WO2023007809A1 - コロナウイルス感染症の重症化リスクの評価方法、およびコロナウイルス感染症の重症化リスク評価キット - Google Patents

コロナウイルス感染症の重症化リスクの評価方法、およびコロナウイルス感染症の重症化リスク評価キット Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating the risk of aggravation of coronavirus infection and a kit for evaluating the risk of aggravation of coronavirus infection.
  • COVID-19 is a viral infection caused by SARS-CoV-2. Up to about 20% of COVID-19 cases are severe (14% moderate to severe, 5% severe, 2% death). Elderly people and those with underlying diseases such as hypertension, diabetes, cardiovascular disease, chronic respiratory disease, and cancer are at high risk of severe disease, and approximately 6-14% are said to develop severe disease. In COVID-19 epidemic areas, critically ill patients, the elderly, and patients with underlying diseases occupy ICUs and general beds, respectively, leading to medical collapse.
  • Non-Patent Document 1 reports that CD4-positive T cells that react with SARS-CoV-2 were detected in about 40-60% of uninfected persons.
  • the purpose of the present invention is to provide a method for evaluating the risk of aggravation of coronavirus infection and a kit for evaluating the risk of aggravation of coronavirus infection, which can easily determine the risk of aggravation of coronavirus infection.
  • a method for evaluating the risk of aggravation of a coronavirus infection comprising: (a) subject-derived T cells to a different type of coronavirus that is a different type of coronavirus from the causative virus of the coronavirus infection; (b) assessing the risk of aggravation of the coronavirus infection based on the responsiveness of the T cells to the protein or fragment thereof; A method for evaluating the risk of exacerbation of viral infections.
  • the protein or a fragment thereof is derived from a first heterospecies coronavirus that accepts a molecule different from the molecule that the causative virus accepts, and the step (b) includes the protein or The method for assessing the risk of aggravation of coronavirus infection according to [1], which is a step of assessing that the risk of aggravation of coronavirus infection is high when the responsiveness of the T cells to the fragment is low.
  • the protein or a fragment thereof is derived from a second other coronavirus whose receptor is the same molecule as that of the causative virus, and the step (b) comprises the protein or its fragment
  • the step (a) comprises (a1) a protein or a fragment thereof derived from a first heterospecies coronavirus that accepts a molecule different from the molecule that the causative virus accepts for the T cell.
  • step of (b) comprises (b1) measuring a first responsiveness of the T cell to a protein or fragment thereof derived from the first heterogeneous coronavirus; and (b2) the (b3) measuring a second responsiveness of said T cell to a protein or fragment thereof derived from a second heterogeneous coronavirus; (Second responsiveness / first responsiveness), evaluating the risk of aggravation of the coronavirus infection according to [1], including the step of evaluating the risk of aggravation of the coronavirus infection. Evaluation method.
  • [5] The coronavirus infection according to any one of [1] to [4], wherein the causative virus and the coronavirus from which the protein or fragment thereof is derived belong to the genus Betacoronavirus or Alphacoronavirus.
  • [6] The method for evaluating the risk of aggravation of coronavirus infection according to any one of [1] to [5], wherein the causative virus is SARS-CoV-2.
  • kits for evaluating the risk of aggravation of coronavirus infection wherein the coronavirus contains a protein or a fragment thereof derived from a different type of coronavirus that is a different type of coronavirus from the causative virus of the coronavirus infection.
  • a kit for assessing the risk of aggravation of infectious diseases [8] The kit for assessing the risk of aggravation of coronavirus infection according to [7], further comprising a specific binding substance for cytokines secreted by T cells in response to antigenic stimulation.
  • a method for evaluating the risk of aggravation of coronavirus infection and a kit for evaluating the risk of aggravation of coronavirus infection, which can easily determine the risk of aggravation of coronavirus infection, are provided.
  • FIG. 2 shows the results of an ELISPOT assay using PBMCs isolated from the blood of COVID-19 convalescent patients and healthy subjects.
  • FIG. 2 shows a graph quantifying the results of the ELISPOT assay using the HKU1-S protein in FIG. 1.
  • FIG. 2 shows a graph quantifying the results of an ELISPOT assay using the OC43-S protein in FIG. 1.
  • FIG. 2 shows a graph quantifying the results of an ELISPOT assay using the SARS-CoV-2-S protein in FIG. 1.
  • FIG. The results of ELISPOT assay using HCoV-HKU1 S protein (HKU1-S) as a T lymphocyte stimulating antigen are shown.
  • ELISPOT assay using HCoV-OC43 S protein (OC43-S) as a T lymphocyte stimulating antigen are shown.
  • the results of ELISPOT assay using HCoV-NL63 S protein (NL63-S) as a T lymphocyte stimulating antigen are shown.
  • the results of ELISPOT assay using HCoV-229E S protein (229E-S) as a T lymphocyte stimulating antigen are shown.
  • the results of an ELISPOT assay using SARS-CoV-2 S protein (CoV2-S) as a T-lymphocyte-stimulating antigen are shown.
  • FIG. 3B is a graph summarizing the results of moderate I, moderate II, and severe in FIG. 3A as “moderate or higher”.
  • FIG. 3B is a graph summarizing the results of moderate I, moderate II, and severe in FIG. 3B as “moderate or higher”.
  • FIG. 4B is a graph summarizing the results of moderate I, moderate II, and severe in FIG. 4A as “moderate or higher”.
  • FIG. 4C is a graph summarizing the results of moderate I, moderate II, and severe in FIG. 4B as “moderate or higher”.
  • FIG. 5B is a graph summarizing the results of moderate I, moderate II, and severe in FIG. 5A as “moderate or higher”.
  • FIG. 5B is a graph summarizing the results of moderate I, moderate II, and severe in FIG. 5B as “moderate or higher”.
  • 1 is a graph showing a severity risk value (Y) calculated by Equation (1) described later, classified into healthy subjects, mild cases, and moderate to severe cases.
  • Y a severity risk value calculated by Equation (1) described later, classified into healthy subjects, mild cases, and moderate to severe cases.
  • the results of ELISPOT assay using HKU1-S as a T-lymphocyte-stimulating antigen before (Pre) and after (Post) vaccination are shown.
  • the results of ELISPOT assays performed before (Pre) and after (Post) vaccination using OC43-S as a T-lymphocyte-stimulating antigen are shown.
  • the results of ELISPOT assays performed using HCoV-NL63 as a T-lymphocyte-stimulating antigen before (Pre) and after (Post) vaccination are shown.
  • the results of ELISPOT assays performed before (Pre) and after (Post) vaccination using 229ES as a T-lymphocyte-stimulating antigen are shown.
  • the results of ELISPOT assay using CoV2-S as a T-lymphocyte-stimulating antigen before (Pre) and after (Post) vaccination are shown.
  • the results of ELISPOT assay using CoV2-all as a T lymphocyte stimulating antigen before (Pre) and after (Post) vaccination are shown.
  • FIG. 3 is a scatter diagram showing the exacerbation risk value (Y) before vaccination (Pre) and after vaccination (Post).
  • Fig. 2 shows changes in the severity risk value (Y) before vaccination (Pre) and after vaccination (Post).
  • the result of analyzing the correlation between the aggravation risk value (Y) and age is shown.
  • the result of analyzing the correlation between the aggravation risk value (Y) and BMI is shown.
  • the result of analyzing the correlation between the severity risk value (Y) and the smoking index BI is shown.
  • the result of analyzing the correlation between the severity risk value (Y) and smoking history is shown.
  • 2 shows the results of analyzing the correlation between severity and age in the subjects of Example 2.
  • FIG. 2 shows the results of analyzing the correlation between severity and BMI in the subjects of Example 2.
  • FIG. 2 shows the results of analyzing the correlation between severity and smoking index BI in the subjects of Example 2.
  • FIG. 2 shows the results of analyzing the correlation between severity and smoking history in the subjects of Example 2.
  • the term “comprise” means that it may include elements other than the subject element.
  • the term “consist of” means containing no elements other than the subject element.
  • the term “consisting essentially of” means that it does not include constituent elements other than the subject constituent elements in a mode that exhibits a special function (such as a mode that completely loses the effect of the invention). means.
  • the word “comprise” includes aspects that "consist of” and aspects that "consist essentially of.”
  • Proteins, peptides, and cells can be isolated. "Isolated” means separated from the natural state or other components. “Isolated” can be substantially free of other components. “Substantially free of other components” means that the content of other components contained in the isolated component is negligible. The content of other components contained in the isolated component is, for example, 10% by mass or less, 5% by mass or less, 4% by mass or less, 3% by mass or less, 2% by mass or less, 1% by mass or less, 0.5% by mass or less. It may be 5% by mass or less, or 0.1% by mass or less.
  • the proteins, peptides and cells described herein can be isolated proteins, isolated peptides and isolated cells.
  • Coronavirus refers to a virus belonging to the Coronaviridae family. Viruses of the Coronaviridae family are single-stranded, positive-stranded RNA viruses with an envelope. Viruses are classified, for example, according to the classification of the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV). Coronaviruses are taxonomically classified into the genus Nidovirus, family Coronaviridae. The Coronavirus family is further divided into the Coronavirinae (Orthocorovirinae) and the Torovirinae.
  • ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses
  • coronavirus subfamily is subdivided into four genera: alpha ( ⁇ )coronavirus, beta ( ⁇ )coronavirus, gamma ( ⁇ )coronavirus, and delta ( ⁇ )coronavirus.
  • SARS-CoV-1, MERS-CoV, SARS-CoV-2 are classified in the betacoronavirus genus.
  • HCoV-HKU1 and HCoV-OC43 are classified in the betacoronavirus genus.
  • the remaining human cold coronaviruses, HCoV-229E and HCoV-NL63 are classified in the genus Alphacoronavirus (El-Sayed A, et al.
  • SARS-CoV-2 has a high homology of 75.7% with HCoV-HKU1 and 74.8% with HCoV-OC43, both belonging to the same betacoronavirus genus, in terms of amino acid sequence homology.
  • SARS-CoV-2 has a low homology of 64.9% with HCoV-229E, which is an alphacoronavirus, and 56.3% with HCoV-NL63 (Cueno ME, et al. Front Med (Lausanne). 2021 Jan 14;7:594439.). High homology can be expected to increase cross-reactivity in cell-mediated immunological analysis.
  • the coronavirus is a human coronavirus.
  • Human coronavirus means a coronavirus that infects humans. Human coronaviruses include Alphacoronaviruses HCoV-229E and HCoV-NL63; and Betacoronaviruses HCoV-HKU1, HCoV-OC43, SARS-CoV, MERS-CoV, and SARS- CoV-2 and the like. SARS-CoV-2 exists in existing strains such as alpha, beta, gamma, delta, lambda, mu, epsilon, eta, iota, kappa, and omicron strains, as well as future strains. It includes possible mutant strains.
  • Coronavirus infectious disease refers to a disease caused by infection with a coronavirus.
  • HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, and HCoV-OC43 cause the common cold.
  • SARS-CoV causes severe acute respiratory syndrome (SARS).
  • MERS-CoV causes Middle East respiratory syndrome (MERS).
  • SARS-CoV-2 causes the novel coronavirus disease (COVID-19).
  • “Risk of aggravation of coronavirus infection” refers to the risk of progression of symptoms of coronavirus infection. For example, if the subject is a person infected with coronavirus, the risk of aggravation of coronavirus infection is qualitatively the possibility that the symptoms of the coronavirus will progress and the situation will require active medical intervention. can be an indicator. The risk of aggravation of coronavirus infection is, for example, if the subject is not infected with coronavirus, the symptoms of the coronavirus progress when the subject is infected with coronavirus, and active medical intervention is required. It can be a qualitative indicator of the likelihood of a necessary situation.
  • the risk of aggravation of coronavirus infection may be, for example, the risk of developing various symptoms associated with the progression of infection when the subject is infected with coronavirus.
  • Symptoms that develop with the progression of coronavirus infection include, for example, dyspnea, pneumonia, hypoxia, respiratory failure, acute respiratory distress syndrome, acute lung injury, sepsis, and multiple organ failure.
  • coronavirus infection is COVID-19
  • the risk of aggravation is moderate or higher (for example, new coronavirus infection (COVID-19) medical treatment guide, 5th edition (Ministry of Health, Labor and Welfare) (https://www .mhlw.go.jp/content/000785119.pdf), moderate I or higher, moderate II or higher, or severe or higher).
  • COVID-19 Medical Care Guide, 5th Edition the severity of COVID-19 is classified as follows: Mild: Oxygen saturation (SpO2) ⁇ 96% with no respiratory symptoms or cough but no dyspnea. No evidence of pneumonia was observed in either case.
  • Moderate I no respiratory failure
  • Moderate II with respiratory failure
  • Severe Requires admission to ICU or ventilator.
  • the risk of aggravation is that if the subject is a cured person after suffering from COVID-19, due to the emergence of SARS-CoV-2 mutants, the future will be infected again with SARS-CoV-2 and develop COVID-19, It may be a risk of exacerbation.
  • the risk of aggravation is that if the subject is a cured person after contracting COVID-19, due to the deterioration of the subject's immune memory, the risk of developing COVID-19 by being infected with SARS-CoV-2 again in the future and becoming severe may be If the subject is an asymptomatic person who is PCR-positive in the SARS-CoV-2 PCR test, it often follows a course of either aggravation or spontaneous recovery about 1 week after the onset of COVID-19. In this case, the risk of aggravation may be the risk of developing COVID-19 and leading to aggravation.
  • the risk of severe disease is due to the emergence of vaccine-low-susceptibility SARS-CoV-2 mutant strains, which will infect SARS-CoV-2 again in the future and cause COVID-19. It may be a risk of developing and becoming severe. If the subject is a SARS-CoV-2 vaccine recipient, the risk of severe disease is that the subject will be infected with SARS-CoV-2 again in the future, develop COVID-19, and become severe, along with the weakening of the vaccine effect in the subject. can be a risk.
  • antibody is meant an immunoglobulin that has antigen-binding activity. Antibodies are not limited to intact antibodies, and may be antigen-binding fragments as long as they have antigen-binding activity. As used herein, the term “antibody” includes antigen-binding fragments.
  • An "antigen-binding fragment” is a polypeptide comprising a portion of an antibody that retains the antigen-binding properties of the original antibody. Antigen-binding fragments preferably include all six complementarity determining regions (CDRs) of the original antibody. That is, it preferably contains all of the CDR1, CDR2 and CDR3 of the heavy chain variable region and the CDR1, CDR2 and CDR3 of the light chain variable region.
  • CDRs complementarity determining regions
  • Antigen-binding fragments include, for example, Fab, Fab', F(ab') 2 , variable region fragments (Fv), disulfide-bonded Fv, single-chain Fv (scFv), sc(Fv) 2 and the like.
  • Antibodies may be derived from any organism. Examples of organisms from which antibodies are derived include, but are not limited to, mammals (humans, mice, rats, rabbits, horses, cows, pigs, monkeys, dogs, etc.), birds (chickens, ostriches), and the like.
  • Antibodies can be of any class and subclass of immunoglobulin.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, preferably a monoclonal antibody.
  • Antibodies can be produced by known methods such as the immunization method, hybridoma method, and phage display method.
  • Binding pair refers to two molecules (a pair of molecules) that bind to each other.
  • a “first member” of a binding pair refers to one molecule of a pair of molecules that constitute the binding pair.
  • a “second member” of a binding pair refers to the other molecule of the pair of molecules that constitute the binding pair. Examples of binding pairs include biotin or derivatives thereof and avidin or derivatives thereof (streptavidin, neutravidin, etc.).
  • a "receptor” is a molecule that a virus binds to when it invades a cell. Receptors are usually present on the cell surface of host cells subject to viral infection. Coronaviruses are thought to infect host cells by binding to receptors present on the cell surface of host cells with spike proteins. Receptors for major species of alphacoronaviruses and betacoronaviruses are shown in Table 1. In Table 1, APN1 represents aminopeptidase N, ACE2 represents angiotensin covering enzyme 2, and DPP4 represents dipeptidyl peptidase-4.
  • HCoC-NL63 and SARS-CoV have the same receptor as SARS-CoV-2 (ie ACE2).
  • HCoC-229E, HCoC-OC43, HCoC-HKU1, and MERS-CoV have different receptors than SARS-CoV-2.
  • a first aspect of the present disclosure is a method for evaluating the risk of aggravation of coronavirus infection.
  • the method according to this aspect includes the following steps (a) and (b).
  • the evaluation method according to this aspect can be implemented using an ELISPOT assay technique.
  • a protein or a fragment thereof derived from a different type of coronavirus which is a different type of coronavirus from the coronavirus infection whose risk of aggravation is to be evaluated, can be used.
  • the evaluation method according to this aspect is a method performed in vitro.
  • step (a) subject-derived T cells are brought into contact with a protein or a fragment thereof derived from a coronavirus of a different species than the causative virus of coronavirus infection.
  • Subject refers to an individual subject to assessment of the risk of severe coronavirus infection.
  • the subject is not particularly limited as long as it is an animal suffering from coronavirus infection.
  • Subjects include humans and mammals other than humans. Mammals other than humans include, for example, primates such as monkeys, chimpanzees, gorillas and marmosets; rodents such as mice, guinea pigs, hamsters and rats; carnivora such as dogs and cats; Not limited.
  • the subject is human.
  • the subject may be an infected person with the causative virus (hereinafter also simply referred to as the "causative virus") of the coronavirus infectious disease (hereinafter referred to as the "target coronavirus infectious disease”) subject to the risk assessment of aggravation, It may be a non-infected person.
  • “Infected person” means a person who is in a state where the causative coronavirus can be detected.
  • Non-infected person means a person in whom no causative coronavirus is detected.
  • a coronavirus can be detected by a known method (PCR method, antigen method, etc.) using a biological sample (saliva, nasal swab, nasopharyngeal swab, etc.) collected from a subject.
  • PCR method PCR method, antigen method, etc.
  • a biological sample saliva, nasal swab, nasopharyngeal swab, etc.
  • the subject When the subject is a causative coronavirus-infected person, it is preferably in the early stages of infection with the causative coronavirus. By assessing the risk of aggravation at the early stage of infection, it is possible to predict whether the subject will develop the target coronavirus infection and whether the symptoms will be aggravated. As a result, appropriate therapeutic intervention can be performed. By evaluating the risk of aggravation in non-infected people, it is possible to predict whether the symptoms of the target coronavirus infection will be aggravated when the target is infected with the causative virus. Appropriate protective interventions, such as vaccination, can then be taken.
  • the subject may be a subject who has developed the subject coronavirus infection, or may be a non-developer.
  • “Patient” means a person infected with a causative coronavirus and who develops one or more symptoms of the subject coronavirus infection.
  • “Non-symptomatic” means a person who has been infected with the causative coronavirus and has not developed symptoms of the target coronavirus infection.
  • the subject is a subject who has developed a coronavirus infection, it is preferably in the early stages of onset of the coronavirus infection. By evaluating the risk of aggravation at the early stage of onset, it is possible to predict whether the symptoms of the subject coronavirus infection will be aggravated in the subject.
  • the target is a non-symptomatic person with the target coronavirus infection and is infected with the causative virus, by evaluating the risk of aggravation, the target will develop the target coronavirus infection and the symptoms will become severe. can predict whether As a result, appropriate therapeutic intervention can be performed.
  • the subject may be an infected person with the subject coronavirus infection or may be an uninfected person.
  • Pre-infected person means a person who has been infected with the causative virus at least once and who has been cured of the target coronavirus infection.
