WO2023002088A1 - Composición basada en la actividad antioxidante de la enzima superóxido dismutasa y su aplicación en enfermedades oculares - Google Patents

Composición basada en la actividad antioxidante de la enzima superóxido dismutasa y su aplicación en enfermedades oculares Download PDF

Info

Publication number
WO2023002088A1
WO2023002088A1 PCT/ES2022/070486 ES2022070486W WO2023002088A1 WO 2023002088 A1 WO2023002088 A1 WO 2023002088A1 ES 2022070486 W ES2022070486 W ES 2022070486W WO 2023002088 A1 WO2023002088 A1 WO 2023002088A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sod
composition according
composition
concentration
eye
Prior art date
Application number
PCT/ES2022/070486
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Francisco Javier ESCOBAR BEDIA
Aloma Tadea MAYORDOMO FEBRER
Maria Dolores PINAZO DURÁN
María José SABATER PICOT
Silvia María SANZ GONZÁLEZ
Original Assignee
Fundación para el Fomento de la investigación Sanitaria y Biomédica de la Comunidad Valenciana (FISABIO)
Universitat Politècnica De València
Consejo Superior De Investigaciones Cientificas. (Csic)
Universidad Cardenal Herrera CEU San Pablo
Universitat De València
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fundación para el Fomento de la investigación Sanitaria y Biomédica de la Comunidad Valenciana (FISABIO), Universitat Politècnica De València, Consejo Superior De Investigaciones Cientificas. (Csic), Universidad Cardenal Herrera CEU San Pablo, Universitat De València filed Critical Fundación para el Fomento de la investigación Sanitaria y Biomédica de la Comunidad Valenciana (FISABIO)
Priority to EP22845498.9A priority Critical patent/EP4374871A1/en
Publication of WO2023002088A1 publication Critical patent/WO2023002088A1/es

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/728—Hyaluronic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/14—Alkali metal chlorides; Alkaline earth metal chlorides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • A61K38/446—Superoxide dismutase (1.15)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y115/00—Oxidoreductases acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • C12Y115/01—Oxidoreductases acting on superoxide as acceptor (1.15) with NAD or NADP as acceptor (1.15.1)
    • C12Y115/01001—Superoxide dismutase (1.15.1.1)

