WO2022195351A1 - Vacunas para prevenir la covid19 basadas en sitios no glicosilados del dominio de unión al receptor (rbd) de la proteína s del virus sars-cov-2 - Google Patents

Vacunas para prevenir la covid19 basadas en sitios no glicosilados del dominio de unión al receptor (rbd) de la proteína s del virus sars-cov-2 Download PDF

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WO2022195351A1
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antibodies
serum
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Leandro NÚÑEZ MUÑOZ
Gabriel MARCELINO PÉREZ
Miriam PÉREZ ZALDIVAR
Karla ACOSTA VIRGEN
Hugo GONZÁLEZ CONCHILLOS
Brenda VARGAS HERNÁNDEZ
Ana OLIVARES MARTÍNEZ
Roberto RUÍZ MEDRANO
Daniela ROA VELÁZQUEZ
Edgar MORALES RÍOS
Jorge RAMOS FLORES
Gustavo TORRES FRANCO
Diana PELÁEZ GONZÁLEZ
Jorge FERNÁNDEZ HERNÁNDEZ
Martha ESPINOSA CANTELLANO
Diana TAPIA SIDAS
José RAMÍREZ POOL
América PADILLA VIVEROS
Beatriz XOCONOSTLE CÁZARES
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Centro De Investigación Y De Estudios Avanzados Del Instituto Politécnico Nacional
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Definitions

  • the present invention is related to the development of vaccines to prevent diseases, particularly with vaccines to prevent COVID19 using immunogenic proteins of the SARS-CoV-2 virus, mainly using receptor binding domain (RBD) proteins of the virus, without binding sites. glycosylation and with immunogenic properties.
  • RBD receptor binding domain
  • the Coronaviridae family comprises several viruses that can cause human illness ranging from the common cold to severe clinical manifestations such as Middle East Respiratory Syndrome (MERS-CoV), Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS-CoV) and COVID-19 ( SARS-CoV-2) [1 ,2] SARS-CoV and SARS-CoV-2 coronaviruses use the Spike (S) protein to enter host cells through interaction with angiotensin-converting enzyme (ACE2) [ 3,4]
  • S is the largest known type 1 viral fusion protein, containing 22 canonical N-glycosylation sites (N-X-S/T, where X1P), as well as 33 O-glycosylation sites [5-9 ] that could enhance infectivity [10] This impairs the host's ability to mount an effective adaptive immune response [11], or probably causes epitope masking [12], as has been reported for other viral proteins such as the envelope (ENV) of HIV [13], glycoprotein 1 (GP1) from Ebola virus [
  • the S protein of the SARS-CoV-2 virus has N-glycosylations that can be classified as complex (55%), high in mannose (28%) or hybrid (17%), covering approximately 40% of its surface [ 18,19]
  • the S protein also has a homotrimeric structure typical of coronaviruses, where each monomer consists of a signal peptide (SP), S1 and S2 subunits (the first responsible for receptor binding and the second with a receptor-anchoring function). the viral membrane), a transmembrane domain (TM) and an intracellular domain (IC) [20].
  • the S1 subunit contains the receptor binding domain (RBD) and within it, the receptor binding motif (RBM).
  • RBD has a total of 4 disulfide bridges [21] and 3 N-glycosylation sites: two experimentally verified (N331 and N343), and a third predicted (N370) based on comparisons with RBD from SARS-CoV.
  • N331 and N343 two experimentally verified
  • N370 third predicted
  • Protein S has been proposed as a key element for the development of antigens with prophylactic potential and for the immunodiagnosis of COVID19, taking into account the presence of RBD and its role in the entry of the virus into host cells. If antibodies against RBD could be generated, it would potentially impede virus entry and allow a humoral and cellular immune response to inactivate viral particles [22].
  • the use of the full-length protein S of SARS-CoV as a protective vaccine using the modified recombinant Vaccinia Ankara virus (rMVA), induced a strong inflammatory response in liver tissues of ferrets [23], while in macaque models the production of anti-spike SARS-CoV IgG in the infected lungs is responsible for an injury acute lung disease due to a bias in the response that resolves inflammation [24].
  • rMVA modified recombinant Vaccinia Ankara virus
  • RBD from SARS-CoV as a promising antigen has shown the induction of neutralizing antibodies, as well as recognition by antibodies present in the serum of convalescent patients [3, 25]
  • Park et al. [62] describe vaccines based on the Newcastle virus for nasal application using a recombinant S protein of the SARS-CoV-2 virus, which induces high levels of neutralizing IgA and IgG2a antibodies in hamsters and is capable of blocking the virus in the lungs. within the first 4 days after vaccination.
  • Wang [63] describes a vaccine composition that comprises mRNA coding for the S protein of the SARS-CoV-2 virus, which was modified by codon optimization and is administered using the TC83 virus of equine encephalitis from Venezuela as a vector, the which induces in animals the production of antibodies 14 days after its administration.
  • Lee et al. [64] describe the production and purification of the recombinant antigen RBD219-N1C1 which induces a robust neutralizing antibody response against the SARS-CoV-2 virus in mice.
  • Norheim et al. [66] describe low-cost vaccines based on DNA plasmids that encode homodimers of a target unit that binds chymosin receptors that induce antigen presentation in conjunction with the RBD protein of the SARS-CoV-2 virus. Said vaccine induces a robust and dose-dependent immune response of IgG antibodies in mice that persists for 3 months after its administration, detecting neutralizing antibodies against the virus from day 7 after its administration and a T-cell response against the virus.
  • Sun et al. [68] describe the production of a recombinant subunit vaccine (RBD-Fc Vacc) against the SARS-CoV-2 virus that comprises a recombinant protein formed from the RBD protein of the virus fused with the Fe domain of human IgG1, which induces Specific neutralizing antibodies in primates and in transgenic mice for human ACE2 and showing neutralization of 3 different strains of the SARS-CoV-2 virus.
  • RBD-Fc Vacc recombinant subunit vaccine against the SARS-CoV-2 virus that comprises a recombinant protein formed from the RBD protein of the virus fused with the Fe domain of human IgG1, which induces Specific neutralizing antibodies in primates and in transgenic mice for human ACE2 and showing neutralization of 3 different strains of the SARS-CoV-2 virus.
  • Ma et al. [69] describe vaccines against the SARS-CoV-2 virus based on nanoparticles containing 24mer-ferritin conjugated to the RBD protein of the virus, which induce a robust immune response and neutralizing antibodies against the virus when compared with vaccines containing monomers.
  • the previous vaccines do not consider per se sites that are not glycosylated in the RBD protein for the design of effective vaccines against the disease; Likewise, some of them use viral vectors for their administration.
  • FIG. 1 A schematic diagram of the antigens proposed by the invention as vaccine candidates against SARS-CoV-2 under an expression platform based on E. coli is shown.
  • Signal Peptide SP
  • S1 Subunit 1
  • S2 Subunit 2
  • TM Transmembrane Domain
  • IC Intracellular Domain
  • RDB Receptor Binding Site
  • RBM Receptor Binding Motif
  • NG19 Non-glycosylated protein of 19 kDa.
  • NG06 Non-glycosylated protein of 6 kDa.
  • the brackets joining the regions in RDB correspond to disulfide bridges described above.
  • FIG. 3 The structure of the NG06 and NG19 antigens is shown.
  • C) and NG19 C and NG19
  • D Three-dimensional structure predicted de novo for peptides NG6 (C) and NG19 (D).
  • C peptides NG6
  • D Three-dimensional structure predicted de novo for peptides NG6
  • each monomer is shown in different shades of blue and the NG06 and NG19 regions within the RBD (open state in red and closed state in pink).
  • Figure 4 The validation of three-dimensional models of NG06 (A) and NG19 (B) is shown using the Z-Score and local quality values for NG06 (C) and NG19 (D)
  • FIG. 6 The purification steps of the NG06 (A) and NG19 (B) proteins and immunodetection by Western blot (C) are shown.
  • Line 1A, 1B and 1C Molecular weight marker
  • Line 2A and 2B total fraction
  • Line 3A and 3B insoluble fraction
  • Line 4A and 4B soluble fraction
  • Line 5A and 5B unbound fraction obtained after purification by IMAC
  • Lane 6A and Lane 6B bound fraction obtained after IMAC purification
  • Lane 7A bound fraction after second IMAC
  • Lane 7B Refolded/SEC fraction
  • Lane 8A unbound fraction after second IMAC
  • Lane 2C and 8B fraction obtained after SEC.
  • Line 3C Western blot immunodetection using NG19 as antigen and serum immunized with NG06.
  • FIG. 7 Chromatographic steps through FLPC for the purification of NG06 are shown.
  • FIG. 8 Chromatographic steps through FLPC for the purification of NG19 are shown.
  • B-C Indirect ELISA titration of pre-immune and hyperimmune sera using NG06 (B) and NG19 (C) antigens.
  • CBC complete blood count.
  • FIG. 10 The IgG response in patients positive for SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2 (+), red) and healthy subjects (SARS-CoV-2 (-), blue) against the recombinant antigens NG06 ( A) and NG19 (B). Data are presented as the mean of triplicate OD values per subject. Each point represents a subject and the horizontal bars correspond to the mean values with SD.
  • FIG. 11 The antigenic sequences of the invention are shown.
  • B) the NG19 protein (SEQ.ID.No.2) and its coding sequence are observed of DNA (SEQ.ID.No.5)
  • amino acids and nucleotides corresponding to His-Tag blue
  • MBP maltose binding protein
  • violet violet
  • additional from the vector red
  • amino acids and nucleotides corresponding to the adjuvant red double underlined
  • changes in the amino acids of the NG19 sequence blue boxes
  • those corresponding to the antigens of the invention underlined.
  • Figure 12 shows A) expression in E. coli and B) purification of the eNG19m(20H) protein.
  • the protein obtained and purified is indicated with an arrow.
  • FIG. 13 Recognition of eNG19m protein by sera from recovered COVID-19 patients (P) and healthy individuals (C) is shown. Wells of ELISA plates were sensitized with 100 ng of the protein; COVID patients were evaluated for the presence of SARS-CoV-2 with real-time PCR. Serum dilution: 1/5000; secondary antibody dilution: 1/5000
  • the present invention provides vaccines to prevent COVID19, based on immunogenic proteins of the SARS-CoV-2 virus, mainly using receptor binding domain (RBD) proteins of the virus, without glycosylation sites and with immunogenic properties.
  • RBD receptor binding domain
  • the receptor-binding domain (RBD) of the Spike (S) protein of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) has glycosylation sites that may limit the production of reliable antigens expressed on prokaryotic platforms, due to glycan-mediated evasion of the host immune response.
  • protein regions without glycosylated residues capable of inducing neutralizing antibodies could be useful for the production of antigens in systems that do not possess the glycosylation machinery.
  • the potential antigens NG06 SEQ.ID.No.1 and NG19 (SEQ.ID.No.2) located in the non-glycosylated S-RBD region, were selected and expressed in Escherichia coli, purified by FPLC, and used to determine their immunogenic potential by detecting antibodies in the serum of immunized rabbits and COVID-19 patients.
  • the purified antigens were able to raise polyclonal antibodies in rabbits evoking a strong immune response. Additionally, we detected IgG antibodies in sera from recovered COVID-19 patients.
  • the present invention highlights the utility of antigens based on the non-N-glycosylated region of the RBD of SARS-CoV-2 for the development of vaccines, as well as for immunotherapy.
  • the region of the protein S with the most exposed epitopes comprises the apical zone of the RBD domain in its open conformation [19].
  • the selected peptides can be effective as protective antigens, as long as the virus continues to recognize the ACE2 receptor to mediate cell entry.
  • mapping NG06 and NG19 mapping NG06 and NG19, with similar patterns for the protein S from SARS-CoV, MERS-CoV and SARS-CoV-2.
  • the NG06 and NG19 proteins that have lost the post-translational modification consisting of glycans could not evoke the production of auto-antibodies that occur in SARS-CoV-2 infection [45], thus pointing to molecules such as host carbohydrates (for example, gangliosides) that cause neuropathic syndromes such as Guillain-Barré or Miller Fisher [46-48]
  • neuropathic syndromes such as Guillain-Barré or Miller Fisher [46-48]
  • transverse myelitis has been reported in a volunteer patient immunized against SARS -CoV-2, where the protective agent was an adenovirus-based vaccine containing the glycosylated ORF of protein S on its surface [49,50]
  • the NG06 and NG19 proteins could also be useful for immunodiagnosis, since the presence of antibodies on these regions correlates with the presence of neutralizing anti-RBD antibodies that do not recognize the glycan.
  • This type of glycan-directed antibodies is common in autoimmune
  • a limitation of the antigens generally proposed as protective vaccines prior to the present invention is that they do not encompass all viral variants circulating in the population.
  • Two low-frequency substitutions mapping to NG06 and NG19 have been reported: G476S (which could shorten the length of a linear B-cell epitope) and V483A (with no apparent effect on epitope length for B or T cells) [53] No However, it must be taken into account that the NG06 and NG19 antigens of the present invention were designed containing other epitopes that can generate efficient immune responses, where the effect of these low-frequency substitutions on the immune response is unknown until now, and advantageously said substitutions are geographically limited. In addition, vaccine antigens could be generated, including variants circulating in specific regions.
  • RBD domain expressed in E. coli is capable of generating a cellular and humoral immune response leading to the production of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 [54].
  • lower neutralization titers are achieved using RBD compared to the ORF of the S1 subunit of the Spike protein [55], probably due to the unfolding and low purity (60%) of said immunogens.
  • including glycosylation sites in an antigen based prokaryotic expression platform would lead to the exposure of epitopes absent in the native domain of RBD, altering the immune response.
  • high purity and soluble NG06 protein was obtained through fusion to MBP, subsequent cleavage with TEV protease and purification by IMAC and SEC.
  • this strategy was not successful for NG19 protein, because we did not obtain enough antigen after proteolysis with TEV protease.
  • Other approaches to ensure refolding and soluble expression include additional fusion partners, longer hinges between fusion and antigens, or use of additives or purification strategies of inclusion bodies (IB).
  • the key element of the variation resides in the RBD domain of the Spike protein, where the epitopes that generate neutralizing antibodies have been mapped and that consist of the receptor binding motifs.
  • the adjuvanted proteins eNG19m (SEQ.ID.No.24) and eNG19m(20H) (SEQ.ID.No.25) were designed and expressed, which contain additional amino acids at the amino termini and carboxyl of the NG19 protein that allow them to be adjuvant antigens, where the eNG19m(20H) protein contains the following amino acid changes from the NG19 protein: K from position 417 to N, E from position 484 to K and N of position 501 by Y (see figure 11).
  • one of the additional modalities of the present invention is to provide polyvalent and/or multivalent vaccine compositions that comprise one or more immunogenic proteins of the invention, being capable of generating protective immunity against the original strain of the SARS- CoV-2, as well as against its variants SARS-CoV-2 B.1.1.7 (emerged in the United Kingdom) and SARS-CoV-2 B.1.351 (emerged in South Africa), for example comprising the proteins NG06, NG19 , eNG19m, eNG19m(20H) and a mixture thereof.
  • One of the modalities of the invention refers to the use of the proteins NG06, NG19, eNG19m, eNG19m(20H) and/or mixtures thereof to obtain vaccine compositions useful to prevent COVID19.
  • Another of the modalities of the invention refers to the use of the proteins NG06, NG19, eNG19m and/or eNG19m(20H) for the accurate diagnosis of COVID19, where said proteins are used to detect the presence of specific antibodies in biological samples of patients.
