaluation
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PCT/JP2022/029200
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幸治 鈴木
浩美 宮川
夕湖 由井
健介 大草
博史 及川
由香 平松
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ジーエルサイエンス株式会社
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    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N30/86—Signal analysis
    • G—PHYSICS
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    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating packing materials for liquid chromatography, and more particularly to a method for evaluating packing materials for liquid chromatography columns used in liquid chromatography mass spectrometry.
  • Liquid chromatography is a useful technique for component separation that utilizes differences in adsorptive power, charge, and hydrophobicity due to differences in the types and sizes of functional groups in compounds.
  • Liquid chromatography mass spectrometry which can selectively detect compound-specific ions in liquid chromatography, is optimal even if sample components are not completely separated by high-performance liquid chromatography (HPLC) columns.
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • Electrospray ionization is an ionization method that uses electrospray technology. When a high voltage of several kV is applied between a capillary that supplies a sample solution and a counter electrode, a conical cone of liquid is generated at the tip of the capillary. (Taylor cones) are formed, producing highly charged droplets from the tip of the Taylor cone. Then, as the volume of the droplet shrinks due to the evaporation of the solvent, the electrification density of the droplet increases.
  • Atmospheric pressure chemical ionization is an ionization method using corona discharge under atmospheric pressure. These are basically the same in removing volatile components as much as possible when the sample solution enters the mass spectrometer, but differ only in the method.
  • HPLC packing is subjected to solvent extraction, baking to dryness, etc., and evaluation of elution from packing is widely performed as a test at the synthesis stage of packing, but in actual LC / MS analysis , the effluent from the HPLC column that is washed away by the mobile phase is a problem.
  • baseline measurement is mainly performed when the mobile phase used for LC/MS measurement is passed through.
  • a background signal (bleed) generated by elution was collected, and the packing material was evaluated using the magnitude of the bleed value as an index (Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 4 4-Ethylaniline Test
  • Non-Patent Document 5 Aminopyridine Test
  • Non-Patent Document 6 the retention force and steric Selectivity Test
  • the LC/MS mass spectrometer Contamination was observed on the metal surface of a metal plate such as a so-called curtain plate or sampling cone (hereinafter simply referred to as "curtain plate”), which is a metal plate that hits the eluate from the inlet side column, and accumulated on this curtain plate.
  • curtain plate a metal plate that hits the eluate from the inlet side column, and accumulated on this curtain plate.
  • fillers with a large amount of bonding groups and fillers with a large number of carbon atoms in the bonding groups that is, fillers with a high carbon content ratio, which are excellent in the ability to separate positional isomers, are more likely to stain the curtain plate. A trend was seen.
  • the SRM869 method of the prior art aims to classify the density and arrangement pattern of octadecyl groups. It was possible to estimate the resolving power to separate, but it was not possible to estimate the resolving power to separate regioisomers. Also, the prior art 4-Ethylaniline Test, Aminopyridine Test or Selectivity Test could not estimate the separation ability to separate positional isomers.
  • LC/MS it is required to suppress and prevent contamination of the curtain plate by the effluent from the column.
  • LC/MS capable of high-sensitivity detection is required to separate and distinguish isomers including positional isomers having the same molecular weight. Therefore, in LC/MS, there is a demand for a packing material to which dirt is less likely to adhere to the curtain plate and a packing material capable of achieving separation of isomers including positional isomers. Therefore, in LC/MS, it is possible to easily select a packing material to which stains are less likely to adhere to the curtain plate, and it is possible to easily select a packing material that can achieve separation of isomers including positional isomers. is required.
  • one of the objects of the present invention is to suppress and prevent contamination of the curtain template by the effluent from the column in liquid chromatography mass spectrometry (LC/MS). Another object is to separate and distinguish isomers including positional isomers in LC/MS. Another object of the present invention is to provide a filler that is less likely to stain a curtain template in LC/MS. Another object of the present invention is to provide a filler capable of separating isomers including positional isomers in LC/MS. Another object of the present invention is to enable easy selection of a filler that is less likely to stain the curtain template in LC/MS.
  • the present invention as a means for solving the above problems is to pass a liquid through a column filled with a packing material, directly dry the eluate from the column, and fill the state of the eluate after drying.
  • This is an evaluation method for fillers used as an index for evaluating agents.
  • the eluate from the column is brought into direct contact with a plate and dried on the plate.
  • the plate is a method for evaluating a filler that is a metal plate.
  • the metal plate is a metal plate in a mass spectrometer that is hit by the effluent from the column.
  • the drying of the eluted material is performed by spraying the eluted material under an inert gas atmosphere or/and with an inert gas.
  • the drying of the eluate is performed under reduced pressure and/or under an inert gas purge.
  • the drying of the eluate is a method of evaluating a filler performed by applying a voltage to the eluate and spraying the eluate.
  • the drying of the eluted material is performed by heating the eluted material.
  • the method for evaluating a filler comprises photographing the state of the eluted material after drying and observing or observing the photographed image for evaluation.
  • the state of the eluted material after drying is photographed, a digitized image is generated, and the state of the eluted material is quantified and evaluated.
  • a method for evaluating the filler using an electrospray ionization (ESI) method using a mass spectrometer.
  • ESI electrospray ionization
  • a method for evaluating the filler using an atmospheric pressure chemical ionization (APCI) method using a mass spectrometer.
  • APCI atmospheric pressure chemical ionization
  • the method for evaluating a filler includes evaluating the filler during analysis using a mass spectrometer.
  • a filler evaluation method using a chromatogram showing the separation ability of the filler as an evaluation index and a filler evaluation method in which a filler is evaluated by combining any of the above filler evaluation methods.
  • the chromatogram showing the separation ability of the filler is a chromatogram showing the ability to separate isomers of the filler.
  • the chromatogram indicating the separation ability of the filler is a method for evaluating a filler including a chromatogram indicating the separation ability of positional isomers of the filler.
  • the chromatogram indicating the separation ability of the packing material is a packing material evaluation method including a chromatogram indicating the separation ability of the packing material for stereoisomers.
  • the chromatogram showing the separation capacity of the packing material includes a chromatogram showing the separation capacity of the packing material for positional isomers and a chromatogram showing the separation capacity for stereoisomers of the packing material. It is a method for evaluating fillers containing.
  • the method for evaluating the filler using a chromatogram showing the separation ability of the positional isomers of the filler as an evaluation index is based on a chromatogram obtained by analyzing two or more positional isomers. 3, a filler evaluation method in which the respective retention times or retention factor ratios are determined, and the retention times or retention factor ratios are used as an index for the evaluation of the filler.
  • the method for evaluating a filler using a chromatogram showing the ability of the filler to separate stereoisomers as an evaluation index is a chromatogram obtained by analyzing two or more compounds having different steric structures.
  • This is a filler evaluation method in which the respective retention times or retention factor ratios are obtained from grams, and the retention times or retention factor ratios are used as indexes for evaluating the filler.
  • the positional isomer is a positional isomer having a different bonding position of a substituent.
  • the positional isomer is an evaluation method for a filler that is an aromatic compound.
  • the compound having a different steric structure is an evaluation method for a filler that is an aromatic compound.
  • a silica gel matrix is used, and the silica gel matrix has a pore diameter of 15 to 25 nm, a chemical bond group of C26 to C30, and a carbon content of 16 to 25 wt%. It is a filler with
  • the filler has a pore diameter of 19 to 21 nm in the silica gel matrix, and is subjected to end capping as the secondary treatment.
  • the filler has a carbon content of 17 to 24 wt%.
  • It is also a packing material evaluation apparatus comprising a column filled with packing material, a liquid transfer device, and a device for directly drying the effluent from the column.
  • the apparatus for directly drying the effluent from the column is a packing material evaluation apparatus equipped with a metal plate.
  • the packing material evaluation apparatus includes a mass spectrometer, and the apparatus for directly drying the eluate from the column is the mass spectrometer in which the eluate from the column hits. It is an evaluation device equipped with a metal plate of
  • LC/MS liquid chromatography-mass spectrometry
  • the present invention is a packing material evaluation method in which a liquid is passed through a column filled with a packing material, the eluate from the column is directly dried, and the state of the eluate after drying is used as an index for evaluating the packing material. is.
  • the present invention is also a method for evaluating fillers suitable for LC/MS.
  • the packing material evaluation device used to perform these packing material evaluation methods is composed of a column filled with packing material, a liquid transfer device, and a device that directly dries the effluent from the column.
  • An apparatus for directly drying the effluent from the column consists of a plate with which the effluent from the column is in direct contact.
  • Equipment for directly drying the eluate from the column collects a certain amount of the eluate eluted from the column, collects the collected solution, heats and stirs, gas purges, and removes the solvent under reduced pressure. Unlike the equipment used in the preparative method, which concentrates and dries up with , the eluate is dried sequentially as soon as it is eluted from the column. It is a device that directly contacts and holds the eluted material on the plate by spraying, dripping, spraying, etc. without contacting other equipment, and dries the eluted material between and on the plates from the column outlet.
  • the size of the column packed with the filler is not particularly limited, but columns with an inner diameter of 1.0 to 4.6 mm and a length of 10 to 250 mm, which are often used for LC/MS analysis, are preferred.
  • a syringe or a liquid-feeding pump may be used as a liquid-feeding device for feeding a liquid through a column filled with a packing material.
  • the operating method of the liquid transfer device may be manual or automatic.
  • the LC-MS 1 is configured with a liquid chromatograph 2 and a mass spectrometer 3, the liquid chromatograph 2 includes a liquid-sending pump 4 as a liquid-sending device and a column 5 filled with a packing material, and the mass spectrometer 3 is composed of an ionization section 6 and a mass spectrometry section 7, which are also devices for directly drying the effluent from the column.
  • a curtain plate 8 as a plate is installed in the ionization section 6 .
  • a column is first filled with the filler to be evaluated, and a column filled with the filler is produced. Then, a liquid is passed through the column filled with the packing material by a liquid delivery device to elute the eluate from the column. The eluate from the column is then dried directly. Finally, the state of the extract after drying is used as an index for evaluating the filler. Specifically, the state of the eluate after drying is observed or observed, certified, and used as an evaluation index, and the filler is evaluated based on whether or not the index satisfies a predetermined standard. .
  • the liquid that is passed through the column filled with packing material is not particularly limited as long as it does not contain a non-volatile substance, but mobile phases that are often used for LC/MS analysis are preferred. Specifically, organic solvents such as acetonitrile, methanol, ethanol, tetrahydrofuran, isopropanol, and hexane; volatile acids such as formic acid, acetic acid and trifluoroacetic acid; volatile salts such as ammonium formate and ammonium acetate; Mixtures of these are preferred.
  • a mixture of an aqueous solution of a volatile salt such as an aqueous solution of 1 to 100 mM ammonium formate and acetonitrile and/or methanol
  • an aqueous solution of a volatile acid such as an aqueous formic acid solution of 0.01 to 0.5% and acetonitrile and/or
  • a mixed solution of methanol is more preferable because it is often used for LC/MS analysis.
  • the flow rate of the liquid passing through the column packed with packing material is preferably the flow rate often used for analysis by LC/MS. is preferably 0.05 to 1.0 mL/min at which the effluent from the dried column is easily confirmed without being too diluted.
  • the eluate from the column is dried directly.
  • "directly drying the eluate from the column” means that a certain amount of the eluate eluted from the column is once collected and collected, and the collected solution is heated and stirred, gas purged, or decompressed. Unlike the preparative separation method in which the solvent is removed to concentrate and dry, this means that the eluate is dried in order as soon as it is eluted from the column. If the eluate from the column is once stored in a container and then dried as in the conventional fractionation method, it is not possible to grasp the elution state from the column, such as the spreading state and shape of the eluate. In order to use it as an index for evaluating fillers, it is necessary to directly dry the eluate.
  • the eluate from the column is directly contacted and held on the plate by spraying, dropping, spraying, etc., without contacting other equipment. Dry the eluate between and on the plate. In this way the dried eluate adheres to the surface of the plate.
  • the shape of the plate is not particularly limited as long as the state of the eluate after drying can be confirmed.
  • a metal can be used, for example, a metal plate, which is a plate made of metal, can be used.
  • a metal plate is preferable because it can be heated and voltage can be applied, and its shape and physical properties are less likely to be changed by heating or pressurization, so that it is easy to directly dry the eluate.
  • the plate is preferably made of stainless steel, which is resistant to rust.
  • the plate it is located on the inlet side of the mass spectrometer and can be composed of a metal plate having a metal surface on which the effluent from the column directly hits.
  • the metal plate of this mass spectrometer has different names such as curtain plate, sampling cone, orifice, etc. depending on the manufacturer of the mass spectrometer. included.
  • the method for drying the effluent from the column is not particularly limited, but the following methods can be used. That is, a plate is installed on the outlet side of the column, and nitrogen, helium, A method in which an inert gas such as argon is supplied and the eluate from the column is brought into contact with a plate to be dried under an inert gas atmosphere, or an inert gas is supplied to the outlet from the column and the inert gas is A method can be used in which the effluent from the column is sprayed on a plate and dried. Alternatively, the eluate may be sprayed onto the plate with an inert gas under an inert gas atmosphere.
  • the formation of droplets can be assisted and the efficiency of desolvation can be increased. , the oxidative decomposition of the effluent can be reduced.
  • a method of drying the eluate on a plate can be used. Efficiency of desolvation can be improved by reducing the pressure in this manner. Further, by reducing the pressure while supplying an inert gas, the eluate can be more easily dried.
  • the drying of the eluate can be carried out by heating the eluate. Heating of the eluate is carried out by heating the plate and/or the entire space from the outlet of the column to the plate, in other words, the space in which the plate is placed, or the entire ionization section in the case of a mass spectrometer. can be done. Drying of the eluate can be performed by applying a voltage of ⁇ 1 to 10 kV to the eluate. Application of voltage to the eluate can be performed by applying voltage between the outlet of the column and the plate or/and applying voltage to the metal plate as the plate. By applying a voltage to the eluate, charged droplets can be generated, leading to desolvation by heating, droplet splitting by Coulomb repulsion, and ion generation.
  • the above methods may be used alone, or two or more may be used in combination.
  • the method of applying a voltage while heating the eluate in an inert gas atmosphere is more preferable because it is close to the conditions of LC-MS actually used.
  • LC-MS can also be used as a packing material evaluation tool.
  • the filler evaluation device does not have to be LC-MS itself. If the equipment can reproduce from the column outlet to the curtain template, it is not necessary to use expensive LC-MS or curtain templates for LC-MS, so packing materials can be evaluated at a low cost. become.
  • the eluate it is preferable to dry the eluate until it becomes completely solid, that is, to dry it. It suffices if the state can be maintained, and drying may be performed so that the eluate is in a sol state with low fluidity without completely solidifying the eluate. As a measure of drying, it is sufficient if the eluate has a viscosity of 100 mPa ⁇ s (millipascal seconds) or more. Furthermore, for example, when a still image is taken and used for evaluation, the dried eluate should be kept in the same state for about 0.5 seconds, and when a moving image is taken and used for evaluation, it is necessary Since it is possible to confirm a certain part of the frame, it may be fluid. However, considering the use of various other observation methods or observation methods, it is preferred that the eluate be dried so as to maintain the same state for 10 minutes or more.
  • the state of the eluted matter after drying is observed or observed, certified, and used as an evaluation index.
  • the filler is evaluated according to whether the index meets predetermined criteria.
  • the method for observing the extractables to certify the condition of the extractables after drying can be used. It is possible to That is, the dried eluate is visually observed, the area, thickness, shape, color, and gloss of the dried eluate are observed or observed, and the area, thickness, shape, color, and gloss are each or two or more of these. A combination can be used as an index for evaluation.
  • a microscope may be used to measure the thickness of the dried extract, and a ruler may be used to measure the area.
  • the weight of the dried extract can be measured and the weight can be used as an index for evaluation.
  • use an electronic balance to measure the weight of the plate only before the eluate adheres and the weight of the plate to which the eluate is attached and dried, and the difference is eluted. It can be the weight of an object.
  • the surface of the plate on which the eluate is dried and solidified can be touched with a finger to confirm the degree of roughness, and the degree of roughness can be used as an index for evaluation.
  • the roughness of the plate surface on which the eluate has dried can be measured, and the degree of roughness can be used as an index for evaluation.
  • the glossiness of the surface of the plate on which the eluate has dried can be observed, and the glossiness can be used as an index for evaluation.
  • the coefficient of friction of the surface of the plate on which the eluate has dried can be measured using a friction and wear analyzer, and the coefficient of friction can be used as an index for evaluation.
  • the degree of contamination by the dried eluate can be quantified from the surface reflectance when the dried eluate is irradiated with light, and the numerical value can be used as an evaluation index.
  • the content of metal components contained in the eluate after drying can be quantified from the fluorescent X-rays when X-rays are irradiated, and the numerical value can be used as an index for evaluation. I can. Further, the predetermined criteria can be determined in advance according to the degree of condition, numerical value, etc. in these indices.
  • the state without change in the dried extractables can be used as an index, but the change in the extractables can also be used as an index as follows. That is, the plate after drying the eluate is immersed in an acidic solution such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, or hydrofluoric acid, an alkaline solution such as sodium hydroxide or ammonia, or a dyeing solution, and the eluate is dried and solidified. can be used as an index for evaluation. In addition, the plate on which the eluate has been dried and solidified is observed for the surface state after washing with a solvent or polishing, and the change state at this time or the plate before attaching the eluate is compared with the evaluation index.
  • an acidic solution such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, or hydrofluoric acid
  • an alkaline solution such as sodium hydroxide or ammonia
  • a dyeing solution such as sodium hydroxide or ammonia
  • the dried effluent is ignited and the state of flame color is observed, and the state of flame color can be used as an index for evaluation.