Definitions

  • the present invention refers to a composition containing an enzyme belonging to the group of superoxide dismutases (SOD), or any SOD mimic, together with hyaluronic acid and EDTA or any of its salts.
  • Said composition is part of a pharmaceutical formulation which promotes or maintains ocular health through the inhibition of cell damage produced by free radicals, making it useful in the treatment or prevention of ocular diseases that occur with oxidative stress, or as coadjuvant of other current existing treatments. In the same way, it is also useful for post-operative use of ocular anterior segment surgery, and/or laser treatment in which an inflammatory response and oxidative stress occurs.
  • the present invention belongs to the field of pharmacology or pharmaceutical chemistry.
  • Oxidative stress arises when there is an imbalance between the production of reactive oxygen species (ROS) and the ability of the biological system to counteract them (antioxidant systems) in favor of the former. That is, oxidative stress is due to increased pro-oxidant activity and/or reduced antioxidant defense mechanisms, or to failure of repair mechanisms. of oxidative damage at the cellular and tissue level. Under normal conditions, oxygen (O2) is reduced tetravalently to H 2 0.
  • ROS reactive oxygen species
  • the enzyme superoxide dismutase SOD is the first defense barrier against oxidative aggression, since it exerts a protective role against oxidative stress, catalyzing the dismutation of the highly toxic radical called superoxide anion (O2 ' ) into O2 and H2O2, which is finally transformed into a totally innocuous compound like water.
  • the O2 ' radical has been shown to be an important mediator of tissue damage and organ dysfunction in different processes (ie inflammation, apoptosis, cytotoxicity/excitotoxicity, angiogenesis), and since the SOD enzyme is a potent antioxidant capable of blocking the formation of radical O2 ' , efforts have been made to develop a therapy to normalize the activity of the cellular detoxification system and reduce ROS levels at the ocular level, based on the redox activity of the SOD enzyme (S. Di Meo, T. Reed , P. Venditti, VM Victor, Role of ROS and RNS Sources in Physiological and Pathological Conditions, Oxid. Med. Cell Longev., 2016, 2016: 1245049).
  • SOD enzyme for the treatment of diseases associated with oxidative stress
  • old inventions describe the use of pharmaceutical compositions containing SOD enzyme for topical administration in order to prevent and treat ocular diseases (US2003/0228299).
  • other inventions such as the one described in W003/082081 describe the use of a compound (i.e. SOD) in topical, intravitreal, and systemic administration to reduce the amount of ROS metabolites and thus treat intraocular damage.
  • non-enzymatic products such as the exogenous ones ingested with food, among which vitamins (A, C, E), metals such as Zn, Se, Mn , carotenoids (lutein, zeaxanthin), flavonoids (catechins, quercetins, anthocyanidins), and omega 3 fatty acids, or as endogenous acids, among which glutathione and coenzyme Q10 stand out. All of them are also often used as antioxidants.
  • vitamins A, C, E
  • metals such as Zn, Se, Mn
  • carotenoids lutein, zeaxanthin
  • flavonoids catechins, quercetins, anthocyanidins
  • omega 3 fatty acids or as endogenous acids, among which glutathione and coenzyme Q10 stand out. All of them are also often used as antioxidants.
  • document CN101243875 describes a preparation containing lutein and beta-carotene to increase the activity of SOD protected by gliadin. It appears that lutein alone is less efficient in increasing SOD enzyme activity than in combination with b-carotene, highlighting this synergistic effect.
  • Another more recent invention describes the preparation of a preparation to be administered orally containing a plant extract of the SOD enzyme protected with a polymer in association with lutein and zeaxanthin (US 2013/0195985).
  • the inventors have developed a stable isotonic solution that incorporates SOD, hyaluronic acid and EDTA or its salts that distinguishes this preparation from others currently on the market, since in addition to its moisturizing, lubricating, regenerative and protective properties of the ocular surface provided by hyaluronic acid, the EDTA salt acts as a chelating agent for free metal cations (ie copper, iron, manganese,...) that can catalyze oxidation reactions, thus exerting a synergistic effect that enhances the antioxidant activity of the enzyme SOD.
  • free metal cations ie copper, iron, manganese,
  • composition of the invention is effective and tolerable in regulating total antioxidant activity and interleukin-6-dependent inflammatory activity, so it can be applied to pathologies of the ocular surface in which both lesion mechanisms are involved, specifically in the syndrome of ocular surface dysfunction - dry eye
  • the present invention refers to a composition comprising: superoxide dismutase (SOD) enzyme, in a concentration of between 0.002 U/ml to 30,000 U/ml.
  • SOD superoxide dismutase
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • the SOD enzyme refers to any of the 4 known isomorphic proteins of this enzyme, therefore, preferably, the SOD of the composition of the invention is selected from among Cu/Zn-SOD, Mn-SOD, Ni-SOD and Fe- SOD. More preferably said SOD is Cu/Zn-SOD.
  • the SOD enzyme of the composition of the invention refers to a SOD enzyme of natural origin (plant, animal or human origin) or of synthetic origin, preferably of animal origin.
  • SOD enzyme of natural origin it does not come from any genetically modified organism (GMO).
  • GMO genetically modified organism
  • SOD enzyme of natural origin it does not come from any genetically modified organism (GMO).
  • GMO genetically modified organism
  • it is a SOD (Cu/Zn-SOD) enzyme of animal origin from mammalian cells (bovine erythrocytes).
  • SOD enzyme of synthetic origin it refers to recombinant SOD, both of plant and animal origin.
  • a SOD enzyme sequence of human origin cloned and produced in a prokaryotic system such as a bacterium.
  • a SOD enzyme sequence of human origin cloned and produced in a eukaryotic system such as for example a fungal or mammalian cell (ie CHO cells).
  • a SOD enzyme sequence of human origin cloned and produced in a viral system such as a baculovirus.
  • composition of the invention are any mimics of SOD, which are understood as functional analogues of this low molecular weight enzyme; Among them, it is worth highlighting metal complexes that act as pharmacological agents, blocking the production of radicals, especially the superoxide radical anion, among others. Also organic, inorganic and metalloorganic molecules that act as functional analogues, blocking the formation of radicals.
  • the SOD of the composition of the invention is in a concentration between 0.2 and 20,000U/ml, preferably between 1 and 500U/ml, more preferably between 10 and 250U/ml and even more preferably between 15 and 500U/ml. 60U/ml.
  • 1 mg of SOD can be estimated approximately as 4,700 U according to the manufacturer Sigma-Aldrich and these units in the present invention are referred to the total ml of the composition described herein.
  • the hyaluronic acid in the composition is at a concentration of between 0.05 to 5% weight by volume with respect to the total composition and even more preferably 0.1% weight by volume with respect to the total composition.
  • the EDTA in the composition is at a concentration of between 0.05 to 5% weight per volume with respect to the total composition and more preferably 0.1% weight per volume with respect to the total composition.
  • the EDTA in the composition of the invention is in the sodium salt form.
  • the above mentioned possible buffers are in the form of sodium salt.
  • the buffer in the composition of the invention is sodium borate.
  • the composition of the invention further comprises a salt selected from among NaCl, KCl, MgCh, CaCh. More preferably, the salt is NaCI.
  • the composition of the invention is characterized by having a pH between 7 and 7.5. More preferably, characterized by having a pH of 7.3.
  • compositions comprising the composition as described above and at least one pharmaceutically acceptable carrier.
  • this pharmaceutical composition is formulated as an eye drop, artificial tear solution, injection solution, spray, gel, ointment or cream.
  • Another aspect of the invention relates to the composition as described above for use as a medicament.
  • Another aspect of the invention relates to the composition as described above for use in the treatment or prevention of eye diseases.
  • the ocular disease is selected from dry eye syndrome, conjunctivitis with an inflammatory component, chronic blepharitis, non-infectious keratitis, keratoconus, non-infectious uveitis, and/or glaucoma.
  • the composition of the invention can also be used in the treatment and/or prevention of the inflammatory response and oxidative stress produced in the postoperative period of ocular surgery, particularly of the ocular anterior segment and/or laser treatments.
  • Examples of the administration route of the composition of the invention include systemic administration (for example, oral administration or injection), topical administration (for example, ocular instillation, eye ointment, artificial tears), periocular administration (for example, sub-Tenon capsule administration), conjunctival administration, intraocular administration, subretinal administration, suprachoroidal administration, retrobulbar administration and the like.
  • the administration route of the composition of the present invention can be appropriately determined according to whether the application to an oxidative stress-associated ophthalmic disease is aimed at prophylaxis or treatment and the like.
  • the preferred route of administration is topical ophthalmic administration.
