WO2022223814A1 - Composition pharmaceutique et nutraceutique comprenant un mélange de plantes pour la prevention et le traitement de maladies neurodegeneratives - Google Patents

Composition pharmaceutique et nutraceutique comprenant un mélange de plantes pour la prevention et le traitement de maladies neurodegeneratives Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to the pharmaceutical and nutraceutical fields and, more specifically, to a composition comprising as active ingredient at least one extract from a combination of plants.
  • composition according to the invention is used for the prevention and/or treatment of neurodegenerative diseases, in particular Alzheimer's disease.
  • AD Alzheimer's disease
  • a neurodegenerative disease of brain tissue that mainly affects people over the age of 65.
  • other risk factors have been incriminated such as genetic factors or even environmental factors.
  • This disease is characterized by a degenerative disorder of the central nervous system associated with a significant loss of specific neuronal cells. It manifests clinically in a progressive loss of the patient's memory, cognition, reasoning, judgment and emotional stability which gradually leads to profound mental deterioration and ultimately death.
  • Alzheimer's disease constitutes a major public health issue given the progressive aging of the population and the absence of curative treatments to date. In the United States, up to four million people suffer from Alzheimer's disease with no less than 100,000 deaths per year.
  • amyloid plaques or senile plaques
  • neurofibrillary degeneration or neurofibrillary tangles
  • amyloid plaques are made up of a peptide, called Ab, which derives from a precursor protein called APP.
  • Ab a peptide
  • APP a precursor protein
  • neurofibrillary degeneration it consists of an accumulation, in the form of fibers and inside the neurons, of another protein, the Tau protein, which is then in an abnormal form.
  • any substance reducing Ab neurotoxicity may be useful as a novel therapeutic agent for the treatment or prevention of Alzheimer's disease.
  • acetylcholinesterase inhibitors such as donepezil, galantamine, and rivastigmine
  • NMDA receptor antagonists such as memantine.
  • these drugs only treat the symptoms of Alzheimer's disease and only modestly slow the progression of the disease.
  • taking these drugs is often accompanied by significant side effects such as nausea, diarrhea and liver problems. There is therefore an urgent need to develop new alternatives.
  • This AT000 extract comes from the extraction of an equimassic mixture of plants consisting of Syzygium aromaticum, Santalum album, Aquilaria malaccensis, Boswellia carterii, Cyperus rotundus, Styrax benzoin, Liquidambar orientalis, Saussurea costus and of Dryobalanops aromatica.
  • the inventors have identified three extracts possessing a protective effect against the neurotoxicity of Abs from a design of formulation experiments based on the optimization of antioxidant activity (DPPH test, radical scavenging activity of the extract ) of different formulas based on 9 plants:
  • the present invention relates to a composition comprising extract la, lb or 2.
  • a first object of the invention relates to a composition, which may be pharmaceutical or nutraceutical, comprising an extract derived from a mixture of plants consisting of Syzygium aromaticum, Santalum album, Aquilaria malaccensis, Boswellia carterii, Cyperus rotundus, Styrax benzoin, Liquidambar orientalis, Cinnamomum camphora and Saussurea costus.
  • Another object of the invention relates to a composition as defined above for use as a medicament.
  • Another subject relates to a composition as defined above for use in the treatment and/or prevention of a neurodegenerative disease, preferably Alzheimer's disease, in mammals, preferably in humans.
  • a neurodegenerative disease preferably Alzheimer's disease
  • Another object of the invention relates to an edible oil comprising at least 0.5% (by weight relative to the total weight of the oil) of a composition as mentioned above, preferably at least 1% or 2% .
  • a final object of the invention relates to a functional drink produced by diluting a glycerinated macerate with water in a 1:10 ratio.
  • Figure 1 Effect of different extracts and donepezil (DPZ) on a mouse model of spatial working memory.
  • Figure 2 Effect of different extracts and donepezil on a mouse model of long-term contextual memory.
  • Figure 4 UHPLC-DAD analysis at 254 nm (a) of the extract 1b from a decoction extraction of a mixture of plants in a hydroalcoholic mixture; (b) macerate 1b resulting from an extraction by maceration of a mixture of plants in 100% glycerine; (c) macerate lb resulting from an extraction by maceration of a mixture of plants in an equal volume mixture of glycerin / ethanol.
  • Figure 5 UHPLC-DAD analysis at 325 nm (a) of the extract 1b from a decoction extraction of a mixture of plants in a hydroalcoholic mixture; (b) macerate 1b resulting from an extraction by maceration of a mixture of plants in 100% glycerin; (c) macerate 1b resulting from an extraction by maceration of a mixture of plants in an equal volume mixture of glycerin/ethanol.
  • Figure 7 Study of the extraction kinetics: UHPLC-DAD analysis at 325 nm of macerate 1b at different times T during maceration in 100% glycerine.
  • Figure 8 Neuronal survival of a primary culture of cortical neurons treated with Ab 1-42 followed by the composition according to the invention.
  • Figure 9 Total network of neurites in a primary culture of cortical neurons treated with Ab 1-42 followed by the composition according to the invention
  • Figure 10 Neuronal survival of a primary culture of cortical neurons treated with Ab 1-42 followed by DHA.
  • Figure 11 Total neurite network in primary culture of cortical neurons treated with Ab 1-42 followed by DHA.
  • the inventors have now developed a composition comprising an extract derived from a specific mixture of plants which makes it possible to protect against the neurotoxicity of the Ab.
  • extract refers to a substance extracted from a natural product, regardless of its method of extraction or the composition of the ingredients. For example, this includes those obtained by extracting soluble ingredients from a natural product using water, glycerin or an organic solvent, or those obtained by extracting specific ingredients only, such as oil (eg olive oil).
  • the extraction processes are well known to those skilled in the art and consist in particular of a decoction, an infusion or a maceration of parts of plants (buds, roots, leaves, etc.), crushed or not, in an extraction solvent appropriate.
  • the extract is obtained by decoction using a solvent selected from the group consisting of water, a linear or branched alcohol having 1 to 4 carbon atoms, acetate of ethyl, dichloromethane, acetone, glycerin and mixtures thereof.
  • a solvent selected from the group consisting of water, a linear or branched alcohol having 1 to 4 carbon atoms, acetate of ethyl, dichloromethane, acetone, glycerin and mixtures thereof.
  • the extract is obtained by decoction using glycerin, a hydroalcoholic mixture or a glycerinated hydroalcoholic mixture, more preferably using a hydroalcoholic mixture.
  • the extract is obtained by maceration of the plant mixture at room temperature in 100% glycerin or in an equal volume mixture of glycerin and ethanol, preferably by maceration in 100% glycerin.
  • the extract thus obtained is also called macerate.
  • the maceration of the mixture of plants in glycerin is carried out between 30° C. and 50° C., preferably at 40° C., for 30 minutes to 5 hours, preferably between 1 and 4 hours, in particular 2 hours, preferably in 100% of glycerine or in an equal volume mixture of glycerine and ethanol, preferably by maceration in 100% glycerine.
  • the extract thus obtained is also called macerate.
  • the extract is not a dry extract, preferably the extract is obtained by maceration in glycerin, more preferably the extract is obtained by maceration in vegetable glycerin.
  • dry extract a solid extract obtained after evaporation of the solvent used for its extraction.
  • glycerin is meant glycerin of vegetable origin or glycerin of animal origin, preferably glycerin of vegetable origin.
  • hydroalcoholic mixture is meant a mixture of water and alcohol, preferably a mixture composed of 70% water and 30% alcohol.
  • hydroalcoholic glycerin mixture is meant a mixture of water, alcohol and glycerin, preferably a mixture composed of 35% water, 15% alcohol and 50% glycerin.
  • decoction is meant an extraction process in which the mixture of plants is placed in the presence of a solvent and then heated to the boiling point of the latter for several hours before being filtered.
  • the filtrate thus obtained constitutes the extract of the plant mixture.
  • the boiling point will be that of the azeotrope formed.
  • Clove or Cloves is a species of plant in the Myrtaceae family and in the Syzygium genus. Clove trees are trees native to Indonesia whose flower buds form a spice called cloves. Preferably, the herbal mixture uses buds of Syzygium aromaticum. In the case where the extract does not comprise an equimassic mixture of plants, the mixture has a content of between 25 and 55% (by weight relative to the total weight of the plant mixture) in Syzygium aromaticum, preferably between 30 and 50%.
  • White Sandalwood (Santalum album) is a tropical tree of the Santalaceae family and of the Santalum genus. It is the best known source of sandalwood. This species is mainly native to southern India in Sri Lanka, Australia and the Malay Archipelago.
  • the plant mixture uses wood from Santalum album, and particularly preferably heartwood (heartwood) from Santalum album.
  • the mixture has a content of between 5 and 9% (by weight relative to the total weight of the plant mixture) in Santalum album, preferably between 6 and 8%.
  • Aquilaria malaccensis also known as aloewood, Malacca eaglewood or agarwood, is a rainforest tree belonging to the genus Aquilaria and is in the family Thymeleaceae. This species is mainly native to Bangladesh, Bhutan, India, Indonesia, Iran, Malaysia, Sri, Philippines, Singapore, and Thailand.
  • Aquilaria malaccensis produces in the heartwood a particular resin, fragrant in reaction to certain physical attacks (injuries, fire) or biological attacks (attacks by xylophagous insects, bacteria and fungi). This resin is widely used in traditional medicine and perfumery.
  • the plant mixture uses wood from Aquilaria malaccensis and, particularly preferably, heartwood (heartwood) from Aquilaria malaccensis.
  • the mixture has a content of between 15 and 30% (by weight relative to the total weight of the plant mixture) of Aquilaria malaccensis, preferably between 18 and 24%.
  • the frankincense tree Boswellia carterii belongs to the Boswellia genus and the Burseraceae family. This tree is mainly native to Yemen and Somalia.
  • the resin of this tree is one of the oldest fragrant and medicinal resins known worldwide. It has been widely used in traditional Ayurvedic medicine.
  • the herbal mixture uses Boswellia carterii resin.
  • the mixture has a content of between 5 and 9% (by weight relative to the total weight of the plant mixture) of Boswellia carterii resin, preferably between 6 and 8%.
  • Nutsedge (Cyperus rotundus) is a species of monocotyledonous plant in the Cyperaceae family. It is a perennial herbaceous plant with rhizomes and tubers. It is also known as Asian Tigernut, Tigernut, Onion Grass or Tuberous Tigernut. Originally from India, this species has gradually developed from Africa to the south of Europe to extend over a large part of the planet. The tubers are used for medicinal and food purposes. Preferably, the herbal mixture uses Cyperus rotundus buds.
  • the mixture has a content of between 5 and 9% (by weight relative to the total weight of the plant mixture) of Cyperus rotundus buds, preferably between 6 and 8%.
  • Styrax benzoin is a species of tree native to Sumatra, Indonesia, of the genus Styrax and belonging to the family Styracaceae. This tree produces a balsamic resin (benzoin) with a slightly vanilla smell. This resin is widely used in tropical Asia for its fragrance and its action on well-being.
  • the herbal mixture uses Styrax benzoin resin.
  • the mixture has a content of between 5 and 9% (by weight relative to the total weight of the plant mixture) of Styrax benzoin resin, preferably between 6 and 8%.
  • Liquidambar orientalis also known as oriental sweetgum, is a tree of the family Hamamelidaceae (or Altingiaceae according to the phylogenetic classification). It is a deciduous tree of the genus Liquidambar. Native to the eastern Mediterranean region, this species occurs mainly in the floodplains of southeastern Turkey and on the Greek island of Rhodes. Its resin is widely used as incense or in perfumery. Preferably, the herbal mixture uses resin from Liquidambar orientalis.
  • the mixture has a content of between 5 and 9% (by weight relative to the total weight of the plant mixture) of Liquidambar orientalis resin, preferably between 6 and 8%.