  • This modality also includes diagnostic kits or kits that comprise the NG06, NG19, eNG19m and/or eNG19m(20H) proteins for the diagnosis of COVID19.
  • Vaccine pharmaceutical compositions comprising the NG60, NG19, eNG19m, eNG19m(20H) proteins and mixtures thereof of the invention, as well as pharmaceutically acceptable excipients or vehicles are also considered within said modalities.
  • Another of the modalities of the invention refers to the production of the proteins NG06, NG19, eNG19m, eNG19m(20H) by means of genetic manipulation techniques and molecular biology in prokaryotic systems, which allows to substantially reduce the costs associated with their production. and substantially increases the yields in its production at scale.
  • Another of the modalities of the present invention refers to therapeutic methods for the prevention of COVID19, which comprise the administration of the vaccine compositions described here to patients who need it by means of suitable administration regimens.
  • the results of the present invention show that the vaccine compositions that comprise the NG06, NG19, eNG19m and/or eNG19m(20H) proteins described here are useful as a new therapeutic alternative to prevent COVID-19, so it is part of the modalities of the invention the use of said proteins to obtain the aforementioned vaccine compositions in order to be used to prevent COVID-19.
  • an embodiment of the invention is the adaptation of the active ingredients to be used in monovalent and/or polyvalent vaccine pharmaceutical compositions for enteral and/or parenteral administration, including inhalation and/or nasal administration.
  • the effective doses of the active ingredient for the patient will also be adjusted in accordance with preclinical and clinical studies, but based on the findings of the present invention.
  • Examples of pharmaceutically acceptable excipients that accompany the active ingredient of the invention are, for example, for oral administration as tablets, agents that include, for example, diluents, binders, stabilizers, bulking agents, thickening agents, such as povidone, cellulose microcrystalline, lactose, etc., disintegrating agents such as cross-linked carboxymethylcellulose, surfactants such as sodium lauryl sulfate, lubricating or slip agents such as magnesium stearate, colloidal silicon dioxide, etc., where said excipients can be formulated for preferably slow or prolonged release for a systemic effect.
  • Solutions for intravenous or intraperitoneal administration of the active ingredient can be prepared, dissolved first in an organic solvent such as DMSO, ethanol, or dimethylformamide and subsequently in aqueous buffers, such as PBS, as long as they are compatible with the proteins NG06, NG19, eNG19m and/or eNG19m(20H).
  • organic solvent such as DMSO, ethanol, or dimethylformamide
  • aqueous buffers such as PBS
  • compositions suitable for administration can be formulated, for example, and whose excipients can be selected, for example, from components compatible with said pharmaceutical form, for example of a lipid or peptide nature, and which can preferably be bound to the active ingredients of the invention to improve their bioavailability; blowing agents such as propane, butane, or permissible chlorofluorocarbons; pH regulators such as sulfuric acid; chelating agents such as EDTA.
  • the active ingredients can also be formed into micronized particles contained in gelatin capsules or in other systems known in the technical field, which help to release the active ingredient to its target site of action, for example, through solid pharmaceutical forms such as tablets or dragees.
  • the vaccine pharmaceutical compositions described herein can be obtained by combining the proteins NG06, NG19, eNG19m, eNG19m(20H) and/or mixtures thereof with pharmaceutically compatible carriers known in the art, in the quantities and /or corresponding concentrations as described herein, and compounds known in the art for obtaining said compositions may be included.
  • the administration of such compositions may be done depending on the patient's conditions, which will determine the doses and frequency of administration necessary to achieve an effective treatment of the condition in each particular case.
  • the invention provides pharmaceutical compositions comprising the proteins NG06, NG19, eNG19m, eNG19m(20H) and/or mixtures thereof, suitable for nasal administration.
  • compositions suitable for nasal administration include, but are not limited to, aqueous solutions, ointments, and gels.
  • a composition suitable for topical nasal administration can be in the form of an ointment or gel, in the form of a nasal spray to be potentially administered by means of an aerosol administration mechanism, for example, through through inhaler devices known in the art, or in the form of aqueous solutions to be administered by drops.
  • a person of ordinary skill in the technical field of the present invention would know how to prepare such compositions using techniques conventional in the art.
  • the NG06, NG19, eNG19m and/or eNG19m(20H) proteins and compositions comprising them are administered to the nasal mucous membrane of the patient affected by COVID-19.
  • any method known in the art can be used for the administration of said active ingredients to the nasal mucous membrane, where said active ingredients are preferably administered via the nasal route through drops or aerosols, which allows them to reach their site. action quickly and efficiently.
  • aqueous solutions comprising the proteins NG06, NG19, eNG19m and/or eNG19m(20H) can be administered to the patient affected by COVID-19 through the application of drops into the nasal cavity through the nostrils.
  • said aqueous solutions can be administered to the patient affected by COVID-19 through nasal application aerosols or by an aerosol administration mechanism through devices known in the art for this purpose, so that the aqueous solution comprising the NG06, NG19, eNG19m, and/or eNG19m(20H) proteins are sprayed into the respiratory tissue in a single or multiple ways, as needed by the patient.
  • the pharmaceutical compositions described herein in gel or ointment form can be administered nasally by topical application to one or more mucous membranes of the nasal cavity, as well as upper and lower respiratory tissues, including lung tissue.
  • the present invention comprises the nasal or intranasal administration of the compositions described herein.
  • the benefits of said administration include the precise delivery of the active ingredients to the target site of action, in this case the respiratory and lung tissue, a substantial increase in covering a greater surface of superficial tissue in the application, shorter nebulization times, reduction of systemic toxicity and accumulation of a higher concentration of drugs at the target site.
  • Quantities of the NG06, NG19, eNG19m, and/or eNG19m(20H) proteins can be rapidly delivered to respiratory tissue using nebulizers of various types, such as ultrasonic.
  • a greater portion of the dose administered by this route can be deposited very efficiently in the lung if necessary.
  • the parenteral application of the NG06, NG19, eNG19m and/or eNG19m(20H) proteins is one of the modalities of the present invention, where said route of administration provides obvious benefits in that a greater load of said active ingredients if necessary, thus avoiding the use of excipients and solvents that could hinder said administration by this route (for example, co-solvents and/or high-density solubilizers, extreme pH's, etc.), and using liquid and/or aqueous formulations that facilitate their administration through conventional devices known in the art, such as hypodermic needles that allow intravenous, intramuscular and/or subcutaneous administration.
  • excipients and solvents for example, co-solvents and/or high-density solubilizers, extreme pH's, etc.
  • liquid and/or aqueous formulations that facilitate their administration through conventional devices known in the art, such as hypodermic needles that allow intravenous, intramuscular and/or subcutaneous administration.
  • compositions described are available in such a way that they can be administered parenterally or intranasally, for example through the use of aerosols, in the same way as other active ingredients directed at the respiratory tissue, which they exert their activity directly on their site of action in an almost direct way.
  • the invention comprises the administration of the compositions described through the intranasal route, which allows their active ingredients to arrive more efficiently and in much less time than with parenteral administration, which is also possible.
  • the intranasal application of the NG06, NG19, eNG19m and/or eNG19m(20H) proteins described here generates protective effects very similar to when they are applied parenterally, generating an efficient local effect in the affected lung tissue. and an applicable route that turns out to be highly effective in patients affected by COVID-19, where said intranasal administration can be carried out, for example, through inhaler devices known in the art and that are already available on the market.
  • the present invention provides strong evidence that the NG06, NG19, eNG19m and/or eNG19m(20H) proteins described here work efficiently for the treatment of COVID-19 by different application routes, where at Like their parenteral administration, their intranasal administration generates a beneficial effect in stimulating the immune response, this being clear evidence that the NG06, NG19, eNG19m and/or eNG19m(20H) proteins described here provide a positive systemic protective effect of lung tissue in patients affected by COVID-19.
  • the present invention also includes prevention or prophylactic methods of COVID-19 that comprise administering to the patient in need, the NG06, NG19, eNG19m and/or eNG19m(20H) proteins, or compositions that comprise them in adequate concentrations that provide the desired therapeutic effect as described herein and with the corresponding dosage frequency and therapeutic regimen, either orally, parenterally and/or nasally, although parenteral administration is preferred.
  • said proteins NG06, NG19, eNG19m and/or eNG19m(20H) and the compositions that comprise them can be administered to the patient who requires it for the time and frequency that is necessary until adequate protection against the COVID19.
  • an effective treatment and dosage regimen applied to a patient may also depend on the patient's age, gender, height, weight, previous health status, etc., so that Considering said factors as well as the practices known in the art for it, the adequate dosage regimen for each case will be easily determined, as well as the amount for the administration of the NG06 and NG19 proteins and of the vaccine compositions that comprise them, with the in order to achieve the desired therapeutic result for the patient in need of treatment.
  • the proteins NG06, NG19, eNG19m, eNG19m(20H) and/or mixtures thereof described can be administered to the patient in doses that are adequate to exert their prophylactic effects, where the concentration in which they are administered comprises a range of 100-300 pg, preferably 100-200 pg, which can be administered parenterally.
  • a method for detecting the development of COVID19 in a human subject by detecting specific antibodies that recognize the NG06, NG19, eNG19m and/or eNG19m(20H) proteins in a biological sample of the subject includes obtaining a clinical sample from the human subject, and conducting one or more immunological tests on the clinical sample of said subject, detecting in it specific antibodies against the proteins NG06, NG19, eNG19m and/or eNG19m(20H) to detect the development or presence of the COVID19 in the subject.
  • the detection method described here comprises the steps of: a) Obtaining a tissue sample from the patient suspected of having COVID19 and processing said sample so that it has the appropriate conditions to be analyzed later.
  • any technique known in the art to obtain the sample from the patient can be used at this stage, such as nasal scraping or taking a blood sample to obtain serum.
  • This stage is part of a routine technique in pathology laboratories, which includes the incubation of the treated sample with precise dilutions of the anti-antibody, which allows the method of the invention to be adapted to routine laboratory methods. in a very agile way and also allows the amount of specific antibodies in the sample to be quantified, with which information is obtained on the degree of production of said antibodies in the subject, correlating this with the degree of evolution of the disease.
  • Add detection means that reveal the binding of the NG06, NG19, eNG19m and/or eNG19m(20H) proteins to the specific antibodies that recognize said proteins and that may be present in the patient's sample.
  • the detection of the signal produced indicates the presence of specific antibodies for the NG06, NG19, eNG19m and/or eNG19m(20H) proteins in the sample, which can be done visually or by detection systems for said proteins. well-known signs in art.
  • the detection of specific antibodies for the NG06, NG19, eNG19m and/or eNG19m(20H) proteins in the sample will indicate the presence of COVID19 in the analyzed patient, either in an early stage of development or in stages of development. more advanced; This will make it possible to detect the disease in a timely manner, provide adequate follow-up, monitoring and treatment to the diagnosed patient, substantially reducing the risk of developing COVID19 towards serious stages, such as Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS).
  • SARS Severe Acute Respiratory Syndrome
  • Immunological assays involving antigens include coating a surface with the proteins NG06, NG19, eNG19m and/or eNG19m(20H), in such a way that said proteins capture by affinity and binding specific antibodies of interest, where said surfaces can be plates of titration, membranes, chips, etc.
  • the antigen of interest can be, for example, the NG06, NG19, eNG19m and/or eNG19m(20H) proteins of the present invention or unique parts of the protein that allow their specific identification. After blocking the unbound parts of the surface, the clinical sample to be tested can be applied for binding with COVID19-specific antibody capture antigen, which can be detected by other primary anti-antibody.
  • the two primary antibodies or the pair of both capture and detection antibodies interact with the antigen of interest (sandwich).
  • the capture antibody may be the same or a different antibody than the detection antibody, as long as both antibodies can specifically bind to the antigen of interest.
  • the antigen-antibody complex formed can be detected by a second antibody which has affinity for the detection antibody, facilitating measurement by standard detection systems of immunological complexes using colorimetry, chemiluminescence, fluorescence or various types of substrates.
  • Final readings or visualizations can be made by instruments with appropriate light absorbance readers or directly by observation and compare the results with the control sample.
  • Positive results will indicate the binding of the antigen of interest to the primary antibody, the capture antibody and/or the detection antibody and therefore the presence of antibodies specific for the NG06 and NG 19 proteins in the clinical sample.
  • negative results will indicate the lack of binding of the antibodies of interest to the NG06, NG19, eNG19m and/or eNG19m(20H) proteins and therefore the absence of COVID19 in the patient under analysis.
  • One or more immunological assays can be used to detect at least three types of proteins of interest, including, but not limited to, antigen, antibody, and antigen/antibody immune complexes, among others.
  • the formats of one or more immunological assays may be microplate, membrane-based rapid test, protein chip, etc.
  • the principles of the assays are the same as described except for the detection systems that vary depending on the substrate chosen to analyze the results in different ways by a specific instrument designed for the assay.
  • the procedures, conditions, binding specificity, development of one type of immunological assay in one format may be adapted in a different format from the same or different immunological assay and/or different immunological assay of the same or different form.
  • One or more immunological assays according to the present invention lend themselves to using the NG06, NG19, eNG19m and/or eNG19m(20H) proteins, resulting in immunological assays with high sensitivity and specificity to detect the presence of specific polyclonal and/or monoclonal antibodies. for these proteins.
  • Such assays include, but are not limited to, protein chip assays, ELISA assays, Western blot assays, immune complex assays, radioimmunoprecipitation assays, rapid immunochromatographic membrane assays, and ICQ assays followed by flow cytometry. Likewise, these tests can be non-invasive with minimal or no additional instruments required.
  • antibody includes intact antibody molecules, as well as fragments thereof, such as Fab, F(ab)2 or CDR fragments which are capable of binding to NG06, NG19, eNG19m and/or proteins. or eNG19m(20H).
  • Blockers are added to ensure that non-specific proteins, proteases, or artifact substances present in the experimental sample under analysis do not bind with the antibodies or the labeled reporter antibody, which can lead to false-positive or false-negative results. Selection of blockers can therefore add substantial specificity to the assays described in the present invention.
  • a number of non-relevant (non-specific) antibodies of the same class or subclass of those used in the assays may be used as blockers.
  • the concentration of such blockers typically 1 to 100 pg/mL) can be important to maintain proper sensitivity and still inhibit any unwanted interference from proteins in the sample.
  • the present invention also provides a diagnostic kit to carry out the detection method of the invention, for example through ELISA or Western blot, to detect the protein.
  • the kit may include a blocking solution prior to the binding of the antibody to the NG06, NG19, eNG19m and/or eNG19m(20H) proteins, a blocking solution after the binding of the antibody to the NG06, NG19, eNG19m and/or eNG19m proteins (20H), a polyclonal anti-antibody as the first antibody, a second antibody, for example anti-mouse or anti-rabbit conjugated with peroxidase (HRP) or biotin or other agents that reveal the binding of the second antibody with the first antibody, as well as a solution containing appropriate agents used as substrates to detect the binding of the second antibody.
  • HRP peroxidase
  • the anti-polyclonal antibody can be, for example, a specific polyclonal antibody or a monoclonal antibody or a combination of said antibodies.
  • Said kit can be used to carry out an immunological assay, including but not limited to ELISA, assays with antigens for NG06, NG19, eNG19m and/or eNG19m(20H) proteins, antibody assays for antibodies against NG06, NG19, eNG19m and/or eNG19m(20H) proteins, assays for immune complexes of NG06, NG19, eNG19m and /o eNG19m(20H), protein chip assays, radioimmunoprecipitation assays, immunochromatographic assays, IHC of tissues and/or cells of the respiratory system, and immunocytological assays followed by flow cytometry, as well as combinations of such assays.