  • the dried eluate is allowed to react with a coloring reagent, the coloring reaction resulting from the reaction is observed, and the state of coloring can be used as an index for evaluation.
  • the subjectivity of the measurer is likely to enter, so it is better to record the state of the extract after drying on a recording medium, and to observe, observe, certify, and evaluate using the recording medium. , can be evaluated.
  • a recording medium the state of the eluted matter after drying is photographed, and still images such as photographs taken, moving images such as videos, still images using scanners and copiers, ink and paints on the eluted matter after drying, etc. Examples include media such as paper on which the dyed product is applied and transferred.
  • recording media such as still images, moving images, and scan data can be recorded in advance using a digital device or digitized, so that a digitized image can be generated and the state of the extractables can be quantified.
  • the photographing method is not particularly limited, such as continuously taking pictures of a narrow range and combining them to form a whole picture.
  • the methods for observing, observing, certifying, and evaluating the state of the eluate after drying are not limited to those described above, and two or more of the above observation, observation, certifying, and evaluating methods may be combined.
  • the index for evaluating the filler is not limited to the above, and two or more of the above evaluation indices may be used in combination.
  • the packing material may be evaluated using the dry matter on the curtain plate as an index, but the eluate derived from the sample components does not affect the dry state of the eluate. Therefore, it is desirable to evaluate the filler by performing a series of steps without injecting the sample, such as during conditioning.
  • the state of the eluate dried on the plate for example, the dry state of the residue after removing the solvent
  • the numerical value is used as an evaluation index. It is also possible to Then, it is possible to evaluate the filler based on whether or not the numerical value as the evaluation index obtained in this manner satisfies a predetermined reference value.
  • digitization with image analysis software is not limited to this, but for example, take a picture of the dried or dried eluate on an LC-MS curtain template, and calculate the area value for each color of the picture image. It can be digitized.
  • the image analysis software is not limited to this, but ImageJ developed by the US National Institutes of Health, which is used for image processing of electrophoresis, etc., can be used. Detailed results of evaluation using ImageJ are disclosed in the Examples, and an overview of the evaluation method is presented here.
  • Photographs used for image analysis are taken with a digital camera such as a document camera after removing the curtain plate from the mass spectrometer.
  • a digital image of the curtain template is cropped using image editing software to include areas where dirt, ie dried out effluent can be seen. When there are multiple images to be compared, the images are trimmed with the same size for comparison.
  • the image editing software is not particularly limited, but Paint can be used. In the case of images taken with a film camera, dirt can be observed by visually observing the images taken, and the images can be digitized by a scanner or the like and used for image analysis.
  • the image is first converted to gray scale using image analysis software, and if the image contains an iontophoresis hole, this part is excluded from the analysis. For example, if white dirt is used as an index for evaluation, it is filled with black. Next, a threshold value is set so that the background portion where the dirt on the curtain plate is not seen is not counted, and then image analysis is performed to create a luminance distribution graph. From the analysis result of the luminance distribution graph, the number of pixels of the part where the stain is observed (hereinafter referred to as "count number") obtained by using the Count number in the luminance distribution graph is calculated as the area value.
  • count number the number of pixels of the part where the stain is observed
  • the degree of whiteness of the dirt portion is defined as the degree of dirt
  • the overall dirt on the curtain template is calculated by calculating the count number ⁇ (average luminance value (using the mean number in the luminance distribution graph) - threshold value (Min in the luminance distribution graph). It can be calculated from )) using numbers.
  • the count number indicating the area value may be used, or the average brightness value of the stain portion and the threshold value are used, and the count number ⁇ (average brightness value ⁇ threshold value) is used.
  • the dirt on the LC-MS curtain template that is, the eluate after drying, is a colored deposit, an example of which is a white deposit, and the numerical standard for color analysis is calculated using image analysis software.
  • the colored area such as white from the curtain template (background) is calculated from the count number ⁇ (average brightness value - threshold value), and for example, the numerical value is less than 10,000 as a predetermined standard for evaluation.
  • the elution method of the eluate from the column to the LC-MS curtain plate is to connect the column to the MS/MS detector of a liquid chromatograph tandem mass spectrometer (LC-MS/MS), and for example, the mobile phase is , with a gradient at a flow rate of 0.2 mL/min.
  • LC-MS/MS liquid chromatograph tandem mass spectrometer
  • Gradient conditions are, for example, mobile phase A: aqueous solution of volatile salt such as 10 mM aqueous ammonium acetate solution, mobile phase B: aqueous solution of volatile salt such as aqueous solution of 10 mM ammonium acetate, and acetonitrile.
  • the column oven temperature condition is not particularly limited, it can be about 40°C. Ionization in the mass spectrometer is in positive mode and detection mode is Q1 scan.
  • the curtain plate is removed from the mass spectrometer, and a photograph of the dried eluate, which is the soiled portion of the curtain plate, taken with a document camera is used for image analysis.
  • An overview of the results analyzed, certified, and evaluated in this manner is shown below.
  • the number of counts ⁇ (average luminance value ⁇ threshold value) can be used as an evaluation index, and the predetermined numerical value can be used as an evaluation standard.
  • column A is calculated from 73 ⁇ (147.384-142), the value is 393, column D is calculated from 1219 ⁇ (146.977-125), the value is 26790, column H is calculated from 37 ⁇ (154.405 ⁇ 145) and quantified as 348 to evaluate the filler.
  • evaluation is performed by grasping the count number of pixels determined to be soiled portions and the state of luminance distribution of these pixels, and quantification, and the numerical value is used for evaluation of the filler. It can be used as an index.
  • the white stain portion on the plate (the portion surrounded by the dotted line in the figure) shown in FIG.
  • the black stain on the plate (surrounded by the dotted line in the figure) shown in FIG. parts) are digitized by image analysis software or the numerical values are compared, and the obtained numerical values are used as indexes for evaluating the fillers, so that the fillers can be easily ranked.
  • the eluate from the column is directly dried, and the state of the eluate after drying is regarded as stains on the plate.
  • a packed HPLC column can be evaluated and it can be readily determined whether the column is suitable for LC/MS.
  • ImageJ and GIMP distributed under the GNU General Public License were used in the examples, but there was no significant difference between the two software. Therefore, as image analysis software, GIMP can be used in addition to ImageJ, and any software having functions equivalent to those of ImageJ and GIMP can be used without particular limitation.
  • the state of the eluted material after drying is regarded as dirt on the plate, and the quantification of the state is not limited to these methods, and the analog image is digitized, brightness and contrast correction, noise removal, etc.
  • the above-mentioned image analysis is performed, and the method of quantifying as described above, the method of quantifying by binarizing the brightness, and the RGB values and CMYK values of the colors of the color image are converted into numerical values.
  • Various methods can be used, such as a method of
  • a liquid is passed through a column filled with the packing material, the eluate from the column is directly dried, and the state of the eluate after drying is used as an index for evaluating the packing material.
  • a packing agent evaluation method (hereinafter also referred to as a “packing agent evaluation method using the state of extractables as an evaluation index”) and a packing agent evaluation method using a chromatogram showing the separation ability of the packing agent as an evaluation index. It is a filler evaluation method for evaluating fillers by combining with.
  • the predetermined criteria can be determined in advance based on numerical values obtained from the chromatograms.
  • the separation capacity of a packing material is the separation capacity of isomers
  • the chromatogram showing the separation capacity of the positional isomers of the packing material is used as a method of evaluating the packing material using the chromatogram showing the separation capacity of the packing material as an evaluation index. Examples include a method for evaluating a packing material as an evaluation index and a method for evaluating a packing material in which a chromatogram showing the separation capability of stereoisomers of the packing material is used as an evaluation index.
  • the packing material evaluation method of the present invention that uses the state of the eluate as an evaluation index to evaluate whether the packing material is suitable for LC/MS, the packing material is suitable for LC/MS. I know if there is or not.
  • a combination of two evaluation methods one using the state of the eluate as an evaluation index and the other using a chromatogram showing the separation ability of positional isomers of the packing material as an evaluation index, is used.
  • a combination of two evaluation methods one using the state of the eluate as an evaluation index and the other using a chromatogram showing the separation ability of stereoisomers of the packing agent as an evaluation index, is used.
  • a stereoisomer characterized by less staining of the curtain plate and different steric structures by using a column packed with a packing material with good evaluation results in LC/MS for analysis by evaluating the packing material.
  • a packing material evaluation method using the state of the eluate as an evaluation index a packing material evaluation method using a chromatogram showing the separation ability of the packing material's positional isomers as an evaluation index
  • a column filled with the packing is connected to an HPLC device, a sample is sent to the column with a mobile phase, and a chromatogram is obtained.
  • the retention time of each component in the chromatogram, the ratio of retention coefficients, the degree of separation, etc. can be used as an index for evaluating the separation ability of the packing material.
  • the difference or the quotient of the retention time of each component can be used as the index.
  • the column size and the HPLC apparatus to be used conventionally known configurations can be used. Columns may be separately prepared using the same lot of packing material, and the staining of the curtain template by the eluate from the column and the ability to separate the packing material may be evaluated separately.
  • the column used to observe the state of the eluate described above may be used as it is to obtain a chromatogram showing the separation ability of the packing material.
  • the eluate from the column was extracted in the manner described above. The condition may be observed, but care must be taken because depending on the type of packing material, the amount of dry solids after drying the eluate may decrease, resulting in observation errors.
  • the above process for observing the state of the eluate and the process for obtaining a chromatogram showing the separation ability are performed separately by preparing columns separately using the same type of packing material and packing material from the same lot. It may be done.
  • Aromatic compounds are a group of cyclic unsaturated organic compounds represented by benzene, which are composed of a single ring or multiple rings (aromatic rings) exhibiting aromaticity, and which contain elements other than carbon in the ring structure. Aromatic compounds also include heteroaromatic compounds containing Aromatic compounds also include polycyclic aromatics, which are compounds in which two or more aromatic rings are condensed. Aromatic compounds also include compounds having substituents substituted for hydrogen atoms attached to aromatic rings. The structure and constituent elements of the substituent are not particularly limited, and may contain elements other than carbon and hydrogen, such as oxygen, nitrogen, and halogen.
  • aromatic hydrocarbons composed of carbon and hydrogen are also included in the aromatic compound, and the aromatic compound includes elements other than carbon and hydrogen such as oxygen, nitrogen, and halogen.
  • polycyclic aromatic compounds are 4- to 7-membered ring compounds in which two or more rings are condensed, such as naphthalene, phenanthrene, anthracene, tetracene, pentacene, benzopyrene, chrysene, pyrene, triphenylene, corannulene, coronene, and ovalene. etc.
  • condensed rings and the condensed position may have a planar structure such as triphenylene or BaP or may have a non-planar structure such as PhPh or TBN.
  • a compound such as o-terphenyl in which an aryl group is bonded to a monocyclic 4- to 7-membered compound the aryl group can rotate freely, so the stericity is enhanced.
  • the aryl group can rotate freely, so that the stericity is enhanced.
  • the constituent elements of aromatic compounds with planar structures, aromatic compounds with non-planar structures, and aromatic compounds with high stericity used for testing the ability to recognize stereostructures may be only carbon and hydrogen, or only carbon and hydrogen. However, it may contain other elements.
  • An aromatic compound with a planar structure, an aromatic compound with a non-planar structure, and an aromatic compound with a high stericity can be said to be aromatic compounds with different steric structures.
  • the greater the elution interval between butylbenzene and amylbenzene, the higher the hydrophobicity, and the ratio of the retention coefficients of caffeine and phenol can confirm the degree of inertness, and the retention of o-terphenyl and triphenylene. Stereoselectivity can be confirmed from the coefficient ratio. Since o-terphenyl and triphenylene are common compounds that are readily available and stable, it is preferred to use the Selectivity Test as one method of column evaluation. Then, the ratio of the retention factors of o-terphenyl and triphenylene in this method can be used as an index for the evaluation of fillers. By comparing the retention factor ratio of a compound with high stericity and that of a compound with high planarity for each column, it is possible to confirm and evaluate the separating ability of the packing material of the column for steric compounds.
  • a chromatogram obtained by analyzing two or more positional isomers is used as an evaluation index as a packing material evaluation method that uses a chromatogram that shows the separation ability of the packing material's positional isomers as an evaluation index.
  • the positional isomers to be used are not particularly limited, but normal-hexane, 2-methylpentane, 3-methylpentane, 2,2-dimethyl, which are well known as positional isomers with the same molecular weight but different bonding positions of substituents.
  • a chromatogram obtained by analyzing alkylbenzene can be used as an evaluation index.
  • alkylbenzene positional isomers of divinylbenzene in which the bonding position of the vinyl group as a substituent is different can be used. It is possible to confirm the binding position recognition ability of the filler, which indicates how much difference can be recognized. Under the conditions of Examples described later, if the ratio of retention coefficients of m-divinylbenzene and p-divinylbenzene is 1.060 or more, the peak top can be separated, and positional isomers can be identified by LC/MS detection. is possible.
  • the ratio of the retention coefficients of o-terphenyl and triphenylene is 1.85 or more, regioisomer separation
  • the ratio of the retention coefficients of m-divinylbenzene and p-divinylbenzene is 1.060 or more at which the peak top can be separated, and the isomers including positional isomers and stereoisomers It is evaluated that it is a filler with a separation ability of
  • the numerical value of the ratio of the retention coefficients of m-divinylbenzene and p-divinylbenzene described above is only an example, and the index for determining whether the column is packed with a packing material suitable for isomer separation is For example, it is desirable to set an appropriate value in consideration of the required accuracy of analysis and the maintenance frequency of the apparatus according to the situation, such as on the condition that the peak top can be separated.
  • the contamination of the curtain template of the mass spectrometer can be applied to a wide range of applications. It is possible to select a packing material and a column capable of separating isomers, including stereoisomers and positional isomers, with less isomers.
  • the packing material By selecting and using the packing material, it is possible to produce a packing material that does not easily stain the curtain plate of the mass spectrometer and a column filled with the packing material.
  • it is evaluated using the evaluation method using the state of the eluate after drying as an index and the evaluation method for the separation performance of isomers including the stereoisomers and positional isomers described above, and meets predetermined criteria.
  • the packing materials are selected and used within the range confirmed to be effective, and the packing material is designed so that it does not easily stain the curtain template of the mass spectrometer and has excellent isomer separation capability, including stereoisomers and positional isomers. Packing and columns can be made.
  • the shape of the filler is not particularly limited, but may be spherical, crushed, or monolithic. can be used.
  • the size of the filler is not particularly limited, but a particulate filler having a diameter of 1 to 1000 ⁇ m is preferable because of good separation and ease of handling.
  • the matrix of the filler is not particularly limited, and includes polymer matrix obtained by polymerizing organic monomers such as divinylbenzene, methacrylate, and styrene, silica gel obtained by hydrolyzing and polymerizing water glass, tetraethoxysilane, titanium isopropylsilane, etc., titanium oxide, and the like.
  • An organic hybrid silica gel in which organic functional groups such as methyl and ethyl groups are incorporated in the inorganic matrix of the silica gel skeleton, and an integral type with a three-dimensional network structure skeleton obtained by hydrolyzing and polymerizing tetramethoxysilane, phenyltrimethoxysilane, etc.
  • a porous monolithic body or the like can be used.
  • the filler it is preferable to subject the filler to secondary treatment.
  • a secondary treatment a secondary treatment performed by combining one or more kinds of washing such as agitation washing, heat washing, ultrasonic washing, SFC washing, high pressure washing, etc., a secondary treatment that repeats the initial bonding treatment, or the first
  • a secondary treatment of additionally introducing a bonding group different from the bonding group bonded in the bonding treatment can be mentioned.
  • the secondary treatment of additionally introducing low-molecular-weight binding groups has the effect of increasing the inactivation of basic compounds and metal coordinating compounds, so it is known by names such as endcapping, endcapping, and terminal addition. ing.
  • These secondary treatments can be carried out in an aqueous solution, a buffer solution, an organic solvent, a mixed solution thereof, in vacuum, or in a gas phase such as inert gas or carbon dioxide.
  • a secondary treatment known as endcapping which introduces additional low molecular weight compounds, is reactive silane agents such as methyltrichlorosilane, dimethyldichlorosilane, trimethylchlorosilane, hexamethylcyclotrisiloxane, and octamethylcyclotetrasiloxane. can be used alone or in combination of two or more.
  • the filler desirably has a surface area of 50 m 2 /g or more or a pore volume of 0.1 mL/g or more, and the filler has a pore diameter of 8 nm to 50 nm.
  • the separation of positional isomers which is the object of the present invention, is hardly affected by the pore size range of the filler.
  • a packing material with a pore diameter of 8 nm to 25 nm is preferable because the number of theoretical plates is more likely to be obtained with a pore diameter of 25 nm or less in order to reduce diffusion inside the pore diameter.
  • the C18 group is about 2 nm and the silica gel matrix with a pore size of about 8 nm to 12 nm is used. Since the size is 3 nm or more, a larger pore diameter of 15 nm or more is required for binding in the pores. On the other hand, when the pore diameter is 30 nm or more, the surface area of the filler becomes small, and the number of theoretical plates decreases, making it unsuitable for isomer separation.
  • the pore diameter of the filler is preferably 15 nm to 25 nm, more preferably 19 nm to 21 nm.
  • various fillers are examined and verified using matrix silica gel having a more optimal average pore size of 20 nm.
  • the method for evaluating a packing material that uses the state of the eluate as an evaluation index for evaluating whether the packing material is suitable for LC/MS, and whether the packing material can separate positional isomers.
  • an evaluation method that combines the three evaluation methods of the evaluation method of and the evaluation method of whether it is a filler that can separate stereoisomers, Table 2
  • a packing that has a chemically bonded group of C26 to C30, a carbon content of 16 to 25 wt%, and undergoes secondary treatment can separate isomers, including positional isomers, and can be used for LC/MS. It turns out to be a drug.
