WO2022249716A1 - 歯科用組成物および象牙質の培養方法 - Google Patents

歯科用組成物および象牙質の培養方法 Download PDF

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成史 岸田
美砂子 中島
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エア・ウォーター株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a dental composition and a method for culturing dentin, which are used for dental caries treatment, pulpectomy, infected root canal treatment, and the like.
  • the structure of the tooth consists of layers of enamel, dentin, and pulp in order from the outside.
  • Dentin therein is one of the hard tissues that constitute teeth, and is composed of about 70% inorganic matter and about 30% organic matter. Dentin is characterized by being softer than enamel, which is composed mostly of inorganic substances. With soft dentin layered under hard enamel, the dentin acts like a cushion, giving the teeth a strong structure that is resistant to cracking even when impacted.
  • the dental pulp below the dentin surface gradually becomes closer to the surface of the tooth and becomes exposed through the dentin tubules to the inside of the oral cavity. Since the dental pulp is nerve tissue, when the pulp is close to the surface of the tooth, it causes subjective symptoms of caries such as tooth sensitivity and pain. As a treatment when caries progresses and symptoms such as pulpitis appear, it is common to perform pulpectomy to remove the inflamed dental pulp.
  • the pulp has the function of notifying tooth decay through pain sensation, and the pulp tissue itself has a buffering effect, so it can prevent fractures, and has a role in protecting the tooth through the metabolic action of blood vessels and nerves, anti-inflammation, and anti-infection action. Therefore, pulpectomy increases the risk of tooth loss due to fracture, spread of infection to the apical periodontal tissue, or exacerbation of inflammation. If such a situation occurs in a pulp-extracted tooth, treatment methods include dentures and implant treatment. However, these treatment methods have the problem of deteriorating esthetics and occlusal properties. Therefore, as a new treatment method, a dental pulp regeneration treatment has been proposed, in which the pulp tissue is restored to its original state after the pulpectomy.
  • This treatment is a method of regenerating pulp tissue by collecting pulp tissue from unwanted teeth such as wisdom teeth, culturing the dental pulp stem cells present therein, and transplanting this together with a drug to the pulp-extracted tooth.
  • this treatment regenerates the entire dental pulp tissue and adds dentin to the dentin wall of the root canal, but only a small amount of dentin regeneration can be induced in the crown, and cement, resin, or metal is applied. It is the present condition to reinforce it with a thing and a padding.
  • Patent Document 1 describes a method for regenerating dentin in which dental pulp cells are differentiated into odontoblasts using a composite material obtained by cross-linking collagen with non-collagenous phosphorylated proteins such as phosphorin as a scaffold.
  • Patent Document 2 describes a dentin formation promoter containing an HGM-CoA reductase inhibitor as an active ingredient.
  • Patent Document 3 differentiation-induced ivory buds are produced by three-dimensionally culturing isolated human dental pulp cells to a predetermined cell density while adding 1,25 (dihydroxy) vitamin D3. A method for producing cells is described.
  • the odontoblasts induced to differentiate in vitro are terminally differentiated, so they cannot adhere even when transplanted in vivo, making it difficult to use them for dentin regeneration. be done.
  • Patent Document 4 describes a method for regenerating dentin using a ceramic-based porous carrier.
  • the ceramic-based porous carrier described in the same document has a very small diameter of 100 to 500 ⁇ m, which is impractical from the viewpoint of handling and transplantation.
  • the present invention has been made in view of such problems, and aims to provide a dental composition suitable for pulp regeneration treatment and a method for culturing dentin, in which the safety of the substances used can be easily ensured.
  • a dental composition according to the present invention has the following configuration.
  • [1] A dental composition used for promoting regeneration of dentin, characterized by containing pulverized human teeth.
  • the dental composition according to [1], wherein the pulverized material is demineralized using a strong acid aqueous solution of 0.4 to 1.0 normality as a demineralization liquid.
  • a method for culturing dentin according to the present invention has the following configuration. [8] A method for culturing dentin, which comprises contacting dental pulp cells with a dental composition containing pulverized human teeth to induce odontoblasts.
  • the present invention uses pulverized human teeth as a component that promotes regeneration of dentin. For this reason, safety can be easily ensured, and it is suitable for dentin regeneration treatment that repairs and regenerates capsular dentin on the regenerated pulp tissue surface during pulp regeneration treatment or on the pulp surface during direct pulp capping/living pulp cutting treatment.
  • a dental composition that is preferably used can be provided.
  • FIG. 3A Schematic diagram showing the position of the tooth fragment in the treatment of a pulp-extracted tooth CBCT image of Example 1 CBCT image showing enlarged area A in FIG. 2A Photograph of tissue specimen of Example 1 Photograph of tissue specimen showing enlarged region B in FIG. 3A
  • Schematic diagram of dental pulp regeneration treatment using a dental composition containing tooth pulverized material at the advanced stage of dentin regeneration Schematic diagram explaining the progress after pulp transplantation in dental pulp regeneration treatment
  • Explanatory drawing showing the correspondence between schematic diagrams at 4 to 6 months and 12 months after transplantation and photographs of tissue specimens in Example 1.
  • Photomicrograph of Example 2 (decalcification treatment, 3% by weight EDTA) Photomicrograph of Example 2 (decalcification treatment, 3% by weight EDTA) Magnified micrograph of area C in FIG. 7B Photomicrograph of Example 2 (physiological saline) Photomicrograph of Example 3 (decalcification treatment, 0.6 N hydrochloric acid) Photomicrograph of Example 3 (decalcification treatment, 17% by weight EDTA) Photomicrograph of Example 3 (17% by weight EDTA after decalcification treatment, 0.6 N hydrochloric acid) Photomicrograph of Example 3 (undecalcified)
  • composition contains pulverized human teeth (natural teeth).
  • a cross-section of a tooth contains dentin and dentin tubules, which are suitable as a scaffold for dental pulp cells including dental pulp stem cells. Therefore, use of a tooth pulverized product can promote regeneration of dentin.
  • dental pulp stem cells and tooth pulverized material used for dentin regeneration are preferably derived from the patient himself/herself, but may be provided by others.
  • dental pulp stem cells and tooth pulverized material provided by a donor other than the patient for example, regeneration of tooth dentin in patients who do not have unnecessary teeth such as wisdom teeth or in patients whose function of dental pulp stem cells has decreased due to aging. can be promoted.
  • the person other than the patient may be, for example, a relative of the patient, but may be a person other than the relative as long as they are compatible with the patient.
  • the dental pulp stem cells and the pulverized tooth provided from a non-patient are preferably derived from the same tooth, but may be derived from different teeth.
  • Dental pulp regeneration treatment begins with the extraction of the patient's unwanted teeth.
  • Dental pulp stem cells are cultured after extracting the pulp tissue from within the tooth. Some of the dental pulp cells, including dental pulp stem cells, adhere to the scaffold and survive, and differentiate into odontoblasts in response to microstructures of ⁇ m order.
  • the dentin and dentinal tubules of tooth fragments extracted from human dental pulp cells consist of individual patient's own proteins. Therefore, it is considered that the tooth fragments remaining after the extraction of the pulp tissue have good compatibility with the dental pulp stem cells and do not cause immune rejection.
  • the tooth from which human pulp cells were collected has good compatibility with the dental pulp stem cells extracted as the pulp tissue within the tooth.
