WO2022196186A1 - 閉鎖系の自動試料分取システム - Google Patents

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WO2022196186A1
WO2022196186A1 PCT/JP2022/004858 JP2022004858W WO2022196186A1 WO 2022196186 A1 WO2022196186 A1 WO 2022196186A1 JP 2022004858 W JP2022004858 W JP 2022004858W WO 2022196186 A1 WO2022196186 A1 WO 2022196186A1
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bioparticles
filter module
reagent
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義人 林
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ソニーグループ株式会社
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    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
    • G01N2001/4088—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids filtration
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    • G01N2035/00465—Separating and mixing arrangements
    • G01N2035/00475—Filters

Definitions

  • This technology relates to a closed automatic sample collection system and a sample collection device.
  • CSC cell sorter
  • the pretreatment red blood cell and platelet removal, staining with fluorescent-labeled antibodies, washing, concentration adjustment, etc.
  • the pretreatment before inputting the collected sample to the CSC currently requires a great deal of labor and cost.
  • devices that can perform individual steps included in such pretreatment in a closed system all steps cannot be performed in one go. It is necessary to handle samples and reagents inside the laboratory.
  • this technology provides an automated sample collection system that makes it possible to perform multiple steps of CSC pretreatment in an aseptic closed circuit.
  • the present technology includes a storage unit that stores a sample to be fractionated, a fractionation unit that fractionates a target biological sample from the sample to be fractionated, and a storage unit that stores the target biological sample,
  • a sample fractionating system further comprising a first liquid storage section in which a storage section, a fractionation section, and a storage section are hermetically connected through a flow channel, and which contains a liquid to be circulated in the flow channel.
  • the collection unit includes a first filter module for separating a mixture of solids smaller than the target bioparticles from a mixture containing the target bioparticles, a second filter module for separating a mixture of solids from a mixture containing target bioparticles; a first reagent reservoir containing a reagent for labeling target bioparticles or other particles; a chamber for temporarily holding a sample, particle, reagent, liquid or mixture thereof therein.
  • the first filter module removes a mixture of solids having a size smaller than the target bioparticles from the sample to be fractionated that flows from the storage unit.
  • the label may be a bead
  • the reagent for labeling the particle may be a reagent for binding the bead to the target bioparticle or other particle.
  • the sample to be sorted that flows from the storage unit is: (a) smaller than the target bioparticles by the first filter module; (b) removal of a mixture of solids having a size larger than the target bioparticle by a second filter module; (c1) flow from the first reagent reservoir in the chamber; After binding the beads to the target bioparticles by the reaction between the reagent and the sample to be fractionated, the sample to be fractionated is passed through the second filter module to obtain a mixture of solids larger in size than the target bioparticles.
  • the sample to be fractionated is passed through the second filter module, and the particles bound to the beads are removed as a mixture of solids larger than the target bioparticles.
  • a combination of a), (b) and (c1), a combination of (a), (b) and (c2), or a combination of (a) and (c2) are performed.
  • beads from the target biological particles is removed.
  • the collection unit includes a first reagent storage unit containing a reagent for binding beads to target bioparticles and a bead to particles other than target bioparticles. and another reagent storage unit containing a reagent for binding to, and in this fractionation unit, (a) the first filter (b) removal of a mixture of solids with a size smaller than the target bioparticles by a module; (b) removal of a mixture of solids with a size larger than the target bioparticles with a second filter module; After binding the beads to the target bioparticles by the reaction between the reagent flowing from the reagent storage part and the sample to be fractionated, the sample to be fractionated is passed through the second filter module, and the target bioparticles (c2) a process of sorting the target bioparticles bound to the beads as a mixture of solids having a size larger than the target by reacting the sample to be sorted with the reagent flowing from other rea
  • the first filter module and the second filter module are microchannels that distribute solids in the sample introduced from the inlet to two different outlets according to the size of the solids. can do.
  • the sample sorting system further includes a labeling unit that labels the sample to be sorted with a fluorescent dye, and the labeling unit is hermetically connected to at least one of the storage unit and the sorting unit. good too. Further, the concentration of target bioparticles may be adjusted in the sample collection system. Furthermore, in the sample sorting system, a liquid may be introduced from a first liquid storage unit into the storage unit, and the liquid may be mixed with the sample to be sorted.
  • the present technology includes a storage unit that stores a sample to be fractionated, a fractionation unit that fractionates a target biological sample from the sample to be fractionated, and a storage unit that stores the target biological sample, and the storage unit , the above-described sample sorting system in which the sorting unit and the storage unit are hermetically connected; a light irradiation unit that irradiates the sample to be sorted with excitation light; and a light detector that detects fluorescence emitted from the sample to be sorted. and an arithmetic processor that calculates fractionation information based on the detection result of the photodetector.
  • the sample sorting device may be a cell sorter hermetically connected to the sample sorting system described above, and the cell sorter is preferably a closed cell sorter, more preferably a closed cell therapy cell sorter. Furthermore, the sample sorting device may further include a culture section for adjusting the temperature of the storage section. In addition, the sample sorting apparatus may further include a drug injection management section for controlling drug injection into the storage section.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration example of a sample collection system according to the present technology.
  • FIG. 2 is a flowchart showing a specific example of sample fractionation including negative selection using the sample fractionation system according to the present technology.
  • FIG. 3 is a flowchart showing a specific example of sample fractionation including positive selection using the sample fractionation system according to the present technology.
  • the sample sorting system of the present technology includes a storage section that stores a sample to be sorted and a sorting section that sorts a target biological sample from the sample to be sorted. and a storage part in which the target biological sample is stored, wherein the storage part, the sorting part, and the storage part are hermetically connected through a flow path, and contain a liquid to be circulated in the flow path. It further comprises one liquid container.
  • the sorting unit includes a first filter module that separates a mixture of solids having a size smaller than the target bioparticles from a mixture containing the target bioparticles, and a mixture of solids having a size larger than the target bioparticles and the target.
  • a second filter module that separates a mixture containing bioparticles, a first reagent container that contains a reagent for labeling target bioparticles or other particles, and a sample, particles, and reagents in the channel , a chamber for temporarily holding liquids or mixtures thereof.
  • the first filter module and the second filter module are sequentially used, and among the solids contained in the sample to be fractionated, the solids smaller in size than the target bioparticles, Remove as much solid material as possible that is larger than the target bioparticle. Furthermore, in the sample collection system of the present technology, the target bioparticles and the other particles are separated by labeling either the target bioparticles or other particles with a labeling reagent. Thereby, the concentration of the target bioparticles in the sample to be fractionated can be increased, that is, the target bioparticles can be concentrated.
  • the sample fractionation system 1 shown in FIG. A first reagent storage section 30 containing a reagent for labeling particles, a chamber 50 for temporarily holding a sample, particles, reagents, liquids, or a mixture thereof in the channel, and flowing in the channel It has a first liquid storage section 40 and a storage section 60 that contain a liquid that causes the liquid to flow.
  • the sample collection system of the present technology may include a plurality of liquid storage units and reagent storage units, and the sample collection system 1 shown in FIG. A portion 31 and a third reagent storage portion 32 are provided.
  • the sample collection system 1 shown in FIG. 1 comprises a concentration sensor 80 for sensing the concentration of target bioparticles and a waste section 70 for containing waste.
  • the fractionation target sample storage unit 10 stores the fractionation target sample.
  • the sample to be sorted is not particularly limited as long as it contains the target bioparticles to be sorted.
  • the sample collection system of the present technology is particularly advantageous when the target bioparticles are cells, as the multiple steps for sample collection can all be performed in a sterile closed circuit.
  • Cells can include animal cells (blood lineage cells, etc.) and plant cells.
  • the cells may in particular be blood lineage cells or tissue lineage cells.
  • the blood lineage cells can include, for example, white blood cells (eg, peripheral blood mononuclear cells), red blood cells, and platelets, and the blood lineage cells particularly include white blood cells.
  • Leukocytes can include, for example, monocytes (macrophages), lymphocytes, neutrophils, basophils, and eosinophils.
  • Cells may be, for example, suspension cells such as T cells and B cells.
  • the tissue cells may be, for example, adherent cultured cells or adherent cells dissociated from a tissue. Alternatively, the cells may be tumor cells.
  • the cells may be cultured or non-cultured.
  • Cells to be targeted bioparticles may be, for example, cells for therapeutic use or blood cells such as white blood cells.
  • the samples to be fractionated are blood-derived samples, and examples thereof include thawed frozen apheresis, fresh apheresis (unfrozen), and whole blood samples.
  • the sample to be sorted contains (or possibly contains) nucleic acids, such as when the sample to be sorted contains frozen cells, it is possible to degrade the nucleic acids by mixing the sample to be sorted with a nucleic acid-degrading substance. desirable.
  • Such mixing of the nucleic acid degrading substances can be carried out by storing the nucleic acid degrading substances in the second reagent container 31 in advance and allowing the nucleic acid decomposing substances to flow from there to the container 10 .
  • the nucleic acid degrading substance may flow from the second reagent storage portion 31 to the entire channel. This prevents aggregation of solids in the sample to be fractionated, and thus prevents clogging of the channel and the filter module.
  • nucleolytic enzymes can be preferably used, and examples of nucleolytic enzymes include deoxyribonucleases (DNase I, etc.), ribonucleases, and mixtures thereof.
  • DNase I deoxyribonucleases
  • ribonucleases ribonucleases
  • mixtures thereof examples include deoxyribonucleases (DNase I, etc.), ribonucleases, and mixtures thereof.
  • the liquid contained in the first liquid containing part 40 serves as a carrier for the sample to be sorted and containing the target bioparticles, and is therefore a liquid that does not have any harmful effect on the target bioparticles.
  • a buffer buffer solution
  • buffers include PBS+ (ordinary phosphate buffered saline), PBS- (PBS+ without magnesium and calcium), Physiological saline, medium, Ringer's solution and the like can be mentioned.
  • PBS- can be used by adding magnesium ions at a physiological concentration, or at an amount equivalent to or twice that of PBS+.
  • the calcium ions contained in PBS+ affect the cell viability and the like. Divalent ions necessary for enzymatic activity can be replenished while avoiding exerting . Albumin, antibiotics, physiological concentrations of glucose, etc. may also be added to these buffers.
  • liquids washing liquids
  • a cleaning liquid hyperochlorous acid solution, surfactant solution, etc.
  • This washing liquid can optionally be passed through some or all of the elements and flow paths included in the sample collection system 1 and then sent to waste.
  • this washing liquid is suitable for washing the storage section 10 after the sample to be separated has been removed, and the first filter module 20 and the second filter module 21 after the sample to be separated has flowed.
  • the liquid from the first liquid storage unit 40 is allowed to flow through the part touched by the washing liquid. should be removed.
  • the filter module used in the present technology may be any one that can sort particles present in the liquid into two outlets according to the size of the particles, and its specific structure. is not particularly limited.
  • the filter module may be a hollow fiber filter, or may be a cylindrical filter whose outer side also has a cylindrical structure.