  • the fillers that were subjected to the evaluation method of the present invention and satisfied the predetermined criteria also showed good separation of tocopherol isomers (Table 2).
  • the packing material of the present invention in which the state of the eluate is used as an evaluation index, is used.
  • An evaluation method that combines three evaluation methods: a method for evaluating the agent, a method for evaluating whether the filler can separate positional isomers, and a method for evaluating whether the filler can separate stereoisomers. , it is possible to select a filler that exhibits a predetermined index and obtains a predetermined evaluation.
  • the evaluation method of the present invention has separation characteristics that can separate isomers including positional isomers and stereoisomers that cannot be distinguished by mass spectrometry, and in LC / MS It is possible to design packing materials that can be used without soiling the curtain plate of a mass spectrometer and that can provide accurate analytical results. Then, by preparing a packing according to the design, it is possible to prepare a packing compatible with LC/MS while separating isomers including positional isomers and stereoisomers.
  • the present invention can be applied to isomer analysis of antioxidant substances that have the property of preventing or delaying cell damage, and can be applied to qualitative and quantitative analysis of antioxidant components contained in vegetables and fruits, and to pharmaceuticals. It is possible to understand, design and manufacture fillers that can be widely used such as examination of , and application to supplements.
  • the column oven temperature condition was 40°C. Ionization on the MS/MS detector was in ESI positive mode and detection mode was Q1 scan (scan range m/z 200-1000). Other settings were performed under the following conditions.
  • Turbo gas temperature 500°C Curtain gas (nitrogen): 30 psi Ion spray voltage: 4500V Drift voltage: 20V
  • the curtain template was removed from the mass spectrometer, and the dried eluate, which was the soiled portion of the curtain template, was photographed with a document camera (Elmo Co., P30S).
  • This curtain template photo was cropped to include the areas where you can see the dirt in the image editing software paint.
  • the image size was 62,100 pixels (Fig. 3).
  • image analysis was performed on the trimmed image using image analysis software ImageJ. The image was converted to grayscale and then blacked out to exclude the iontophoretic pore area from the analysis before being used in the analysis.
  • the threshold was set to 125 so that the background portion where no dirt was observed was not counted, and the area with brightness greater than 125 was 1219 pixels.
  • the luminance average value of the corresponding area was 146.977, and the numerical value representing the dirt was calculated by 1219 ⁇ (146.977 ⁇ 125) to obtain 26790.
  • Table 3 shows the results of the same evaluation of 9 commercially available columns A to I including the commercially available column D and an empty column not packed with packing material.
  • the image analysis value is 393 for an empty column, and if it is less than 1000, the elution can hardly be recognized, and considering the error, it can be judged that there is almost no elution from the column. .
  • the dried matter could be removed from the curtain template by washing or polishing with a solvent, but if the image analysis value was 10,000 or more, it could not be completely removed in some cases. Therefore, if the image analysis value is less than 10,000, there is a high possibility that the dried matter can be removed by ordinary curtain template maintenance such as washing with a solvent or removal by polishing.
  • those with an image analysis value of less than 1000 are considered particularly suitable for LC/MS, and are indicated by ⁇ in the table.
  • those with an image analysis value of 1000 to less than 10000 are considered suitable for LC/MS and are indicated by ⁇ in the table.
  • those with an image analysis value of 10,000 or more cannot be recommended for use in LC/MS isomer analysis, and are indicated by x in the table. This indicated that an image analysis value of less than 10,000 is recommended for LC/MS isomer analysis.
  • the ionization of the MS/MS detector was performed in ESI positive mode, and the other conditions were the same as in Example 1.
  • the curtain template was removed from the apparatus, and image analysis was performed in the same manner as in Example 1.
  • the commercially available column E was also subjected to measurement and curtain template image analysis. Based on the LC/MS blank analysis performed here, the baseline measurement results in total ion chromatography (TICC) and the results obtained in column A and column E for the image analysis values of the curtain template were compared.
  • the ratio of the retention coefficients of o-terphenyl and triphenylene was calculated from the results of the Selectivity Test as a stereoscopic recognition ability evaluation test. Also, using the same columns A to I, an alkylbenzene test was performed as a position recognition ability evaluation test, and the ratio of the retention coefficients of m-divinylbenzene and p-divinylbenzene was calculated. Under these conditions, if the retention coefficient ratio of o-terphenyl to triphenylene is 1.85 or more, it can be classified as a polymeric filler according to SRM869, and it can be said that stereoselectivity is high.
  • the retention factor ratio of terphenyl and triphenylene is 1.85 or more, and as an alkylbenzene test to confirm the ability to separate positional isomers, the retention factors of m-divinylbenzene and p-divinylbenzene ratio of 1.060 or more, which enables the peak top to be separated, was used as an evaluation criterion, and the filler was evaluated.
  • Table 4 shows a comprehensive evaluation of the results of quantification by image analysis in Example 1 of each column A to I and the evaluation results of the analytical performance of the packing material by the chromatographic test of Example 3. Those exceeding the numerical values of the respective evaluation criteria were indicated by ⁇ as being acceptable, and those not exceeding the numerical values were indicated by x as being unacceptable. Based on the results of the Selectivity Test and the alkylbenzene test, the separation ability of isomers including stereoisomers and positional isomers is evaluated, and if both evaluations are passed, it is indicated by ⁇ , and if both evaluations are unsuccessful. If one passed and the other failed, it was indicated by ⁇ as being suitable for either stereoisomers or positional isomers. The result of Example 1 and the result of Example 3 were combined, and when either one failed, it was rejected, and when one passed and the other passed, it was indicated by ⁇ .
  • the separation of positional isomers was performed using the ratio of the retention coefficients of o-terphenyl and triphenylene in the Selectivity Test as an index, and the ratio of the retention coefficients of divinylbenzene isomers in the alkylbenzene test. Comparing the high performance of each column, it was confirmed that the column with high three-dimensional structure recognition performance tended to have high resolution of positional isomers as a whole, but the tendency was different depending on the column. rice field.
  • column A when comparing column A and column C, when comparing the height of the three-dimensional structure recognition performance according to the ratio of the retention coefficients of o-terphenyl and triphenylene, column C shows a higher value than column A, and the three-dimensional structure Although the recognition performance was found to be high, column A showed higher separation performance than column C in terms of the separation performance of positional isomers using the ratio of the retention coefficients of divinylbenzene isomers as an index. From this result, the Selectivity Test alone is not sufficient as an index for separating isomers, and by using the ability to separate positional isomers such as divinylbenzene isomers as an index, it can be used as an index for more accurate packing material selection. can do
  • the gel was filtered through a glass filter, and then rinsed with 300 mL of toluene at 80° C. in 5 portions of 60 mL each to remove unreacted triacontyltrichlorosilane. After that, toluene was removed with 300 mL of acetone, and then hydrogen chloride was removed with 300 mL of water. Further, after washing with 300 ml of acetone, it was dried at 60° C. under reduced pressure for 16 hours.
  • endcapping which is a secondary treatment, is carried out by transferring the triacontylsilylated silica gel thus obtained to the apparatus described above, adding 90 mL of dry toluene, and degassing in an ultrasonic bath for about 5 minutes. , 10 g of trimethylchlorosilane was added and reacted at 40° C. for 10 hours.