  • an immunological assay including but not limited to ELISA, assays with antigen
  • the detection of specific antibodies against the NG06, NG19, eNG19m and/or eNG19m(20H) proteins through immunological assays can be used in clinical inspections to detect COVID19 and can be done through a simple rapid test or through more complete tests involving the combination of several immunoassays, which significantly increases the sensitivity and accuracy of the screening test.
  • the invention comprises methods for obtaining the NG06, NG19, eNG19m and/or eNG19m(20H) proteins, which comprise cloning nucleic acid sequences encoding said proteins in cloning and/or expression vectors that allow their production in prokaryotic systems, for example Gram negative bacteria such as E. coli, and for example by obtaining said proteins in inclusion bodies, for their subsequent purification by methods known in the art and that allow, for example, the correct folding of said proteins obtained thereby conserving their antigenic properties.
  • prokaryotic systems are especially preferred, since said systems do not add carbohydrate residues in the obtained proteins, this being the fundamental characteristic of not adding carbohydrate residues to observe the antigenic effect of the NG06, NG19, eNG19m and/or eNG19m(20H) proteins of the invention.
  • the present invention comprises methods for obtaining specific hyperimmune plasmas and/or sera useful for the treatment of COVID19, which comprise immunization, for example, of animal models with the proteins NG06, NG19, eNG19m, eNG19m(20H) and/or mixtures thereof.
  • anti-COVID19 hyperimmune plasmas and/or serums that are effective for the treatment of the disease, which include antibodies that specifically recognize antigenic determinants of the SARS-CoV-2 virus and that allow its elimination, as well as neutralizing antibodies capable of suppressing the union of the virus with its receptor and consequently allow the effective treatment of COVID19, even in immunocompromised patients affected by the disease or with involvement of other organs.
  • antibodies that specifically recognize antigenic determinants of the SARS-CoV-2 virus and that allow its elimination as well as neutralizing antibodies capable of suppressing the union of the virus with its receptor and consequently allow the effective treatment of COVID19, even in immunocompromised patients affected by the disease or with involvement of other organs.
  • plasmas and/or or anti-COVID19 hyperimmune sera can be obtained by immunizing animal models with an immunologically effective amount of the NG06, NG19, eNG19m, eNG19m(20H) proteins and/or mixtures thereof, such as 100 to 300 pg, although higher amounts may be necessary to administer depending on the animal model to be inoculated and the immunization schedule determined, based on the immunization schedule described here and outlined in Figure 9.
  • the anti-COVID19 hyperimmune plasma and/or serum of the present invention procedures known in the art for obtaining plasma and/or serum can be used, such as, for example, those that use centrifugation to obtain the plasma and/or serum, or such as those that use selective separation by plasmapheresis, which are included in the scope of the present invention, although any method that allows obtaining the anti-COVID19 hyperimmune plasma and/or serum of the invention is also useful, such as for example the one reported by Wei [91]
  • the hyperimmune plasmas and/or sera produced by the proteins of the invention NG06, NG19, eNG19m, eNG19m(20H) and/or mixtures thereof will be capable of neutralize and be effective against the original viral strain from Wuhan as well as against the viral variants B.1.1.7 (English) and B.1.351 (South African), which have been reported to be found in various parts of the world, including Mexico and that may be more infective than the original viral strain, which may represent emergency treatment if necessary, since polyvalent anti-COVID19 hyperimmune plasma and/or sera would be obtained.
  • the present invention represents a viable alternative to provide effective immunotherapy with plasmas. and/or polyvalent anti-COVID19 hyperimmune sera for patients affected by COVID19 caused by said viral variants.
  • the physicochemical properties were calculated with the ProtParam tool from the ExPAsy server (https://web.expasy.org/protparam/) [28]
  • the prediction of antigenic sequences was determined using the Predicting Antigenic Peptides tool (http://imed. med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)[29].
  • Potential allergenicity was determined using AllerTOP v2.0 (http://www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP/) [24] and IgE epitope module mapping from the AlgPred server (https://webs.iiitd.
  • the pUC57 eRBD (SARS-CoV-2) RBD plasmid vector encoding SARS-CoV-2 RBD with optimized codon usage for expression in E. coli was used as a template. Oligonucleotides including the 5'-Ncol and 3'-Hindlll restriction sites (Table 1) were designed for subsequent cloning.
  • POR was performed in a final volume of 25 pL with 15.4 pL of sterile Milli-Q H2O, 2.5 pL of 10X Taq ex buffer, 2 pL of dNTPs (2.5 mM each), 2 pL of each oligonucleotide (10 pM), 0.1 pL of TaKaRa Ex Taq polymerase and 1 pL of plasmid DNA (10 ng/pL).
  • ORP conditions were initial denaturation at 94°C for 3 min, followed by 30 cycles at 94°C for 30 s, annealing at 60°C for 30 s, and extension at 72°C for 30 s, with a final extension at 72°C for 10 min.
  • PCR products were ligated into pCR8/GW/TOPO® (Invitrogen), transformed into E. coli MACHI-T1 cells and subsequently subcloned into pCrila (for NG06 and NG19) or pCr ⁇ 8a (for NG19 only) vectors.
  • pCrila for NG06 and NG19
  • pCr ⁇ 8a for NG19 only vectors.
  • the synthetic construction of the NG19 protein was used as a template to synthesize the variant sequences by PCR, using the oligonucleotides described in Table 2; Likewise, the frequent codon usage of E. coli was used to generate the final sequence.
  • Each gram of biomass obtained was resuspended in 10 ml of buffer A (20 mM NaH2P04, 0.5 M NaCl, 20 mM imidazole, 1 mM PMSF, 1 mM benzamidine hydrochloride, pH 7.4) and subsequently used by ultrasonication in an ice bath using a Homogenizing Ultrasonicator 500 at 150 W (4 min, 5 s for ultrasonication and 30 s for rest interval) (Cole-Parmer, Vernon Hills, IL). The lysate was centrifuged at 35,000 rpm for 30 min at 4°C.
  • the protein fractions were exchanged in buffer C (1 mM reduced glutathione, 1 mM oxidized glutathione, 25 mM Tris-HCI, 150 mM NaCl, pH 7.4); using a HiPrep 26/10 Desalting column (GE Healthcare).
  • the desalted fractions were combined, TEV enzyme (1:100 ratio) was added and the reaction mixture was incubated at 4°C for 16 h. After enzymatic cleavage, samples were further purified using a 5 mL HisTrap HP column.
  • the unbound fraction corresponding to the recombinant protein without fusion partner was concentrated in 0.5 mL with an Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (MWCO at 3000 kDa) (Millipore, USA) and loaded on a Superdex 75 10/ 300 GL (GE Healthcare) to perform size exclusion chromatography (SEC), which was equilibrated with 2 CV of buffer D (1X PBS) at a flow rate of 0.5 mL/min.
  • MWCO Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit
  • SEC size exclusion chromatography
  • Peripheral blood samples were obtained from the central artery before immunization (pre-immune serum), 15 and 30 days after the first immunization (hyperimmune serum), as well as from recovered COVID-19 patients.
  • pre-immune serum pre-immune serum
  • hyperimmune serum hyperimmune serum
  • recovered COVID-19 patients those who did not show symptoms of the disease 2-4 weeks after a positive RT-qPCR result.
  • RT-qPCR was carried out according to the Berlin Protocol for the detection of SARS-CoV-2 [40]. Blood samples were centrifuged at 2000 rpm for 5 min. the sera of recovered COVID-19 patients were thermally inactivated at 56°C for 30 min in order to minimize exposure to SARS-CoV-2 in subsequent evaluations.
  • Serum samples were diluted in PBST (1:50-1:106 for rabbit samples and 1:5000 for human samples) using 100 pL/well and incubated for 1 h at 37°C. Preimmune or PCR negative sera were used as negative controls. Plates were washed 3 times with PBST and Goat Anti-Rabbit IgG-HRP (Sigma-Aldrich) or Goat Anti-Human IgG (H+L) HRP (Thermo Fisher Scientific) secondary antibodies were used at 1:2000 and 1:5000, respectively. The plates were incubated at 37°C for 1 h.
  • TMB 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine
  • Example 2 Antigen design based on a non-glycosylated domain within the RDB of the Spike protein.
  • the Spike protein has been described as a target of the humoral immune response, considering its location in the viral particle and due to experimental evidence of its high antigenicity.
  • the receptor binding domain (RBD) is found between residues R319 to F541 in the S protein, while the receptor binding motif (RBM) has been mapped between residues N437 to Y508, where no binding sites have been observed. N-glycosylation or O-glycosylation, and antibodies map to this region.
  • Two non-glycosylated (NG) antigens were designed taking into account the non-glycosylated regions of RBD: NG19 located at S371-F541 and NG06 located between S438-N487 ( Figure 1).
  • the mean antigenic propensity analysis of NG06 was 0.9964 with two antigenic determinants (YNYLYRL (SEQ.ID.No.11) and STEIYQAGS (SEQ.ID.No.12)), whereas for NG19, the mean antigenic propensity was from 1.0401 with 7 antigenic determinants (ASASFSTFKCYGVSP (SEQ.ID.No.13), KLNDLCFTNVYADSFVIR (SEQ.ID.No.14), DFTGCVIA (SEQ.ID.No.15), YNYLYRL (SEQ.ID.No.16) , STEIYQAGS (SEQ.ID.No.17), EGFNCYFPLQSYG (SEQ.ID.No.18) and VGYQPYRWVLSFELLHAPATVCGP (SEQ.ID.No.19)).
  • Panel A shows the location of NG6, where a 90° turn locates the selected NG06 in the central region.
  • Panel B shows NG19, also located in the apical region, but distributed on the surface and in the Spike lateral trimeric structure.
  • Both NG06 and NG19 are hydrophilic, with a theoretical isoelectric point of 8.1 and 8.6, respectively, and a predicted index of high stability (Table 3).
  • Table 3 Primary structure and physicochemical properties of the vaccine antigenic candidates.
  • Example 3 Antigen expression in a heterologous system.
  • the pCrila expression vector allows the expression of proteins translationally fused to maltose binding protein (MBP), which increases the solubility of the resulting fusion peptide, and the addition of a histidine tag (His 6X) in the N region. -terminal. MBP and its His-Tag domain can be cleaved by digestion with TEV protease to obtain peptides NG6 and NG19.
  • the antigens expressed in E. coli SEQ.ID.No.7 and SEQ.ID.No.8) were affinity purified using nickel columns. Soluble and purified proteins were digested with TEV protease and finally purified by size exclusion chromatography (SEC).
  • FIG. 6 shows the Trice-SDS-PAGE gels containing the chromatographic steps to purify the antigens. NG06 and NG19 were able to form a homodimer under non-reducing conditions.
  • Figures 7 and 8 show the chromatographic purification steps of the NG06 and NG19 proteins.
  • the antigen produced was induced by IPTG, representing 30% of the total protein of recombinant E. coli (figure 12), which could be purified to 98% purity by washing inclusion bodies. and subsequent purification on a cation exchange column.
  • Example 4 Immunization of rabbits.
  • the antigens were used in immunization schemes for the production of rabbit antibodies (FIG. 9A).
  • the NG06 and NG19 antigens were administered subcutaneously and intramuscularly to two female New Zealand rabbits.
  • IgG quantification by immune plasma revealed the recognition of the recombinant antigens of the invention in a serum dilution of 1 to 106; however, a higher titer was observed when NG19 was used. Both antigens evoked a more efficient response when a second inoculation was used ( Figure 9B and 9C).
  • IgGs from recovered COVID-19 patients recognize the recombinant antigens NG06, NG19 and eNG19m of the invention.
  • IgGs from recovered COVID-19 patient sera showed affinity (at a dilution of 1:5000) to the recombinant NG06 and NG19 antigens of the invention by indirect ELISA assays.
  • an A450 nm of 0.13 ⁇ 0.08 and 0.11 ⁇ 0.08 was obtained in the control group with both antigens.

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Abstract

La invención describe vacunas útiles para la prevención de la C0VID19, donde se diseñaron y expresaron antígenos recombinantes de dominios no glicosilados en la región S-RBD codificados en el genoma del virus SARS-CoV-2, tanto de la cepa viral original de Wuhan como de las cepas virales variantes B.1.1.7 (inglesa) y B.1.351 (sudafricana). Los antígenos purificados de la invención fueron capaces de inducir la producción de anticuerpos policlonales en animales, así como una fuerte respuesta inmune incluso mediante su administración nasal y/o intranasal; así mismo, se detectaron anticuerpos IgG en sueros de pacientes COVID-19 recuperados que reconocen dichos antígenos. La invención destaca la utilidad de los antígenos basados en la región no N-glicosilada de RBD de SARS- CoV-2 para el desarrollo de vacunas monovalentes y/o polivalentes efectivas contra la COVID-19, para el diagnóstico de dicha enfermedad, así como para su prevención e inmunoterapia mediante la producción y uso de plasmas y/o sueros hiperinmunes anti-COVID19 monovalentes y/o polivalentes.

Description

Vacunas para prevenir la C0VID19 basadas en sitios no glicosilados del dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína S del virus SARS-CoV-2
Campo de la invención.
La presente invención se relaciona con el desarrollo de vacunas para prevenir enfermedades, particularmente con vacunas para prevenir la COVID19 utilizando proteínas inmunogénicas del virus SARS-CoV-2, principalmente utilizando proteínas del dominio de unión al receptor (RBD) del virus, sin sitios de glicosilación y con propiedades inmunogénicas.
Antecedentes de la invención.