  • a liquid component (which may contain small particles) coming out of the fine holes of the hollow fiber filter or the cylindrical filter can be guided to another channel.
  • a flow path leading out of this outer tube leads to an outlet through which the small size is discharged.
  • the flow in the filter of the hollow fiber filter or tubular filter can be introduced (circulated) again into the hollow fiber filter or tubular filter via the chamber, and the outlet can be opened and closed with a valve during the circulation circuit.
  • a channel is provided and the lead channel leads to an outlet through which the large size particles are diverted.
  • a microchannel can also be used as the filter module used in this technology.
  • This microchannel is also called a microchannel device or a microchannel chip.
  • the sample is directed into a microfluidic channel where it flows in parallel with another liquid (such as a buffer).
  • a precisely placed island structure can generate hydrodynamic lift (a force perpendicular to the main flow) to size particles of interest (such as cells).
  • the width of the microchannel in the chip can be adjusted in the range of approximately 1 to 1000 ⁇ m.
  • the threshold for separating solids in a sample by microchannels can be appropriately determined according to the size of the target bioparticle and the size of the solids to be removed from the sample to be sorted.
  • the first filter module 20 is not particularly limited as long as it can separate a mixture of solids smaller than the target bioparticles from a mixture containing the target bioparticles.
  • a first filter module 20 for example, a mixture of solids smaller than the target bioparticles and a mixture containing the target bioparticles are separated from the solids in the sample introduced from the inlet, and separated into separate outlets. It is possible to suitably use a micro-channel that divides into .
  • the second filter module 21 is not particularly limited as long as it can separate a mixture of solids larger than the target bioparticles from a mixture containing the target bioparticles.
  • a second filter module 21 for example, a mixture of solids larger than the target bioparticles and a mixture containing the target bioparticles are separated from the solids in the sample introduced from the inlet. It is possible to suitably use a micro-channel that divides into .
  • the first filter module 20 and the second filter module 21 are provided with two inlets and two outlets, as shown in FIG.
  • one inlet introduces the sample to be fractionated from the container 10 or the chamber 50, and the other inlet introduces the liquid from the liquid container 40.
  • FIG. Sample separation then takes place within each filter module, with one outlet discharging the mixture containing the small size solids and the other outlet discharging the mixture containing the large size solids.
  • the first filter module 20 removes red blood cells and platelets smaller than white blood cells, and removes the solvent from the liquid storage unit 40. can be replaced. As a result, leukocytes can be recovered with high yield without waste and damage. Also, the second filter module 21 can remove cells larger than lymphocytes.
  • selection of target bioparticles using labels is performed, which can improve the concentration of target bioparticles in the sample to be collected.
  • This selection includes positive selection in which the labeled particles are sorted after labeling the target bioparticles, negative selection in which the labeled particles are removed after labeling of particles other than the target bioparticles, and Combinations can be used.
  • a sample to be fractionated containing target bioparticles is introduced into the chamber 50, and a labeling reagent is introduced into the chamber 50 from the first reagent storage unit 30 to obtain the target bioparticles. Or other particles can be labeled. Separation of labeled particles can be performed according to the properties of the label.
  • multiple particles other than target bioparticles may be labeled, and in this case, multiple types of labeling reagents may be used.
  • a plurality of types of labeling reagents may be stored separately in a plurality of reagent storage units, or may be mixed in advance and stored in the first reagent storage unit 30 .
  • the labeling reagent used for positive selection and negative selection may be a conjugate of a labeling substance and a substance that captures the target particles.
  • the substance that captures the particles of interest may be, for example, a substance that itself binds to the particles of interest (also referred to as a “particle-binding substance”), or a substance that captures the particles of interest via another substance. can be In the latter case, the substance that captures the particles of interest itself may not be the substance that binds to the particles, but the substance that binds the other substance to the particles of interest.
  • the particle-binding substance is, as described above, a substance that itself binds to the particles of interest, such as an antibody or an antibody fragment, such as an antibody or antibody that binds to an antigen present on the surface of the particles of interest. It may be a fragment, for example an antibody or antibody fragment that binds to a cell surface antigen.
  • the substance that captures the target particles through the other substance does not have to be a substance that itself binds to the target particles.
  • the substance that captures the target particles via the other substance may be, for example, a substance that binds to the particle-binding substance, such as a protein that binds to an antibody or an antibody fragment, such as an antibody or an antibody fragment. It may be a protein that specifically binds to Examples of such proteins may be antibody binding proteins, such as any one or any combination of Protein A, Protein G, Protein L, and Protein A/G.
  • the labeling substance contained in the labeling reagents used for positive selection and negative selection may be any substance that enables separation of the particles bound with the label, and more specifically, automatic separation of the particles bound with the label. It is desirable to be able to separate easily. Beads, for example, can be suitably used as such a labeling substance.
  • the size of the beads may be such that, in the second filter module, the target bioparticles to which the beads are bound are separated as a mixture of solids larger than the target bioparticles.
  • positive selection and negative selection when beads are used as labels, separation of particles bound with labels can be performed using a second filter module.
  • the flow of the sample to be fractionated through the second filter module results in a mixture of solids larger than the target bioparticles and the beads. Bound target bioparticles can be sorted.
  • the beads bind to particles other than the target bioparticles, so the sample to be fractionated is passed through the second filter module to form a mixture of solid particles larger than the target bioparticles. can be collected and discarded.
  • the second filter module not only removes bead-bound particles, but also non-bead-bound solids having a size larger than the target bioparticles. It can be disposed of as a mixture of solids with sizes larger than the target bioparticles. Therefore, in this case, the removal of large-sized solid matter by the second filter module 21 that does not use the label does not necessarily have to be performed.
  • the sample to be sorted can be labeled (stained) with a fluorescent dye at any timing before the target biological sample is completed.
  • the sample sorting system of the present technology further includes a labeling unit that labels the sample to be sorted with a fluorescent dye, and the labeling unit is hermetically connected to at least one of the storage unit and the sorting unit.
  • the sample fractionation system 1 shown in FIG. The sample to be acquired can be labeled with a fluorescent dye.
  • this fluorescent dye labeling treatment can be performed simultaneously with the labeling treatment in the above positive selection and/or negative selection.
  • the type and number of fluorescent dyes used for the above staining are not particularly limited, and include FITC (fluorescein isothiocyanete: C21H11NO5S), PE (phycoerythrin), PerCP (periidinin chlorophyll protein), PE-Cy5 and PE-Cy7.
  • FITC fluorescein isothiocyanete: C21H11NO5S
  • PE phycoerythrin
  • PerCP periidinin chlorophyll protein
  • PE-Cy5 and PE-Cy7 Known dyes can be appropriately selected and used as needed.
  • the fluorescent dye may be bound to the sample to be fractionated via a degradable linker, particularly a photodegradable linker.
  • a fluorescence-labeled antibody may be used as the fluorescence-labeling reagent, which makes it possible to stain only the target bioparticles.
  • multiple types of fluorescent labeling reagents can be blended in advance so as to be suitable for
  • concentration of the particles suspended in the liquid in the sample to be fractionated can be measured, and the concentration can be adjusted as necessary.
  • the method for measuring the concentration of particles such as cells may be any method that can measure the concentration of particles in the sample without touching the sample in the closed channel, such as an optical method. , in particular, turbidity measurement, etc. are preferably used.
  • a flow path and a valve are placed in the .
  • the concentration of particles in the sample to be fractionated is determined to be within the appropriate range, the sample can be stored in the storage unit as the target biological sample. On the other hand, if it is determined that the concentration of particles in the sample to be fractionated is not within the proper range, the sample can be concentrated or diluted.
  • Dilution of the sample to be fractionated can be performed by mixing the sample to be fractionated and the liquid from the first liquid storage part 40 in an appropriate ratio in the chamber 50 .
  • the sample to be fractionated can be concentrated using, for example, a filter module.
  • a filter module such as a microchannel distributes particles to two outlets according to their size, the flow rate of the liquid from the liquid storage unit 40 differs between the two outlets. Different concentrations of particles. Therefore, of the first filter module and the second filter module, by passing the target bioparticles through the filter module that distributes the target bioparticles to an outlet with a low liquid flow rate, the preparative sample containing the target bioparticles can be collected.
  • a sample of interest can be concentrated.
  • the outlet to which larger size particles are diverted has a lower liquid flow rate, thus concentrating the particle concentration.
  • the sample to be sorted can be concentrated, for example, by flowing it through the first filter module and causing the sample to be sorted containing the target bioparticles to flow out of the outlet through which large-sized particles flow. .
  • target particles can be moved to a curved channel, where the target particles can join the narrower flow by fluid lift.
  • This allows the particles of interest to be concentrated by discarding a stream of liquid (such as a buffer) that does not contain the particles of interest and reducing the amount of liquid in the stream containing the particles of interest.
  • the sample to be fractionated can be concentrated using a third filter module that is separate from the first and second filter modules described above.
  • a third filter module has an outlet for distributing small-sized particles and an outlet for distributing large-sized particles, and has a high liquid flow rate (that is, the liquid flow rate from the liquid storage unit 40 is A filter module in which the outlets are first or opposite to the second filter module can be used.
  • the second filter module is of the type with a high liquid flow rate outlet for small size particles
  • the third filter module may be of the same threshold value as the outlet liquid for large size particles.
  • the third filter module has an outlet for distributing small-sized particles and an outlet for distributing large-sized particles, and has a large liquid flow rate (that is, a large liquid flow rate from the liquid storage section 40).
  • a filter module can be used that allows the fractionated sample containing the target bioparticles to flow out from an outlet on the opposite side of the outlet.
  • the target bioparticle-containing sample is caused to flow through the third filter module through the target bioparticle-containing sample that has flowed out from the outlet of the first filter module or the second filter module. It is possible to flow out the concentrated preparative sample to be collected.
  • the concentration of the sample to be preparatively described above may be performed in advance before the concentration measurement, so that the concentration measurement will show that the concentration is within the appropriate range or higher. If the result indicates that the concentration is within the appropriate range, the sample to be fractionated can be stored in the reservoir as the target biological sample, and if the concentration is determined to be higher than the appropriate range, Samples can be diluted.
  • (viii) dead volume recovery process Furthermore, in the sample fractionation system of the present technology, when the fractionation process is completed, a place other than the place where the sample to be fractionated containing the target bioparticle exists, for example, a storage unit, Target bioparticles may remain in the first and second filter modules, chambers, channels, etc., and this amount of target bioparticles remaining is the dead volume. In the sample collection system of the present technology, a target biological sample containing as many target biological particles as possible can be obtained by collecting this dead volume.
  • the dead volume is recovered, for example, by allowing the liquid from the liquid storage section 40 to flow through the location where the storage section and the sample to be fractionated flowed, and allowing the flowed liquid to merge with the sample to be fractionated. be able to.
  • the sample contained in the flowed liquid liquid to be combined with the sample to be fractionated
  • the sample is combined with the sample to be fractionated.
  • concentration processing of the target bioparticles in the sorting section may be performed on the mixture after the flowing liquid is combined with the sample to be sorted.