  • composition of the present invention is preferably administered to a particularly human subject, either after the diagnosis of the risk of ophthalmic disease, before initiating a possible treatment thereof (ie as prophylactic treatment) or after the onset of a disease. diagnosed ophthalmic (as therapeutic treatment).
  • the treatment plan can be appropriately determined according to the type of active ingredient to be used, dosage, route of administration, cause and, when necessary, the level of subjective symptoms of an ophthalmic disease.
  • the dosage (dose) of the composition of the present invention for a subject, particularly a human being will be an amount sufficient to provide a desired response in the latter, whereby administration will take place for a reasonable period of time.
  • the dose is appropriately determined according to various factors including the concentration of the active ingredient to be used, the age, the species, the symptoms, the disease state, the body weight and severity of the disease of the administration subject, the route, timing and frequency of administration and the like.
  • the dose can also be appropriately controlled in accordance with the route, time and frequency of administration and the like. Depending on the symptom or stage of the disease, long-term treatment involving the administration of several doses per day may be necessary.
  • composition of the present invention preferably contains a "pharmaceutically acceptable carrier" and, as an active ingredient, SOD in an amount sufficient to prophylactically or therapeutically treat an ophthalmic disease such as those mentioned above.
  • the vehicle can be any as long as it incorporates the drug and is not particularly limited except when it is limited by physicochemical elements to consider (for example, solubility and lack of reactivity with the compound or influence on the structure of the SOD) and route of administration.
  • the administration form (dosage form) of the composition of the present invention is not particularly limited and can be administered in various forms to achieve a desired therapeutic or prophylactic action.
  • composition of the present invention may contain another pharmaceutically active compound as long as it does not inhibit the effect of SOD.
  • composition of the present invention can be administered simultaneously with another pharmaceutically active compound as long as the effect of the present invention is not impaired.
  • Simultaneous administration means the administration of another pharmaceutically active compound simultaneously (eg, in the same preparation or in a different preparation) by the same or different route of administration before or after administration of the composition of the present invention.
  • the present invention provides a method of treating ophthalmic diseases comprising a step of administering, to a subject in need of treatment, the composition of the invention in an amount sufficient to treat the subject for the disease and/or prevent the development of possible ophthalmic pathologies.
  • FIG. 1 Graphical representation (in bar diagram and dot graph) of the activity (Cl%) of the SOD enzyme over time in artificial tear solution at three different concentrations: Composition A: Light gray color: 20.3 U /ml; Composition B: Dark gray color 56.4 U/mL; Composition C: Black color 169.2 U/mL, determined at -21 eC , +4 eC and +25 eC .
  • Figure 3 Representation of weekly body weight for the three study groups. A) Mice treated with 20.3U/mL SOD, B) Mice treated with 56.4U/mL SOD and C) Mice treated with 169.2U/mL SOD.
  • FIG. 4 Fluorescein staining test. A) Both eyes before removing the excess. B) Right eye and C) Left eye. Both eyes give a negative result, indicative of the absence of corneal ulcers.
  • Figure 9 Mouse plasma concentration of IL6 at the start of the trial (basal) and after 15 days of treatment with the two concentrations of SOD (SOD1 and SOD2) tested.
  • Example 1 preparation of the ophthalmic compositions.
  • the artificial tear solution is prepared in a topaz-colored glass container to protect it from light.
  • the composition of the artificial tear is as follows: hyaluronic acid (0.1%), disodium edetate (0.1%), NaCI and boric acid/sodium borate (pH: 7.3).
  • the artificial tear solution is prepared in a topaz-colored glass container to protect it from light.
  • the composition of the artificial tear is as follows: hyaluronic acid (0.1%), disodium edetate (0.1%), NaCl and boric acid/sodium borate (pH: 7.3)
  • the artificial tear solution is prepared in a topaz-colored glass container to protect it from light.
  • the composition of the artificial tear is as follows: hyaluronic acid (0.1%), disodium edetate (0.1%), NaCI and boric acid/sodium borate (pH: 7.3).
  • Example 2 determination of the antioxidant activity of the compositions of the invention
  • the determination of the activity of the SOD enzyme in the three compositions A, B and C prepared (20.3 U/ml, 56.4 U/ml and 169.2 U/ml) and at three different temperatures (-20, +4 and +25 e C ) is performed periodically using the McCord-Fridovich method.
  • This method indirectly quantifies the ability of the enzyme to catalyze the dismutation reaction of the superoxide anion (O2 ' ) into H2O2 and O2 using colorimetric methods.
  • fi x rate of reduction of NBT in the presence of X units of SOD
  • the SOD enzyme fully maintains its original activity, and even a large part of it, in isotonic and buffered solutions of artificial tears within the range of concentrations and temperatures studied in the tests and at relatively long storage times (2 months).
  • the biological assays were carried out in three groups of mice, each one treated with one of the compositions 1, 2 and 3 respectively, for 4 weeks (2 instillations/day; 1 drop/instillation). During the four weeks of the tests, the mean body weights of each group of mice did not differ statistically significant. However, there was a trend towards a progressive increase in body weight over time for each group ( Figure 6). Regarding the feeding and behavior of the animals, no significant differences were found between the different groups of mice.
  • mice Studies in mice indicate that daily instillation (2 instillations per day; 1 drop/instillation) for 4 weeks has no deleterious effect on the anterior segment and ocular adnexa. This is a very good result that confirms the tolerability of the instillation and the absence of toxicity derived from serial administrations.
  • Example 4 Measurement of the antioxidant activity of the composition of the invention in human tears.
  • the measurement of the total antioxidant activity of the tear samples is a determination of the composition of all the antioxidants present in said sample and provides information on the total antioxidant balance.
  • TAC Total Antioxidant Capacity
  • ABTS + - 2,2-azino-di-3-[ethylbenzothiazoline] sulfonate
  • the amount of ABTS + - produced can be quantified spectrophotometrically by measuring the absorbance of a band at 750nm (or 405nm).
  • the tears were obtained by the same ophthalmologist on all occasions and with the same extraction technique, to avoid differences derived from the extraction technique. All subjects read the information sheet and signed the informed consent giving their consent to participate in the study.
  • the initial interview, the clinical history and the ophthalmological examination were used to randomly select those attending the ophthalmological consultations, when it was verified that they met the inclusion/exclusion criteria in the study.
  • the tears were frozen at -80 °C until processing.
  • TAC total antioxidant activity
  • Table 2 shows our results in tears obtained from subjects diagnosed with ocular surface dysfunction syndrome -dry eye- distributed in the two subgroups to which the corresponding concentration of SOD was added. As can be seen, with the two concentrations of SOD tested, similar results were obtained.
  • the formulation added to the tears of patients with ocular surface dysfunction -dry eye- was able to reverse and maintain the values of total antioxidant activity within normal limits.
  • Figure 3 shows the graphical representation of the total antioxidant concentration in the two main groups classified into subgroups according to the concentration of SOD that was tested, with no differences between groups and subgroups, which supports the efficiency of the formula with SOD. to maintain a total antioxidant activity within normal values, in human tears.
  • This assay was developed to assess the effectiveness of the formulation containing SOD in the eyes of healthy mice, evaluating the expression of inflammation molecules, specifically interleukin 6, which has been shown to play an essential role in inflammation mechanisms and the immune response of patients. with the ocular surface dysfunction syndrome -dry eye-.
  • Antioxidants have inherent anti-inflammatory properties, through direct inhibition of EROX-mediated activation of NFkB signaling, which functions as a transcription factor promoting the expression of proinflammatory cytokines and chemokines.
  • 20 mice (10 females and 10 males) have been studied, kept in cages and stable conditions, with 12h/12h light, humidity, temperature and controlled feeding conditions (food and water), and examined at the beginning of the study and at the 15 days. The body weight is included in Figure 7.
  • One drop of the SOD1 solution was instilled in the right eye in 10 mice and one drop of the SOD2 solution in 10 mice.
  • both groups were instilled with one drop of the vehicle used in the left eye without the formulation.
  • the ophthalmological examination demonstrated that the anterior segment structures were intact at the beginning of the study.
  • the eyelids, conjunctiva, cornea, anterior chamber and its transparency, pupils, and iris were examined.
  • Blood was drawn from the submandibular vein of the animals, and determination of the proinflammatory molecule interleukin 6 (IL6) was performed by ELISA. Data were expressed as mean + SD in pg/mL, following the manufacturer's protocol and instructions. The results are shown in figures 8 and 9.
  • IL6 proinflammatory molecule interleukin 6