La familia Coronaviridae comprende varios virus que pueden causar enfermedades humanas que van desde el resfriado común hasta manifestaciones clínicas graves como el Síndrome Respiratorio del Medio Este (MERS-CoV), el Síndrome Respiratorio Agudo Severo (SARS-CoV) y el COVID-19 (SARS-CoV-2) [1 ,2] Los coronavirus SARS-CoV y SARS-CoV-2 emplean la proteína Spike (S) para entrar en las células huésped a través de la interacción con la enzima convertidora de angiotensina (ACE2) [3,4] La proteína S es la proteína de fusión viral de tipo 1 más grande conocida, y contiene 22 sitios canónicos de N-glicosilación (N-X-S/T, donde X¹P), así como 33 sitios de O-glicosilación [5-9] que podrían mejorar la infectividad [10] Esto afecta la capacidad del huésped para desarrollar una respuesta inmune adaptativa eficaz [11], o probablemente causa enmascaramiento de epítopos [12], como se ha reportado para otras proteínas virales tales como la proteína de la envoltura (ENV) del HIV [13], la glicoproteína 1 (GP1) del virus del ébola [14], la hemaglutinina (HA) del virus de influenza [15], el complejo de glicoproteína del virus Lassa (LASV GPC) [16] y, curiosamente, la proteína NL63 S de coronavirus [17]
La proteína S del virus SARS-CoV-2 posee N-glicosilaciones que pueden clasificarse como complejas (55%), con alto contenido de mañosa (28%) o híbridas (17%), que cubren aproximadamente el 40% de su superficie [18,19] La proteína S también tiene una estructura homotrimérica típica de coronavirus, donde cada monómero consiste de un péptido señal (SP), subunidades S1 y S2 (la primera responsable de la unión a receptores y la segunda con una función de anclaje a la membrana viral), un dominio transmembranal (TM) y un dominio intracelular (IC) [20] La subunidad S1 contiene el dominio de unión al receptor (RBD) y dentro de él, el motivo de unión al receptor (RBM). RBD tiene un total de 4 puentes disulfuro [21] y 3 sitios de N-glicosilación: dos verificados experimentalmente (N331 y N343), y un tercero pronosticado (N370) según las comparaciones con RBD de SARS-CoV. También se han encontrado experimentalmente cuatro sitios de O-glicosilación (T323, S325, T333 y T345) [6,8]
La proteína S ha sido propuesta como un elemento clave para el desarrollo de antígenos con potencial profiláctico y para el inmunodiagnóstico de la COVID19, teniendo en cuenta la presencia de RBD y su papel en la entrada del virus en las células huésped. Si se pudieran generar anticuerpos contra la RBD, potencialmente impediría la entrada del virus y permitiría una respuesta inmune humoral y celular para inactivar las partículas virales [22] Además, el uso de la proteína S de longitud completa de SARS-CoV como una vacuna protectora, utilizando el virus Vaccinia Ankara recombinante modificado (rMVA), indujo una fuerte respuesta inflamatoria en tejidos hepáticos de hurones [23], mientras que en modelos macacos la producción de IgG anti-spike SARS-CoV en los pulmones infectados es responsable de una lesión pulmonar aguda por un sesgo en la respuesta que resuelve la inflamación [24] El uso de RBD de SARS-CoV como antígeno prometedor ha demostrado la inducción de anticuerpos neutralizantes, así como el reconocimiento por anticuerpos presentes en el suero de pacientes convalecientes [3,25] Actualmente, los laboratorios farmacéuticos se centran en la producción de diferentes versiones de la proteína S expresadas en sistemas eucarióticos, incluidas las vacunas subunidad basadas en RBD contra SARS-CoV-2 [26]
Hasta el momento, se han reportado múltiples propuestas de vacunas para prevenir la infección por el virus SARS-CoV-2, dentro de las cuales mencionamos a continuación algunas de ellas:
Park y col. [62] describen vacunas basadas en el virus de Newcastle de aplicación nasal utilizando una proteína S recombinante del virus SARS-CoV-2, la cual induce en hámsters altos niveles de anticuerpos neutralizantes IgA e lgG2a y es capaz de bloquear el virus en los pulmones dentro de los primeros 4 días después de la vacunación.
Wang [63] describe una composición vacunal que comprende RNAm codificante para la proteína S del virus SARS-CoV-2, el cual fue modificado mediante optimización de codones y que es administrado utilizando como vector el virus TC83 de la encefalitis equina de Venezuela, la cual induce en animales la producción de anticuerpos 14 días después de su administración. Lee y col. [64] describen la producción y purificación del antígeno recombinante RBD219-N1C1 el cual induce en ratones una respuesta robusta de anticuerpos neutralizantes en contra del virus SARS- CoV-2.
Walsh y col. [65] describen el efecto de las vacunas BNT162b1 que codifica la proteína trimerizada de la proteína RBD del virus SARS-CoV-2 y BNT162b2 que codifica la proteína Spike completa anclada a la membrana y estabilizada en su conformación, ambas vacunas basadas en RNAm. Dichas vacunas fueron utilizadas en estudios clínicos fase 1 en EUA, obteniéndose resultados acerca de su seguridad e inducción de inmunogenicidad en jóvenes y adultos, lo que refuerza su potencial uso para realizar las posteriores fases cínicas 2 y 3.
Norheim y col. [66] describen vacunas de bajo costo basadas en plásmidos de DNA que codifican homodímeros de una unidad blanco que une receptores de quimosina que inducen presentación de antígeno en conjunción con la proteína RBD del virus SARS-CoV-2. Dicha vacuna induce en ratones una respuesta inmune robusta y dosis dependiente de anticuerpos IgG que persiste durante 3 meses posteriores a su administración detectándose anticuerpos neutralizantes contra el virus desde el día 7 posterior a su administración y una respuesta de células T contra el virus.
Guirakhoo y col. [67] describen la vacuna UB-612 multiepítope y multiproteica contra el virus SARS- CoV-2. Dicha vacuna induce en animales una gran cantidad de anticuerpos neutralizantes y una amplia respuesta de células T contra el virus, la cual comprende una proteína de fusión S1-RBD y 6 péptidos sintéticos derivados de péptidos del virus. Dicha vacuna ha mostrado seguridad y efectividad en primates y en fase clínica 1 en humanos realizada en Taiwán.
Sun y col. [68] describen la producción de una vacuna subunidad recombinante (RBD-Fc Vacc) contra el virus SARS-CoV-2 que comprende una proteína recombinante formada de la proteína RBD del virus fusionada con el dominio Fe de la lgG1 humana, la cual induce anticuerpos neutralizantes específicos en primates y en ratones transgénicos para ACE2 humana y que muestra neutralización de 3 diversas cepas del virus SARS-CoV-2.
Finalmente, Ma y col. [69] describen vacunas contra el virus SARS-CoV-2 basadas en nanopartículas que contienen 24mer-ferritina conjugada a la proteína RBD del virus, las cuales inducen una respuesta inmune robusta y de anticuerpos neutralizantes contra el virus cuando se compara con vacunas que contienen monómeros.
Sin embargo, las vacunas anteriores no consideran per se sitios que no estén glicosilados en la proteína RBD para el diseño de vacunas efectivas contra la enfermedad; así mismo algunas de ellas utilizan vectores virales para su administración.
Por lo anterior, es evidente que sigue siendo necesario contar con mayores y mejores soluciones terapéuticas para la prevención y tratamiento profiláctico de la COVID19.
Breve descripción de las figuras.
Figura 1. Se muestra un diagrama esquemático de los antígenos propuestos por la invención como candidatos vacunales contra el SARS-CoV-2 bajo una plataforma de expresión basada en E. coli. Se observa péptido de señal (SP), Subunidad 1 (S1), Subunidad 2 (S2), Dominio transmembranal (TM), Dominio intracelular (IC), Sitio de unión al receptor (RBD), motivo de unión al receptor (RBM). NG19: proteína No glicosilada de19 kDa. NG06: proteína No glicosilada de 6 kDa. Los corchetes que unen las regiones en RDB corresponden a puentes disulfuro descritos anteriormente.
Figura 2. Se muestra la predicción de la estructura secundaria para NG06 (A) y NG19 (B)
Figura 3. Se muestra la estructura de los antígenos NG06 y NG19. Se observa A) Región NG06 resaltada en la región Spike ORF, B) Región NG19 resaltada en el Spike ORF. Estructura tridimensional predicha de novo para los péptidos NG6 (C) y NG19 (D). En Ay B, cada monómero se muestra en diferentes tonos de azul y las regiones NG06 y NG19 dentro del RBD (estado abierto en rojo y estado cerrado en rosa).
Figura 4. Se muestra la validación de modelos tridimensionales de NG06 (A) y NG19 (B) utilizando los valores Z-Score y de calidad local para NG06 (C) y NG19 (D)
Figura 5. Se muestran las gráficas Ramachandran para la validación de las estructuras predichas de novo para las proteínas NG06 (A) y NG19 (B).
Figura 6. Se muestran los pasos de purificación de las proteínas NG06 (A) y NG19 (B) e inmunodetección por Western blot (C). Línea 1A, 1 B y 1C: Marcador de peso molecular, Línea 2A y 2B: fracción total, Línea 3A y 3B: fracción insoluble, Línea 4A y 4B: fracción soluble, Línea 5A y 5B: fracción no unida obtenida tras la purificación por IMAC, Línea 6Ay Línea 6B: fracción unida obtenida después de la purificación por IMAC, Línea 7A: fracción unida después del segundo IMAC, Línea 7B: Replegado/fracción SEC, Línea 8A: fracción no unida después del segundo IMAC, Línea 2C y 8B: fracción obtenida después de SEC. Línea 3C: Inmunodetección por Western blot empleando NG19 como antígeno y suero inmunizado con NG06.
Figura 7. Se muestran los pasos cromatográficos a través de FLPC para la purificación de NG06. Se observa A) cromatograma IMAC inicial para NG06. B) Cromatograma de intercambio de buffer para NG06 C) Cromatograma IMAC para NG06 después del corte con la enzima TEV. D) Intercambio final del buffer para la purificación de NG06.
Figura 8. Se muestran los pasos cromatográficos a través de FLPC para la purificación de NG19. Se observa A) cromatograma ¡MAC inicial para NG19. B) Cromatograma SEC-replegado para NG19 Figura 9. Se muestra que las proteínas NG06 y NG19 provocan respuestas inmunes en conejos. Se observa A) esquema de inmunización de conejos con los antígenos NG06 y NG19. (B-C) Titulación indirecta por ELISA de sueros pre-inmunes e hiperinmunes utilizando los antígenos NG06 (B) y NG19 (C). CBC: Conteo sanguíneo completo.
Figura 10 Se muestra la respuesta de IgGs en pacientes positivos a SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2 (+), rojo) y sujetos sanos (SARS-CoV-2 (-), azul) contra los antígenos recombinantes NG06 (A) y NG19 (B). Los datos se presentan como la media de los valores de DO por triplicado por sujeto. Cada punto representa un sujeto y las barras horizontales corresponden a los valores medios con SD.
Figura 11. Se muestran las secuencias antigénicas de la invención. Se observa A) la proteína NG06 (SEQ.ID.No.1) y su secuencia codificadora de DNA (SEQ.ID.No.3), B) la proteína NG19 (SEQ.ID.No.2) y su secuencia codificadora de DNA (SEQ.ID.No.5), C) la proteína eNG19m (SEQ.ID.No.24) y su secuencia codificadora de DNA (SEQ.ID.No.26) y D) la proteína eNG19m(20H) (SEQ.ID.No.25) y su secuencia codificadora de DNA (SEQ.ID.No.28). Se indican los aminoácidos y nucleótidos correspondientes a His-Tag (azul), provenientes de la proteína de unión a maltosa (MBP)(verde), correspondientes al sitio de corte de la enzima TEV (violeta), adicionales provenientes del vector (rojo), correspondientes al adyuvante (rojo doble subrayado), cambios en los aminoácidos de la secuencia NG19 (cuadros azules) y los correspondientes a los antígenos de la invención (subrayados).
Figura 12. Se muestra la A) expresión en E. coli y B) purificación de la proteína eNG19m(20H). Se indica con una flecha la proteína obtenida y purificada.
Figura 13. Se muestra el reconocimiento de la proteína eNG19m por sueros de pacientes COVID-19 recuperados (P) e individuos sanos (C). Se sensibilizaron pozos de placas de ELISA con 100 ng de la proteína; los pacientes COVID fueron evaluados por la presencia de SARS-CoV-2 con PCR tiempo real. Dilución del suero: 1/5000; dilución del anticuerpo secundario: 1/5000
Descripción detallada de la invención.
La presente invención proporciona vacunas para prevenir la COVID19, basadas en proteínas inmunogénicas del virus SARS-CoV-2, principalmente utilizando proteínas del dominio de unión al receptor (RBD) del virus, sin sitios de glicosilación y con propiedades inmunogénicas.
Teniendo en cuenta que no hay sitios de glicosilación en las regiones media y C-terminal de RBD y que se han reportado varios anticuerpos neutralizantes que mapean esta región, en la presente invención evaluamos la utilidad de dos regiones no glicosiladas de RBD del SARS-CoV-2 que expresamos en Escherichia coli. Usando estos antígenos para ensayos de inmunización en conejo, pudimos detectar títulos altos de IgGs, así como detectar IgGs en sueros de pacientes afectados con COVID-19. Conforme a la presente invención, estos péptidos se proponen para el diseño de vacunas y aplicaciones terapéuticas.
El dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína Spike (S) del Coronavirus 2 del Síndrome Respiratorio Agudo Severo (SARS-CoV-2) tiene sitios de glicosilación que pueden limitar la producción de antígenos confiables expresados en plataformas procarióticas, debido a la evasión mediada por glicanos de la respuesta inmune del huésped. Sin embargo, las regiones proteicas sin residuos glicosilados capaces de inducir anticuerpos neutralizantes, podrían ser útiles para la producción de antígenos en sistemas que no poseen la maquinaria de glicosilación. Para probar esta hipótesis y de acuerdo con la presente invención, los antígenos potenciales NG06 (SEQ.ID.No.1) y NG19 (SEQ.ID.No.2) ubicados en la región S-RBD no glicosilada, fueron seleccionados y expresados en Escherichia coli, purificados por FPLC, y empleados para determinar su potencial inmunogénico mediante la detección de anticuerpos en el suero de conejos inmunizados y pacientes COVID-19. De acuerdo con la invención, los antígenos purificados fueron capaces de aumentar los anticuerpos policlonales en conejos evocando una fuerte respuesta inmune. Además, detectamos anticuerpos IgG en sueros de pacientes COVID-19 recuperados. La presente invención destaca la utilidad de los antígenos basados en la región no N-glicosilada de RBD de SARS-CoV-2 para el desarrollo de vacunas, así como para la inmunoterapia. La región de la proteína S con los epítopos más expuestos comprende la zona apical del dominio RBD en su conformación abierta [19] De acuerdo con la presente invención, diseñamos los antígenos NG06 y NG19 en esta región donde el virus no puede explotar la estrategia de escudo de glicano o la deriva genética sin disminuir su aptitud. De esta manera y acorde con la presente invención, los péptidos seleccionados pueden ser eficaces como antígenos protectores, siempre y cuando el virus continúe reconociendo el receptor ACE2 para mediar la entrada en las células. Además, la mayoría de los anticuerpos neutralizantes descritos anteriormente tales como CR3022 [41], DB-368-2 [42], 47D11 [43], B38 y H4 [44] se han encontrado mapeando NG06 y NG19, con patrones similares para la proteína S de SARS-CoV, MERS-CoV y SARS-CoV-2.
Conforme a la presente invención, las proteínas NG06 y NG19 que han perdido la modificación post- traduccional consistente en glicanos, podrían no evocar la producción de auto-anticuerpos que se producen en la infección con SARS-CoV-2 [45], apuntando entonces a moléculas como los carbohidratos del huésped (por ejemplo, gangliósidos) que causan síndromes neuropáticos tales como el Guillain-Barré o Miller Fisher [46-48] De hecho, se ha reportado un caso de mielitis transversa en un paciente voluntario inmunizado contra el SARS-CoV-2, donde el agente protector era una vacuna basada en adenovirus que contenía el ORF glicosilado de la proteína S en su superficie [49,50] Las proteínas NG06 y NG19 también podrían ser útiles para inmunodiagnóstico, ya que la presencia de anticuerpos sobre estas regiones se correlaciona con la presencia de anticuerpos anti-RBD neutralizantes que no reconocen el glicano. Este tipo de anticuerpos dirigidos a glicanos es común en enfermedades autoinmunes o infecciones virales causadas por Citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, virus de la hepatitis E, virus de influenza A y el virus del Zika [51 ,52]
Una limitación de los antígenos generalmente propuestos como vacunas protectoras antes de la presente invención es que no abarcan todas las variantes virales que circulan en la población. Se han notificado dos sustituciones de baja frecuencia mapeando a NG06 y NG19: G476S (que podría acortar la longitud de un epítopo lineal de células B) y V483A (sin efecto aparente sobre la longitud del epítopo para células B o T) [53] Sin embargo, hay que tener en cuenta que los antígenos NG06 y NG19 de la presente invención fueron diseñados conteniendo otros epítopos que pueden generar respuestas inmunes eficientes, donde el efecto de estas sustituciones de baja frecuencia en la respuesta inmune es hasta ahora desconocido, y ventajosamente dichas sustituciones son limitadas geográficamente. Además, podrían generarse antígenos vacunales, incluyendo las variantes circulantes en regiones específicas.