  • dentin and dentinal tubule proteins are unique to individual patients. Therefore, by using a tooth from which human dental pulp cells used for dentin regeneration are collected, immune rejection can be avoided, and induction of differentiation from human dental pulp cells to odontoblasts and dentin regeneration can be efficiently performed. .
  • conventionally discarded teeth which become unnecessary after collecting human dental pulp cells, are used to induce and promote dentin regeneration.
  • the unnecessary teeth include teeth extracted during orthodontic treatment and wisdom teeth. Since the composition of the present invention uses teeth that have conventionally been discarded, it has little impact on the environment and can be produced by a very inexpensive and ecological production method.
  • the tooth fragment, ie, the pulverized material can be produced at the same time as the dental pulp tissue by using a pressing machine for splitting the tooth and extracting the pulp tissue, so that the manufacturing efficiency is excellent.
  • Fig. 1 is a schematic diagram showing the position of pulverized material 3 in composition 4 in treatment of a pulp-extracted tooth.
  • a pulp-extracted tooth a mixture 1 of dental pulp stem cells and a drug is transplanted to the pulp-extracted tooth, and a tooth pulverized material 3 containing a composition 4 is placed on the mixture 1. left undisturbed.
  • the part from which the dentin and enamel were removed during the treatment of the crown is reinforced with a covering of resin 2 .
  • odontoblasts produced in vitro are terminally differentiated cells, they do not adhere to the root canal wall even if they are transplanted.
  • Dental pulp stem cells in mixture 1 function as dentin matrix rather than terminally differentiated cells. Therefore, dental pulp stem cells can adhere to the cell root canal wall when transplanted in vivo.
  • a bioceramic material such as Biodentin (registered trademark, manufactured by Septodon), MTA (Mineal Trioxide Aggregate) cement, or the like is used.
  • the composition 4 reduces the particle size of the pulverized matter 3 placed on the mixture 1 to a predetermined size. and This makes it possible to keep the position of the crushed material 3 in the crown above the mixture 1 .
  • the effect of promoting regeneration of dentin can be enhanced.
  • the particle size of the pulverized material 3 is preferably larger than the diameter of the root canal.
  • the root canal diameter varies depending on the site of the tooth and the age of the patient. As the age increases, the proportion of dentin increases, and the diameter of the pulp cavity and root canal filled with pulp tissue narrows, resulting in a smaller diameter of the root canal. Therefore, it is necessary to determine the particle size of the pulverized material 3 used for induction of dentin regeneration according to the site and age of the patient's teeth.
  • the size of the root canal diameter r varies depending on the site of the tooth and the patient's age, but it is usually about 0.5-1.0 mm (500-1000 ⁇ m). Therefore, from the viewpoint of preventing the pulverized material 3 from falling into the root canal, the particle size of the pulverized material 3 should be 500 ⁇ m or more, preferably 600 ⁇ m or more, and more preferably 700 ⁇ m or more.
  • the particle size of the pulverized material 3 should be smaller than the width (cross-sectional distance) R of the portion into which the mixture 1 of dental pulp stem cells and drug is injected, and may be, for example, 2000 ⁇ m or less. In addition, it can be said that reducing the particle size is advantageous for regeneration of dentin in that the surface area of the pulverized material 3 increases. Therefore, the particle size of the pulverized material 3 is preferably 1500 ⁇ m or less, more preferably 1000 ⁇ m or less.
  • the pulverized material 3 can be maintained at a position effective for promoting regeneration of dentin.
  • the appropriate particle size is determined depending on the target root canal to be transplanted.
  • the particle size of the pulverized material 3 is preferably equal to or larger than the root canal diameter r of the root canal to be transplanted.
  • About 5 to 15 grains of the pulverized material 3 may be used for one tooth, for example.
  • the numerical range A to B means A or more and B or less.
  • the pulverized material 3 having a particle size within the above range can be used, for example, by using a strainer (sieve) to extract from pulverized teeth.
  • the average particle diameter (median diameter, D50) of pulverized material 3 contained in composition 4 is preferably 600 to 1500 ⁇ m, more preferably 700 to 900 ⁇ m.
  • the pulverized material 3 contains an enamel portion and a dentin portion, but it is mainly the dentin portion that has the effect of promoting pulp regeneration. Therefore, from the viewpoint of promoting regeneration of dentin, it is preferable that the pulverized material 3 be demineralized. By eluting the calcium salt crystals from the enamel portion of the pulverized material 3 by the demineralizing treatment, the effect of the dentin regeneration by the dentin portion is improved.
  • demineralization means dissolving calcium phosphate, which is the main component of tooth enamel.
  • an acidic to weakly alkaline aqueous solution in which the substrate is dissolved can be used.
  • Demineralization with acid is a relatively strong treatment that utilizes the action of eluting calcium phosphate.
  • Substrates used for acid demineralization include hydrochloric acid, formic acid, nitric acid, trichloroacetic acid, sodium sulfate, sodium citrate, Planck-Lucro solution (mixture of hydrochloric acid, formic acid and aluminum chloride), Morse solution (formic acid, sodium citrate mixture) and the like.
  • a demineralization solution containing a strong acid such as hydrochloric acid or nitric acid as a substrate is preferable from the viewpoint of sufficiently eluting calcium phosphate.
  • Demineralization with a chelating agent is a relatively weak treatment that uses the action of softening calcium phosphate.
  • Substrates used for deashing with chelating agents include ethylenediamine derivatives such as the sodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA).
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • the ethylenediamine derivative is used, for example, as an aqueous solution of about 1 to 30% by weight.
  • Demineralization with acid from the viewpoint of sufficiently dissolving tooth enamel to reveal dentin and promoting the differentiation of pulp stem cells into tubular dentin, bone-like dentin, etc. in teeth after pulpectomy. is preferred, and a strong acid such as hydrochloric acid is more preferred.
  • the concentration of the strong acid aqueous solution is preferably 0.1 to 2.0N, more preferably 0.3 to 1.0N.
  • the time to treat the pulverized material with the demineralization solution should be enough time to dissolve the enamel of the pulverized material.
  • the treatment time is preferably 10 to 40 hours. ⁇ 30 hours is more preferred.
  • the pulverized material 3 is preferably immersed in a solution containing an antibacterial agent and then dried.
  • solutions containing an antibacterial agent include alcohol solutions containing silver ions, pure water containing silver ions, silica water, and the like.
  • the composition of this embodiment can be produced, for example, as follows.
  • the teeth are placed in a cylinder with an open top, the body is inserted from above, and pressure is applied to randomly crush the teeth.
  • a pulverized tooth having a predetermined diameter is transferred to a tube or the like, and sterilized by impregnating it with ethanol for disinfection.
  • odontoblasts are induced by contacting dental pulp cells with a dental composition containing pulverized human teeth. Since no drug that induces odontoblasts is used, the patient to whom the cultured dentin is applied does not have to worry about the drug, and it is easy to ensure safety. In addition, since the pulverized tooth used for inducing odontoblasts can be produced at the same time as the extraction of the pulp, dentin can be cultured at low cost.
  • Example 1 Two canine teeth (total of 8 root canals) were implanted with canine tooth pulverized material into the root canals, leaving part of the pulp. In order to observe the progress after transplantation, images were taken by dental CT (cone beam CT, CBCT) 4 months after transplantation, and tissue specimens were prepared and photographed 6 months after transplantation.