  • Non-infected person means a person who has never been infected with the causative virus.
  • the subject may be a person who has been vaccinated against the target coronavirus infection (a vaccinated person) or an unvaccinated person.
  • a vaccinated person By evaluating the risk of aggravation of the vaccine recipient, it is possible to evaluate whether vaccination has acquired immunity to the extent that it is possible to avoid aggravation of the target coronavirus infection. Appropriate protective interventions, such as re-vaccination, can then be taken.
  • protective interventions such as vaccination
  • Appropriate protective interventions such as vaccination
  • T cells A subject's T cells can be isolated from the subject's blood by known methods. For example, a peripheral blood mononuclear cell (PBMC) fraction containing T cells can be separated from blood by density gradient centrifugation. PBMCs include antigen-presenting cells such as dendritic cells, monocytes/macrophages, and B cells, in addition to T cells (CD8-positive T-cells, CD4-positive T-cells, etc.). In step (a), PBMCs may be used as the cell population containing T cells of interest. Alternatively, T cells may be isolated from PBMC using antibodies that specifically bind to T cell markers (CD8, CD4, etc.). In one embodiment, T cells comprise at least one selected from the group consisting of CD8-positive T-cells and CD4-positive T-cells. In one embodiment, T-cells include both CD8-positive T-cells and CD4-positive T-cells.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cell
  • a “other coronavirus” is a different type of coronavirus from the causative virus.
  • Other types of coronaviruses are viruses belonging to the coronavirus family, and are not particularly limited as long as they are different types of coronaviruses from the causative virus.
  • the antigenic virus is a coronavirus belonging to a different species than the causative virus.
  • the antigenic virus is a coronavirus belonging to the same genus as the causative virus and a different species from the causative virus.
  • the antigenic virus may be a different species of the genus Betacoronavirus.
  • the antigenic virus may be of the genus Alphacoronavirus.
  • the antigenic virus is a coronavirus capable of infecting a subject.
  • a virus belonging to the genus Betacoronavirus can be used as the antigenic virus.
  • a human coronavirus belonging to the genus Betacoronavirus HCoV-OC43, HCoV-HKU1, etc.
  • the antigenic virus may be a coronavirus that accepts a molecule different from that of the causative virus (hereinafter also referred to as "first antigenic virus” or “first other coronavirus”). good.
  • first antigenic virus or “first other coronavirus”
  • coronaviruses include HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-HKU1, MERS-CoV, and the like.
  • the antigenic virus may be a coronavirus whose receptor is the same molecule as that of the causative virus (hereinafter also referred to as "second antigenic virus” or “second other coronavirus”).
  • second antigenic virus or “second other coronavirus”
  • a coronavirus with ACE2 as a receptor can be used as an antigenic virus.
  • Such coronaviruses include HCoV-NL63, SARS-CoV, and the like.
  • antigenic virus only one type of antigenic virus may be used, or two or more types may be used.
  • the antigenic virus it is preferable to use both the first antigenic virus and the second antigenic virus.
  • the first antigen virus it is preferable to use one or more selected from the group consisting of HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-HKU1, and MERS-CoV, more preferably two or more, It is more preferable to use three or more kinds. All of HCoV-229E, HCoV-OC43, and HCoV-HKU1 are preferably used as the first antigen virus.
  • the second antigen virus it is preferable to use one or more selected from the group consisting of HCoV-NL63 and SARS-CoV. It is preferable to use HCoV-NL63 as the second antigenic virus.
  • a protein derived from an antigen virus or a fragment thereof is used as a T cell stimulating antigen.
  • a “protein derived from an antigenic virus” (hereinafter also referred to as “antigenic virus protein”) refers to a protein possessed by an antigenic virus or a protein expressed by a provirus of an antigenic virus.
  • Antigen viral proteins include, for example, spike protein (S protein), nucleocapsid protein (N protein), membrane protein (M protein), envelope protein (E protein), RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) and the like.
  • proteins that bind to receptors are antigenic viral proteins.
  • Immunological memory against an antigenic virus that has the same receptor as the causative virus induces an excessive immune response upon infection with the causative virus, which may lead to aggravation of coronavirus infection caused by the causative virus.
  • Coronaviruses usually bind to their receptors via the spike protein (S protein). Therefore, it is preferable to use the S protein as the antigenic viral protein.
  • the fragment of the antigenic viral protein is not particularly limited as long as it has a part of the amino acid sequence of the antigenic viral protein.
  • the fragment of the antigenic viral protein preferably has a size that enables activation of T cells.
  • a fragment of an antigenic viral protein may be a fragment of an antigenic viral protein of 8 amino acids or more, 9 amino acids or more, or 10 amino acids or more.
  • a fragment of an antigenic viral protein comprises a T-cell epitope of the antigenic viral protein.
  • the antigenic viral protein may be modified as long as it can induce cell-mediated immunity against the antigenic virus.
  • the antigenic virus protein has one or several (eg, 2 to 20, 2 to 15, 2 to 10, 2 to 5, 2 to 4 1, 2 or 3) amino acids are substituted, deleted and/or added.
  • the antigenic viral protein or fragment thereof may be synthesized based on the amino acid sequence of the antigenic viral protein. Alternatively, it may be synthesized by cellular or cell-free synthesis systems using polynucleotides encoding antigenic viral proteins or fragments thereof. Amino acid sequences or gene sequences of antigenic viral proteins can be obtained from sequence databases such as GenBank. For example, the amino acid sequence of the S protein of HCoV-OC43 is NCBI Reference Sequence: YP_009555241.1 (SEQ ID NO: 1) or GenBank No. The one registered under AMK59677.1 (SEQ ID NO: 2) can be used.
  • the amino acid sequence of the S protein of HCoV-HKU1 is NCBI Reference Sequence: YP_173238.1 (SEQ ID NO: 3) or GenBank No.
  • the one registered under AYN64561.1 (SEQ ID NO: 4) can be used.
  • the HCoV-229E S protein amino acid sequence registered under NCBI Reference Sequence: NP — 073551.1 (SEQ ID NO: 5) can be used.
  • the HCoV-NL63 S protein amino acid sequence registered under NCBI Reference Sequence: YP_003767.1 SEQ ID NO: 6
  • antigen viral proteins or fragments thereof may be used.
  • HcoV-OC43 S protein and HcoV-HKU1 S protein were obtained from Sino Biological Inc. etc. is commercially available.
  • SARS-Cov-2 S protein and SARS-Cov-2 peptide pools are commercially available from mabtech AB and others.
  • the antigenic viral protein or its fragment it is preferable to use the full-length antigenic viral protein.
  • the full-length protein it is more likely to contain T-cell epitopes. In addition, it is easy to deal with mutant strains.
  • the method of contacting the subject-derived T cells with the antigenic viral protein or fragment thereof is not particularly limited. For example, methods commonly used in ELISPOT assays can be used.
  • the contacting of the T cell with the antigenic viral protein or fragment thereof occurs in the presence of an antigen presenting cell.
  • Antigen-presenting cells include dendritic cells, B cells, macrophages, and the like.
  • Antigen-presenting cells are preferably obtained from a subject.
  • PBMCs isolated from a subject's blood contain T cells and antigen-presenting cells. As such, PBMC obtained from the subject's blood may be used for contact with antigenic viral proteins or fragments thereof.
  • the antigenic viral protein or fragment thereof may be presented by antigen-presenting cells.
  • the antigenic viral protein or its fragment is cultured with the antigen-presenting cell, the antigenic viral protein or its fragment is taken up by the antigen-presenting cell and presented to the antigen-presenting cell as an MHC/peptide complex.
  • Antigen presenting cells presenting this MHC/peptide complex may be used to contact T cells from the subject.
  • the amount of subject-derived T cells used in the reaction is not particularly limited.
  • the amount of T cells includes, for example, 10 3 to 10 8 , 10 4 to 10 7 , 10 4 to 10 6 , or 10 3 to 10 8 .
  • the number of PBMC cells used in the reaction is, for example, 10 3 to 10 8 , 10 4 to 10 7 , 10 4 to 10 6 , or 10 3 to 10 8 .
  • the amount of the antigenic viral protein or fragment thereof used for the reaction is not particularly limited.
  • examples of the amount of the antigenic viral protein or fragment thereof include 0.1 ⁇ g/mL or more, 0.5 ⁇ g/mL or more, 1 ⁇ g/mL or more, 2 ⁇ g/mL or more, 5 ⁇ g/mL or more, or 10 ⁇ g/mL or more. be done.
  • the upper limit of the antigenic viral protein or fragment thereof is not particularly limited, but is mL or less, and the like. The above upper limit and lower limit can be arbitrarily combined.
  • the reaction time is not particularly limited, as long as it is sufficient to induce an immune response of T cells by the antigenic viral protein or its fragment.
  • Examples of the reaction time include 1 hour or longer, 2 hours or longer, 5 hours or longer, 7 hours or longer, 10 hours or longer, 15 hours or longer, or 20 hours or longer.
  • the upper limit of the reaction time is not particularly limited, examples thereof include 50 hours or less, 40 hours or less, 30 hours or less, or 25 hours or less. The above upper limit and lower limit can be arbitrarily combined.
  • reaction temperature examples include 20-40°C, 25-40°C, and 30-40°C.
  • the reaction temperature is typically 37°C.
  • the subject-derived T cells may be brought into contact with antigenic viral proteins or fragments thereof using a well plate for ELISPOT or the like.
  • a commercially available ELISPOT plate can be used.
  • the well plate for ELISPOT may be immobilized with capture antibodies that specifically bind to cytokines secreted by T cells upon antigen stimulation.
  • the cytokines include interferon gamma (IFN-gamma), interleukin 2 (IL-2), IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, perforin, granzyme B (GzB), tumor necrosis.
  • Factor alpha (TNF- ⁇ ) and the like include, but are not limited to.
  • One type of capturing antibody may be used, or two or more types may be used.
  • the capturing antibodies are anti-IFN- ⁇ antibodies and anti-IL-2 antibodies.
  • T cells responsive to antigenic viral proteins or fragments thereof secrete cytokines upon contact with antigenic viral proteins or fragments thereof.
  • a capture antibody can bind to cytokines secreted from T cells and capture them on the well plate.
  • the bottom surface of the wells of the ELISPOT plate may be formed of a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane to immobilize the capturing antibody.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • T cells it is preferable to contact the subject-derived T cells with antigenic viral proteins or fragments thereof for each type of antigenic virus from which the antigenic proteins or fragments thereof are derived. That is, it is preferable to contact T cells with an antigenic viral protein or a fragment thereof derived from one type of antigenic virus. Thereby, the responsiveness of T cells can be measured for each type of antigen virus.
  • a protein derived from HCoV-229E or a fragment thereof contacts T cells; contact of a protein derived from HCoV-HKU1 or a fragment thereof with T cells; contact of a protein derived from HCoV-HKU1 or a fragment thereof with T cells; and contact of a protein derived from HCoV-NL63 or a fragment thereof with T cells.
  • HCoV-229E contacts T cells; contact of a protein derived from HCoV-HKU1 or a fragment thereof with T cells; contact of a protein derived from HCoV-HKU1 or a fragment thereof with T cells; and contact of a protein derived from HCoV-NL63 or a fragment thereof with T cells.
  • antigenic viral proteins or fragments thereof multiple types of proteins or fragments thereof may be used for one type of antigenic virus, or only one type of protein or fragments thereof may be used.
  • the protein or fragment thereof comprises the S protein or fragment thereof.
  • step (b) the risk of aggravation of the subject's coronavirus infection is assessed based on the responsiveness of subject-derived T cells to antigenic viral proteins or fragments thereof.
  • T cells proliferate and produce cytokines when activated by contact with antigenic viral proteins or fragments thereof.
  • T cell responsiveness to antigenic viral proteins or fragments thereof may be measured based on T cell proliferation or cytokine production.
  • T cell responsiveness can be measured based on the secretion of cytokines from T cells in response to stimulation by antigenic viral proteins or fragments thereof. For example, the greater the amount of cytokines secreted from T cells upon contact with antigenic viral proteins or fragments thereof, the higher the responsiveness can be evaluated.
  • the amount of cytokine secretion can be measured, for example, by an immunological method using an antibody that specifically binds to the cytokine. Examples of such immunological techniques include, but are not limited to, ELISA, Western blotting, and the like.
  • T cell responsiveness may be assessed based on the amount of cytokine mRNA expressed by the T cell population. Methods for measuring cytokine mRNA levels include, but are not limited to, RT-qPCR, Northern blotting, and the like.
  • the responsiveness of T cells may be evaluated by the number of T cells that secrete cytokines upon contact with antigenic viral proteins or fragments thereof. For example, the greater the number of T cells that secrete cytokines upon contact with antigenic viral proteins or fragments thereof, the higher the responsiveness can be evaluated.
  • the number of cytokine-secreting T cells can be measured, for example, by an immunological technique using an antibody that specifically binds to the cytokine. Examples of such immunological techniques include, but are not limited to, ELISPOT assays and the like.
  • the responsiveness of subject-derived T cells to antigenic viral proteins or fragments thereof can be measured using the ELISPOT assay technique.
  • An ELISPOT assay can be performed, for example, as follows. In the ELISPOT assay, T cells and T cell stimulating antigens (antigenic viral proteins or fragments thereof) are incubated in wells, and cytokines secreted by T cells are captured with well-immobilized capture antibodies. The wells are then washed to remove T cells before adding a labeled detection antibody to the wells. As the detection antibody, an antibody that specifically binds to the same cytokine as the capture antibody can be used. A detection antibody binds to the cytokine captured by the capture antibody.
  • the cytokine can be detected by performing a color reaction according to the label of the detection antibody.
  • a color reaction according to the label of the detection antibody.
  • spots of chromogenic reaction occur where cytokine-secreting T cells are located. The number of spots can be counted by an ELISPOT reader or the like. It can be evaluated that the greater the number of spots, the higher the responsiveness of T cells to antigenic viral proteins or fragments thereof.
  • the chromogenic reaction for detecting cytokines can be performed using an enzyme that catalyzes the chromogenic reaction (hereinafter referred to as "chromogenic enzyme") and a substrate for the enzyme.
  • Chromogenic enzymes include, for example, peroxidase (eg, horseradish peroxidase; HRP), alkaline phosphatase (AP), and the like.
  • HRP horseradish peroxidase
  • AP alkaline phosphatase
  • the chromogenic enzyme may be directly labeled to the detection antibody or may be conjugated to the detection antibody using a binding pair such as biotin-avidin binding.
  • different chromogenic enzymes may be used for each cytokine.
  • An antibody labeled with a fluorescent dye may be used as the detection antibody.
  • fluorescent spots are generated at the locations of the T cells that have secreted cytokines.
  • the fluorescent spots may be counted with a fluorescent spot detection reader or the like.
  • Responsiveness of T cells from a subject to an antigenic viral protein or fragment thereof is associated with the risk of severe coronavirus infection in the subject. For example, if the responsiveness of T cells from a subject to an antigenic viral protein or fragment thereof is low, the subject can be assessed as having a high risk of severe disease for the subject coronavirus infection. For example, if subject-derived T cells are highly responsive to an antigenic viral protein or fragment thereof, the subject can be assessed as having a low risk of severe disease for the subject coronavirus infection.
  • the high responsiveness of subject-derived T cells to antigenic viral proteins or fragments thereof may mean that the subject has experienced infection with the antigenic virus and maintains cell-mediated immunity against the antigenic virus. It is believed that T cells that are responsive to antigenic viruses also respond to causative viruses of target coronavirus infections through cross-reactivity. Therefore, it is thought that in subjects with cell-mediated immunity against the antigenic virus, the growth of the causative virus is suppressed, and aggravation of the subject's coronavirus infection can be avoided.
  • the antigenic viral protein or fragment thereof is derived from the first antigenic virus
  • the risk of aggravation of the subject coronavirus infection is assessed to be high when T cell responsiveness to the antigenic protein or fragment thereof is low. good too.
  • the responsiveness to the first antigenic virus which has a different receptor from the causative virus, tends to show a negative correlation with the risk of aggravation of the target coronavirus infection.
  • the causative virus is SARS-CoV-2
  • the first antigen viruses include HCoV-OC43, HCoV-HKU1, HCoV-229E, and MERS-CoV.
  • the antigenic viral protein or fragment thereof is derived from a second antigenic virus
  • the risk of aggravation of the target coronavirus infection is assessed to be high when T-cell responsiveness to the antigenic protein or fragment thereof is high. good too.
  • Responsiveness to a second antigenic virus having the same receptor as the causative virus tends to show a positive correlation with the risk of aggravation of the target coronavirus infection.
  • the causative virus is SARS-CoV-2
  • the second antigen viruses include HCoV-NL63 and SARS-CoV.
  • the evaluation of the responsiveness of the target T cells may be performed based on a preset reference value. For example, when the responsiveness of T cells to antigenic viral proteins or fragments thereof is higher than a reference value, responsiveness may be evaluated as high. For example, when T cell responsiveness to antigenic viral proteins or fragments thereof is lower than a reference value, responsiveness may be evaluated as low.
  • the reference value may be, for example, a numerical value calculated by performing statistical processing or the like on the responsiveness measured in a healthy subject group composed of an arbitrary number of people. Alternatively, it may be a numerical value calculated by statistical processing or the like from the responsiveness measured in a group of target coronavirus infected or symptomatic persons composed of an arbitrary number of people.
  • the reference value may be, for example, a numerical value calculated from responsiveness measured in a group of subjects with mild symptoms of coronavirus infection. Alternatively, baseline values were calculated from responsiveness measured in moderate or higher patient groups for the subject coronavirus infection (e.g., moderate I, moderate II, and severe in the case of COVID-19) It may be a numerical value.
  • T cells collected from a patient in the convalescent stage of the target coronavirus infection it is preferable to use T cells collected from a patient in the convalescent stage of the target coronavirus infection.
  • the reference value is preferably set for each type of antigenic virus. For example, if the target coronavirus infection is COVID-19 and HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-HKU1, and HCoV-NL63 are used as antigenic viruses, standard values are set for each of these four antigenic viruses. can do.
  • step (a) may include the following steps (a1) and (a2). (a1) contacting a subject-derived T cell with a protein or a fragment thereof derived from a first heterospecies coronavirus (first antigenic virus) whose receptor is a molecule different from that of the causative virus; The process of making (a2) contacting a subject-derived T cell with a protein or a fragment thereof derived from a second heterospecies coronavirus (second antigenic virus) whose receptor is the same molecule as that of the causative virus; process.
  • step (b) may include the following steps (b1) to (b3).
  • (b1) measuring a first responsiveness of a subject-derived T cell to a protein or fragment thereof derived from a first heterospecies coronavirus (first antigenic virus);
  • (b2) measuring a second responsiveness of T cells from the subject to a protein or fragment thereof from a second heterogeneous coronavirus;
  • (b3) A step of evaluating the risk of aggravation of coronavirus infection based on the value of the ratio of the second responsiveness to the first responsiveness (second responsiveness/first responsiveness).
  • Step (a1) may be carried out using a protein derived from the first antigen virus or a fragment thereof.
  • step (a2) step (a) may be performed using a protein derived from the second antigen virus or a fragment thereof.
  • step (b1) the responsiveness of the subject-derived T cells induced in step (a1) may be measured.
  • the responsiveness obtained by the process (b1) be the 1st responsiveness.
  • step (b2) the responsiveness of the subject-derived T cells induced in step (a2) may be measured.
  • the responsiveness obtained by the process (b2) be the 2nd responsiveness.
  • T cell responsiveness can be measured by the methods described above.