Se ha demostrado que el dominio RBD expresado en E. coli es capaz de generar una respuesta inmune celular y humoral que conduce a la producción de anticuerpos neutralizantes contra el SARS- CoV-2 [54] Sin embargo, títulos menores de neutralización se logran utilizando RBD en comparación con el ORF de la subunidad S1 de la proteína Spike [55], probablemente debido al desplegamiento y baja pureza (60%) de dichos inmunógenos. Además, incluir sitios de glicosilación en un antígeno basado en una plataforma de expresión procariótica conduciría a la exposición de epítopos ausentes en el dominio nativo de RBD, alterando la respuesta inmune.
De acuerdo con la presente invención, la proteína NG06 soluble y de alta pureza se obtuvo a través de una fusión a MBP, posterior corte con TEV proteasa y purificación por IMAC y SEC. Sin embargo, esta estrategia no tuvo éxito para la proteína NG19, porque no obtuvimos suficiente antígeno después de la proteólisis con TEV proteasa. Establecimos la hipótesis de que en la estructura tridimensional de MBP-NG19 el sitio de corte podría ser inaccesible debido a un obstáculo estérico [56] Otros enfoques para garantizar el replegado y la expresión soluble incluyen socios de fusión adicionales, bisagras más largas entre socios de fusión y antígenos, o bien uso de aditivos o estrategias de purificación de cuerpos de inclusión (IB). Evaluamos sin éxito la expresión de NG19 fusionada con las proteínas GST y TrxA (datos no mostrados), en comparación con la observada para TrxA-RBD de SARS-CoV [57], debido probablemente a diferencias en la estructura primaria y secundaria que podrían afectar la solubilidad de RBD de SARS-CoV-2. Decidimos entonces utilizar IB para producir el antígeno replegado y soluble empleando metodologías de purificación y plegado previamente descritas en el arte.
La inmunización de conejos con RBD de SARS-CoV-2 ha demostrado una mejor producción de IgGs de alta afinidad con altos títulos de neutralización. El 85% de los epítopos reconocidos por estos IgGs provocados por RBD se encuentran al menos parcialmente en las regiones antigénicas seleccionadas para NG19 y NG06 [58] Se han obtenido resultados similares en otro estudio en el que el RBD se utilizó como antígeno vacunal en ensayos de inmunización con primates no humanos [59] Además, actualmente hay más de diez iniciativas de vacunas basadas en RBD, algunas de las cuales ya están en ensayos clínicos [60,61] Nuestros resultados demuestran que ambas proteínas NG06 y NG19 pueden ser reconocidas por IgGs específicos de pacientes COVID-19 recuperados. Por último, cabe destacar que el uso de antígenos producidos en E. coli reduce los costos de fabricación, lo que es un factor importante en la lucha actual contra el SARS-CoV-2.
Variantes del aislado original SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 están circulando actualmente a nivel mundial. Estas nuevas variantes surgieron en el otoño de 2020, de las cuales destacan:
• En el Reino Unido surgió la variante 20I / 501Y.V1 , VOC 202012/01 o B.1.1.7, que contiene diferentes mutaciones. Desde entonces, esta variante se ha detectado en numerosos países de todo el mundo, incluido México. En enero de 2021 , científicos del Reino Unido publicaron evidencias que sugieren que la variante B.1.1.7 puede estar asociada con un mayor riesgo de muerte en comparación con otras variantes. Se necesitan más estudios para confirmar este hallazgo.
• En Sudáfrica, surgió otra variante de SARS-CoV-2, conocida como 20H / 501Y.V2 o B.1 .351 , y es independiente de B.1.1 .7. Esta variante comparte algunas mutaciones con B.1 .1.7 y se ha detectado en Europa central. La vacunación con la vacuna desarrollada por Oxford Astra Zeneca y que emplea la proteína Spike, donde están presentes las mutaciones, no protege de esta nueva variante sudafricana, por lo cual es muy importante generar vacunas multivalentes que permitan evocar anticuerpos neutralizantes.
A pesar de tener orígenes evolutivos diferentes, evidenciado mediante el cálculo de filogenias con los genomas completos, el elemento clave de la variación reside en el dominio RBD de la proteína Spike, donde se han mapeado los epítopes que generan anticuerpos neutralizantes y que consisten en los motifs de unión al receptor.
Por ello y conforme a la presente invención, es posible generar tres cambios en el dominio RBD de la proteína Spike para contener los diferentes cambios identificados en las variantes B.1.1.7 y B.1.351 mencionadas anteriormente, generando proteínas que pueden ser utilizadas en la obtención de composiciones vacunales polivalentes y/o multivalentes, capaces de proveer de protección inmunológica en contra de las variantes mencionadas.
Para ese fin y acorde con la presente invención, se diseñaron y expresaron las proteínas adyuvadas eNG19m (SEQ.ID.No.24) y eNG19m(20H) (SEQ.ID.No.25) las cuales contienen aminoácidos adicionales en los extremos amino y carboxilo de la proteína NG19 que les permiten ser antígenos adyuvados, donde la proteína eNG19m(20H) contiene los siguientes cambios de aminoácidos a partir de la proteína NG19: K de la posición 417 por N, E de la posición 484 por K y N de la posición 501 por Y (ver figura 11).
Acorde con lo anterior, una de las modalidades adicionales de la presente invención es proveer composiciones vacunales polivalentes y/o multivalentes que comprendan una o más proteínas inmunogénicas de la invención, siendo capaces de generar inmunidad protectora en contra de la cepa original del virus SARS-CoV-2, así como en contra de sus variantes SARS-CoV-2 B.1 .1.7 (surgida en Reino Unido) y SARS-CoV-2 B.1.351 (surgida en Sudáfrica), por ejemplo comprendiendo las proteínas NG06, NG19, eNG19m, eNG19m(20H) y una mezcla de las mismas.
Una de las modalidades de la invención se refiere al uso de las proteínas NG06, NG19, eNG19m, eNG19m(20H) y/o mezclas de las mismas para obtener composiciones vacunales útiles para prevenir la COVID19.
Otra de las modalidades de la invención se refiere al uso de las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H) para el diagnóstico certero de la COVID19, donde dichas proteínas se utilizan para detectar la presencia de anticuerpos específicos en muestras biológicas de pacientes. En dicha modalidad también quedan comprendidos kits o estuches diagnósticos que comprenden las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H) para el diagnóstico de COVID19.
Son también modalidades de la invención las composiciones farmacéuticas vacunales que comprenden las proteínas NG60, NG19, eNG19m, eNG19m(20H) y mezclas de las mismas de la invención, así como excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables están también considerados dentro de dichas modalidades.
Otra de las modalidades de la invención se refiere a la producción de las proteínas NG06, NG19, eNG19m, eNG19m(20H) mediante técnicas de manipulación genética y biología molecular en sistemas procariontes, lo que permite reducir de manera sustantiva los costos asociados a su producción e incrementa sustantivamente los rendimientos en su producción a escala.
Otra de las modalidades de la presente invención se refiere a métodos terapéuticos para la prevención de la COVID19, que comprenden la administración de las composiciones vacunales descritas aquí a pacientes que lo necesiten mediante regímenes de administración adecuados.
Los resultados de la presente invención muestran que las composiciones vacunales que comprenden las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H) descritas aquí son útiles como una nueva alternativa terapéutica para prevenir la COVID-19, por lo que es parte de las modalidades de la invención el uso de dichas proteínas para la obtención de las composiciones vacunales mencionadas con el fin de usarse para prevenir la COVID-19.
Por lo tanto, es objeto de la invención proveer de composiciones farmacéuticas vacunales que comprendan las proteínas NG06, NG19, eNG19m, eNG19m(20H) y mezclas de las mismas como principios activos junto con excipientes farmacéuticamente aceptables y adecuados para ser administrados al paciente que lo requiera. Es modalidad de la invención la adaptación de los principios activos para utilizarse en composiciones farmacéuticas vacunales monovalentes y/o polivalentes para administración enteral y/o parenteral, incluyendo la inhalación y/o administración vía nasal. Las dosis efectivas del principio activo para el paciente serán también ajustadas de conformidad con estudios preclínicos y clínicos procedentes, pero tomando como base los hallazgos de la presente invención. Ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables que acompañen al principio activo de la invención son por ejemplo, para la administración oral como tabletas o comprimidos, agentes que comprenden por ejemplo, diluyentes, aglutinantes, estabilizantes, agentes de carga, agentes espesantes, tales como povidona, celulosa microcristalina, lactosa, etc., agentes desintegrantes tales como por ejemplo carboximetilcelulosa entrecruzada, surfactantes como por ejemplo, laurilsulfato de sodio, agentes lubricantes o deslizantes como por ejemplo estearato de magnesio, dióxido de silicio coloidal, etc., donde dichos excipientes pueden ser formulados para liberación preferentemente lenta o prolongada para un efecto sistémico.
Se pueden preparar soluciones para administración intravenosa o intraperitoneal del principio activo disueltos primero en un solvente orgánico como DMSO, etanol, o dimetilformamida y subsecuentemente en buffers acuosos, como PBS, siempre y cuando sean compatibles con las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H).
Se tiene especial preferencia por las formas farmacéuticas vacunales diseñadas para la administración parenteral donde se pueden formular composiciones adecuadas para su administración por ejemplo, y cuyos excipientes pueden seleccionarse por ejemplo, de componentes compatibles con dicha forma farmacéutica, por ejemplo de naturaleza lipídica o peptídica, y que de preferencia puedan quedar unidos a los principios activos de la invención para mejorar su biodisponibilidad; agentes propulsores como por ejemplo, propano, butano, o clorofluorocarbonos permisibles; reguladores de pH como por ejemplo, ácido sulfúrico; agentes quelantes como por ejemplo, EDTA. También se pueden conformar los principios activos en partículas micronizadas contenidas en cápsulas de gelatina o en otros sistemas conocidos en el campo técnico, que ayuden a liberar el principio activo a su sitio blanco de acción, por ejemplo, mediante formas farmacéuticas sólidas como tabletas o grageas, incluyendo aquellas formuladas para su liberación prolongada. Conforme a la presente invención, pueden obtenerse las composiciones farmacéuticas vacunales aquí descritas mediante la combinación de las proteínas NG06, NG19, eNG19m, eNG19m(20H) y/o mezclas de las mismas con vehículos farmacéuticamente compatibles conocidos en el arte, en las cantidades y/o concentraciones que correspondan conforme a lo descrito aquí, y pueden incluirse compuestos conocidos en el arte para la obtención de dichas composiciones. Así mismo, la administración de tales composiciones, podrá hacerse dependiendo de las condiciones del paciente, lo que determinará las dosis y frecuencia de administración necesarias para lograr un tratamiento efectivo del padecimiento en cada caso en particular.
En una de sus modalidades, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas NG06, NG19, eNG19m, eNG19m(20H) y/o mezclas de las mismas, adecuadas para su administración nasal. Ejemplos de composiciones adecuadas para la administración nasal incluyen, pero no se limitan a, soluciones acuosas, pomadas y geles. En este sentido y conforme a la presente invención, una composición adecuada para la administración nasal por vía tópica puede encontrarse en forma de pomada o gel, en forma de aerosol nasal para ser potencialmente administrada mediante un mecanismo de administración por aerosoles, por ejemplo, a través de dispositivos inhaladores conocidos en el arte, o bien en forma de soluciones acuosas para ser administradas mediante gotas. Así mismo, una persona con conocimientos medios en el campo técnico de la presente invención, sabría cómo preparar tales composiciones utilizando técnicas convencionales en el arte.
Acorde con una de las modalidades de la presente invención, las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H) y las composiciones que los comprenden se administran a la membrana mucosa nasal del paciente afectado por la COVID-19. Conforme a la presente invención, cualquier método conocido en el arte se puede utilizar para la administración de dichos principios activos a la membrana mucosa nasal, donde preferentemente dichos principios activos se administran vía nasal mediante gotas o aerosoles, lo que les permite llegar a su sitio de acción de manera rápida y eficiente. Particularmente, soluciones acuosas que comprendan las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H) puede administrarse al paciente afectado por la COVID-19 mediante la aplicación de gotas a la cavidad nasal a través de las fosas nasales. Alternativamente, dichas soluciones acuosas se pueden administrar al paciente afectado por la COVID-19 mediante aerosoles de aplicación nasal o bien mediante mecanismo de administración de aerosoles a través de dispositivos conocidos en el arte para tal fin, de modo que la solución acuosa que comprende las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H) se rocía al tejido respiratorio de una manera única o bien múltiple, conforme el paciente lo necesite. En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas descritas aquí en forma de gel o ungüento, se pueden administrar vía nasal mediante aplicación tópica a una o más membranas mucosas de la cavidad nasal, así como en los tejidos respiratorios superiores e inferiores, incluyendo el tejido pulmonar.
En una de sus modalidades, la presente invención comprende la administración nasal o intranasal de las composiciones descritas aquí. Los beneficios de dicha administración comprenden la entrega precisa de los principios activos al sitio blanco de acción, en este caso el tejido respiratorio y pulmonar, un incremento sustantivo en cubrir mayor superficie de tejido superficial en la aplicación, tiempos de nebulización más cortos, reducción de toxicidad sistémica y de acumulación de una mayor concentración de fármacos en el sitio objetivo. Cantidades de las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H) se pueden entregar rápidamente en el tejido respiratorio utilizando nebulizadores de diversos tipos, como por ejemplo ultrasónicos. Además, una porción mayor de la dosis administrada por ésta vía se puede depositar de manera muy eficiente en el pulmón en caso necesario.
Como ya se ha mencionado anteriormente, la aplicación parenteral de las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H) es una de las modalidades de la presente invención, donde dicha vía de administración proporciona beneficios evidentes en cuanto a que puede administrase una mayor carga de dichos principios activos en caso necesario evitando con ello el uso de excipientes y solventes que podrían dificultar dicha administración por ésta vía (por ejemplo, co-solventes y/o solubilizadores de alta densidad, pH’s extremos, etc.), y utilizando formulaciones líquidas y/o acuosas que facilitan su administración mediante dispositivos convencionales conocidos en el arte, tales como agujas hipodérmicas que permiten la administración intravenosa, intramuscular y/o subcutánea. Dentro del alcance de la invención, las composiciones descritas se encuentran disponibles en forma tal que pueden administrarse en forma parenteral o intranasal, por ejemplo mediante el uso de aerosoles, de la misma manera que se administran otros principios activos dirigidos al tejido respiratorio, los cuales ejercen su actividad directamente en su sitio de acción de manera casi directa. Adicionalmente, la invención comprende la administración de las composiciones descritas a través de la vía intranasal, lo que permite que sus principios activos lleguen de manera más eficiente y en mucho menor tiempo que con la administración parenteral que también es posible.
Como puede observarse más adelante, la aplicación intranasal de las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H) descritas aquí, genera efectos protectores muy similares a cuando se aplican de manera parenteral, generando un efecto local eficiente en el tejido pulmonar afectado y una vía aplicable que resulta ser altamente efectiva en pacientes afectados por la COVID-19, donde dicha administración intranasal se puede realizar por ejemplo, a través de dispositivos inhaladores conocidos en el arte y que ya se encuentran disponibles en el mercado.
Como puede observarse más adelante, la presente invención proporciona evidencia contundente de que las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H) descritas aquí funcionan de manera eficiente para el tratamiento de la COVID-19 por diferentes vías de aplicación, donde al igual que la administración de estos por vía parenteral, su administración por vía intranasal genera un efecto benéfico en la estimulación de la respuesta inmune, siendo esto una clara evidencia de que las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H) descritas aquí proporcionan un efecto protector sistémico positivo del tejido pulmonar en pacientes afectados por la COVID-19.