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

La presente invención se refiere a la composición que contiene una enzima perteneciente al grupo de las superóxido dismutasas (SOD), o bien cualquier mímico de la SOD y similares junto con ácido hialurónico y EDTA. Dicha composición forma parte de una formulación farmacéutica la cual promueve o mantiene la salud ocular a través de la inhibición del daño celular y tisular producido por radicales libres, por lo que es útil en el tratamiento y/o prevención de enfermedades oculares que cursan con estrés oxidativo, o como coadyuvante de otros tratamientos actuales existentes, así como en tratamientos post-operatorios para tratar y/o prevenir reacciones adversas inflamatorias o de estrés oxidativo.

Description

COMPOSICIÓN BASADA EN LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LA ENZIMA SUPERÓXIDO DISMUTASA Y SU APLICACIÓN EN ENFERMEDADES OCULARES
SECTOR DE LA TÉCNICA
La presente invención se refiere a una composición que contiene una enzima perteneciente al grupo de las superóxido dismutasas (SOD), o bien cualquier mímico de la SOD, junto con ácido hialurónico y EDTA o cualquiera de sus sales. Dicha composición forma parte de una formulación farmacéutica la cual promueve o mantiene la salud ocular a través de la inhibición del daño celular producido por radicales libres, por lo que es útil en el tratamiento o prevención de enfermedades oculares que cursan con estrés oxidativo, o como coadyuvante de otros tratamientos actuales existentes. De igual modo también es útil para uso post-operatorio de cirugía del segmento anterior ocular, y/o tratamiento láser en los que se produce una respuesta inflamatoria y estrés oxidativo.
Por tanto, la presente invención pertenece al campo de la farmacología o química farmacéutica.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las consultas oftalmológicas atienden diariamente a un elevado número de pacientes que sufren enfermedades potencialmente causantes de discapacidad visual y ceguera, y otras muchas consultas por problemas oculares de muy diversa índole. Hay que destacar aquellas que afectan a los errores refractivos (miopía, hipermetropía astigmatismo, presbicia), a superficie ocular (síndrome de ojo seco, queratocono, distrofias corneales), y las que afectan a la retina o al nervio óptico (retinopatías, accidentes vasculares retiñíanos, degeneración macular y/o neuropatías ópticas), así como patologías neurodegenerativas (glaucoma, distrofias retinianas hereditarias y síndromes genéticos). Todos ellos, desde los más leves hasta los más graves, tienen en común procesos patogénicos tales como el estrés oxidativo, la inflamación y/o la apoptosis.
El estrés oxidativo surge cuando hay un desequilibrio entre la producción de las especies reactivas del oxígeno (EROs) y la capacidad del sistema biológico de contrarrestarlos (sistemas antioxidantes) en favor de las primeras. Es decir, el estrés oxidativo se debe al aumento de la actividad pro-oxidante y/o a la reducción de los mecanismos de defensa antioxidantes, o bien al fracaso de los mecanismos reparadores del daño oxidativo a nivel celular y tisular. En condiciones normales el oxígeno (O2) se reduce tetravalentemente a H20. Sin embargo, la reducción incompleta del oxígeno genera EROs, entre ellas el anión superóxido (O2 '), el cual en presencia de metales (Fe, Cu, Cr, Ni) induce la formación del peróxido de hidrógeno (H2O2) y radical hidroxilo (OH ) siendo estas especies de oxígeno muy nocivas para las células, tejidos, órganos y sistemas (Figura 1).
En este contexto, la enzima superóxido dismutasa SOD es la primera barrera de defensa frente a la agresión oxidativa, ya que ejerce un papel protector contra el estrés oxidativo catalizando la dismutación del radical altamente tóxico denominado anión superóxido (O2 ') en O2 y H2O2, el cual finalmente se transforma en un compuesto totalmente inocuo como el agua. Dado que se ha demostrado que el radical O2 ' es un importante mediador del daño tisular y de la disfunción orgánica en diferentes procesos (i.e. inflamación, apoptosis, citotoxicidad/excitotoxicidad, angiogénesis), y puesto que la enzima SOD es un potente antioxidante capaz de bloquear la formación de radical O2 ' se ha buscado elaborar una terapia para normalizar la actividad del sistema de detoxificación celular y disminuir los niveles de EROs a nivel ocular, basada en la actividad redox de la enzima SOD (S. Di Meo, T. Reed, P. Venditti, V. M. Víctor, Role of ROS and RNS Sources in Physiological and Pathological Conditions, Oxid. Med. Cell Longev., 2016, 2016: 1245049).
El uso de la enzima SOD para el tratamiento de enfermedades asociadas al estrés oxidativo es conocido en el estado del arte. De hecho, en antiguas invenciones se describe el uso de composiciones farmacéuticas conteniendo enzima SOD para administración tópica con objeto de prevenir y tratar enfermedades oculares (US2003/0228299). Además, en otras invenciones como la descrita en W003/082081 se describe el uso de un compuesto (i.e. SOD) en administración tópica, intravítrea, y sistémica para reducir la cantidad de metabolitos de EROs y tratar así el daño intraocular.
Por otra parte, la administración de SOD por vía oral ha estado limitada debido a la degradación de la enzima a través del tracto digestivo. Se sabe que la ruta de administración es un factor crítico en cualquier intervención terapéutica. Para superar este problema se ha descrito el uso de gliadina de trigo (un biopolímero o proteína que se encuentra en la harina de trigo) para proteger la enzima SOD de la degradación digestiva (GliSODinR (Isocell)). De hecho, se ha demostrado que la actividad catalítica de SOD es preservada por este biopolímero durante la administración oral, permitiendo su administración a través de esta vía (I. Vouldoukis, D. Lacan, C. Kamate, P. Coste, A. Calenda, D. Mazier, M. Conti, B. Dugas, Journal of Ethnopharmacology, 2004,94(1), 67- 75).
En paralelo a la protección de tipo enzimático contra el estrés oxidativo también existen productos no enzimáticos, como los exógenos que se ingieren con la alimentación, entre los que destacan las vitaminas (A, C, E), los metales como Zn, Se, Mn, los carotenoides (luteína, zeaxantina), flavonoides (catequinas, quercetinas, antocianidinas), y los ácidos grasos omega 3, o como los endógenos entre los que destacan el glutatión y la coenzima Q10. Todos ellos se suelen emplear también como antioxidantes. En los documentos US2005/0032914, US2010/0159029 y W02009/129859, se describen composiciones para administración oral de luteína, zeaxantina en combinación con otros productos antioxidantes los cuales protegen la visión, disminuyen la sintomatología de diversas enfermedades oculares y enlentecen el curso de la degeneración macular seca o atrófica, y promueven la salud ocular en general.
Por otra parte, en el documento CN101243875 se describe un preparado que contiene luteína y beta-caroteno para incrementar la actividad de la SOD protegida por gliadina. Aparentemente la luteína sola es menos eficiente para incrementar la actividad de la enzima SOD que en combinación con b-caroteno, destacando este efecto sinérgico. Otra invención más reciente describe la preparación de un preparado para ser administrado por vía oral conteniendo un extracto vegetal de la enzima SOD protegida con un polímero en asociación con luteína y zeaxantina (US 2013/0195985).
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores han desarrollado una solución isotónica estable que incorpora SOD, ácido hialurónico y EDTA o sus sales que distingue a este preparado de otros que se comercializan en la actualidad, ya que además de las propiedades humectantes, lubricantes, regeneradoras y protectoras de la superficie ocular que aporta el ácido hialurónico, la sal EDTA actúa como agente quelante de cationes metálicos libres (i.e. cobre, hierro, manganeso,..) que pueden catalizar reacciones de oxidación, por lo que ejerce un efecto sinérgico potenciador de la actividad antioxidante de la enzima SOD. Por otra parte, con la formulación de todos estos componentes en un mismo preparado se consigue una solución de la enzima estable a largo plazo (2 meses). Además, los datos de los ensayos realizados con lágrimas humanas y plasma de animales experimentales demuestran que la composición de la invención es efectiva y tolerable para regular la actividad antioxidante total y la actividad inflamatoria dependiente de la interleuquina 6, por lo que pueden aplicarse a las patologías de la superficie ocular en las que ambos mecanismos lesivos están implicados, concretamente en el síndrome de disfunción de la superficie ocular - ojo seco
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una composición que comprende: - enzima superóxido dismutasa (SOD), en una concentración de entre 0,002 U/ml a 30.000 U/ml.
- ácido hialurónico o cualquiera de sus sales, en una concentración de entre 0,0001 y 10% en peso por volumen respecto a la composición total,
- ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o cualquiera de sus sales, en una concentración de entre 0,0001 a 10% en peso por volumen respecto a la composición total, y
- un tamponador de pH que se selecciona de entre citrato, fosfato, ascorbato, borato. La enzima SOD se refiere a cualquiera de las 4 proteínas isomorfas conocidas de esta enzima, por lo que, preferiblemente, la SOD de la composición de la invención se selecciona entre Cu/Zn-SOD, Mn-SOD, Ni-SOD y Fe-SOD. Más preferiblemente, dicha SOD es Cu/Zn-SOD. La enzima SOD de la composición de la invención se refiere a enzima SOD de origen natural (origen vegetal, animal o humano) o de origen sintético, preferiblemente de origen animal.