  • dental CT cone beam CT, CBCT
  • Tooth pulverized material A tooth extracted from a dog to be transplanted was pulverized with a press, and a pulverized material (undemineralized) having a particle size of 500 to 1000 ⁇ m was taken out using a strainer. Teeth to be transplanted: Teeth with viable dental pulp (with remaining dental pulp) were transplanted. Implantation site: Without using any scaffold material other than the tooth pulverized product, 5 to 10 pulverized products were left still near the entrance of the root canal of the tooth to be transplanted.
  • FIG. 2A is a CBCT image at 4 months after transplantation
  • FIG. 2B is an enlarged CBCT image of region A enclosed by a rectangle in FIG. 2A.
  • white impermeable dentin-like hard tissue was formed in the tooth implanted with the pulverized material.
  • dentin-like hard tissue was formed in all of the teeth implanted with the pulverized material at 4 months after implantation, similar to the teeth shown in FIGS. 2A and 2B.
  • FIG. 3A is a photograph of a tissue sample 6 months after transplantation
  • FIG. 3B is a photograph of a tissue sample enlarging the area B surrounded by a rectangle in FIG. 3A.
  • FIG. 3A 6 months after transplantation, a layer of bone-like dentin-like hard tissue was formed over a wide area on the surface of the regenerated dental pulp.
  • FIG. 3B it was found that regeneration of bone-like dentin progressed between the root canal walls.
  • FIG. 4A is a cross-sectional view schematically showing the tooth at the time when the pulverized material is implanted
  • FIG. 4B is a cross-sectional view schematically showing the tooth at the time when sufficient time has passed for regeneration after implantation.
  • pulverized material with a particle size of 500 to 1000 ⁇ m
  • regenerated dentin 6 can be formed near the entrance of the root canal. Formation of the regenerated dentin 6 progresses, the regenerated dentin 6 fills the gap between the pulverized material and the remaining crown dentin, and the natural tooth and the regenerated dentin fuse together, thereby forming a natural core under the resin 2. (stuck part) can be done. Therefore, the strength of the tooth after treatment is improved, and it is possible to prevent re-infection (microleakage) of bacteria from the oral cavity and re-cavity (secondary caries).
  • the pulverized material 3 that promotes the formation of the regenerated dentin 6 is pulverized teeth. Since the pulverized material 3 is denatured and melted and gradually replaced with regenerated dentin, after the regenerated dentin 6 is formed, it exhibits mechanical and chemical properties similar to those of the regenerated dentin 6 . For example, the same applies to changes in thermal expansion caused by changes in environmental temperature. Therefore, when hot or cold foods are eaten, gaps do not occur between the pulverized material 3 and the regenerated dentin 6 and natural dentin. On the other hand, if an artificial material is used, gaps may occur due to differences in thermal expansion when hot or cold foods are eaten. Since autologous proteins do not cause immunological rejection, it is more preferable to form the pulverized product 3 using teeth of the same person as the person to be treated.
  • FIG. 5 is a schematic diagram of a root canal model explaining the course after transplantation. As shown in the figure, a mixture 1 of dental pulp stem cells and a drug is transplanted into a pulp-extracted root canal. In the figure, a dentine substitute 5 is placed between a pulverized material 3 and a resin 2 .
  • regenerated dentin (regenerated bone-like dentin) 6 is formed in the area where the pulverized material 3 is left still, and regenerated dental pulp 7 is formed in the area where the mixture 1 is transplanted.
  • tubular dentin 8 is formed in the lower part of regenerated dentin 6 (upper part of regenerated dental pulp 7) ("Dentin induction by implants of autolyzed antigen-extracted allogenic dentin on amputated pulps of dogs, Misako Nakashima, 1989).
  • FIG. 6 is an explanatory diagram showing the correspondence relationship between the root canal model at 4 to 6 months and 12 months after transplantation and the photograph of the tissue specimen of Example 1 (at 6 months after transplantation). As shown in the figure, it can be seen that a regenerated dental pulp 7 has been formed from the photograph of the tissue sample taken 6 months after transplantation. The photograph also shows that the formation of tubule dentin 8 has started below the regenerated dentin 6 .
  • Example 1 In the same manner as in Example 1, except that a pulverized tooth with a particle size of 150 to 500 ⁇ m was used instead of a pulverized tooth with a particle size of 500 to 1000 ⁇ m, a pulverized product of dog-derived teeth was added to the pulp. A part was transplanted into the remaining root canal, and the progress was observed. However, when the pulverized product with a particle size of 150 to 500 ⁇ m was used, no capsular dentin formation was observed. This is probably because the pulverized material did not remain near the entrance of the root canal and fell on the apical side of the tooth.
  • the surface area of the pulverized material is increased by reducing the particle size is advantageous for promoting dentin regeneration.
  • the location of the pulverized material was important to promote dentin regeneration. It can be said that it is necessary to keep the pulverized material in the
  • Example 1 it can be said that the pulverized material 3 with a particle size of 500 to 1000 ⁇ m was used, and as a result, the pulverized material 3 stayed near the entrance of the root canal, thereby promoting the formation of the capsular dentin. Moreover, the pulverized material with a particle size of 500 to 1000 ⁇ m was easier to handle than the one with a particle size of 150 to 500 ⁇ m, and was superior in workability in transplantation.
  • Example 2 and 3 Of the enamel and dentin that constitute tooth pulverized material, it is believed that the dentin mainly contributes to the promotion of regeneration of dentin. Therefore, the influence of treating the surface of the pulverized material with a solution was evaluated by the following method. That is, the effects of bringing dental pulp stem cells into contact with pulverized teeth subjected to different demineralization treatments to promote differentiation ability, ie, dentin formation ability, were evaluated.
  • Example 2 ⁇ Pulverized tooth> A dog-derived tooth was pulverized with a press, and a pulverized tooth having a particle size of 500 to 1000 ⁇ m was taken out using a strainer.
  • the treatment (A) is a demineralizing treatment, which removes enamel from the surface of the pulverized material.
  • Treatment in (B) is a control.
  • Example 3 ⁇ Pulverized tooth> The unnecessary tooth was pulverized with a press, and pulverized tooth having a particle size of 750 to 1000 ⁇ m was taken out using a strainer.
  • FIGS. 7A to 7C and 8 show pellets of pulverized material and dental pulp stem cells surface-treated with (A) 3% by weight EDTA aqueous solution and (B) physiological saline solution as a control in Example 2. It is a microphotograph after culturing at. As shown in FIGS. 7A to 7C, the pulverized material treated with the 3% by weight EDTA aqueous solution had better adhesion of dental pulp stem cells to the pellet surface of the pulverized material than the pulverized material treated with the control saline solution. rice field.
  • the direction of the double-headed arrow shown in FIG. 7A indicates the direction in which the dentinal tubules, that is, the tubule structure of dentin (hole diameter 1 to 2 ⁇ m), extends.
  • FIG. 7C is an enlarged view of region C in FIG. 7B.
  • Figures 9A, 9B and 9C are micrographs of the pulverized material and dental pulp stem cells subjected to treatments (C), (D) and (E) in Example 3 after being pelleted and cultured.
  • FIG. 10 is a photomicrograph of an untreated pulverized material and dental pulp stem cells as a control after being pelleted and cultured.
  • Dental pulp stem cells are adherent cells, and when they are single cells, they proliferate in a star-like shape. On the other hand, when the dental pulp stem cells become dense, the cell shape elongates and promotes tissue formation. This tissue cell elongation is characteristic of dental pulp stem cells. When cultured in a pellet form, the culture environment is dense, and if the pulverized material surface is an appropriate adhesive scaffold, the dental pulp stem cells are elongated in shape, have directionality in a certain direction, and differentiate into tissues. do.