  • T cell responsiveness is preferably measured by an ELISPOT assay.
  • T cell responsiveness may be quantified, for example, as the number of valid spots by ELISPOT assay, or as the number of valid spots index.
  • the number of effective spots is calculated as the number of spots obtained in the compartment (well) where T cells were incubated in the presence of the T cell stimulating antigen minus the number of spots in the negative control compartment (well).
  • Negative control compartments are compartments in which T cells were incubated in the absence of T cell stimulating antigen.
  • the active spots index is calculated as the number of active spots divided by the number of spots in the positive control wells.
  • a positive control compartment is a compartment in which T cells were incubated with an anti-CD3 antibody to which all T cells reacted strongly as a T cell stimulating antigen.
  • step (b3) the risk of aggravation of coronavirus infection is evaluated based on the ratio of the second responsiveness to the first responsiveness (second responsiveness/first responsiveness).
  • the ratio value (second responsiveness/first responsiveness) may be multiplied by a suitable factor.
  • the risk of aggravation can be evaluated by the aggravation risk value (Y) obtained by the following formula (1).
  • Y k(B/A) (1)
  • Y is a severity risk value
  • k is a coefficient
  • A is the first responsiveness
  • B is the second responsiveness.
  • the factor k can take a numerical value in the range 1-10, for example.
  • each of the two or more first viruses is calculated by the above formula (1), and the risk value of aggravation (Y) is calculated and added. , may yield an overall severity risk value (Y).
  • B in the formula (1) is the same value between the two or more first antigenic viruses. is preferably used.
  • the severity risk value (Y) may be obtained by the following formula (2).
  • Y k 1 (B/A 1 )+k 2 (B/A 2 )+ (2)
  • Y is the risk value of aggravation
  • k 1 and k 2 are coefficients
  • a 1 is the first response by the first antigen virus of the first type
  • B is second responsivity.
  • the coefficients k 1 and k 2 can take numerical values ranging from 1 to 10, for example.
  • addition can be performed in the same manner.
  • the causative virus is SARS-CoV-2
  • HCoV-NL63 it is preferable to use HCoV-NL63 as the second antigenic virus.
  • the severity risk value (Y) may be obtained by the following formula (I).
  • Y is a severity risk value
  • k 1 , k 2 and k 3 are coefficients
  • NL63 is T cell responsiveness to proteins or fragments thereof derived from HCoV-NL63
  • OC43 is T cell responsiveness to proteins or fragments thereof derived from HCoV-OC43
  • 229E is T cell responsiveness to proteins or fragments thereof derived from HCoV-229E.
  • the coefficients k 1 , k 2 and k 3 can take numerical values ranging from 1 to 10, for example.
  • the aggravation risk value (Y) obtained by the above formula (1), (2) or (I) shows a positive correlation with the aggravation risk of corona infection. Therefore, the risk of aggravation of the target corona infectious disease can be evaluated by the aggravation risk value (Y). For example, when the severity risk value (Y) obtained for a certain subject is higher than a preset reference value (cutoff value), the subject can be determined to have a high severity risk. When the severity risk value (Y) obtained for a certain subject is lower than a preset reference value (cutoff value), the subject can be determined to have a low severity risk.
  • the reference value may be, for example, a numerical value obtained by statistically processing the aggravation risk value (Y) calculated for a group of infected or symptomatic persons composed of an arbitrary number of people.
  • the risk of aggravation of coronavirus infection can be evaluated by a simple method. By assessing the risk of aggravation, it becomes possible to take socially and medically appropriate measures.
  • a protein or a fragment thereof derived from a different type of coronavirus (antigenic virus) from the causative virus of the subject coronavirus infection is used as the T cell stimulating antigen. Therefore, the risk of aggravation of the target coronavirus infection should be evaluated in subjects who have not been infected with the causative virus, and in subjects who have been infected with the causative virus or who have been vaccinated but have lost cell-mediated immunity to the causative virus. be able to. According to the method according to this aspect, the risk of aggravation can be evaluated even for an unknown coronavirus infection.
  • the method according to this aspect may include optional steps in addition to the steps described above.
  • an optional step for example, (c) if the subject is a person infected with the causative virus, a step of determining a treatment policy for the subject coronavirus infection based on the evaluation result of the risk of aggravation of the subject coronavirus infection; (d) Observation of the symptoms of the target coronavirus infection and treatment of the target coronavirus infection if the subject is assessed as having a high risk of aggravation of the target coronavirus infection and is infected with the causative virus. a step of taking at least one measure selected from the group; and the like.
  • the method according to this aspect may be a method for preventing aggravation of coronavirus infection.
  • the method according to this aspect may be a method of treating coronavirus infection.
  • the treatment policy for the subject coronavirus infection can be determined based on the risk of aggravation. Infected individuals assessed as having a low risk of severe disease may decide not to be aggressively treated but only observed. Patients with a high risk of severe illness may be able to avoid severe illness by carefully monitoring the progression of symptoms and providing aggressive treatment from the early stages of infection. Therefore, it may be decided to aggressively treat an infected person who is evaluated as having a high risk of severe disease from the early stage of infection.
  • a therapeutic method for a target coronavirus infection can be selected according to the type of the target coronavirus. Treatment methods include administration of antiviral agents, neutralizing antibodies, and the like.
  • antiviral drugs include molnupiravir (trade name: Lübrio Capsules), nirmatrelvir/ritonavir (trade name: Pakilovid Pack), remdesivir (trade name: Bellcry). intravenous drip infusion), dexamethasone, tocilizumab (trade name: Actemra), favipiravir (trade name: Avigan), and the like.
  • neutralizing antibodies include antibody cocktail therapy of casilibimab and imdevimab (trade name: Lonaprive Injection Set).
  • Step (d) Subject If the subject is assessed as having a high risk of aggravation of the coronavirus infection and is infected with the causative virus, careful follow-up of the symptoms from the early stage of infection and aggressive treatment should be taken to prevent aggravation. may be avoided. Therefore, those infected with a high risk of severe disease may be monitored for symptoms and/or treated for coronavirus infection. Treatment methods include those described above. In addition, admission to a hospital may be taken in preparation for follow-up observation and rapid response when the condition becomes severe.
  • the step (d) may be a step of treating the causative virus-infected person who has been determined to have a high risk of aggravation to treat the corona infection. For example, step (d) may be a step of administering an antiviral drug or a neutralizing antibody against the causative virus to a causative virus-infected person determined to have a high risk of severe disease.
  • Step (e) If a subject who has been assessed as having a high risk of aggravation of the subject coronavirus infection is not infected with the causative virus, there is a risk that the subject will become severe if infected with the causative virus. Therefore, it is conceivable to vaccinate such subjects against the targeted coronavirus infection. Acquiring immunity against the target coronavirus infection by vaccination can reduce the risk of aggravation of the target coronavirus in the subject. Step (e) may be a step of administering vaccination against the target coronavirus infectious disease to non-infected persons determined to have a high risk of aggravation.
  • a second aspect of the present disclosure is a kit for evaluating the risk of aggravation of coronavirus infection.
  • the kit according to this aspect contains a protein (antigenic virus protein) derived from a different type of coronavirus from the causative virus of the coronavirus infection, or a fragment thereof.
  • Antigenic viral proteins or fragments thereof include those mentioned above.
  • the antigenic virus is preferably a coronavirus belonging to the same genus as the causative virus and a species different from the causative virus.
  • the antigenic virus may be a different species of the genus Betacoronavirus.
  • the antigenic virus may be of the genus Alphacoronavirus.
  • the antigenic virus is a coronavirus capable of infecting a subject.
  • the causative virus is SARS-CoV-2
  • a virus belonging to the genus Betacoronavirus can be used as the antigenic virus.
  • a human coronavirus belonging to the genus Betacoronavirus (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, etc.) can be used as an antigenic virus.
  • the antigenic virus may be the first antigenic virus.
  • the causative virus is SARS-CoV-2 and the subject is a human
  • antigenic viral proteins or fragments thereof derived from HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-HKU1, or MERS-CoV can be used. can be used.
  • the antigenic virus may be a second antigenic virus.
  • the causative virus is SARS-CoV-2 and the subject is a human
  • antigenic viral proteins or fragments thereof derived from HCoV-NL63 or SARS-CoV can be used.
  • the antigenic viral protein or fragment thereof may be of one type, or of two or more types.
  • Antigenic viral proteins or fragments thereof preferably include both those derived from the first antigenic virus and those derived from the second antigenic virus.
  • the kit according to this aspect is selected from the group consisting of HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-HKU1, and MERS-CoV. It preferably contains antigenic viral proteins or fragments thereof derived from one or more species and antigenic viral proteins or fragments thereof derived from one or more species selected from the group consisting of HCoV-NL63 and SARS-CoV.
  • the kit according to this aspect contains an antigenic viral protein or fragment thereof derived from HCoV-HKU1, an antigenic viral protein or fragment thereof derived from HCoV-OC43, an antigenic viral protein or fragment thereof derived from HCoV-229E, and HCoV - antigenic viral proteins or fragments thereof derived from NL63.
  • Antigen viral proteins include S protein, N protein, M protein, and E protein, with S protein being preferred.
  • the kit according to this aspect may contain any configuration in addition to the antigenic viral protein or fragment thereof.
  • Optional components include, for example, specific binding substances for cytokines secreted by T cells in response to antigenic stimulation, solid phase carriers, chromogenic enzymes, chromogenic enzyme substrates, washing buffers, dilution buffers, instructions for use, and the like. .
  • the kit according to this aspect may contain a specific binding substance for cytokines secreted by T cells in response to antigenic stimulation.
  • a "specific binding substance” means a substance that has specific binding properties for a specific biomolecule. "Having specific binding properties” means having high binding affinity for a specific biomolecule, but very low binding affinity for other biomolecules.
  • a specific binding substance preferably has high binding to a particular biomolecule, but little binding to other biomolecules.
  • Specific binding substances for proteins include antibodies, aptamers, and the like.
  • the specific binding agent is an antibody.
  • Cytokines secreted by T cells in response to antigen stimulation include the same ones as above.
  • Specific examples of specific binding substances for cytokines include anti-IFN- ⁇ antibody, anti-IL-2 antibody, anti-IL-4 antibody, anti-IL-5 antibody, anti-IL-10 antibody, anti-IL-13 antibody, Examples include, but are not limited to, anti-perforin antibodies, anti-granzyme B antibodies, anti-TNF- ⁇ antibodies, and the like.
  • the specific binding substance may be used singly or in combination of two or more. When two or more cytokines are to be detected, specific binding substances that respectively bind to the two or more cytokines are used.
  • a specific binding substance for cytokines may be bound to a solid-phase carrier as a capturing antibody. Binding of a specific binding substance to a solid phase carrier can be performed by a known method.
  • Solid phase carriers include, for example, well plates. A specific binding substance may be attached to the well bottom of the well plate.
  • the solid phase carrier may be, for example, an ELISPOT well plate.
  • the solid phase carrier may have well bottoms composed of a PVDF membrane.
  • a specific binding substance for cytokines may be labeled with a labeling substance as a detection antibody.
  • the labeling substance may be a chromogenic enzyme or the first member of a binding pair for binding the chromogenic enzyme.
  • a specific example of a specific binding substance labeled with the first member of a binding pair is a biotin-labeled antibody.
  • the chromogenic enzyme include those similar to those described above.
  • specific examples of specific binding substances include FITC-labeled anti-human IFN- ⁇ antibodies.
  • specific examples of specific binding substances include biotin-labeled anti-human IL-2 antibodies.
  • the detection antibody may be labeled with a fluorescent dye.
  • a fluorescent dye Any known fluorescent dye can be used without particular limitation.
  • fluorescent dyes include carboxyfluorescein (FAM), 6-carboxy-4',5'-dichloro2',7'-dimethoxyfluorescein (JOE), fluorescein isothiocyanate (FITC), tetrachlorofluorescein (TET), 5′-hexachloro-fluorescein-CE phosphoramidite (HEX), phycoerythrin (PE), Cy3, Cy5, Alexa568, Alexa647, etc., but not limited to these.
  • FAM carboxyfluorescein
  • JE 6-carboxy-4',5'-dichloro2',7'-dimethoxyfluorescein
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • TET tetrachlorofluorescein
  • HEX 5′-hexachloro-fluorescein
  • the chromogenic enzyme is not particularly limited, and known enzymes can be used. Chromogenic enzymes include HRP, AP, and the like.
  • the chromogenic enzyme may be conjugated to a detection antibody. If the detection antibody is labeled with the first member of the binding pair (eg biotin), the chromogenic enzyme may be labeled with the second member of the binding pair (eg avidin or a derivative thereof). For example, if the detection antibody is a FITC-labeled anti-human IFN- ⁇ antibody, the chromogenic enzyme may be FITC-labeled HRP (FITC-HRP). For example, if the detection antibody is a biotin-labeled anti-human IL-2 antibody, the chromogenic enzyme may be streptavidin-labeled AP (Strep-Ap).
  • the chromogenic enzyme substrate can be appropriately selected according to the type of chromogenic enzyme.
  • chromogenic enzyme substrates include 3,3′-diaminobenzidine (DAB), 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB), 2,2′-azinobis[3 -ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid] (ABTS), o-phenylenediamine dihydrochloride (OPD), and the like.
  • chromogenic enzyme is AP
  • NBT nitroblue tetrazolium chloride
  • BCIP 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate
  • PNPP p-nitrophenyl phosphate
  • a kit according to this aspect may be provided as an ELISPOT assay kit.
  • the kit according to this aspect can be used to carry out the evaluation method according to the first aspect.
  • the present disclosure provides the use of an antigenic viral protein or fragment thereof for manufacturing a kit for assessing the risk of severe coronavirus infection.
  • the present disclosure provides the use of antigenic viral proteins or fragments thereof for assessing the risk of severe coronavirus infection.
  • the present disclosure provides antigenic viral proteins or fragments thereof for assessing the risk of severe coronavirus infection. Examples of antigenic viral proteins include those mentioned above, and a combination of a protein derived from a first antigenic virus and a second antigenic viral protein is preferred.
  • a method for determining the risk of aggravation of a coronavirus infection comprising: (a) subject-derived T cells are treated with a protein derived from a different type of coronavirus that is a different type of coronavirus from the causative virus of the coronavirus infection; or a fragment thereof; and (b) determining the risk of aggravation of the coronavirus infection based on the responsiveness of the T cell to the protein or fragment thereof.
  • a method for selecting a T cell-containing sample derived from a subject at high risk of aggravation of coronavirus infection comprising: (a) identifying the T cells in the T cell-containing sample as a causative virus of the coronavirus infection; (b) determining the severity of said coronavirus infection based on the responsiveness of said T cells to said proteins or fragments thereof; and selecting said T cell-containing sample from a subject at high risk of aggravation of coronavirus infection.
  • Example 1 Subjects were patients in the convalescent phase of COVID-19 infection who received treatment for COVID-19 at Tohoku University Hospital and related facilities (Kurihara Chuo Hospital, Kesennuma Municipal Hospital). Subjects were informed in advance and consent was obtained. During the recovery period after healing, about 10 mL of peripheral blood was collected in a dedicated container. Blood was collected in the same manner from a control group of healthy subjects with no history of COVID-19.
  • COVID-19 The severity of COVID-19 in subjects was determined using the “New Coronavirus Infectious Disease (COVID-19) Medical Treatment Guide, 5th Edition (Ministry of Health, Labor and Welfare)” (https://www.mhlw.go.jp/content/000785119. pdf) were classified as follows.
  • the subjects were 3 healthy subjects and 11 infected with COVID-19 (4 mild, 3 moderate I, 4 moderate II).
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the ELISPOT assay was performed by partially modifying the method described in the literature (Czerkinsky C, et al. Immunol. Methods, 1988.). Specifically, a 96-well ELISPOT plate with a PVDF membrane on the bottom of the wells was coated with a human IFN- ⁇ /IL-2 capture antibody and incubated overnight at 4°C. After washing the plate with PBS, T lymphocyte stimulating antigen and co-stimulatory anti-CD28 antibody were added and incubated at 37° C. for 20 minutes.
  • T-lymphocyte-stimulating antigens betacoronavirus (HCoV-OC43, HCoV-HKU1) spike (S) protein, SARS-CoV-2 S protein, SARS-CoV-2 S protein + nucleocapsid (N) protein
  • S betacoronavirus
  • SARS-CoV-2 S protein SARS-CoV-2 S protein + nucleocapsid
  • N nucleocapsid
  • M +membrane
  • the concentration of the T lymphocyte stimulating antigen in the above incubation was 2 ⁇ g/mL (final concentration) for the SARS-CoV-2 S protein and peptide pool.
  • the S protein of ⁇ -coronavirus (HCoV-OC43, HCoV-HKU1) was 12.5 ⁇ g/mL (final concentration).
  • PBMCs collected from 3 healthy subjects and 11 COVID-19 infected subjects were collected at 300,000/well. added. It was then incubated at 37°C for 24 hours. After washing with PBS, it was washed with 0.05% Tween/PBS. Next, IFN- ⁇ /IL-2 detection antibodies (anti-human IFN gamma (FITC) Detection Ab and anti-human IL-2 (Biotin) Detection Ab) were added and incubated at room temperature for 2 hours.
  • FITC anti-human IFN gamma
  • Biotin biotin
  • the number of reacted T lymphocytes was automatically analyzed as Spot-Forming Cells (SFC) using the Automated Immunospot Analyzer, CTL (Cellular Technologies, Cleveland, OH, USA).
  • SFC Spot-Forming Cells
  • CTL Cellular Technologies, Cleveland, OH, USA.
  • a value obtained by subtracting the number of spots in the negative control group from the counted number of spots was evaluated according to the following criteria.
  • Figure 1 shows the results of the ELISPOT assay.
  • the upper figure is a well image in the ELISPOT assay.
  • the figure below shows the evaluation results based on the above evaluation criteria. Healthy subjects did not respond to any of the S proteins of HCoV-OC43, HCoV-HKU1, and SARS-CoV-2. Among convalescent COVID patients, mild cases were moderate to strong responses to HCoV-OC43 and HCoV-HKU1. Moderate I was a weak responder. In moderate disease II, almost no responsiveness was observed.
  • Figures 2A to 2C are graphs quantifying the results of the ELISPOT assay in Figure 1. Mild cases showed a higher number of active spots for HCoV-OC43 and HCoV-HKU1 compared to moderate I and moderate II. From this result, it was confirmed that the ELISPOT assay using HCoV-OC43 and/or HCoV-HKU1 antigen proteins can evaluate the risk of severe SARS-CoV-2.
  • Example 2 ⁇ Subject> Subjects were 37 healthy individuals and 27 COVID-19 infected individuals (8 mild, 6 moderate I, 9 moderate II, 4 severe). As in Example 1, COVID-19 pre-infected subjects were treated for COVID-19 at Tohoku University Hospital and related facilities (Kurihara Central Hospital, Kesennuma Municipal Hospital). and
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • ELISPOT assay was performed using the T lymphocyte stimulating antigens shown in Table 3 in addition to the T lymphocyte stimulating antigens shown in Table 2.
  • ELISPOT assay was performed by fluorescence method. Reactivity of T lymphocytes was assessed against secreted IFN- ⁇ and IL-2, TNF- ⁇ and GranzymeB. Human IFN- ⁇ /IL-2/TNF- ⁇ /GranzymeB Four-Color FluoroSPOT Kit: hT4000F-10, CTL (Cellular Technologies, Cleveland, OH, USA) was used for the ELISPOT assay. The ELISPOT assay was performed by partially modifying the method described in the literature (Czerkinsky C, et al. Immunol. Methods, 1988).