  • a dead volume recovery process is preferably performed on a storage section or a place where the target bioparticles tend to remain after the flow of the sample, such as the filter module.
  • sample fractionation by the sample fractionation system will be described with specific examples.
  • a target biological sample in which leukocytes (target bioparticles) are concentrated is obtained from a blood-derived sample (sample to be fractionated).
  • Chip A is a microchannel chip as a first filter module, a mixture containing leukocytes is obtained from a large cell outlet provided in the chip, and a mixture containing smaller leukocytes is obtained from a small cell outlet. A mixture of sized solids is obtained.
  • Chip B is a microchannel chip as a second filter module, a mixture of solids larger than leukocytes is obtained from a large cell outlet provided in the chip, and a mixture containing leukocytes is obtained from a small cell outlet. is obtained. In both chips, sample solvent exits from the large cell outlet decreases and sample solvent exits from the small cell outlet increases.
  • Sample collection device> The present technology also provides a sample sorting device using the sample sorting system.
  • This sample sorting apparatus is roughly divided into the sample sorting system, a light irradiation section, a light detection section, and an arithmetic processing section.
  • An input management section, a culture section, and a pressure adjustment section may be provided. Each part will be described below.
  • sample sorting device includes a sample sorting system that sorts and stores a target biological sample. Since the configuration of this sample sorting system is the same as the configuration of the sample sorting system 1 shown in FIG. 1, the description thereof will be omitted.
  • the sample sorting device includes a light irradiator that irradiates the sample to be sorted with light.
  • the light irradiator includes, for example, a light source that emits excitation light and an objective lens that collects the excitation light on the sample to be separated.
  • the light source is appropriately selected from laser diodes, SHG lasers, solid-state lasers, gas lasers, high-intensity LEDs, and the like, depending on the purpose of analysis.
  • the light irradiation section may have optical elements other than the light source and the objective lens, if necessary.
  • a sample fractionation device includes a photodetector that detects fluorescence and scattered light emitted from a sample to be fractionated irradiated with excitation light. Specifically, the photodetector detects fluorescence and scattered light emitted from the sample to be fractionated and converts them into electrical signals. Then, the electrical signal is output to the arithmetic processing unit.
  • the configuration of the photodetector is not particularly limited, and a known configuration can be employed, and the method of conversion into an electric signal is not particularly limited either.
  • the sample sorting device includes an arithmetic processing unit to which the electrical signal converted by the photodetector is input. This arithmetic processing unit determines the optical properties of the sample to be fractionated and the target biological particles contained in the sample to be fractionated, based on the input electrical signal. Further, in the arithmetic processing unit, a threshold value for sorting the target bioparticles from the sample to be sorted, a threshold value for determining whether or not the required number or more of the target bioparticles have been sorted, and the labeling unit A gating circuit is provided for calculating a threshold or the like for sorting the target bioparticles based on the fluorescence intensity of the fluorescent dye applied.
  • the gating circuit when a threshold value for fractionating the target biological sample from the sample to be fractionated is calculated, it is converted into an electrical signal for fractionation, and the fractionation signal is converted into the above-mentioned It is output to the first pressure adjustment section provided in the fractionation section.
  • the configuration of the arithmetic processing unit is not particularly limited, and a known configuration can be adopted. Furthermore, a publicly known method can be adopted as the arithmetic processing method performed by the gating circuit of the arithmetic processing unit.
  • the sample sorting device may include a position control unit for controlling the position of the light irradiation unit, if necessary.
  • the configuration of the position control unit is not particularly limited, and a known configuration can be adopted, and examples thereof include an actuator serving as a drive source.
  • the sample collection device may include a decomposition light irradiation unit, if necessary.
  • the sample sorting system includes the labeling unit and the sample to be sorted is labeled with a fluorescent dye via a photodegradable linker
  • the sample to be sorted is labeled with a fluorescent dye depending on the usage environment. must be eliminated.
  • the decomposition light irradiation unit irradiates the photodegradable linker with predetermined light.
  • the fluorescent dye can be excluded from the sample to be fractionated.
  • the wavelength of the light with which the decomposable linker is irradiated may be a wavelength corresponding to each photodegradable linker.
  • the decomposition efficiency is the highest at 346 nm, and if this is set to 1, the decomposition efficiency is 0.89 at 364 nm, 0.15 at 406 nm, and 0.007 at 487 nm. It is preferable not to use wavelengths of 300 nm or less, as they may damage samples to be sorted. In addition, it is preferable to irradiate at a dose that does not damage the sample to be fractionated, particularly the target biological sample, for example, 30 mW/cm 2 , 100 sec. ⁇ 3 J/cm 2 .
  • the sample sorting device may include a drug input management section, if necessary.
  • the target biological sample stored in the storage unit of the sample sorting system needs to be activated/gene-introduced as necessary.
  • a drug for activation or a drug for introducing a gene into the target biological sample is introduced.
  • the drug input management unit manages the input amount of each drug according to the state of the stored target biological sample.
  • Said agents include various cytokines (interleukin-2 (IL-2), IL-7, IL-15, IL-21, etc.) and various antibodies (anti-CD3 antibody, anti-CD28 antibody, etc.) for activation,
  • IL-2 interleukin-2
  • IL-7 interleukin-7
  • IL-15 interleukin-15
  • IL-21 interleukin-21
  • antibodies anti-CD3 antibody, anti-CD28 antibody, etc.
  • known agents such as various viral vectors (adeno-associated virus vectors, adenoviral vectors, retroviral vectors, lentiviral vectors, etc.) into which a plasmid that expresses the target gene has been introduced can be used and stored. An appropriate one can be selected according to the type and condition of the target biological sample. Furthermore, a plurality of known drugs can be used in combination.
  • the sample sorting device may include a culture section, if necessary.
  • the culture unit cultures the target biological sample stored in the storage unit.
  • the temperature inside the reservoir is controlled to increase the target bioparticles accommodated in the reservoir.
  • the temperature adjustment method in the culture section is not particularly limited, and a known method can be adopted.
  • a heating element is provided in the storage section, and the temperature rise/fall of the heat generation element is controlled from the culture section. You may make it output the electrical signal which carries out.
  • the sample fractionating device may include a pressure adjusting part, if necessary.
  • the pressure adjustment section adjusts the pressure inside the storage section. Specifically, it is configured to generate a negative pressure in the reservoir, and a piezoelectric element such as a piezoelectric element can be used.
  • the pressure adjustment unit is configured to adjust the pressure inside the storage unit by adjusting the flow rate of the preparative separation sample flowing out of the storage unit.
  • the storage section, the sorting section, and the storage section are hermetically connected via the sealing section. Therefore, fractionation of the target biological sample and storage of the target biological sample can be performed in a closed space, thereby improving the degree of purification of the fractionation of the target biological sample. Contamination of the sample collection system itself and/or contamination of the collected target biological sample with other substances can be prevented. As a result, the sample sorting device according to the present technology can be applied clinically where the purity of the target biological sample is required.
  • the sample sorting device may be a cell sorter hermetically connected to the sample sorting system described above, and the cell sorter is preferably a closed cell sorter, more preferably a closed cell therapy cell sorter. .
  • the sample sorting system and the sample sorting device can also have the following configurations.
  • a storage unit containing a sample to be fractionated, a fractionating unit for fractionating a target biological sample from the sample to be fractionated, and a storage unit for storing the target biological sample, wherein the storage unit;
  • a sample fractionating system further comprising a first liquid storage section in which the collection section and the storage section are hermetically connected through a flow path, and which contains a liquid to be circulated in the flow path,
  • the sorting unit comprises a first filter module that separates a mixture of solids having a size smaller than the target bioparticles from a mixture containing the target bioparticles, and a mixture of solids having a size larger than the target bioparticles and the target.
  • a second filter module that separates a mixture containing bioparticles, a first reagent container that contains a reagent for labeling target bioparticles or other particles, and a sample, particles, and reagents in the channel , a chamber for temporarily holding liquids or mixtures thereof,
  • the fractionation unit for the sample to be fractionated that flows from the storage unit, (a) removal of a mixture of solids with a size smaller than the target bioparticles by the first filter module; (b) removal of a mixture of solids with a size larger than the target bioparticles by a second filter module; (c1) a process of labeling the target bioparticles by reaction between the reagent flowing from the first reagent storage unit and the sample to be sorted in the chamber, and then sorting the labeled particles; and (c2 ) After labeling particles other than the target bioparticles by reaction between the reagent flowing from the first reagent storage unit and the sample to be fractionated in the chamber, the process of removing
  • the sample to be fractionated is passed through the second filter module, and solid matter larger in size than the target bioparticles a combination of (a), (b) and (c1), a combination of (a), (b) and (c2), or (a) and (c2) ) are combined and If the process (b) is performed after the process (c1) is performed, the beads are removed from the target bioparticles after the process (c1) and before the process (b) is performed.
  • the sample collection system includes a first reagent storage section containing a reagent for binding beads to target bioparticles, and another reagent storage section containing a reagent for binding beads to particles other than target bioparticles.
  • the sample to be fractionated flowing from the storage unit, (a) removal of a mixture of solids with a size smaller than the target bioparticles by the first filter module; (b) removal of a mixture of solids with a size larger than the target bioparticles by a second filter module; (c1) After binding the beads to the target bioparticles by the reaction between the reagent flowing from the first reagent container and the sample to be fractionated in the chamber, the sample to be fractionated is transferred to the second filter module.
  • the sample to be fractionated is passed through the second filter module to remove solid particles larger than the target bioparticles.
  • the combination of (a), (b), (c1) and (c2) or the combination of (a), (c1) and (c2) is performed among the treatments for removing the particles bound to the beads as a mixture,
  • the sample fractionation system according to any one of (1) to (8), a light irradiation unit that irradiates the sample to be fractionated with excitation light, and light that detects fluorescence emitted from the sample to be fractionated.
  • a sample sorting apparatus comprising: a detection unit; and an arithmetic processing unit that calculates fractionation information based on the detection result of the photodetector.
  • the cell sorter is a cell sorter for closed-system cell therapy.
  • the sample collection device according to any one of (9) to (12), further comprising a culture section that adjusts the temperature of the storage section.
  • the sample sorting apparatus according to any one of (9) to (13), further comprising a drug input management section that controls drug input to the storage section.