En el caso de enzima SOD de origen natural, no procede de ningún organismo modificado genéticamente (OMG). En la más preferible de las realizaciones, se trata de una enzima SOD (Cu/Zn-SOD) de origen animal procedente de células de mamífero (eritrocitos de bovino).
En el caso de enzima SOD de origen sintético, se refiere a SOD recombinante, tanto de origen vegetal como animal. Por ejemplo, una secuencia de enzima SOD de origen humano clonada y producida en un sistema procariota, tal como por ejemplo una bacteria. O bien, una secuencia de enzima SOD de origen humano clonada y producida en un sistema eucariota, tal como por ejemplo un hongo o una célula de un mamífero (i.e. células CHO). O bien, una secuencia de enzima SOD de origen humano clonada y producida en un sistema vírico, tal como por ejemplo un baculovirus.
También se consideran para la composición de la invención cualquier mímico de la SOD, que se entienden como análogos funcionales de esta enzima de bajo peso molecular; entre ellos cabe destacar complejos metálicos que actúen como agentes farmacológicos bloqueando la producción de radicales, especialmente el anión radical superóxido, entre otros. También moléculas orgánicas, inorgánicas y metaloorgánicas que actúen como análogos funcionales bloqueando la formación de radicales.
Preferiblemente, la SOD de la composición de la invención está en una concentración de entre 0,2 a 20.000U/ml, preferiblemente entre 1 y 500 U/ml, más preferiblemente entre 10 a 250 U/ml y aún más preferiblemente de 15 a 60 U/ml. En la presente invención 1 mg de SOD puede estimarse aproximadamente como 4.700 U según fabricante Sigma-Aldrich y estas unidades en la presente invención son referidas a los mi totales de la composición aquí descrita. Preferiblemente, el ácido hialurónico de la composición está una concentración de entre 0,05 a 5% de peso por volumen respecto a la composición total y aún más preferiblemente 0,1% de peso por volumen respecto a la composición total.
Preferiblemente, el EDTA de la composición está una concentración de entre 0,05 a 5% de peso por volumen respecto a la composición total y más preferiblemente 0,1% de peso por volumen respecto a la composición total.
Preferiblemente, el EDTA de la composición de la invención está en forma sal sódica. Preferiblemente, los posibles tamponadores arriba mencionados están en forma de sal sódica. Preferiblemente, el tamponador de la composición de la invención es borato sódico.
Preferiblemente, la composición de la invención comprende además una sal que se selecciona de entre NaCI, KCI, MgCh, CaCh. Más preferiblemente, la sal es NaCI. Preferiblemente, la composición de la invención está caracterizada por tener un pH de entre 7 a 7,5. Más preferiblemente, caracterizada por tener un pH de 7,3.
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la composición según se ha descrito anteriormente y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Preferiblemente, esta composición farmacéutica está formulada en forma de colirio, solución de lágrimas artificiales, solución inyectable, espray, gel, ungüento o crema.
Otro aspecto de la invención se refiere a la composición según se ha descrito anteriormente para su uso como medicamento.
Otro aspecto de la invención se refiere a la composición según se ha descrito anteriormente para uso en el tratamiento o prevención de enfermedades oculares.
Preferiblemente, la enfermedad ocular se selecciona de entre síndrome de ojo seco, conjuntivitis con componente inflamatorio, blefaritis crónicas, queratitis no infecciosas, queratocono, uveítis no infecciosas y/o glaucoma.
Preferiblemente, la composición de la invención también se puede usar en el tratamiento y/o prevención de la respuesta inflamatoria y el estrés oxidativo producidos en post operatorio de cirugía ocular, particularmente del segmento anterior ocular y/o tratamientos con láser.
Los ejemplos de la vía de administración de la composición de la invención incluyen administración sistémica (por ejemplo, administración oral o inyección), administración tópica (por ejemplo, instilación ocular, ungüento para los ojos, lágrimas artificiales), administración periocular (por ejemplo, administración de cápsulas sub-Tenon), administración conjuntiva, administración intraocular, administración subretiniana, administración supracoroidea, administración retrobulbar y similares. La vía de administración de la composición de la presente invención puede determinarse apropiadamente según si la aplicación a una enfermedad oftálmica asociada a estrés oxidativo tiene como objetivo la profilaxis o el tratamiento y similares. La vía de administración preferida es una administración tópica oftálmica. La composición de la presente invención se administra preferiblemente a un sujeto particularmente humano, bien sea después del diagnóstico del riesgo de enfermedad oftálmica, antes de iniciar un posible tratamiento de la misma (es decir como tratamiento profiláctico) o bien después del inicio de una enfermedad oftálmica diagnosticada (como tratamiento terapéutico). El plan de tratamiento puede determinarse apropiadamente de acuerdo con el tipo de ingrediente activo a usar, dosis, vía de administración, causa y, cuando sea necesario, el nivel de síntomas subjetivos de una enfermedad oftálmica.
La dosificación (dosis) de la composición de la presente invención para un sujeto particularmente un ser humano, será una cantidad suficiente para proporcionar una respuesta deseada en este último, por lo que la administración tendrá lugar por un período de tiempo razonable. La dosis se determina apropiadamente de acuerdo con varios factores que incluyen la concentración del ingrediente activo a usar, la edad, la especie, los síntomas, el estado de la enfermedad, el peso corporal y la gravedad de la enfermedad del sujeto de administración, la vía, el momento y la frecuencia de la administración y similares. La dosis también se puede controlar de manera apropiada de acuerdo con la ruta, el momento y la frecuencia de la administración y similares. Dependiendo del síntoma o estado de la enfermedad, puede ser necesario un tratamiento a largo plazo que implique la administración de varias dosis al día.
La composición de la presente invención contiene preferiblemente un "vehículo farmacéuticamente aceptable" y, como ingrediente activo, SOD en una cantidad suficiente para tratar profilácticamente o terapéuticamente una enfermedad oftálmica como por ejemplo las mencionadas anteriormente. El vehículo puede ser cualquiera siempre que incorpore el medicamento y no esté particularmente limitado excepto cuando lo sea por elementos fisicoquímicos a considerar (por ejemplo, solubilidad y falta de reactividad con el compuesto o influencia sobre la estructura de la SOD) y vía de administración. La forma de administración (forma de dosificación) de la composición de la presente invención no está particularmente limitada y se puede administrar en varias formas para lograr una acción terapéutica o profiláctica deseada.
La composición de la presente invención puede contener otro compuesto farmacéuticamente activo siempre que no inhiba el efecto de la SOD. La composición de la presente invención se puede administrar simultáneamente con otro compuesto farmacéuticamente activo siempre que no se altere el efecto de la presente invención. La "administración simultánea" significa la administración de otro compuesto farmacéuticamente activo simultáneamente (por ejemplo, en la misma preparación o en una preparación diferente) por la misma o diferente vía de administración antes o después de la administración de la composición de la presente invención.
Además, la presente invención proporciona un método para tratar enfermedades oftálmicas que comprende un paso de administrar, a un sujeto que necesita el tratamiento, la composición de la invención en una cantidad suficiente para tratar al sujeto de la enfermedad y/o prevenir el desarrollo de posibles patologías oftálmicas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Transformación de O2 en EROs.
Figura 2. Representación gráfica (en diagrama de barras y gráfica de puntos) de la actividad (Cl%) de la enzima SOD con el tiempo en solución de lágrimas artificiales a tres concentraciones distintas: Composición A: Color gris claro: 20,3 U/ml; Composición B: Color gris oscuro 56,4 U/mL; Composición C: Color negro 169,2 U/mL, determinada a -21 eC, +4eC y +25eC.
Figura 3. Representación del peso corporal semanal para los tres grupos de estudio. A) Ratones tratados con 20.3U/mL SOD, B) Ratones tratados con 56.4U/mL SOD y C) Ratones tratados con 169.2U/mL SOD.
Figura 4. Prueba de tinción con fluoresceína. A) Ambos ojos antes de retirar el exceso. B) Ojo derecho y C) Ojo izquierdo. Ambos ojos dan un resultado negativo, indicativo de ausencia de úlceras en la córnea.
Figura 5. Presiones intraoculares determinadas semanalmente en los tres grupos de ratones bajo estudio. En los ojos derechos se instila tampón de lágrima como control (barras rayadas) y en el ojo izquierdo se instila tampón lágrima+ SOD (barras sólidas). Las dosis de SOD son: A) 20.3U/ml, B) 56.4U/ml y C) 169.2U/ml.