  • the Camphor tree, camphor tree, Shiu wood or Chinese laurel are the various names of Cinnamomum camphora, a species of tree of the Lauraceae family native to China, Taiwan and Japan, which has become naturalized everywhere on other continents.
  • the leaves and young twigs are distilled to obtain essential oils containing camphor.
  • the herbal mixture uses Cinnamomum camphora leaves.
  • the mixture has a content of between 5 and 9% (by weight relative to the total weight of the plant mixture) of Cinnamomum camphora leaves, preferably between 6 and 8%.
  • Saussurea costus is a tall, hardy herbaceous perennial in the Asteraceae family. Originally from Asia (Himalayas, Kashmir, India, Pakistan), it is often cultivated for its medicinal properties. Preferably, the plant mixture uses the roots of Saussurea costus.
  • the mixture has a content of between 5 and 9% (by weight relative to the total weight of the plant mixture) of roots of Saussurea costus, preferably between 6 and 8%.
  • the content of extract in the composition according to the invention is between 0.1% and 90% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the content of extract in the composition will be between 20% and 50% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the extract content in the composition will rather be between 0.1% and 10% by weight relative to the total weight of the composition, more preferably between 0 5% and 5% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the composition can allow daily administration of an extract of the mixture of plants from 62.5 mg in mice and from 625 mg in humans.
  • composition according to the invention is characterized in that the extract is obtained from a mixture of plants which has:
  • composition according to the invention can be in the form of solid dry extract, of resin, of emulsion or in liquid form.
  • composition according to the invention can be in the form of flavored oil, syrup, tablets, capsules, powder, capsules, sticks, sachets, ampoules, droppers or in the form injectable.
  • the composition according to the invention is in the form of a capsule, an oil or a functional drink
  • the capsule is a “vegetable” capsule.
  • Such a particular vegetable capsule can be made simply, in particular with a cellulose-based envelope (Hydroxypropylmethylcellulose, or “HPMC”, or even “Hypromellose”); to which the cellulose can be added with natural dye, so as to obtain the envelope having the desired properties.
  • a cellulose-based envelope Hydropropylmethylcellulose, or “HPMC”, or even “Hypromellose”
  • the composition according to the invention has a proportion of Hydroxypropylmethylcellulose of between 50 and 150 mg, for example between 75 and 125 mg.
  • the capsule As such, its weight is ideally between 0.25 and 0.75 grams/capsule to benefit from an easily ingestible capsule and, by extension, a good grip by the subject.
  • Said envelope may also also comprise opacifying agents.
  • Other pharmaceutically and/or food-acceptable agents can be added, such as antioxidants, bulking agents, fluidizers, natural extracts, minerals, trace elements, amino acids, fatty acids, anti-caking agents , natural oils, flavorings, colorings, acidifiers, thickeners, preservatives and sweeteners.
  • antioxidant agents mention may be made of polyphenols, in particular in the form of plant extracts (extracts of green tea, grape, ginseng), vitamin C, in particular in the form of plant extracts ( acerola, pomegranate, citrus extract), or even vitamin E, in particular in the form of plant extracts; or their derivatives.
  • microcrystalline cellulose By way of examples of bulking agents, mention may be made of microcrystalline cellulose, potato maltodextrin or even magnesium lactate, preferably microcrystalline cellulose.
  • fluidizers mention may be made of magnesium silicate, magnesium stearate or even colloidal silica.
  • minerals or trace elements mention may be made of magnesium, iodine, iron, copper, zinc, selenium, chromium, molybdenum, manganese, silicon, vanadium, nickel or tin.
  • amino acids mention may be made of alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, histidine, isoleucine, lysine, leucine, methionine, asparagine, proline, glutamine, arginine, serine, threonine, valine, tryptophan or tyrosine.
  • fatty acids examples include unsaturated fatty acids such as omega-3 or omega-6.
  • composition according to the invention comprises at least one fatty acid belonging to the omega-3 family.
  • composition according to the invention comprises docosahexaenoic acid (DHA) which is an unsaturated fatty acid belonging to the omega-3 family
  • DHA docosahexaenoic acid
  • the DHA content in the composition is adjusted so as to allow a daily administration of 250 mg which constitutes the recommended dose.
  • anti-caking agents usually used in the food industry, mention may be made of magnesium stearate (E470b), silicon dioxide (E551) and colloidal silica.
  • a thickener As an example of a thickener, mention may be made of potato starch, hydroxypropyl methylcellulose, citrus pectin, guar gum, locust bean gum, agar-agar, konjac, hydrogenated oils or more beeswax.
  • citric acid By way of example of acidifiers, mention may be made of citric acid.
  • sweeteners mention may be made, inter alia, of xylitol, aspartame, glucose syrup, fructooligosaccharide syrup, maltitol powder or syrup, acesulfame potassium, fructooligosaccharide and sodium cyclamate.
  • curcumins E100
  • carminic acid E120
  • erythrosine E127
  • chlorophylls and chlorophyllins E140
  • copper-chlorophyll and chlorophyllin complexes E141
  • caramel E150
  • carotenoids E160
  • anthocyanins E163
  • calcium carbonate E170
  • iron oxide and hydroxide E172
  • even orcein E182
  • preservatives examples include potassium sorbate, sodium benzoate or ascorbyl palmitate (antioxidant). Now, all these compounds are in no way limiting of the pharmaceutically and food-acceptable agents that can be added to the composition according to the invention and other agents can be envisaged.
  • composition as defined above can be used in the manufacture of an edible oil and/or a functional drink.
  • the composition according to the invention is an edible oil (for example olive oil) or a functional drink.
  • composition according to the invention has a content of at least 0.5% (by weight relative to the total weight) of a composition as defined above, preferably at least 1% or 2%.
  • edible oil any oil capable of being used in food, namely olive oil, sesame oil, walnut oil, rapeseed oil, grape seed oil, sunflower oil or mixtures thereof.
  • functional drink we mean all non-alcoholic drinks which allow the consumer in addition to hydration but also to improve his well-being and his health, or which can even reduce the risk of disease. These include sports drinks, energy drinks, smart drinks, ready-to-drink (RTD) coffees and teas, enhanced waters.
  • RTD ready-to-drink
  • composition as defined as a medicament
  • the latter is administered in a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • pharmaceutically acceptable vehicle any vehicle which does not interfere with the effectiveness of the biological activity of the composition or of the extract according to the invention and which is not toxic for the host to which the composition or extract according to the invention is administered.
  • composition for preventing and/or treating a neurodegenerative disease in a subject it is preferably a mammal and, particularly preferably, a human.
  • neurodegenerative diseases these are advantageously Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease and amyotrophic lateral sclerosis.
  • Example 1 The invention is illustrated by examples.
  • Example 1 The invention is illustrated by examples.
  • Example 1 The invention is illustrated by examples.
  • Plant extracts A - Extraction method
  • a total of 175g of a pre-ground equimassic mixture of Syzygium aromaticum buds, Santalum album heartwood (heartwood), Aquilaria malaccensis heartwood (heartwood), Boswellia carterii resin, Cyperus rotundus, Styrax benzoin resin, Liquidambar orientalis resin, Saussurea costus roots and Dryobalanops aromatica resin is extracted with the equivalent of 10 volumes of a water/ethanol mixture (70:30, v/v ) at 80-85°C using a reflux condenser for 3 h. The extract is then filtered under vacuum using a Büchner flask and evaporated using a rotary evaporator at 60°C. A resin is thus obtained.
  • a total of 175g of a pre-ground equimassic mixture of Syzygium aromaticum buds, Santalum album heartwood (heartwood), Aquilaria malaccensis heartwood (heartwood), Boswellia carterii resin, Cyperus rotundus, Styrax benzoin resin, Liquidambar orientalis resin, Saussurea costus roots and Cinnamomum camphora leaves is extracted with the equivalent of 10 volumes of a water/ethanol mixture (70:30, v/v ) at 80-85°C using a reflux condenser for 3 h.
  • the extract is then filtered under vacuum using a Büchner flask and evaporated using a rotary evaporator at 60°C.
  • a resin is thus obtained.
  • Extract 1b obtained by decoction of a mixture of plants in a hydroalcoholic medium
  • Extract lb is obtained according to a protocol identical to that for obtaining extract la, with the difference that 5 equivalents of buds of the Syzygium aromaticum plant and 3 equivalents of heartwood (heartwood) of the Aquilaria malaccensis plant are used instead of an equivalent. The other plants are used as above up to one equivalent. A resin is thus obtained.
  • Extract 2 obtained by decoction of a mixture of plants in a hydroalcoholic medium Extract 2 is obtained according to a protocol identical to that allowing extract 1b (Ac) to be obtained, except that the plant mixture allowing extract 2 to be obtained does not contain Saussurea costus. A resin is thus obtained.
  • Macerate lb is obtained by maceration from buds of Syzygium aromaticum (5 equiv.), heartwood (heartwood) of Santalum album (1 equiv.), heartwood (heartwood) of Aquilaria malaccensis (3 equiv. .), Boswellia carterii resin (1 equiv.), Cyperus rotundus buds (1 equiv.), Styrax benzoin resin (1 equiv.), Liquidambar orientalis resin (1 equiv.), Saussurea costus (1 equiv.) and Cinnamomum camphora leaves (1 equiv.) in 100% vegetable glycerin at room temperature for 3 h protected from light. The mixture is extracted with the equivalent in weight of 1 mass of dried and ground plants for 4 volumes of vegetable glycerin (ratio 1:4). The macerate is regularly mixed. The extract is then filtered under vacuum using a Büchner flask.
  • the protocol is identical to point (A-e) except for the maceration solvent which is composed of an ethanol/vegetable glycerine mixture with a volume ratio of 50/50 and the same ratio of plants to solvent by weight of 1:4.
  • a stock solution was prepared: 10.0 mg of control was placed in a 10 mL volumetric flask. After solubilization in about 3 mL of methanol using ultrasound, the solution was adjusted to the line of the gauge with the same solvent. Dilutions were prepared at 100, 20, 10, 5 and 1 ue/mL. Each dilution was filtered through a 0.22 ⁇ m filter before being injected. - Preparation of samples to be analyzed
  • the glycerine extract was diluted to 10th with ethanol. 100 ⁇ L of the extract was mixed with 900 ⁇ L of ethanol using a vortex. 2 mL of this solution were filtered through a 0.22 ⁇ m filter before being injected.
  • the chemical profile of the various extracts 1b was determined by means of analysis by ultra-high performance liquid chromatography equipped with a diode array UV detector and coupled to a mass spectrometer.
  • a Kinetex Polar C18 column (150 ⁇ 4.6 mm; 2.6 ⁇ m) is used for the separation of compounds.
  • the mobile phase consists of water acidified at 0.1% (volume/volume) by formic acid as solvent A and acetonitrile acidified at 0.1% (volume/volume) by formic acid as solvent B.
  • the elution gradient is as follows: 0-2 min 15% B, 2-14 min 15-100% B, 14-17 min 100% B, 17-17.01 min 100-15% B, 17.01-20 min 15% B.
  • the flow and the column oven are set to 0.5 m L/min and 40°C, respectively.
  • the analysis is carried out using 2 pL of the samples to be analyzed.
  • the chromatograms obtained provide information on the diversity of the molecules present in the extract 1b resulting from the different types of extraction A-(c), A-(e), A-(f).
  • the inventors were also able to identify 5 other compounds common to these 3 extracts 1b: isobiflorin, biflorin, vanillin, benzoic acid and eugenol (FIG. 4 (b)).
  • the calibration curve of the two standards are linear ( Figure 6) with correlation coefficients (R2) greater than 0.999.
  • the deviations from back-calculated concentrations are less than 5%.