La presente invención comprende también métodos de prevención o profilácticos de la COVID-19 que comprenden administrar al paciente que lo necesite, las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H), o composiciones que las comprendan en concentraciones adecuadas que proporcionen el efecto terapéutico deseado conforme lo descrito aquí y con la frecuencia de dosificación y régimen terapéutico que corresponda, ya sea por vía oral, parenteral y/o nasal, aunque la administración parenteral es preferida. Conforme a la presente invención, dichas proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H) y las composiciones que las comprenden, pueden administrarse al paciente que lo requiera durante el tiempo y frecuencia que sea necesarias hasta lograr una protección adecuada en contra de la COVID19.
Conforme a la presente invención, además de los protocolos de tratamiento descritos anteriormente, un tratamiento y un régimen de dosificación eficaces aplicados a un paciente también pueden depender de la edad del paciente, sexo, altura, peso, estado de salud previo, etc., por lo que considerando dichos factores así como las prácticas conocidas en el arte para ello, será fácilmente determinado el régimen de dosificación adecuado para cada caso, así como la cantidad para la administración de las proteínas NG06 y NG19 y de las composiciones vacunales que las comprenden, con el fin de lograr el resultado terapéutico deseado para el paciente en necesidad de tratamiento. Conforme a lo anterior, las proteínas NG06, NG19, eNG19m, eNG19m(20H) y/o mezclas de las mismas descritas pueden administrarse al paciente en dosis que resulten adecuadas para ejercer sus efectos profilácticos, donde la concentración en la que se administran comprende un rango de 100- 300 pg, preferentemente 100-200 pg, la cual puede administrarse vía parenteral.
En otra modalidad de la invención, un método para detectar en un sujeto humano el desarrollo de la COVID19 mediante la detección de anticuerpos específicos que reconozcan las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H) en una muestra biológica del sujeto, incluye obtener una muestra clínica del sujeto humano, y conducir uno o más ensayos inmunológicos sobre la muestra clínica de dicho sujeto detectando en ella anticuerpos específicos contra las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H) para detectar el desarrollo o presencia de la COVID19 en el sujeto.
Para efectos de la invención, el método de detección descrito aquí comprende las etapas de: a) Obtener una muestra de tejido del paciente sospechoso de tener la COVID19 y procesar dicha muestra para que tenga las condiciones adecuadas para ser analizada posteriormente.
En esta etapa puede ocuparse cualquier técnica conocida en el arte para obtener la muestra del paciente, como por ejemplo raspado nasal o la toma de una muestra sanguínea para obtener suero. b) Adicionar a las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H) la muestra obtenida del paciente permitiendo que a dichas proteínas se unan específicamente anticuerpos específicos capaces de reconocerlas que puedan estar presentes en la muestra, para posteriormente adicionar un anti-anticuerpo capaz de reconocer la fracción conservada de los anticuerpos presentes en la muestra del paciente permitiendo que se unan específicamente a su sitio blanco, donde dicho anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal.
Esta etapa es parte de una técnica de rutina en los laboratorios de patología en el que se incluye la incubación de la muestra tratada con diluciones precisas del anti-anticuerpo, lo que permite adaptar el método de la invención a los métodos de rutina de los laboratorios de forma muy ágil y permite también cuantificar la cantidad de anticuerpos específicos en la muestra, con lo que se obtiene información del grado de producción de dichos anticuerpos en el sujeto, correlacionado esto con el grado de evolución de la enfermedad. c) Adicionar medios de detección que permitan revelar la unión de las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H) a los anticuerpos específicos que reconocen a dichas proteínas y que puedan estar presentes en la muestra del paciente.
En esta etapa es posible utilizar diferentes indicadores como medios de detección, los cuales permiten desarrollar una señal particular (por ejemplo, coloración o luz de cierta longitud de onda) cuando la molécula de interés se une a su sitio blanco, lo cual se procesa mediante técnicas estándares conocidas en el arte, y d) Detectar la presencia de anticuerpos específicos para las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H) en la muestra.
En esta etapa, la detección de la señal producida indica la presencia de anticuerpos específicos para las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H) en la muestra, lo cual puede realizarse de forma visual o bien mediante sistemas de detección de dichas señales conocidos en el arte.
Acorde con la invención, la detección de anticuerpos específicos para las proteínas NG06, NG19, eNG19my/o eNG19m(20H) en la muestra indicará la presencia de COVID19 en el paciente analizado, ya sea en una etapa de desarrollo temprano o en etapas de desarrollo más avanzadas; esto permitirá detectar la enfermedad oportunamente, proporcionar seguimiento, monitoreo y tratamiento adecuado al paciente diagnosticado reduciendo de forma sustantiva el riesgo de desarrollar COVID19 hacia etapas graves, tales como el Síndrome Respiratorio Agudo Severo (SARS).
Los ensayos inmunológicos que involucran antígenos, incluyen recubrir una superficie con las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H), de tal manera que dichas proteínas capturen por afinidad y unión anticuerpos específicos de interés, donde dichas superficies pueden ser placas de titulación, membranas, chips, etc. El antígeno de interés puede ser, por ejemplo las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H) de la presente invención o partes únicas de la proteína que permitan su identificación específica. Después de bloquear las partes no unidas de la superficie, la muestra clínica a ser analizada puede ser aplicada para su unión con el antígeno de captura de anticuerpos específicos COVID19, los cuales pueden ser detectados por otro anti-anticuerpo primario o por un anticuerpo de detección al unirse al antígeno de interés. Por lo tanto, los dos anticuerpos primarios o el par de anticuerpos tanto de captura como de detección interactúan con el antígeno de interés (sándwich). El anticuerpo de captura puede ser el mismo o bien un anticuerpo diferente al anticuerpo de detección, siempre y cuando ambos anticuerpos puedan unirse específicamente al antígeno de interés.
Posteriormente el complejo antígeno-anticuerpo formado puede ser detectado por un segundo anticuerpo el cual tiene afinidad por el anticuerpo de detección facilitando la medición por sistemas de detección estándar de complejos inmunológicos usando colorimetría, quimioluminiscencia, fluorescencia o diversos tipos de sustratos. Las lecturas finales o visualizaciones pueden realizarse por instrumentos con lectores de absorbancia de luz apropiados o directamente por observación y comparar los resultados con la muestra control. Los resultados positivos indicarán la unión del antígeno de interés al anticuerpo primario, el anticuerpo de captura y/o el anticuerpo de detección y por lo tanto la presencia de anticuerpos específicos para las proteínas NG06 y NG 19 en la muestra clínica. Por el contrario, resultados negativos indicarán la falta de unión de anticuerpos de interés a las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H) y por lo tanto la ausencia de la COVID19 en el paciente bajo análisis.
Uno o más ensayos inmunológicos pueden usarse para detectar al menos tres tipos de proteínas de interés, incluyendo pero no limitado a, antígeno, anticuerpo e inmunocomplejos antígeno/anticuerpo, entre otros.
Los formatos de uno o más ensayos inmunológicos pueden ser en formato de microplaca, prueba rápida basada en membranas, chip de proteína, etc. Los principios de los ensayos son los mismos que se han descrito excepto por los sistemas de detección que varían dependiendo del sustrato escogido para analizar los resultados en diferentes formas por un instrumento específico diseñado para el ensayo. En resumen, los procedimientos, condiciones, especificidad de unión, desarrollo de un tipo de ensayo inmunológico en un formato puede ser adaptado en un formato diferente del mismo o diferente ensayo inmunológico y/o diferente ensayo inmunológico de la misma o diferente forma. Uno o más ensayos inmunológicos conforme a la presente invención, se prestan para utilizar las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H) resultando en ensayos inmunológicos con alta sensibilidad y especificidad para detectar la presencia de anticuerpos policlonales y/o monoclonales específicos para dichas proteínas. Dichos ensayos incluyen, pero no se limitan a, ensayos con chip de proteína, ensayos de ELISA, ensayos de Western blot, ensayos para inmunocomplejos, ensayos de radioinmunoprecipitación, ensayos rápidos inmunocromatográficos de membrana, y ensayos de ICQ seguidos de citometría de flujo. Así mismo dichos ensayos pueden ser no invasivos con instrumental adicional mínimo o no requerido.
Para fines de la presente invención, el término anticuerpo incluye moléculas intactas del anticuerpo, así como fragmentos del mismo, tales como fragmentos Fab, F(ab)2 o CDR los cuales son capaces de unirse a las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H).
En la realización de los ensayos es deseable incluir ciertos bloqueadores en el medio de incubación, usualmente añadidos con el anticuerpo marcado soluble. Los bloqueadores son añadidos para asegurar que las proteínas no-específicas, proteasas, o sustancias artefacto presentes en la muestra experimental bajo análisis no se unan con los anticuerpos o al anticuerpo indicador marcado, lo que puede generar resultados falsos positivos o falsos negativos. La selección de los bloqueadores por lo tanto puede añadir especificidad sustancial a los ensayos descritos en la presente invención. Un número de anticuerpos no relevantes (no específicos) de la misma clase o subclase de aquellos usados en los ensayos pueden ser usados como bloqueadores. La concentración de tales bloqueadores (normalmente de 1 a 100 pg/mI) puede ser importante para mantener la sensibilidad apropiada y aun inhibir cualquier interferencia no deseada que puedan provocar las proteínas contenidas en la muestra.
La presente invención también proporciona un estuche diagnóstico (kit) para realizar el método de detección de la invención, por ejemplo a través de ELISA o Western blot, para detectar la proteína. El kit puede incluir una solución bloqueadora previa a la unión del anticuerpo a las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H), una solución bloqueadora posterior a la unión del anticuerpo a las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H), un anti-anticuerpo policlonal como primer anticuerpo, un segundo anticuerpo, por ejemplo anti-ratón o anti-conejo conjugado con peroxidasa (HRP) o biotina u otros agentes que revelen la unión del segundo anticuerpo con el primer anticuerpo, así como una solución conteniendo agentes apropiados usados como sustratos para detectar la unión del segundo anticuerpo. El anti-anticuerpo policlonal puede ser por ejemplo un anticuerpo policlonal específico o un anticuerpo monoclonal o bien una combinación de dichos anticuerpos. Dicho kit puede ser utilizado para realizar un ensayo inmunológico, incluyendo pero no limitado a ELISA, ensayos con antígenos para las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H), ensayos con anticuerpos para anticuerpos contra las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H), ensayos para inmunocomplejos de las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H), ensayos con chips de proteínas, ensayos de radioinmunoprecipitación, ensayos inmunocromatográficos, IHQ de tejidos y/o células del sistema respiratorio y ensayos inmunocitológicos seguidos de citometría de flujo, así como combinaciones de dichos ensayos.
La detección de anticuerpos específicos contra las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H) mediante ensayos inmunológicos puede ser utilizada en inspecciones clínicas para detectar COVID19 y puede hacerse mediante una prueba rápida simple o bien mediante pruebas más completas que impliquen la combinación de varios inmunoensayos, lo que aumenta de forma significativa la sensibilidad y exactitud de la prueba de detección.
En otra de sus modalidades, la invención comprende métodos para obtener las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H), los cuales comprenden clonar secuencias de ácidos nucleicos codificantes de dichas proteínas en vectores de clonación y/o expresión que permitan su producción en sistemas procariontes, por ejemplo bacterias Gram negativas como por ejemplo E. coli, y por ejemplo mediante la obtención de dichas proteínas en cuerpos de inclusión, para su posterior purificación mediante métodos conocidos en el arte y que permitan por ejemplo el plegado correcto de dichas proteínas obtenidas conservándose con ello sus propiedades antigénicas. A pesar de que pueden utilizarse sistemas eucariontes conocidos en el arte para producir las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H), se prefieren especialmente los sistemas procariontes, ya que dichos sistemas no adicionan residuos de carbohidratos en las proteínas obtenidas, siendo esta característica fundamental de no adición de residuos de carbohidratos para observar el efecto antigénico de las proteínas NG06, NG19, eNG19m y/o eNG19m(20H) de la invención.
En una más de sus modalidades, la presente invención comprende métodos para la obtención de plasmas y/o sueros hiperinmunes específicos útiles para el tratamiento de la COVID19, los cuales comprenden la inmunización por ejemplo de modelos animales con las proteínas NG06, NG19, eNG19m, eNG19m(20H) y/o mezclas de las mismas. Mediante dichos métodos, es posible obtener plasmas y/o sueros hiperinmunes anti-COVID19 que resultan efectivos para el tratamiento de la enfermedad, los que incluyen anticuerpos que reconocen específicamente determinantes antigénicos del virus SARS-CoV-2 y que permiten su eliminación, así como anticuerpos neutralizantes capaces de suprimir la unión del virus con su receptor y en consecuencia permiten el tratamiento efectivo de la COVID19, incluso en pacientes inmunocomprometidos afectados por la enfermedad o con afectación de otros órganos. En este sentido, existen múltiples reportes en el estado del arte [70-84] donde se describe la efectividad de la inmunoterapia para el tratamiento de personas afectadas por COVID19 mediante la administración a dichos pacientes de plasmas y/o sueros hiperinmunes provenientes de pacientes convalecientes a dicha enfermedad, lo que ha permitido proporcionar un tratamiento efectivo desde etapas tempranas a avanzadas de la enfermedad, evitando con ello que el paciente afectado evolucione a estados graves de la enfermedad como por ejemplo SARS; dicha estrategia se ha utilizado con éxito como medida de emergencia ante casos donde otro tratamiento no resulta factible o bien en casos donde la enfermedad ha evolucionado a estados graves [85-88] Así mismo, para efectos de la presente invención, los plasmas y/o sueros hiperinmunes anti-COVID19 pueden obtenerse mediante la inmunización a modelos animales con una cantidad inmunológicamente efectiva de las proteínas NG06, NG19, eNG19m, eNG19m(20H) y/o mezclas de las mismas, como por ejemplo de 100 a 300 pg, aunque cantidades superiores podrían ser necesarias administrar dependiendo del modelo animal a inocular y del esquema de inmunización que se determine, tomando como base el esquema de inmunización descrito aquí y que se esquematiza en la figura 9. Así mismo y para los fines de la presente invención, pueden utilizarse métodos conocidos en el arte, como por ejemplo los reportados para la producción de anti-toxoide tetánico que es producido en caballos, o bien los métodos reportados por Gupta [89] o León [90] que utilizan equinos, siempre y cuando generen plasmas y/o sueros hiperinmunes anti-COVID19. Para la obtención del plasma y/o suero hiperinmune anti-COVID19 de la presente invención, pueden utilizarse procedimientos conocidos en el arte para la obtención de plasmas y/o sueros, tales como por ejemplo aquellos que utilizan centrifugación para obtener el plasma y/o suero, o como por ejemplo aquellos que utilizan separación selectiva mediante plasmaferesis, los cuales quedan comprendidos en el alcance de la presente invención, aunque cualquier método que permita obtener el plasma y/o suero hiperinmune anti-COVID19 de la invención también resultan útiles tal como por ejemplo el reportado por Wei [91]
Adicionalmente, los plasmas y/o sueros hiperinmunes producidos mediante las proteínas de la invención NG06, NG19, eNG19m, eNG19m(20H) y/o mezclas de las mismas, serán capaces de neutralizar y ser efectivos contra la cepa viral original de Wuhan así como también contra las variantes virales B.1 .1.7 (inglesa) y B.1.351 (sudafricana), de las que se ha reportado se encuentran en diversas partes del mundo, incluyendo México y que pueden resultar más infectivas que la cepa viral original, lo que puede representar un tratamiento de emergencia en caso de ser necesario ya que se obtendrían plasmas y/o sueros hiperinmunes anti-COVID19 polivalentes. Hasta antes de la presente invención no se habían reportado antígenos ni métodos que fueran capaces o que incluso tuvieran el potencial de ser efectivos para el tratamiento de las variantes virales mencionadas, por lo que la presente invención representa una alternativa viable para proporcionar inmunoterapia efectiva con plasmas y/o sueros hiperinmunes anti-COVID19 polivalentes para pacientes afectados por COVID19 causada por dichas variantes virales.