  • the demineralization treatment should be performed for a period of time longer than 60 minutes, for example, 10 hours or more, 15 hours or more. It can be said that it is preferable to carry out the treatment for a treatment time of 20 hours or longer.
  • the dental composition and dentin culture method of the present invention can be used for caries treatment, pulpectomy and infected root canal treatment.

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Abstract

組成物４は、ヒトの歯を粉砕した粉砕物３を含有しており、歯の断面には象牙質や象牙細管があるため、ヒト歯髄細胞の足場として適切である。また、ヒトの歯なので薬剤への不安を患者に抱かせることなく、ヒト歯髄細胞から象牙芽細胞を誘発して、象牙質の再生・修復へと導くことができる。このため、ヒトの歯の粉砕物を含有する歯科用組成物を用いることにより、歯髄組織を修復・再生することができ、また歯髄再生治療において使用する物質の安全性の確保が容易である。

Description

歯科用組成物および象牙質の培養方法
　本発明は、歯のう蝕治療、抜髄・感染根管治療等に用いる、歯科用組成物および象牙質の培養方法に関する。
　歯の構造は、外側から順にエナメル質、象牙質、歯髄の層構造となっている。その中の象牙質は、歯を構成する硬組織の１つであり、約７０％の無機物と約３０％の有機物とで構成されている。象牙質には、殆どが無機物で構成されるエナメル質と比べて柔らかいという特徴がある。硬いエナメル質の下に柔らかな象牙質が重なり合っていることで、象牙質がクッションのような役割を担うため、歯は全体として、衝撃を受けても割れにくい丈夫な構造となっている。
　しかし、虫歯の進行によって象牙質が侵食されていくと、象牙質面下の歯髄が次第に歯の表面近くとなり、象牙細管を通じて口腔内とつながるような露出状態となる。歯髄は神経組織であるため、歯髄が歯の表面近くになると、歯がしみる・痛むといった虫歯の自覚症状を招く。虫歯が進行して歯髄炎等の症状が現れた場合の治療として、炎症を起こした歯髄を取り除く抜髄が行われることが一般的である。
　歯髄は痛覚によって虫歯を知らせる機能や歯髄組織そのものに緩衝作用があるため、破折を防止でき、血管・神経による代謝作用や抗炎症・感染防御作用等により歯を保護する役割を有する。よって抜髄すると、破折や根尖部歯周組織への感染拡大あるいは炎症増悪などにより歯の喪失リスクを高めてしまう。抜髄した歯にこのような事態が生じた場合の治療法としては、入れ歯やインプラント治療が挙げられる。しかし、これらの治療法には、審美性や咬合性の低下を招くという問題がある。そこで、新たな治療法として、抜髄後に歯髄組織を元通りに回復させる歯髄再生治療が提唱されている。この治療は、智歯等の不用歯から歯髄組織を採取し、その中に存在する歯髄幹細胞の培養を行い、これと薬剤とを抜髄した歯に移植することで歯髄組織を再生する方法である。ただし、この治療法は歯髄組織全体が再生され、根管の象牙質壁へ象牙質が添加されるが、歯冠部には少量しか象牙質再生を誘導できず、セメントやレジン、金属といった被せ物や詰め物により補強しているのが現状である。
　象牙質組織を再生するアプローチに関して、薬剤を添加して歯髄細胞の分化誘導を促す化学的な方法が提唱されている。例えば、特許文献１には、フォスフォリン等の非コラーゲン性リン酸化タンパク質をコラーゲンに架橋した複合材料を足場として歯髄細胞を象牙芽細胞に分化させる、象牙質の再生方法が記載されている。特許文献２には、ＨＧＭ－ＣｏＡ還元酵素阻害剤を有効成分とする象牙質形成促進剤が記載されている。特許文献３には、分離したヒト歯髄細胞を、１，２５（ジヒドロキシ）ビタミンＤ３を添加しながら三次元的に、所定の細胞密度となるように培養することを含む、分化誘導された象牙芽細胞の製造方法が記載されている。しかし、これらの化学的なアプローチのように試験管内で分化誘導された象牙芽細胞は最終分化しているため、生体内に移植しても接着できず、象牙質再生に用いることは困難と考えられる。
　象牙芽細胞を作製してから移植するスキームである化学的アプローチに対して、抜髄した歯において歯髄細胞を象牙芽細胞へと分化させる、無機系焼成物の人工物を用いた物理的アプローチによる方法が提唱されている。例えば、特許文献４には、セラミックス系多孔質担体を用いた象牙質の再生方法が記載されている。しかし、同文献に記載されているセラミックス系多孔質担体は、直径が１００～５００μｍと極めて小さく、取り扱いや移植の観点から実用的ではないという問題がある。
国際公開ＷＯ２００５／０７９７２８号 国際公開ＷＯ２００８／１２０７２０号 特許第４８８４６７８号公報 特開２００５－２７０６４７号公報
　本発明はかかる問題に鑑みてなされたものであり、使用する物質の安全性の確保が容易な歯髄再生治療に好適な歯科用組成物および象牙質の培養方法を提供することを目的とする。
　本発明にかかる歯科用組成物は、以下の構成を備えている。
［１］ヒトの歯の粉砕物を含有することを特徴とする、象牙質の再生を促進するために用いられる歯科用組成物。
［２］前記粉砕物の粒径が５００～２０００μｍである、［１］に記載の歯科用組成物。
［３］前記粉砕物が脱灰処理されたものである、［１］に記載の歯科用組成物。
［４］前記粉砕物が、０．４～１．０規定の強酸水溶液を脱灰液として用いて、脱灰処理されたものである、［１］に記載の歯科用組成物。
［５］前記粉砕物が、エチレンジアミン誘導体の水溶液を脱灰液として用いて、脱灰処理されたものである、［１］に記載の歯科用組成物。
［６］前記粉砕物が、抗菌剤を含有する溶液に浸漬した後、乾燥させたものである、［１］に記載の歯科用組成物。
［７］前記抗菌剤を含有する溶液が銀イオンを含むアルコール溶液である、［６］に記載の歯科用組成物。
　本発明にかかる象牙質の培養方法は、以下の構成を備えている。
［８］歯髄細胞とヒトの歯の粉砕物を含む歯科用組成物とを接触させて象牙芽細胞を誘発することを特徴とする、象牙質の培養方法。
　本発明は、象牙質の再生を促進する成分として、ヒトの歯の粉砕物を用いている。このため、安全性を容易に確保でき、歯髄再生治療時の再生歯髄組織面上あるいは直接覆髄・生活歯髄切断治療時の歯髄面上に被蓋象牙質を修復・再生する象牙質再生治療に好適に用いられる歯科用組成物を提供することができる。