  • the glycerinated maceras sampled at TO, T1h, T2h, TBh, T4h, T5h, T6h and T24h were prepared according to the preparation method described in part B.2-(b) and are analyzed according to the analysis method described in part B.3—The results of the chromatographic profiles at 325 nm of the various samples are presented in Figure 7. These results indicate that the maximum vanillin concentration is reached after 2 hours of maceration.
  • mice Male Swiss mice, 6 weeks old and weighing 30-35 g, from JANVIER LABS are used throughout the study. Mice are housed in groups with free access to food and water except during behavioral experiments. The mice are kept in an animal facility at controlled temperature and humidity, under a light/dark cycle of 12 h (light off at 7:00 p.m.). Mice are numbered by marking their tails with a permanent marker. All animal procedures are carried out in strict compliance with the European Union directives of September 22, 2010 (2010/63/EU). 2. Method of Treatment a) Administration procedure of Ab25-35 peptide and mutated Ab25-35 peptide
  • a homogeneous oligomeric preparation of the Ab25-35 peptide and of the mutated Ab25-35 peptide (negative control) was carried out according to a procedure belonging to AMYLGEN.
  • the preparations were dissolved in sterile distilled water at a concentration of 3 mg/mL, then stored at -20°C until use. Prior to injection, the peptides were aggregated by incubation at 37°C for 4 days.
  • Each mouse is anesthetized for 5 min with 2.5% isoflurane before receiving, by means of a 26-gauge stainless steel syringe, a gradual injection, lasting 30 s, of 3 ⁇ L of the peptide Ab25- 35 (9 mmol/mouse) or mutated and inactive Ab25-35 peptide (9 mmol/mouse) in the right lateral ventricle of the brain according to a method already described.
  • the syringe needle is held at the injection site for an additional 30 seconds before being withdrawn.
  • mice received, at 10:00 a.m., a single intracerebroventricular injection of 3 pL (3 mg/mL) of the Ab25-35 oligomeric peptide or of the mutated Ab25-35 peptide (negative control) b) Donepezil administration procedure ( reference) and plant extracts AT000, la, lb and 2 obtained by decoction in an aqueous-alcoholic mixture.
  • the vehicle 5% solution of DMSO in water
  • the extracts AT000, la, lb, or 2 are administered to the mice twice a day by force-feeding (per os), once at 9 a.m. and once at 5 p.m.
  • Each extract is dissolved in an aqueous solution of DMSO at 5% and is freshly prepared just before each gavage administration.
  • Donepezil (reference) is also administered orally (1 mg/kg) but only once a day (9:00 a.m.), from D-14 to D 10, after having been dissolved in water beforehand.
  • the volume of solution administered per mouse is calculated according to the individual weight of each mouse (5 mL/kg).
  • mice The long-term non-spatial memory of the mice is assessed using a passive avoidance procedure which takes place in two stages. The first part of the test takes place on D9 and is a so-called learning phase. The 2nd part takes place on D10 and is a so-called retention phase. c) Euthanasia of mice
  • mice On D 10, immediately after the passive avoidance retention session, the mice are decapitated. The hippocampus and cortex of each group of mice are quickly removed, weighed and stored in liquid nitrogen until analysis.
  • mice are tested for spontaneous alternation performance in the Y-maze, an index of spatial working memory.
  • the Y-maze is made of gray polyvinyl chloride. Each arm is 40cm long, 13cm high, 3cm wide at the bottom, 10cm wide at the top and converges at an equal angle.
  • Each mouse is placed at arm's length and allowed to move freely through the maze for an 8-minute session.
  • An alternation is defined as entries into all three arms on consecutive occasions.
  • the maximum number of alternations is therefore the total number of arm entries minus two and the percentage of alternation is calculated as follows:
  • Parameters include alternation percentage (memory index) and total number of arm entries (crawl index).
  • the test apparatus consists of a box with two compartments (15 x 20 x 15 cm high), one of which is illuminated by white polyvinyl chloride walls and the other darkened by black polyvinyl chloride walls and with a grid on the ground.
  • a guillotine door separates the two compartments.
  • a 60 W lamp positioned 40 cm above the device illuminates the white compartment during the experiment.
  • random electric shocks of 0.3 mA are delivered to the paws for 3 seconds thanks to a random electric generator (Lafayette Instruments, Lafayette, USA).
  • the 1st phase of the experience takes place on D10.
  • the guillotine door is initially closed during the training session. Each mouse is placed in the white compartment. After 5 seconds, the door will lift. When the mouse enters the dark compartment and puts all its paws on the grid, the door closes and the random electric shock is delivered to the paws for 3 seconds.
  • the latency time before entering the dark compartment and the number of vocalizations are recorded. The number of vocalizations did not differ between groups indicating that all animals received the electric shock equally Animals for which the latency time during the training session is less than 10 seconds are discarded from the experiment.
  • the 2nd phase of the experience is carried out 24 hours after the 1st phase.
  • Each mouse is returned to the white compartment.
  • the door separating the two compartments is lifted after 5 seconds.
  • the latency of entry into the dark compartment is recorded for a duration of 300 seconds.
  • the number of entries and the escape time i.e. the time taken to return to the white compartment, are measured over 300 seconds.
  • the animals which exhibit latency times during the retention session of less than 10 seconds are discarded from the experiment. The results are shown in Figure 2.
  • Spatial working memory is assessed using a Y-maze spontaneous alternation test.
  • the injection of the Ab25-35 peptide very significantly alters the spatial working memory of the mice compared to that of the mice having received only the injection of the mutated Ab25-35 peptide (negative control)
  • extract 2 extract 2: 78% vs Ab25-35: 64%).
  • plant Saussurea costus is essential in the composition of the extract to obtain optimal protection of the cognitive performance of intoxicated mice (at 250mg/kg, extract 2: 78% vs extract lb: 100%).
  • the plant extract AT000 and the plant extract lb induce a neuroprotective effect comparable to that of Donepezil when a daily dose of 250 mg/kg of one of these extracts is administered to poisoned mice according to the method treatment previously defined.
  • the administration in poisoned mice of a lower dose of the 1b extract (62.5 mg/kg versus 250 mg/kg) slightly reduces the efficacy of this extract on the deleterious effects of the Ab25-35 peptide, nevertheless this efficacy is of the same order of magnitude as that of extract 2 when the latter is administered at 250 mg.
  • the measurement of lipid peroxidation in the hippocampus of poisoned mice constitutes an index of the level of oxidative stress in this organ.
  • mice intoxicated with the Ab25-35 peptide show a significant increase in lipid peroxidation in the hippocampus (+50% compared to the negative control, Figure 3).
  • Memory impairment is the early hallmark of Alzheimer's disease and these results clearly show that the toxic effect of amyloid peptide Ab25-35 on behavioral and cognitive performance (including memory) is avoided or ameliorated by extracts la, lb and 2 of the invention obtained by decoction in an aqueous-alcoholic mixture.
  • Rat cortical neurons will be cultured as described by Callizot et al., 2013; 2020.
  • Female rats (Wistar) 15 days gestation will be killed using deep anesthesia with a C02 chamber and cervical dislocation. Briefly, the fetuses will be collected and immediately placed in ice-cold Leibovitz L15 medium with a solution of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10 mg/mL) at 2% (PS) and 1% albumin of bovine serum (BSA).
  • the cortex will be treated for 20 min at 37°C with a trypsin-EDTA solution at a final concentration of 0.05% trypsin and 0.02% EDTA.
  • Dissociation will be stopped by adding Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) with 4.5 g/L of glucose, containing DNAse I grade II (final concentration 0.5 mg/mL) and 10% of fetal bovine serum (FCS).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FCS fetal bovine serum
  • the cells will be mechanically dissociated by three forced passages through the end of a 10 ml pipette. The cells will then be centrifuged at 515 xg for 10 minutes at 4°C. The supernatant is removed and the pellet is resuspended in a culture medium composed of Neurobasal medium with a solution of 2% B27 supplement, 2 mmol/litre of L-glutamine, 2% PS solution and 10 ng/mL of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • Viable cells will be counted in a Neubauer cytometer, using the trypan blue exclusion test.
  • the cells will be seeded at a density of 25,000 per well in 96-well plates pre-coated with poly-L-lysine and will be cultured at 37°C in an air (95%) - C02 (5%) incubator.
  • the medium will be changed every 2 days.
  • the first and last columns as well as the first and last rows of the plate will not be used in the study. Empty wells will be filled with water.
  • composition according to the invention DHA, BDNF
  • glycerol a compound that will be dissolved in the culture medium (0.1% of glycerol maximum) and incubated for 1 hour before the lesion.
  • A31-42 On day 11 of culture, cortical neurons will be injured with A31-42 solution.
  • the preparation of A31-42 will be added at a final concentration of 15 mM (2 mM of oligomers, AbO) diluted in the control medium in the presence of the compounds, for 24 hours.
  • the cortical neurons will be fixed with a cold solution of ethanol (95%) and acetic acid (5%) for 5 min at -20°C.
  • the cells will be washed twice in PBS, then permeabilized. Non-specific sites will be blocked with a PBS solution containing 0.1% saponin and 1% FCS for 15 min at room temperature.
  • the cultures will be incubated with a polyclonal chicken anti-microtubule-associated protein 2 (MAP-2) antibody at a dilution of 1/1000 in PBS containing 1% fetal calf serum and 0.1% saponin (this antibody specifically stains cell bodies and neurites, allowing the study of neuronal cell death and the neurite network).
  • MAP-2 polyclonal chicken anti-microtubule-associated protein 2
  • This antibody will be revealed with a secondary antibody coupled to Alexa Fluor at a 1/400 dilution in PBS containing 1% FCS, 0.1% saponin, for 1 hour at room temperature.
  • the cell nuclei will be counterstained with a Hoechst solution (Sigma, 1/1000). Automatic analysis by computer
  • composition according to the invention has neuroprotective effects of 0.3 pg/mL to 7.5 pg/mL (plate 1).
  • DHA 50% extract
  • the tested form of the composition according to the invention is the glycerinated form which comprises methyl cinnamate.
  • the results suggest that the glycerinated liquid form of the composition according to the invention could be a good candidate for joint pain since it is known in the literature that methyl cinnamate has demonstrated potential anti-inflammatory activity with less cytotoxicity and good pro-inflammatory activity.

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Abstract

La présente invention concerne les domaines pharmaceutique et nutraceutique et, plus spécifiquement, une composition comprenant un extrait issu d'une combinaison de plantes pour la prévention et/ou le traitement d'une maladie neurodégénérative

Description

COMPOSITION PHARMACEUTIQUE ET NUTRACEUTIQUE COMPRENANT UN MÉLANGE DE PLANTES POUR LA PREVENTION ET LE TRAITEMENT DE MALADIES NEURODEGENERATIVES
Domaine de l'invention
La présente invention concerne les domaines pharmaceutique et nutraceutique et, plus spécifiquement, une composition comprenant comme ingrédient actif au moins un extrait issu d'une combinaison de plantes.
La composition selon l'invention est utilisée pour la prévention et/ou le traitement de maladies neurodégénératives, notamment la maladie d'Alzheimer.
Etat de l'art
La Maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative du tissu cérébral qui touche principalement les personnes âgées de plus de 65 ans. Outre l'âge, d'autres facteurs de risques ont été incriminés tels que les facteurs génétiques ou bien encore les facteurs environnementaux. Cette maladie se caractérise par un trouble dégénératif du système nerveux central associé à une perte importante de cellules neuronales spécifiques. Elle se manifeste cliniquement par une perte progressive de la mémoire, de la cognition, du raisonnement, du jugement et de la stabilité émotionnelle du patient qui conduit progressivement à une profonde détérioration mentale et finalement à sa mort.
Dès lors, la Maladie d'Alzheimer constitue un enjeu majeur de santé publique compte tenu du vieillissement progressif de la population et de l'absence de traitements curatifs à ce jour. Aux États-Unis, jusqu'à quatre millions de personnes souffrent de la maladie d'Alzheimer avec pas moins de 100000 décès par an.