Figura 6. Representación gráfica de la concentración de antioxidante total en los dos grupos principales.
Figura 7. El peso corporal de todos los animales se determinó al comienzo del estudio en una balanza de animalario y se expresa como la media + DS en gramos.
Figura 8. Concentración en plasma de ratón de la IL6 al inicio del ensayo (basal) y a los 15 días de tratamiento con las dos concentraciones de la formula (SOD1 y SOD2).
Figura 9. Concentración en plasma de ratón de la IL6 al inicio del ensayo (basal) y a los 15 días de tratamiento con las dos concentraciones de SOD (SOD1 y SOD2) ensayadas.
REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓN
La presente invención se ilustra con los siguientes ejemplos: Ejemplo 1 : preparación de las composiciones oftálmicas.
Composición A: Inicialmente, se prepara una solución isotónica tamponada de lágrimas artificiales en la que se incorpora la enzima SOD a la concentración de 20.3 U/ml (U/ml = Unidades/mililitro). La solución de lágrima artificial se prepara en un envase de vidrio de color topacio para protegerla de la luz. La composición de la lágrima artificial es la siguiente: ácido hialurónico (0,1%), edetato disódico (0,1%), NaCI y ácido bórico/ borato sódico (pH: 7,3).
Composición B: Inicialmente, se prepara una solución isotónica tamponada de lágrimas artificiales en la que se incorpora la enzima SOD a la concentración de 56.4 U/ml (U/ml = Unidades/mililitro). La solución de lágrima artificial se prepara en envase de vidrio de color topacio para protegerla de la luz. La composición de la lágrima artificial es la siguiente: ácido hialurónico (0,1%), edetato disódico (0,1%), NaCI y ácido bórico/ borato sódico (pH: 7,3) Composición C: Inicialmente, se preparó una solución isotónica tamponada de lágrimas artificiales en la que se incorpora la enzima SOD a la concentración de 169.2 U/ml (U/ml = Unidades/mililitro). La solución de lágrima artificial se prepara en un envase de vidrio de color topacio para protegerla de la luz. La composición de la lágrima artificial es la siguiente: ácido hialurónico (0,1%), edetato disódico (0,1%), NaCI y ácido bórico/ borato sódico (pH: 7,3). Ejemplo 2: determinación de la actividad antioxidante de las composiciones de la invención
La determinación de la actividad de la enzima SOD en las tres composiciones A, B y C preparadas (20.3 U/ml, 56.4 U/ml y 169.2 U/ml) y a tres temperaturas distintas (-20, +4 y +25eC) se realiza de forma periódica mediante el método de McCord-Fridovich. Este método cuantifica de forma indirecta la capacidad de la enzima para catalizar la reacción de dismutación del anión superóxido (O2 ') en H2O2 y O2 empleando métodos colorimétricos. Concretamente mide la variación de la velocidad de reducción del colorante nitroazul de tetrazolio (NBT) por parte del anión superóxido (O2 ') a formazán (l= 532 nm), en base a la variación de la absorbancia de este último. A partir de este dato de absorbancia se puede obtener el coeficiente de inhibición Cl (%) (eq. 1) de la enzima SOD en lágrimas artificiales a diferentes concentraciones y temperaturas, siendo este un dato crucial que va a aportar información sobre la actividad y estabilidad de la enzima: 100 (eq. 1 )
Figure imgf000011_0001
Cl (%)= coeficiente de inhibición expresado en porcentaje fío = velocidad de reducción de NBT en ausencia de SOD fíx = velocidad de reducción de NBT en presencia de X unidades de SOD Tal como se desprende de los resultados analíticos representados en las figuras 2-5, puede decirse que en general los valores iniciales de Cl (%) de la enzima SOD se mantuvieron estables durante todo el periodo de tiempo (2 meses) que duraron los ensayos de las tres composiciones 1, 2 y 3 (20.3 U/ml, 56.4 U/ml y 169.2 U/ml) y a temperaturas diferentes (-20, +4 y +25eC).
Por todo ello puede concluirse que la enzima SOD mantiene íntegramente su actividad original, e incluso gran parte de ella, en las soluciones isotónicas y tamponadas de lágrimas artificiales dentro del rango de concentraciones y temperaturas estudiados en los ensayos y a tiempos relativamente largos de almacenamiento (2 meses).
Ejemplo 3: ensayos biológicos
Los ensayos biológicos se llevaron a cabo en tres grupos de ratones, cada uno tratado con una de las composiciones 1, 2 y 3 respectivamente, durante 4 semanas (2 instilaciones/día; 1 gota/instilación). Durante las cuatro semanas de los ensayos, la media de los pesos corporales de cada grupo de ratones no presentaba diferencias estadísticamente significativas. No obstante, se apreció una tendencia al aumento progresivo del peso corporal con el paso del tiempo para cada grupo (Figura 6). En cuanto a la alimentación y el comportamiento de los animales, no se encontraron diferencias significativas entre los diferentes grupos de ratones.
Continuando con los ensayos se llevó a cabo una exploración oftalmológica continuada y seriada de los tres grupos de ratones en la que no se apreciaron lesiones en los anejos oculares (región orbitaria, párpados y pestañas) en ninguno de los grupos de ratones a lo largo de todo el experimento (4 semanas).
Los ensayos clínicos mostraron que todos los ratones presentaban integridad de las estructuras de la superficie ocular, con una buena transparencia corneal, sin aparición de úlceras ni leucomas. Para este estudio se utilizó el test de fluoresceína, el cual mostro que el estado de la conjuntiva y la córnea eran totalmente normales en los tres grupos de ratones durante las 4 semanas de estudio (Figura 7). Finalmente, se tomaron las presiones intraoculares para cada ratón de forma semanal durante 4 semanas. Los resultados de las presiones intraoculares no mostraron diferencias significativas dentro de cada semana comparando los tres grupos de estudio tanto para el ojo izquierdo OI (experimental) y como el ojo derecho OD (control) (p>0.05) (Figura 8).
Los ensayos en ratones indican que la instilación diaria (2 instilaciones al día; 1 gota/instilación) durante 4 semanas no presenta ningún efecto nocivo sobre el segmento anterior y anejos oculares. Este es un muy buen resultado que confirma la tolerabilidad de la instilación y la ausencia de toxicidad derivada de las administraciones seriadas.
Ejemplo 4: medida de la actividad antioxidante de la composición de la invención en lágrimas humanas.
La medida de la actividad antioxidante total de las muestras de lágrima es una determinación de la composición de todos los antioxidantes presentes en dicha muestra y proporciona información del balance total antioxidante. Para cuantificar la actividad antioxidante se recurre al ensayo denominado “Total Antioxidant Capacity” (TAC) que está basado en la capacidad que tienen los antioxidantes de inhibir la oxidación del sulfonato de 2,2-azino-di-3-[ethylbenzothiazolina] (ABTS) a ABTS+- por parte de la metamioglobina. En este caso, la cantidad de ABTS+- producido puede ser cuantificado espectrofotométricamente midiendo la absorbancia de una banda a 750nm (o bien 405nm). En un principio, dado que los antioxidantes presentes en las lágrimas pueden impedir la formación de ABTS+-, una caída en la absorbancia de esta especie daría una medida de la TAC, la cual puede ser expresada en unidades de concentración como mM (mmoles/L). Así pues, para llevar a cabo este ensayo se obtuvieron muestras de lágrima de 25 voluntarios de edades comprendidas entre los 36 y 85 años de edad, que acudieron a las consultas de oftalmología, los cuales fueron distribuidos en dos grupos 1) Grupo de pacientes con Síndrome de Ojo Seco (n=15) y 2) Grupo de sujetos controles sanos (n=10). Las lágrimas fueron obtenidas por el mismo oftalmólogo en todas las ocasiones y con la misma técnica de extracción, para evitar diferencias derivadas de la técnica de extracción. Todos los sujetos leyeron la hoja de información y firmaron el consentimiento informado dando el consentimiento para la participación en el estudio. La entrevista inicial, la historia clínica y el examen oftalmológico sirvió para ser seleccionados al azar entre los asistentes a las consultas oftalmológicas, cuando se comprobó que cumplían los criterios de inclusión/exclusión en el estudio. Una vez extraídas, las lágrimas se congelaron a -80eC hasta su procesamiento. A continuación, se realizó la determinación de la actividad antioxidante total (TAC) mediante el kit comercial Antioxidant Assay Kit No 709001 , siguiendo protocolos y las instrucciones del fabricante (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA).
Los datos obtenidos en las lágrimas extraídas de los sujetos del grupo control se muestran en la tabla 1. Como se puede apreciar, con las dos concentraciones de SOD ensayada, se obtuvieron resultados similares. La formulación añadida a las lágrimas de sujetos sanos mantuvo los valores de antioxidante total dentro de la normalidad.
Figure imgf000013_0001
sujetos del grupo control. Se expresan como la media + DS en milimoles.
Estos resultados fueron similares a los obtenidos por otros investigadores en ojo sanos con el mismo tipo de ensayo que se ha utilizado para estas muestras de lágrima ( Choi W, Lian C, Ying L, et a!. Expression of lipid peroxidation markers in the tear film and ocular surface of patients with non-Sjogren syndrome: potential biomarkers for dry eye disease. Curr Eye fíes. 2016; 41: 1143- 1149, Seen S, Tong L. Dry eye disease and oxidative stress. Acta Ophthalmologica 2017; 96 (4):e412-e420). Además Choi et al., demostraron con la técnica FRASC que la medida del antioxidante total de la muestra (mean+SD) en lágrimas recolectadas con un tubo capilar en 47 individuos sanos de China y los datos fueron similares a los 6 obtenidos con la técnica TAC: 0.409 + 0.16 mM (con un rango entre 0.46-1.02 mM) Choy CK, Benzie IF, Cho P. Ascorbic acid concentration and total antioxidant activity of human tear fluid measured using the FRASC assay. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000;41 :3293-8.