  • a 96-well ELISPOT plate with a PVDF membrane on the well bottom was coated with a human IFN- ⁇ /IL-2/TNF- ⁇ /GranzymeB capture antibody and incubated overnight at 4°C. .
  • T lymphocyte stimulating antigen and co-stimulatory anti-CD28 antibody were added and incubated at 37° C. for 20 minutes.
  • T lymphocyte stimulating antigens in addition to the T lymphocyte stimulating antigens shown in Table 2, spike (S) proteins of alphacoronaviruses (HCoV-NL63, HCoV-229E) shown in Table 3 were used.
  • Anti-CD3 antibody was added to positive control wells instead of the T-lymphocyte-stimulating antigen.
  • T lymphocyte stimulating antigen was added to negative control wells.
  • the T lymphocyte stimulating antigen concentration in the incubation was 2 ⁇ g/mL (final concentration) for the SARS-CoV-2 S protein and peptide pools.
  • the S protein of human cold coronavirus (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, HCoV-NL63, HCoV-229E) was 12.5 ⁇ g/mL (final concentration).
  • PBMC collected from healthy subjects and COVID-19 infected subjects were added at 300,000 cells/well. It was then incubated at 37°C for 24 hours. After washing with PBS, it was washed with 0.05% Tween/PBS.
  • IFN- ⁇ /IL-2/TNF- ⁇ /GranzymeB detection antibodies anti-human IFN- ⁇ (FITC) Detection Ab, Anti-human IL-2 (Hapten2) Detection Ab, Anti-human TNF- ⁇ ( Hapten1) Detection Ab and Anti-human Granzyme B (Biotin) Detection Ab
  • FITC fluorescent-labelectron-labelectron-activated cytoplasmic cytoplasmin-associated cytoplasmin-associated cytoplasmin-associated cytoplasmin-associated cytoplasmin-associated fibroblasts, and anti-human TNF- ⁇ (Biotin) Detection Ab
  • FITC anti-human IFN- ⁇
  • Hapten2 Anti-human IL-2 (Hapten2) Detection Ab
  • Anti-human TNF- ⁇ Hapten1 Detection Ab
  • Anti-human Granzyme B Biotin
  • T lymphocytes After washing with distilled water, it was naturally dried in a clean bench for 24 hours. Evaluation of the number of reacted T lymphocytes was automatically analyzed as Spot-Forming Cells (SFC) using an automated immunospot analyzer, CTL (Cellular Technologies, Cleveland, OH, USA).
  • SFC Spot-Forming Cells
  • HCoV-HKU1 S protein HKU1-S
  • HCoV-OC43 S protein OC43-S
  • HCoV-NL63 S protein NL63-S
  • HCoV-229E S protein 229E-S
  • SARS-CoV-2 S protein CoV2-S
  • SARS-CoV-2 peptide pool CoV2 -all
  • Figures 6A to 8B show the results when moderate I, moderate II, and severe are summarized as "moderate or higher". In both cases, the above tendency became more pronounced.
  • NL63, HKU1, OC43, and 229E are T lymphocyte stimulating antigens, when ELISPOT assay is performed using NL63-S, HKU1-S, OC43-S, and 229E-S, respectively. is the effective number of spots index of .
  • k 1 , k 2 , and k 3 are coefficients.
  • FIG. 9 shows a graph showing the Y values obtained by the above formula (1) for groups of healthy subjects, mild cases, and moderate to severe cases.
  • the Y value was significantly higher in moderate to severe cases than in mild cases.
  • the Y value cutoff value (X) was set to 20, the following results were obtained.
  • Example 3 Subjects were vaccinated individuals who received the Pfizer vaccine (BNT162b2). There were 28 subjects. Blood was collected before vaccination and after vaccination (generally 6 to 9 weeks later).
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • ELISPOT assay Preparation of PBMC and ELISPOT assay were performed in the same manner as in Example 2.
  • FIG. 10A to FIG. 12B respectively show the results of ELISPOT assay using all (FIG. 12B). In the figure, "Pre” indicates before vaccination and "Post” indicates after vaccination.
  • FIG. 14A to FIG. 15B show the results of analyzing the correlation between known COVID-19 exacerbation risk factors and exacerbation risk values (Y). Severity risk value (Y) was not significantly correlated with age (Figure 14A), BMI ( Figure 14B), smoking index BI (Figure 15A), or smoking history (Figure 15B).
  • a method for evaluating the risk of aggravation of coronavirus infection and a kit for evaluating the risk of aggravation of coronavirus infection, which can easily determine the risk of aggravation of coronavirus infection are provided.
  • the evaluation method and evaluation kit according to the present invention can be applied to the evaluation of the risk of aggravation of COVID-19. It is also applicable to future unknown coronavirus infections.

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Abstract

コロナウイルス感染症の重症化リスクの評価方法であって、（ａ）対象由来のＴ細胞を、前記コロナウイルス感染症の原因ウイルスとは異なる種類のコロナウイルスである他種コロナウイルスに由来するタンパク質またはその断片に接触させる工程と、（ｂ）前記タンパク質またはその断片に対する前記Ｔ細胞の応答性に基づいて、前記コロナウイルス感染症の重症化リスクを評価する工程と、を含む、コロナウイルス感染症の重症化リスクの評価方法。また、前記コロナウイルス感染症の原因ウイルスとは異なる種類のコロナウイルスである他種コロナウイルスに由来するタンパク質またはその断片を含む、コロナウイルス感染症の重症化リスク評価キット。

Description

コロナウイルス感染症の重症化リスクの評価方法、およびコロナウイルス感染症の重症化リスク評価キット
　本発明は、コロナウイルス感染症の重症化リスクの評価方法、およびコロナウイルス感染症の重症化リスク評価キットに関する。
　本願は、２０２１年７月２９日に、日本に出願された特願２０２１－１２４３９０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　ＣＯＶＩＤ－１９は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を原因ウイルスとするウイルス感染症である。ＣＯＶＩＤ－１９症例のうち、重症例は、最大約２０％（中等症～重症が１４％、重篤が５％、死亡が２％）である。高齢者、ならびに高血圧、糖尿病、心血管疾患、慢性呼吸器疾患および癌などの基礎疾患を有する症例等で、重症化リスクが高く、概ね６～１４％が重症化するとされている。ＣＯＶＩＤ－１９流行地域では、重症患者、高齢者および基礎疾患を有する患者が、それぞれＩＣＵおよび一般病床を占拠し、医療崩壊を招いている。
　最近、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞が、それぞれ７０％および１００％のＣＯＶＩＤ－１９回復期患者において、検出されたことが報告されている（非特許文献１）。非特許文献１では、非感染者の約４０～６０％において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞が検出されたことも報告されている。
Alba Grifoni et al., Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals. Cell. 2020 Jun 25; 181(7): 1489-1501.e15.
　ＣＯＶＩＤ－１９が重症化しやすい者と重症化しにくい者とを事前に弁別できれば、積極的で効率的な医療および行政の介入を行うことが可能である。例えば、感染初期に重症化リスクを判定し、積極的な治療的介入を行うことで、重症化を抑制できる可能性がある。また、ワクチン普及後も、免疫能の維持を定期的に確認することで、医療と経済のバランスを図る指標となり得る。現在は、年齢および基礎疾患の有無で重症化リスクが判断されるのみであり、ＣＯＶＩＤ－１９の重症化リスクを評価できる検査法は存在しない。そのため、ＣＯＶＩＤ－１９の重症化リスクを簡易に判定可能な検査法の開発が求められている。
　ワクチンの普及によりＣＯＶＩＤ－１９の流行が克服された場合でも、将来、新たなコロナウイルス感染症が蔓延する可能性がある。そのような新規コロナウイルス感染症に対しても、重症化しやすい者と重症化しにくい者とを事前に弁別できれば、効率的な医療および行政の介入が可能になる。
　そこで、本発明は、コロナウイルス感染症の重症化リスクを簡易に判定可能な、コロナウイルス感染症の重症化リスクの評価方法、およびコロナウイルス感染症の重症化リスク評価キットを提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］コロナウイルス感染症の重症化リスクの評価方法であって、（ａ）対象由来のＴ細胞を、前記コロナウイルス感染症の原因ウイルスとは異なる種類のコロナウイルスである他種コロナウイルスに由来するタンパク質またはその断片に接触させる工程と、（ｂ）前記タンパク質またはその断片に対する前記Ｔ細胞の応答性に基づいて、前記コロナウイルス感染症の重症化リスクを評価する工程と、を含む、コロナウイルス感染症の重症化リスクの評価方法。
［２］前記タンパク質またはその断片が、前記原因ウイルスが受容体とする分子とは異なる分子を受容体とする第１の他種コロナウイルスに由来し、前記（ｂ）の工程が、前記タンパク質またはその断片に対する前記Ｔ細胞の応答性が低い場合に、前記コロナウイルス感染症の重症化リスクが高いと評価する工程である、［１］に記載のコロナウイルス感染症の重症化リスクの評価方法。
［３］前記タンパク質またはその断片が、前記原因ウイルスが受容体とする分子と同じ分子を受容体とする第２の他種コロナウイルスに由来し、前記（ｂ）の工程が、前記タンパク質またはその断片に対する前記Ｔ細胞の応答性が高い場合に、前記コロナウイルス感染症の重症化リスクが高いと評価する工程である、［１］に記載のコロナウイルス感染症の重症化リスクの評価方法。
［４］前記工程（ａ）が、（ａ１）前記Ｔ細胞を、前記原因ウイルスが受容体とする分子とは異なる分子を受容体とする第１の他種コロナウイルスに由来するタンパク質またはその断片に接触させる工程と、（ａ２）前記Ｔ細胞を、前記原因ウイルスが受容体とする分子と同じ分子を受容体とする第２の他種コロナウイルスに由来するタンパク質またはその断片に接触させる工程と、を含み、前記（ｂ）の工程が、（ｂ１）前記第１の他種コロナウイルスに由来するタンパク質またはその断片に対する前記Ｔ細胞の第１の応答性を測定する工程と、（ｂ２）前記第２の他種コロナウイルスに由来するタンパク質またはその断片に対する前記Ｔ細胞の第２の応答性を測定する工程と、（ｂ３）前記第１の応答性に対する前記第２の応答性の比の値（第２の応答性／第１の応答性）に基づいて、前記コロナウイルス感染症の重症化リスクを評価する工程と、を含む、［１］に記載のコロナウイルス感染症の重症化リスクの評価方法。
［５］前記原因ウイルスおよび前記タンパク質またはその断片が由来する前記コロナウイルスが、ベータコロナウイルス属またはアルファコロナウイルス属である、［１］～［４］のいずれか１つに記載のコロナウイルス感染症の重症化リスクの評価方法。
［６］前記原因ウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、［１］～［５］のいずれか１つに記載のコロナウイルス感染症の重症化リスクの評価方法。
［７］コロナウイルス感染症の重症化リスク評価キットであって、前記コロナウイルス感染症の原因ウイルスとは異なる種類のコロナウイルスである他種コロナウイルスに由来するタンパク質またはその断片を含む、コロナウイルス感染症の重症化リスク評価キット。
［８］Ｔ細胞が抗原刺激に応答して分泌するサイトカインに対する特異的結合物質をさらに含む、［７］に記載のコロナウイルス感染症の重症化リスク評価キット。
［９］固相担体に結合された前記特異的結合物質と、標識物質で標識された前記特異的結合物質とを含む、［８］に記載のコロナウイルス感染症の重症化リスク評価キット。
［１０］前記サイトカインがインターフェロンγ、インターロイキン２、及び腫瘍壊死因子アルファからなる群より選択される少なくとも１種である、［８］または［９］に記載のコロナウイルス感染症の重症化リスク評価キット。
［１１］前記タンパク質またはその断片が、前記原因ウイルスが受容体とする分子とは異なる分子を受容体とする第１の他種コロナウイルスに由来するタンパク質またはその断片と、前記原因ウイルスが受容体とする分子と同じ分子を受容体とする第２の他種コロナウイルスに由来するタンパク質またはその断片と、を含む、［７］～［１０］のいずれか１つに記載のコロナウイルス感染症の重症化リスク評価キット。
［１２］前記原因ウイルスおよび前記タンパク質またはその断片が由来する前記コロナウイルスが、ベータコロナウイルス属またはアルファコロナウイルス属である、［７］～［１１］のいずれか１つに記載のコロナウイルス感染症の重症化リスク評価キット。
［１３］前記原因ウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、［７］～［１２］のいずれか１つに記載のコロナウイルス感染症の重症化リスク評価キット。
　本発明によれば、コロナウイルス感染症の重症化リスクを簡易に判定可能な、コロナウイルス感染症の重症化リスクの評価方法、およびコロナウイルス感染症の重症化リスク評価キットが提供される。
ＣＯＶＩＤ－１９回復期患者及び健常者の血液から単離したＰＢＭＣを用いたＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。 図１におけるＨＫＵ１－Ｓタンパク質を用いたＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を定量化したグラフを示す。 図１におけるＯＣ４３－Ｓタンパク質を用いたＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を定量化したグラフを示す。 図１におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓタンパク質を用いたＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を定量化したグラフを示す。 Ｔリンパ球刺激抗原としてＨＣｏＶ－ＨＫＵ１のＳ蛋白（ＨＫＵ１－Ｓ）を用いてＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った結果を示す。 Ｔリンパ球刺激抗原としてＨＣｏＶ－ＯＣ４３のＳ蛋白（ＯＣ４３－Ｓ）を用いてＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った結果を示す。 Ｔリンパ球刺激抗原としてＨＣｏＶ－ＮＬ６３のＳ蛋白（ＮＬ６３－Ｓ）を用いてＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った結果を示す。 Ｔリンパ球刺激抗原としてＨＣｏＶ－２２９ＥのＳ蛋白（２２９Ｅ－Ｓ）を用いてＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った結果を示す。 Ｔリンパ球刺激抗原としＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ蛋白（ＣｏＶ２－Ｓ）を用いてＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った結果を示す。 Ｔリンパ球刺激抗原としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のペプチドプール（ＣｏＶ２－ａｌｌ）を用いてＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った結果を示す。 図３Ａにおける中等症Ｉ、中等症ＩＩ及び重症の結果を、「中等症以上」としてまとめて示したグラフである。 図３Ｂにおける中等症Ｉ、中等症ＩＩ及び重症の結果を、「中等症以上」としてまとめて示したグラフである。 図４Ａにおける中等症Ｉ、中等症ＩＩ及び重症の結果を、「中等症以上」としてまとめて示したグラフである。 図４Ｂにおける中等症Ｉ、中等症ＩＩ及び重症の結果を、「中等症以上」としてまとめて示したグラフである。 図５Ａにおける中等症Ｉ、中等症ＩＩ及び重症の結果を、「中等症以上」としてまとめて示したグラフである。 図５Ｂにおける中等症Ｉ、中等症ＩＩ及び重症の結果を、「中等症以上」としてまとめて示したグラフである。 後述の式（１）により算出した重症化リスク値（Ｙ）を、健常者、軽症例、及び中等症以上の症例に区分して示したグラフである。 ワクチン接種前（Ｐｒｅ）及びワクチン接種後（Ｐｏｓｔ）に、Ｔリンパ球刺激抗原としてＨＫＵ１－Ｓを用いて、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った結果を示す。 ワクチン接種前（Ｐｒｅ）及びワクチン接種後（Ｐｏｓｔ）に、Ｔリンパ球刺激抗原としてＯＣ４３－Ｓを用いて、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った結果を示す。 ワクチン接種前（Ｐｒｅ）及びワクチン接種後（Ｐｏｓｔ）に、Ｔリンパ球刺激抗原としてＨＣｏＶ－ＮＬ６３を用いて、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った結果を示す。 ワクチン接種前（Ｐｒｅ）及びワクチン接種後（Ｐｏｓｔ）に、Ｔリンパ球刺激抗原として２２９Ｅ－Ｓを用いて、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った結果を示す。 ワクチン接種前（Ｐｒｅ）及びワクチン接種後（Ｐｏｓｔ）に、Ｔリンパ球刺激抗原としてＣｏＶ２－Ｓを用いて、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った結果を示す。 ワクチン接種前（Ｐｒｅ）及びワクチン接種後（Ｐｏｓｔ）に、Ｔリンパ球刺激抗原としてＣｏＶ２－ａｌｌを用いて、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った結果を示す。 ワクチン接種前（Ｐｒｅ）及びワクチン接種後（Ｐｏｓｔ）の重症化リスク値（Ｙ）を示す散布図である。 ワクチン接種前（Ｐｒｅ）及びワクチン接種後（Ｐｏｓｔ）における重症化リスク値（Ｙ）の変化を示す。 重症化リスク値（Ｙ）と年齢との相関を解析した結果を示す。 重症化リスク値（Ｙ）とＢＭＩとの相関を解析した結果を示す。 重症化リスク値（Ｙ）と喫煙指数ＢＩとの相関を解析した結果を示す。 重症化リスク値（Ｙ）と喫煙歴との相関を解析した結果を示す。 実施例２の被験者において、重症度と年齢との相関を解析した結果を示す。 実施例２の被験者において、重症度とＢＭＩとの相関を解析した結果を示す。 実施例２の被験者において、重症度と喫煙指数ＢＩとの相関を解析した結果を示す。 実施例２の被験者において、重症度と喫煙歴との相関を解析した結果を示す。