Bien que le mécanisme et l'origine de la maladie d'Alzheimer ne soient pas encore pleinement élucidés, des scientifiques ont pu mettre en évidence deux marqueurs biologiques caractéristiques de celle-ci qui sont les plaques amyloïdes (ou plaques séniles) et une dégénérescence neurofibrillaire (ou enchevêtrements neurofibrillaires).
Dans le détail, les plaques amyloïdes sont constituées d'un peptide, appelé Ab, qui dérive d'une protéine précurseur nommée APP. Pour ce qui est de la dégénérescence neurofibrillaire, elle consiste en une accumulation, sous forme de fibres et à l'intérieur des neurones, d'une autre protéine, la protéine Tau, qui se trouve alors sous forme anormale.
En lien avec ces marqueurs, des études ont montré qu'il existe une corrélation entre les niveaux d’A solubles et l'étendue de la perte synaptique et de la gravité de la déficience cognitive chez les patients. Par conséquent, toute substance réduisant la neurotoxicité Ab peut être utile en tant que nouvel agent thérapeutique pour le traitement ou la prévention de la maladie d'Alzheimer.
Les seuls médicaments existants aujourd'hui pour traiter la maladie d'Alzheimer sont de deux types. On trouve tout d'abord les inhibiteurs d'acétylcholinestérase, tels que le donépézil, la galantamine, et le rivastigmine, et les antagonistes du récepteur NMDA tel que la mémantine. Toutefois, ces médicaments ne traitent que les symptômes de la maladie d'Alzheimer et permettent seulement de ralentir, de façon modeste, la progression de la maladie. De plus, la prise de ces médicaments est souvent accompagnée d'effets indésirables importants tels que des nausées, diarrhées et troubles hépatiques. Il existe donc un besoin urgent de développer de nouvelles alternatives.
Il a récemment été mis en évidence l'effet neuroprotecteur significatif de l'extrait AT000 chez des souris intoxiquées avec le peptide Ab25-35. Il a ainsi été démontré que l'administration de cet extrait atténue considérablement les effets délétères causés par ce peptide tels que le déficit d'apprentissage et le stress oxydatif (ISKANDAR et al., Chemistry of Advanced Materials, vol.3(2) ; p :36-59, 2018).
Cet extrait AT000 est issu de l'extraction d'un mélange équimassique de plantes constitué de Syzygium aromaticum, de Santalum album, d'Aquilaria malaccensis, de Boswellia carterii, de Cyperus rotundus, de Styrax benzoin, de Liquidambar orientalis, de Saussurea costus et de Dryobalanops aromatica.
Malgré, l'efficacité de cet extrait contre les effets délétères induits par le peptide Ab25-35, son utilisation semble compromise dans la mesure où la plante Dryobalanops aromatica n'est pas répertoriée dans la pharmacopée française.
Les inventeurs ont découvert de façon surprenante que la substitution de la plante Dryobalanops aromatica par la plante Cinnamomum camphora permettait l'obtention d'un extrait dont l'efficacité contre la toxicité du peptide Ab25-35 est similaire à celle de l'extrait AT000 tout en ayant une nouvelle composition reconnue alimentaire.
Résumé de l'invention
Les inventeurs ont identifié trois extraits possédant un effet protecteur contre la neurotoxicité des Ab à partir d'un plan d'expériences de formulation basé sur l'optimisation de l'activité antioxydante (test du DPPH, activité de piégeage des radicaux de l'extrait) de différentes formules à base de 9 plantes :
- L'extrait la et lb obtenu à partir d'un mélange de teneurs différentes de bourgeons de Syzygium aromaticum, de bois de cœur de Santalum album, de bois de cœur d'Aquilaria malaccensis, de résine de Boswellia carterii, de bourgeons de Cyperus rotundus, de résine de Styrax benzoin, de résine de Liquidambar orientalis, de feuilles de Cinnamomum camphora, et de racines de Saussurea costus;
- L'extrait 2 obtenu à partir d'un mélange de teneurs différentes de bourgeons de Syzygium aromaticum (clou de girofle), de bois de cœur de Santalum album, de bois de cœur d'Aquilaria malaccensis, de résine de Boswellia carterii, de bourgeons de Cyperus rotundus, de résine de Styrax benzoin, de résine de Liquidambar orientalis, et de feuilles de Cinnamomum camphora.
La présente invention concerne une composition comprenant l'extrait la, lb ou 2.
En conséquence, un premier objet de l'invention concerne une composition, qui peut être pharmaceutique ou nutraceutique, comprenant un extrait issu d'un mélange de plantes constitué de Syzygium aromaticum, de Santalum album, d'Aquilaria malaccensis, de Boswellia carterii, de Cyperus rotundus, de Styrax benzoin, de Liquidambar orientalis, de Cinnamomum camphora et de Saussurea costus.
Les inventeurs ont mis en évidence que ce dernier ingrédient (Saussurea costus) permettait de réduire significativement la dose efficace de l'extrait dans son ensemble.
Un autre objet de l'invention porte sur une composition telle que définie précédemment pour utilisation comme médicament.
Un autre objet porte sur une composition telle que définie précédemment pour utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une maladie neurodégénérative, de préférence la maladie d'Alzheimer, chez les mammifères, de préférence chez l'Homme.
Un autre objet de l'invention porte sur une huile alimentaire comprenant au moins 0,5% (en poids par rapport au poids total de l'huile) d'une composition telle que mentionnée précédemment, de préférence au moins 1% ou 2%.
Un dernier objet de l'invention porte sur une boisson fonctionnelle réalisée par dilution d'un macérat glycériné avec de l'eau suivant un ratio 1:10.
Brève description des Figures
Figure 1 : Effet de différents extraits et du donépézil (DPZ) sur un modèle murin de la mémoire spatiale de travail.
Figure 2 : Effet de différents extraits et du donépézil sur un modèle murin de la mémoire contextuelle à long-terme.
Figure 3 : Effet de différents extraits et du donépézil sur la peroxydation lipidique.
Figure 4 : Analyse UHPLC-DAD à 254 nm (a) de l'extrait lb issu d'une extraction par décoction d'un mélange de plantes dans un mélange hydroalcoolique ; (b) du macérat lb issu d'une extraction par macération d'un mélange de plantes dans 100% de glycérine ; (c) du macérat lb issu d'une extraction par macération d'un mélange de plantes dans un mélange équivolumique de glycérine / éthanol.
Figure 5 : Analyse UHPLC-DAD à 325 nm (a) de l'extrait lb issu d'une extraction par décoction d'un mélange de plantes dans un mélange hydroalcoolique ; (b) du macérat lb issu d'une extraction par macération d'un mélange de plantes dans 100% de glycérine ; (c) du macérat lb issu d'une extraction par macération d'un mélange de plantes dans un mélange équivolumique de glycérine / éthanol.
Figure 6 : Courbes de linéarité de l'acide benzoïque et de la vanilline
Figure 7 : Etude de la cinétique d'extraction : analyse UHPLC-DAD à 325 nm du macérat lb à différent temps T au cours de la macération dans 100 % de glycérine.
Figure 8 : Survie neuronale d'une culture primaire de neurones corticaux traités avec Ab 1-42 suivi de la composition selon l'invention.
Figure 9 : Réseau total de neurites dans une culture primaire de neurones corticaux traités avec Ab 1-42 suivi de la composition selon l'invention
Figure 10 : Survie neuronale d'une culture primaire de neurones corticaux traités avec Ab 1- 42 suivi de DHA.
Figure 11 : Réseau total de neurites dans une culture primaire de neurones corticaux traités avec Ab 1-42 suivi de DHA.
Description détaillée de l'invention
Les inventeurs ont maintenant développé une composition comprenant un extrait issu d'un mélange spécifique de plantes qui permet de protéger contre la neurotoxicité de I'Ab.
Le terme « extrait » fait référence à une substance extraite d'un produit naturel, indépendamment de sa méthode d'extraction ou de la composition des ingrédients. Par exemple, cela inclut celles obtenues par extraction d'ingrédients solubles à partir d'un produit naturel en utilisant l'eau, de la glycérine ou un solvant organique, ou celles obtenus par l'extraction d'ingrédients spécifiques uniquement, tels que l'huile (ex. huile d'olive). Les procédés d'extractions sont bien connus de l'homme de métier et consistent notamment en une décoction, une infusion ou une macération de parties de plantes (bourgeons, racines, feuilles...) broyés ou non, dans un solvant d'extraction approprié.
Selon un mode de réalisation préféré, l'extrait est obtenu par décoction au moyen d'un solvant sélectionné dans le groupe composé de l'eau, d'un alcool linéaire ou ramifié ayant 1 à 4 atomes de carbone, de l'acétate d'éthyle, du dichlorométhane, de l'acétone, de la glycérine et de leurs mélanges. Avantageusement, l'extrait est obtenu par décoction au moyen de la glycérine, d'un mélange hydroalcoolique ou d'un mélange hydroalcoolique glycériné, plus préférentiellement au moyen d'un mélange hydroalcoolique.
Selon un autre mode de réalisation préféré, l'extrait est obtenu par macération du mélange de plantes à température ambiante dans 100% de glycérine ou dans un mélange équivolumique de glycérine et d'éthanol, de préférence par macération dans 100% de glycérine. L'extrait ainsi obtenu est également appelé macérat.
Préférentiellement, la macération du mélange de plantes dans la glycérine est réalisée entre 30°C et 50°C, préférentiellement à 40°C, pendant 30 minutes à 5 heures, préférentiellement entre 1 et 4 heures, notamment 2 heures, préférentiellement dans 100% de glycérine ou dans un mélange équivolumique de glycérine et d'éthanol, de préférence par macération dans 100% de glycérine. L'extrait ainsi obtenu est également appelé macérat.
Avantageusement, l'extrait n'est pas un extrait sec, de préférence l'extrait est obtenu par macération dans la glycérine, plus préférentiellement l'extrait est obtenu par macération dans la glycérine végétale.
Par extrait sec, on entend un extrait solide obtenu après évaporation du solvant ayant servi à son extraction.
Par glycérine, on entend la glycérine d'origine végétale ou de la glycérine d'origine animale, de préférence de la glycérine d'origine végétale.
Par mélange hydroalcoolique, on entend un mélange d'eau et d'alcool, de préférence un mélange composé de 70% d'eau et 30% d'alcool.
Par mélange hydroalcoolique glycériné, on entend un mélange d'eau, d'alcool et de glycérine, de préférence un mélange composé de 35% d'eau, de 15% d'alcool et 50% de glycérine.
Par décoction on entend un procédé d'extraction dans lequel le mélange de plantes est mis en présence d'un solvant puis chauffé au point d'ébullition de celui-ci pendant plusieurs heures avant d'être filtré. Le filtrat ainsi obtenu constitue l'extrait du mélange de plante. Dans le cas d'un mélange de solvant, le point d'ébullition sera celui de l'azéotrope formé.
Par macération, on entend un procédé d'extraction dans lequel le mélange de plante est mis en présence d'un solvant à température ambiante pendant plusieurs heures avant d'être filtrée. Le filtrat ainsi obtenu constitue l'extrait du mélange de plante
Le Giroflier ou Girofle (Syzygium aromaticum) est une espèce de plantes de la famille des Myrtacées et du genre Syzygium. Les girofliers sont des arbres originaires d'Indonésie dont les boutons floraux forment une épice appelée clous de girofle. De préférence, le mélange de plantes utilise des bourgeons de Syzygium aromaticum. Dans le cas de figure où l'extrait ne comprend pas un mélange équimassique de plantes, le mélange présente une teneur comprise entre 25 et 55% (en poids par rapport au poids total du mélange de plante) en Syzygium aromaticum, de préférence entre 30 et 50%.