  • the gel was filtered through a glass filter, washed with toluene, acetone, water, and acetone in that order, and dried at 60°C under reduced pressure for 16 hours.
  • the amount of triacontyltrichlorosilane used in the synthesis four kinds of triacontyl group-introduced silica gels with different carbon contents were obtained.
  • the amount of carbon after end capping is 26 wt%
  • the amount of carbon after end capping is 24 wt%
  • 9 g of TATCS the amount of carbon after end capping is 17 wt%.
  • TATCS triacontyl group-introduced silica gel having a carbon content of 15 wt % after endcapping when 7 g of TATCS was used.
  • a triacontyl group-introduced silica gel having a carbon content of 17 wt % and not subjected to endcapping was obtained.
  • 11 g of hexacosyltrichlorosilane was used to synthesize a hexacosyl group-introduced silica gel, and a hexacosyl group-introduced silica gel having a carbon content of 17 wt % was end-capped in the same manner as described above.
  • Carbon content was measured by heating a certain weight of triacontyl group-introduced silica gel or hexacosyl group-introduced silica gel dried at 60°C under reduced pressure for 16 hours from 20°C to 800°C in an air atmosphere.
  • the weight loss value at this time is taken as the carbon weight in the filler used for measurement, and the ratio of the carbon weight contained in the triacontyl group-introduced silica gel or the hexacosyl group-introduced silica gel is calculated from the weight change before and after heating, and the carbon content (wt% ) was calculated.
  • the triacontyl-group-introduced silica gel or hexacosyl-group-introduced silica gel obtained here was packed into stainless steel column hardware to prepare a column with an inner diameter of 2.1 mm and a length of 15 cm, which was designated as columns J to O.
  • Table 5 shows the specifications of the columns used in each test.
  • the chromatogram was collected using a high-speed liquid chromatograph GL7700 (GL Sciences), and the mobile phase (methanol) was sent at a flow rate of 0.2 mL/min using a liquid sending pump PU7710 (GL Sciences). .
  • the set temperature of the separation column constant temperature bath CO7730 (GL Sciences) was 25°C.
  • a UV detector UV7750 (GL Sciences) was used for detection. The detection wavelength was 210 nm.
  • Transfer ⁇ -tocopherol (0.30 mg/mL), ⁇ -tocopherol (0.30 mg/mL), ⁇ -tocopherol (0.30 mg/mL), ⁇ -tocopherol (0.30 mg/mL), ⁇ -tocopherol (0.30 mg/mL) to the sample A phase-diluted solution was used.
  • the sample injection volume was 1 ⁇ L, and was injected using an autosampler AS7720C (GL Sciences).
  • FIGS. 11(a), 12(a) and 13(a) the chromatograms of column L are shown in FIGS. 11(a), 12(a) and 13(a), and the chromatograms of column J are shown in FIGS. ), shown in FIG.
  • FIG. 14(a) the images of the curtain template when tocopherol is used as the sample are shown in FIG. 14(a) for column L and FIG. 14(b) for column J.
  • Table 6 shows the test results and evaluation results.
  • the present invention can be applied to isomer analysis of antioxidant substances that have the property of preventing or delaying cell damage.
  • the present invention can be usefully utilized in the pharmaceutical industry, the health food industry, etc., because it is possible to identify, design, and manufacture fillers that can be widely used in applications such as supplements.

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Abstract

液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）において、カラムからの溶出物によるカーテンプレートの汚れを抑制、防止することを目的の１つとする。そのため、充填剤が充填されたカラムに液体を通液し、前記カラムからの溶出物を、直接乾燥させ、乾燥後の溶出物の状態を充填剤の評価の指標とする充填剤の評価方法が提案される。又、充填剤が充填されたカラム５、送液装置としての送液ポンプ４、カラム５からの溶出物を直接乾燥する装置としてのイオン化部６を備える充填剤の評価装置が提案される。

Description

液体クロマトグラフィー用充填剤の評価方法
　本発明は、液体クロマトグラフィー用充填剤の評価方法に関し、特に液体クロマトグラフィー質量分析法に用いる液体クロマトグラフィーカラムの充填剤の評価方法に関する。
　液体クロマトグラフィーは、化合物の官能基の種類や大きさの違いによる吸着力、電荷、疎水性の差を利用した、成分分離に有用な手法である。その液体クロマトグラフィーにおいて、化合物特有のイオンを選択的に検出できる液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムで試料成分が完全分離されていなくても、最適な検出イオンを設定することによって、試料成分の定性定量分析が可能であることから、代謝物分析、生体成分分析や環境分析などの多成分分析に広く使われ、ＬＣ／ＭＳの需要は益々増えてきている。
　ＬＣ／ＭＳで用いられる質量分析計の試料のイオン化法として、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ：electrospray ionization）法や大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ：atmospheric pressure chemical ionization）法等がある。エレクトロスプレーイオン化法は、エレクトロスプレー（electrospray）の技術を使ったイオン化法であり、試料溶液を供給するキャピラリーと対向電極の間に数ｋＶの高電圧を印加すると、キャピラリー先端に円錐状の液体コーン（テイラーコーン（taylor cone））が形成され、テイラーコーン先端より高度に帯電した液滴が生成する。そして、溶媒の気化による液滴の体積収縮に伴って液滴の電化密度が増大し、電化密度がレイリー極限（rayleigh limit）を超えると液滴が自発的に分裂に至り、分裂した帯電液滴のサイズが溶媒の気化で更に小さくなると、ついには帯電液滴からイオンの蒸発が起こる。そして、プロトン付加による多価正イオンやプロトン脱離による多価負イオン等を生成することが出来る。又、大気圧化学イオン化法は、大気圧下でコロナ放電を用いたイオン化法である。これらは、基本的には、試料溶液が質量分析計に入る時になるべく揮発性成分を取り除くことは同じで、その方法が異なるだけである。
　しかし、質量分析計を用いても、分子量が同じである位置異性体は区別が出来ないので、前段に取り付ける高速液体クロマトグラフィーカラム（ＨＰＬＣカラム）で分離する必要がある。そのため、目的成分である位置異性体の分離を達成するため、種々のＨＰＬＣカラムを試行錯誤で試しながら、位置異性体を分離することが出来る充填剤を充填したカラムを選択して液体クロマトグラフィー質量分析法分析（ＬＣ／ＭＳ分析）を行う必要があり、非常に手間が掛かっている。
又、ＨＰＬＣ充填剤を溶媒抽出や焼成乾固等を行い、充填剤からの溶出物を評価することは、充填剤の合成段階の試験として広く行われているが、実際のＬＣ／ＭＳ分析では、移動相によって流されるＨＰＬＣカラムからの溶出物が問題となっている。
　そこで、従来、ＬＣ／ＭＳに適する充填剤を評価し、選択するに際し、ＬＣ／ＭＳ測定に用いる移動相を通液した時のベースライン測定を主に行い、カラム固定相からの分解物等の溶出により生成されるバックグラウンドシグナル（ブリード）を採取し、ブリードの値の大きさを指標として充填剤を評価していた（非特許文献１）。
　又、ＨＰＬＣカラムにおいて、いくつかの異性体分析のアプリケーションが公開されているが、統一した方法での評価がされておらず、ある充填剤がどの程度異性体分析に有効であるかの基準はない。又、シリカゲル母体にオクタデシル基（Ｃ１８基）を結合した充填剤（Ｃ１８充填剤）が充填されているＨＰＬＣカラムであるＯＤＳカラム（オクタデシルシリル化シリカゲルカラム）の評価方法として、Phenanthro[3,4-c]phenanthrene (PhPh)非平面分子(non-planar)、Tetrabenzonaphthalene (TBN)非平面分子(non-planar)、Benzo[a]pyrene (BaP)平面分子(planar)の３種の立体構造が異なる芳香族化合物の分析を行い、その溶出挙動を用いて、その保持係数の比より、立体構造認識能力を検査するＳＲＭ８６９方法が提唱されている（非特許文献２、非特許文献３）。
　その他のカラム評価方法として、良く用いられる方法としては、4-Ethylaniline Test（非特許文献４）やAminopyridine Test（非特許文献５）のような方法が知られている。又、簡単な化合物で、充填剤の不活性度、即ち、塩基性化合物等の分析時に生じやすい、疎水性相互作用以外の作用による吸着のし難さ、疎水性相互作用に基づく保持力及び立体構造認識能力を同時に評価する方法のSelectivity Test（非特許文献６）が、公開されている。
株式会社住化分析センター　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｎｅｗｓ　ＴＮ３７５「低ブリードを実現したＨＰＬＣカラム"ＳＵＭＩＰＡＸ　ＯＤＳ　Ｚ－ＣＬＵＥ"」 Lane C. Sander, Stephen A. Wise, LC・GC, 8(5) (1990) 378-390 Lane C. Sander, Stephen A. Wise, Journal of Chromatography, 656 (1993) 335-351 N.Engelharde, et al., LC・GC  15 (1997) 856 D.A.Barret, et al., J.Chromatogr.Sci.  34 (1996) 146 K.Kimata, N.Tanaka, et al., J.Chromatogr.Sci.  27 (1989) 721
　しかし、種々の充填剤が充填されたカラムを用いてＬＣ／ＭＳでの測定を行うと、充填剤の種類によっては、ブリードの値の大きさに関係無く、ＬＣ／ＭＳ用の質量分析装置の入口側のカラムからの溶出液が当たる金属板である、所謂カーテンプレートやサンプリングコーン等の金属板（以下単に「カーテンプレート」という。）の金属面に汚れが観測され、このカーテンプレートに蓄積した汚れの中には、溶媒を用いた洗浄によっても、又、研磨によっても、カーテンプレートからの除去が困難なものがあった。特に、位置異性体分離能力に優れた、結合基の結合量の多い充填剤や結合基の炭素数が多い充填剤、即ち炭素量比率の高い充填剤の方がカーテンプレートの汚れが顕著になる傾向が見られた。
　そして、この汚れが蓄積したままのカーテンプレートを装着したＬＣ／ＭＳ用の質量分析装置を用いて測定を行うと、カラムで分離された成分がカーテンプレートの汚れに吸着し、定量値に影響を与えてしまうことがあった。又、カーテンプレートに蓄積された残余物、即ち汚れと分離成分が反応してしまう可能性もあった。更に、カーテンプレートに蓄積した汚れが脱離することで、ＬＣ／ＭＳでの測定結果に悪影響を及ぼす可能性もあった。
　更に、上述のように、質量分析装置では分子量が同じ位置異性体を区別するのは困難であるので、位置異性体分離能力に優れたカラムで位置異性体同士をよく分離した後に質量分析装置に送った方が、より正確な分析結果になるはずであるが、しかし、位置異性体分離能力に優れた充填剤を充填したカラムを選択すると、質量分析装置のカーテンプレートの汚れが顕著になり、測定結果に悪影響を及ぼす可能性も高くなってしまう。
　又、カラムからの溶出液を一旦所定量採取、収集して、その収集した所定量の採取溶液を加熱攪拌やガスパージや減圧溶媒除去等により濃縮、乾固する分取方法も知られている。しかし、分取された成分の分析時に初めて、カラムからの溶出物が判明し、再溶解精製などの手法で、さらに煩雑な前処理を行うことが必要になるという問題点があった。
　又、従来技術のＳＲＭ８６９方法は、オクタデシル基の密度や配列様式を分類することを目的としており、異性体のうち、鏡像異性体を除くジアステレオマー、シス-トランス異性体などの立体異性体を分離する分離能力を推定することが出来るが、位置異性体を分離する分離能力を推定することは出来なかった。又、従来技術の4-Ethylaniline Test、Aminopyridine Test又はSelectivity Testも位置異性体を分離する分離能力を推定することは出来なかった。
　そこで、ＬＣ／ＭＳにおいて、カラムからの溶出物によるカーテンプレートの汚れを抑制、防止することが求められている。又、高感度検出が出来るＬＣ／ＭＳにおいて、分子量が同じである位置異性体を含む異性体の分離、区別を行うことが求められている。そのため、ＬＣ／ＭＳにおいて、カーテンプレートに汚れが付着し難い充填剤、位置異性体を含む異性体の分離を達成出来る充填剤が求められている。そのため、ＬＣ／ＭＳにおいて、カーテンプレートに汚れが付着し難い充填剤を容易に選択することが出来ること、位置異性体を含む異性体の分離を達成出来る充填剤を容易に選択することが出来ることが求められている。そのため、カーテンプレートに汚れが付着し難い充填剤を容易に選択するための充填剤の評価方法及び評価のための指標、位置異性体を含む異性体の分離を達成出来る充填剤を容易に選択するための充填剤の評価方法及び評価のための指標が求められている。
　そこで、本発明は、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）において、カラムからの溶出物によるカーテンプレートの汚れを抑制、防止することを目的の１つとする。又、ＬＣ／ＭＳにおいて、位置異性体を含む異性体の分離、区別を行うことを目的の１つとする。又、ＬＣ／ＭＳにおいて、カーテンプレートに汚れが付着し難い充填剤を提供することを目的の１つとする。又、ＬＣ／ＭＳにおいて、位置異性体を含む異性体の分離を達成出来る充填剤を提供することを目的の１つとする。又、ＬＣ／ＭＳにおいて、カーテンプレートに汚れが付着し難い充填剤を容易に選択することが出来ることを目的の１つとする。又、ＬＣ／ＭＳにおいて、位置異性体を含む異性体の分離を達成出来る充填剤を容易に選択することが出来ることを目的の１つとする。又、ＬＣ／ＭＳにおいて、カーテンプレートに汚れが付着し難い充填剤を容易に選択するための充填剤の評価方法及び評価のための指標を提供することを目的の１つとする。又、ＬＣ／ＭＳにおいて、位置異性体を含む異性体の分離を達成出来る充填剤を容易に選択するための充填剤の評価方法及び評価のための指標を提供することを目的の１つとする。又、これらの評価方法及び評価のための指標を用いて充填剤を設計し、位置異性体を含む異性体分離能力に優れると共に質量分析装置のカーテンプレートを汚し難い充填剤及びカラムを作製することを目的の１つとする。
　上記の課題を解決するための手段としての本発明は、充填剤が充填されたカラムに液体を通液し、前記カラムからの溶出物を、直接乾燥させ、乾燥後の溶出物の状態を充填剤の評価の指標とする充填剤の評価方法である。
  又、上記充填剤の評価方法において、前記カラムからの溶出物を、直接プレートに接触させ、前記プレート上で乾燥させる充填剤の評価方法である。
   又、上記充填剤の評価方法において、前記プレートは金属板である充填剤の評価方法である。
   又、上記充填剤の評価方法において、前記金属板は、カラムからの溶出物が当たる、質量分析装置内の金属板である充填剤の評価方法である。