  • sample collection system 10 container 20 first filter module 21 second filter module 30 first reagent container 31 second reagent container 32 third reagent container 40 first liquid container 41 Second liquid storage section 50 Chamber 60 Storage section 70 Waste section 80 Concentration sensor

Abstract

分取対象試料が収容された収容部と、前記分取対象試料から目標生体試料を分取する分取部と、前記目標生体試料が収容される貯留部とを備え、前記収容部と、分取部と、貯留部とが流路を通じて密閉連結され、流路内に通流させる液体を含有する第一の液体収容部をさらに備える、試料分取システムが開示される。この試料分取システムは、CSC前処理の複数の工程を無菌的閉路内で行うことを可能とする自動化した試料分取システムとして有用である。

Description

閉鎖系の自動試料分取システム
　本技術は、閉鎖系の自動試料分取システム、および試料分取装置に関する。
　遺伝子改変Ｔ細胞療法（CART療法）は既に実用化されており、例えば、米国ではNovartis社のKymriahが2017年8月に発売され、Kite Pharma社（米Gilead Sciences社子会社）のYescartaが2017年10月に発売され、日本でも2019年3月にKymriahが承認されている。CART療法などの細胞療法とその関連技術は今後さらに成長が期待される分野である。現状では、細胞治療で必要となる免疫系細胞の回収プロセスは、抗体修飾磁気ビーズを使った方法が主流と見られている。磁気ビーズプロセスは一度に大量の血液試料を処理することが可能であるが、一度の処理で細かい細胞サブセットを選別することができないこと、非標的細胞の混入が多く、純度が悪いこと、標的細胞数の規定が難しいなどの課題が存在する。言い換えると、癌免疫治療等の細胞治療領域において、治療成績や安全性向上、副作用低減、および適応患者の拡大のためには、治療に有効な細胞を選別して使えるようにすることが重要であり、それを無菌環境下で実行する手法として閉鎖系細胞治療用セルソーター（CSC）の開発が進んでいる（特許文献１）。
特開２０１７－１８１２７８号公報
　しかし、採取された試料をCSCに投入するまでの前処理（赤血球や血小板除去、蛍光標識抗体による染色、洗浄、濃度調整など）には、現状では多大な労力とコストがかかっており、さらには、手技による作業が多いために汚染リスクがあることなどが問題となっている。このような前処理に含まれる個々の工程を閉鎖系で行うことができる装置は存在するものの、全ての工程を一気通貫で行うことはできず、手技によりバックを繋ぎ変えることや、安全キャビネット内で試料や試薬をハンドリングすることなどが必要である。また、最終的に濃度を自動調整できる装置も存在しない。
　そこで、本技術は、CSC前処理の複数の工程を無菌的閉路内で行うことを可能とする自動化した試料分取システムを提供する。
　本技術は、分取対象試料が収容された収容部と、前記分取対象試料から目標生体試料を分取する分取部と、前記目標生体試料が収容される貯留部と、を備え、前記収容部と、分取部と、貯留部と、が流路を通じて密閉連結され、流路内に通流させる液体を含有する第一の液体収容部をさらに備える、試料分取システムを提供する。
　この試料分取システムにおいて、前記分取部は、目標生体粒子よりも小さいサイズの固形物の混合物と目標生体粒子を含む混合物とを分離する第一のフィルターモジュールと、目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物と目標生体粒子を含む混合物とを分離する第二のフィルターモジュールと、目標生体粒子またはそれ以外の粒子を標識するための試薬を含有する第一の試薬収容部と、流路内の試料、粒子、試薬、液体またはこれらの混合物を一時的に保持するためのチャンバーと、を備える。
　試料分取システム中の前記分取部においては、収容部から通流される分取対象試料に対して、（ａ）第一のフィルターモジュールによる目標生体粒子よりも小さいサイズの固形物の混合物の除去、（ｂ）第二のフィルターモジュールによる目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物の除去、（ｃ１）チャンバー内における、第一の試薬収容部から通流される試薬と分取対象試料との反応による目標生体粒子の標識を行った後に、標識された粒子を分取する処理、ならびに（ｃ２）チャンバー内における、第一の試薬収容部から通流される試薬と分取対象試料との反応による目標生体粒子以外の粒子の標識を行った後に、標識された粒子を除去する処理、のうち、（ａ）、（ｂ）および（ｃ１）の組み合わせ、（ａ）、（ｂ）および（ｃ２）の組み合わせ、あるいは（ａ）および（ｃ２）の組み合わせが行われる。
　前記標識はビーズとしてもよく、粒子を標識するための試薬は、目標生体粒子またはそれ以外の粒子にビーズを結合させるための試薬であってもよい。
　標識としてビーズを使用する場合、試料分取システム中の前記分取部においては、収容部から通流される分取対象試料に対して、（ａ）第一のフィルターモジュールによる目標生体粒子よりも小さいサイズの固形物の混合物の除去、（ｂ）第二のフィルターモジュールによる目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物の除去、（ｃ１）チャンバー内における、第一の試薬収容部から通流される試薬と分取対象試料との反応による目標生体粒子へのビーズの結合を行った後に、分取対象試料を第二のフィルターモジュールに通流させ、目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物としてビーズと結合した目標生体粒子を分取する処理、ならびに（ｃ２）チャンバー内における、第一の試薬収容部から通流される試薬と分取対象試料との反応による目標生体粒子以外の粒子へのビーズの結合を行った後に、分取対象試料を第二のフィルターモジュールに通流させ、目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物としてビーズと結合した粒子を除去する処理、のうち、（ａ）、（ｂ）および（ｃ１）の組み合わせ、（ａ）、（ｂ）および（ｃ２）の組み合わせ、あるいは（ａ）および（ｃ２）の組み合わせが行われる。ここで、（ｃ１）の処理を行った後に（ｂ）の処理を行う場合には、（ｃ１）の処理を行った後、かつ、（ｂ）の処理を行う前に、目標生体粒子からビーズを除去する処理が行われる。
　標識としてビーズを使用する場合、試料分取システムにおいて、前記分取部は、目標生体粒子にビーズを結合させるための試薬を含有する第一の試薬収容部と、目標生体粒子以外の粒子にビーズを結合させるための試薬を含有する他の試薬収容部とを備えていてもよく、この分取部においては、収容部から通流される分取対象試料に対して、（ａ）第一のフィルターモジュールによる目標生体粒子よりも小さいサイズの固形物の混合物の除去、（ｂ）第二のフィルターモジュールによる目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物の除去、（ｃ１）チャンバー内における、第一の試薬収容部から通流される試薬と分取対象試料との反応による目標生体粒子へのビーズの結合を行った後に、分取対象試料を第二のフィルターモジュールに通流させ、目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物としてビーズと結合した目標生体粒子を分取する処理、ならびに（ｃ２）チャンバー内における、他の試薬収容部から通流される試薬と分取対象試料との反応による目標生体粒子以外の粒子へのビーズの結合を行った後に、分取対象試料を第二のフィルターモジュールに通流させ、目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物としてビーズと結合した粒子を除去する処理、のうち、（ａ）、（ｂ）、（ｃ１）および（ｃ２）の組み合わせ、あるいは（ａ）、（ｃ１）および（ｃ２）の組み合わせが行われる。ここで、（ｃ１）の処理を行った後に（ｂ）および／または（ｃ２）の処理を行う場合には、（ｃ１）の処理を行った後、かつ、（ｂ）および／または（ｃ２）の処理を行う前に、目標生体粒子からビーズを除去する処理が行われる。
　前記試料分取システムにおいて、前記第一のフィルターモジュールおよび前記第二のフィルターモジュールは、インレットから導入された試料中の固形物を、固形物の大きさによって２つの異なるアウトレットに振り分けるマイクロ流路とすることができる。
　また、前記試料分取システムは、前記分取対象試料を蛍光色素で標識する標識部、を更に備え、前記標識部が、前記収容部と分取部の少なくともいずれか一方に密閉連結されていてもよい。
　更に、前記試料分取システムにおいて、目標生体粒子の濃度が調整されてもよい。
　更に、前記試料分取システムにおいて、前記収容部に、第一の液体収容部から液体を導入し、この液体を分取対象試料に混合してもよい。
　また、本技術は、分取対象試料が収容された収容部、前記分取対象試料から目標生体試料を分取する分取部及び前記目標生体試料が収容される貯留部を備え、前記収容部、分取部及び貯留部が密閉連結された上述の試料分取システムと、前記分取対象試料に励起光を照射する光照射部と、前記分取対象試料から発せられる蛍光を検出する光検出部と、前記光検出部の検出結果に基づいて分取情報を算出する演算処理部と、を備える、試料分取装置をも提供する。
　この試料分取装置は、上述の試料分取システムと密閉連結されたセルソーターであってもよく、このセルソーターは、好ましくは閉鎖系セルソーター、より好ましくは閉鎖系細胞治療用セルソーターとされる。
　更に、前記試料分取装置は、更に前記貯留部の温度調整を行う培養部を備えていてもよい。
　また、前記試料分取装置は、更に前記貯留部に対する薬剤投入を制御する薬剤投入管理部を備えていてもよい。
　本技術によれば、CSC前処理の一連の工程を無菌的閉路内で行う自動化した低コストデバイスを提供することが可能となり、また、従来では別々に行っていた一部工程を同時に実施することでプロセス時間の短縮を果たす。プロセス時間の短縮は、単に作業効率に係わるだけでなく、細胞のダメージを低減することにも繋がるので細胞治療薬製造に有益である。なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本技術中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
図１は、本技術に係る試料分取システムの構成例を示す模式図である。 図２は、本技術に係る試料分取システムを用いた、ネガティブセレクションを含む試料分取の具体例を示すフローチャートである。 図３は、本技術に係る試料分取システムを用いた、ポジティブセレクションを含む試料分取の具体例を示すフローチャートである。
　以下、本技術を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
＜１．試料分取システム＞
（１）本技術の試料分取システムの説明
　本技術の試料分取システムは、分取対象試料が収容された収容部と、前記分取対象試料から目標生体試料を分取する分取部と、前記目標生体試料が収容される貯留部と、を備え、前記収容部と、分取部と、貯留部と、が流路を通じて密閉連結され、流路内に通流させる液体を含有する第一の液体収容部をさらに備える。前記分取部は、目標生体粒子よりも小さいサイズの固形物の混合物と目標生体粒子を含む混合物とを分離する第一のフィルターモジュールと、目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物と目標生体粒子を含む混合物とを分離する第二のフィルターモジュールと、目標生体粒子またはそれ以外の粒子を標識するための試薬を含有する第一の試薬収容部と、流路内の試料、粒子、試薬、液体またはこれらの混合物を一時的に保持するためのチャンバーと、を備える。