Le Santal blanc (Santalum album) est un arbre tropical de la famille des Santalacées et du genre Santalum. Cest la source la plus connue du bois de santal. Cette espèce est principalement originaire du sud de l'Inde au Sri Lanka, d'Australie et de l'archipel malais. De préférence, le mélange de plantes utilise du bois de Santalum album, et de manière particulièrement préférée du duramen (bois de cœur) de Santalum album.
Dans le cas de figure où l'extrait ne comprend pas un mélange équimassique de plantes, le mélange présente une teneur comprise entre 5 et 9% (en poids par rapport au poids total du mélange de plante) en Santalum album, de préférence entre 6 et 8%.
L'Aquilaria malaccensis, aussi connu sous le nom de bois d'aloès, bois d'aigle de Malacca ou bois d'agar, est un arbre de la forêt tropicale appartenant au genre Aquilaria et est de la famille des Thyméléacées. Cette espèce est principalement originaire du Bangladesh, du Bhutan, de l'Inde, de l'Indonésie, de l'Iran, de la Malaisie, du Myanmar, des Philippines, du Singapour et de la Thaïlande. L'Aquilaria malaccensis produit dans le duramen une résine particulière, odorante en réaction à certaines agressions physiques (blessures, feu) ou biologiques (attaques d'insectes xylophages, de bactéries et champignons). Cette résine est très utilisée en médecine traditionnelle et en parfumerie. De préférence, le mélange de plantes utilise du bois d'Aquilaria malaccensis et, de manière particulièrement préférée, du duramen (bois de cœur) d'Aquilaria malaccensis.
Dans le cas de figure où l'extrait ne comprend pas un mélange équimassique de plantes, le mélange présente une teneur comprise entre 15 et 30% (en poids par rapport au poids total du mélange de plante) en Aquilaria malaccensis, de préférence entre 18 et 24%.
L'arbre à encens Boswellia carterii appartient au genre Boswellia et à la famille des Burséracées. Cet arbre est principalement originaire du Yémen et de Somalie. La résine de cet arbre est l'une des plus anciennes résines parfumées et médicinales connues dans le monde entier. Elle a notamment été très utilisée dans la médecine traditionnelle Ayurvédique. De préférence, le mélange de plantes utilise de la résine de Boswellia carterii.
Dans le cas de figure où l'extrait ne comprend pas un mélange équimassique de plantes, le mélange présente une teneur comprise entre 5 et 9% (en poids par rapport au poids total du mélange de plante) en résine de Boswellia carterii, de préférence entre 6 et 8%.
Le souchet rond (Cyperus rotundus) est une espèce de plantes monocotylédones de la famille des Cypéracées. C'est une plante herbacée vivace à rhizomes et tubercules. Elle est également connue sous le nom de Souchet d'Asie, Souchet officinal, Herbe à oignon ou Souchet à tubercule. Originaire d'Inde, cette espèce s'est peu à peu développée de l'Afrique au sud de l'Europe jusqu'à s'étendre sur une grande partie de la planète. Les tubercules sont utilisés à des fins médicinales et alimentaires. De préférence, le mélange de plantes utilise des bourgeons de Cyperus rotundus.
Dans le cas de figure où l'extrait ne comprend pas un mélange équimassique de plantes, le mélange présente une teneur comprise entre 5 et 9% (en poids par rapport au poids total du mélange de plante) en bourgeons de Cyperus rotundus, de préférence entre 6 et 8%.
Le Styrax benzoin est une espèce d'arbre originaire du Sumatra, en Indonésie, du genre Styrax et appartenant à la famille des Styracacées. Cet arbre produit une résine balsamique (benjoin) dont l'odeur est légèrement vanillée. Cette résine est très utilisée en Asie tropicale pour son parfum et son action sur le bien-être. De préférence, le mélange de plantes utilise de la résine de Styrax benzoin.
Dans le cas de figure où l'extrait ne comprend pas un mélange équimassique de plantes, le mélange présente une teneur comprise entre 5 et 9% (en poids par rapport au poids total du mélange de plante) en résine de Styrax benzoin, de préférence entre 6 et 8%.
Le Liquidambar orientalis, aussi connu sous le nom de copalme d'Orient, est un arbre de la famille des Hamamélidacées (ou des Altingiacées selon la classification phylogénétique). C'est un arbre à feuille caduque du genre Liquidambar. Originaire de la région de la méditerranée orientale, cette espèce se produit principalement dans les plaines inondables du sud-ouest de la Turquie et sur l'île grecque de Rhodes. Sa résine est très utilisée comme encens ou en parfumerie. De préférence, le mélange de plantes utilise de la résine de Liquidambar orientalis.
Dans le cas de figure où l'extrait ne comprend pas un mélange équimassique de plantes, le mélange présente une teneur comprise entre 5 et 9% (en poids par rapport au poids total du mélange de plante) de résine de Liquidambar orientalis, de préférence entre 6 et 8%.
Le Camphrier, arbre à camphre, Bois de Shiu ou Laurier de Chine sont les divers noms du Cinnamomum camphora, une espèce d'arbres de la famille des Lauracées originaire de Chine, de Taïwan et du Japon, qui s'est naturalisée un peu partout sur les autres continents. Les feuillages et les jeunes rameaux sont distillés pour obtenir des huiles essentielles contenant du camphre. De préférence, le mélange de plantes utilise des feuilles de Cinnamomum camphora.
Dans le cas de figure où l'extrait ne comprend pas un mélange équimassique de plantes, le mélange présente une teneur comprise entre 5 et 9% (en poids par rapport au poids total du mélange de plante) de feuilles de Cinnamomum camphora, de préférence entre 6 et 8%.
Saussurea costus est une grande plante herbacée robuste et vivace de la famille des Astéracées. Originaire d'Asie (Himalaya, Cachemire, Inde, Pakistan), elle est souvent cultivée pour ses propriétés médicinales. De préférence, le mélange de plantes utilise des racines de Saussurea costus.
Dans le cas de figure où l'extrait ne comprend pas un mélange équimassique de plantes, le mélange présente une teneur comprise entre 5 et 9% (en poids par rapport au poids total du mélange de plante) de racines de Saussurea costus, de préférence entre 6 et 8%.
Typiquement la teneur en extrait dans la composition selon l'invention est comprise entre 0,1% et 90% en poids par rapport au poids total de la composition.
Cet intervalle est justifié par les formes qu'est susceptible de prendre la composition selon l'invention.
Ainsi, dans le cadre d'un sirop (concentré) ou d'une gélule ; la teneur en extrait dans la composition sera comprise entre 20% et 50% en poids par rapport au poids total de la composition.
Maintenant, dans le cadre d'une huile alimentaire ou d'une boisson fonctionnelle, la teneur en extrait dans la composition sera plutôt comprise entre 0,1% et 10% en poids par rapport au poids total de la composition, plus préférentiellement entre 0,5% et 5% en poids par rapport au poids total de la composition.
En tout état de cause, la composition peut permettre une administration journalière d'un extrait du mélange de plantes à partir de 62,5 mg chez la souris et à partir de 625 mg chez l'homme.
De manière préférée, la composition selon l'invention est caractérisée en ce que l'extrait est obtenu à partir d'un mélange de plantes qui présente :
-une teneur comprise entre 25 et 55% de Syzygium aromaticum,
-une teneur comprise entre 5 et 9% de Santalum album,
-une teneur comprise entre 15 et 30% d'Aquilaria malaccensis,
-une teneur comprise entre 5 et 9% de Boswellia carterii,
-une teneur comprise entre 5 et 9% de Cyperus rotundus,
-une teneur comprise entre 5 et 9% de Styrax benzoin,
-une teneur comprise entre 5 et 9% de Liquidambar orientalis,
-une teneur comprise entre 5 et 9% de Cinnamomum camphora ; et
-une teneur comprise entre 5 et 9% de Saussurea costus.
Le pourcentage de chaque plante utilisée dans l'extrait correspond au pourcentage en poids par rapport au poids total du mélange de plantes. La composition selon l'invention peut être sous forme d'extrait sec solide, de résine, d'émulsion ou sous forme liquide.
Plus spécifiquement, la composition selon l'invention peut être sous forme d'huile aromatisée, de sirop, de comprimés, de capsules, de poudre, de gélules, de sticks, de sachets, d'ampoules, de compte-gouttes ou sous forme injectable.
Selon un mode de réalisation particulier, la composition selon l'invention se présente sous forme d'une gélule, d'une huile ou d'une boisson fonctionnelle
De manière particulièrement préférée, la gélule est une gélule « végétale ».
Une telle gélule notamment végétale peut être réalisée simplement, notamment avec une enveloppe à base de cellulose (Hydroxypropylmethylcellulose, ou « HPMC », ou encore « Hypromellose ») ; à laquelle la cellulose peut être additionnée de colorant naturels, de sorte à obtenir l'enveloppe présentant les propriétés souhaitées.
Typiquement, la composition selon l'invention présente une proportion en Hydroxypropylmethylcellulose comprise entre 50 et 150 mg, par exemple entre 75 et 125 mg.
Pour ce qui est de la gélule en tant que telle, son poids est idéalement compris entre 0,25 et 0,75 gramme/gélule pour bénéficier d'une gélule facilement ingérable et, par ricochet, d'une bonne prise par le sujet.
Ladite enveloppe peut en outre également comprendre des agents opacifiants.
D'autres agents pharmaceutiquement et/ou alimentairement acceptables peuvent être rajoutés, tels que des agents antioxydants, des agents de charge, des fluidisants, des extraits naturels, des minéraux, des oligoéléments, des acides aminés, des acides gras, des anti- agglomérants, des huiles naturelles, des arômes, des colorants, des acidifiants, des épaississants, des conservateurs et des édulcorants.
A titre d'exemples d'agents antioxydants, on pourra citer, les polyphénols, notamment sous la forme d'extraits végétaux (extraits de thé vert, de raisin, ginseng), la vitamine C, notamment sous la forme d'extraits végétaux (extrait d'acérola, de grenade, d'agrumes), ou encore la vitamine E, notamment sous forme d'extraits végétaux ; ou leurs dérivés.
A titre d'exemples d'agents de charge, on pourra citer la cellulose microcristalline, la maltodextrine de pomme de terre ou encore le lactate de magnésium, de préférence la cellulose microcristalline.
A titre d'exemples de fluidisants, on pourra citer le silicate de magnésium, le stéarate de magnésium ou encore la silice colloïdale. A titre d'exemples de minéraux ou d'oligoéléments, on pourra citer le magnésium, l'iode, le fer, le cuivre, le zinc, le sélénium, le chrome, le molybdène, le manganèse, le silicium, le vanadium, le nickel ou encore l'étain.
A titre d'exemples d'acides aminés, on pourra citer l'alanine, la cystéine, l'acide aspartique, l'acide glutamique, la phénylalanine, la glycine, l'histidine, l'isoleucine, la lysine, la leucine, la méthionine, l'asparagine, la proline, la glutamine, l'arginine, la sérine, la thréonine, la valine, le tryptophane ou la tyrosine.
A titre d'exemples d'acide gras, on pourra citer les acides gras insaturés tels que les oméga-3 ou les oméga-6.
Avantageusement, la composition selon l'invention comprend au moins un acide gras appartenant à la famille des oméga-3.
De préférence, la composition selon l'invention comprend de l'acide docosahexaénoïque (DHA) qui est un acide gras insaturé appartenant à la famille des oméga-3
De manière préférée, la teneur en DHA dans la composition est ajustée de sorte à permettre une administration journalière de 250 mg qui constitue la dose conseillée.
A titre d'exemples d'anti-agglomérants utilisés usuellement dans l'industrie alimentaire, on pourra citer le stéarate de magnésium (E470b), le dioxyde de silicium (E551) et la silice colloïdale.