A continuación, se incluyen los siguientes ejemplos con la única finalidad de ¡lustrar la invención y sin que ello implique limitaciones a su alcance.
Ejemplo 1. Materiales y métodos.
Análisis bioinformático. El modelo estructural del "estado abierto" de la proteína S (PDB: 7JZL), la secuencia del dominio de unión a receptor (RBD) [27] y los datos experimentales de glicosilación [5], se emplearon para la selección de la región no glicosilada de la RBD, de los residuos S371 a F541. Además, se seleccionó un segundo péptido dentro del motivo de unión del receptor (RBM) [21] que comprende de S438 a N487. Estos antígenos se denominaron NG06 y NG19 correspondientemente, como proteínas no glicosiladas de 6 y 19 kDa. Las propiedades fisicoquímicas se calcularon con la herramienta ProtParam desde el servidor ExPAsy (https://web.expasy.org/protparam/) [28] La predicción de secuencias antigénicas se determinó utilizando la herramienta Predicting Antigenic Peptides (http://imed.med. ucm.es/Tools/antigenic.pl)[29]. La potencial alergenicidad se determinó utilizando AllerTOP v2.0 (http://www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP/) [24] y el mapeo del módulo del epítopo IgE desde el servidor AlgPred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/algpred/index.html) [30] La estructura secundaria de los antígenos se predijo utilizando PSIPred Protein Sequence Analysis Workbench (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) [31 ,32], mientras que la predicción de la estructura terciaria se predijo de novo utilizando trRosetta (https://yanglab.nankai.edu.cn/trRosetta/) [33], refinando si fuera necesario con Galaxy Refine Server (http://galaxy.seoklab.org/cgi- bin/submit.cg¡?type-REFINE)[34], validado mediante PROCHEK v.3.5
(https://servicesn.mbi.ucla.edu/PROCHECK/) [35] y ProSA
(https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php) [36] Se visualizaron modelos representativos utilizando UCSF Chimera [37]
Clonación molecular. Se empleó como templado el vector plasmídico pUC57 eRBD (SARS-CoV-2) RBD que codifica RBD de SARS-CoV-2 con un uso optimizado de codones para la expresión en E. coli. Se diseñaron oligonucleótidos que incluyen los sitios de restricción 5'-Ncol y 3'-Hindlll (Tabla 1) para la clonación posterior.
Tabla 1. Secuencias de los oligonucleótidos utilizados en la presente invención
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* Los sitios de restricción para Ncol y Hindlll están indicados en negritas.
La POR se realizó en un volumen final de 25 pL con 15.4 pL de H2O Milli-Q estéril, 2.5 pL de buffer ex Taq 10X, 2 pL de dNTP (2.5 mM cada uno), 2 pL de cada oligonucleótido (10 pM), 0.1 pL de TaKaRa Ex Taq polimerasa y 1 pL de ADN plásmido (10 ng/pL). Las condiciones de la POR fueron la desnaturalización inicial a 94°C durante 3 min, seguidas de 30 ciclos a 94°C durante 30 s, alineación a 60°C durante 30 s y extensión a 72°C durante 30 s, con una extensión final a 72°C durante 10 min. Los productos de PCR se ligaron en pCR8/GW/TOPO® (Invitrogen), se transformaron en células E. coli MACHI -T1 y posteriormente se subclonaron en los vectores pCrila (para NG06 y NG19) o pCr¡8a (sólo para NG19) [38] mediante la digestión de 3 pg de cada plásmido, purificando los fragmentos de interés con el kit Zymoclean Gel DNA Recovery (Zymo Research) y ligando a una relación molar 1 :10 (vector: inserto) con el kit DNA rapid ligation (Thermo Fisher Scientific) utilizando 100 ng del vector. La mezcla de ligación resultante se utilizó posteriormente para transformar células químicamente competentes de E. coli MACHI -T 1 por choque térmico e incubadas en placas LB con kanamicina (50 pg/mL) a 37°C durante toda la noche. Los clones resultantes fueron analizados por PCR punto final, restricción y secuenciación de Sanger (Macrogen Inc.)
Mutagénesis dirigida. Para la obtención de la proteína eNG19m(20H), se empleó la construcción sintética de la proteína NG19 como molde para sintetizar por PCR las secuencias variantes, mediante el uso de los oligonucleótidos descritos en la tabla 2; así mismo se empleó el uso de codones frecuente de E. coli para generar la secuencia final.
Tabla 2. Oligos empleados para la mutagénesis dirigida.
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Expresión y purificación de proteínas. E. coli BL21 (DE3) que alberga pCri-1a/NG06 o pCri-1a/NG19 se inocularon en medio TB (1.5% volumen de inoculación v/v) suplementado con sulfato de kanamicina (50 pg/mL), cloranfenicol (20 pg/mL) y glucosa (5 g/L). Los cultivos fueron incubados a 37°C, 200 rpm y se indujeron con 1 mM de IPTG (Sigma-Aldrich) a OD600nm=0.7-0.8. Las condiciones de inducción del cultivo fueron para MBP-NG06, 37°C por 5 h y para MBP-NG19, 18°C durante 16 h. Cada gramo de biomasa obtenido se resuspendió en 10 mi del buffer A (20 mM NaH2P04, 0.5 M NaCI, 20 mM imidazol, 1 mM PMSF, 1 mM de clorhidrato de benzamidina, pH 7.4) y Usado posteriormente por ultrasonicación en baño de hielo utilizando un Ultrasonicador Homogeneizador 500 a 150 W (4 min, 5 s para ultrasonicación y 30 s para intervalo de descanso) (Cole-Parmer, Vernon Hills, IL). El lisado se centrifugó a 35000 rpm durante 30 min a 4°C.
Las purificaciones de fracciones solubles de MBP-NG06 y MBP-NG19 se realizaron utilizando un AKTA puré 25 (GE Healthcare, Chicago IL) a través de cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (Ni2+-IMAC) empleando una columna HisTrap HP de 5 mL (GE Healthcare) previamente equilibrada con buffer A, a un flujo de 2.5 mL/min. La columna se lavó con 3 volúmenes de buffer A y se eluyó a través de un gradiente lineal (0-100%) de buffer B (20 mM NaH2P04, 0.5 M NaCI, 500 mM imidazol, 1 mM PMSF, 1 mM de clorhidrato de benzamidina, pH 7.4) en volúmenes de 20 columnas. Posteriormente, las fracciones proteicas se intercambiaron en buffer C (1 mM de glutatión reducido, 1 mM de glutatión oxidado, 25 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, pH 7.4); utilizando una columna HiPrep 26/10 Desalting (GE Healthcare). Se combinaron las fracciones desaladas, se añadió enzima TEV (relación 1 :100) y la mezcla de reacción fue incubaba a 4°C durante 16 h. Después del corte enzimático, las muestras fueron purificadas de nuevo usando una columna HisTrap HP de 5 mL. La fracción no unida que corresponde a la proteína recombinante sin socio de fusión, se concentró en 0.5 mL con una unidad Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter (MWCO a 3000 kDa) (Millipore, UU.) y cargada en una columna Superdex 75 10/300 GL (GE Healthcare) para realizar una cromatografía de exclusión de tamaño (SEC), que se equilibró con 2 CV de buffer D (1X PBS) a un rango de flujo de 0.5 mL/min. Para la expresión del antígeno NG19 en el vector pCr¡8a/NG19, llevamos a cabo la purificación y el replegado de cuerpos de inclusión de acuerdo con un flujo de trabajo previamente descrito [39] con las siguientes modificaciones: buffer B con 1 M de hidrocloruro de guanidina en lugar de 2 M, buffer C con 1% Tritón X-100 en lugar de 1% Tritón X-114 y buffer de solubilización con 1 mM de DTT en lugar de 1 mM b-mercaptoetanol. Todos los pasos de purificación fueron analizados porTricina-SDS-PAGE al 12% y cualificados usando el kit Pierce™ BCA™ (ThermoFisher, Waltham MA).
Inmunizaciones y procesamiento de muestras séricas. Se combinaron 200 pg de proteínas recombinantes purificadas NG06 o NG19 con el adyuvante TiterMax Gold (Sigma-Aldrich) (1 :1) y se inyectaron en conejos hembra Nueva Zelanda con ocho semanas de edad (n=2, peso=1.93 y 1.90 kg, alojados a ciclos de 12 h luz/oscuridad a 20±1°C con alimentos y agua ad libitum), a través de vía subcutánea e intramuscular (100 pg por vía). Se les dio una dosis de refuerzo (200 pg) dos semanas más tarde. Se obtuvieron muestras de sangre periférica de la arteria central antes de la inmunización (suero pre-inmune), 15 y 30 días después de la primera inmunización (suero hiperinmune), así como de pacientes COVID-19 recuperados. Consideramos como pacientes COVID-19 recuperados aquellos que no mostraron síntomas de la enfermedad 2-4 semanas después de un resultado positivo por RT-qPCR. La RT-qPCR se llevó a cabo de acuerdo con el Protocolo de Berlín para la detección del SARS-CoV-2 [40] Las muestras de sangre se centrifugaron a 2000 rpm durante 5 min. Los sueros de pacientes COVID-19 recuperados se inactivaron térmicamente a 56°C durante 30 min con el fin de minimizar la exposición al SARS-CoV-2 en posteriores evaluaciones.
Análisis de Western blot. Las proteínas recombinantes (15 pg/pozo) se separaron en geles Tricina SDS-PAGE al 8% y se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) a 30 V durante toda la noche. Las membranas se bloquearon con un 5% de leche seca sin grasa durante 2 h y se incubaron durante toda la noche con sueros hiperinmunes de conejo (1 :1000). Al día siguiente, las membranas se lavaron con PBST y se incubaron durante 4 horas con un anticuerpo secundario de cabra anti-conejo acoplado a peroxidasa (1 :40000) (Sigma). Todas las membranas fueron reveladas utilizando ECLTM Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare) siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Titulación de anticuerpos por ELISA. Placas sólidas Nunc-lmmuno MicroWell de 96 pozos (Sigma- Aldrich) fueron recubiertas con 100 pL (0.05 pg/pozo) de proteínas NG06 o NG19, diluidas en buffer de carbonato-bicarbonato 0.05 M pH 9.6 (Sigma-Aldrich) e incubadas durante toda la noche a 4°C. Las placas se bloquearon con 100 pL de albúmina sérica bovina al 1% en PBS durante 1 h a 37°C y luego se lavaron 3 veces con 200 pL de PBST (Buffer salino de Fosfato 1X + 0.05% Tween-20). Las muestras de suero se diluyeron en PBST (1 :50-1 :106 para muestras de conejo y 1 :5000 para muestras humanas) empleando 100 pL/pozo e incubado durante 1 h a 37°C. Se utilizaron sueros preinmunes o PCR negativos como controles negativos. Las placas se lavaron 3 veces con PBST y anticuerpos secundarios de cabra Anti-conejo IgG-HRP (Sigma-Aldrich) o de cabra Anti-Humano IgG (H+L), HRP (Thermo Fisher Scientific) fueron empleados a 1 :2000 y 1 :5000, respectivamente. Las placas fueron incubadas a 37°C durante 1 h. Después de lavar 3 veces con PBST, se añadieron 100 pL de solución de sustrato de 3,3’,5,5’-tetrametilbenzid¡na (TMB) (Sigma-Aldrich) incubando 30 min a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con 100 pL de H2SO4 0.2 M. La densidad óptica se midió a 450 nm utilizando un espectrofotómetro de microplacas Epoch (BioTek Instruments).
Análisis estadístico. El análisis estadístico se realizó con el software GraphPad Prism 6.01. La diferencia entre dos grupos se evaluó utilizando la prueba ranqueada no paramétrica Mann-Whitney. Un valor de p <0.05 se consideró significativo. Para los valores obtenidos con buffer de dilución se restaron a los obtenidos con el suero.
Declaraciones éticas. El protocolo para aumentar los anticuerpos policlonales en conejos y la evaluación de la presencia de IgM/lgG en pacientes COVID-19 recuperados, fue aprobado por el Comité de ética de Cinvestav para la investigación humana (062/2020). Se obtuvo el consentimiento informado de pacientes COVID-19 recuperados y sujetos no expuestos para cada suero.
Ejemplo 2. Diseño de antígeno basado en un dominio no glicosilado dentro de RDB de la proteína Spike. La proteína Spike ha sido descrita como un blanco de la respuesta inmune humoral, considerando su localización en la partícula viral y debido a la evidencia experimental de su alta antigenicidad. El dominio de unión al receptor (RBD) se encuentra entre los residuos R319 a F541 en la proteína S, mientras que el motivo de unión al receptor (RBM) se ha mapeado entre los residuos N437 a Y508, donde no se han observado sitios de N-glicosilación u O-glicosilación, y los anticuerpos mapean a esta región. Se diseñaron dos antígenos no glicosilados (NG) teniendo en cuenta las regiones no glicosiladas de RBD: NG19 ubicada en S371-F541 y NG06 ubicada entre S438-N487 (Figura 1).
El análisis de la propensión antigénica media de NG06 fue de 0.9964 con dos determinantes antigénicos (YNYLYRL (SEQ.ID.No.11) y STEIYQAGS (SEQ.ID.No.12)), mientras que para NG19, la propensión antigénica promedio fue de 1.0401 con 7 determinantes antigénicos (ASASFSTFKCYGVSP (SEQ.ID.No.13), KLNDLCFTNVYADSFVIR (SEQ.ID.No.14), DFTGCVIA (SEQ.ID.No.15), YNYLYRL (SEQ.ID.No.16), STEIYQAGS (SEQ.ID.No.17), EGFNCYFPLQSYG (SEQ.ID.No.18) y VGYQPYRWVLSFELLHAPATVCGP (SEQ.ID.No.19)). La predicción de alergenicidad indicó que ambas secuencias probablemente no son alérgenos, así como la falta de secuencias de epítopos contra IgE, lo que justifica su seguridad como antígenos vacunales. Además, realizamos el análisis de la estructura secundaria (Figura 2) y se determinaron las propiedades fisicoquímicas de las proteínas NG06 y NG19 (Tabla 3).
Para visualizar si las proteínas NG seleccionadas de la invención se encontraban en la superficie del ORF S, empleamos la proteína Spike trimérica en estados cerrados y abiertos (Figura 3). El panel A muestra la ubicación de NG6, donde un giro de 90° localiza el NG06 seleccionado en la región central. El panel B muestra NG19, también situado en la región apical, pero distribuido en la superficie y en la estructura trimérica lateral Spike. Tanto NG06 como NG19 son hidrofílicos, con un punto isoeléctrico teórico de 8.1 y 8.6, respectivamente, y un índice predicho de alta estabilidad (Tabla 3). Tabla 3. Estructura primaria y propiedades fisicoquímicas de los candidatos antigénicos vacunales.