  又、上記充填剤の評価方法において、前記溶出物の乾燥は、不活性ガス雰囲気下で又は／及び不活性ガスで前記溶出物を噴霧して行う充填剤の評価方法である。
  又、上記充填剤の評価方法において、前記溶出物の乾燥は、減圧下又は／及び不活性ガスパージ下で行う充填剤の評価方法である。
  又、上記充填剤の評価方法において、前記溶出物の乾燥は、前記溶出物に、電圧を印加し、前記溶出液を噴霧させて行う充填剤の評価方法である。
又、上記充填剤の評価方法において、前記溶出物の乾燥は、前記溶出物を加熱して行う充填剤の評価方法である。
  又、上記充填剤の評価方法において、前記乾燥後の溶出物の状態を撮影し、撮影された画像を観察又は観測して評価する充填剤の評価方法である。
  又、上記充填剤の評価方法において、前記乾燥後の溶出物の状態を撮影し、デジタル化された画像を生成し、前記溶出物の状態を数値化して評価する充填剤の評価方法である。
  又、上記充填剤の評価方法において、質量分析装置を用いて、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法を用いる充填剤の評価方法である。
  又、上記充填剤の評価方法において、質量分析装置を用いて、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）法を用いる充填剤の評価方法である。
  又、上記充填剤の評価方法において、質量分析装置を用いた分析時に、前記充填剤の評価を行う充填剤の評価方法である。
　又、充填剤の分離能力を示すクロマトグラムを評価の指標とする充填剤の評価方法と、上記のうちいずれかの充填剤の評価方法を組み合わせて充填剤を評価する充填剤の評価方法である。
　又、上記充填剤の評価方法において、前記充填剤の分離能力を示すクロマトグラムは、充填剤の異性体の分離能力を示すクロマトグラムである充填剤の評価方法である。
　又、上記充填剤の評価方法において、前記充填剤の分離能力を示すクロマトグラムは、充填剤の位置異性体の分離能力を示すクロマトグラムを含む充填剤の評価方法である。
  又、上記充填剤の評価方法において、前記充填剤の分離能力を示すクロマトグラムは、充填剤の立体異性体の分離能力を示すクロマトグラムを含む充填剤の評価方法である。
  又、上記充填剤の評価方法において、前記充填剤の分離能力を示すクロマトグラムは、充填剤の位置異性体の分離能力を示すクロマトグラム及び充填剤の立体異性体の分離能を示すクロマトグラムを含む充填剤の評価方法である。
  又、上記充填剤の評価方法において、前記充填剤の位置異性体の分離能力を示すクロマトグラムを評価の指標とする充填剤の評価方法は、２種以上の位置異性体を分析したクロマトグラムから、夫々の保持時間又は保持係数の比を求め、当該保持時間又は保持係数の比を充填剤の評価の指標とする充填剤の評価方法である。
　又、上記充填剤の評価方法において、前記充填剤の立体異性体の分離能力を示すクロマトグラムを評価の指標とする充填剤の評価方法は、立体構造が異なる２種以上の化合物を分析したクロマトグラムから、夫々の保持時間又は保持係数の比を求め、当該保持時間又は保持係数の比を充填剤の評価の指標とする充填剤の評価方法である。
  又、上記充填剤の評価方法において、前記位置異性体が、置換基の結合位置が異なる位置異性体である充填剤の評価方法である。
  又、上記充填剤の評価方法において、前記位置異性体が、芳香族化合物である充填剤の評価方法である。
  又、上記充填剤の評価方法において、前記立体構造が異なる化合物は、芳香族化合物である充填剤の評価方法である。
  又、上記充填剤の評価方法で得られた所定の基準を満たしている高速液体クロマトグラフィー用充填剤である。
  又、上記高速液体クロマトグラフィー用充填剤が充填されている高速液体クロマトグラフィー用カラムである。
  又、上記高速液体クロマトグラフィー用カラムが用いられている高速液体クロマトグラフである。
  又、上記高速液体クロマトグラフィー用カラムが用いられている液体クロマトグラフ質量分析装置である。
  又、上記充填剤の評価方法を用いる充填剤の設計方法である。
  又、上記設計方法により設計された充填剤である。
  又、上記充填剤において、前記充填剤は、シリカゲル母体が用いられ、前記シリカゲル母体の細孔径が１５～２５ｎｍであり、化学結合基Ｃ２６～Ｃ３０、炭素量１６～２５ｗｔ％であり、二次処理が施されている充填剤である。
  又、上記充填剤において、前記充填剤は、前記シリカゲル母体の細孔径が１９～２１ｎｍであり、前記二次処理としてエンドキャッピングが施されている充填剤である。
  又、上記充填剤において、前記充填剤は、炭素量１７～２４ｗｔ％である充填剤である。
  又、充填剤が充填されたカラム、送液装置、前記カラムからの溶出物を直接乾燥する装置、を備えている充填剤の評価装置である。
  又、上記充填剤の評価装置において、前記カラムからの溶出物を直接乾燥する装置は、金属板を備えている充填剤の評価装置である。
   又、上記充填剤の評価装置において、前記充填剤の評価装置は質量分析装置を備え、前記カラムからの溶出物を直接乾燥する装置は、前記カラムからの溶出物が当たる、前記質量分析装置内の金属板を備えている評価装置である。
　以上のような本発明によれば、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）において、カラムからの溶出物によるカーテンプレートの汚れを抑制、防止することが可能となった。又、ＬＣ／ＭＳにおいて、位置異性体を含む異性体の分離、区別を行うことが可能となった。又、ＬＣ／ＭＳにおいて、カーテンプレートに汚れが付着し難い充填剤を提供することが可能となった。又、ＬＣ／ＭＳにおいて、位置異性体を含む異性体の分離を達成出来る充填剤を提供することが可能となった。又、ＬＣ／ＭＳにおいて、カーテンプレートに汚れが付着し難い充填剤を容易に選択することが可能となった。又、ＬＣ／ＭＳにおいて、位置異性体を含む異性体の分離を達成出来る充填剤を容易に選択することが可能となった。又、ＬＣ／ＭＳにおいて、カーテンプレートに汚れが付着し難い充填剤を容易に選択するための充填剤の評価方法及び評価のための指標を提供することが可能となった。又、ＬＣ／ＭＳにおいて、位置異性体を含む異性体の分離を達成出来る充填剤を容易に選択するための充填剤の評価方法及び評価のための指標を提供することが可能となった。又、これらの評価方法及び評価のための指標を用いて充填剤を設計し、位置異性体を含む異性体分離能力に優れると共に質量分析装置のカーテンプレートを汚し難い充填剤及びカラムを作製することが可能となった。
ＬＣ‐ＭＳ一実施例概要図 イオン化部の一実施例概要図 カーテンプレート上の溶出物の状態の写真 溶出物の状態を画像解析ソフトで数値化した輝度分布グラフ プレート上の溶出物の状態の写真 ＰｈＰｈとＴＢＮとＢａＰのクロマトグラム ＴＩＣＣのクロマトグラム カーテンプレート上の溶出物の状態の写真 o-ターフェニルとトリフェニレンのクロマトグラム ジビニルベンゼンのクロマトグラム o-ターフェニルとトリフェニレンのクロマトグラム ジビニルベンゼンのクロマトグラム トコフェロールのクロマトグラム カーテンプレート上の溶出物の状態の写真 ImageJ とＧＩＭＰの比較の図
　本発明は、充填剤が充填されたカラムに液体を通液し、カラムからの溶出物を、直接乾燥させ、乾燥後の溶出物の状態を充填剤の評価の指標とする充填剤の評価方法である。又、本発明は、ＬＣ／ＭＳに適した充填剤の評価方法である。
　これらの充填剤の評価方法を行うために用いる充填剤の評価装置は、充填剤が充填されたカラム、送液装置、カラムからの溶出物を直接乾燥する装置を備えて構成される。カラムからの溶出物を直接乾燥する装置は、カラムからの溶出物が直接接触するプレートを備えて構成される。「カラムからの溶出物を直接乾燥する装置」は、カラムから溶出した溶出物を、一旦、一定量を採取して集め、その一定量集めた採取溶液を、加熱攪拌やガスパージや減圧溶媒除去などにより濃縮、乾固する分取方法で用いる装置とは異なり、カラムから溶出し次第、溶出した溶出物から順次、乾燥させる装置であり、カラムからの溶出物を直接乾燥させるために、カラムから溶出した溶出物を、他の器具に接触させることなく、吹き付け、滴下、噴霧等により直接プレートに接触、保持させ、そして、カラム出口からプレート間及びプレート上で溶出物を乾燥させる装置である。
　充填剤を充填するカラムのサイズは、特に限定されないが、ＬＣ／ＭＳでの分析によく用いられる、内径１．０～４．６ｍｍ、長さ１０～２５０ｍｍのサイズのカラムが好ましい。又、充填剤が充填されたカラムに液体を通液するための送液装置は、シリンジでもよいし送液ポンプでもよい。又、送液装置の作動方法は手動でもよいし自動でもよい。
　これらの充填剤の評価方法を行うために用いる装置として、図１に概要を示す液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ－ＭＳ）１を用いることが出来る。ＬＣ‐ＭＳ１は、液体クロマトグラフ２及び質量分析装置３を備えて構成され、液体クロマトグラフ２は送液装置としての送液ポンプ４及び充填剤が充填されたカラム５を備え、質量分析装置３はカラムからの溶出物を直接乾燥する装置でもあるイオン化部６及び質量分析部７を備えて構成されている。又、イオン化部６にはプレートとしてのカーテンプレート８が設置されている。
　この評価方法は、先ず評価したい充填剤をカラムに充填し、充填剤が充填されたカラムを作製する。そして、充填剤が充填されたカラムに送液装置で液体を通液し、カラムから溶出物を溶出させる。次に、カラムからの溶出物を、直接乾燥させる。最後に、乾燥後の溶出物の状態を充填剤の評価の指標とする。具体的には、乾燥後の溶出物の状態を観察或いは観測し、認定して、評価の指標とし、当該指標が予め定められた所定の基準を満たしているか否かで充填剤の評価を行う。
　充填剤が充填されたカラムに通液する液体は、不揮発性物質を含まなければ特に限定されないが、ＬＣ／ＭＳでの分析によく用いられる移動相が好ましい。具体的には、アセトニトリル、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、イソプロパノール、ヘキサン等の有機溶媒、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸等の揮発性の酸、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の揮発性の塩、水、そしてこれらの混合物が好ましい。更に、１～１００ｍＭのギ酸アンモニウム水溶液等の揮発性の塩の水溶液とアセトニトリル及び／又はメタノールの混合物、０．０１～０．５％のギ酸水溶液等の揮発性の酸の水溶液とアセトニトリル及び／又はメタノールの混合溶液がＬＣ／ＭＳでの分析によく用いられるので、より好ましい。
　充填剤を充填したカラムに通液する液体の流量は、ＬＣ／ＭＳでの分析によく用いられる流量が好ましく、又、ＬＣ／ＭＳにおいてカーテンプレートの汚れの原因となる充填剤から溶出する化学物質が希釈され過ぎず、乾燥させたカラムからの溶出物が確認しやすい０．０５～１．０ｍＬ／ｍｉｎが好ましい。
　カラムからの溶出物は直接乾燥させる。ここで、「カラムからの溶出物を直接乾燥させる」とは、カラムから溶出した溶出物を、一旦、一定量を採取して集め、その一定量集めた採取溶液を、加熱攪拌やガスパージや減圧溶媒除去などにより濃縮、乾固する分取方法とは異なり、カラムから溶出し次第、溶出した溶出物から順次、乾燥させることを意味する。カラムからの溶出物は、従来の分取方法のように一旦容器に溜めてからの乾燥であると、カラムからの溶出状態、例えば溶出物の広がり状態や形状等を把握することが出来ないので、充填剤の評価の指標とするためには、溶出物を直接乾燥する必要がある。カラムからの溶出物を直接乾燥させるために、カラムから溶出した溶出物を、他の器具に接触させることなく、吹き付け、滴下、噴霧等により直接プレートに接触、保持させ、そして、カラム出口からプレート間及びプレート上で溶出物を乾燥させる。このようにして、乾燥された溶出物はプレートの表面に付着する。
　カラムからの溶出物から直接溶媒を除去することにより、溶出物の出方も確認することが出来る。例えば、カラムからの溶出物の溶出条件と乾燥条件が同じ場合、溶出物中の汚れの原因となる化学物質が低分子、又は低粘度である方が、薄く広がりやすくなる。このように、カラムからの溶出物を直接乾燥させることで、溶出物に含まれる化学物質の分子量や粘度等について、より多くの情報を得ることが出来る。
　プレートの形状は、乾燥後の溶出物の状態を確認することが出来れば特に限定されず、円錐状、板状、半球状等を用いることが出来、プレートの材質も特に限定されず、ガラスや金属を用いることが出来、例えば、金属製の板体である金属板を用いることが出来る。金属製のプレートは、加熱することや、電圧を掛けることが出来、又、加熱や加圧によっても形状や物性が変化しにくいので、直接溶出物の乾燥を行い易いので、好ましい。又、ＬＣ／ＭＳの移動相としてはイオン化し易い酸性液がよく使用されるので、プレートは、錆難いステンレス製が好ましい。
　プレートの一実施形態としては、質量分析装置の入口側にあり、カラムからの溶出物が直接当たる金属面を有する金属板で構成することが出来る。この質量分析装置の金属板は、質量分析装置メーカーによって、カーテンプレート、サンプリングコーン、オリフィス等名前が異なるが、これら全てがプレートに含まれ、又、将来他の名前が付けられた場合でもプレートに含まれる。
　カラムからの溶出物を乾燥させる方法としては、特に限定されないが、以下のような方法を用いることが出来る。即ち、カラムの出口側にプレートを設置し、カラムの出口からプレートまでの空間の全体、言い換えれば、プレートが置かれている空間、質量分析装置の場合にはイオン化部全体、に窒素、ヘリウム、アルゴンなどの不活性ガスを供給し、不活性ガス雰囲気下にして、カラムからの溶出物をプレートに接触させて乾燥させる方法、又は、カラムからの出口に不活性ガスを供給し、不活性ガスでカラムからの溶出物を噴霧して、プレートに吹き付けて乾燥させる方法を用いることが出来る。又、不活性ガス雰囲気下において、不活性ガスで溶出物をプレートに噴霧してもよい。不活性ガスを供給し、プレート、例えば金属板に直接溶出物を噴霧することにより、液滴の生成が補助され、脱溶媒の効率を高めることが出来、又、不活性ガスを使用することにより、溶出物の酸化分解を低減することが出来る。
　又、カラムの出口側にプレートを設置し、カラムの出口からプレートまでの空間の全体、言い換えれば、プレートが置かれている空間、質量分析装置の場合にはイオン化部全体、を減圧することによりプレート上で溶出物を乾燥させる方法を用いることが出来る。このように減圧状態にすることにより、脱溶媒の効率を高めることが出来る。又、不活性ガスを供給しながら、減圧することにより、溶出物をより乾燥させ易くすることが出来る。
　又、溶出物の乾燥は、溶出物を加熱して行うことが出来る。溶出物の加熱は、プレートの加熱又は／及びカラムの出口からプレートまでの空間の全体、言い換えれば、プレートが置かれている空間、質量分析装置の場合にはイオン化部全体、の加熱により行うことが出来る。又、溶出物の乾燥は、溶出物に±１～１０ｋＶの電圧を印加して行うことが出来る。溶出物への電圧の印加は、カラムの出口とプレート間に電圧を印加し又は／及びプレートとしての金属板に電圧を印加することにより行うことが出来る。溶出物に電圧を印加することにより、帯電液滴を生成させ、加熱による脱溶媒、クーロン反発による液滴分裂、イオン生成を導くことが出来る。
　溶出物を乾燥させる方法は、上記の方法を単独で用いてもよいが、２種以上を組み合わせてもよい。カラムからの溶出物から出来るだけ早く溶媒を蒸発させた方が、溶出物の乾燥後の平面的に広がる状態を、目視或いは画像解析ソフトを用いて判別しやすくなるので、２種以上を組み合わせることが好ましい。又、溶出物を不活性ガス雰囲気化で、加熱しながら、電圧をかける方法が、実際に用いるＬＣ‐ＭＳの状態に近いのでより好ましい。
　図１に概要を示すＬＣ‐ＭＳ１を用いて溶出物を乾燥させる場合、図２に示すように、イオン化部６でカラム５からの溶出物２１がネブライザーガス３１でカーテンプレート８に噴霧され、電圧印加装置９１等を用いてイオン化及び乾燥され、イオン１１はカーテンプレート８のイオン導入孔８５から質量分析部７へ送られ、噴霧された溶出物２１はカーテンプレート８上で乾燥され汚れ１０として蓄積する。このように、ＬＣ‐ＭＳも充填剤の評価装置となり得る。又、充填剤の評価装置は、ＬＣ‐ＭＳそのものでなくても良い。カラム出口からカーテンプレートまでを再現することができる装置であれば、高価なＬＣ‐ＭＳやＬＣ‐ＭＳ用のカーテンプレートを使用しなくてよいため、充填剤の評価を安価に行うことができるようになる。
　溶出物の乾燥は、溶出物が完全に固体となるまで乾燥させる、即ち乾固させるのが好ましいが、カラムからの溶出物の状態を観察又は観測出来ればよいため、観察又は観測する所定期間同じ状態を維持出来ればよく、溶出物を完全な固体にせず、溶出物が流動性の低いゾル状態となる乾燥でもよい。乾燥の一つの目安として、乾燥により溶出物が１００ｍＰａ・ｓ（ミリパスカル秒）以上の粘性を備えるようになればよい。更に、例えば、静止画像を撮影して評価に用いる場合では、乾燥させた溶出物は０．５秒程度同じ状態が保たれていればよく、動画像を撮影して評価に用いる場合では、必要な１部のコマを確認することが出来るので、流動性があってもよい。しかし、他の種々の観察方法又は観測方法を用いることを考慮すると、溶出物は、１０分以上同一の状態が維持されるように乾燥されることが好ましい。
　そして、乾燥後の溶出物の状態を充填剤の評価の指標とするため、乾燥後に残余した溶出物の状態を、観察又は観測し、認定して評価の指標とし、その指標を用いて、当該指標が予め定められた所定の基準を満たしているか否かで充填剤を評価する。乾燥後の溶出物の状態を認定するための溶出物の観測方法としては、特に限定されないが、以下のような方法を用いることが出来、それらの方法で観察又は観測された状態を評価の指標とすることが出来る。即ち、乾燥した溶出物を目視し、乾燥した溶出物の面積、厚さ、形、色、光沢を観察又は観測し、面積、厚さ、形、色、光沢の夫々を又はこれらの２以上を組み合わせたものを評価の指標とすることが出来る。乾燥した溶出物の厚さを測定する場合にはマイクロスコープを用いてもよく、面積を測定する場合には定規を用いてもよい。又、乾燥した溶出物の重量を測定し、重量を評価の指標とすることが出来る。乾燥した溶出物の重量を測定する場合には、電子天秤を用いて、溶出物が付着する前のプレートのみの重量及び溶出物を付着、乾燥させたプレートの重量を測定し、その差分を溶出物の重量とすることが出来る。又、溶出物が乾燥されて乾固したプレート表面を、指で触りざらつき具合を確認し、ざらつきの程度を評価の指標とすることが出来る。又、接触式又は非接触式表面粗さ計を用いて、溶出物が乾固したプレート表面の粗さを計測し、粗さの程度を評価の指標とすることが出来る。又、光沢計を用いて、溶出物が乾固したプレート表面の光沢度を観測し、光沢度を評価の指標とすることが出来る。又、摩擦摩耗解析装置を用いて、溶出物が乾固したプレート表面の摩擦係数を測定し、摩擦係数を評価の指標とすることが出来る。更に、測色色差計を用いて、乾燥後の溶出物に光を照射したときの表面反射率から乾燥後の溶出物による汚れ度合いを数値化し、当該数値を評価の指標とすることが出来る。又、蛍光Ｘ線分析装置を用いて、Ｘ線を照射したときの蛍光Ｘ線から、乾燥後の溶出物に含まれる金属成分の含有量を数値化し、当該数値を評価の指標とすることが出来る。そして、所定の基準はこれらの指標において、状態の程度、数値等により予め定めることが出来る。
　このように乾燥した溶出物の変化を伴わない状態を指標とすることが出来るが、以下のように、溶出物の変化の状態を指標とすることも出来る。即ち、溶出物が乾燥されて乾固したプレートを、塩酸、硫酸、硝酸、フッ酸などの酸性溶液や水酸化ナトリウムやアンモニア等のアルカリ性溶液や染色液などに浸漬して、乾固した溶出物の変化状態を観測し、変化状態を評価の指標とすることが出来る。又、溶出物が乾燥されて乾固したプレートを、溶媒を用いた洗浄や研磨した後の表面状態を観測し、このときの変化状態あるいは溶出物を付着する前のプレートと比較し評価の指標とすることが出来る。又、乾燥させた溶出物に火を付けて、その炎色状態を観測し、炎色状態を評価の指標とすることが出来る。乾燥させた溶出物に呈色試薬を反応させ、その反応による呈色反応を観測し、呈色状態を評価の指標とすることが出来る。