A titre d'exemple d'épaississant, on pourra citer l'amidon de pomme de terre, l'hydroxypropylméthylcellulose, la pectine de citrus, la gomme de guar, de caroube, l'agar-agar, le konjac, les huiles hydrogénées ou encore la cire d'abeille.
A titre d'exemple d'acidifiants, on pourra citer l'acide citrique.
A titre d'exemples d'édulcorants, on pourra citer, entre autres, le xylitol, l'aspartame, le sirop de glucose, le sirop de fructooligosaccharide, le maltitol en poudre ou en sirop, l'acésulfame de potassium, le fructooligosaccharide et le cyclamate de sodium.
A titre de colorants, on pourra citer les curcumines (E100), l'acide carminique (E120), l'érythrosine (E127), les chlorophylles et chlorophyllines (E140), les complexes cuivre- chlorophylles et chlorophyllines (E141), le caramel (E150), les caroténoïdes (E160), les anthocyanes (E163), le carbonate de calcium (E170), l'oxyde et hydroxyde de fer (E172) ou encore l'orcéine (E182).
A titre d'exemples de conservateurs, on pourra citer le sorbate de potassium, le benzoate de sodium ou le palmitate d'ascorbyle (antioxydant). Maintenant, tous ces composés ne sont nullement limitatifs des agents pharmaceutiquement et alimentairement acceptables pouvant être ajoutés à la composition selon l'invention et d'autres agents peuvent être envisagés.
Dans le cadre d'une application nutraceutique, la composition telle que définie précédemment peut être utilisée dans la fabrication d'une huile alimentaire et/ou d'une boisson fonctionnelle.
Aussi, selon un mode de réalisation particulier, la composition selon l'invention est une huile alimentaire (par exemple l'huile d'olive) ou une boisson fonctionnelle.
Dans ce cadre, la composition selon l'invention présente une teneur d'au moins 0,5% (en poids par rapport au poids total) d'une composition telle que définie précédemment, de préférence au moins 1% ou 2%.
Par huile alimentaire, on entend toute huile susceptible d'être utilisé dans l'alimentation à savoir l'huile d'olive, de sésame, de noix, de colza, de pépins de raisons, de tournesol ou encore leurs mélanges.
Par boisson fonctionnelle, on entend toutes boissons non alcoolisées qui permettent au consommateur outre de s'hydrater mais aussi d'améliorer son bien-être et sa santé, ou pouvant même réduire le risque de maladies. Il s'agit notamment des boissons pour sportifs, boissons énergisantes, boissons intelligentes, des cafés et thés prêts à boire (RTD), des eaux améliorées.
Dans le cadre de l'utilisation d'une composition telle que définie en tant que médicament, celle-ci est administrée dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Par «véhicule pharmaceutiquement acceptable», on entend tout véhicule qui n'interfère pas avec l'efficacité de l'activité biologique de la composition ou de l'extrait selon l'invention et qui n'est pas toxique pour l'hôte auquel la composition ou de l'extrait selon l'invention est administré.
En lien cette fois avec une telle composition pour prévenir et/ou traiter une maladie neurodégénérative chez un sujet, il s'agit de préférence d'un mammifère et, de manière particulièrement préférée d'un humain.
Concernant les maladies neurodégénératives, il s'agit avantageusement de la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington et la sclérose latérale amyotrophique.
Les exemples ci-après sont fournis pour illustrer les réalisations de l'invention et ne doivent pas être considérés comme limitant la portée de l'invention.
Exemple :
L'invention est illustrée par des exemples. Exemple 1
Une étude in vivo a été réalisée dans un modèle murin de la maladie d'Alzheimer, pour évaluer l'effet neuroprotecteur des extraits de plantes AT000, la, lb, et 2, obtenus par décoction dans un mélange hydroalcoolique, contre la toxicité induite par le peptide Ab25-35.
Matériels
Extraits de plantes A - Méthode d'extraction
(a) Extrait AT000 obtenu par décoction d'un mélange de plantes dans un milieu hydroalcoolique
Un total de 175 g d'un mélange équimassique préalablement broyé de bourgeons de Syzygium aromaticum, de duramen (bois de cœur) de Santalum album, de duramen (bois de cœur) d'Aquilaria malaccensis, de résine de Boswellia carterii, de bourgeons de Cyperus rotundus, de résine de Styrax benzoin, de résine de Liquidambar orientalis, de racines de Saussurea costus et de résine de Dryobalanops aromatica est extrait avec l'équivalent de 10 volumes d'un mélange eau/éthanol (70:30, v/v) à 80-85°C à l'aide d'un condenseur à reflux pendant 3 h. L'extrait est ensuite filtré sous vide en utilisant une fiole Büchner et est évaporé au moyen d'un évaporateur rotatif à 60 °C. Une résine est ainsi obtenue.
(b) Extrait la obtenu par décoction d'un mélange de plantes dans un milieu hydroalcoolique
Un total de 175 g d'un mélange équimassique préalablement broyé de bourgeons de Syzygium aromaticum, de duramen (bois de cœur) de Santalum album, de duramen (bois de cœur) d'Aquilaria malaccensis, de résine de Boswellia carterii, de bourgeons de Cyperus rotundus, de résine de Styrax benzoin, de résine de Liquidambar orientalis, de racines de Saussurea costus et de feuilles de Cinnamomum camphora est extrait avec l'équivalent de 10 volumes d'un mélange eau/éthanol (70:30, v/v) à 80-85°C à l'aide d'un condenseur à reflux pendant 3 h. L'extrait est ensuite filtré sous vide en utilisant une fiole Büchner et est évaporé au moyen d'un évaporateur rotatif à 60 °C. Une résine est ainsi obtenue.
(c) Extrait lb obtenu par décoction d'un mélange de plantes dans un milieu hydroalcoolique
L'extrait lb est obtenu selon un protocole identique à celui permettant l'obtention de l'extrait la à la différence que 5 équivalents de bourgeons de la plante Syzygium aromaticum et 3 équivalents de duramen (bois de cœur) de la plante Aquilaria malaccensis sont utilisés au lieu d'un équivalent. Les autres plantes sont utilisées comme précédemment à hauteur d'un équivalent. Une résine est ainsi obtenue.
(d) Extrait 2 obtenu par décoction d'un mélange de plantes dans un milieu hydroalcoolique L'extrait 2 est obtenu selon un protocole identique à celui permettant l'obtention de l'extrait lb (A-c) à la différence que le mélange de plante permettant l'obtention de l'extrait 2 ne contient pas de Saussurea costus. Une résine est ainsi obtenue.
(e) Extrait lb obtenu par macération d'un mélange de plantes dans 100% de glycérine végétale
Le macérat lb est obtenu par macération à partir de bourgeons de Syzygium aromaticum (5 équiv.), de duramen (bois de cœur) de Santalum album (1 équiv.), de duramen (bois de cœur) d'Aquilaria malaccensis (3 équiv.), de résine de Boswellia carterii (1 équiv.), de bourgeons de Cyperus rotundus (1 équiv.), de résine de Styrax benzoin (1 équiv.), de résine de Liquidambar orientalis (1 équiv.), de racines de Saussurea costus (1 équiv.) et de feuilles de Cinnamomum camphora (1 équiv.) dans 100% de glycérine végétale à température ambiante pendant 3 h à l'abri de la lumière. Le mélange est extrait avec l'équivalent en poids de 1 masse de plantes séchées et broyées pour 4 volumes de glycérine végétale (ratio 1:4). Le macérat est régulièrement mélangé. L'extrait est ensuite filtré sous vide en utilisant une fiole Büchner.
(f) Extrait lb obtenu par macération d'un mélange de plantes dans un mélange éthanol/glycérine
Le protocole est identique au point (A-e) excepté le solvant de macération qui est composé d'un mélange éthanol / glycérine végétale avec un ratio volumique de 50/50 et du même ratio massique plantes-solvant de 1:4.
B- Détermination du profil chimique des différents extraits lb
1 - Préparation de solutions témoins
Une solution mère a été préparée : 10,0 mg de témoin ont été placés dans une fiole jaugée de 10 mL. Après solubilisation dans environ 3 mL du méthanol à l'aide des ultrasons, la solution a été ajustée au trait du jauge avec du même solvant. Les dilutions ont été préparées à 100, 20, 10, 5 et 1 ue/mL. Chaque dilution a été filtrée un filtre 0,22 um avant d'être injectée. - Préparation des échantillons à analyser
(a) Extrait sec lb obtenu par décoction dans un milieu hydroalcoolique selon le protocole A-
(c)
5,1 mg d'extrait ont été solubilisés dans 2,55 mL d'EtOH à 30% (v/v) à l'aide des ultrasons pour obtenir une solution à une concentration finale de 2 mg/mL. 2 mL de cette solution ont été filtrés sur un filtre 0,22 pm avant d'être injectés.
(b) Extrait (ou macérat) lb obtenu par macération dans 100% de glycérine selon le protocole A-(e) L'extrait glycériné a été dilué au lOème avec du méthanol. 100 pL de l'extrait ont été mélangés avec 900 pL de méthanol à l'aide d'un vortex. 2 mL de cette solution ont été filtrés sur un filtre 0,22 miti avant d'être injectés.
(c) Extrait (ou macérat) lb obtenu par macération dans un mélange éthanol / glycérine selon le protocole A-(f)
L'extrait glycériné a été dilué au lOème avec de l'éthanol. 100 pL de l'extrait ont été mélangés avec 900 pL d'éthanol à l'aide d'un vortex. 2 mL de cette solution ont été filtrés sur un filtre 0,22 pm avant d'être injectés.
3 - Méthode d'analyse
Le profil chimique des différents extraits lb a été déterminé au moyen d'une analyse par chromatographie liquide ultra-haute performance équipée d'un détecteur UV à barrette de diodes et couplée à un spectromètre de masse. Une colonne Kinetex Polar C18 (150 x 4,6 mm ; 2,6 pm) est utilisée pour la séparation de composés. La phase mobile est constituée d'eau acidifiée à 0.1% (volume/volume) par acide formique comme le solvant A et d'acétonitrile acidifié à 0.1% (volume/volume) par acide formique comme le solvant B. Le gradient d'élution est suivant : 0-2 min 15% B, 2-14 min 15-100% B, 14-17 min 100% B, 17-17.01 min 100-15% B, 17.01-20 min 15% B. Le débit et le four à colonne sont réglés à 0,5 m L/min et 40 °C, respectivement.
L'analyse est effectuée à partir de 2 pL des échantillons à analyser.
4 - Résultats et discussion
(a) Analyse qualitative
Les chromatogrammes obtenus nous renseignent sur la diversité des molécules présentes dans l'extrait lb issu des différents types d'extraction A-(c), A-(e), A-(f).
Qualitativement, les trois extraits lb présentent un profile chromatographique similaire. A 254 nm, un pic additionnel correspondant au cinnamate de méthyle est néanmoins observé uniquement sur le chromatogramme de l'extrait lb issu d'une macération dans 100% de glycérine (A-(e)) (Figure 4 (b)).
Les inventeurs ont pu également identifier 5 autres composés communs à ces 3 extraits lb : l'isobiflorine, la biflorine, la vanilline, l'acide benzoïque et l'eugénol (Figure 4 (b)).
(b) Analyse quantitative de la vanilline et de l'acide benzoïque dans l'extrait lb issu des différents types d'extraction A-(c), A-(e), A-(f).
La détection de l'acide benzoïque et de la vanilline a été réalisée à leur longueur d'onde maximale d'absorption qui est respectivement 270 nm et 325 nm. En vue d'une quantification de la teneur de chaque composé dans l'extrait sec et de la concentration dans les extraits liquides, une courbe de calibration selon le modèle logl0(Y)=axlogl0(X)+b a été réalisée.
La courbe de calibration des deux standards sont linéaires (Figure 6) avec des coefficients de corrélation (R2) supérieur à 0,999. Les déviations de concentrations rétro -calculées sont inférieures à 5%.