En la tabla 2 se muestran nuestros resultados en lágrimas obtenidas de sujetos diagnosticados de síndrome de disfunción de la superficie ocular -ojo seco- distribuidos en los dos subgrupos a los que se le añadió la concentración correspondiente de la SOD. Como se puede apreciar, con las dos concentraciones de SOD ensayada, se obtuvieron resultados similares. La formulación añadida a las lágrimas de pacientes con disfunción de la superficie ocular -ojo seco- fue capaz de revertir y mantener los valores de la actividad antioxidante total dentro de la normalidad.
Figure imgf000014_0001
Tabla 2. Resultados obtenidos de la actividad antioxidante total de las lágrimas de los sujetos del grupo con síndrome de disfunción de la superficie ocular -ojo seco-. Se expresan como la media + DS en milimoles
La figura 3 muestra la representación gráfica de la concentración de antioxidante total en los dos grupos principales clasificados en subgrupos de acuerdo con la concentración de SOD que se ensayó, sin existir diferencias entre grupos y subgrupos, lo que apoya la eficiencia de la formula con SOD para mantener una actividad antioxidante total dentro de los valores de la normalidad, en las lágrimas humanas.
Se sabe que los ojos con síndrome de disfunción de la superficie ocular -ojo seco- presentan un aumento de la actividad oxidativa y disminución de la capacidad antioxidante. En este ensayo se ha comprobado que con las dos dosis utilizadas de la enzima SOD, las muestras de lágrima de los pacientes con síndrome de ojo seco igualaban sus valores de antioxidante total a los valores de los controles, tal como muestra la figura 3, sugiriendo que la aportación del enzima al fluido lagrimal induce el aumento de la actividad antioxidante total de la muestra, que por su patología estaba disminuida y aumentada la actividad pro-oxidante. Es decir, la administración de la composición de la invención que contiene SOD contribuye a normalizar los valores de actividad antioxidante en lágrimas de pacientes con patología de ojo seco y llevarlos por tanto a valores de sujetos sanos. Ejemplo 5: medida de la expresión de moléculas de inflamación
Se desarrolló este ensayo para valorar la efectividad de la formulación conteniendo SOD en los ojos de los ratones sanos, evaluando la expresión de moléculas de inflamación, específicamente la interleuquina 6 que ha demostrado desempeñar una función esencial en los mecanismos de inflamación y respuesta inmune de pacientes con el síndrome de disfunción de la superficie ocular -ojo seco-. Los antioxidantes tienen propiedades antiinflamatorias inherentes, a través de la inhibición directa de la activación mediada por EROX de la señalización NFkB, que funciona como un factor de transcripción promoviendo la expresión de citoquinas y quimioquinas proinflamatorias. Se han estudiado 20 ratones (10 hembras y 10 machos) que se han mantenido en jaulas y condiciones de estabulación, con luz 12h/12h, humedad, temperatura y condiciones de alimentación (pienso y agua) controladas, y examinado al comienzo del estudio y a los 15 días. El peso corporal se incluye en la figura 7. Se procedió a instilar en el ojo derecho una gota de la solución SOD1 en 10 ratones y una gota de la solución SOD2 en 10 ratones. Por otra parte, a ambos grupos se les instiló una gota del vehículo utilizado en el ojo izquierdo sin la formulación.
El examen oftalmológico demostró que las estructuras del segmento anterior estaban indemnes al comienzo del estudio. Se examinaron los párpados, conjuntiva, córnea, cámara anterior y su transparencia, pupilas e iris. La sangre se extrajo de la vena submandibular de los animales, y se realizó la determinación de la molécula proinflamatoria interleuquina 6 (IL6) mediante ELISA. Los datos se expresaron como media + DS en pg/mL, siguiendo protocolo y las instrucciones del fabricante. Los resultados se muestran en las figuras 8 y 9.
Los datos de la medición de la IL6 en plasma de todos los animales de experimentación, demuestran que las dos concentraciones de la formula con SOD1 y SOD2 actuaron igualmente en cuanto a la expresión de la molécula proinflamatoria. Las dos concentraciones resultaron igualmente efectivas, tanto en hembras como en machos, lo que supone que la formulación sería efectiva para actuar frente al mecanismo inflamatorio que acompaña a las patologías de la superficie ocular, incluida la disfunción de la superficie ocular -ojo seco-. Además, la exploración ocular de los animales a los 15 dias de la instilación continuada del producto en sus dos concentraciones, demostró que los párpados, pestañas, conjuntiva y córnea no fueron dañadas por el mismo. Los animales tampoco demostraron comportamientos compatibles con malestar ni cambios en su rutina diaria, por lo que se deduce que el producto tampoco interfería con su salud en general.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende:
- enzima superóxido dismutasa (SOD), en una concentración de entre 0,002 U/ml a 30.000 U/ml.
- ácido hialurónico o cualquiera de sus sales, en una concentración de entre 0,0001 y 10% de peso por volumen respecto a la composición total,
- ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o cualquiera de sus sales, en una concentración de entre 0,0001 a 10% respecto a la composición total y
- un tamponador de pH que se selecciona de entre citrato, fosfato, ascorbato, borato.
2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1 , en la que dicha SOD se selecciona entre Cu/Zn-SOD, Mn-SOD, Ni-SOD y Fe-SOD.
3. La composición de acuerdo con la reivindicación 2, en la que dicha SOD es Cu/Zn-SOD.
4. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha SOD puede ser de origen vegetal, animal, humano o sintético.
5. La composición de acuerdo con la reivindicación 4, en la que dicha SOD es de origen animal.
6. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la SOD está en una concentración de entre 0,2 a 20.000 U/ml.
7. La composición de acuerdo con la reivindicación 6, en la que la SOD está en una concentración de entre 1 a 500 U/ml.
8. La composición de acuerdo con la reivindicación 7, en la que la SOD está en una concentración de entre 10 a 250 U/ml.
9. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el ácido hialurónico, está una concentración comprendida entre 0,05 y 5% de peso por volumen respecto a la composición total.
10. La composición de acuerdo la reivindicación 9, en la que el ácido hialurónico está en una concentración de 0,1% de peso por volumen respecto a la composición total.
11. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el EDTA, está una concentración comprendida entre 0,05 a 5% de peso por volumen respecto a la composición total.
12. La composición de acuerdo la reivindicación 11 , en la que el EDTA está en una concentración de 0,1% de peso por volumen.
13. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que el EDTA está en forma de sal sódica.
14. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en la que el tamponador es borato sódico.
15. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende además una sal que se selecciona de entre NaCI, KCI, MgCh, CaC .
16. La composición de acuerdo con la reivindicación 15, en la que la sal es NaCI.
17. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizada por tener un pH de entre 7 a 7,5.
18. La composición de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizada por tener un pH de 7,3.
19. Composición farmacéutica que comprende la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.
20. Composición farmacéutica según la reivindicación 19, en la que dicha composición farmacéutica está formulada en forma de colirio, solución de lágrimas artificiales, solución inyectable, espray, gel, ungüento o crema.
21. Composición de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 18 para uso como medicamento.
22. Composición de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 18 para uso en el tratamiento y/o prevención de enfermedades oculares.
23. Composición para uso según la reivindicación 22, donde la enfermedad ocular se selecciona de entre las siguientes: síndrome de ojo seco, conjuntivitis con componente inflamatorio, blefaritis crónicas, queratitis no infecciosas, queratocono, uveítis no infecciosas y/o glaucoma.
24. Composición de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 18 para uso en el tratamiento y/o prevención de la respuesta inflamatoria y el estrés oxidativo producidos en post-operatorio de cirugía ocular.
25. Composición para uso según la reivindicación 24, donde el post-operatorio es en cirugía del segmento anterior ocular y/o tratamiento láser.
PCT/ES2022/070486 2021-07-23 2022-07-22 Composición basada en la actividad antioxidante de la enzima superóxido dismutasa y su aplicación en enfermedades oculares WO2023002088A1 (es)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP22845498.9A EP4374871A1 (en) 2021-07-23 2022-07-22 Composition based on the antioxidant activity of the enzyme superoxide dismutase and application thereof in eye diseases