［定義］
　「を含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を含んでいてもよいことを意味する。「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｏｆ）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を含まないことを意味する。「から本質的になる」（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ　ｏｆ）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を特別な機能を発揮する態様（発明の効果を完全に喪失させる態様など）では含まないことを意味する。本明細書において、「を含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）と記載する場合、「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｏｆ）態様、及び「から本質的になる」（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ　ｏｆ）態様を包含する。
　タンパク質、ペプチド、及び細胞は、単離されたものであり得る。「単離された」とは、天然状態又は他の成分から分離された状態を意味する。「単離された」ものは、他の成分を実質的に含まないものであり得る。「他の成分を実質的に含まない」とは、単離された成分に含まれる他の成分の含有量が無視できる程度であることを意味する。単離された成分に含まれる他の成分の含有量は、例えば、１０質量％以下、５質量％以下、４質量％以下、３質量％以下、２質量％以下、１質量％以下、０．５質量％以下、又は０．１質量％以下であり得る。本明細書に記載されるタンパク質、ペプチド、及び細胞は、単離されたタンパク質、単離されたペプチド、及び単離された細胞であり得る。
　「コロナウイルス」とは、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスをいう。コロナウイルス科のウイルスは、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスであり、エンベロープを有する。ウイルスの分類は、例えば、国際ウイルス分類委員会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ　ｏｎ　Ｔａｘｏｎｏｍｙ　ｏｆ　Ｖｉｒｕｓｅｓ：ＩＣＴＶ）の分類による。コロナウイルスは、ウイルス分類学上、ニドウイルス属コロナウイルス科に分類される。コロナウイルス科は、さらにコロナウイルス亜科（オルトコロナウイルス亜科）およびトロウイルス亜科に分けられる。コロナウイルス亜科は、アルファ（α）コロナウイルス属、ベータ（β）コロナウイルス属、ガンマ（γ）コロナウイルス属、およびデルタ（δ）コロナウイルス属の４つの属にさらに分類される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ベータコロナウイルス属に分類される。４種類のヒト風邪コロナウイルスのなかでは、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１およびＨＣｏＶ－ＯＣ４３が、ベータコロナウイルス属に分類される。残りのヒト風邪コロナウイルスであるＨＣｏＶ－２２９ＥおよびＨＣｏＶ－ＮＬ６３は、アルファコロナウイルス属に分類される（El-Sayed A, et al. Environ Sci Pollut Res Int. 2021 Apr;28(16):19589-19600）。アミノ酸配列の相同性の比較では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、同じベータコロナウイルス属であるＨＣｏＶ－ＨＫＵ１とは７５．７％、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３とは７４．８％と高い相同性がある。これに対し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、アルファコロナウイルス属であるＨＣｏＶ－２２９Ｅとは６４．９％、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３とは５６．３％と相同性が低い（Cueno ME, et al. Front Med (Lausanne). 2021 Jan 14;7:594439.）。相同性が高いと細胞性免疫学的に交差反応性が高くなることが期待できる。
　一実施形態において、コロナウイルスはヒトコロナウイルスである。「ヒトコロナウイルス」とは、ヒトに感染するコロナウイルスをいう。ヒトコロナウイルスとしては、アルファコロナウイルス属（Ａｌｐｈａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）のＨＣｏＶ－２２９ＥおよびＨＣｏＶ－ＮＬ６３；ならびにベータコロナウイルス属（Ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）のＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２等が挙げられる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、アルファ株、ベータ株、ガンマ株、デルタ株、ラムダ株、ミュー株、イプシロン株、イータ株、イオタ株、カッパ株、およびオミクロン株等の既存の変異株、ならびに将来発生し得る変異株を包含する。
　「コロナウイルス感染症」とは、コロナウイルスの感染によって引き起こされる疾患をいう。例えば、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、およびＨＣｏＶ－ＯＣ４３は、風邪を引き起こす。ＳＡＲＳ－ＣｏＶは、重症急性呼吸器症候群（Ｓｅｖｅｒｅ　ａｃｕｔｅ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＳＡＲＳ）を引き起こす。ＭＥＲＳ－ＣｏＶは、中東呼吸器症候群（Ｍｉｄｄｌｅ　Ｅａｓｔ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＭＥＲＳ）を引き起こす。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）を引き起こす。
　「コロナウイルス感染症の重症化リスク」とは、コロナウイルス感染症の症状が進行するリスクをいう。コロナウイルス感染症の重症化リスクは、例えば、対象がコロナウイルス感染者である場合、当該コロナウイルスの症状が進行し、医療上の積極的な介入が必要となる状況になる可能性の定性的指標となり得る。コロナウイルス感染症の重症化リスクは、例えば、対象がコロナウイルス非感染者である場合、前記対象がコロナウイルスに感染したときに当該コロナウイルスの症状が進行し、医療上の積極的な介入が必要となる状況になる可能性の定性的指標となり得る。コロナウイルス感染症の重症化リスクは、例えば、対象がコロナウイルスに感染した場合に、感染症の進行に伴う各種症状を発症するリスクであってもよい。コロナウイルス感染症の進行に伴って発症する症状としては、例えば、呼吸困難、肺炎、低酸素症、呼吸不全、急性呼吸窮迫症候群、急性肺障害、敗血症、および多臓器不全等が挙げられる。コロナウイルス感染症がＣＯＶＩＤ－１９である場合、重症化リスクは、中等症以上（例えば、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）診療の手引き・第５版（厚生労働省）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｈｌｗ．ｇｏ．ｊｐ／ｃｏｎｔｅｎｔ／０００７８５１１９．ｐｄｆ）による中等症Ｉ以上、中等症ＩＩ以上または重症以上）となるリスクであってもよい。前記新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）診療の手引き・第５版によれば、ＣＯＶＩＤ－１９の重症度は、以下のように分類される。
　軽症：酸素飽和度（ＳｐＯ２）≧９６％で、呼吸器症状なし、または、咳のみで呼吸困難なし。いずれの場合であっても肺炎所見を認めない。
　中等症Ｉ（呼吸不全なし）：９３％＜ＳｐＯ２＜９６％で、呼吸困難，肺炎所見を認める。
　中等症ＩＩ（呼吸不全あり）：ＳｐＯ２≦９３％で、酸素投与が必要。
　重症：ＩＣＵに入室、または人工呼吸器が必要。
　重症化リスクは、対象がＣＯＶＩＤ－１９罹患後の治癒者である場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株の出現により、将来、再びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染してＣＯＶＩＤ－１９を発症し、重症化するリスクであってもよい。
　重症化リスクは、対象がＣＯＶＩＤ－１９罹患後の治癒者である場合、対象の免疫記憶の低下により、将来、再びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染してＣＯＶＩＤ－１９を発症し、重症化するリスクであってもよい。
　対象がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＰＣＲ検査におけるＰＣＲ陽性の無症状者である場合、ＣＯＶＩＤ－１９の発症約１週後に重症化に至るか自然治癒するかのどちらかの経過をたどることが多い。この場合、重症化リスクは、ＣＯＶＩＤ－１９を発症して重症化に至るリスクであってもよい。
　重症化リスクは、対象がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のワクチン接種者である場合、ワクチン低感受性のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株の出現により、将来、再びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染してＣＯＶＩＤ－１９を発症し、重症化するリスクであってもよい。
　重症化リスクは、対象がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のワクチン接種者である場合、対象におけるワクチン効果の減弱とともに、将来、再びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染してＣＯＶＩＤ－１９を発症し、重症化するリスクであってもよい。
　「抗体」とは、抗原結合活性を有する免疫グロブリンを意味する。抗体は、抗原結合活性を有していれば、インタクトな抗体に限定されず、抗原結合断片であってもよい。本明細書において、「抗体」という用語は、抗原結合断片を包含する。「抗原結合断片」とは、抗体の一部を含むポリペプチドであって、元の抗体の抗原結合性を維持しているポリペプチドである。抗原結合断片は、元の抗体の６つの相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）を全て含むものが好ましい。すなわち、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を全て含むことが好ましい。抗原結合断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２等が挙げられる。
　抗体は、いずれの生物に由来するものであってもよい。抗体が由来する生物としては、例えば、哺乳類（ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、イヌ等）、鳥類（ニワトリ、ダチョウ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　抗体は、免疫グロブリンのいずれのクラス及びサブクラスであってもよい。抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。
　抗体は、免疫法、ハイブリドーマ法、ファージディスプレイ法等の公知の方法により作製することができる。
　「結合対」とは、互いに結合する２つの分子（１対の分子）をいう。結合対の「第１要素」とは、結合対を構成する１対の分子のうちの一方の分子をいう。結合対の「第２要素」とは、結合対を構成する１対の分子のうちの他方の分子をいう。結合対の例としては、例えば、ビオチン若しくはその誘導体及びアビジン若しくはその誘導体（ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等）等が挙げられる。
　「受容体」とは、ウイルスが細胞に侵入する際に結合する分子をいう。受容体は、通常、ウイルス感染の対象となる宿主細胞の細胞表層に存在する。コロナウイルスは、スパイクタンパク質で宿主細胞の細胞表層に存在する受容体に結合し、宿主細胞に感染すると考えられている。アルファコロナウイルス及びベータコロナウイルスの主な種の受容体を表１に示す。表１中、ＡＰＮ１はａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ　Ｎを表し、ＡＣＥ２はａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　ｃｏｖｅｒｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ　２を表し、ＤＰＰ４はｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ　ｐｅｐｔｉｄａｓｅ－４を表す。
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　ＨＣｏＣ－ＮＬ６３及びＳＡＲＳ－ＣｏＶは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と同じ分子（すなわち、ＡＣＥ２）を受容体としている。
　ＨＣｏＣ－２２９Ｅ、ＨＣｏＣ－ＯＣ４３、ＨＣｏＣ－ＨＫＵ１、及びＭＥＲＳ－ＣｏＶは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とは異なる分子を受容体としている。
［コロナウイルス感染症の重症化リスクの評価方法］
　本開示の第１の態様は、コロナウイルス感染症の重症化リスクの評価方法である。本態様にかかる方法は、下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含む。
　（ａ）対象由来のＴ細胞を、前記コロナウイルス感染症の原因ウイルスとは異なる種類のコロナウイルスである他種コロナウイルスに由来するタンパク質またはその断片に接触させる工程。
　（ｂ）前記タンパク質又はその断片に対する前記Ｔ細胞の応答性に基づいて、前記コロナウイルス感染症の重症化リスクを評価する工程。
　一実施形態において、本態様にかかる評価方法は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの手法を用いて実施することができる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおけるＴ細胞刺激抗原としては、重症化リスクの評価対象であるコロナウイルス感染症とは異なる種類のコロナウイルスである他種コロナウイルスに由来するタンパク質またはその断片を用いることができる。本態様にかかる評価方法は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで行われる方法である。
＜工程（ａ）＞
　工程（ａ）では、対象由来のＴ細胞を、コロナウイルス感染症の原因ウイルスとは異なる種類のコロナウイルスである他種コロナウイルスに由来するタンパク質又はその断片に接触させる。
（対象）
　「対象」とは、コロナウイルス感染症の重症化リスクの評価対象となる個体をいう。対象は、コロナウイルス感染症に罹患する動物であれば、特に限定されない。対象としては、ヒト、ヒト以外の哺乳動物が挙げられる。ヒト以外の哺乳動物としては、例えば、サル、チンパンジー、ゴリラ、マーモセット等の霊長類；マウス、モルモット、ハムスター、ラット等のげっ歯類；イヌ、ネコ等の食肉目等が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、対象は、ヒトである。
　対象は、重症化リスク評価の対象となるコロナウイルス感染症（以下、「対象コロナウイルス感染症」という）の原因ウイルス（以下、単に「原因ウイルス」ともいう）の感染者であってもよく、非感染者であってもよい。「感染者」とは、原因コロナウイルスが検出される状態にある者をいう。「非感染者」とは、原因コロナウイルスが検出されない者をいう。コロナウイルスの検出は、対象から採取された生体試料（唾液、鼻腔ぬぐい液、鼻咽頭ぬぐい液等）を用いて、公知の方法（ＰＣＲ法、抗原法等）により行うことができる。
　対象が、原因コロナウイルス感染者である場合、原因コロナウイルスの感染初期であることが好ましい。感染初期に重症化リスクを評価することにより、対象が、対象コロナウイルス感染症を発症し、その症状が重症化するかを予測することができる。その結果、適切な治療的介入を行うことができる。
　非感染者の重症化リスクを評価することにより、対象が原因ウイルスに感染した場合に、対象コロナウイルス感染症の症状が重症化するかを予測することができる。その結果、ワクチン接種等の適切な防御的介入を行うことができる。
　対象は、対象コロナウイルス感染症の発症者であってもよく、非発症者であってもよい。「発症者」とは、原因コロナウイルスに感染し、対象コロナウイルス感染症の１つ以上の症状を発症している者をいう。「非発症者」とは、原因コロナウイルスに感染し、対象コロナウイルス感染症の症状を発症していない者をいう。
　対象が、対象コロナウイルス感染症発症者である場合、コロナウイルス感染症の発症初期であることが好ましい。発症初期に重症化リスクを評価することにより、対象において、対象コロナウイルス感染症の症状が重症化するかを予測することができる。その結果、適切な治療的介入を行うことができる。
　対象が、対象コロナウイルス感染症の非発症者であって、原因ウイルス感染者である場合、重症化リスクを評価することにより、対象において、対象コロナウイルス感染症を発症し、その症状が重症化するかを予測することができる。その結果、適切な治療的介入を行うことができる。
　対象は、対象コロナウイルス感染症の既感染者であってもよく、未感染者であってもよい。「既感染者」とは、原因ウイルスに１度以上感染したことがある者であって、対象コロナウイルス感染症が治癒している者をいう。「未感染者」とは、原因ウイルスに１度も感染したことがない者をいう。
　既感染者の重症化リスクを評価することにより、対象が原因ウイルスに再度感染した場合に、対象コロナウイルス感染症を発症し、その症状が重症化するかを予測することができる。その結果、ワクチン接種等の適切な防御的介入を行うことができる。
　未感染者の重症化リスクを評価することにより、対象が原因ウイルスに感染した場合に、対象コロナウイルス感染症を発症し、その症状が重症化するかを予測することができる。その結果、ワクチン接種等の適切な防御的介入を行うことができる。
　対象は、対象コロナウイルス感染症のワクチン接種を受けた者（ワクチン接種者）であってもよく、ワクチン未接種者であってもよい。
　ワクチン接種者の重症化リスクを評価することにより、ワクチン接種により、対象コロナウイルス感染症の重症化を回避できる程度の免疫が獲得できたかを評価することができる。その結果、再度のワクチン接種等の適切な防御的介入を行うことができる。
　ワクチン未接種者の重症化リスクを評価することにより、対象が、ワクチン接種によらずに対象コロナウイルス感染症の重症化を回避できる程度の免疫を有しているかを評価することができる。その結果、ワクチン接種等の適切な防御的介入を行うことができる。
（対象のＴ細胞）
　対象のＴ細胞は、対象の血液から、公知の方法により、単離することができる。例えば、密度勾配遠心法により、血液から、Ｔ細胞を含む末梢血単核球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　Ｂｌｏｏｄ　Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　Ｃｅｌｌｓ；ＰＢＭＣ）画分を分離することができる。ＰＢＭＣは、Ｔ細胞（ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞等）のほか、樹状細胞、単球・マクロファージ、Ｂ細胞等の抗原提示細胞を含んでいる。工程（ａ）では、対象のＴ細胞を含む細胞集団として、ＰＢＭＣを用いてもよい。
　あるいは、Ｔ細胞マーカー（ＣＤ８、ＣＤ４等）に特異的に結合する抗体等を用いて、ＰＢＭＣからＴ細胞を単離してもよい。一実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞からなる群より選択される少なくとも１種を含む。一実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の両方を含む。
（他種コロナウイルスに由来するタンパク質またはその断片）
　「他種コロナウイルス」は、原因ウイルスとは異なる種類のコロナウイルスである。他種コロナウイルス（以下、「抗原ウイルス」ともいう）は、コロナウイルス科に属するウイルスであって、原因ウイルスとは異なる種類のコロナウイルスであれば、特に限定されない。一実施形態において、抗原ウイルスは、原因ウイルスとは異なる種に属するコロナウイルスである。一実施形態において、抗原ウイルスは、原因ウイルスと同じ属に属し、且つ原因ウイルスと異なる種に属するコロナウイルスである。例えば、原因ウイルスがベータコロナウイルス属である場合、抗原ウイルスはベータコロナウイルス属の異なる種であってもよい。抗原ウイルスはアルファコロナウイルス属であってもよい。抗原ウイルスは、対象に感染可能なコロナウイルスであることが好ましい。
　例えば、原因ウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である場合、抗原ウイルスとして、ベータコロナウイルス属のウイルスを用いることができる。例えば、原因ウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり、対象がヒトである場合、抗原ウイルスとして、ベータコロナウイルス属のヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１等）を用いることができる。
　抗原ウイルスは、原因ウイルスが受容体とする分子とは異なる分子を受容体とするコロナウイルス（以下、「第１の抗原ウイルス」又は「第１の他種コロナウイルス」ともいう）であってもよい。例えば、原因ウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり、対象がヒトである場合、抗原ウイルスとして、ＡＣＥ２以外の分子を受容体とするコロナウイルスを用いることができる。そのようなコロナウイルスとしては、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ等が挙げられる。
　抗原ウイルスは、原因ウイルスが受容体とする分子と同じ分子を受容体とするコロナウイルス（以下、「第２の抗原ウイルス」又は「第２の他種コロナウイルス」ともいう）であってもよい。例えば、原因ウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり、対象がヒトである場合、抗原ウイルスとして、ＡＣＥ２を受容体とするコロナウイルスを用いることができる。そのようなコロナウイルスとしては、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ等が挙げられる。