　目視の場合は、測定者の主観が入り易いので、乾燥後の溶出物の状態を記録媒体に記録し、その記録媒体を用いて観察、観測、認定、評価を行うことが、客観的に認定、評価をすることが出来るので好ましい。記録媒体として、乾燥後の溶出物の状態を撮影し、撮影された写真等の静止画像やビデオ等の動画像、スキャナや複写機を用いた静止画像、乾燥後の溶出物に墨や絵の具等の染色物を塗って転写した紙等媒体等が挙げられる。特に静止画像、動画像、スキャンデータ等の記録媒体は、予めデジタル機器を用いて記録し或いはデジタル化することにより、デジタル化された画像を生成して、溶出物の状態を数値化できるので、客観的な認定、評価に適している。尚、写真や動画においては、可視光以外に紫外線やＸ線や電子線などを用いる方法がある。又、乾燥後の溶出物の全体写真を撮り難い場合には、狭い範囲を連続的に撮り、それを組み合わせて、全体像にする等その撮影方法は特に限定されない。
　尚、乾燥後の溶出物の状態の観察、観測、認定、評価方法としては、上記に限定されず、又、上記の観察、観測、認定、評価方法を２種以上組み合わせてもよい。又、充填剤の評価の指標としては、上記に限定されず、又、上記の評価の指標を２種以上組み合わせて指標としてもよい。
　尚、質量分析装置を用いた実際の分析時に、カーテンプレート上の乾固物を指標として充填剤を評価することとしてもよいが、試料成分由来の溶出物が、溶出物の乾燥状態に影響を及ぼすため、コンディショニング時等、試料を注入しない条件で一連の工程を行い、充填剤を評価することが望ましい。
　又、溶出物がプレート上で乾燥された状態、一例として、溶媒が除去された残余物の乾固状態を、種々のソフトウェアで数値化して観測、認定、評価し、その数値を評価の指標とすることとしてもよい。そして、このようにして求められた評価の指標としての数値が予め定められた所定の基準値を満たしているか否かで充填剤の評価を行うことが出来る。
　例えば画像解析ソフトウェアでの数値化は、これに限定されないが、例えばＬＣ‐ＭＳのカーテンプレート上で乾燥又は乾固させた溶出物の写真を撮り、写真の画像の色別に面積値を算出して数値化することが出来る。
　又、画像解析ソフトウェアとしては、これに限定されないが、電気泳動の画像処理などに用いられる、米国国立衛生研究所で開発されたImageJを用いることが出来る。ImageJを用いた評価の詳細な結果は実施例にて開示し、ここでは評価の方法の概要を示す。
　画像解析に用いる写真は、カーテンプレートを質量分析装置から外し、書画カメラ等のデジタルカメラで撮影する。カーテンプレートのデジタル画像を、画像編集ソフトを用いて汚れ、即ち溶出物が乾固したものが見られる部分が含まれるようにトリミングする。比較する複数の画像がある場合には、対比のために画像サイズを統一してトリミングする。画像編集ソフトとしては特に限定されないが、ペイントを使用することが出来る。尚、フィルムカメラで撮影した画像は、撮影された画像を目視して汚れを観測する他、画像をスキャナ等でデジタル化された画像に生成して画像解析に用いることが出来る。
　画像解析による数値化は、はじめに画像解析ソフトを用いて画像をグレースケールに変換し、画像にイオン導入孔が含まれる場合は、この部分を解析から除外するために解析に影響を及ぼさない色、例えば白い汚れを評価の指標とする場合には黒、に塗りつぶす。次にカーテンプレートの汚れが見られない背景部分がカウントされないように閾値を設定し、続いて画像解析を行なうことで輝度分布グラフを作成する。輝度分布グラフの解析結果から、輝度分布グラフ中のCount数を利用して得た、汚れが見られる部分のピクセル数（以下「カウント数」という。）を面積値として算出する。更に、この汚れ部分の白さ程度を汚れ程度とし、カーテンプレートの総合的な汚れを、カウント数×（輝度平均値（輝度分布グラフ中のMean数を用いる）－閾値（輝度分布グラフ中のMin数を用いる））から算出することが出来る。同様にカーテンプレートの汚れが見られない背景部分より黒い部分についても汚れ部分と把握して数値化することも出来る。このように、汚れの数値としては、面積値を示すカウント数を用いてもよいし、更には汚れ部分の輝度平均値と閾値を利用して、カウント数×（輝度平均値－閾値）を用いてもよい。
　ＬＣ‐ＭＳのカーテンプレートの汚れ、即ち乾燥後の溶出物は、色彩を有する付着物であり、一例として白色の付着であり、色解析による数値基準は、画像解析ソフトにより算出される。カーテンプレート（背景）より白色等の着色の領域は、カウント数×（輝度平均値－閾値）から算出され、例えばその数値が１０，０００未満であることを所定の基準として評価の基準値とすることが出来る。カラムからの溶出物のＬＣ－ＭＳのカーテンプレートへの溶出方法は、液体クロマトグラフタンデム質量分析装置（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）のＭＳ／ＭＳ検出器にカラムを接続し、一例として、移動相は、グラジエントで０．２ｍＬ／ｍｉｎの流量で送液する。グラジエント条件は、一例として、移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液等の揮発性の塩の水溶液、移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液等の揮発性の塩の水溶液とアセトニトリルとの混液を用いて、Ａ／Ｂ＝９９／１－（６０ｍｉｎ）－１／９９－（３０ｍｉｎ）－９９／１－(５ｍｉｎ) －９９／１，ｖ／ｖを３回繰り返し行うことが出来る。カラムオーブン温度条件は特に限定されないが、４０℃程度とすることが出来る。質量分析装置でのイオン化はポジティブモードで行い、検出モードはＱ１スキャンで実施する。カラムへの移動相の通液後、カーテンプレートを質量分析装置から外し、カーテンプレートの汚れ部分である乾固した溶出物を書画カメラで撮影した写真を画像解析に用いる。このようにして解析されて、認定、評価された結果の概要を以下に示す。
　カーテンプレート上の溶出物の状態を撮影した写真を見ると、充填剤を充填していないカラムＡから溶出した溶出物による汚れはほとんど確認されない（図３（ａ））。充填剤が充填された市販のカラムＤでは、カラムから溶出した白い溶出物を確認することが出来る（図３（ｂ））。充填剤が充填された市販のカラムＨでは、白い溶出物はほぼ無いことを確認することが出来る（図３（ｃ））。この白い部分即ち溶出物の状態を、画像解析ソフトで数値化した一例として、図４（ａ）～図４（ｃ）に示す、カラムＡ、カラムＤ及びカラムＨの輝度分布グラフにある解析結果値を利用して、カウント数×（輝度平均値－閾値）を評価の指標とし、その所定の数値を評価の基準することが出来る。この指標を用いた場合、カラムＡは７３×（１４７．３８４－１４２）から算出され、その数値を３９３、カラムＤは１２１９×（１４６．９７７－１２５）から算出され、その数値を２６７９０、カラムＨは３７×（１５４．４０５－１４５）から算出され、その数値を３４８と数値化し、充填剤の評価をすることが出来る。
　カウント数×（輝度平均値－閾値）以外にも、画像解析から得られたカウント数（カラムＡ：７３、カラムＤ：１２１９、カラムＨ：３７）や、カウント数×輝度平均値（カラムＡ：７３×１４７．３８４＝１０７５９、カラムＤ：１２１９×１４６．９７７＝１７９１６５、カラムＨ：３７×１５４．４０５＝５７１３）等も汚れを数値化した値として、充填剤の評価の指標として使用することが出来る。更に、これらの値から、充填剤を充填していないカラムの汚れを数値化した値をブランク値として引いた値を充填剤の評価の指標として用いることも出来る。この他にも、輝度分布グラフを目視することにより、汚れ部分と判定される画素のカウント数やこれらの輝度分布状態を把握することによっても評価し、数値化し、その数値を充填剤の評価の指標として用いることが出来る。
　これらの数値を充填剤の評価の指標として用いてカラムに充填された充填剤を簡単に評価することが出来、溶出物が少ない充填剤を容易に順位付けすることが出来る。又、このような方法を用いることで、ＬＣ／ＭＳに適した充填剤を容易に順位付けすることが出来る。更に、上記の実施形態では、図５（ａ）に示す、プレート上の白い汚れ部分（図中点線で囲まれた部分）を画像解析ソフトで数値化したが、他の色の着色部分、例えば図５（ｂ）に示す、プレート上の黒い汚れ部分（図中点線で囲まれた部分）や、図５（ｃ）に示す、プレート上のこげ茶の汚れ部分（図中点線で囲まれた部分）を夫々画像解析ソフトで数値化し或いはその数値を比較して、そこで得た数値を充填剤を評価する指標として用いて、充填剤を容易に順位付けすることが出来る。
　このように、カラムからの溶出物を、直接乾燥させ、乾燥後の溶出物の状態を、プレート上の汚れとして、その状態を数値化して充填剤の評価の指標とすることにより、充填剤が充填されたＨＰＬＣカラムを評価することが出来、カラムがＬＣ／ＭＳに適しているかを容易に確認することが出来る。
　尚、画像解析ソフトとして、実施例においてImageJとGNU General Public Licenseの下で配布されているＧＩＭＰを用いたが、この２つのソフトの間で有意な差は無かった。従って、画像解析ソフトとしては、ImageJの他にＧＩＭＰを用いることが出来、更に、ImageJ及びＧＩＭＰの２つのソフトウェアと同等の機能を持つソフトウェアであれば、特に限定されず使用することが出来る。
　乾燥後の溶出物の状態を、プレート上の汚れとし、その状態の数値化は、これらの方法に限定されるものではなく、アナログ画像をデジタル化し、輝度やコントラストの補正、ノイズの除去などの画像処理を行った後に上述のような画像解析をして、上述のように数値化する方法、輝度の２値化により数値化する方法、カラー画像の色のＲＧＢ値やＣＭＹＫ値を用いて数値化する方法等種々の方法を用いることが出来る。
　又、本発明は、上記の充填剤が充填されたカラムに液体を通液し、前記カラムからの溶出物を、直接乾燥させ、乾燥後の溶出物の状態を充填剤の評価の指標とする充填剤の評価方法（以下「溶出物の状態を評価の指標とする充填剤の評価方法」ともいう。）と、充填剤の分離能力を示すクロマトグラムを評価の指標とする充填剤の評価方法とを組み合わせて、充填剤を評価する充填剤の評価方法である。充填剤の分離能力を示すクロマトグラムを評価の指標とする充填剤の評価方法においては、所定の基準はクロマトグラムから得られる数値等により予め定めることが出来る。充填剤の分離能力は異性体の分離能力であり、充填剤の分離能力を示すクロマトグラムを評価の指標とする充填剤の評価方法として、充填剤の位置異性体の分離能力を示すクロマトグラムを評価の指標とする充填剤の評価方法と充填剤の立体異性体の分離能力を示すクロマトグラムを評価の指標とする充填剤の評価方法が挙げられる。
　上述のように、ＬＣ／ＭＳに適した充填剤かを評価する本発明の溶出物の状態を評価の指標とする充填剤の評価方法により、充填剤がＬＣ／ＭＳに適している充填剤であるか否かが分かる。更に、溶出物の状態を評価の指標とする充填剤の評価方法と充填剤の位置異性体の分離能力を示すクロマトグラムを評価の指標とする充填剤の評価方法の２つの評価方法を組み合わせて充填剤を評価することにより、ＬＣ／ＭＳにおいて、評価結果の良好な充填剤が充填されたカラムを分析に用いることでカーテンプレートの汚れが少なく、位置異性体の違いを判別することが出来る、より正確な分析結果を得ることが出来る。又、溶出物の状態を評価の指標とする充填剤の評価方法と充填剤の立体異性体の分離能力を示すクロマトグラムを評価の指標とする充填剤の評価方法の２つの評価方法を組み合わせて充填剤を評価することにより、ＬＣ／ＭＳにおいて、評価結果の良好な充填剤が充填されたカラムを分析に用いることでカーテンプレートの汚れが少なく、立体構造が異なることを特徴とする立体異性体の違いを判別することが出来る、より正確な分析結果を得ることが出来る。又、溶出物の状態を評価の指標とする充填剤の評価方法と充填剤の位置異性体の分離能力を示すクロマトグラムを評価の指標とする充填剤の評価方法と充填剤の立体異性体の分離能力を示すクロマトグラムを評価の指標とする充填剤の評価方法の３つの評価方法を組み合わせて充填剤を評価することにより、ＬＣ／ＭＳにおいて、評価結果の良好な充填剤が充填されたカラムを分析に用いることでカーテンプレートの汚れが少なく、位置異性体及び立体異性体を含む異性体の違いを判別することが出来る、より正確な分析結果を得ることが出来る。
　充填剤の分離能力を示すクロマトグラムを評価の指標とする充填剤の評価方法では、充填剤を充填したカラムを、ＨＰＬＣ装置に接続し、試料を移動相によりカラムに送り、クロマトグラムを得て、そのクロマトグラムの各成分の保持時間や保持係数の比、分離度等を評価の指標として充填剤の分離能力を評価することが出来る。保持時間を指標に用いる場合は、各成分の保持時間の差や商を指標にすることが出来る。使用するカラムのカラムサイズやＨＰＬＣ装置は、従来から用いられている公知の構成を用いることが出来る。尚、同一ロットの充填剤を用いて別々にカラムを準備して、カラムからの溶出物によるカーテンプレートの汚れと充填剤の分離能力を別々に評価してもよい。
　又、上記の溶出物の状態を観測するために用いたカラムを、充填剤の分離能力を示すクロマトグラムを得るために、そのまま用いてもよい。逆に、充填剤の分離能力を示すクロマトグラムを得るために、具体的には、異性体分離の評価を得るために使用したカラムを用いて、上述のような方法でカラムからの溶出物の状態を観察してもよいが、充填剤の種類によっては、溶出物の乾燥後の乾固物が減り、観測誤差が生じる可能性があるので、注意は必要である。上記の溶出物の状態を観測するための工程と分離能力を示すクロマトグラムを得るための工程を、同一種類の充填剤や同一ロットの充填剤を用いて別々にカラムを準備して、別々に行うこととしてもよい。
　このように、ＬＣ／ＭＳに適した充填剤かを評価する溶出物の状態を評価の指標とする充填剤の評価方法と位置異性体を分離することが出来る充填剤であるかの評価方法の２つの評価方法、又は溶出物の状態を評価の指標とする充填剤の評価方法と充填剤の立体異性体の分離能力を示すクロマトグラムを評価の指標とする充填剤の評価方法の２つの評価方法、又は溶出物の状態を評価の指標とする充填剤の評価方法と充填剤の位置異性体の分離能力を示すクロマトグラムを評価の指標とする充填剤の評価方法と充填剤の立体異性体の分離能力を示すクロマトグラムを評価の指標とする充填剤の評価方法の３つの評価方法においては、夫々の評価方法の順番、同一装置で行うか別個の装置で行うかは特に限定されない。
　立体異性体の分離能力を示すクロマトグラムとして、立体異性体を試料として用いず、立体構造が異なる２種以上の化合物を分析したクロマトグラムを用いることも出来る。立体構造が異なる２種以上の化合物を分析したときの分離能力から、立体異性体の分離能力を類推することが可能であるからである。充填剤の立体異性体の分離能力を示すクロマトグラムを評価の指標とする充填剤の評価方法として、従来から用いられている、Phenanthro[3,4-c]phenanthrene (PhPh)非平面分子(non-planar)、Tetrabenzonaphthalene (TBN)非平面分子(non-planar)、Benzo[a]pyrene (BaP)平面分子(planar)の３種の立体構造が異なる芳香族化合物の分析を行い、その溶出挙動を用いて、その保持係数の比より、立体構造認識能力を検査するＳＲＭ８６９方法、又、簡単な化合物で、充填剤の不活性度、疎水性相互作用に基づく保持力及び立体構造認識能力を同時に評価する方法である、Selectivity Testを用いることが出来る。
　尚、芳香族化合物とは、ベンゼンを代表とする環状不飽和有機化合物の一群であり、芳香族性を示す単環あるいは複数の環（芳香環）から構成され、環構造に炭素以外の元素を含む複素芳香族化合物も芳香族化合物に含まれる。又、２つ以上の芳香環が縮合した化合物である多環芳香族も芳香族化合物に含まれる。更に、芳香環に結合した水素原子に置き換えられた置換基を有する化合物も芳香族化合物に含まれる。置換基の構造や構成元素に特に制限はなく、酸素、窒素、ハロゲン等の炭素、水素以外の元素を含んでいてもよい。芳香族化合物を構成する元素に特に制限はなく、炭素と水素から構成される芳香族炭化水素も芳香族化合物に含まれるし、芳香族化合物は酸素、窒素、ハロゲン等の炭素、水素以外の元素を含んでいてもよい。又、多環芳香族は、４～７員環の化合物が、２環以上が縮合した化合物であり、ナフタレンやフェナントレン、アントラセン、テトラセン、ペンタセン、ベンゾピレン、クリセン、ピレン、トリフェニレン、コランニュレン 、コロネン、オバレン等が挙げられる。縮合した環の数や種類、縮合位置によってはトリフェニレン、BaPのような平面性構造となる場合とPhPh、TBNのように非平面性構造になる場合がある。一方、o-ターフェニルのように、単環の４～７員環の化合物にアリール基が結合された化合物では、アリール基が自由に回転出来るため、立体性が高まる。又、２環以上の４～７員環の化合物にアリール基が結合された化合物でも、アリール基が自由に回転出来るため、立体性が高まる。これらは立体性の高い芳香族化合物の一部である。立体構造認識能力の検査に用いる、平面性構造の芳香族化合物及び非平面性構造の芳香族化合物、立体性の高い芳香族化合物の構成元素は、炭素と水素のみでも良いし、炭素と水素のみならず、他の元素を含んでいても良い。平面性構造の芳香族化合物、非平面性構造の芳香族化合物、立体性の高い芳香族化合物は互いに立体構造が異なる芳香族化合物と言える。
　Selectivity Testでは、ブチルベンゼンとアミルベンゼンの溶出間隔が開くほど、疎水性が高く、カフェインとフェノールの保持係数の比によって、不活性度を確認することが出来、o-ターフェニルとトリフェニレンの保持係数の比より立体選択性を確認することが出来る。o-ターフェニルとトリフェニレンは入手し易い一般的な化合物であり、安定しているので、Selectivity Testをカラム評価の一つの方法として用いることが好ましい。そして、この方法の中のo-ターフェニルとトリフェニレンの保持係数の比を充填剤の評価の指標として用いることが出来る。カラム毎に、立体性の高い化合物と平面性の高い化合物の保持係数の比を比較することにより、そのカラムの充填剤の立体化合物に対する分離能力を確認、評価することが出来る。
　表１に示すように、後述する実施例３における、o-ターフェニルとトリフェニレンを用いたSelectivity Testにおける保持係数の比は、市販のカラムＡ：２．２２０、市販のカラムＣ：２．７９０となる。又、実施例３の条件において、実施例３に記載のあるSelectivity Testの分析時と試料、移動相と流量、設定温度以外は同じ条件、装置で、移動相（アセトニトリル／水＝８５／１５、ｖ／ｖ）を用いて、分離カラム恒温槽の設定温度２５℃で行ったＳＲＭ８６９試験におけるTBN とBaP 保持係数の比は、カラムＡ：０．５９８、カラムＣ：０．５０５であった（表１）。
選択性試験（ＳＲＭ８６９ｂ）
LC/UV Conditions
Eluent： アセトニトリル／水＝８５／１５、ｖ／ｖ
Column： 市販のカラムＡ、Ｃ
Flow rate： ０．４ｍＬ／ｍｉｎ
Col.Temp.： ２５℃
Detection：ＵＶ２５４ｎｍ
Injection Vol.： ＳＲＭ８６９ｂ（ＮＩＳＴより頒布）１μＬ