抜髄した歯の治療における歯の粉砕物の位置を示す模式図 実施例１のＣＢＣＴ画像 図２Ａの領域Ａを拡大して示すＣＢＣＴ画像 実施例１の組織標本写真 図３Ａの領域Ｂを拡大して示す組織標本写真 移植直後の段階における歯の粉砕物を含む歯科用組成物を用いた歯髄再生治療の模式図 象牙質再生が進んだ段階における歯の粉砕物を含む歯科用組成物を用いた歯髄再生治療の模式図 歯髄再生治療における、歯髄移植後の経過を説明する模式図 移植後４～６ヶ月および１２カ月経過時点の模式図と、実施例１の組織標本写真との対応を示す説明図 実施例２の顕微鏡写真（脱灰処理、３重量％ＥＤＴＡ） 実施例２の顕微鏡写真（脱灰処理、３重量％ＥＤＴＡ） 図７Ｂの領域Ｃを拡大した顕微鏡写真 実施例２の顕微鏡写真（生理食塩水） 実施例３の顕微鏡写真（脱灰処理、０．６規定塩酸） 実施例３の顕微鏡写真（脱灰処理、１７重量％ＥＤＴＡ） 実施例３の顕微鏡写真（脱灰処理、０．６規定塩酸の後、１７重量％ＥＤＴＡ） 実施例３の顕微鏡写真（未脱灰）
＜歯科用組成物＞
　本発明の歯科用組成物（以下、適宜「組成物」ともいう。）はヒトの歯（天然歯）の粉砕物を含有している。歯の断面には象牙質や象牙細管があり、歯髄幹細胞を含む歯髄細胞の足場として適しているため、歯の粉砕物を用いることにより、象牙質の再生を促進することができる。象牙質の再生に用いられる歯髄幹細胞および歯の粉砕物は、適合性の観点からその由来は患者自身であることが好ましいが、他者から提供されたものであってもよい。患者以外のドナーから提供された歯髄幹細胞および歯の粉砕物を用いることにより、例えば、智歯等の不用歯が無い患者や老化によって歯髄幹細胞の機能が低下した患者等の歯の象牙質の再生を促進することができる。患者以外の者としては、例えば患者の親族等が挙げられるが、患者との適合性が良ければ親族以外であってもよい。患者以外から提供される歯髄幹細胞と歯の粉砕物とは、同じ歯に由来することが好ましいが、異なる歯に由来するものであってもよい。以下では、患者の不用歯から抽出した歯髄幹細胞および当該不用歯の粉砕物を用いて抜髄した歯の象牙質を再生する態様について説明する。
　歯髄再生治療は患者の不用歯を抜去することから始まる。歯髄幹細胞の培養は歯内の歯髄組織を抽出してから行うが、その際、歯髄組織が抽出された後に残る歯の削片は従来廃棄されていた。歯髄幹細胞を含む歯髄細胞の一部は、足場に接着して生存しており、μｍオーダーの微細構造に対して応答して象牙芽細胞に分化する。また、ヒト歯髄細胞を抽出した歯の削片の象牙質や象牙細管は、個々の患者自身の蛋白質から成る。このため、歯髄組織が抽出された後に残る歯の削片は、歯髄幹細胞との適合性が良好でかつ免疫拒絶反応が起こらないと考えられる。
　そこで、歯の粉砕物の上記性質を利用して、従来、廃棄されていた歯を、歯髄幹細胞から象牙芽細胞への分化誘導並びに象牙質再生・修復の促進に用いることに想到した。また、上記の誘導、促進機能を奏するためには、割り出した歯を適切な大きさとして、適切な位置にとどめることが有効であることを見出した。また、ヒト歯髄細胞を採取した後に残る歯は従来廃棄されていたため、ヒト歯髄細胞を採取した歯を象牙質の再生を促進する成分として用いれば、歯科用組成物を安価に製造することができる。
　ヒト歯髄細胞を採取した歯は、当該歯内の歯髄組織として抽出された歯髄幹細胞との適合性が良好である。また、象牙質や象牙細管の蛋白質は個々の患者に特有のものである。このため、象牙質再生に用いられるヒト歯髄細胞を採取した歯を用いることにより、免疫拒絶反応を回避させてヒト歯髄細胞から象牙芽細胞への分化誘導並びに象牙質再生を効率良く行うことができる。
　本発明は、ヒト歯髄細胞を採取した後に不用となる、従来、廃棄されていた歯（不用歯）を象牙質再生の誘導促進に用いている。ここで不用となる歯としては、例えば矯正歯科治療時に抜歯した歯や智歯（親知らず）などが挙げられる。本発明の組成物は、従来、廃棄されていた歯を使用したものであるため、環境への影響が小さく、非常に安価でエコな製造方法により製造することができる。また、歯の欠片すなわち粉砕物は、歯を割って歯髄組織の摘出を行う押圧プレス機を用いて歯髄組織と同時に製作できるため、製造効率が良好である。
　図１は抜髄した歯の治療における組成物４中の粉砕物３の位置を示す模式図である。同図に示すように、抜髄した歯の治療においては、歯髄幹細胞と薬剤との混合物１が抜髄後の歯に移植され、組成物４が含有する歯の粉砕物３は、混合物１の上に静置される。象牙質代替物５で覆われた後、歯冠部における治療の際に象牙質やエナメル質が取り除かれた部分がレジン２の被せ物によって補強される。
　生体外で作製された象牙芽細胞は最終分化した細胞であるため、これを移植しても根管側壁には接着しない。混合物１における歯髄幹細胞は、最終分化した細胞ではなく、象牙質基質として機能する。このため、歯髄幹細胞は、生体内へ移植した場合に、細胞根管側壁に接着することができる。
　象牙質代替物５としては、例えば、バイオデンチン（登録商標、セプトドン製）などのバイオセラミックス材、ＭＴＡ（Ｍｉｎｅａｌ　Ｔｒｉｏｘｉｄｅ　Ａｇｇｒｅｇａｔｅ）セメント等が用いられる。
　組成物４は、粉砕物３が混合物１の下側すなわちレジン２から遠い側へ移動することを抑制する観点から、混合物１の上に静置される粉砕物３の粒径を所定の大きさとしている。これによって、粉砕物３の位置を混合物１の上側の歯冠部に保持することができる。抜髄後の歯内における粉砕物３の位置を混合物１とレジン２と境界の近くに維持することにより、象牙質の再生を促進する効果を高めることができる。
　粉砕物３を適切な位置にとどめて象牙芽細胞への分化誘導並びに象牙質再生を行う観点から、粉砕物３の粒径は、根管径よりも大きいことが好ましい。ただし、根管径は歯の部位や、患者の年齢などによって異なる。年齢が高くなるにつれて、象牙質が占める割合が多くなり、歯髄組織が満たされている歯髄腔や根管径は狭窄するため、根管径は小さくなる。そこで、象牙質の再生誘導に用いる粉砕物３の粒径は、適応患者の歯の部位や年齢によって定める必要がある。
　上述したように、根管径ｒの大きさは、歯の部位や患者の年齢により異なるが、通常、０．５～１．０ｍｍ（５００～１０００μｍ）程度である。このため、粉砕物３が根管内に落ち込むことを防ぐ観点から、粉砕物３の粒径は、５００μｍ以上のものを用いればよく、６００μｍ以上が好ましく、７００μｍ以上がより好ましい。
　粉砕物３の粒径は、歯髄幹細胞と薬剤との混合物１を注入する部分の幅（断面距離）Ｒよりも小さければよく、例えば、２０００μｍ以下とすればよい。また、粒径を小さくすることで粉砕物３の表面積が増える点において、象牙質の再生に有利になるといえる。このため、粉砕物３の粒径は１５００μｍ以下が好ましく、１０００μｍ以下がより好ましい。
　以上のように、通常の場合、粉砕物３の粒径を５００～２０００μｍ、好ましくは５００～１０００μｍとすることで、象牙質の再生促進に効果的な位置に粉砕物３を維持することができる。ただし、根管径の大きさは個人および部位によって異なるため、適切な粒径は移植する対象根管によって決まる。象牙質の再生促進の観点から、粉砕物３の粒子径は、移植対象とする根管の根管径ｒと同等以上であることが好ましい。粉砕物３は、一つの歯に対して、例えば、５～１５粒程度を用いればよい。本発明において、数値範囲Ａ～ＢはＡ以上Ｂ以下を意義する。