　抗原ウイルスは、１種のみを用いてもよく、２種以上を用いてもよい。抗原ウイルスとしては、第１の抗原ウイルス及び第２の抗原ウイルスの両方を用いることが好ましい。
　第１の抗原ウイルスとしては、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、及びＭＥＲＳ－ＣｏＶからなる群より選択される１種以上を用いることが好ましく、２種以上を用いることがより好ましく、３種以上を用いることがさらに好ましい。第１の抗原ウイルスとしては、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１の全てを用いることが好ましい。
　第２の抗原ウイルスとしては、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶからなる群より選択される１種以上を用いることが好ましい。第２の抗原ウイルスとしては、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３を用いることが好ましい。
　抗原ウイルスに由来するタンパク質またはその断片は、Ｔ細胞刺激抗原として用いられる。「抗原ウイルスに由来するタンパク質」（以下、「抗原ウイルスタンパク質」ともいう）とは、抗原ウイルスが有するタンパク質または抗原ウイルスのプロウイルスにより発現されるタンパク質をいう。抗原ウイルスタンパク質としては、例えば、スパイクタンパク質（Ｓ蛋白）、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ蛋白）、膜タンパク質（Ｍ蛋白）、エンベロープタンパク質（Ｅ蛋白）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）等が挙げられる。
　抗原ウイルスタンパク質は、受容体に結合するタンパク質を用いることが好ましい。原因ウイルスと受容体が同じ抗原ウイルスに対する免疫記憶は、原因ウイルスの感染に際し、過剰な免疫応答を誘導し、原因ウイルスによるコロナウイルス感染症の重症化を招く可能性がある。コロナウイルスは、通常、スパイクタンパク質（Ｓ蛋白）により受容体に結合する。そのため、抗原ウイルスタンパク質としては、Ｓ蛋白を用いることが好ましい。
　抗原ウイルスタンパク質の断片は、抗原ウイルスタンパク質のアミノ酸配列の一部を有する限り特に限定されない。抗原ウイルスタンパク質の断片は、Ｔ細胞の活性化が可能な程度の大きさを有することが好ましい。例えば、抗原ウイルスタンパク質の断片は、８アミノ酸以上、９アミノ酸以上、又は１０アミノ酸以上の抗原ウイルスタンパク質の断片であってもよい。一実施形態において、抗原ウイルスタンパク質の断片は、抗原ウイルスタンパク質のＴ細胞エピトープを含む。
　抗原ウイルスタンパク質は、抗原ウイルスに対する細胞性免疫を誘導できる限り、改変されたものであってもよい。例えば、抗原ウイルスタンパク質は、天然の抗原ウイルスが有するタンパク質のアミノ酸配列において、１個又は数個（例えば、２～２０個、２～１５個、２～１０個、２～５個、２～４個、２個又は３個）のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　抗原ウイルスタンパク質またはその断片は、抗原ウイルスタンパク質のアミノ酸配列に基づいて合成してもよい。あるいは、抗原ウイルスタンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドを用いて、細胞または無細胞合成系により合成してもよい。抗原ウイルスタンパク質のアミノ酸配列または遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等の配列データベースから取得することができる。例えば、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３のＳ蛋白のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＹＰ＿００９５５５２４１．１（配列番号１）又はＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．ＡＭＫ５９６７７．１（配列番号２）で登録されているものを用いることができる。例えば、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１のＳ蛋白のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＹＰ＿１７３２３８．１(配列番号３）又はＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．ＡＹＮ６４５６１．１（配列番号４）で登録されているものを用いることができる。例えば、ＨＣｏＶ－２２９ＥのＳ蛋白のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿０７３５５１．１(配列番号５）で登録されているものを用いることができる。例えば、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３のＳ蛋白のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＹＰ＿００３７６７．１　(配列番号６）で登録されているものを用いることができる。
　抗原ウイルスタンパク質またはその断片は、市販のものを用いてもよい。例えば、ＨｃｏＶ－ＯＣ４３のＳ蛋白、及びＨｃｏＶ－ＨＫＵ１のＳ蛋白は、Ｓｉｎｏ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｃ．等から市販されている。例えば、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２のＳ蛋白、及びＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２のペプチドプールは、ｍａｂｔｅｃｈ　ＡＢ等から市販されている。
　抗原ウイルスタンパク質またはその断片は、抗原ウイルスタンパク質の全長タンパク質を用いることが好ましい。全長タンパク質を用いることにより、Ｔ細胞エピトープを含む可能性が高くなる。また、変異株にも対応しやすい。
（接触方法）
　対象由来のＴ細胞を、抗原ウイルスタンパク質またはその断片に接触させる方法は特に限定されない。例えば、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで通常行われる方法を用いることができる。一実施形態において、Ｔ細胞と、抗原ウイルスタンパク質またはその断片との接触は、抗原提示細胞の存在下で行われる。抗原提示細胞としては、樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージ等が挙げられる。抗原提示細胞は、対象から採取されたものであることが好ましい。対象の血液から単離したＰＢＭＣは、Ｔ細胞及び抗原提示細胞を含む。そのため、抗原ウイルスタンパク質またはその断片との接触に、対象の血液から取得したＰＢＭＣを用いてもよい。
　抗原ウイルスタンパク質またはその断片は、抗原提示細胞に提示されたものであってもよい。抗原ウイルスタンパク質またはその断片を抗原提示細胞と培養すると、抗原ウイルスタンパク質またはその断片が抗原提示細胞に取り込まれ、ＭＨＣ／ペプチド複合体として抗原提示細胞に提示される。このＭＨＣ／ペプチド複合体を提示する抗原提示細胞を、対象由来のＴ細胞との接触に用いてもよい。
　反応に用いる対象由来のＴ細胞の量は、特に限定されない。Ｔ細胞の量としては、例えば、１０３～１０８個、１０４～１０７個、１０４～１０６個、または１０３～１０８個等が挙げられる。ＰＢＭＣを用いる場合、反応に用いるＰＢＭＣの細胞数としては、例えば、１０３～１０８個、１０４～１０７個、１０４～１０６個、または１０３～１０８個等が挙げられる。
　反応に用いる抗原ウイルスタンパク質またはその断片の量は、特に限定されない。抗原ウイルスタンパク質またはその断片の量としては、例えば、０．１μｇ／ｍＬ以上、０．５μｇ／ｍＬ以上、１μｇ／ｍＬ以上、２μｇ／ｍＬ以上、５μｇ／ｍＬ以上、または１０μｇ／ｍＬ以上等が挙げられる。抗原ウイルスタンパク質またはその断片の上限値は特に限定されないが、例えば、１００μｇ／ｍＬ以下、６０μｇ／ｍＬ以下、５０μｇ／ｍＬ以下、４０μｇ／ｍＬ以下、３０μｇ／ｍＬ以下、２０μｇ／ｍＬ以下、または１５μｇ／ｍＬ以下等が挙げられる。前記上限値および下限値は、任意に組合せ可能である。
　反応時間は、特に限定されず、抗原ウイルスタンパク質またはその断片によるＴ細胞の免疫応答が誘導される程度の時間であればよい。反応時間としては、例えば、１時間以上、２時間以上、５時間以上、７時間以上、１０時間以上、１５時間以上、または２０時間以上等が挙げられる。反応時間の上限は、特に限定されないが、例えば、５０時間以下、４０時間以下、３０時間以下、または２５時間以下等が挙げられる。前記上限値および下限値は、任意に組合せ可能である。
　反応温度としては、例えば、２０～４０℃、２５～４０℃、または３０～４０℃が挙げられる。反応温度は、典型的には、３７℃である。
　対象由来のＴ細胞と抗原ウイルスタンパク質またはその断片との接触は、ＥＬＩＳＰＯＴ用のウェルプレート等を用いて行ってもよい。ＥＬＩＳＰＯＴ用プレートは、市販のものを用いることができる。ＥＬＩＳＰＯＴ用のウェルプレートには、抗原刺激によりＴ細胞が分泌するサイトカインに特異的に結合する捕捉用抗体が固定されていてもよい。前記サイトカインとしては、例えば、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、パーフォリン、グランザイムＢ（ＧｚＢ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）等が挙げられるが、これらに限定されない。捕捉用抗体は、１種であってもよく、２種以上であってもよい。一実施形態において、捕捉用抗体は、抗ＩＦＮ－γ抗体、および抗ＩＬ－２抗体である。
　抗原ウイルスタンパク質またはその断片に対して応答性を有するＴ細胞は、抗原ウイルスタンパク質またはその断片との接触により、サイトカインを分泌する。捕捉用抗体は、Ｔ細胞から分泌されたサイトカインに結合し、ウェルプレート上に捕捉し得る。
　捕捉用抗体を固定するために、ＥＬＩＳＰＯＴ用プレートのウェル底面はポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜で形成されていてもよい。
　対象由来のＴ細胞と抗原ウイルスタンパク質又はその断片の接触は、抗原タンパク質またはその断片が由来する抗原ウイルスの種類毎に行うことが好ましい。すなわち、１種類の抗原ウイルスに由来する抗原ウイルスタンパク質又はその断片を、Ｔ細胞と接触させることが好ましい。これにより、抗原ウイルスの種類毎に、Ｔ細胞の応答性を測定することができる。例えば、抗原ウイルスとして、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、及びＨＣｏＶ－ＮＬ６３の４種類を用いる場合、ＨＣｏＶ－２２９Ｅに由来するタンパク質またはその断片とＴ細胞との接触；ＨＣｏＶ－ＯＣ４３に由来するタンパク質またはその断片とＴ細胞との接触；ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１に由来するタンパク質またはその断片とＴ細胞との接触；及びＨＣｏＶ－ＮＬ６３に由来するタンパク質またはその断片とＴ細胞との接触を、それぞれ別々に行うことができる。
　抗原ウイルスタンパク質またはその断片は、１種の抗原ウイルスについて複数種類のタンパク質またはその断片を用いてもよく、１種類のタンパク質またはその断片のみを用いてもよい。タンパク質またはその断片は、Ｓ蛋白またはその断片を含むことが好ましい。
＜工程（ｂ）＞
　工程（ｂ）では、抗原ウイルスタンパク質またはその断片に対する対象由来のＴ細胞の応答性に基づいて、対象コロナウイルス感染症の重症化リスクを評価する。
　抗原ウイルスタンパク質またはその断片に対する対象由来のＴ細胞の応答性は、公知の方法に基づいて、測定することができる。Ｔ細胞は、抗原ウイルスタンパク質またはその断片への接触により活性化すると、増殖してサイトカインを生成する。そのため、抗原ウイルスタンパク質またはその断片に対するＴ細胞の応答性は、Ｔ細胞の増殖又はサイトカインの生成に基づいて、測定してもよい。
　例えば、Ｔ細胞の応答性は、抗原ウイルスタンパク質またはその断片による刺激に対するＴ細胞からのサイトカインの分泌に基づいて測定することができる。例えば、抗原ウイルスタンパク質またはその断片との接触によりＴ細胞から分泌されるサイトカイン量が多いほど、応答性が高いと評価することができる。サイトカインの分泌量は、例えば、サイトカインに特異的に結合する抗体を用いた免疫学的手法により測定することができる。そのような免疫学的手法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロッティング法等が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、Ｔ細胞の応答性は、Ｔ細胞集団が発現するサイトカインのｍＲＮＡ量に基づいて評価してもよい。サイトカインのｍＲＮＡ量を測定する方法としては、例えば、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ノーザンブロッティング等が挙げられるが、これらに限定されない。
　Ｔ細胞の応答性は、抗原ウイルスタンパク質またはその断片との接触によりサイトカインを分泌するＴ細胞の数により評価してもよい。例えば、抗原ウイルスタンパク質またはその断片との接触によりサイトカインを分泌するＴ細胞の数が多いほど、応答性が高いと評価することができる。サイトカインを分泌するＴ細胞数は、例えば、サイトカインに特異的に結合する抗体を用いた免疫学的手法により測定することができる。そのような免疫学的手法としては、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ等が挙げられるが、これに限定されない。
　例えば、抗原ウイルスタンパク質またはその断片に対する対象由来のＴ細胞の応答性は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの手法を用いて測定することができる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、例えば、以下のように行うことができる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイでは、Ｔ細胞およびＴ細胞刺激抗原（抗原ウイルスタンパク質またはその断片）をウェル内でインキュベートし、Ｔ細胞から分泌されるサイトカインを、ウェルに固定した捕捉用抗体で捕捉する。次いで、ウェルを洗浄してＴ細胞を除去した後、標識化された検出用抗体をウェルに添加する。検出用抗体としては、捕捉用抗体と同じサイトカインに特異的に結合する抗体を用いることができる。検出用抗体は、捕捉用抗体に捕捉されたサイトカインに結合する。次いで、検出用抗体が有する標識に応じて、発色反応を行うことにより、サイトカインを検出することができる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイでは、サイトカインを分泌したＴ細胞が位置した場所に、発色反応によるスポットが生じる。スポット数は、ＥＬＩＳＰＯＴリーダー等によりカウントすることができる。スポット数が多いほど、抗原ウイルスタンパク質またはその断片に対するＴ細胞の応答性が高いと評価することができる。
　サイトカインを検出する発色反応は、発色反応を触媒する酵素（以下。「発色酵素」という）と、当該酵素の基質を用いて行うことができる。発色酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ；ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）等が挙げられる。発色酵素は、検出用抗体に直接標識してもよく、ビオチン－アビジン結合等の結合対を利用して、検出用抗体に結合してもよい。２種以上のサイトカインを検出する場合には、サイトカイン毎に異なる発色酵素を用いてもよい。
　検出用抗体として蛍光色素で標識された抗体を用いてもよい。この場合、Ｔ細胞を除去後のウェルに検出用抗体を添加して反応させると、サイトカインを分泌したＴ細胞が位置した場所に、蛍光スポットが生じる。蛍光スポット検出リーダー等で、この蛍光スポットをカウントしてもよい。
　抗原ウイルスタンパク質またはその断片に対する対象由来のＴ細胞の応答性は、対象コロナウイルス感染症の重症化リスクと関連している。
　例えば、抗原ウイルスタンパク質またはその断片に対する対象由来のＴ細胞の応答性が低い場合、前記対象は、対象コロナウイルス感染症に対する重症化リスクが高いと評価することができる。
　例えば、抗原ウイルスタンパク質またはその断片に対する対象由来のＴ細胞の応答性が高い場合、前記対象は、対象コロナウイルス感染症に対する重症化リスクが低いと評価することができる。
　抗原ウイルスタンパク質またはその断片に対する対象由来のＴ細胞の応答性が高いことは、当該対象が、抗原ウイルスに感染した経験があり、抗原ウイルスに対する細胞性免疫が維持されていることを意味し得る。抗原ウイルスに対して応答性を有するＴ細胞は、交差反応により、対象コロナウイルス感染症の原因ウイルスに対しても応答すると考えられる。そのため、抗原ウイルスに対する細胞性免疫を有する対象では、原因ウイルスの増殖が抑制されて、対象コロナウイルス感染症の重症化を回避できると考えられる。
　抗原ウイルスタンパク質またはその断片が、第１の抗原ウイルスに由来する場合、前記抗原タンパク質またはその断片に対するＴ細胞の応答性が低い場合に、対象コロナウイルス感染症の重症化リスクが高いと評価してもよい。原因ウイルスと受容体が異なる第１の抗原ウイルスに対する応答性は、対象コロナウイルス感染症の重症化リスクと負の相関を示す傾向がある。例えば、原因ウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である場合、第１の抗原ウイルスとしては、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、及びＭＥＲＳ－ＣｏＶが挙げられる。抗原ウイルスタンパク質またはその断片として、これらのコロナウイルスに由来するタンパク質又はその断片を用いた場合、Ｔ細胞の応答性が低い場合に、ＣＯＶＩＤ－１９の重症化リスクが高いと評価してもよい。
　抗原ウイルスタンパク質またはその断片が、第２の抗原ウイルスに由来する場合、前記抗原タンパク質またはその断片に対するＴ細胞の応答性が高い場合に、対象コロナウイルス感染症の重症化リスクが高いと評価してもよい。原因ウイルスと受容体が同じ第２の抗原ウイルスに対する応答性は、対象コロナウイルス感染症の重症化リスクと正の相関を示す傾向がある。例えば、原因ウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である場合、第２の抗原ウイルスとしては、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶが挙げられる。抗原ウイルスタンパク質またはその断片として、これらのコロナウイルスに由来するタンパク質又はその断片を用いた場合、Ｔ細胞の応答性が高い場合に、ＣＯＶＩＤ－１９の重症化リスクが高いと評価してもよい。
　対象のＴ細胞の応答性の評価は、予め設定した基準値に基づいて行ってもよい。例えば、抗原ウイルスタンパク質またはその断片に対するＴ細胞の応答性が、基準値よりも高い場合に、応答性が高いと評価してもよい。例えば、抗原ウイルスタンパク質またはその断片に対するＴ細胞の応答性が、基準値よりも低い場合に、応答性が低いと評価してもよい。
　前記基準値は、例えば、任意の人数で構成される健常者グループにおいて測定された応答性から、統計処理等を行って算出された数値であってもよい。あるいは、任意の人数で構成される対象コロナウイルス感染症の感染者又は発症者のグループにおいて測定された応答性から、統計処理等を行って算出された数値であってもよい。基準値は、例えば、対象コロナウイルス感染症の軽症者グループにおいて測定された応答性から算出された数値であってもよい。あるいは、基準値は、対象コロナウイルス感染症の中等症以上の患者グループ（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９の場合には、中等症Ｉ、中等症ＩＩ、及び重症）において測定された応答性から算出された数値であってもよい。対象コロナウイルス感染症の感染者又は発症者の応答性から基準値を設定する場合、対象コロナウイルス感染症の回復期にある患者から採取されたＴ細胞を用いることが好ましい。
　基準値は、抗原ウイルスの種類毎に、設定されることが好ましい。例えば、対象コロナウイルス感染症がＣＯＶＩＤ－１９であり、抗原ウイルスとして、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、及びＨＣｏＶ－ＮＬ６３用いる場合、これらの４種類の抗原ウイルス毎に基準値を設定することができる。
　本態様にかかる方法は、工程（ａ）が、下記工程（ａ１）及び工程（ａ２）を含んでもよい。
　（ａ１）対象由来のＴ細胞を、原因ウイルスが受容体とする分子とは異なる分子を受容体とする第１の他種コロナウイルス（第１の抗原ウイルス）に由来するタンパク質またはその断片に接触させる工程。
　（ａ２）対象由来のＴ細胞を、原因ウイルスが受容体とする分子と同じ分子を受容体とする第２の他種コロナウイルス（第２の抗原ウイルス）に由来するタンパク質またはその断片に接触させる工程。
　本態様にかかる方法は、工程（ｂ）が、下記工程（ｂ１）～工程（ｂ３）を含んでもよい。
　（ｂ１）第１の他種コロナウイルス（第１の抗原ウイルス）に由来するタンパク質またはその断片に対する対象由来のＴ細胞の第１の応答性を測定する工程。
　（ｂ２）第２の他種コロナウイルスに由来するタンパク質またはその断片に対する対象由来のＴ細胞の第２の応答性を測定する工程。
　（ｂ３）第１の応答性に対する第２の応答性の比の値（第２の応答性／第１の応答性）に基づいて、コロナウイルス感染症の重症化リスクを評価する工程。
　工程（ａ１）は、第１の抗原ウイルスに由来するタンパク質またはその断片を用いて、工程（ａ）を行えばよい。
　工程（ａ２）では、第２の抗原ウイルスに由来するタンパク質またはその断片を用いて、工程（ａ）を行えばよい。
　工程（ｂ１）では、工程（ａ１）により誘導された対象由来のＴ細胞の応答性を測定すればよい。工程（ｂ１）により得られた応答性を第１の応答性とする。
　工程（ｂ２）では、工程（ａ２）により誘導された対象由来のＴ細胞の応答性を測定すればよい。工程（ｂ２）により得られた応答性を第２の応答性とする。
　Ｔ細胞の応答性は、上述の方法により測定することができる。Ｔ細胞の応答性は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定することが好ましい。Ｔ細胞の応答性は、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる有効スポット数として定量化してもよいし、有効スポット数インデックスとして定量化してもよい。有効スポット数は、Ｔ細胞刺激抗原の存在下でＴ細胞をインキュベートした区画（ウェル）で得られたスポット数から、陰性対照区画（ウェル）のスポット数を差し引いた値として算出される。陰性対照区画は、Ｔ細胞刺激抗原の非存在下でＴ細胞をインキュベートした区画である。有効スポット数インデックスは、有効スポット数を陽性対照区画（ウェル）のスポット数で除した値として算出される。陽性対照区画は、Ｔ細胞刺激抗原としてすべてのＴ細胞が強く反応する抗ＣＤ３抗体を用いてＴ細胞をインキュベートした区画である。