　本技術の試料分取システムでは、第一のフィルターモジュールと第二のフィルターモジュールとを順次用いて、分取対象試料に含まれる固形物のうち、目標生体粒子よりも小さいサイズの固形物と、目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物をできるだけ除去する。さらに、本技術の試料分取システムでは、標識試薬を用いて目標生体粒子およびそれ以外の粒子のいずれかを標識することにより、目標生体粒子とそれ以外の粒子とを分離する。これにより、分取対象試料中における目標生体粒子の濃度を高くする、つまり、目標生体粒子を濃縮することができる。
（２）本技術の試料分取システムの構成例およびこの試料分取システムを用いた試料分取方法の例
　本技術の試料分取システムの構成例およびその使用方法を、図１を参照しながら以下に説明する。
(i)構成例
　図１に示される試料分取システム１は、分取対象試料が収容された収容部１０、第一のフィルターモジュール２０、第二のフィルターモジュール２１、目標生体粒子またはそれ以外の粒子を標識するための試薬を含有する第一の試薬収容部３０、流路内の試料、粒子、試薬、液体またはこれらの混合物を一時的に保持するためのチャンバー５０、流路内に通流させる液体を含有する第一の液体収容部４０、貯留部６０を備えている。本技術の試料分取システムは、複数の液体収容部や試薬収容部を備えていてもよく、図１に示される試料分取システム１は、第二の液体収容部４１、第二の試薬収容部３１および第三の試薬収容部３２を備えている。さらに、図１に示される試料分取システム１は、目標生体粒子の濃度を感知するための濃度センサー８０、および廃棄物を収容するための廃棄部７０を備えている。
　本技術の試料分取システムに含まれる全ての要素は密閉連結された流路によってつながっており、図１に示されるようなバルブとポンプの作動によって流路内の試料、粒子、試薬、液体またはこれらの混合物を移動させることができる。これにより、試料を分取するための複数の工程の全てを無菌的閉路内で行うことが可能となる。
(ii)分取対象試料
　収容部１０には、分取対象試料が収容される。分取対象試料は、分取しようとする目標生体粒子を含むものであればよく、特に制限されない。しかし、本技術の試料分取システムは試料を分取するための複数の工程の全てを無菌的閉路内で行うことができるため、目標生体粒子が細胞である場合には特に有利である。
　細胞には、動物細胞（血液系細胞など）および植物細胞が含まれうる。細胞は、特には血液系細胞または組織系細胞でありうる。前記血液系細胞としては、例えば、白血球（例えば末梢血単核細胞）、赤血球、および血小板を挙げることができ、前記血液系細胞は、特には白血球を含む。白血球としては、例えば、単球（マクロファージ）、リンパ球、好中球、好塩基球、および好酸球を挙げることができる。細胞は、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞などの浮遊系細胞であってよい。前記組織系細胞は、例えば、接着系の培養細胞または組織からばらされた接着系細胞などであってよい。また、細胞は、腫瘍細胞であってもよい。細胞は、培養されたものであってもよく、または培養されていないものであってもよい。目標生体粒子とされる細胞は、例えば、治療に用いるための細胞や、白血球などの血液細胞であってよい。目標生体粒子が血液細胞である場合には、分取対象試料は血液由来試料とされ、例えば、凍結アフェレーシスを解凍したもの、新鮮アフェレーシス（未凍結）、全血サンプルなどが挙げられる。
　分取対象試料が凍結細胞を含む場合など、分取対象試料中に核酸が含まれる（可能性がある）場合には、分取対象試料に核酸分解物質を混合して核酸を分解することが望ましい。このような核酸分解物質の混合は、予め核酸分解物質を第二の試薬収容部３１に収容しておき、そこから収容部１０に核酸分解物質を通流させることにより行うことができる。あるいは、核酸分解物質は、第二の試薬収容部３１から流路の全体に通流させてもよい。これにより、分取対象試料における固形物の凝集を防ぎ、よって、流路やフィルターモジュールにおける目詰まりを防ぐことができる。このような核酸分解物質としては、核酸分解酵素を好適に用いることができ、核酸分解酵素としては、例えば、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅＩなど）、リボヌクレアーゼ、およびこれらの混合物が挙げられる。第二の試薬収容部３１に固体の核酸分解物質が収容される場合には、第一の液体収容部４０から液体を第二の試薬収容部３１に通流させ、核酸分解物質を溶解した後に使用することができる。
(iii)液体（キャリアー）
　第一の液体収容部４０に収容される液体は、目標生体粒子を含む分取対象試料のキャリアーとなるものであり、よって、目標生体粒子にとって有害な作用を持たない液体とされる。このような液体としては、バッファー（緩衝液）を用いることが好ましく、バッファーとしては、例えば、ＰＢＳ＋（通常のリン酸緩衝生理食塩水）、ＰＢＳ－（ＰＢＳ＋からマグネシウムとカルシウムを除いたもの）、生理食塩水、培地、リンゲル液等を挙げることができる。また、バッファーとして、ＰＢＳ－に、生理的濃度あるいはＰＢＳ＋相当もしくはその２倍量のマグネシウムイオンを添加したものを用いることもでき、この組成により、ＰＢＳ＋に含まれるカルシウムイオンが細胞生存率等に影響を及ぼすことを回避しつつ、酵素活性に必要な２価イオンを補充することができる。また、これらのバッファーには、アルブミン、抗生剤、生理的濃度のグルコースなどを添加してもよい。
(iv)液体（洗浄液）
　本技術では、液体として、試料分取システム１に含まれる要素や流路を洗浄するための洗浄液（次亜塩素酸溶液や界面活性剤溶液など）を用いることができ、この洗浄液は、例えば、第二の液体収容部４１に収容することができる。この洗浄液は、必要に応じて、試料分取システム１に含まれる要素および流路の一部または全部に通流され、その後、廃棄部に送ることができる。特に、この洗浄液は、分取対象試料が除去された後の収容部１０、ならびに分取対象試料が通流した後の第一のフィルターモジュール２０および第二のフィルターモジュール２１の洗浄に適している。また、この洗浄液による洗浄が終わった後は、次工程での細胞などの目標生体粒子へのダメージを防ぐため、洗浄液が触れた部分に第一の液体収容部４０からの液体を通流し、洗浄液を取り除くことが望ましい。
(v)分取部における目標生体粒子の濃縮
　本技術において用いられるフィルターモジュールは、液体中に存在する粒子の大きさに従って２つのアウトレットに振り分けることのできるものであればよく、その具体的な構造は特に制限されるものではない。例えば、フィルターモジュールとしては、中空糸フィルターを挙げることができ、さらには、筒状のフィルターであって、さらにその外側も筒状の構造になっている筒状フィルターを挙げることができる。前記中空糸フィルターまたは前記筒状フィルターの微小穴から出た液状成分（小粒子を含んでも良い）は、別流路に導くことができる。この外側の筒から導出される流路は小さいサイズが排出されるアウトレットに繋がる。一方で、中空糸フィルターまたは筒状フィルターのフィルター内の流れは、チャンバーを介して再度中空糸フィルターまたは筒状フィルターに導入可能（循環可能）であり、その循環回路中にバルブで開閉可能な導出路が設けられていて、その導出路は大きいサイズの粒子が振り分けられるアウトレットに繋がる。
　本技術において用いられるフィルターモジュールとしては、マイクロ流路を用いることもできる。このマイクロ流路は、マイクロ流路デバイスまたはマイクロ流路チップとも呼ばれる。このマイクロ流路では、試料が微小流体チャンネルに導かれ、そこで他の液体（緩衝液など）と平行に通流する。このチャンネル内では、精密に配置されたアイランド構造が流体揚力（主な流れに対して垂直方向の力）を発生させ、目的の粒子（細胞など）をサイズで分類することができる。上記のマイクロ流路におけるチップ内の流路の幅は、概ね１～１０００μｍの範囲で調整することができる。マイクロ流路によって試料中の固形物を分離するときの閾値は、目標生体粒子のサイズと、分取対象試料から除去しようとする固形物のサイズに応じて適宜決定することができる。
　第一のフィルターモジュール２０は、目標生体粒子よりも小さいサイズの固形物の混合物と目標生体粒子を含む混合物とを分離することのできるモジュールであればよく、特に制限されるものではない。このような第一のフィルターモジュール２０としては、例えば、インレットから導入された試料中の固形物を、目標生体粒子よりも小さいサイズの固形物の混合物と目標生体粒子を含む混合物とを別々のアウトレットに振り分けるマイクロ流路を好適に用いることができる。
　第二のフィルターモジュール２１は、目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物と目標生体粒子を含む混合物とを分離することのできるモジュールであればよく、特に制限されるものではない。このような第二のフィルターモジュール２１としては、例えば、インレットから導入された試料中の固形物を、目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物と目標生体粒子を含む混合物とを別々のアウトレットに振り分けるマイクロ流路を好適に用いることができる。
　図１に示される試料分取システム１では、第一のフィルターモジュール２０および第二のフィルターモジュール２１には、図１に示されるように、２つのインレットと２つのアウトレットが備えられている。それぞれのフィルターモジュールにおいて、一方のインレットからは、収容部１０またはチャンバー５０からの分取対象試料が導入され、他方のインレットからは、液体収容部４０からの液体が導入される。その後、それぞれのフィルターモジュール内で試料の分離が行われ、一方のアウトレットからは小さいサイズの固形物を含む混合物が排出され、他方のアウトレットからは大きいサイズの固形物を含む混合物が排出される。
　分取対象試料が血液由来試料であり、目標生体粒子が白血球である場合、第一のフィルターモジュール２０では、白血球より小さい赤血球や血小板を除去し、また、溶媒を液体収容部４０からの液体に置換することができる。これにより、白血球を、高い収率で無駄なく、ダメージを与えずに回収することができる。また、第二のフィルターモジュール２１では、リンパ球より大型の細胞を除去することができる。
　本技術の試料分取システムでは、標識を用いた目標生体粒子のセレクションが行われ、これにより、分取対象試料中の目標生体粒子の濃度を向上させることができる。このセレクションとしては、目標生体粒子の標識を行った後に標識された粒子を分取するポジティブセレクション、目標生体粒子以外の粒子の標識を行った後に標識された粒子を除去するネガティブセレクション、およびこれらの組み合わせを用いることができる。図１に示される試料分取システム１では、目標生体粒子を含む分取対象試料をチャンバー５０に導入し、第一の試薬収容部３０からチャンバー５０に標識試薬を導入することにより、目標生体粒子またはそれ以外の粒子を標識することができる。標識された粒子の分離は、その標識の特性に従って行うことができる。
　ネガティブセレクションでは、目標生体粒子以外の複数の粒子（例えば、リンパ球と赤血球など）の標識を行ってもよく、この場合には、複数種の標識試薬を用いることもできる。複数種の標識試薬は、複数の試薬収容部を設けてそれぞれ別々に収容されていてもよいし、あるいは、予め混合して第一の試薬収容部３０に収容してもよい。
　ポジティブセレクションおよびネガティブセレクションに用いられる標識試薬は、標識物質と目的の粒子を捕捉する物質とのコンジュゲートであってもよい。目的の粒子を捕捉する物質は、例えば、それ自体が目的の粒子と結合する物質（「粒子結合性物質」ともいう）であってよく、または他の物質を介して目的の粒子を捕捉する物質であってよい。後者の場合、目的の粒子を捕捉する物質それ自体はその粒子に結合する物質ではなく、当該他の物質が目的の粒子と結合する物質であってよい。