A l'aide de l'équation de la droite de calibration de chaque standard, la concentration et la teneur en acide benzoïque et en vanilline présents dans l'extrait a été calculés.
Les résultats sont présentés dans le Tableau 1 ci-dessous [Tableau 1] Estimation quantitative de l'acide benzoïque et de la vanilline dans les différents extraits lb obtenus selon les protocoles A-(c), A-(e) et A-(f)
Figure imgf000016_0001
dans 1 mL de l'extrait liquide. (c) Etude de la cinétique d'extraction dans 100% de glycérine
Les macéras glycérinés prélevés à TO, Tlh, T2h, TBh, T4h, T5h, T6h et T24h ont été préparés selon la méthode de préparation décrite dans la partie B.2-(b) et sont analysés selon la méthode d'analyse décrite dans la partie B.3- Les résultats des profils chromatographiques à 325 nm des différents prélèvements sont présentés dans la Figure 7. Ces résultats indiquent que la concentration maximale en vanilline est atteinte au bout de 2h de macération.
Animaux
Des souris Suisse mâles, âgées de 6 semaines et pesant 30-35 g, provenant de JANVIER LABS sont utilisées tout au long de l'étude. Les souris sont logées en groupe avec un accès libre à la nourriture et à l'eau sauf pendant les expériences comportementales. Les souris sont maintenues dans une animalerie à température et humidité contrôlée, sous un cycle lumière/obscurité de 12h (lumière éteinte à 19h00). Les souris sont numérotées en marquant leur queue avec un marqueur permanent. Toutes les procédures animales sont réalisées dans le strict respect des directives de l'Union Européenne du 22 Septembre 2010 (2010/63/UE). 2. Méthode de Traitement a) Procédure d'administration du peptide Ab25-35 et du peptide Ab25-35 muté
Une préparation oligomérique homogène du peptide Ab25-35 et du peptide Ab25-35 muté (contrôle négatif) a été réalisée selon une procédure appartenant à AMYLGEN. Les préparations ont été dissoutes dans l'eau distillée stérile à une concentration de 3 mg/mL, puis conservées à -20°C jusqu'à utilisation. Avant l'injection, les peptides ont été agrégés par incubation à 37°C pendant 4 jours. Chaque souris est anesthésiée 5 min avec 2,5% d'isoflurane avant de recevoir, au moyen d'une seringue en acier inoxydable de calibre 26, une injection graduelle, d'une durée de 30 s, de 3 pL du peptide Ab25-35 (9 mmole/souris) ou du peptide Ab25-35 muté et inactif (9 mmole/souris) dans le ventricule latéral droit du cerveau selon une méthode déjà décrite. L'aiguille de la seringue est maintenue sur le site d'injection pendant une durée supplémentaire de 30 s avant d'être retirée.
À Jl, les souris ont reçu, à lOhOO, une seule injection intracérébroventriculaire de 3 pL (3 mg/mL) du peptide oligomérique Ab25-35 ou du peptide Ab25-35 muté (contrôle négatif) b) Procédure d'administration du Donépézil (référence) et des extraits de plantes AT000, la, lb et 2 obtenus par décoction dans un mélange hydroalcoolique.
Du Jour -14 (J-14) au Jour +10 (J 10), le véhicule (solution de 5% de DMSO dans l'eau), les extraits AT000, la, lb, ou 2 sont administrés aux souris deux fois par jour par gavage (per os), une fois à 9h00 et une fois à 17h00. Chaque extrait est solubilisé dans une solution aqueuse de DMSO à 5% et est fraîchement préparé juste avant chaque administration de gavage.
Le Donépézil (référence) est aussi administré par voie orale (1 mg/kg) mais seulement une fois par jour (9h00), de J-14 à J 10, après avoir été préalablement dissous dans l'eau.
Le volume de solution administré par souris est calculé en fonction du poids individuel de chaque souris (5 mL/kg).
À J 8, tous les animaux sont testés pour leur performance d'altération spontanée dans le labyrinthe en Y, un indice de la mémoire de travail spatiale
La mémoire non spatiale à long-terme des souris est évaluée au moyen d'une procédure d'évitement passif qui se déroule en deux temps. La 1ère partie du test a lieu à J9 et est une phase dite d'apprentissage. La 2ème partie a lieu à J10 et est une phase dite de rétention. c) Euthanasie des souris
À J 10, immédiatement après la session de rétention d'évitement passif, les souris sont décapitées. L'hippocampe et le cortex de chaque groupe de souris sont rapidement prélevés, pesés et conservés dans l'azote liquide jusqu'à l'analyse.
Animaux et groupes de traitement Soixante-dix-huit souris Suisse mâles de S0 à 35g sont utilisées pour cette étude et ont été réparties de façon aléatoire dans les groupes
Huit groupes de souris ont été constitués pour cette étude (Tableau 2) :
[Tableau 2]
Figure imgf000018_0001
* b.i.d. (bis in die): administration deux fois par jour
3. Déroulement des tests - Paramètres testés
Test de performance d'alternance spontanée dans un labyrinthe Y
À J8, toutes les souris sont testées pour les performances d'alternance spontanée dans le labyrinthe en Y, un indice de la mémoire de travail spatiale. Le labyrinthe en Y est en polychlorure de vinyle gris. Chaque bras mesure 40 cm de long, 13 cm de haut, 3 cm de large en bas, 10 cm de large en haut et converge à un angle égal.
Chaque souris est placée au bout d'un bras et est autorisée à se déplacer librement dans le labyrinthe pendant une session de 8 minutes.
Les séries d'entrées de bras, y compris les retours possibles dans le même bras, sont vérifiés visuellement.
Une alternance est définie comme des entrées dans les trois bras à des occasions consécutives. Le nombre d'alternances maximales est donc le nombre total d'entrée de bras moins deux et le pourcentage d'alternance est calculé de la façon suivante :
[(alternances réelles) /(alternance maximales)]xl00.
Les paramètres incluent le pourcentage d'alternance (indice de mémoire) et le nombre total d'entrées de bras (index d'exploration).
Les souris qui présentent un comportement extrême (pourcentage d'alternance <20% ou > 90% ou un nombre d'entrées de bras <10) sont exclus des calculs. En l'occurrence, aucun animal n'a été exclu ici. Les résultats sont présentés sur la Figure 1.
Test d'évitement passif
À J9 et J 10, toutes les souris ont été testées dans la tâche d'évitement passif progressive. Ce test permet d'évaluer la mémoire non spatiale à long terme.
L'appareil du test consiste en une boîte à deux compartiments (15 x 20 x 15 cm de hauteur) dont l'un est éclairé par des parois blanches en polychlorure de vinyle et l'autre obscurci par des parois noires en polychlorure de vinyle et disposant d'une grille au sol. Une porte guillotine sépare les deux compartiments. Une lampe de 60 W positionnée à 40 cm au-dessus de l'appareil illumine le compartiment blanc pendant l'expérience. Au niveau de la grille, les chocs électriques aléatoires de 0,3 mA sont délivrés aux pattes pendant 3 secondes grâce à un générateur électrique aléatoire (Lafayette Instruments, Lafayette, USA).
La 1ère phase de l'expérience, appelée apprentissage ou entrainement, a lieu à J10. La porte guillotine est initialement fermée pendant la séance d'entraînement. Chaque souris est placée dans le compartiment blanc. Après 5 secondes, la porte se soulève. Lorsque la souris entre dans le compartiment sombre et pose toutes ses pattes sur la grille, la porte se ferme et le choc électrique aléatoire est délivré aux pattes pendant 3 secondes. Le temps de latence avant l'entrée dans le compartiment sombre et le nombre de vocalisations sont enregistrés. Le nombre de vocalisations ne diffère pas entre les groupes indiquant que tous les animaux ont également reçu le choc électrique Les animaux pour lesquels le temps de latence pendant la session d'entrainement est inférieur à 10 secondes sont écartés de l'expérience.
La 2ème phase de l'expérience, appelée rétention, est effectuée 24h après la 1ère phase. Chaque souris est replacée dans le compartiment blanc. La porte séparant les deux compartiments est levée après 5 secondes. Le temps de latence d'entrée dans le compartiment sombre est enregistré pendant une durée de 300 secondes. Le nombre d'entrées et le temps d'échappement, c'est-à-dire le temps passé pour retourner dans le compartiment blanc, sont mesurés pendant 300 secondes. Les animaux qui présentent des temps de latences pendant la session de rétention inférieurs à 10 secondes sont écartés de l'expérience. Les résultats sont présentés sur la Figure 2.
Test de stress oxydatif - Mesure de la peroxydation des lipides
Six hémi-hippocampes de chaque groupe de souris sont décongelés pour analyse. Les hippocampes sont ensuite homogénéisés dans du méthanol froid (1/10 p / v), centrifugés à 1000 g pendant 5 min et le surnageant est placé dans des tubes EPPENDORF. Le volume réactionnel de chaque homogénat est ajouté à une solution comprenant du FeS04 1 mM, H2S04 0,25 M, xylénol orange 1 mM et est incubé pendant 30 min à température ambiante. Après lecture de l'absorbance à 580 nm (A580 1), 10 mI d'hydro peroxyde de cumène à 1 mM (CHP) sont ajoutés à l'échantillon avant d'être incubé pendant 30 min à température ambiante, pour déterminer le niveau d'oxydation maximal. L'absorbance est mesurée à 580 nm (A5802).
Le niveau de peroxydation lipidique est déterminé en équivalents de CHP selon l'équation suivante :
CHPE = A580 1 / A580 2 x [CHP(nmol)]
Et est exprimé en équivalents CHP par poids de tissu et en pourcentage des données du groupe témoin.
Les résultats sont présentés sur la Figure 3.
4. Résultats et Discussion
2.1 Performances d'alternance spontanée
La mémoire de travail spatiale est évaluée au moyen d'un test d'alternance spontanée dans le labyrinthe en Y.
Comme le montre la Figure 1, l'injection du peptide Ab25-35 altère de manière très significative la mémoire de travail spatiale des souris en comparaison à celle des souris ayant reçues seulement l'injection du peptide Ab25-35 muté (contrôle négatif)
Cet effet délétère est évité de manière significative par l'administration journalière de lmg/kg de Donépézil (DPZ) selon la méthode décrite précédemment Les résultats montrent également que les extraits de plantes AT000 et lb induisent un effet neuroprotecteur comparable à celui du Donépézil lorsqu'une dose journalière de 250 mg/kg de l'un de ces extraits est administrée aux souris intoxiquées comme décrit dans la méthode de traitement définie précédemment. L'administration chez les souris intoxiquées d'une dose plus faible de l'extrait lb (62.5 mg/kg versus 250 mg/kg) induit une diminution significative, mais moindre (22%) du comportement d'alternance spontané.
Les résultats montrent en outre que l'extrait la contrecarre quasiment le déficit de mémoire de travail spatiale induit par l'injection du peptide Ab25-35. En effet, cet extrait permet une protection quasi-complète (93%) des performances cognitives des souris intoxiquées.
Finalement, seulement une légère amélioration dans les performances est observée avec l'extrait 2 (extrait 2 : 78% vs Ab25-35 : 64%). Toutefois, il semblerait que la plante Saussurea costus soit indispensable dans la composition de l'extrait pour obtenir une protection optimale des performances cognitives des souris intoxiquées (à 250mg/kg, extrait 2 : 78% vs extrait lb : 100%).
2.2Test d'évitement passif progressif
La mémoire contextuelle à long-terme a été évaluée au moyen d'un test d'évitement passif.
Les résultats montrent que le peptide Ab25-35 produit une diminution significative de la performance de la mémoire chez les souris intoxiquées comme l'indiquent les figures 2a et 2b en comparaison du contrôle négatif.
Cet effet délétère est évité de manière significative par l'administration journalière de 1 mg/kg de Donépézil (DPZ) selon la méthode décrite précédemment.