　工程（ｂ３）では、第１の応答性に対する第２の応答性の比の値（第２の応答性／第１の応答性）に基づいて、コロナウイルス感染症の重症化リスクを評価する。前記比の値（第２の応答性／第１の応答性）は、適当な係数を乗じたものであってもよい。例えば、重症化リスクは、下記式（１）により求められる重症化リスク値（Ｙ）により評価することができる。
　Ｙ＝ｋ（Ｂ／Ａ）　　　（１）
　式（１）中、Ｙは重症化リスク値；ｋは係数；Ａは第１の応答性；Ｂは第２の応答性である。係数ｋは、例えば、１～１０の範囲の数値を取り得る。
　第１の抗原ウイルスが２種以上である場合、当該２種以上の第１のウイルスのそれぞれについて、前記式（１）により、重症化リスク値（Ｙ）をそれぞれ算出し、それらを加算して、総合的な重症化リスク値（Ｙ）を得てもよい。２種以上の第１の抗原ウイルスのそれぞれについて、重症化リスク値（Ｙ）を算出する場合、前記式（１）中のＢとしては、２種以上の第１の抗原ウイルス間で同一の値を用いることが好ましい。
　例えば、重症化リスク値（Ｙ）は、下記式（２）により求めてもよい。
　Ｙ＝ｋ１（Ｂ／Ａ１）＋ｋ２（Ｂ／Ａ２）＋・・・　　　（２）
　式（２）中、Ｙは重症化リスク値；ｋ１およびｋ２は係数；Ａ１は１種類目の第１の抗原ウイルスによる第１の応答性；Ａ２は２種類目の第１の抗原ウイルスによる第１の応答性；Ｂは第２の応答性である。係数ｋ１およびｋ２は、例えば、１～１０の範囲の数値を取り得る。３種類目以降の第１の抗原ウイルスについても、同様に加算していけばよい。
　原因ウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である場合、第１の抗原ウイルスとしては、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、及びＨＣｏＶ－２２９Ｅの３種を用いることが好ましい。第２の抗原ウイルスとしては、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３を用いることが好ましい。この場合、重症化リスク値（Ｙ）は、下記式（Ｉ）により求めてもよい。
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 　式（Ｉ）中、Ｙは重症化リスク値；ｋ１、ｋ２およびｋ３は係数；ＮＬ６３はＨＣｏＶ－ＮＬ６３に由来するタンパク質またはその断片に対するＴ細胞の応答性；ＨＫＵ１はＨＣｏＶ－ＨＫＵ１に由来するタンパク質またはその断片に対するＴ細胞の応答性；ＯＣ４３はＨＣｏＶ－ＯＣ４３に由来するタンパク質またはその断片に対するＴ細胞の応答性；２２９ＥはＨＣｏＶ－２２９Ｅに由来するタンパク質またはその断片に対するＴ細胞の応答性である。係数ｋ１、ｋ２およびｋ３は、例えば、１～１０の範囲の数値を取り得る。係数ｋ１、ｋ２およびｋ３は、例えば、１～５の範囲の数値であってもよく、１～３の範囲の数値であってもよい。たとえば、一例として、ｋ１＝３、ｋ２＝１およびｋ３＝３が挙げられる。
　上記式（１）、（２）又は（Ｉ）で求められる重症化リスク値（Ｙ）は、コロナ感染症の重症化リスクと正の相関を示す。そのため、対象コロナ感染症の重症化リスクを、重症化リスク値（Ｙ）により評価することができる。例えば、ある対象について求められた重症化リスク値（Ｙ）が、予め設定した基準値（カットオフ値）よりも高い場合には、当該対象は、重症化リスクが高いと判定することができる。ある対象について求められた重症化リスク値（Ｙ）が、予め設定した基準値（カットオフ値）よりも低い場合には、当該対象は、重症化リスクが低いと判定することができる。基準値は、例えば、任意の人数により構成される感染者又は発症者のグループにおいて算出された重症化リスク値（Ｙ）を統計処理等して得られる数値であってもよい。
　本態様にかかる方法によれば、簡易な方法で、コロナウイルス感染症の重症化リスクを評価することができる。重症化リスクを評価することで、社会的及び医療的に適切な措置を講じることが可能となる。
　本態様にかかる方法では、Ｔ細胞刺激抗原として、対象コロナウイルス感染症の原因ウイルスとは異なる種類のコロナウイルス（抗原ウイルス）に由来するタンパク質またはその断片を用いる。そのため、原因ウイルスの未感染者、および原因ウイルスの既感染者またはワクチン接種者であるが原因ウイルスに対する細胞性免疫が消失した対象であっても、対象コロナウイルス感染症の重症化リスクを評価することができる。
　本態様にかかる方法によれば、未知のコロナウイルス感染症に対しても、重症化リスクを評価することができる。
＜任意工程＞
　本態様にかかる方法は、上記工程に加えて、任意の工程を含んでもよい。任意工程としては、例えば、（ｃ）対象が原因ウイルス感染者である場合に、対象コロナウイルス感染症の重症化リスクの評価結果に基づいて、対象コロナウイルス感染症の治療方針を決定する工程、（ｄ）対象コロナウイルス感染症の重症化リスクが高いと評価された対象が原因ウイルスの感染者である場合に、対象コロナウイルス感染症の症状の観察、および対象コロナウイルス感染症の治療からなる群より選択される少なくとも１種の措置を行う工程、ならびに（ｅ）対象コロナウイルス感染症の重症化リスクが高いと評価された対象が原因ウイルスの非感染者である場合に、対象コロナウイルス感染症のワクチン接種を行う工程、等が挙げられる。工程（ｃ）～（ｅ）のいずれかを含む場合、本態様にかかる方法は、コロナウイルス感染症の重症化を予防する方法であってもよい。工程（ｃ）及び工程（ｄ）のいずれかを含む場合、本態様にかかる方法は、コロナウイルス感染症を治療する方法であってもよい。
（工程（ｃ））
　対象が原因ウイルス感染者である場合、重症化リスクに基づいて、対象コロナウイルス感染症の治療方針を決定することができる。重症化リスクが低いと評価された感染者は、積極的な治療を行わず、経過観察のみを行うと決定してもよい。重症化リスクが高い感染者は、症状の進行を慎重に観察し、感染初期から積極的な治療を施すことで、重症化を回避できる可能性がある。そこで、重症化リスクが高いと評価された感染者に対しては、感染初期から積極的な治療を行うと決定してもよい。対象コロナウイルス感染症の治療方法は、対象コロナウイルスの種類に応じて選択可能である。治療方法としては、抗ウイルス薬または中和抗体等の投与が挙げられる。対象コロナウイルス感染症がＣＯＶＩＤ－１９である場合、抗ウイルス薬としては、モルヌピラビルル（商品名：ラゲブリオカプセル）、ニルマトレルビル／リトナビル（商品名：パキロビッドパック）、レムデシビル（商品名：ベルクリー点滴静注液）、デキサメサゾン、トシリズマブ（商品名：アクテムラ）、ファビピラビル（商品名：アビガン）等が挙げられる。中和抗体としては、カシリビマブとイムデビマブの抗体カクテル療法（商品名：ロナプリーブ注射液セット）が挙げられる。
（工程（ｄ））
　対象コロナウイルス感染症の重症化リスクが高いと評価された対象が原因ウイルスの感染者である場合、感染初期から症状の慎重な経過観察を行い、積極的な治療を施すことで、重症化を回避できる可能性がある。そこで、重症化リスクが高い感染者に対しては、症状の観察、および／またはコロナウイルス感染症の治療を行ってもよい。治療方法としては、上記と同様のものが挙げられる。また、経過観察および重症化したときの迅速な対応に備えて、病院への入院措置を行ってもよい。工程（ｄ）は、重症化リスクが高いと判定された原因ウイルス感染者に対し、コロナ感染症に対する治療を行う工程であってもよい。例えば、工程（ｄ）は、重症化リスクが高いと判定された原因ウイルス感染者に対し、原因ウイルスに対する抗ウイルス薬又は中和抗体を投与する工程であってもよい。
（工程（ｅ））
　対象コロナウイルス感染症の重症化リスクが高いと評価された対象が原因ウイルスの非感染者である場合、対象が原因ウイルスに感染すると重症化する恐れがある。そのため、そのような対象に対しては、対象コロナウイルス感染症のワクチン接種を行うことが考えられる。ワクチン接種を行って対象コロナウイルス感染症に対する免疫を獲得させることで、当該対象において、対象コロナウイルスに対する重症化リスクを低下させ得る。工程（ｅ）は、重症化リスクが高いと判定された非感染者に対し、対象コロナウイルス感染症のワクチン接種を行う工程であってもよい。
［コロナウイルス感染症の重症化リスクの評価キット］
　本開示の第２の態様は、コロナウイルス感染症の重症化リスク評価キットである。本態様にかかるキットは、前記コロナウイルス感染症の原因ウイルスとは異なる種類のコロナウイルスに由来するタンパク質（抗原ウイルスタンパク質）又はその断片を含む。
＜抗原ウイルスタンパク質またはその断片＞
　抗原ウイルスタンパク質またはその断片としては、上記と同様のものが挙げられる。抗原ウイルスは、原因ウイルスと同じ属に属し、且つ原因ウイルスと異なる種に属するコロナウイルスであることが好ましい。例えば、原因ウイルスがベータコロナウイルス属である場合、抗原ウイルスはベータコロナウイルス属の異なる種であってもよい。抗原ウイルスは、アルファコロナウイルス属であってもよい。抗原ウイルスは、対象に感染可能なコロナウイルスであることが好ましい。
　原因ウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である場合、抗原ウイルスは、ベータコロナウイルス属のウイルスを用いることができる。原因ウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり、対象がヒトである場合、抗原ウイルスとして、ベータコロナウイルス属のヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１等）を用いることができる。
　抗原ウイルスは、第１の抗原ウイルスであってもよい。例えば、原因ウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり、対象がヒトである場合、抗原ウイルスタンパク質またはその断片としては、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、またはＭＥＲＳ－ＣｏＶに由来するものを用いることができる。
　抗原ウイルスは、第２の抗原ウイルスであってもよい。例えば、原因ウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり、対象がヒトである場合、抗原ウイルスタンパク質またはその断片としては、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶに由来するものを用いることができる。
　抗原ウイルスタンパク質またはその断片は、１種であってもよく、２種以上であってもよい。抗原ウイルスタンパク質またはその断片は、第１の抗原ウイルスに由来するものと、第２の抗原ウイルスに由来するものの両方を含むことが好ましい。例えば、原因ウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり、対象がヒトである場合、本態様にかかるキットは、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、及びＭＥＲＳ－ＣｏＶからなる群より選択される１種以上に由来する抗原ウイルスタンパク質またはその断片と、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶからなる群より選択される１種以上に由来する抗原ウイルスタンパク質またはその断片と、を含むことが好ましい。
　本態様にかかるキットは、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１に由来する抗原ウイルスタンパク質またはその断片と、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３に由来する抗原ウイルスタンパク質またはその断片と、ＨＣｏＶ－２２９Ｅに由来する抗原ウイルスタンパク質またはその断片と、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３に由来する抗原ウイルスタンパク質またはその断片とを含むことが好ましい。
　抗原ウイルスタンパク質としては、Ｓ蛋白、Ｎ蛋白、Ｍ蛋白、およびＥ蛋白等が挙げられ、Ｓ蛋白が好ましい。
＜任意の構成＞
　本態様にかかるキットは、抗原ウイルスタンパク質またはその断片に加えて、任意の構成を含んでいてもよい。任意の構成としては、例えば、Ｔ細胞が抗原刺激に応答して分泌するサイトカインに対する特異的結合物質、固相担体、発色酵素、発色酵素基質、洗浄バッファー、希釈バッファー、使用説明書等が挙げられる。
（Ｔ細胞が抗原刺激に応答して分泌するサイトカインに対する特異的結合物質）
　本態様にかかるキットは、Ｔ細胞が抗原刺激に応答して分泌するサイトカインに対する特異的結合物質を含んでもよい。
　「特異的結合物質」とは、特定の生体分子に対して、特異的結合性を有する物質を意味する。「特異的結合性を有する」とは、特定の生体分子に対して高い結合親和性を有するが、他の生体分子に対しては、極めて低い結合親和性しか有さないことを意味する。特異的結合物質は、好ましくは、特定の生体分子に高い結合性を有するが、他の生体分子にはほとんど結合性を有しない。タンパク質に対する特異的結合物質としては、抗体、およびアプタマー等が挙げられる。一実施形態において、特異的結合物質は、抗体である。
　Ｔ細胞が抗原刺激に応答して分泌するサイトカインとしては、上記と同様のものが挙げられる。サイトカインに対する特異的結合物質の具体例としては、例えば、抗ＩＦＮ－γ抗体、抗ＩＬ－２抗体、抗ＩＬ－４抗体、抗ＩＬ－５抗体、抗ＩＬ－１０抗体、抗ＩＬ－１３抗体、抗パーフォリン抗体、抗グランザイムＢ抗体、抗ＴＮＦ－α抗体等が挙げられるが、これらに限定されない。特異的結合物質は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。２種以上のサイトカインを検出する場合、前記２種以上のサイトカインにそれぞれ結合する特異的結合物質を用いる。
　サイトカインに対する特異的結合物質は、捕捉用抗体として、固相担体に結合されていてもよい。固相担体に対する特異的結合物質の結合は、公知の方法により、行うことができる。固相担体としては、例えば、ウェルプレートが挙げられる。特異的結合物質はウェルプレートのウェル底面に結合されてもよい。固相担体は、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴ用ウェルプレートであってもよい。固相担体は、ウェル底面がＰＶＤＦメンブレンで構成されたものでもよい。
　サイトカインに対する特異的結合物質は、検出用抗体として、標識物質で標識されていてもよい。標識物質は、発色酵素であってもよく、発色酵素を結合するための結合対の第１要素であってもよい。結合対の第１要素で標識化された特異的結合物質の具体例としては、ビオチン標識抗体が挙げられる。発色酵素としては、上記と同様のものが挙げられる。例えば、サイトカインとしてＩＦＮ－γを検出する場合、特異的結合物質の具体例としては、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩＦＮ－γ抗体等が挙げられる。例えば、サイトカインとしてＩＬ－２を検出する場合、特異的結合物質の具体例としては、ビオチン標識抗ヒトＩＬ－２抗体等が挙げられる。
　検出用抗体は、蛍光色素で標識されていてもよい。蛍光色素は、公知のものを特に制限なく用いることができる。蛍光色素としては、例えば、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、６－カルボキシ－４’,５’－ジクロロ２’,７’－ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、５'－ヘキサクロロ－フルオレセイン－ＣＥホスホロアミダイト（ＨＥＸ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ６４７等が挙げられるが、これらに限定されない。
（発色酵素）
　発色酵素は、特に限定されず、公知のものを用いることができる。発色酵素としては、ＨＲＰ、およびＡＰ等が挙げられる。発色酵素は、検出用抗体に結合されていてもよい。検出用抗体が、結合対の第１要素（例えば、ビオチン）で標識されている場合、発色酵素は結合対の第２要素（例えば、アビジン又はその誘導体）で標識されていてもよい。例えば、検出用抗体がＦＩＴＣ標識抗ヒトＩＦＮ－γ抗体である場合、発色酵素はＦＩＴＣ標識ＨＲＰ（ＦＩＴＣ－ＨＲＰ）であってもよい。例えば、検出用抗体がビオチン標識抗ヒトＩＬ－２抗体である場合、発色酵素はストレプトアビジン標識ＡＰ（Ｓｔｒｅｐ－Ａｐ）であってもよい。
（発色酵素基質）
　発色酵素基質は、発色酵素の種類に応じて、適宜選択することができる。
　発色酵素がＨＲＰである場合、発色酵素基質としては、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’－アジノビス［３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸］（ＡＢＴＳ）、ｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）等が挙げられる。
　発色酵素がＡＰである場合、発色酵素基質としては、ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ＮＢＴ）、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ｐ－ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）等が挙げられる。
　本態様にかかるキットは、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ用キットとして提供されてもよい。
　本態様にかかるキットは、前記第１の態様にかかる評価方法を実施するために使用することができる。
　他の態様において、本開示は、コロナウイルス感染症の重症化リスクの評価キットを製造するための、抗原ウイルスタンパク質またはその断片の使用を提供する。他の態様において、本開示は、コロナウイルス感染症の重症化リスクの評価するための、抗原ウイルスタンパク質またはその断片の使用を提供する。他の態様において、本開示は、コロナウイルス感染症の重症化リスクの評価するための、抗原ウイルスタンパク質またはその断片を提供する。抗原ウイルスタンパク質としては、上記と同様のものが挙げられ、第１の抗原ウイルスに由来するタンパク質、及び第２の抗原ウイルスタンパク質の組合せが好ましい。
　本開示は、以下の態様を含み得る。
　コロナウイルス感染症の重症化リスクの判定方法であって、（ａ）対象由来のＴ細胞を、前記コロナウイルス感染症の原因ウイルスとは異なる種類のコロナウイルスである他種コロナウイルスに由来するタンパク質またはその断片に接触させる工程と、（ｂ）前記タンパク質またはその断片に対する前記Ｔ細胞の応答性に基づいて、前記コロナウイルス感染症の重症化リスクを判定する工程と、を含む、コロナウイルス感染症の重症化リスクの判定方法。
　コロナウイルス感染症の重症化リスクの高い対象に由来するＴ細胞含有試料を選別する方法であって、（ａ）前記Ｔ細胞含有試料中のＴ細胞を、前記コロナウイルス感染症の原因ウイルスとは異なる種類のコロナウイルスである他種コロナウイルスに由来するタンパク質またはその断片に接触させる工程と、（ｂ）前記タンパク質またはその断片に対する前記Ｔ細胞の応答性に基づいて、前記コロナウイルス感染症の重症化リスクが高い対象に由来する前記Ｔ細胞含有試料を選別する工程と、を含む、コロナウイルス感染症の重症化リスクの高い対象に由来するＴ細胞含有試料を選別する方法。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
＜被験者＞
　被験者は、東北大学病院ならびに関連施設（栗原中央病院、気仙沼市立病院）でＣＯＶＩＤ－１９の治療を受けたＣＯＶＩＤ－１９感染回復期にある患者とした。被験者には、事前に説明して同意を得た。治癒後の回復期に、末梢血１０ｍＬ程度を専用の容器に採取した。ＣＯＶＩＤ－１９に罹患歴のない健常者を対照群として、同様に採血を行った。
　被験者におけるＣＯＶＩＤ－１９の重症度は、「新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）診療の手引き・第５版（厚生労働省）」（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｈｌｗ．ｇｏ．ｊｐ／ｃｏｎｔｅｎｔ／０００７８５１１９．ｐｄｆ）に準じて、以下のように分類した。
　軽症：酸素飽和度（ＳｐＯ２）≧９６％で、呼吸器症状なし、または、咳のみで呼吸困難なし。いずれの場合であっても肺炎所見を認めない。
　中等症Ｉ（呼吸不全なし）：９３％＜ＳｐＯ２＜９６％で、呼吸困難，肺炎所見を認める。
　中等症ＩＩ（呼吸不全あり）：ＳｐＯ２≦９３％で、酸素投与が必要。
　重症：ＩＣＵに入室、または人工呼吸器が必要。
　被験者は、健常者が３例、ＣＯＶＩＤ－１９既感染者が１１例（軽症が４例、中等症Ｉが３例、中等症ＩＩが４例）であった。
＜末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の調製＞
　ＣＯＶＩＤ－１９感染後に６週以上経過して治癒期にある患者、および対照群である非感染者から、末梢血を採取した。ＢＤバキュティナ（登録商標）ＣＰＴ単核球分離用採血管（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて、１５００～１８００Ｇ、室温で、１５分間遠心分離して単核球層を分離および採取した。ＣＴＬ－ｗａｓｈ　ｓｕｐｐｌｉｍｅｎｔ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ，ＵＳＡ）添加したＲＰＭＩ－１６４０で、細胞を洗浄した。次いで、３００Ｇ、室温で、１５分間遠心分離した。この洗浄操作を２回繰り返した。その後、細胞保存液（ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ２ (日本全薬工業)）を加えてＰＢＭＣを－８０℃で保存した。
＜ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ＞
　Ｔリンパ球の反応性は、分泌されるＩＦＮ－γとＩＬ－２を対象として評価した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイには、Ｈｕｍａｎ　ＩＦＮ－γ／ＩＬ－２　Ｄｏｕｂｌｅ－Ｃｏｌｏｒ　ＥＬＩＳＰＯＴ　Ｋｉｔ：ｈＩＦＮｇＩＬ２－２Ｍ，ＣＴＬ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ，ＵＳＡ）を用いた。
　ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、文献（Czerkinsky C, et al. Immunol. Methods,1988.）に記載の方法を一部変更して行った。具体的には、ウェル底面がＰＶＤＦメンブレンとなっている９６ウェルのＥＬＩＳＰＯＴ用プレートに、ヒトＩＦＮ－γ／ＩＬ－２キャプチャー抗体をコートして、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳでプレートを洗浄した後、Ｔリンパ球刺激抗原および共刺激の抗ＣＤ２８抗体を添加して、３７℃で、２０分間インキュベートした。Ｔリンパ球刺激抗原として、ベータコロナウイルス属（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）のスパイク（Ｓ）蛋白、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ蛋白、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ蛋白＋ヌクレオカプシド（Ｎ）蛋白＋膜（Ｍ）蛋白のペプチドプールを用いた。用いたＴリンパ球刺激抗原を表２に示す。ネガティブコントロールのウェルには、Ｔリンパ球刺激抗原を添加しなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　上記インキュベートにおけるＴリンパ球刺激抗原濃度は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ蛋白およびペプチドプールでは、２μｇ／ｍＬ（最終濃度）とした。βコロナウイルス属（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）のＳ蛋白では、１２．５μｇ／ｍＬ（最終濃度）とした。