　前記粒子結合性物質は、上記の通り、それ自体が目的の粒子と結合する物質であり、例えば、抗体または抗体断片であり、例えば、目的の粒子の表面に存在する抗原に結合する抗体または抗体断片であってよく、例えば、細胞の表面抗原に結合する抗体または抗体断片であってよい。
　前記他の物質を介して目的の粒子を捕捉する物質は、上記の通り、それ自体は目的の粒子と結合する物質でなくてよい。前記他の物質を介して目的の粒子を捕捉する物質は、例えば、粒子結合性物質と結合する物質であってよく、例えば、抗体または抗体断片に結合するタンパク質であり、例えば、抗体または抗体断片に特異的に結合するタンパク質であってよい。このようなタンパク質の例としては、抗体結合性タンパク質、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、およびプロテインＡ／Ｇのうちのいずれか１つまたは任意の組み合わせであってよい。
　ポジティブセレクションおよびネガティブセレクションに用いられる標識試薬に含まれる標識物質は、その標識が結合した粒子の分離を可能とするものであればよく、より特定的には、その標識が結合した粒子の自動的な分離を可能とするものであることが望ましい。このような標識物質としては、例えば、ビーズを好適に用いることができる。ビーズのサイズは、例えば、第二のフィルターモジュールにおいて、該ビーズが結合した目標生体粒子が、目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物として分離されるようなサイズであればよい。
　ポジティブセレクションおよびネガティブセレクションにおいて、標識としてビーズを使用する場合には、標識が結合した粒子の分離は、第二のフィルターモジュールを利用して行うことができる。つまり、ポジティブセレクションの場合には、目標生体粒子にビーズが結合するため、分取対象試料の第二のフィルターモジュールへの通流により、目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物としてビーズと結合した目標生体粒子を分取することができる。ネガティブセレクションの場合には、目標生体粒子以外の粒子にビーズが結合するため、分取対象試料の第二のフィルターモジュールへの通流により、目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物としてビーズと結合した粒子を分取し、これを廃棄することができる。
　ビーズ標識を用いてネガティブセレクションを行う場合には、第二のフィルターモジュールによって、ビーズが結合した粒子だけでなく、目標生体粒子よりも大きいサイズの、ビーズが結合していない固形物も一緒に、目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物として廃棄することができる。よって、この場合には、標識を用いない第二のフィルターモジュール２１による大きいサイズの固形物の除去処理は、必ずしも行わなくてよい。
　ポジティブセレクションおよびネガティブセレクションのうち、いずれか一方のみを行ってもよいが、両方を行ってもよい。ポジティブセレクションおよびネガティブセレクションの両方を行う場合には、それぞれに必要な標識試薬を別々に収容しておくため、第一の試薬収容部３０と同様の位置に配置される別の試薬収容部を設ける必要がある。
　以上のように、（ａ）第一のフィルターモジュールによる小型粒子の除去、（ｂ）第二のフィルターモジュールによる非標識の大型粒子の除去、（ｃ１）ポジティブセレクションおよび（ｃ２）ネガティブセレクションのうち、（ａ）、（ｂ）、（ｃ１）および（ｃ２）の組み合わせ、（ａ）、（ｃ１）および（ｃ２）の組み合わせ、（ａ）、（ｂ）および（ｃ１）の組み合わせ、（ａ）、（ｂ）および（ｃ２）の組み合わせ、あるいは（ａ）および（ｃ２）の組み合わせによって、分取対象試料から、目標生体粒子が濃縮された目標生体試料を分取することができる。ここで、（ｃ１）および（ｃ２）の処理においてビーズ標識を用いる場合であって、（ｃ１）の処理を行った後に（ｂ）および／または（ｃ２）の処理を行う場合には、（ｃ１）の処理を行った後、かつ、（ｂ）および／または（ｃ２）の処理を行う前に、目標生体粒子からビーズを除去する処理が行われる。また、それ以外の場合においても、目標生体粒子からビーズを除去する処理を行ってもよい。
(vi)蛍光染色
　更に、目標生体試料が完成する前に、いずれかのタイミングで、分取対象試料を蛍光色素で標識する（染色する）ことができる。この場合、本技術の試料分取システムは、分取対象試料を蛍光色素で標識する標識部、を更に備え、前記標識部が、前記収容部と分取部の少なくともいずれか一方に密閉連結されていてもよい。例えば、図１に示される試料分取システム１において、第三の試薬収容部３２に蛍光標識試薬を収容しておき、蛍光標識試薬をチャンバー５０内で分取対象試料と混合することにより、分取対象試料を蛍光色素で標識することができる。また、この蛍光色素標識の処理は、上記のポジティブセレクションおよび／またはネガティブセレクションにおける標識処理と同時に行うこともできる。
　上記の染色に用いられる蛍光色素の種類および数は特に限定されるものではなく、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanete：Ｃ２１Ｈ１１ＮＯ５Ｓ）、ＰＥ（phycoerythrin）、ＰｅｒＣＰ（periidinin chlorophyll protein）、ＰＥ－Ｃｙ５及びＰＥ－Ｃｙ７などの公知の色素を、必要に応じて適宜選択して使用することができる。また、前記蛍光色素は、分解性リンカ、特に光分解性リンカを介して分取対象試料に結合させてもよい。また、蛍光標識試薬としては、蛍光標識付き抗体を用いてもよく、これにより、目標生体粒子のみを染色することも可能である。また、多マーカー（多色）の染色に適するように、複数種の蛍光標識試薬を予めブレンドしておくこともできる。蛍光標識試薬は、溶液状態でも凍結乾燥状態でもよい。
(vii)濃度調整
　更に、目標生体試料が完成する前に、分取対象試料において液体中に懸濁されている粒子の濃度を測定し、必要に応じてその濃度を調整することができる。細胞などの粒子の濃度を測定する方法は、密閉流路内の試料に手を触れることなくその試料中の粒子の濃度を測定することができるいかなる方法であってもよいが、例えば光学的手法、特に濁度測定法などが好適に用いられる。例えば、図１に示される試料分取システム１において、貯留部６０の前に濃度センサー８０が設けられ、濃度センサー８０から流出する試料が、貯留部６０およびチャンバー５０のいずれにも通流できるように、流路とバルブが配置される。
　濃度測定の結果、分取対象試料中の粒子の濃度が適正範囲内と判定されれば、その試料を目標生体試料として貯留部に貯留することができる。一方で、分取対象試料中の粒子の濃度が適正範囲内にないと判定された場合には、その試料を濃縮または希釈することができる。
　分取対象試料の希釈は、チャンバー５０内において、分取対象試料と、第一の液体収容部４０からの液体とを適切な比率で混合することにより行うことができる。
　分取対象試料の濃縮は、例えば、フィルターモジュールを利用して行うことができる。マイクロ流路などのフィルターモジュールは、粒子をそのサイズに応じて２つのアウトレットに振り分ける際に、２つのアウトレットの間で液体収容部４０からの液体の流量が異なり、よって、アウトレットから流出する試料における粒子の濃度が異なる。よって、第一のフィルターモジュールと第二のフィルターモジュールのうち、目標生体粒子を、液体流量の少ないアウトレットに振り分けるフィルターモジュールに分取対象試料を通流させることにより、目標生体粒子を含有する分取対象試料を濃縮することができる。多くのフィルターモジュールでは、大きいサイズの粒子が振り分けられるアウトレットの方が液体流量が少なく、よって、粒子の濃度が濃縮される。従って、分取対象試料は、例えば、第一のフィルターモジュールを通流させ、大きいサイズの粒子が流出するアウトレットから目標生体粒子を含有する分取対象試料を流出させることにより、濃縮することができる。　
　フィルターモジュールとしてマイクロ流路を用いる場合には、例えば、目的の粒子（細胞など）をカーブしたチャンネルに移動させ、そこで流体揚力により目的の粒子を狭い方の流れに合流させることができる。これにより、目的の粒子を含まない液体（緩衝液など）の流れを廃棄し、目的の粒子を含む方の流れの液体の量を減らすことにより目的の粒子を濃縮することができる。
　あるいは、上述の第一のフィルターモジュールおよび第二のフィルターモジュールとは別の、第三のフィルターモジュールを用いて分取対象試料の濃縮を行うこともできる。このような第三のフィルターモジュールとしては、小さいサイズの粒子が振り分けられるアウトレットと大きいサイズの粒子が振り分けられるアウトレットとを有し、液体流量の多い（つまり、液体収容部４０からの液体の流量が多い）アウトレットが第一のフィルターモジュールまたは第二のフィルターモジュールとは逆のフィルターモジュールを用いることができる。このようなフィルターモジュールを、適宜、第一のフィルターモジュールまたは第二のフィルターモジュールの代わりに用いることで、分取対象試料の希釈を防ぐことができる。例えば、第二のフィルターモジュールが、小さいサイズの粒子が振り分けられるアウトレットの液体流量が多いタイプである場合には、第三のフィルターモジュールとして、同じ閾値で、大きいサイズの粒子が振り分けられるアウトレットの液体流量が多いタイプのフィルターモジュールを使用し、適度に第二のフィルターモジュールの代わりに使用することにより、その小さいサイズの粒子が振り分けられるアウトレットから、目標生体粒子を含有する濃縮された分取対象試料を流出させることができる。
　あるいは、第三のフィルターモジュールとして、小さいサイズの粒子が振り分けられるアウトレットと大きいサイズの粒子が振り分けられるアウトレットとを有し、液体流量の多い（つまり、液体収容部４０からの液体の流量が多い）アウトレットとは反対側のアウトレットから目標生体粒子を含有する分取対象試料を流出させるフィルターモジュールを用いることができる。第一のフィルターモジュールまたは第二のフィルターモジュールのアウトレットから流出してきた、目標生体粒子を含有する分取対象試料を、このような第三のフィルターモジュールに通流させることにより、目標生体粒子を含有する濃縮された分取対象試料を流出させることができる。
　上記の分取対象試料の濃縮は、濃度測定の前に予め行ってもよく、これにより、濃度測定では、濃度が適正範囲内であるか、それよりも濃いという結果が得られる。濃度が適正範囲内という結果が得られた場合には、その分取対象試料を目標生体試料として貯留部に貯留することができ、濃度が適正範囲よりも濃いと判定された場合には、その試料を希釈することができる。
(viii)デッドボリューム回収処理
　更に、本技術の試料分取システムにおいて、分取処理が完了した段階で、目標生体粒子を含有する分取対象試料が存在する場所以外の場所、例えば、収容部、第一および第二のフィルターモジュール、チャンバー、流路などに、目標生体粒子が残存していることがあり、この残存している目標生体粒子の量がデッドボリュームである。本技術の試料分取システムでは、このデッドボリュームを回収することにより、少しでも多くの目標生体粒子を含む目標生体試料を得ることができる。
　デッドボリュームの回収は、例えば、収容部および分取対象試料が通流された場所に、液体収容部４０からの液体を通流させ、通流した液体を分取対象試料に合流させることによって行うことができる。ここで、通流させた液体（分取対象試料に合流させる液体）に含まれる試料が、分取部における目標生体粒子の濃縮処理を経ていないものである場合には、分取対象試料に合流させる前に、その液体に対して分取部における目標生体粒子の濃縮処理を行うことが望ましい。また、このような分取部における目標生体粒子の濃縮処理は、通流した液体を分取対象試料に合流させた後、その混合物に対して行ってもよい。特に、このようなデッドボリュームの回収処理は、収容部や、試料の通流の後に目標生体粒子が残留しやすい場所、例えば、フィルターモジュールに対して行うとよい。