On observe que l'extrait de plante AT000 et l'extrait de plante lb induisent un effet neuroprotecteur comparable à celui du Donépézil lorsqu'une dose journalière de 250 mg/kg de l'un de ces extraits est administrée aux souris intoxiquées selon la méthode de traitement définie précédemment. Maintenant, l'administration chez les souris intoxiquées d'une dose plus faible de l'extrait lb (62.5 mg/kg versus 250 mg/kg) réduit légèrement l'efficacité de cet extrait sur les effets délétères du peptide Ab25-35 , néanmoins cette efficacité est du même ordre de grandeur que celle de l'extrait 2 lorsque celui-ci est administré à 250 mg.
On observe également que l'extrait la atténue fortement les déficits de mémoire contextuelle à long-terme induits par le peptide Ab25-35.
Finalement, l'administration de l'extrait 2 permet une légère amélioration du comportement des souris intoxiquées au peptide Ab25-35. A noter que les différences des temps de latence d'entrée et de sortie observés entre les extraits lb et 2 soulignent une fois encore l'importance de la plante Saussurea costus dans le mélange de plantes permettant l'obtention de l'extrait ayant les meilleures performances. 2.3 Mesure de la peroxydation lipidique
La mesure de la peroxydation lipidique de l'hippocampe des souris intoxiquées constitue un indice du niveau de stress oxydatif dans cet organe.
Les résultats montrent que les souris intoxiquées au peptide Ab25-35 présentent une augmentation significative de la peroxydation lipidique dans l'hippocampe (+50% comparé au contrôle négatif, Figure 3).
Maintenant, on observe que ce stress oxydatif est complètement évité par les extraits AT000, la ou lb lorsqu'ils sont administrés à une dose journalière de 250 mg/kg comme définie précédemment dans la méthode de traitement. Ces extraits présentent un effet neuroprotecteur contre la toxicité du peptide Ab25-35 comparable à celle du Donépézil (contrôle positif), lorsque celui-ci est administré à une dose journalière de 1 mg/kg comme décrit dans la méthode de traitement précédemment définie.
A noter que le traitement des souris intoxiquées avec une dose journalière de l'extrait lb plus faible (62.5mg/kg vs 250 mg/kg) montre une hausse de 20% de la peroxydation lipidique par rapport au contrôle négatif.
Concernant l'extrait 2, les résultats montrent qu'il atténué légèrement le stress oxydatif : une hausse de 30% de la peroxydation lipidique est observée contre 50% chez les souris intoxiquées au peptide Ab25-35 et non traitées. Ce résultat souligne à nouveau l'importance de la plante Saussurea costus dans la composition de l'extrait pour obtenir une protection optimale des performances cognitives des souris intoxiquées au peptide Ab25-35.
Conclusion
L'altération de la mémoire est la caractéristique précoce de la maladie d'Alzheimer et ces résultats montrent clairement que l'effet toxique du peptide amyloïde Ab25-35 sur les performances comportementales et cognitives (y compris la mémoire) est évité ou atténué par les extraits la, lb et 2 de l'invention obtenu par décoction dans un mélange hydroalcoolique.
Exemple 2 :
MÉTHODES ET CONCEPTION EXPÉRIMENTALE
Toutes les expériences seront réalisées conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animais du National Research Council (US) et suivront les réglementations actuelles de l'Union européenne (directive 2010/63/EU). Numéro d'accord : B1301310.
Culture primaire de neurones corticaux Les neurones corticaux de rat seront cultivés comme décrit par Callizot et al., 2013 ; 2020. Les rats femelles (Wistar) de 15 jours de gestation seront tuées en utilisant une anesthésie profonde avec une chambre à C02 et une dislocation cervicale. Brièvement, les fœtus seront collectés et immédiatement placés dans du milieu de Leibovitz L15 glacé avec une solution de pénicilline (10 000 U/mL) et de streptomycine (10 mg/mL) à 2% (PS) et 1% d'albumine de sérum bovin (BSA). Le cortex sera traité pendant 20 min à 37°C avec une solution de trypsine- EDTA à une concentration finale de 0,05% de trypsine et 0,02% d'EDTA. La dissociation sera arrêtée par l'ajout de milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 4,5 g/L de glucose, contenant de la DNAse I grade II (concentration finale 0,5 mg/mL) et 10% de sérum de veau fœtal (FCS). Les cellules seront dissociées mécaniquement par trois passages forcés à travers l'extrémité d'une pipette de 10 ml. Les cellules seront ensuite centrifugées à 515 x g pendant 10 minutes à 4°C. Le surnageant est éliminé et le culot est remis en suspension dans un milieu de culture composé de milieu Neurobasal avec une solution de 2% de supplément B27, 2 mmol/litre de L-glutamine, 2% de solution PS et 10 ng/mL de facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF). Les cellules viables seront comptées dans un cytomètre Neubauer, en utilisant le test d'exclusion au bleu trypan. Les cellules seront ensemencées à une densité de 25 000 par puits dans des plaques à 96 puits pré-revêtues de poly-L-lysine et seront cultivées à 37°C dans un incubateur air (95 %) - C02 (5 %). Le milieu sera changé tous les 2 jours.
Pour éviter l'effet de bord, les premières et dernières colonnes ainsi que les premières et dernières lignes de la plaque ne seront pas utilisées dans l'étude. Les puits vides seront remplis d'eau.
Application des composés testés et lésion chronique avec Ab1-42
Véhicule : Milieu de culture (jusqu'à 0,1 % de glycérol).
Pré-traitement : Au jour 11 de la culture, les composés testés (Composition selon l'invention, DHA, BDNF) seront dissous dans le milieu de culture (0,1% de glycérol maximum) et incubés pendant 1 heure avant la lésion.
Lésion : La préparation de GAbI-42 se fera selon la procédure décrite par Callizot et al, 2020. Brièvement, le peptide Ab1-42 (Bachem, 1071428) sera dissous dans le milieu de culture défini mentionné ci-dessus, à une concentration initiale de 20 mM. Cette solution sera doucement agitée pendant 3 jours à 37 °C dans l'obscurité et immédiatement utilisée après avoir été correctement diluée dans le milieu de culture aux concentrations utilisées (15 mM, 2 mM d'oligomères).
Au jour 11 de la culture, les neurones corticaux seront blessés avec une solution d'A31-42. La préparation d'A31-42 sera ajoutée à une concentration finale de 15 mM (2 mM d'oligomères, AbO) diluée dans le milieu de contrôle en présence des composés, pendant 24 heures.
ORGANISATION DES PLAQUES DE CULTURE Les composés testés seront testés sur deux cultures dans des plaques de 96 puits (n = 6 puits de culture par condition).
Efficacité de la composition selon l'invention et du DHA [Tableau 31
Figure imgf000024_0001
ÉVALUATION DU POINT FINAL Immunomarquage : MAP2 et AT100
24 heures après la blessure, les neurones corticaux seront fixés par une solution froide d'éthanol (95 %) et d'acide acétique (5 %) pendant 5 min à -20 °C. Les cellules seront lavées deux fois dans du PBS, puis perméabilisées. Les sites non spécifiques seront bloqués avec une solution de PBS contenant 0,1% de saponine et 1% de FCS pendant 15 min à température ambiante. Les cultures seront incubées avec un anticorps polyclonal de poulet anti-protéine associée aux microtubules 2 (MAP-2) à une dilution de 1/1000 dans du PBS contenant 1% de sérum de veau foetal et 0,1% de saponine (cet anticorps colore spécifiquement les corps cellulaires et les neurites, permettant l'étude de la mort cellulaire neuronale et du réseau de neurites).
Cet anticorps sera révélé avec un anticorps secondaire couplé à Alexa Fluor à la dilution 1/400 dans du PBS contenant 1 % de FCS, 0,1 % de saponine, pendant 1 heure à température ambiante. Les noyaux cellulaires seront contre-colorés avec une solution de Hoechst (Sigma, 1/1000). Analyse automatique par ordinateur
Pour chaque condition, 30 images (représentatives de toute la surface du puits) par puits seront automatiquement prises en utilisant ImageXpress (Molecular Devices) avec un grossissement de 20x. Toutes les images sont générées par ImageXpress® en utilisant les mêmes paramètres d'acquisition. A partir des images, les analyses seront directement et automatiquement réalisées par MetaXpress® (Molecular Devices).
Les lectures suivantes seront étudiées :
- La survie totale des neurones (neurones MAP-2 positifs, nombre),
- Le réseau total de neurites (MAP-2 en pm), ANALYSE STATISTIQUE
Toutes les valeurs sont exprimées en moyenne +/- SEM (erreur standard de la moyenne). L'analyse statistique sera effectuée par ANOVA à sens unique, suivie d'un test LSD de Dunnett ou de Fisher. p<0,05 sera considéré comme significatif.
CONCLUSION Les résultats indiquent que la composition selon l'invention a des effets neuroprotecteurs de 0.3 pg/mL à 7.5 pg/mL (plaque 1). Le DHA (extrait à 40%) a eu un effet neuroprotecteur plus modeste, à 0.1 et 0.3 pM (plaque 2).
La forme testée de la composition selon l'invention est la forme glycérinée qui comporte le cinnamate de méthyle. Les résultats suggèrent que la forme liquide glycérinée de la composition selon l'invention pourrait être un bon candidat pour les douleurs articulaires car il est connu dans la littérature que le méthyl cinnamate a démontré une activité anti-inflammatoire potentielle avec moins de cytotoxicité et une bonne activité pro-inflammatoire.

Claims

REVENDICATIONS
[Revendication 1] Composition comprenant un extrait issu d'un mélange de plantes constitué de Syzygium aromaticum, de Santalum album, d'Aquilaria malaccensis, de Boswellia carterii, de Cyperus rotundus, de Styrax benzoin, de Liquidambar orientalis, de Cinnamomum camphora et de Saussurea costus.
[Revendication 2] Composition selon la revendication 1, dans laquelle le mélange de plantes est un mélange équimassique de plantes.
[Revendication 3] Ccomposition selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'extrait est obtenu à partir d'un mélange de plantes qui présente :
- une teneur comprise entre 25 et 55% de Syzygium aromaticum,
- une teneur comprise entre 5 et 9% de Santalum album,
- une teneur comprise entre 15 et 30% d'Aquilaria malaccensis,
- une teneur comprise entre 5 et 9% de Boswellia carterii,
- une teneur comprise entre 5 et 9% de Cyperus rotundus,
- une teneur comprise entre 5 et 9% de Styrax benzoin,
- une teneur comprise entre 5 et 9% de Liquidambar orientalis,
- une teneur comprise entre 5 et 9% de Cinnamomum camphora ;et
- une teneur comprise entre 5 et 9% de Saussurea costus.
[Revendication 4] Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'extrait n'est pas un extrait sec, de préférence l'extrait est obtenu par macération dans la glycérine, plus préférentiellement l'extrait est obtenu par macération dans la glycérine végétale.
[Revendication s] Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'extrait est issu d'un mélange de bourgeons de Syzygium aromaticum, de bois de cœur de Santalum album, de bois de cœur d'Aquilaria malaccensis, de résine de Boswellia carterii, de bourgeons de Cyperus rotundus, de résine de Styrax benzoin, de résine de Liquidambar orientalis, de feuilles de Cinnamomum camphora et, de racines de Saussurea costus.
[Revendication 6] Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre de l'acide docosahexaénoïque (DHA).
[Revendication 7] Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme d'une gélule, d'une huile ou d'une boisson fonctionnelle Tl
[Revendication 8] Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes pour utilisation comme médicament.
[Revendication 9] Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour utilisation dans le traitement et/ou prévention d'une maladie neurodégénérative chez les mammifères, de préférence chez l'Homme.
[Revendication 10] Composition selon la revendication 9 caractérisée en ce que la maladie neurodégénérative est la maladie d'Alzheimer.
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