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Después del modelado estructural, las proteínas fueron validadas teniendo en cuenta los gráficos de calidad global del valor Z de los modelos obtenidos, así como los gráficos Ramachandran. Los valores Z de ambos modelos fueron -3,99 para NG06 y -6.31 para NG19, los cuales están dentro de los valores calculados para las proteínas resueltas por RMN; también, los modelos de calidad local no superan los umbrales utilizando valores de tamaño de ventana de 40 aminoácidos (Figura 4). Por último, en las gráficas Ramachandran para la proteína NG06, observamos el 97.8% de los residuos dentro de las regiones favorecidas, el 2.2% en regiones permitidas adicionales, mientras que NG19 contiene 90.6% de aminoácidos en regiones más favorecidas, 8.1% en regiones favorecidas adicionales y 1.3% en regiones generosamente permitidas. Ambos modelos presentaron 0% de aminoácidos en regiones no favorecidas, lo que indica la buena calidad de los modelos obtenidos (Figura 5). Las regiones seleccionadas se muestran dentro de la estructura Spike como regiones resaltadas en rojo, como parte de cada monómero en conformación abierta (roja) o cerrada (rosa) y como parte de RBD (Figura 3). Además, la visualización final de los modelos predichos de novo se muestran en la Figura 3C y Figura 3D.
Ejemplo 3. Expresión de antígeno en un sistema heterólogo. El vector de expresión pCrila permite la expresión de proteínas traslacionalmente fusionadas a la proteína de unión a maltosa (MBP), lo que aumenta la solubilidad del péptido de fusión resultante, y la adición de una etiqueta de histidina (His 6X) en la región N-terminal. MBP y su dominio His-Tag se pueden escindir por digestión con proteasa TEV para obtener los péptidos NG6 y NG19. Los antígenos expresados en E. coli (SEQ.ID.No.7 y SEQ.ID.No.8) fueron purificados por afinidad usando columnas de níquel. Las proteínas solubles y purificadas se digirieron con proteasa TEV y finalmente se purificaron mediante cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Sin embargo, la digestión con proteasa TEV no proteolizó la fusión MBP-TEV-NG19, por lo que decidimos clonar y expresar el antígeno NG19 en el vector pCr¡8a que lleva sólo una etiqueta de histidina. De esta manera, pudimos solubilizar cuerpos de inclusión, replegar, purificar la proteína y con TEV, esta vez usando sólo His-TEV-NG19 para obtener el antígeno NG19 final. La Figura 6 muestra los geles Trice-SDS-PAGE que contienen los pasos cromatográficos para purificar los antígenos. NG06 y NG19 fueron capaces de formar un homodímero en condiciones no reductoras. Las figuras 7 y 8 muestran los pasos cromatográficos de purificación de las proteínas NG06 y NG19. Respecto a la proteína eNG19m(20H), el antígeno producido fue inducido por IPTG, representando el 30% de la proteína total de E. coli recombinante (figura 12), el cual pudo purificarse a 98% de pureza mediante lavado de cuerpos de inclusión y posterior purificación en columna de intercambio catiónico.
Ejemplo 4. Inmunización de conejos. Los antígenos se emplearon en esquemas de inmunización para la producción de anticuerpos de conejo (Figura 9A). Los antígenos NG06 y NG19 se administraron por vía subcutánea e intramuscular en dos conejos hembra Nueva Zelanda. La cuantificación de IgG mediante plasma inmune reveló el reconocimiento de los antígenos recombinantes de la invención en una dilución sérica de 1 a 106; sin embargo, se observó una titulación más alta cuando se empleó a NG19. Ambos antígenos evocaron una respuesta más eficiente cuando se empleó una segunda inoculación (Figura 9B y 9C).
Ejemplo 5. IgGs de pacientes COVID-19 recuperados reconocen los antígenos recombinantes NG06, NG19 y eNG19m de la invención. IgGs de sueros de pacientes COVID-19 recuperados (2-4 semanas después de la recuperación en promedio) mostraron afinidad (en una dilución de 1 :5000) a los antígenos NG06 y NG19 recombinantes de la invención por ensayos indirectos de ELISA. En el caso de NG06, se observó una A450 nm = 0.80 ± 0.33 en pacientes con COVID-19 después de su recuperación, y una A450 nm = 1.13 ± 0.33 para NG19. Por el contrario, se obtuvo una A450 nm de 0.13 ± 0.08 y 0.11 ± 0.08 en el grupo control con ambos antígenos. Estos resultados fueron consistentes con los obtenidos con sueros hiperinmunes de conejo, donde la sensibilidad también fue mayor con el antígeno N19 (Figuras 10A y 10B). Respecto al antígeno eNG19m, los sueros de pacientes fueron capaces de reconocerlo de manera específica en comparación con sueros de pacientes provenientes de individuos sanos, observándose una señal de al menos 300% mayor en sueros de pacientes COVID-19 recuperados (figura 13).
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Claims

Reivindicaciones.
1. Una proteína del dominio de unión al receptor (RBD) del virus SARS-CoV-2, caracterizada porque no tiene sitios de glicosilación y es inmunogénica.
2. La proteína de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque se selecciona del grupo que comprende la proteína con SEQ.ID.No.1 , la proteína con SEQ.ID.No.2, la proteína con SEQ.ID.No.24, la proteína con SEQ.ID.No.25 y mezclas de las mismas.
3. Una composición vacunal para prevenir la COVID19, caracterizada porque comprende la proteína de conformidad con la reivindicación 1 a 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
4. La composición vacunal de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque comprende la proteína con SEQ.ID.No.2 y la proteína con SEQ.ID.No.25.
5. La composición vacunal de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque comprende la proteína con SEQ.ID.No.24 y la proteína con SEQ.ID.No.25.
6. La composición vacunal de conformidad con la reivindicación 3 a 5, caracterizada porque la proteína está en una concentración de 100 a 300 pg.
7. La composición vacunal de conformidad con la reivindicación 3 a 6, caracterizada porque está en una forma de administración parenteral.
8. La composición vacunal de conformidad con la reivindicación 3 a 6, caracterizada porque está en una forma de administración nasal y/o intranasal.
9. Una secuencia de ácido nucleico, caracterizada porque codifica para la proteína de conformidad con la reivindicación 1 o 2.
10. La secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque se selecciona del grupo que comprende el ácido nucleico con la SEQ.ID.No.3, el ácido nucleico con la SEQ.ID.No.5, el ácido nucleico con la SEQ.ID.No.26 y el ácido nucleico con la SEQ.ID.No.28.
11. Un vector molecular de expresión, caracterizado porque comprende la secuencia de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 9 a 10.
12. Una célula huésped, caracterizada porque comprende el vector molecular de conformidad con la reivindicación 11 .
13. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque es una bacteria Gram negativa.
14. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la bacteria Gram negativa es Escherichia coli.
15. Un método para obtener la proteína de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque comprende las etapas de: a) Hacer crecer la célula huésped de conformidad con la reivindicación 12 a 14 en un medio de cultivo adecuado, b) Recuperar la proteína resultante del medio de cultivo, y c) Purificar la proteína.
16. El método para obtener la proteína de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque en la etapa a), la célula huésped produce cuerpos de inclusión.
17. Un método para detectar la COVID19 en un sujeto humano, caracterizado porque comprende las etapas de: a) Obtener una muestra biológica del sujeto humano, b) Adicionar a la proteína de conformidad con la reivindicación 1 a 2, la muestra biológica del sujeto humano y permitir que a dicha proteína se unan anticuerpos que la reconocen específicamente presentes en dicha muestra, c) Adicionara la muestra de la etapa b) un anticuerpo marcado capaz de unirse a los anticuerpos que reconocen específicamente la proteína y permitir que dicho anticuerpo se una a su sitio blanco, d) Adicionar a la muestra de la etapa c) medios de detección que permitan revelar la unión del anticuerpo marcado a los anticuerpos que reconocen específicamente la proteína y que estén presentes en la muestra, y e) Detectar en la muestra la presencia de anticuerpos que reconocen específicamente la proteína, donde la detección positiva de la presencia de anticuerpos que reconocen específicamente la proteína de conformidad con la reivindicación 1 a 2 se relaciona con la presencia de COVID19 en el sujeto humano.
18. El método de la reivindicación 17, caracterizado porque el anticuerpo marcado se selecciona del grupo que comprende anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes, fragmentos de los mismos tales como fragmentos Fab, fragmentos F(ab)2, fragmentos CDR, y mezclas de los mismos.
19. El método de la reivindicación 17, caracterizado porque la muestra es suero o raspado del tejido nasal.
20. El método de la reivindicación 17, caracterizado porque los medios de detección comprenden sistemas de detección que permiten visualizar la interacción del anticuerpo marcado con anticuerpos que reconocen específicamente la proteína y que estén presentes en la muestra.
21. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque el agente se selecciona del grupo que comprende un segundo anticuerpo conjugado con un agente colorimétrico, un segundo anticuerpo conjugado con un cromógeno fluorescente, un agente colorimétrico, un cromógeno fluorescente o combinaciones de los mismos.
22. El método de la reivindicación 17, caracterizado porque se realiza a través de un ensayo inmunológico seleccionado del grupo que comprende ELISA, Western blot, radioinmunoensayo, inmunocitoquímica, inmunohistoquímica, radioinmunoprecipitación, citometría de flujo y combinaciones de las mismas.
23. El método de la reivindicación 22, caracterizado porque el ensayo inmunológico es ELISA o Western blot.
24. Un estuche de diagnóstico para detectar COVID19 en un sujeto humano, caracterizado porque comprende: a) La proteína de conformidad con la reivindicación 1 o 2, b) Un anticuerpo marcado que reconoce anticuerpos que reconocen específicamente la proteína de conformidad con la reivindicación 1 o 2, c) Medios de detección que permitan revelar la unión del anticuerpo a su sitio blanco, y d) Controles positivos y negativos que permitan validar el resultado obtenido por los medios de detección.
25. El estuche de diagnóstico de la reivindicación 24, caracterizado porque el anticuerpo marcado se selecciona del grupo que comprende anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes, fragmentos de los mismos tales como fragmentos Fab, fragmentos F(ab)2, fragmentos CDR, y mezclas de los mismos.
26. El estuche de diagnóstico de la reivindicación 24, caracterizado porque los medios de detección comprenden sistemas de detección que permiten visualizar la interacción del anticuerpo marcado con anticuerpos que reconocen específicamente la proteína y que estén presentes en la muestra.
27. El estuche de diagnóstico de la reivindicación 24, caracterizado porque el agente se selecciona del grupo que comprende un segundo anticuerpo conjugado con un agente colorimétrico, un segundo anticuerpo conjugado con un cromógeno fluorescente, un agente colorimétrico, un cromógeno fluorescente o combinaciones de los mismos.
28. El estuche de diagnóstico de la reivindicación 24, caracterizado porque se utiliza a través de un ensayo inmunológico seleccionado del grupo que comprende ELISA, radioinmunoensayo, inmunocitoquímica, inmunohistoquímica, radioinmunoprecipitación, citometría de flujo y combinaciones de las mismas.
29. El estuche de diagnóstico de la reivindicación 24 a 28, caracterizado porque se utiliza a través de ELISA o Western blot.
30. Una proteína del dominio de unión al receptor (RBD) del virus SARS-CoV-2 que no tiene sitios de glicosilación y es inmunogénica, para usarse para prevenir la COVID19.
31. La proteína para usarse de conformidad con la reivindicación 30, donde se selecciona del grupo que comprende la proteína con SEQ.ID.No.1 , la proteína con SEQ.ID.No.2, la proteína con SEQ.ID.No.24, la proteína con SEQ.ID.No.25 y mezclas de las mismas.
32. Una composición vacunal que comprende la proteína de conformidad con la reivindicación 1 a 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para usarse para prevenir la COVID19.
33. La composición vacunal para usarse de conformidad con la reivindicación 32, donde la proteína está en una concentración de 100 a 300 pg.
34. La composición vacunal para usarse de conformidad con la reivindicación 32 a 33, donde dicha composición está en una forma de administración parenteral.
35. La composición vacunal para usarse de conformidad con la reivindicación 32 a 33, donde dicha composición está en una forma de administración nasal y/o intranasal.
36. El uso de la proteína de conformidad con la reivindicación 1 o 2, para la fabricación de una composición vacunal para prevenir la COVID19.
37. El uso de la proteína de conformidad con la reivindicación 36, donde se induce inmunidad protectora contra la COVID19.
38. El uso de la proteína de conformidad con la reivindicación 36, donde la proteína está en una concentración de 100 a 300 pg.
39. Un método para la prevención de la COVID19, caracterizado porque comprende el paso de administrar a un paciente que lo necesite la composición vacunal de conformidad con la reivindicación 3 a 8.
40. El método para la prevención de la COVID19 de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque en la composición vacunal la proteína está en una concentración de 100 a 300 pg.
41. El método para la prevención de la COVID19 de conformidad con la reivindicación 39 a 41 , caracterizado porque la composición vacunal se administra vía parenteral.
42. El método para la prevención de la COVID19 de conformidad con la reivindicación 39 a 41 , caracterizado porque la composición vacunal se administra vía nasal y/o intranasal.
43. Un método para obtener plasma y/o suero hiperinmune anti-COVID19, caracterizado porque comprende las etapas de: a) Administrar a un animal no humano una cantidad inmunológicamente efectiva de las proteínas de conformidad con las reivindicaciones 1 a 2, b) Permitir que el animal no humano genere una respuesta inmune contra las proteínas de conformidad con las reivindicaciones 1 a 2 hasta la detección de títulos adecuados de anticuerpos, y c) Obtener sangre del animal para posteriormente obtener el plasma y/o suero hiperinmune anti-COVID19.
44. El método para obtener plasma y/o suero hiperinmune anti-COVID19 de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque en la etapa a) se administran conjuntamente las proteínas con SEQ.ID.No.2 y SEQ.ID.No.25.
45. El método para obtener plasma y/o suero hiperinmune anti-COVID19 de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque en la etapa a) se administran conjuntamente las proteínas con SEQ.ID.No.24 y SEQ.ID.No.25.
46. Un plasma y/o suero hiperinmune anti-COVID19, caracterizado porque se obtiene mediante el método de la reivindicación 43.
47. Un plasma y/o suero hiperinmune anti-COVID19, caracterizado porque se obtiene mediante el método de la reivindicación 44.
48. Un plasma y/o suero hiperinmune anti-COVID19, caracterizado porque se obtiene mediante el método de la reivindicación 45.
49. El plasma y/o suero hiperinmune anti-COVID19 de conformidad con la reivindicación 44 y 45, caracterizado porque es un plasma y/o suero hiperinmune anti-COVID19 polivalente capaz de reconocer la cepa viral original de Wuhan, la cepa viral de la variante B.1.1.7 (inglesa) y la cepa viral de la variante B.1.351 (sudafricana).
50. El plasma y/o suero hiperinmune anti-COVID19 de conformidad con la reivindicación 46 a 49, para usarse en el tratamiento de la COVID19.
51. El plasma y/o suero hiperinmune anti-COVID19 de conformidad con la reivindicación 50, donde dicho suero hiperinmune es administrare vía parenteral.
52. El uso del plasma y/o suero hiperinmune anti-COVID19 de conformidad con la reivindicación 46 a 49, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la COVID19.
53. El uso del plasma y/o suero hiperinmune anti-COVID19 de conformidad con la reivindicación 52, donde dicho medicamento es administrare vía parenteral.
54. Un método para el tratamiento de la COVID19, caracterizado porque comprende el paso de administrar a un paciente que lo necesite el plasma y/o suero hiperinmune anti-COVID19 de conformidad con la reivindicación 46 a 49.
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