＜２．試料分取システムによる試料分取の具体例＞
　以下に、具体例を挙げて試料分取システムによる試料分取を説明する。以下の具体例では、血液由来試料（分取対象試料）から白血球（目標生体粒子）が濃縮された目標生体試料を取得する。以下の具体例において、チップＡは第一のフィルターモジュールとしてのマイクロ流路チップであり、チップに備えられた大型細胞アウトレットからは白血球を含む混合物が得られ、小型細胞アウトレットからは白血球よりも小さいサイズの固形物の混合物が得られる。チップＢは第二のフィルターモジュールとしてのマイクロ流路チップであり、チップに備えられた大型細胞アウトレットからは白血球よりも大きいサイズの固形物の混合物が得られ、小型細胞アウトレットからは白血球を含む混合物が得られる。いずれのチップにおいても、大型細胞アウトレットから排出される試料の溶媒は減少し、小型細胞アウトレットから排出される試料の溶媒は増加する。
(i)ネガティブセレクションを利用した試料分取の具体例
　概略を図２のフローチャートに示す。具体的な工程を、以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
(ii)ポジティブセレクションを利用した試料分取の具体例
　概略を図３のフローチャートに示す。具体的な工程を、以下の表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
(iii)ポジティブセレクションおよびネガティブセレクションを利用した試料分取の具体例
　具体的な工程を、以下の表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
＜３．試料分取装置＞
　本技術は、前記試料分取システムを用いた試料分取装置をも提供する。この試料分取装置は、大別して、前記試料分取システムと、光照射部と、光検出部と、演算処理部と、を備え、必要に応じて、位置制御部、分解光照射部、薬剤投入管理部、培養部、圧力調整部を備えていてもよい。以下、各部について説明する。
(i)試料分取システム
　本技術に係る試料分取装置は、目標生体試料の分取および貯留を行う試料分取システムを備える。この試料分取システムの構成は、図１に示す試料分取システム１の構成と同一であるため、その説明を省略する。
(ii)光照射部
　本技術に係る試料分取装置は、前記分取対象試料に対して光を照射する光照射部を備える。光照射部は、例えば、励起光を出射する光源と、分取対象試料に対して励起光を集光する対物レンズ等を含んで構成される。光源は、分析の目的に応じてレーザダイオード、ＳＨＧレーザ、固体レーザ、ガスレーザ及び高輝度ＬＥＤなどから適宜選択される。光照射部は、必要に応じて、光源及び対物レンズ以外の光学素子を有していてもよい。
(iii)光検出部
　本技術に係る試料分取装置は、励起光が照射された分取対象試料から発せられた蛍光及び散乱光を検出する光検出部を備える。光検出部は、具体的には、分取対象試料から発せられた蛍光及び散乱光を検出して、電気信号へと変換する。そして、当該電気信号を前記演算処理部へと出力する。光検出部の構成は特に限定されず、公知の構成を採用することができ、更に電気信号への変換方法に関しても特に限定されない。
(iv)演算処理部
　本技術に係る試料分取装置は、前記光検出部で変換された電気信号が入力される演算処理部を備える。この演算処理部は、入力される電気信号に基づいて、分取対象試料および当該分取対象試料内に含まれる目標生体粒子の光学特性を判定する。更に、当該演算処理部では、分取対象試料から目標生体粒子を分取するための閾値、要求個数以上の目標生体粒子が分取されたか否かを判定するための閾値、前記標識部によって標識される蛍光色素による蛍光強度に基づいて目標生体粒子を選別するための閾値等を算出するためのゲーティング回路を備える。このゲーティング回路の構成により、分取対象試料から目標生体試料を分取するための閾値が算出された場合には、これを分取のための電気信号に変換し、当該分取信号を前記分取部が備える第一圧力調整部に出力する。尚、前記演算処理部の構成は特に限定されず公知の構成を採用することができる。更に、前記演算処理部のゲーティング回路により行われる演算処理方法も公知の方法を採用することができる。
(v)位置制御部
　本技術に係る試料分取装置は、必要に応じて、光照射部の位置を制御するための位置制御部を備えていてもよい。位置制御部の構成としては特に限定されず公知の構成を採用することができ、例えば駆動源となるアクチュエータなどが挙げられる。
(vi)分解光照射部
　本技術に係る試料分取装置は、必要に応じて、分解光照射部を備えていてもよい。前記試料分取システムが前記標識部を備え、分取対象試料が光分解性リンカを介して蛍光色素を標識される構成である場合、使用環境に応じて、前記分取対象試料から蛍光色素を排除する必要がある。前記分解光照射部は、前記光分解性リンカに対して所定の光を照射する。その結果として、分取対象試料から蛍光色素を排除することができる。ここで、分解性リンカに照射する光の波長は、各光分解性リンカに対応する波長であればよい。例えば、メトキシニトロベンジルの場合、346nmで分解効率が最も良く、これを１とすると、364nmでは0.89、406nmでは0.15、487nmでは0.007の分解効率となる。300nm以下の波長は、分取対象試料にダメージを与える可能性があるので使用しないことが好ましい。また、分取対象試料、特に目標生体試料にダメージを与えない、例えば、30mW/cm2,100sec.→3J/cm2等で照射することが好ましい。照射量として、前記目標生体粒子が細胞である場合、その種にもよるが、500J/cm2でDNAにダメージが生じて細胞成長を阻害すると言われている（Callegari, A. J. & Kelly, T. J. Shedding light on the DNA damage checkpoint. Cell Cycle 6, 660-6 (2007)）。また、42J/cm2では細胞毒性が生じない、という報告もある（Masato T, et al, Optical cell separation from three-dimensional environment in photodegradable hydrogels for pure culture techniques, Scientific Reports 4, Article number. 4793(2014)）。
(vii)薬剤投入管理部
　本技術に係る試料分取装置は、必要に応じて、薬剤投入管理部を備えていてもよい。前記試料分取システムの貯留部に貯留された目標生体試料は、必要に応じて、活性化・遺伝子導入を行う必要があり、前記薬剤投入管理部は、前記貯留部に対して目標生体試料を活性化するための薬剤や当該目標生体試料に対して遺伝子を導入するための薬剤を投入する。あるいは、前記薬剤投入管理部は、貯留された目標生体試料の状態に応じて各薬剤の投入量等を管理する。前記薬剤としては、活性化には各種サイトカイン（インターロイキン-2（IL-2）、IL-7、IL-15、IL-21など）や各種抗体（抗CD3抗体、抗CD28抗体など）など、遺伝子導入には、目的遺伝子を発現するプラスミドが導入された各種ウイルスベクター（アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなど）の公知の薬剤を用いることができ、貯留される目標生体試料の種類や状態に応じて適切なものと選択することができる。更には、公知の薬剤を複数種類組み合わせて用いることもできる。
(viii)培養部
　本技術に係る試料分取装置は、必要に応じて、培養部を備えていてもよい。当該試料分取装置の用途に応じ、前記試料分取システムにより分取された目標生体試料の数量を増加させる必要が考えられる。すなわち、前記培養部では、前記貯留部に貯留された目標生体試料を培養する。具体的には、前記貯留部内の温度制御を行い、当該貯留部内に収容される目標生体粒子を増加させる。なお、前記培養部における温度調整方法は特に限定されず、公知の方法を採用することができ、例えば貯留部に発熱体を設け、前記培養部から前記発熱体に対して温度上昇／下降を制御する電気信号を出力するようにしてもよい。
(ix)圧力調整部
　本技術に係る試料分取装置は、必要に応じて、圧力調整部を備えていてもよい。前述の如く、前記試料分取システムでは前記収容部、分取部および貯留部が相互に密閉連結されているため、前記貯留部における圧力変化が収容部及び／又は分取部における圧力変化を引き起こす可能性がある。前記圧力調整部は、前記貯留部内の圧力を調整する。具体的には、前記貯留部内に負圧を発生させる構成であり、ピエゾ素子などの圧電素子が挙げられる。更に、圧力調整部は、収容部から流出される分取対象試料の流量を調整することにより、該収容部内の圧力調整を行う構成であることが好ましい。
　以上のような本技術に係る試料分取装置によれば、前記収容部、前記分取部および前記貯留部が、密閉部を介して密閉連結されている。このため、目標生体試料の分取、目標生体試料の貯留を密閉空間で実行することができ、もって目標生体試料の分取の精製度を向上させることができ、また、目標生体試料を含むミストによる試料分取システム自体の汚染及び／又は分取された目標生体試料への他物質の混入を防止することができる。その結果、本技術に係る試料分取装置は、目標生体試料の純度が要求される臨床に適用することができる。
　本技術に係る試料分取装置は、上述の試料分取システムと密閉連結されたセルソーターであってもよく、このセルソーターは、好ましくは閉鎖系セルソーター、より好ましくは閉鎖系細胞治療用セルソーターとされる。
　本技術に係る試料分取システムおよび試料分取装置は、以下のような構成も取ることができる。
（１）
　分取対象試料が収容された収容部と、前記分取対象試料から目標生体試料を分取する分取部と、前記目標生体試料が収容される貯留部とを備え、前記収容部と、分取部と、貯留部とが流路を通じて密閉連結され、流路内に通流させる液体を含有する第一の液体収容部をさらに備える、試料分取システムであって、
　前記分取部が、目標生体粒子よりも小さいサイズの固形物の混合物と目標生体粒子を含む混合物とを分離する第一のフィルターモジュールと、目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物と目標生体粒子を含む混合物とを分離する第二のフィルターモジュールと、目標生体粒子またはそれ以外の粒子を標識するための試薬を含有する第一の試薬収容部と、流路内の試料、粒子、試薬、液体またはこれらの混合物を一時的に保持するためのチャンバーと、を備え、
　前記分取部において、収容部から通流される分取対象試料に対して、
（ａ）第一のフィルターモジュールによる目標生体粒子よりも小さいサイズの固形物の混合物の除去、
（ｂ）第二のフィルターモジュールによる目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物の除去、
（ｃ１）チャンバー内における、第一の試薬収容部から通流される試薬と分取対象試料との反応による目標生体粒子の標識を行った後に、標識された粒子を分取する処理、ならびに
（ｃ２）チャンバー内における、第一の試薬収容部から通流される試薬と分取対象試料との反応による目標生体粒子以外の粒子の標識を行った後に、標識された粒子を除去する処理
のうち、（ａ）、（ｂ）および（ｃ１）の組み合わせ、（ａ）、（ｂ）および（ｃ２）の組み合わせ、あるいは（ａ）および（ｃ２）の組み合わせが行われる、試料分取システム。
（２）
　前記標識がビーズであり、粒子を標識するための試薬が、目標生体粒子またはそれ以外の粒子にビーズを結合させるための試薬である、（１）に記載の試料分取システム。
（３）
　収容部から通流される分取対象試料に対して、
（ａ）第一のフィルターモジュールによる目標生体粒子よりも小さいサイズの固形物の混合物の除去、
（ｂ）第二のフィルターモジュールによる目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物の除去、