　上記範囲の粒径の粉砕物３は、例えば、ストレーナー（ふるい）を用いて、粉砕後の歯から取り出したものを用いることができる。組成物４に含まれる粉砕物３の粒径の平均（メジアン径、Ｄ５０）は、６００～１５００μｍが好ましく、７００～９００μｍがより好ましい。
　粉砕物３は、エナメル質部と象牙質部とを含んでいるが、歯髄再生を促進する効果を有するのは主に象牙質部である。そこで、象牙質の再生促進の観点から、粉砕物３は脱灰処理されたものが好ましい。脱灰処理により粉砕物３のエナメル質部からカルシウム塩の結晶を溶出させることで、象牙質部による象牙質を再生する効果が向上する。本発明において、脱灰処理とは、歯のエナメル質の主成分であるリン酸カルシウムを溶かすことをいう。
　粉砕物３の脱灰処理に用いる脱灰液としては、基質を溶解させた酸性～弱アルカリ性の水溶液を用いることができる。
　酸による脱灰は、リン酸カルシウムを溶出させる作用を利用した、相対的に程度が強い処理である。酸による脱灰に用いられる基質としては、塩酸、ギ酸、硝酸、トリクロロ酢酸、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、プランク・リュクロ液(塩酸、ギ酸、塩化アルミニウムの混合物)、モールス液(ギ酸、クエン酸ナトリウムの混合物)などが挙げられる。リン酸カルシウムを十分に溶出させる観点から、塩酸、硝酸などの強酸を基質として含む脱灰液が好ましい。
　キレート剤による脱灰は、リン酸カルシウムを軟化させる作用を利用した、相対的に程度が弱い処理である。キレート剤による脱灰に用いられる基材としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のナトリウム塩等のエチレンジアミン誘導体が挙げられる。エチレンジアミン誘導体は、例えば、１～３０重量％程度の水溶液として用いられる。
　歯の粉砕物のエナメル質を十分に溶かして象牙質を顕出させ、抜髄後の歯において、歯髄幹細胞の細管象牙質や骨様象牙質等への分化を促進する観点から、酸による脱灰を行う脱灰液が好ましく、塩酸のような強酸がより好ましい。強酸の水溶液の濃度は、０．１～２．０規定が好ましく、０．３～１．０規定がより好ましい。
　脱灰液によって粉砕物を処理する時間は、粉砕物のエナメル質を溶かすのに十分な時間とすればよい。例えば、粒径（Ｄ５０）が７００～９００μｍ程度の粉砕物３を０．３～１．０規定の塩酸の水溶液を用いて脱灰処理する場合、処理時間は、１０～４０時間が好ましく、１５～３０時間がより好ましい。
　粉砕物３は、抗菌剤を含有する溶液に浸漬した後、乾燥させたものが好ましい。抗菌剤を含有する溶液としては、銀イオンを含むアルコール溶液、銀イオンを含む純水、シリカ水などが挙げられる。
　本実施形態の組成物は、例えば、以下のようにして製造することができる。
（１）歯を上部が開口した筒に入れ、その上から胴体を挿し込んで、押圧を印加し歯をランダムに破砕する。歯を割り出す部材は、硬く、万が一歯の欠片に付着したとしても問題がない生体適合性がある金属を選定する。このような金属としては、例えば、ステンレス・ＳＵＳやチタン合金などが挙げられる。
（２）ストレーナー（ふるい）で所定径（５００～２０００μｍ）の歯の粉砕物（欠片）を取り出す。
（３）所定径の歯の粉砕物をチューブ等に移し、消毒用エタノールに浸透させて殺菌する。
（４）純水等を加え、培養試験にて無菌性を確認する。再度、消毒用エタノールに浸透させる。
（５）無菌空間で消毒用エタノールを乾燥させる。
＜象牙質の培養方法＞
　本発明の象牙質の培養方法は、ヒトの歯の粉砕物を含む歯科用組成物と歯髄細胞とを接触させることにより、象牙芽細胞を誘発するものである。象牙芽細胞を誘発する薬剤を用いないため、培養した象牙質が適用される患者に薬剤への不安を抱かせるおそれがなく、安全性の確保が容易である。また、象牙芽細胞の誘発に用いる歯の粉砕物は歯髄摘出と同時に製作できるため、象牙質の培養を安価に実施することができる。
［実施例１］
　２匹のイヌの歯（計８根管）にイヌ由来の歯の粉砕物を、歯髄の一部を残した根管内に移植した。移植後の経過を観察するために、移植後４カ月経過時点において歯科用ＣＴ（コーンビームＣＴ、ＣＢＣＴ）で撮影し、移植後６カ月経過時点において組織標本を作製し、写真を撮影した。
＜実験条件＞
　歯の粉砕物：移植対象としたイヌから抜歯した歯をプレス機で粉砕し、ストレーナーを用いて、粒径５００～１０００μｍの粉砕物（未脱灰）を取り出した。
　移植対象歯：生活歯髄がある（歯髄が残っている）歯を移植対象とした。
　移植箇所：歯の粉砕物以外の足場材を用いることなく、そのまま５～１０個の粉砕物を移植対象歯の根管の入り口付近に静置した。
＜結果＞
　図２Ａは、移植後４カ月経過時点におけるＣＢＣＴ画像であり、図２Ｂは、図２Ａの矩形で囲った領域Ａを拡大して示したＣＢＣＴ画像である。これらの図に示すように、移植後４カ月経過時点において、粉砕物を移植した歯に白い不透過性の象牙質様硬組織が形成されていた。また、粉砕物を移植した歯のすべてに、移植後４カ月経過時点において、図２Ａおよび図２Ｂに示した歯と同様に、象牙質様硬組織が形成されていた。
　図３Ａは、移植６か月後の組織標本写真であり、図３Ｂは図３Ａの矩形で囲った領域Ｂを拡大して示す組織標本写真である。図３Ａに示すように、移植６か月後において、骨様象牙質様硬組織の層が再生歯髄面上の広い範囲に形成されていた。また、図３Ｂに示すように、根管壁面の間において、骨様象牙質の再生が進んでいることが分かった。これらの結果から、根管の入り口付近に位置させた歯の粉砕物３により、象牙質の再生を促進できることが示されている。
　図４Ａは、粉砕物を移植した時点における歯を模式的に示す断面図であり、図４Ｂは、移植後、再生に十分な時間が経過した時点における歯を模式的に示す断面図である。図４Ａに示すように、粒径５００～１０００μｍの粉砕物を用いることにより、根管の入り口付近において再生象牙質６を形成することができる。再生象牙質６の形成が進行して再生象牙質６が粉砕物と残存する歯冠部象牙質の隙間を埋めて天然歯と再生象牙質が癒合することにより、レジン２の下に天然のコア（つっかえ部）ができる。したがって、治療後における歯の強度が向上し、口腔内からの細菌が再感染（微小漏洩）して再度虫歯になること（二次う蝕）が防止できる。
　また、再生象牙質６の形成を促進する粉砕物３は歯を粉砕したものである。粉砕物３は変性・融解して徐々に再生象牙質に置換されるため、再生象牙質６が形成された後において、再生象牙質６と同様の機械的・化学的性質を示すようになる。例えば、環境温度の変化に伴って生じる熱膨張変化も同じである。このため、熱いものや冷たいものを食べた際に、粉砕物３と再生象牙質６および天然象牙質の間に隙間が生じることがない。対して、人工物を用いた場合、熱いもの、冷たいものを食べた際に、熱膨張の違いによって隙間が生じるおそれがある。自家の蛋白質では免疫拒絶反応を生じないため、治療対象者と同一人の歯を用いて粉砕物３を形成することがより好ましい。