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES202130717A ES2886723A1 (es) 2021-07-23 2021-07-23 Composicion basada en la actividad antioxidante de la enzima superoxido dismutasa y su aplicacion en enfermedades oculares
ESP202130717 2021-07-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023002088A1 true WO2023002088A1 (es) 2023-01-26

Family

ID=79024000

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2022/070486 WO2023002088A1 (es) 2021-07-23 2022-07-22 Composición basada en la actividad antioxidante de la enzima superóxido dismutasa y su aplicación en enfermedades oculares

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP4374871A1 (es)
ES (1) ES2886723A1 (es)
WO (1) WO2023002088A1 (es)

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003082081A2 (en) 2002-03-29 2003-10-09 Maxim Pharmaceuticals, Inc. Use of rom production and release inhibitors to treat and prevent intraocular damage
US20030228299A1 (en) 2001-06-07 2003-12-11 Marie-Therese Droy-Lefaix Use of antioxidant for treating and/or preventing surface ocular disorders
US20050032914A1 (en) 2002-01-30 2005-02-10 Felix Barker Lutein/zeaxanthin for glare protection
CN101243875A (zh) 2008-03-24 2008-08-20 北京维尼康生物技术有限公司 一种富含叶黄素和β-胡萝卜素的保健制剂及制备方法
WO2009129859A1 (en) 2008-04-24 2009-10-29 Dr. Gerhard Mann Chem.-Pharm. Fabrik Gmbh Compositions and methods for maintaining, strengthening, improving, or promoting eye health
US20100159029A1 (en) 2008-12-23 2010-06-24 Alcon Research, Ltd. Composition and nutritional supplements for improving ocular health and reducing ocular inflammatory response
EP2433640A1 (en) * 2010-09-24 2012-03-28 Visiotact Pharma Composition comprising SOD, lutein and zeaxanthin
CN102697713A (zh) * 2012-06-14 2012-10-03 浙江尖峰药业有限公司 玻璃酸钠滴眼液及其制备方法
TW201722412A (zh) * 2015-11-30 2017-07-01 Rohto Pharma 眼科組成物
CN112336660A (zh) * 2020-10-23 2021-02-09 四川福怡长者文化传播有限公司 一种缓解视疲劳眼霜及其制备方法
CN114177280A (zh) * 2021-12-17 2022-03-15 上海卫康光学眼镜有限公司 一种含稳定性抗氧化酶的洗眼液及其制备方法

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030228299A1 (en) 2001-06-07 2003-12-11 Marie-Therese Droy-Lefaix Use of antioxidant for treating and/or preventing surface ocular disorders
US20050032914A1 (en) 2002-01-30 2005-02-10 Felix Barker Lutein/zeaxanthin for glare protection
WO2003082081A2 (en) 2002-03-29 2003-10-09 Maxim Pharmaceuticals, Inc. Use of rom production and release inhibitors to treat and prevent intraocular damage
CN101243875A (zh) 2008-03-24 2008-08-20 北京维尼康生物技术有限公司 一种富含叶黄素和β-胡萝卜素的保健制剂及制备方法
WO2009129859A1 (en) 2008-04-24 2009-10-29 Dr. Gerhard Mann Chem.-Pharm. Fabrik Gmbh Compositions and methods for maintaining, strengthening, improving, or promoting eye health
US20100159029A1 (en) 2008-12-23 2010-06-24 Alcon Research, Ltd. Composition and nutritional supplements for improving ocular health and reducing ocular inflammatory response
EP2433640A1 (en) * 2010-09-24 2012-03-28 Visiotact Pharma Composition comprising SOD, lutein and zeaxanthin
US20130195985A1 (en) 2010-09-24 2013-08-01 Visiotact Pharma Composition Comprising SOD, Lutein and Zeaxanthin
CN102697713A (zh) * 2012-06-14 2012-10-03 浙江尖峰药业有限公司 玻璃酸钠滴眼液及其制备方法
TW201722412A (zh) * 2015-11-30 2017-07-01 Rohto Pharma 眼科組成物
CN112336660A (zh) * 2020-10-23 2021-02-09 四川福怡长者文化传播有限公司 一种缓解视疲劳眼霜及其制备方法
CN114177280A (zh) * 2021-12-17 2022-03-15 上海卫康光学眼镜有限公司 一种含稳定性抗氧化酶的洗眼液及其制备方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANONYMOUS: "Eye drops", WIKIPEDIA, 1 January 2021 (2021-01-01), XP093027655, Retrieved from the Internet <URL:https://es.wikipedia.org/wiki/Colirio> [retrieved on 20230228] *
CHOI WLIAN CYING L ET AL.: "Expression of lipid peroxidation markers in the tear film and ocular surface of patients with non-Sjogren syndrome: potential biomarkers for dry eye disease", CURR EYE RES., vol. 41, 2016, pages 1143 - 1149
I. VOULDOUKISD. LACANC. KAMATEP. COSTEA. CALENDAD. MAZIERM. CONTIB. DUGAS, JOURNAL OF ETHNOPHARMACOLOGY, vol. 94, no. 1, 2004, pages 67 - 75
INVEST OPHTHALMOL VIS SCI., vol. 41, 2000, pages 3293 - 8
S. DI MEOT. REEDP. VENDITTIV. M. VICTOR: "Role of ROS and RNS Sources in Physiological and Pathological Conditions", OXID. MED. CELL LONGER, vol. 2016, 2016, pages 1245049
SEEN STONG L: "Dry eye disease and oxidative stress", ACTA OPHTHALMOLOGICA, vol. 96, no. 4, 2017, pages e412 - e420, XP072398625, DOI: 10.1111/aos.13526

Also Published As

Publication number Publication date
ES2886723A1 (es) 2021-12-20
EP4374871A1 (en) 2024-05-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Tangvarasittichai et al. Oxidative stress, ocular disease and diabetes retinopathy
Shoham et al. Oxidative stress in diseases of the human cornea
Vallabh et al. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in corneal disease
Saccà et al. Environmental light and endogenous antioxidants as the main determinants of non-cancer ocular diseases
Böhm et al. Oxidative stress in the eye and its role in the pathophysiology of ocular diseases
Čejková et al. UV rays, the prooxidant/antioxidant imbalance in the cornea and oxidative eye damage
ES2527791T3 (es) Composición farmacéutica para su uso en oftalmología médica y veterinaria
Spadea et al. Treatment of vascular retinopathies with Pycnogenol®
RU2711913C2 (ru) Лечение пигментной дистрофии сетчатки n-ацетилцистеинамидом
Silva et al. Antioxidants in the prevention and treatment of diabetic retinopathy–a review
JP2004537522A (ja) 眼表面異常の治療及び／又は予防薬の製造における抗酸化剤の使用
ES2732744T3 (es) Composición para la salud ocular
ES2277831T3 (es) Utilizacion de pirenoxina para la proteccion de tejidos corneales en fotoqueratectomia.
MX2012009471A (es) Composicion que comprende como ingrediente activo l-carnitina en combinacion con hidroxiquinurenina-o-beta-dl-glucosido, para la prevencion y/o tratamiento de patologias del ojo debido a radiacion ultravioleta.
Sanz-González et al. Effect of an oral supplementation with a formula containing R-lipoic acid in glaucoma patients
ES2385037T3 (es) Formulación soluble en agua que contiene ubiquinona, para uso oftálmico
Keyal et al. Post-vitrectomy cataract acceleration in phakic eyes: a review
JP7090336B2 (ja) Ｎａｄ関連代謝産物の利用
US8178134B2 (en) Synergistic herbal ophthalmic formulation for lowering intraocular pressure in case of glaucoma
WO2023002088A1 (es) Composición basada en la actividad antioxidante de la enzima superóxido dismutasa y su aplicación en enfermedades oculares
JP5604631B2 (ja) 鉄関連眼病障害の治療および予防へのデフェリプロンの使用
EP3498337A1 (en) Composition for the relief, improvement, prevention and/or treatment of dry eye syndrome
WO2023113586A1 (es) Formulación de base lipídica de uso tópico oftálmico que contiene extracto de arándano azul
WO2013164512A2 (es) Composición para su uso en el tratamiento y/o prevención de la inflamación, el estrés oxidativo y la neovascularización ocular
JP2012515725A5 (es)

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22845498

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022845498

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022845498

Country of ref document: EP

Effective date: 20240223