（ｃ１）チャンバー内における、第一の試薬収容部から通流される試薬と分取対象試料との反応による目標生体粒子へのビーズの結合を行った後に、分取対象試料を第二のフィルターモジュールに通流させ、目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物としてビーズと結合した目標生体粒子を分取する処理、ならびに
（ｃ２）チャンバー内における、第一の試薬収容部から通流される試薬と分取対象試料との反応による目標生体粒子以外の粒子へのビーズの結合を行った後に、分取対象試料を第二のフィルターモジュールに通流させ、目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物としてビーズと結合した粒子を除去する処理
のうち、（ａ）、（ｂ）および（ｃ１）の組み合わせ、（ａ）、（ｂ）および（ｃ２）の組み合わせ、あるいは（ａ）および（ｃ２）の組み合わせが行われ、
　（ｃ１）の処理を行った後に（ｂ）の処理を行う場合には、（ｃ１）の処理を行った後、かつ、（ｂ）の処理を行う前に、目標生体粒子からビーズを除去する処理が行われる、（２）に記載の試料分取システム。
（４）
　前記分取部が、目標生体粒子にビーズを結合させるための試薬を含有する第一の試薬収容部と、目標生体粒子以外の粒子にビーズを結合させるための試薬を含有する他の試薬収容部とを備え、この分取部においては、収容部から通流される分取対象試料に対して、
（ａ）第一のフィルターモジュールによる目標生体粒子よりも小さいサイズの固形物の混合物の除去、
（ｂ）第二のフィルターモジュールによる目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物の除去、
（ｃ１）チャンバー内における、第一の試薬収容部から通流される試薬と分取対象試料との反応による目標生体粒子へのビーズの結合を行った後に、分取対象試料を第二のフィルターモジュールに通流させ、目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物としてビーズと結合した目標生体粒子を分取する処理、ならびに
（ｃ２）チャンバー内における、他の試薬収容部から通流される試薬と分取対象試料との反応による目標生体粒子以外の粒子へのビーズの結合を行った後に、分取対象試料を第二のフィルターモジュールに通流させ、目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物としてビーズと結合した粒子を除去する処理
のうち、（ａ）、（ｂ）、（ｃ１）および（ｃ２）の組み合わせ、あるいは（ａ）、（ｃ１）および（ｃ２）の組み合わせが行われ、
　（ｃ１）の処理を行った後に（ｂ）および／または（ｃ２）の処理を行う場合には、（ｃ１）の処理を行った後、かつ、（ｂ）および／または（ｃ２）の処理を行う前に、目標生体粒子からビーズを除去する処理が行われる、（２）に記載の試料分取システム。
（５）
　前記第一のフィルターモジュールおよび前記第二のフィルターモジュールが、インレットから導入された試料中の固形物を、固形物の大きさによって２つの異なるアウトレットに振り分けるマイクロ流路である、（１）～（４）のいずれか一項に記載の試料分取システム。
（６）
　前記分取対象試料を蛍光色素で標識する標識部を更に備え、前記標識部が、前記収容部と分取部の少なくともいずれか一方に密閉連結されている、（１）～（５）のいずれか一項に記載の試料分取システム。
（７）
　目標生体粒子の濃度が調整される、（１）～（６）のいずれか一項に記載の試料分取システム。
（８）
　前記収容部に、第一の液体収容部から液体が導入され、この液体が分取対象試料に混合される、（１）～（７）のいずれか一項に記載の試料分取システム。
（９）
　（１）～（８）のいずれか一項に記載の試料分取システムと、前記分取対象試料に励起光を照射する光照射部と、前記分取対象試料から発せられる蛍光を検出する光検出部と、前記光検出部の検出結果に基づいて分取情報を算出する演算処理部とを備える、試料分取装置。
（１０）
　前記試料分取システムと密閉連結されたセルソーターである、（９）に記載の試料分取装置。
（１１）
　前記セルソーターが閉鎖系セルソーターである、（１０）に記載の試料分取装置。
（１２）
　前記セルソーターが閉鎖系細胞治療用セルソーターである、（１０）に記載の試料分取装置。
（１３）
　前記貯留部の温度調整を行う培養部を更に備える、（９）～（１２）のいずれか一項に記載の試料分取装置。
（１４）
　前記貯留部に対する薬剤投入を制御する薬剤投入管理部を更に備える、（９）～（１３）のいずれか一項に記載の試料分取装置。
１　　試料分取システム
１０　収容部
２０　第一のフィルターモジュール
２１　第二のフィルターモジュール
３０　第一の試薬収容部
３１　第二の試薬収容部
３２　第三の試薬収容部
４０　第一の液体収容部
４１　第二の液体収容部
５０　チャンバー
６０　貯留部
７０　廃棄部
８０　濃度センサー

Claims (14)

  1. 　分取対象試料が収容された収容部と、前記分取対象試料から目標生体試料を分取する分取部と、前記目標生体試料が収容される貯留部とを備え、前記収容部と、分取部と、貯留部とが流路を通じて密閉連結され、流路内に通流させる液体を含有する第一の液体収容部をさらに備える、試料分取システムであって、
    　前記分取部が、目標生体粒子よりも小さいサイズの固形物の混合物と目標生体粒子を含む混合物とを分離する第一のフィルターモジュールと、目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物と目標生体粒子を含む混合物とを分離する第二のフィルターモジュールと、目標生体粒子またはそれ以外の粒子を標識するための試薬を含有する第一の試薬収容部と、流路内の試料、粒子、試薬、液体またはこれらの混合物を一時的に保持するためのチャンバーと、を備え、
    　前記分取部において、収容部から通流される分取対象試料に対して、
    （ａ）第一のフィルターモジュールによる目標生体粒子よりも小さいサイズの固形物の混合物の除去、
    （ｂ）第二のフィルターモジュールによる目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物の除去、
    （ｃ１）チャンバー内における、第一の試薬収容部から通流される試薬と分取対象試料との反応による目標生体粒子の標識を行った後に、標識された粒子を分取する処理、ならびに
    （ｃ２）チャンバー内における、第一の試薬収容部から通流される試薬と分取対象試料との反応による目標生体粒子以外の粒子の標識を行った後に、標識された粒子を除去する処理
    のうち、（ａ）、（ｂ）および（ｃ１）の組み合わせ、（ａ）、（ｂ）および（ｃ２）の組み合わせ、あるいは（ａ）および（ｃ２）の組み合わせが行われる、試料分取システム。
  2. 　前記標識がビーズであり、粒子を標識するための試薬が、目標生体粒子またはそれ以外の粒子にビーズを結合させるための試薬である、請求項１に記載の試料分取システム。
  3. 　収容部から通流される分取対象試料に対して、
    （ａ）第一のフィルターモジュールによる目標生体粒子よりも小さいサイズの固形物の混合物の除去、
    （ｂ）第二のフィルターモジュールによる目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物の除去、
    （ｃ１）チャンバー内における、第一の試薬収容部から通流される試薬と分取対象試料との反応による目標生体粒子へのビーズの結合を行った後に、分取対象試料を第二のフィルターモジュールに通流させ、目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物としてビーズと結合した目標生体粒子を分取する処理、ならびに
    （ｃ２）チャンバー内における、第一の試薬収容部から通流される試薬と分取対象試料との反応による目標生体粒子以外の粒子へのビーズの結合を行った後に、分取対象試料を第二のフィルターモジュールに通流させ、目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物としてビーズと結合した粒子を除去する処理
    のうち、（ａ）、（ｂ）および（ｃ１）の組み合わせ、（ａ）、（ｂ）および（ｃ２）の組み合わせ、あるいは（ａ）および（ｃ２）の組み合わせが行われ、
    　（ｃ１）の処理を行った後に（ｂ）の処理を行う場合には、（ｃ１）の処理を行った後、かつ、（ｂ）の処理を行う前に、目標生体粒子からビーズを除去する処理が行われる、請求項２に記載の試料分取システム。
  4. 　前記分取部が、目標生体粒子にビーズを結合させるための試薬を含有する第一の試薬収容部と、目標生体粒子以外の粒子にビーズを結合させるための試薬を含有する他の試薬収容部とを備え、この分取部においては、収容部から通流される分取対象試料に対して、
    （ａ）第一のフィルターモジュールによる目標生体粒子よりも小さいサイズの固形物の混合物の除去、
    （ｂ）第二のフィルターモジュールによる目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物の除去、
    （ｃ１）チャンバー内における、第一の試薬収容部から通流される試薬と分取対象試料との反応による目標生体粒子へのビーズの結合を行った後に、分取対象試料を第二のフィルターモジュールに通流させ、目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物としてビーズと結合した目標生体粒子を分取する処理、ならびに
    （ｃ２）チャンバー内における、他の試薬収容部から通流される試薬と分取対象試料との反応による目標生体粒子以外の粒子へのビーズの結合を行った後に、分取対象試料を第二のフィルターモジュールに通流させ、目標生体粒子よりも大きいサイズの固形物の混合物としてビーズと結合した粒子を除去する処理
    のうち、（ａ）、（ｂ）、（ｃ１）および（ｃ２）の組み合わせ、あるいは（ａ）、（ｃ１）および（ｃ２）の組み合わせが行われ、
    　（ｃ１）の処理を行った後に（ｂ）および／または（ｃ２）の処理を行う場合には、（ｃ１）の処理を行った後、かつ、（ｂ）および／または（ｃ２）の処理を行う前に、目標生体粒子からビーズを除去する処理が行われる、請求項２に記載の試料分取システム。
  5. 　前記第一のフィルターモジュールおよび前記第二のフィルターモジュールが、インレットから導入された試料中の固形物を、固形物の大きさによって２つの異なるアウトレットに振り分けるマイクロ流路である、請求項１に記載の試料分取システム。
  6. 　前記分取対象試料を蛍光色素で標識する標識部を更に備え、前記標識部が、前記収容部と分取部の少なくともいずれか一方に密閉連結されている、請求項１に記載の試料分取システム。
  7. 　目標生体粒子の濃度が調整される、請求項１に記載の試料分取システム。
  8. 　前記収容部に、第一の液体収容部から液体が導入され、この液体が分取対象試料に混合される、請求項１に記載の試料分取システム。
  9. 　請求項１に記載の試料分取システムと、前記分取対象試料に励起光を照射する光照射部と、前記分取対象試料から発せられる蛍光を検出する光検出部と、前記光検出部の検出結果に基づいて分取情報を算出する演算処理部とを備える、試料分取装置。
  10. 　前記試料分取システムと密閉連結されたセルソーターである、請求項９に記載の試料分取装置。
  11. 　前記セルソーターが閉鎖系セルソーターである、請求項１０に記載の試料分取装置。
  12. 　前記セルソーターが閉鎖系細胞治療用セルソーターである、請求項１０に記載の試料分取装置。
  13. 　前記貯留部の温度調整を行う培養部を更に備える、請求項９に記載の試料分取装置。
  14. 　前記貯留部に対する薬剤投入を制御する薬剤投入管理部を更に備える、請求項９に記載の試料分取装置。
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