　図５は、移植後の経過を説明する根管モデルの模式図である。同図に示すように、抜髄した根管に、歯髄幹細胞と薬剤との混合物１を移植し、その上に粉砕物３を静置した後、レジン２で被覆する。同図は、粉砕物３とレジン２との間に象牙質代替物５を配置している。
　移植４～６ヶ月後において、粉砕物３を静置した領域に再生象牙質（再生骨様象牙質）６が形成され、混合物１を移植した領域に再生歯髄７が形成される。歯髄幹細胞だけではなく、血管や神経などの歯髄組織を再生させて、象牙質を再生する部分に歯髄組織を呼び込むことにより、根管側面への細胞付着が生じる象牙質再生を実現できる。
　移植１２カ月後において、再生象牙質６の下部（再生歯髄７の上部）に細管象牙質８が形成される（"Dentin induction by implants of autolyzed antigen-extracted allogenic dentin on amputated pulps of dogs, Misako Nakashima, 1989参照）。
　図６は、移植後４～６ヶ月および１２カ月経過時点の根管モデルと、実施例１（移植６ヶ月経過時点）の組織標本写真との対応関係を示す説明図である。同図に示すように、移植６ヶ月経過時点の組織標本写真から再生歯髄７が形成されていることが分かる。また、同写真には、再生象牙質６の下部に、細管象牙質８の形成が始まっていることも示されている。
［比較例１］
　歯の粉砕物として、粒径５００～１０００μｍの粉砕物の代わりに、粒径１５０～５００μｍの粉砕物を用いた以外は、実施例１と同様にして、イヌ由来の歯の粉砕物を歯髄の一部を残した根管内に移植して、経過を観察した。しかし、粒径１５０～５００μｍの粉砕物を用いた場合、被蓋象牙質形成が認められなかった。これは、粉砕物が根管の入り口付近にとどまらず、歯の根尖部側に落ちたためと考えられる。
　粒径を小さくすることで粉砕物の表面積が大きくなる点は、象牙質の再生促進に有利といえる。しかし、歯冠部に被蓋象牙質形成が認められなかったことから、象牙質の再生を促進するには、粉砕物を留まらせる位置が重要であり、歯冠部の根管の入り口より上に粉砕物を留まらせる必要があるといえる。
　実施例１では、粒径５００～１０００μｍの粉砕物３を用いたことにより、粉砕物３が根管の入り口付近にとどまった結果、被蓋象牙質形成を促進したといえる。また、粒径５００～１０００μｍの粉砕物は、粒径１５０～５００μｍのものよりも扱いやすく、移植における作業性においても優れていた。
［実施例２、３］
　歯の粉砕物を構成するエナメル質部と象牙質部のうち、象牙質の再生促進には主に象牙質部が寄与していると考えられる。そこで、溶液を用いて粉砕物の表面を処理することの影響を以下の方法により評価した。すなわち、異なる脱灰処理を行った歯粉砕物に歯髄幹細胞を接触させて、分化能すなわち象牙質形成能を促進する効果を評価した。
［実施例２］
＜歯の粉砕物＞
　イヌ由来の歯をプレス機により粉砕し、ストレーナーを用いて、粒径５００～１０００μｍの歯の粉砕物を取り出した。
＜溶液および処理時間＞
　以下の溶液に以下の時間浸漬した後、水で洗浄、乾燥した粉砕物を用いた。（Ａ）の処理は脱灰処理であり、粉砕物表面からエナメル質が除去される。（Ｂ）の処理は、対照（コントロール）である。
（Ａ）３重量％ＥＤＴＡ水溶液（スメアクリーン；商品名、日本歯科薬品製、脱灰液）、３０分間
（Ｂ）生理食塩水、３０分間
＜培養＞
　歯髄幹細胞（１．２５×１０6セル）と乾燥させた歯削片とをそれぞれペレット状（チューブの底に細胞と粉砕物が重なった状態）にし、遠心チューブ内で以下の培地と混合して、遠心を行い、ペレット状態のまま、蓋は完全密閉しない遠沈管の中で培養した。
　培地：１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）／ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）２ｍｌ
　培地交換頻度：３－４日間（ペレットへのダメージを避けるため、液量の２／３ずつ交換）
　培養環境：３７℃　ＣＯ2インキュベータ内
　培養期間：２２日
＜測定＞
　約３週間（２２日）の培養を行った後、ペレット状の歯髄幹細胞および粉砕物をホルマリン固定後に切片を作製し、歯削片に対する歯髄幹細胞付着の程度を顕微鏡写真により確認した。
［実施例３］
＜歯の粉砕物＞
　不用歯をプレス機により粉砕し、ストレーナーを用いて、粒径７５０～１０００μｍの歯の粉砕物を取り出した。
＜溶液および処理時間＞
　以下の溶液に以下の時間浸漬した後、水で洗浄、乾燥した粉砕物を用いた。（Ｃ）～（Ｅ）の処理は脱灰処理であり、粉砕物表面からエナメル質が除去される。（Ｆ）の処理は、対照（コントロール）である。
（Ｃ）０．６規定塩酸水溶液、２４時間
（Ｄ）１７重量％ＥＤＴＡ水溶液（スメアクリーン；商品名、日本歯科薬品製、脱灰液）、５分間
（Ｅ）処理（Ｃ）の後、処理（Ｄ）
（Ｆ）未脱灰
＜培養＞
　歯髄幹細胞（４．７×１０5セル）と乾燥させた歯削片とをそれぞれペレット状にして培養にし、遠心チューブ内で以下の培地と混合して、遠心を行い、ペレット状態のまま、蓋は完全密閉しない遠沈管の中で培養した。
　培地：ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）２ｍｌ中にＤＭＥＭに対して２０重量％分のＰｏｒｃｉｎｅ血清と濃度０．５ｍｇ／ｍｌのＬ－アスコルビン酸（＝ビタミンＣ、分化促進剤）を含有
　培地交換頻度：３－４日間（ペレットへのダメージを避けるため、液量の２／３ずつ交換）
　培養環境：３７℃　ＣＯ2インキュベータ内
　培養期間：１４日
＜脱灰処理の評価＞
　粉砕物を３５ｍｍディッシュに同数程度振り分けて、デンタルレントゲン装置ＫＤＥＸ－ＳII（株式会社近畿レントゲン工業社）を用いて、脱灰の有無によるＸ線の透過程度の違いを目視により確認した。その結果、（Ｆ）の粉砕物がレントゲン写真に写ること、（Ｃ）および（Ｅ）の粉砕物がレントゲン写真に写らないこと、（Ｄ）の粉砕物が僅かにレントゲン写真に写ることを、確認した。これらのことから、（Ｃ）および（Ｅ）の粉砕物は脱灰処理によりエナメル質が十分に溶解して象牙質が主成分となったこと、（Ｄ）の粉砕物は脱灰処理後においてもエナメル質が少し残っていること、を確認した。
＜測定＞
　約２週間（１４日）の培養を行った後、ペレット状の歯髄幹細胞および粉砕物をホルマリン固定後に切片を作製し、歯削片に対して歯髄幹細胞が付着する程度を顕微鏡写真により確認した。
　図７Ａ～図７Ｃおよび図８は、実施例２における、（Ａ）３重量％ＥＤＴＡ水溶液および対照としての（Ｂ）生理食塩水溶液を用いて表面を処理した粉砕物と歯髄幹細胞とをペレット状にして培養した後の顕微鏡写真である。
　図７Ａ～図７Ｃに示すように、３重量％ＥＤＴＡ水溶液で処理した粉砕物は、対照の生理食塩水溶液で処理した粉砕物よりも粉砕物のペレット表面への歯髄幹細胞の接着状態が良好であった。なお、図７Ａに示した両側矢印の方向は、象牙細管すなわち象牙質の細管構造（穴径１～２μｍ）の伸長方向の向きを示している。図７Ｃは図７Ｂにおける領域Ｃを拡大したものである。
　図７Ａ～図７Ｃの写真から、粉砕物を脱灰処理することにより、粉砕物と歯髄幹細胞の接着性が向上することが分かった。