　このように、ＳＲＭ８６９とSelectivity Testのo-ターフェニルとトリフェニレンの保持係数の比とも同じ傾向を示すので、立体構造が異なる芳香族化合物であれば、どちらか一つの方法のみを用いて立体異性体に関する充填剤の評価の指標を得ることが出来る。上記の条件で行ったＳＲＭ８６９試験におけるクロマトグラムを市販のカラムＡを図６（ａ）に、市販のカラムＣを図６（ｂ）に示す。用いられる試料成分、分析条件により具体的な保持係数の比は異なってくるが、後述する実施例３での条件下では、o-ターフェニルとトリフェニレンの保持係数の比が１．８５以上あれば、ＳＲＭ８６９の言うところのポリメリック充填剤に分類することが出来る。尚、この立体構造が異なる芳香族化合物による評価方法では、立体構造が異なるカロテン異性体や環境中多環芳香族等の分析への応用が実証されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　充填剤の位置異性体の分離能力を示すクロマトグラムを評価の指標とする充填剤の評価方法として、２種以上の位置異性体を分析して得たクロマトグラムを評価の指標として用いる。具体的には、位置異性体を分離可能な充填剤であるかを評価するために、２種以上の位置異性体の保持係数の比より、位置認識を検査する方法が挙げられる。用いる位置異性体としては、特に限定されないが、分子量が同じで置換基の結合位置が異なる位置異性体として良く知られているノルマルヘキサン、2-メチルペンタン、3-メチルペンタン、2,2-ジメチルブタン、2,3-ジメチルブタン、iso-propylalcohol、n-propylalcohol 、1,4- Dimethylbenzene、1,2- Dimethylbenzene、1,3- Dimethylbenzene、o‐ジビニルベンゼン、ｍ‐ジビニルベンゼン、ｐ‐ジビニルベンゼン等が、分解し難く一般的に入手し易いので好ましい。
　一例として、アルキルベンゼンを分析して得たクロマトグラムを評価の指標として用いることが出来る。アルキルベンゼンの一例として、置換基であるビニル基の結合位置が異なるジビニルベンゼンの位置異性体を用いることが出来、ｍ‐ジビニルベンゼンとｐ‐ジビニルベンゼンの保持係数の比より、置換基の結合位置の違いをどの程度認識できるかを示す充填剤の結合位置認識能を確認することが出来る。後述する実施例での条件下では、ｍ‐ジビニルベンゼンとｐ‐ジビニルベンゼンの保持係数の比が１．０６０以上であれば、ピークトップが分離でき、ＬＣ／ＭＳ検出により、位置異性体の同定が可能となっている。
　このように、充填剤の選択性検査として、従来から行なわれている立体構造の認識性能の高さによる分離能力確認、例えば立体的に異なる芳香族化合物による分離能力の評価に、位置異性体、例えばアルキルベンゼンの保持係数の比による評価を加えることにより、異性体を分離可能な充填剤であるかを評価することが出来る。これには限定されないが、後述する実施例においては、芳香族化合物による立体選択性の試験においては、o-ターフェニルとトリフェニレンの保持係数の比が１．８５以上であること、位置異性体分離の試験においては、ｍ‐ジビニルベンゼンとｐ‐ジビニルベンゼンの保持係数の比が、ピークトップが分離出来る１．０６０以上であることを評価の基準として、位置異性体及び立体異性体を含む異性体の分離能力を有する充填剤であると評価している。
　尚、上記のｍ‐ジビニルベンゼンとｐ‐ジビニルベンゼンの保持係数の比の数値は、一例に過ぎず、異性体分離に適した充填剤が充填されたカラムであるかどうかを判断する指標は、例えばピークトップが分離出来ることを条件とする等、状況に応じて、必要となる分析の正確性や装置のメンテナンス頻度などを考慮し、適当な値に設定することが望ましい。
　このように、従来から行われている立体構造が異なる化合物の分離能力の評価に加えて、位置異性体を分析した分離能力の評価を追加することにより、異性体分離に適した充填剤であるか否かを確認することが出来る。そしてこの２種の評価を行うことで、立体異性体及び位置異性体を含む異性体を分離することが出来るカラムを設計することが出来る。
　このように、カーテンプレートの汚れを検査し、更に、立体構造が異なる化合物及び位置異性体を含む異性体の分離性能を検査すれば、広範囲のアプリケーションに対応した、質量分析装置のカーテンプレートの汚れが少なく、且つ立体異性体及び位置異性体を含む異性体の分離が可能な充填剤及びカラムを選定することが出来る。
　又、上述の乾燥後の溶出物の状態を充填剤の評価の指標とする評価方法を用いて、評価され、評価された結果から得られた所定の基準を満たしていることを確認された範囲の充填剤を選択、使用することで、質量分析装置のカーテンプレートを汚しにくい充填剤及びその充填剤を充填したカラムを作製することが出来る。又、上述の乾燥後の溶出物の状態を指標とする評価方法及び上述の立体異性体及び位置異性体を含む異性体の分離性能の評価方法を用いて、評価され、所定の基準を満たしていることを確認された範囲の充填剤を選択、使用して充填剤を設計し、質量分析装置のカーテンプレートを汚しにくく、且つ立体異性体及び位置異性体を含む異性体分離能力に優れている充填剤及びカラムを作製することが出来る。
　このように上述のような充填剤の評価方法で評価され、所定の基準を満たしている充填剤の設計、製造において、充填剤の形状は、特に限定されないが、球状、破砕状、モノリス体を使用することができる。充填剤のサイズは、特に限定されないが、粒子状の充填剤では直径１～１０００μｍが分離が良く、扱いやすいため好ましい。充填剤の母体としては、特に限定されず、ジビニルベンゼン、メタクリレート、スチレン等の有機モノマーを重合させたポリマー母体、水ガラスやテトラエトキシシランやチタンイソプロピルシラン等を加水分解重合したシリカゲルや酸化チタン等の無機母体、シリカゲル骨格に、メチル基、エチル基等の有機官能基を組み込んだ有機ハイブリッドシリカゲル、テトラメトキシシランやフェニルトリメトキシシランなどを加水分解重合した、三次元網目構造の骨格を有する一体型多孔質体のモノリス体等を使用することが出来る。
　又、これらの母体にアルキル基を導入して充填剤を設計、作製することが出来る。これらに限定されないが、オクタデシルトリクロロシラン、オクタデシルメチルジクロロシラン、オクタデシルジメチルクロロシラン、ヘキサコシルトリクロロシラン、ヘキサコシルメチルジクロロシラン、ヘキサコシルジメチルクロロシラン、トリアコンチルトリクロロシラン、トリアコンチルメチルジクロロシラン、トリアコンチルジメチルクロロシラン、オクタデシルトリメトキシシラン、オクタデシルメチルジメトキシシラン、オクタデシルジメチルメトキシシラン、ヘキサコシルトリメトキシシラン、ヘキサコシルメチルジメトキシシラン、ヘキサコシルジメチルメトキシシラン、トリアコンチルトリメトキシシラン、トリアコンチルメチルジメトキシシラン、トリアコンチルジメチルメトキシシラン等の種々の反応性シラン剤を単独で又は２種以上を混合して用いることが出来る。又、母体へのアルキル基の導入は、トルエンなどの有機溶媒中、真空中、又は不活性ガスや二酸化炭素中等の気相中等で行うことが出来る。
　又、充填剤に二次処理を施すことが好ましい。二次処理として、攪拌洗浄、加熱洗浄、超音波洗浄、ＳＦＣ洗浄、高圧洗浄等の洗浄うち１種類又は複数種類を組み合わせて行う二次処理、最初の結合処理を繰り返す二次処理、又は最初の結合処理で結合した結合基と異なる結合基を追加導入する二次処理が挙げられる。特に低分子結合基を追加導入する二次処理は、塩基性化合物や金属配位性化合物等に対する不活性化を高められる効果もあるので、エンドキャッピング、エンドキャップ、末端付加などの名称で知られている。これらの二次処理は、水溶液中、緩衝液中、有機溶媒中、これらの混合溶液中、真空中、又は不活性ガスや二酸化炭素中等の気相中等で行うことが出来る。エンドキャッピングとして知られる二次処理は、低分子化合物を追加導入するが、メチルトリクロロシラン、ジメチルジクロロシラン、トリメチルクロロシラン、ヘキサメチルシクロトリシロキサン、オクタメチルシクロテトラシロキサンなどの低分子の反応性シラン剤を単独で又は２種以上を混合して用いることが出来る。
　オクタデシル基充填剤においては、結合層が嵩高の方が立体認識能は高いことが知られているが、オクタデシル基以外のアルキル基に関しては、系統的に評価された報告はなく、また、位置異性体に対応できるかは不明であったが、上述のような、位置異性体の分離能力を評価する方法で評価すると、炭素鎖がＣ２６～Ｃ３０の充填剤においては、位置異性体の分離能力が高い充填剤が見られた。又、炭素鎖がＣ２６～Ｃ３０においては、充填剤の炭素量が１６～２５ｗｔ％であれば、位置異性体の分離、同定が可能となることが分かった。従って、化学結合基Ｃ２６～Ｃ３０、且つ炭素量１６～２５ｗｔ％の充填剤が、位置異性体の分離に適した充填剤であることが分かる。
　一方、乾燥後の溶出物の状態を充填剤の評価の指標とする充填剤の評価において、化学結合基Ｃ２６～Ｃ３０、且つ炭素量１６～２５ｗｔ％の充填剤の一部では、評価基準以上の溶出物の状態、即ちプレートの汚れが観測され、ＬＣ／ＭＳに使えないことが確認された。しかし、その汚れが観測された充填剤であっても、エンドキャッピング等の二次処理を施すことによりプレートの汚れが評価基準以下になり、ＬＣ／ＭＳに使えることが確認されたので、ＬＣ／ＭＳに使用する充填剤には、二次処理を施すことが望ましい。尚、二次処理がエンドキャッピングの場合には、不活性度も高めることが出来るので、エンドキャッピングが好ましい。
　又、一般的には、充填剤の炭素量が増えると、充填剤の細孔内が結合基で覆われてしまい、細孔径が小さくなり、充填剤の表面積又は細孔容積が減ってしまう。充填剤に結合基が導入されても、表面積又は細孔容積が小さくなると、理論段数が低くなったり、試料負荷量が減ったりする。そのため、充填剤は、表面積５０ｍ２／ｇ以上又は細孔容積０．１ｍＬ／ｇ以上を有することが望ましく、８ｎｍ～５０ｎｍの細孔径の充填剤となる。一方、本発明の目的の位置異性体の分離においては、充填剤の細孔径の範囲は殆ど影響しない。しかし、マトリクス成分などを含む多成分系の分析においては、細孔径内部の拡散を減らすために、２５ｎｍ以下の方が理論段数が出やすいので、８ｎｍ～２５ｎｍの細孔径の充填剤が好ましい。
　又、従来から良く使用されているＣ１８充填剤では、Ｃ１８基が２ｎｍ程度で、８ｎｍ～１２ｎｍ前後の細孔径のシリカゲル母体が用いられているが、異性体分離に有効なＣ２６～Ｃ３０基では、３ｎｍ以上の大きさになるので、細孔内に結合させるためには、より大きい１５ｎｍ以上の細孔径が必要となる。一方、３０ｎｍ以上の細孔径になると充填剤の表面積が小さくなり、理論段数が落ちてしまい、異性体分離には不向きとなる。このことから、結合基が導入できる十分な細孔径を持ち、かつ　理論段数を得るためには、充填剤の細孔径は１５ｎｍ～２５ｎｍが好ましく、１９ｎｍ～２１ｎｍがより好ましい。尚、実施例では、より最適な２０ｎｍの平均細孔径を持つ母体シリカゲルを用いて、各種充填剤を検査し実証を行っている。
　このように、本発明の、ＬＣ／ＭＳに適した充填剤かを評価する溶出物の状態を評価の指標とする充填剤の評価方法と位置異性体を分離することが出来る充填剤であるかの評価方法と立体異性体を分離することが出来る充填剤であるかの評価方法の３つの評価方法を組み合わせた評価方法により、所定の合格基準を満たした条件で設計、製造された、表２に示すような、化学結合基Ｃ２６～Ｃ３０、炭素量１６～２５ｗｔ％且つ二次処理を施した充填剤は、位置異性体を含む異性体を分離することが出来、ＬＣ／ＭＳに使用できる充填剤であることが分かる。尚、本発明での評価方法を行い、所定の基準を満たした充填剤は、トコフェノール異性体の分離も良好であった（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　又、ＬＣ／ＭＳに好適に使用することが出来ると共に、位置異性体を含む異性体の同定も可能である充填剤の設計方法として、本発明の、溶出物の状態を評価の指標とする充填剤の評価方法と位置異性体を分離することが出来る充填剤であるかの評価方法と立体異性体を分離することが出来る充填剤であるかの評価方法の３つの評価方法を組み合わせた評価方法によって、所定の指標を示し、所定の評価を得た充填剤を選択して行うことが出来る。
　以上のように、本発明での評価方法を用いることにより、質量分析計では区別することが出来ない位置異性体及び立体異性体を含む異性体を分離できる分離特性を持つと共に、ＬＣ／ＭＳにおいて、質量分析装置のカーテンプレートを汚すことなく使用することが出来、且つ正確な分析結果を得ることが出来る充填剤を設計することが出来る。そして、その設計に従って充填剤を作製することにより、位置異性体及び立体異性体を含む異性体を分離しながら、ＬＣ／ＭＳに対応できる充填剤を作製することが出来る。
　又、本発明により、細胞の傷害を予防したり遅らせたりする性質がある抗酸化物質等の異性体分析に適用することが出来、野菜や果物に含まれる抗酸化作用成分の定性定量、医薬品への検討、サプリメントへの応用等広く使用することが出来る充填剤を把握、設計、製造することが出来る。
　市販のカラムＤを、ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳ（ＵＨＰＬＣ装置：Ｎｅｘｅｒａ（登録商標）Ｘ２（島津製作所社）、ＭＳ／ＭＳ検出器：４０００　Ｑ　ＴＲＡＰ（登録商標）（エービー・サイエックス社））に接続した。移動相は、グラジエントで０．２ｍＬ／ｍｉｎの流量で送液した。グラジエント条件は、移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液、移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウム／アセトニトリル＝５／９５、ｖ／ｖを用いて、Ａ／Ｂ＝９９／１－（６０ｍｉｎ）－１／９９－（３０ｍｉｎ）－９９／１－(５ｍｉｎ) －９９／１、ｖ／ｖを３回繰り返し行った。カラムオーブン温度条件は４０℃とした。ＭＳ／ＭＳ検出器のイオン化はＥＳＩポジティブモードで行い、検出モードはＱ１スキャン（スキャンレンジｍ／ｚ２００～１０００）で実施した。
その他の設定は以下の条件で実施した。
ターボガス温度 ：５００℃
カーテンガス（窒素） ：３０ｐｓｉ
イオンスプレー電圧 ：４５００Ｖ
ドリフト電圧：２０Ｖ
ネブライザーガス（窒素） ：６０ｐｓｉ
ターボガス（窒素） ：６０ｐｓｉ
カラムサイズ：内径２．１ｍｍ、長さ１５ｃｍ
　通液後、カーテンプレートを質量分析装置から外し、カーテンプレートの汚れ部分である乾固した溶出物を書画カメラ（エルモ社、Ｐ３０Ｓ）で撮影した。このカーテンプレート写真を、画像編集ソフトペイントで汚れが見られる部分が含まれるようにトリミングした。このとき画像サイズは６２，１００ピクセルとした（図３）。次にトリミングした画像を、画像解析ソフトImageJを用いて画像解析を行った。画像をグレースケールに変換し、次にイオン導入孔部分を解析から除外するために黒く塗りつぶしてから解析に用いた。汚れが見られない背景部分がカウントされないように閾値を１２５に設定し、このとき１２５より輝度の大きい領域は、１２１９ピクセルとなった。このとき該当領域の輝度平均値は１４６．９７７であり、汚れを表す数値は、１２１９×（１４６．９７７－１２５）により算出し、２６７９０を得た。
　カーテンプレートの汚れについては、目視からも評価することが可能であるが、画像解析により汚れを数値化した値を評価の指標として用いて比較した。その結果、充填剤の評価の指標を具体的な数値として把握することが出来、より客観的に充填剤が充填されたカラムの評価をすることが出来た。市販のカラムＤを含む９本の市販のカラムＡ～Ｉと充填剤が充填されていない空カラムについても同様に評価を行った結果を表３に示す。
　画像解析値は、空カラムでの解析値が３９３であり、１０００未満であれば溶出物は殆ど認識することが出来ず、誤差を考慮するとカラムからの溶出物は殆どないと判断することが出来る。又、画像解析値が１００００未満のカーテンプレートは、溶媒を用いた洗浄又は研磨により、カーテンプレートから乾固物を除去することが出来たが、１００００以上では、完全に除去できない場合があった。従って、画像解析値が１００００未満であれば、溶媒を用いた洗浄や研磨による除去等の通常のカーテンプレートのメンテナンスで、乾固物を除去できる可能性が高い。
　そこで、評価の基準として、画像解析値が１０００未満のものを、特にＬＣ／ＭＳに適しているものとし、表中◎で示した。又、画像解析値が１０００～１００００未満のものを、ＬＣ／ＭＳに適しているものとし、表中〇で示した。又、画像解析値が１００００以上のものをＬＣ／ＭＳで異性体分析での使用を推奨することが出来ないものとし、表中×で示した。このことから、ＬＣ／ＭＳでの異性体分析には、画像解析値が１００００未満のものが推奨されることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　評価に用いた市販のカラム９本のカラムを画像解析により数値化し、当該数値を充填剤の評価の指標とすることで、ＬＣ／ＭＳに適したカラムをランキングすることが容易に出来、ＬＣ／ＭＳに適したカラムを把握、評価することが出来た。表３に示すように、カラムIで最も汚れが小さく、カラムＡで最も大きな汚れが確認された。更に、ＬＣ／ＭＳに適したカラムであるか否かの判断基準を、画像解析値が１００００未満と設定した場合、９本中４本が適しているカラムであり、残り５本は適していないカラムと評価することが出来た。
　市販のカラムＡを、ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳ（ＵＨＰＬＣ装置：Ｎｅｘｅｒａ（登録商標）Ｘ２（島津製作所社）、ＭＳ／ＭＳ検出器：４０００　Ｑ　ＴＲＡＰ（登録商標）（エービー・サイエックス社））に接続した。移動相は、グラジエントで０．３ｍＬ／ｍｉｎの流量で送液した。グラジエント条件は、移動相Ａ：０．１ｖｏｌ％ギ酸水溶液、移動相Ｂ：０．１ｖｏｌ％ギ酸含有アセトニトリルとの混液を用いて、Ａ／Ｂ＝９５／５－（１ｍｉｎ）－９５／５－（９ｍｉｎ）－５／９５－（３ｍｉｎ）－５／９５、ｖ／ｖを行った。カラムオーブン温度条件は４０℃とした。ＭＳ／ＭＳ検出器のイオン化はＥＳＩポジティブモードで行い、その他の条件は実施例１と同じとした。測定後、カーテンプレートを装置から外し、実施例１と同様に画像解析を行った。市販のカラムＡと同様に、市販のカラムＥについても、測定とカーテンプレートの画像解析を行った。ここで実施した、ＬＣ／ＭＳ空分析による、トータルイオンクロマトグラフィー（ＴＩＣＣ）でのベースライン測定結果とカーテンプレートの画像解析値についてカラムＡとカラムＥで得られた結果を比較した。
　ベースライン測定では、カラムＡを図７（ａ）、カラムＥを図７（ｂ）に示すように、トータルイオンクロマトグラムにおけるイオン強度は最大６．５０ｅ８ｃｐｓ程度となり、大きな違いは見られなかった。一方、カラムＡを図８（ａ）、カラムＥを図８（ｂ）に示すように、カーテンプレートの汚れについては、目視からもカラムＥよりカラムＡのほうが背景より白い箇所が多いことを確認することが出来た。又、カーテンプレート画像からカーテンプレートの汚れをピクセル数×（輝度平均値－閾値）から算出し、数値化した結果、カラムＡでは２８５３、カラムＥでは３７１となり、画像解析からも汚れ程度に大きな違いがあることが確認できた。この結果から、従来のＬＣ／ＭＳに適する充填剤の評価として用いられている、ＬＣ／ＭＳ空分析による、ＴＩＣＣ結果からは、カーテンプレートの汚れを評価することは出来ないことが示唆された。そして、実施例１の結果と総合して判断すると、カラムからの溶出物を、直接乾燥させ、乾燥後の溶出物の状態を充填剤の評価の指標とする充填剤の評価方法が、ＬＣ／ＭＳに適する充填剤の評価方法として極めて有効であることが分かる。
　実施例１で画像解析を行った市販のカラムＡ～Ｉを用いて、立体認識能評価試験としてのSelectivity Testを行った結果からo-ターフェニルとトリフェニレンの保持係数の比を算出した。又、同カラムＡ～Ｉを用いて、位置認識能評価試験としてアルキルベンゼン試験を行ないｍ‐ジビニルベンゼンとｐ‐ジビニルベンゼンの保持係数の比を算出した。この条件下では、o-ターフェニルとトリフェニレンの保持係数の比が１．８５以上あれば、ＳＲＭ８６９の言うところのポリメリック充填剤に分類することが出来、立体選択性が高いといえるので、o-ターフェニルとトリフェニレンの保持係数の比が１．８５以上であること、そして、位置異性体への分離能力を確認するためのアルキルベンゼンの試験としては、ｍ‐ジビニルベンゼンとｐ‐ジビニルベンゼンの保持係数の比が、ピークトップが分離出来る１．０６０以上であることを評価の基準とし、充填剤を評価した。
（Selectivity Test）