　上記インキュベート後、健常者３例、ＣＯＶＩＤ－１９既感染者１１例（軽症：４例、中等症Ｉ：３例、中等症ＩＩ：４例）から採取したＰＢＭＣを、３００，０００個／ウェルで添加した。次いで、３７℃で、２４時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで洗浄した。次いで、ＩＦＮ－γ／ＩＬ－２検出用抗体（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＩＦＮガンマ（ＦＩＴＣ）　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ＡｂおよびＡｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＩＬ－２（Ｂｉｏｔｉｎ）　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ａｂ）を添加し、室温で、２時間インキュベートした。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで洗浄後、Ｓｔｒｅｐ－ＡＰおよびＦＩＴＣ－ＨＲＰの混合溶液をウェルに添加し、室温で、１時間インキュベートした。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで洗浄後、蒸留水で洗浄した。次いで、発色基質であるＢｌｕｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ溶液を添加し、室温で、１５分間インキュベートした。水道水で洗浄後、蒸留水で洗浄した。次いで、Ｒｅｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ溶液を添加し、室温で、１０分間インキュベートした。水道水で洗浄後、クリーンベンチ内で２４時間自然乾燥させた。
　反応したＴリンパ球数の評価は、Ｓｐｏｔ－Ｆｏｒｍｉｎｇ　Ｃｅｌｌｓ（ＳＦＣ）として、自動免疫スポット分析器Ａｕｔｏｍａｔｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ　Ａｎａｌｙｚｅｒ，ＣＴＬ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ，ＵＳＡ）で自動解析した。カウントされたスポット数から陰性対照群のスポット数を差し引いた値（以下、「有効スポット数」ともいう）を、以下の基準に従い評価した。
　（評価基準）
　３＋：５０以上
　２＋：２１以上５０未満
　＋：６以上２１未満
　±：４以上６未満
　－：４未満
＜結果＞
　図１に、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。上図はＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおけるウェル画像である。下図は上記評価基準による評価結果である。健常者では、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のいずれのＳ蛋白に対しても応答を認めなかった。
　回復期のＣＯＶＩＤ患者においては、軽症例では、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３およびＨＣｏＶ－ＨＫＵ１に対して中等度～強応答であった。中等症Ｉでは、弱応答であった。中等症ＩＩでは、ほぼ応答性を認めなかった。
　これらの結果は、ベータコロナウイルス属（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）にあらかじめ細胞性免疫能を有すると、交差反応性により、ＣＯＶＩＤ－１９に対して保護的に作用して軽症で済むことを示す。一方、ベータコロナウイルス属に細胞性免疫能を有さないと、ＣＯＶＩＤ－１９の重症化を招くことを示す。
　上記の結果により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と季節性ベータコロナウイルスとの類似点に起因する細胞性免疫における交差反応性が、ＣＯＶＩＤ－１９の重症度を低下させることが示された。
　図２Ａ～図２Ｃは、図１のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を定量化したグラフである。軽症例では、中等症Ｉ及び中等症ＩＩと比較して、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３およびＨＣｏＶ－ＨＫＵ１に対する有効スポット数が多いことが示された。この結果から、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３および／又はＨＣｏＶ－ＨＫＵ１の抗原タンパク質を用いたＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する重症化リスクを評価できることが確認された。
［実施例２］
＜被験者＞
　被験者は、健常者が３７例、ＣＯＶＩＤ－１９既感染者が２７例（軽症が８例、中等症Ｉが６例、中等症ＩＩが９例、重症が４）であった。ＣＯＶＩＤ－１９既感染者の被験者は、実施例１と同様に、東北大学病院ならびに関連施設（栗原中央病院、気仙沼市立病院）でＣＯＶＩＤ－１９の治療を受けたＣＯＶＩＤ－１９感染回復期にある患者とした。
＜末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の調製＞
　実施例１と同様の方法で、ＰＢＭＣを調製し、－８０℃で保存した。
＜ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ＞
　表２に示すＴリンパ球刺激抗原に加えて、表３に示すＴリンパ球刺激抗原を用いて、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、蛍光法により行った。
　Ｔリンパ球の反応性は、分泌されるＩＦＮ－γとＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＧｒａｎｚｙｍｅＢを対象として評価した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイには、Ｈｕｍａｎ　ＩＦＮ－γ／ＩＬ－２／ＴＮＦ－α／ＧｒａｎｚｙｍｅＢ　Ｆｏｕｒ－Ｃｏｌｏｒ　ＦｌｕｏｒｏＳＰＯＴ　Ｋｉｔ：ｈＴ４０００Ｆ－１０，ＣＴＬ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ，ＵＳＡ）を用いた。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、文献（Czerkinsky C, et al. Immunol. Methods,1988.）に記載の方法を一部変更して行った。具体的には、ウェル底面がＰＶＤＦメンブレンとなっている９６ウェルのＥＬＩＳＰＯＴ用プレートに、ヒトＩＦＮ－γ／ＩＬ－２／ＴＮＦ－α／ＧｒａｎｚｙｍｅＢキャプチャー抗体をコートして、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳでプレートを洗浄した後、Ｔリンパ球刺激抗原および共刺激の抗ＣＤ２８抗体を添加して、３７℃で、２０分間インキュベートした。Ｔリンパ球刺激抗原として、表２に示したＴリンパ球刺激抗原に加えて、表３に示したアルファコロナウイルス属（ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）のスパイク（Ｓ）蛋白を用いた。ポジティブコントロールのウェルには、Ｔリンパ球刺激抗原に代えて抗ＣＤ３抗体を添加した。ネガティブコントロールのウェルには、Ｔリンパ球刺激抗原を添加しなかった。
　上記インキュベートにおけるＴリンパ球刺激抗原濃度は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ蛋白およびペプチドプールでは、２μｇ／ｍＬ（最終濃度）とした。ヒト風邪コロナウイルス（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）のＳ蛋白では、１２．５μｇ／ｍＬ（最終濃度）とした。
　上記インキュベート後、健常者、ＣＯＶＩＤ－１９既感染者から採取したＰＢＭＣを、３００，０００個／ウェルで添加した。次いで、３７℃で、２４時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで洗浄した。次いで、ＩＦＮ－γ／ＩＬ－２／ＴＮＦ－α／ＧｒａｎｚｙｍｅＢ検出用抗体（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＩＦＮ－γ（ＦＩＴＣ）　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ａｂ、Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＩＬ－２（Ｈａｐｔｅｎ２）　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ａｂ、Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＴＮＦ－α（Ｈａｐｔｅｎ１）　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ＡｂおよびＡｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＧｒａｎｚｙｍｅＢ（Ｂｉｏｔｉｎ）　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ａｂ）を添加し、室温で、２時間インキュベートした。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで洗浄後、Ａｎｔｉ－ＦＩＴＣ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｎｔｉ－Ｈａｐｔｅｎ２　ＣＴＬ－Ｒｅｄ、Ａｎｔｉ－Ｈａｐｔｅｎ１　ＣＴＬ－ＹｅｌｌｏｗおよびＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　ｅＦｌｕｏｒ４５０の混合溶液をウェルに添加し、室温で、１時間インキュベートした。蒸留水で洗浄後、クリーンベンチ内で２４時間自然乾燥させた。
　反応したＴリンパ球数の評価は、Ｓｐｏｔ－Ｆｏｒｍｉｎｇ　Ｃｅｌｌｓ（ＳＦＣ）として、自動免疫スポット分析器Ａｕｔｏｍａｔｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ　Ａｎａｌｙｚｅｒ，ＣＴＬ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ，ＵＳＡ）で自動解析した。
＜ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果＞
　Ｔリンパ球刺激抗原として、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１のＳ蛋白（ＨＫＵ１－Ｓ）（図３Ａ）、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３のＳ蛋白（ＯＣ４３－Ｓ）（図３Ｂ）、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３のＳ蛋白（ＮＬ６３－Ｓ）（図４Ａ）、ＨＣｏＶ－２２９ＥのＳ蛋白（２２９Ｅ－Ｓ）（図４Ｂ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ蛋白（ＣｏＶ２－Ｓ）（図５Ａ）及び、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のペプチドプール（ＣｏＶ２－ａｌｌ）（図５Ｂ）をそれぞれ用いて、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った結果を図３Ａ～図５Ｂにそれぞれ示す。
　ベータコロナウイルス属であって、ＡＣＥ２を受容体としないコロナウイルス（ＨＫＵ１、ＯＣ４３）のＳ蛋白に対しては、中等症以上の症例と比較して、軽症例において反応が強い傾向があった（図３Ａ、図３Ｂ）。
　アルファコロナウイルス属であって、ＡＣＥ２を受容体とするコロナウイルス（ＮＬ６３）のＳ蛋白に対しては、軽症例と比較して、中等症以上の症例において反応が強い傾向があった（図４Ａ）。
　アルファコロナウイルス属であって、ＡＣＥ２を受容体としないコロナウイルス（２２９Ｅ）のＳ蛋白に対しては、中等症以上の症例と比較して、軽症例において反応が強い傾向があった（図４Ａ）。
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の蛋白に対しては、重症度が高くなるほど、反応が強い傾向があった（図５Ａ、図５Ｂ）。
　図６Ａ～図８Ｂに、中等症Ｉ、中等症ＩＩ及び重症を「中等症以上」としてまとめた場合の結果を示す。いずれの場合も、上記の傾向がより顕著になった。
＜重症化リスク値の計算式の検討＞
　上記の結果から、以下の傾向が確認された。
（ａ）ＡＣＥ２を受容体とするコロナウイルス（ＮＬ６３）に対しては、軽症例よりも、中等症以上の症例において反応が強い。
（ｂ）ＡＣＥ２を受容体としないコロナウイルス（ＨＫＵ１、ＯＣ４３、２２９Ｅ）に対しては、中等症以上の症例よりも、軽症例において反応が強い。
　上記の結果を考慮し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの有効スポット数インデックスから、ＣＯＶＩＤ－１９重症化リスクの予測値を算出可能な計算式を検討した。その結果、重症化リスク値（Ｙ）の計算式として、下記式（Ｉ）を作成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
　前記式（Ｉ）中、ＮＬ６３、ＨＫＵ１、ＯＣ４３、及び２２９Ｅは、Ｔリンパ球刺激抗原として、ＮＬ６３－Ｓ、ＨＫＵ１－Ｓ、ＯＣ４３－Ｓ、及び２２９Ｅ－Ｓをそれぞれ用いてＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行ったときの有効スポット数インデックスである。
　前記式（Ｉ）中、ｋ１、ｋ２、及びｋ３は、係数である。
　図９に、前記式（１）により得られたＹ値を、健常者、軽症例、及び中等症以上の症例のグループで示したグラフを示す。図９では、前記式（Ｉ）中の各係数は、ｋ１＝３、ｋ２＝１、及びｋ３＝３を用いた。図９に示すように、Ｙ値は、軽症例と比較して、中等症以上の症例で有意に高くなった。
　Ｙ値のカットオフ値（Ｘ）を２０に設定した場合、以下の結果となった。
　Ｘ＞２０：１００％の確率で中等症以上。
　Ｘ≦２０：８／１５（５３％）の確率で軽症。
　上記の結果から、ＣＯＶＩＤ－１９重症化リスクは、前記式（Ｉ）で判定できることが確認された。
［実施例３］
＜被験者＞
　被験者は、ファイザー製ワクチン（ＢＮＴ１６２ｂ２）を接種したワクチン接種者とした。被験者は、２８名であった。ワクチン接種前とワクチン接種後（おおむね６週から９週後）に採血を行った。
＜末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の調製、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ＞
　ＰＢＭＣの調製、及びＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、実施例２と同様の方法で行った。
＜ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ結果＞
　Ｔリンパ球刺激抗原として、ＨＫＵ１－Ｓ（図１０Ａ）、ＯＣ４３－Ｓ（図１０Ｂ）、ＮＬ６３－Ｓ（図１１Ａ）、２２９Ｅ－Ｓ（図１１Ｂ）、ＣｏＶ２－Ｓ（図１２Ａ）及び、ＣｏＶ２－ａｌｌ（図１２Ｂ）をそれぞれ用いて、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った結果を図１０Ａ～図１２Ｂにそれぞれ示す。図中、「Ｐｒｅ」はワクチン接種前を示し、「Ｐｏｓｔ」はワクチン接種後を示す。
　ＡＣＥ２を受容体としないコロナウイルス（ＨＫＵ１、ＯＣ４３、２２９Ｅ）のＳ蛋白に対する反応は、ワクチン接種前とワクチン接種後とで、有意な差はなかった（図１０Ａ、図１０Ｂ、図１１Ｂ）。
　ＡＣＥ２を受容体とするコロナウイルス（ＮＬ６３）のＳ蛋白に対する反応は、ワクチン接種前と比較して、ワクチン接種後で有意に上昇した（図１１Ａ）。
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の蛋白に対する反応は、ワクチン接種前と比較して、ワクチン接種後で有意に上昇した（図１２Ａ、図１２Ｂ）。
＜ワクチン接種前後の重症化リスク値（Ｙ）＞
　ワクチン接種前とワクチン接種後とで、前記式（Ｉ）により、重症化リスク値（Ｙ）を算出した。その結果を図１３Ａ及び図１３Ｂに示す。
　ワクチンの接種前とワクチン接種後とで、Ｙ値に有意な差はなかった。ただし、何人かの被験者では、ワクチン接種後にＹ値が明らかに低下した（図１３Ｂ）。
［実施例４］
　公知のＣＯＶＩＤ－１９重症化リスク因子と重症化リスク値（Ｙ）との相関を解析した結果を図１４Ａ～図１５Ｂに示す。重症化リスク値（Ｙ）は、年齢（図１４Ａ）、ＢＭＩ（図１４Ｂ）、喫煙指数ＢＩ（図１５Ａ）、及び喫煙歴（図１５Ｂ）のいずれとも有意な相関がなかった。
　実施例２の被験者では、重症度は、年齢（図１６Ａ）及びＢＭＩ（図１６Ｂ）のいずれとも有意な相関はなかった。実施例２の被験者では、重症度は、喫煙指数ＢＩ（図１７Ａ）及び喫煙歴（図１７Ｂ）と有意な相関があった。
　本発明によれば、コロナウイルス感染症の重症化リスクを簡易に判定可能な、コロナウイルス感染症の重症化リスクの評価方法、およびコロナウイルス感染症の重症化リスク評価キットが提供される。本発明にかかる評価方法および評価キットは、ＣＯＶＩＤ－１９の重症化リスクの評価に適用可能である。また、将来の未知のコロナウイルス感染症に対しても適用可能である。
　以上、本発明の好ましい実施形態を説明および図示してきたが、これらは本発明を例示するものであり、限定的なものとみなされるべきではないことを理解すべきである。本発明の精神または範囲から逸脱することなく、追加、省略、置換、およびその他の変更を行うことができる。したがって、本発明は、前述の説明によって限定されるものとはみなされず、添付の請求項の範囲によってのみ限定される。

Claims (13)

  1. 　コロナウイルス感染症の重症化リスクの評価方法であって、
    　（ａ）対象由来のＴ細胞を、前記コロナウイルス感染症の原因ウイルスとは異なる種類のコロナウイルスである他種コロナウイルスに由来するタンパク質またはその断片に接触させる工程と、
    　（ｂ）前記タンパク質またはその断片に対する前記Ｔ細胞の応答性に基づいて、前記コロナウイルス感染症の重症化リスクを評価する工程と、
    　を含む、コロナウイルス感染症の重症化リスクの評価方法。
  2. 　前記タンパク質またはその断片が、前記原因ウイルスが受容体とする分子とは異なる分子を受容体とする第１の他種コロナウイルスに由来し、
    　前記（ｂ）の工程が、前記タンパク質またはその断片に対する前記Ｔ細胞の応答性が低い場合に、前記コロナウイルス感染症の重症化リスクが高いと評価する工程である、請求項１に記載のコロナウイルス感染症の重症化リスクの評価方法。
  3. 　前記タンパク質またはその断片が、前記原因ウイルスが受容体とする分子と同じ分子を受容体とする第２の他種コロナウイルスに由来し、
    　前記（ｂ）の工程が、前記タンパク質またはその断片に対する前記Ｔ細胞の応答性が高い場合に、前記コロナウイルス感染症の重症化リスクが高いと評価する工程である、請求項１に記載のコロナウイルス感染症の重症化リスクの評価方法。
  4. 　前記工程（ａ）が、
    　（ａ１）前記Ｔ細胞を、前記原因ウイルスが受容体とする分子とは異なる分子を受容体とする第１の他種コロナウイルスに由来するタンパク質またはその断片に接触させる工程と、
    　（ａ２）前記Ｔ細胞を、前記原因ウイルスが受容体とする分子と同じ分子を受容体とする第２の他種コロナウイルスに由来するタンパク質またはその断片に接触させる工程と、を含み、
    　前記（ｂ）の工程が、
    　（ｂ１）前記第１の他種コロナウイルスに由来するタンパク質またはその断片に対する前記Ｔ細胞の第１の応答性を測定する工程と、
    　（ｂ２）前記第２の他種コロナウイルスに由来するタンパク質またはその断片に対する前記Ｔ細胞の第２の応答性を測定する工程と、
    　（ｂ３）前記第１の応答性に対する前記第２の応答性の比の値（第２の応答性／第１の応答性）に基づいて、前記コロナウイルス感染症の重症化リスクを評価する工程と、
    　を含む、請求項１に記載のコロナウイルス感染症の重症化リスクの評価方法。
  5. 　前記原因ウイルスおよび前記タンパク質またはその断片が由来する前記コロナウイルスが、ベータコロナウイルス属またはアルファコロナウイルス属である、請求項１～４のいずれか一項に記載のコロナウイルス感染症の重症化リスクの評価方法。
  6. 　前記原因ウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求項１～５のいずれか一項に記載のコロナウイルス感染症の重症化リスクの評価方法。
  7. 　コロナウイルス感染症の重症化リスク評価キットであって、
    　前記コロナウイルス感染症の原因ウイルスとは異なる種類のコロナウイルスである他種コロナウイルスに由来するタンパク質またはその断片を含む、
    　コロナウイルス感染症の重症化リスク評価キット。
  8. 　Ｔ細胞が抗原刺激に応答して分泌するサイトカインに対する特異的結合物質をさらに含む、請求項７に記載のコロナウイルス感染症の重症化リスク評価キット。
  9. 　固相担体に結合された前記特異的結合物質と、標識物質で標識された前記特異的結合物質とを含む、請求項８に記載のコロナウイルス感染症の重症化リスク評価キット。
  10. 　前記サイトカインがインターフェロンγ、インターロイキン２、及び腫瘍壊死因子アルファからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項８または９に記載のコロナウイルス感染症の重症化リスク評価キット。
  11. 　前記タンパク質またはその断片が、
    　前記原因ウイルスが受容体とする分子とは異なる分子を受容体とする第１の他種コロナウイルスに由来するタンパク質またはその断片と、
    　前記原因ウイルスが受容体とする分子と同じ分子を受容体とする第２の他種コロナウイルスに由来するタンパク質またはその断片と、
    　を含む、請求項７～１０のいずれか一項に記載のコロナウイルス感染症の重症化リスク評価キット。
  12. 　前記原因ウイルスおよび前記タンパク質またはその断片が由来する前記コロナウイルスが、ベータコロナウイルス属またはアルファコロナウイルス属である、請求項７～１１のいずれか一項に記載のコロナウイルス感染症の重症化リスク評価キット。
  13. 　前記原因ウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求項７～１２のいずれか一項に記載のコロナウイルス感染症の重症化リスク評価キット。
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