　図９Ａ、図９Ｂおよび図９Ｃは、実施例３における、処理（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）をした粉砕物と歯髄幹細胞とをペレット状にして培養した後の顕微鏡写真である。図１０は、対照としての未処理の粉砕物と歯髄幹細胞とをペレット状にして培養した後の顕微鏡写真である。
　歯髄幹細胞は、接着細胞であり、単一の細胞である場合には星のような形状をして増殖する。一方、歯髄幹細胞が密になると細胞形状が伸長して、組織の形成を進める。この組織細胞の伸長は歯髄幹細胞の特徴である。ペレット状で培養した場合、培養環境は密であり、粉砕物面が適切な接着足場であると、歯髄幹細胞はその形状が伸長し、ある方向に方向性をもち、分化して組織になろうとする。
　図９Ａおよび図９Ｃの顕微鏡写真では、細胞が伸長して方向性を持ち、且つ細胞同士が並んでいることが確認できる。対して、図９Ｂの顕微鏡写真では、細胞の伸長による方向性および細胞同士が並んでいることが明確に確認できない。この結果から、抜髄後の歯において、歯髄幹細胞の細管象牙質や骨様象牙質等への分化を促進するには、脱灰処理によって粉砕物のエナメル質を十分に溶解し、粉砕物の表面に象牙質を顕出させることが有効といえる。
　なお、塩酸水溶液（０．６規定）で６０分間処理した粉砕物を用いたものは、粉砕物のペレット表面から歯髄幹細胞の剥がれが認められ、接着状態が３重量％ＥＤＴＡ水溶液で処理した粉砕物よりもやや劣っていた。このことから、０．６規定の塩酸水溶液を用いる場合、歯の粉砕物表面のエナメル質を十分に溶解する観点から、脱灰処理は、６０分間よりも長い時間、例えば、１０時間以上、１５時間以上、２０時間以上の処理時間で行うことが好ましいといえる。
　図８に示すように、実施例２の対照としての溶液（Ｂ）の生理食塩水処理を用いた場合、溶液（Ａ）により粉砕物を脱灰処理したときのように、歯髄幹細胞の接着状態を向上させる効果は認められなかった。
　また、図１０に示すように、実施例３の対照としての未脱灰（Ｆ）の粉砕物では、細胞の伸長による方向性および細胞同士の並びは認められなかった。
　本発明の歯科用組成物および象牙質の培養方法は、う蝕治療、抜髄・感染根管治療に利用することができる。
１　　　　：混合物
２　　　　：レジン
３　　　　：粉砕物
４　　　　：組成物
５　　　　：象牙質代替物
６　　　　：再生象牙質
７　　　　：再生歯髄
８　　　　：細管象牙質
Ａ～Ｃ　　：領域
ｒ　　　　：根管径
Ｒ　　　　：断面距離

Claims (8)

  1. 　ヒトの歯の粉砕物を含有することを特徴とする、象牙質の再生を促進するために用いられる歯科用組成物。
  2. 　前記粉砕物の粒径が５００～２０００μｍである、
    請求項１に記載の歯科用組成物。
  3. 　前記粉砕物が脱灰処理されたものである、
    請求項１に記載の歯科用組成物。
  4. 　前記粉砕物が、０．４～１．０規定の強酸を脱灰液として用いて、脱灰処理されたものである、
    請求項１に記載の歯科用組成物。
  5. 　前記粉砕物が、エチレンジアミン誘導体の水溶液を脱灰液として用いて、脱灰処理されたものである、
    請求項１に記載の歯科用組成物。
  6. 　前記粉砕物が、抗菌剤を含有する溶液に浸漬した後、乾燥させたものである、
    請求項１に記載の歯科用組成物。
  7. 　前記抗菌剤を含有する溶液が銀イオンを含むアルコール溶液である、
    請求項６に記載の歯科用組成物。
  8. 　歯髄細胞とヒトの歯の粉砕物を含む歯科用組成物とを接触させて象牙芽細胞を誘発することを特徴とする、象牙質の培養方法。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11228328A (ja) * 1998-02-13 1999-08-24 Gc Corp 歯科用根管充填材組成物
WO2007099861A1 (ja) * 2006-02-24 2007-09-07 Health Sciences University Of Hokkaido 高度先進医療に応用できる抜去歯粉砕品、抜去歯由来の脱灰粉体、脱灰粉体とアパタイトとの複合体を調製する方法および粉砕機
WO2017135186A1 (ja) * 2016-02-01 2017-08-10 富士フイルム株式会社 根管治療材料および根管治療用キット
WO2017170996A1 (ja) * 2016-03-31 2017-10-05 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター 歯科用前処理材及び歯組織再生キット
JP2018131456A (ja) * 2015-03-25 2018-08-23 株式会社愛歯 銀粒子担持方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11228328A (ja) * 1998-02-13 1999-08-24 Gc Corp 歯科用根管充填材組成物
WO2007099861A1 (ja) * 2006-02-24 2007-09-07 Health Sciences University Of Hokkaido 高度先進医療に応用できる抜去歯粉砕品、抜去歯由来の脱灰粉体、脱灰粉体とアパタイトとの複合体を調製する方法および粉砕機
JP2018131456A (ja) * 2015-03-25 2018-08-23 株式会社愛歯 銀粒子担持方法
WO2017135186A1 (ja) * 2016-02-01 2017-08-10 富士フイルム株式会社 根管治療材料および根管治療用キット
WO2017170996A1 (ja) * 2016-03-31 2017-10-05 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター 歯科用前処理材及び歯組織再生キット

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEE CHI P, JOHN S COLOMBO WAYNE NISHIO AYRE, ALASTAIR J SLOAN , RACHEL J WADDINGTON: "Elucidating the cellular actions of demineralised dentine matrix extract on a clonal dental pulp stem cell population in orchestrating dental tissue repair", JOURNAL OF TISSUE ENGINEERING, vol. 6, 1 January 2015 (2015-01-01), GB , pages 1 - 13, XP093008045, ISSN: 2041-7314, DOI: 10.1177/2041731415586318 *

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