　クロマトグラムの採取は、高速液体クロマトグラフＧＬ７７００（ジーエルサイエンス社）を使用し、送液ポンプＰＵ７７１０（ジーエルサイエンス社）を用いて移動相（メタノール／水＝８０／２０、ｖ／ｖ）を０．２ｍＬ／ｍｉｎの流量で送液した。分離カラム恒温槽ＣＯ７７３０（ジーエルサイエンス社）の設定温度は４０℃とした。検出には、ＵＶ検出器　ＵＶ７７５０（ジーエルサイエンス社）を使用した。検出波長は２５４ｎｍとした。試料には、o-ターフェニル（０．４ｍｇ／ｍＬ）、トリフェニレン（０．１４ｍｇ／ｍＬ）を含み、移動相に希釈した溶液を使用した。試料注入量は１μＬとし、オートサンプラーＡＳ７７２０Ｃ（ジーエルサイエンス社）を用いて注入した。カラムＡのクロマトグラムを図９（ａ）に及びカラムＣのクロマトグラムを図９（ｂ）に示す。
（アルキルベンゼン試験）
　クロマトグラムの採取は、高速液体クロマトグラフＧＬ７７００（ジーエルサイエンス社）を使用し、送液ポンプＰＵ７７１０（ジーエルサイエンス社）を用いて移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０、ｖ／ｖ）を０．２ｍＬ／ｍｉｎの流量で送液した。分離カラム恒温槽ＣＯ７７３０（ジーエルサイエンス社）の設定温度は４０℃とした。検出には、ＵＶ検出器　ＵＶ７７５０（ジーエルサイエンス社）を使用した。検出波長は２５４ｎｍとした。試料には、ジビニルベンゼン（不純物としてエチルビニルベンゼンを４５％含む、０．０１μＬ／ｍＬ）のアセトニトリル溶液を使用した。試料注入量は１μＬとし、オートサンプラーＡＳ７７２０Ｃ（ジーエルサイエンス社）を用いて注入した。カラムＡのクロマトグラムを図１０（ａ）に及びカラムＣのクロマトグラムを図１０（ｂ）に示す。
　各カラムＡ～Ｉの実施例１で画像解析により数値化した結果と、実施例３のクロマト試験による充填剤の分析能の評価結果を総合して評価したものを表４に示す。夫々評価の基準の数値を超えたものを合格として○で示し、越えなかったものを不合格として×で示した。Selectivity Test及びアルキルベンゼン試験の結果から立体異性体及び位置異性体を含む異性体の分離能力の評価を行い、両評価が合格の場合には合格として○で示し、両評価が不合格の場合には不合格として×で示し、一方が合格で他方が不合格の場合には立体異性体又は位置異性体の何れかには適しているとして可として△で示した。実施例１の結果と実施例３の結果を総合し、いずれか一方が不合格であるものは不合格とし、一方が合格他方が可の場合には可として△で示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　この評価方法を用いることで、異性体の分離能力が高く、且つカーテンプレートの汚染が少ないカラムを選定することができるようになった。今回の評価方法で試験した市販のカラムにおいては、クロマトグラム評価で分離基準を達成しているカラムでは、カーテンプレート汚れ評価において、ＬＣ／ＭＳで使用を推奨される画像解析値１００００未満の値を示すカラムは無かった。一方、反対に、カーテンプレート汚れ評価において画像解析値１００００未満を達成しているカラムでは、クロマトグラム評価で分離基準を達成しているカラムは無かった。又、今回の評価に用いた市販のカラムにおいては、総合評価で合格し、ＬＣ／ＭＳで使用を推奨されるカラムは無かったが、カラムＣではクロマトグラム評価とカーテンプレート汚れ評価で共に基準を満たさなかったものの、両方の評価において基準値に近い値を示したことから、今回評価に用いたカラムの中では、最もＬＣ／ＭＳに適したカラムに近い特性を有していることが確認された。又、立体認識能が高いカラムや位置異性体分離能力に優れた結合基の結合量の多い充填剤や結合基の炭素数が多い充填剤、即ち炭素量比率の高い充填剤の方がカーテンプレートの汚れが顕著になる傾向が見られた。
　又、Selectivity Test におけるo-ターフェニルとトリフェニレンの保持係数の比を指標にした立体構造の認識性能の高さと、アルキルベンゼン試験によるジビニルベンゼン異性体の保持係数の比を指標にした位置異性体の分離能力の高さを各カラムで比較すると、全体としては、立体構造の認識性能の高いカラムでは、位置異性体の分離能も高くなる傾向は確認されたが、その傾向はカラムによって違いが確認された。例えばカラムＡとカラムＣを比較すると、o-ターフェニルとトリフェニレンの保持係数の比による立体構造の認識性能の高さを比べると、カラムＣではカラムＡより大きい値を示しており、立体構造の認識性能は高いことが判明したが、ジビニルベンゼン異性体の保持係数の比を指標にした位置異性体の分離能力では、カラムＡのほうがカラムＣより高い分離能力を示した。この結果から、異性体の分離指標としてSelectivity Testのみでは十分ではなく、ジビニルベンゼン異性体のような位置異性体の分離能力も指標とすることで、より正確な充填剤選択のための指標とすることが出来る。
　還流冷却器、攪拌装置及びチッソ導入管を具えた３００ｍＬの三つ口フラスコに、減圧下８０℃で１６時間乾燥した平均細孔径２０ｎｍ、比表面積２００ｍ２／ｇ、平均粒子径５ミクロンのシリカゲル１０ｇを入れ、これに９０ｍＬの乾燥トルエンを加え、超音波槽で約５分間脱気した。これにトリアコンチルトリクロロシラン（ＴＡＴＣＳ）を加え、加熱還流下で１０時間反応させた。反応中に生成する塩化水素はチッソを導入して水酸化ナトリウム溶液の入ったガス吸収管に導入して吸収させた。反応後、ゲルをグラスフィルターでろ過し、続いて未反応のトリアコンチルトリクロロシランを除くため、８０℃のトルエン３００ｍＬを６０ｍＬずつ５回に分けてゲルをリンス洗浄した。その後、アセトン３００ｍＬでトルエンを除き、続いて水３００ｍＬで塩化水素を除いた。更に、アセトン３００mlで洗浄した後、減圧下６０℃で１６時間乾燥した。二次処理となる、いわゆるエンドキャッピングは、このようにして得られたトリアコンチルシリル化されたシリカゲルを前述の装置に移し、乾燥トルエン９０ｍＬを加え、超音波槽で約５分間脱気した後、１０ｇのトリメチルクロロシランを加え、４０℃で１０時間反応させた。
　反応後、ゲルをガラスフィルターでろ過し、トルエン、アセトン、水、アセトンの順に洗浄し減圧下６０℃で１６時間乾燥した。上記合成過程において、合成に用いるトリアコンチルトリクロロシラン量を調整することで、４種類の炭素量の異なるトリアコンチル基導入シリカゲルを得た。ＴＡＴＣＳを２０ｇ用いたときのエンドキャッピング後の炭素量は２６ｗｔ％、ＴＡＴＣＳを１５ｇ用いたときのエンドキャッピング後の炭素量は２４ｗｔ％、ＴＡＴＣＳを９ｇ用いたときのエンドキャプ後の炭素量は１７ｗｔ％、ＴＡＴＣＳを７ｇ用いたときのエンドキャッピング後の炭素量は１５ｗｔ％のトリアコンチル基導入シリカゲルをそれぞれ得た。又、ＴＡＴＣＳを１０ｇ用いたとき、炭素量１７ｗｔ％のエンドキャッピングを実施しないトリアコンチル基導入シリカゲルを得た。更に、ＴＡＴＣＳの代わりに、ヘキサコシルトリクロロシラン１１ｇを用いて、ヘキサコシル基導入シリカゲルを合成し、上記と同様にエンドキャッピングを行った炭素量１７ｗｔ％のヘキサコシル基導入シリカゲルを得た。
　炭素量測定は、減圧下６０℃で１６時間乾燥した一定重量のトリアコンチル基導入シリカゲル又はヘキサコシル基導入シリカゲルを、空気雰囲気下で２０℃から８００℃まで加熱することで実施した。このときの重量減少値を測定に用いた充填剤中の炭素重量とし、トリアコンチル基導入シリカゲル又はヘキサコシル基導入シリカゲル中に含まれる炭素重量の比率を加熱前後の重量変化から算出し炭素量（ｗｔ％）を算出した。
　ここで得られたトリアコンチル基導入シリカゲル又はヘキサコシル基導入シリカゲルをステンレス製のカラムハードウェアに充填し、内径２．１ｍｍ、長さ１５ｃｍのカラムを作製し、カラムＪ～Ｏとした。各試験に用いたカラムの仕様を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　カラムＪ～Ｏを用いて、実施例１及び実施例３と同様の条件でカラムからの溶出物確認試験とクロマト試験を行った。クロマト試験は、実施例３で行った分析のほか、トコフェロールの分析を以下の条件で実施し、o-ターフェニルとトリフェニレンの保持係数の比、及び、ｍ‐ジビニルベンゼンとｐ‐ジビニルベンゼンの保持係数の比から評価された結果とγ-トコフェロールとβ-トコフェロールの保持係数の比から評価された結果を比較した。尚、γ-トコフェロールとβ-トコフェロールの保持係数の比が、ピークトップを確認することが出来る１．０７０以上であることを評価の基準とし、基準値として充填剤を評価した。
（トコフェロールの分離試験）
　クロマトグラムの採取は、高速用液体クロマトグラフＧＬ７７００（ジーエルサイエンス社）を使用し、送液ポンプＰＵ７７１０（ジーエルサイエンス社）を用いて移動相（メタノール）を０．２ｍＬ／ｍｉｎの流量で送液した。分離カラム恒温槽ＣＯ７７３０（ジーエルサイエンス社）の設定温度は２５℃とした。検出には、ＵＶ検出器　ＵＶ７７５０（ジーエルサイエンス社）を使用した。検出波長は２１０ｎｍとした。試料には、δ-トコフェロール（０．３０ｍｇ／ｍＬ）、γ-トコフェロール（０．３０ｍｇ／ｍＬ）、β-トコフェロール（０．３０ｍｇ／ｍＬ）、α-トコフェロール（０．３０ｍｇ／ｍＬ）、を移動相に希釈した溶液を使用した。試料注入量は１μＬとし、オートサンプラーＡＳ７７２０Ｃ（ジーエルサイエンス社）を用いて注入した。
　夫々得られたクロマトグラムのうち、カラムＬのクロマトグラムを図１１（ａ）、図１２（ａ）、図１３（ａ）に、カラムＪのクロマトグラムを図１１（ｂ）、図１２（ｂ）、図１３（ｂ）に示す。又、試料にトコフェロールを用いた場合のカーテンプレートの画像を、カラムＬを図１４（ａ）、カラムＪを図１４（ｂ）に示す。そして、試験の結果及び評価結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　充填剤の仕様の違いにより、カラム評価結果がどのように異なるのかを検討した。トリアコンチル基導入シリカゲルでは、トリアコンチル基導入量を示す炭素量に対する、クロマト試験と画像解析値によるカーテンプレートの汚れについて考察できた。炭素量が２４％のカラムＫと１７％のカラムＬでは、２種類のクロマト試験における保持係数の比と画像解析値ともに基準をクリアしており、これまでに本発明により評価したカラムのなかで最もＬＣ／ＭＳに適したカラムであると評価できた。一方、炭素量が２６％のカラムＪでは、画像解析値が１００００を超えているため、ＬＣ／ＭＳに適したカラムであるとの評価はされなかった。炭素量が１５％のカラムＭでは、ジビニルベンゼン試験での保持係数の比が１．０６０を超えていないため、ＬＣ／ＭＳに適したカラムであるとの評価はされなかった。
　カラムＬと同様の仕様で、エンドキャッピングのみ未実施のカラムＮの結果を比較すると、カラムＮでは、クロマト試験による保持係数の比は基準をクリアしているが、画像解析値では、１１８３６となり基準を満たさなかった。カラムＬと同様の仕様で、トリアコンチル基の代わりにヘキサコシル基を導入したカラムＯの結果を比較すると、どちらのカラムもクロマト試験と画像解析値の基準をクリアしていることから、導入する炭素鎖は、Ｃ２６～Ｃ３０においては、ＬＣ／ＭＳに適した充填剤の作製が可能であることが示唆された。
　試作した充填剤を本発明の評価方法を用いることで、分離能力が高く、かつカーテンプレートの汚染が少ない充填剤の仕様を特定し、目的にあった充填剤を実際に合成することが出来た。更に、より多くの異なる合成条件下で合成した充填剤を用いて、本発明による評価を実施することで、さらに詳細にＬＣ／ＭＳに適した充填剤の設計検討を実施することが出来る。
　尚、ｍ‐ジビニルベンゼンとｐ‐ジビニルベンゼンの保持係数の比から評価された結果とγ-トコフェロールとβ-トコフェロールの保持係数の比から評価された結果を比較すると、ほぼ同様の傾向を示し、本発明の評価方法は、実際の生体成分であるトコフェノールの実試料の分析にも対応することが出来ることが実証された。又、γ-トコフェロールとβ-トコフェロールの保持係数の比も位置異性体の分離能力の評価の指標として使用することが出来ることが分かった。
　実施例１でImageJを用いて実施したカラムＡの画像解析を、ImageJ の代わりにＧＩＭＰを用いて画像解析を行った。同じ元画像（図１５（ａ））を用いて画像解析を行い、輝度１３８から２５５に該当する領域を黒で表示し、その他の領域を白で表示した図をImageJについて図１５（ｂ）に、ＧＩＭＰについて図１５（ｃ）に示す。又、画像解析から得られた充填剤の評価の指標としての数値を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７に示すように、ImageJとＧＩＭＰでは、同様の画像及び解析結果を得ることが出来た。このことから、画像解析ソフトとしては、ImageJの他にＧＩＭＰを用いることが出来、更に、ImageJ及びＧＩＭＰの２つのソフトウェアと同等の機能を持つソフトウェアであれば、特に限定されず使用することが出来ることがわかった。
　本発明により、細胞の傷害を予防したり遅らせたりする性質がある抗酸化物質等の異性体分析に適用することが出来、野菜や果物に含まれる抗酸化作用成分の定性定量、医薬品への検討、サプリメントへの応用等に広く使用することが出来る充填剤を把握、設計、製造することが出来るので、本発明は医薬品産業や健康食品産業等において有用に利用され得る。
　　１　　ＬＣ‐ＭＳ
　　１０　汚れ
　　１１　イオン
　　２　　液体クロマトグラフ
　　２１　カラムからの溶出物
　　３　　質量分析装置
　　３１　ネブライザーガス
　　４　　送液ポンプ
　　５　　充填剤が充填されたカラム
　　６　　イオン化部
　　７　　質量分析部
　　８　　カーテンプレート
　　８５　イオン導入孔
　　９１　電圧印加装置

Claims (35)

  1. 　充填剤が充填されたカラムに液体を通液し、前記カラムからの溶出物を、直接乾燥させ、乾燥後の溶出物の状態を充填剤の評価の指標とする充填剤の評価方法。
  2. 　前記カラムからの溶出物を、直接プレートに接触させ、前記プレート上で乾燥させることを特徴とする請求項１に記載の充填剤の評価方法。
  3. 　前記プレートは金属板であることを特徴とする請求項２に記載の充填剤の評価方法。
  4. 　前記金属板は、カラムからの溶出物が当たる、質量分析装置内の金属板であることを特徴とする請求項３に記載の充填剤の評価方法。
  5. 　前記溶出物の乾燥は、不活性ガス雰囲気下で又は／及び不活性ガスで前記溶出物を噴霧して行うことを特徴とする請求項１から４のうちいずれか１項に記載の充填剤の評価方法。
  6. 　前記溶出物の乾燥は、減圧下又は／及び不活性ガスパージ下で行うことを特徴とする請求項１から５のうちいずれか１項に記載の充填剤の評価方法。
  7. 　前記溶出物の乾燥は、前記溶出物に、電圧を印加し、前記溶出液を噴霧させて行うことを特徴とする請求項１から６のうちいずれか１項に記載の充填剤の評価方法。
  8. 　前記溶出物の乾燥は、前記溶出物を加熱して行うことを特徴とする請求項１から７のうちいずれか１項に記載の充填剤の評価方法。
  9. 　前記乾燥後の溶出物の状態を撮影し、撮影された画像を観察又は観測して評価することを特徴とする請求項１から８のうちいずれか１項に記載の充填剤の評価方法。
  10. 　前記乾燥後の溶出物の状態を撮影し、デジタル化された画像を生成し、前記溶出物の状態を数値化して評価することを特徴とする請求項１から８のうちいずれか１項に記載の充填剤の評価方法。
  11. 　質量分析装置を用いて、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法を用いることを特徴とする請求項１から１０のうちいずれか１項に記載の充填剤の評価方法。
  12. 　質量分析装置を用いて、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）法を用いることを特徴とする請求項１から１０のうちいずれか１項に記載の充填剤の評価方法。
  13. 　質量分析装置を用いた分析時に、前記充填剤の評価を行うことを特徴とする請求項１から１２のうちいずれか１項に記載の充填剤の評価方法。
  14. 　充填剤の分離能力を示すクロマトグラムを評価の指標とする充填剤の評価方法と、請求項１から１３のうちいずれか１項に記載の充填剤の評価方法を組み合わせて充填剤を評価することを特徴とする充填剤の評価方法。
  15. 　前記充填剤の分離能力を示すクロマトグラムは、充填剤の異性体の分離能力を示すクロマトグラムであることを特徴とする請求項１４に記載の充填剤の評価方法。
  16. 　前記充填剤の分離能力を示すクロマトグラムは、充填剤の位置異性体の分離能力を示すクロマトグラムを含むことを特徴とする請求項１４に記載の充填剤の評価方法。
  17. 　前記充填剤の分離能力を示すクロマトグラムは、充填剤の立体異性体の分離能力を示すクロマトグラムを含むことを特徴とする請求項１４に記載の充填剤の評価方法。
  18. 　前記充填剤の分離能力を示すクロマトグラムは、充填剤の位置異性体の分離能力を示すクロマトグラム及び充填剤の立体異性体の分離能力を示すクロマトグラムを含むことを特徴とする請求項１４に記載の充填剤の評価方法。
  19. 　前記充填剤の位置異性体の分離能力を示すクロマトグラムを評価の指標とする充填剤の評価方法は、２種以上の位置異性体を分析したクロマトグラムから、夫々の保持時間又は保持係数の比を求め、当該保持時間又は保持係数の比を充填剤の評価の指標とすることを特徴とする請求項１６又は１８に記載の充填剤の評価方法。
  20. 　前記充填剤の立体異性体の分離能力を示すクロマトグラムを評価の指標とする充填剤の評価方法は、立体構造が異なる２種以上の化合物を分析したクロマトグラムから、夫々の保持時間又は保持係数の比を求め、当該保持時間又は保持係数の比を充填剤の評価の指標とすることを特徴とする請求項１７又は１８に記載の充填剤の評価方法。
  21. 　前記位置異性体が、置換基の結合位置が異なる位置異性体であることを特徴とする請求項１６、１８又は１９に記載の充填剤の評価方法。
  22. 　前記位置異性体が、芳香族化合物であることを特徴とする請求項１６、１８又は１９に記載の充填剤の評価方法。
  23. 　前記立体構造が異なる化合物は、芳香族化合物であることを特徴とする請求項２０に記載の充填剤の評価方法。
  24. 　請求項１から２３のうちいずれか１項に記載の充填剤の評価方法で得られた所定の基準を満たしていることを特徴とする高速液体クロマトグラフィー用充填剤。
  25. 　請求項２４に記載の前記高速液体クロマトグラフィー用充填剤が充填されていることを特徴とする高速液体クロマトグラフィー用カラム。
  26. 　請求項２５に記載の前記高速液体クロマトグラフィー用カラムが用いられていることを特徴とする高速液体クロマトグラフ。
  27. 　請求項２５に記載の前記高速液体クロマトグラフィー用カラムが用いられていることを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析装置。
  28. 　請求項１から２３のうちいずれか１項に記載の充填剤の評価方法を用いることを特徴とする充填剤の設計方法。
  29. 　請求項２８に記載の設計方法により設計されたことを特徴とする充填剤。
  30. 　前記充填剤は、シリカゲル母体が用いられ、前記シリカゲル母体の細孔径が１５～２５ｎｍであり、化学結合基Ｃ２６～Ｃ３０、炭素量１６～２５ｗｔ％であり、二次処理が施されていることを特徴とする請求項２９に記載の充填剤。
  31. 　前記充填剤は、前記シリカゲル母体の細孔径が１９～２１ｎｍであり、前記二次処理としてエンドキャッピングが施されていることを特徴とする請求項３０に記載の充填剤。
  32. 　前記充填剤は、炭素量１７～２４ｗｔ％であることを特徴とする請求項３０又は３１に記載の充填剤。
  33. 　充填剤が充填されたカラム、送液装置、前記カラムからの溶出物を直接乾燥する装置、を備えていることを特徴とする充填剤の評価装置。
  34. 　前記カラムからの溶出物を直接乾燥する装置は、金属板を備えていることを特徴とする請求項３３に記載の充填剤の評価装置。
  35. 　前記充填剤の評価装置は質量分析装置を備え、前記カラムからの溶出物を直接乾燥する装置は、前記カラムからの溶出物が当たる、前記質量分析装置内の金属板を備えていることを特徴とする請求項３４に記載の評価装置。
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