WO2022186349A1

WO2022186349A1 - リンパ管新生促進因子発現線維芽細胞及びそれを含む医薬組成物

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Publication number: WO2022186349A1
Application number: PCT/JP2022/009205
Authority: WO
Inventors: 貴紘岩宮
Original assignee: 株式会社メトセラ
Priority date: 2021-03-04
Filing date: 2022-03-03
Publication date: 2022-09-09
Also published as: IL305069A; US20240148795A1; JP2023058660A; JPWO2022186349A1; CA3211113A1; EP4302771A1; AU2022231584A1; JP7233147B2; KR20230154177A

Abstract

リンパ管新生能を有する細胞としてＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ高発現線維芽細胞を見出し、この細胞を含む医薬組成物を用いた線維症を治療する手段やリンパ管新生能低下状態を改善する手段、組織液の恒常性や脂質及び／又はビタミンの輸送や免疫監視の調節や臓器不全を治療する手段を見出した。また、ＴＮＦ－αとＩＬ－４を添加した培地を用いてヒト線維芽細胞を培養することによって、ＡＤＭ高発現且つＶＣＡＭ－１発現向上型成体由来線維芽細胞が得られることを見出し、ＡＤＭ高発現の線維芽細胞を提供すること及びこの細胞を用いた肺疾患を治療する手段を見出した。

Description

リンパ管新生促進因子発現線維芽細胞及びそれを含む医薬組成物

　本発明は、リンパ管新生促進因子発現線維芽細胞、特に特定の遺伝子やタンパク質（ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ（以下、ＡＤＭとも言う）及び／又はＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃａｌｌｙ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｈｏｍｅｏｂｏｘｐｒｏｔｅｉｎ（以下、ＨＨＥＸとも言う））を発現したリンパ管新生促進因子発現線維芽細胞、及びそれを含む医薬組成物に関する。

　リンパ管は、血管系と並列に走行し、全身に分布している導管ネットワークである。線維症の治療・改善（非特許文献１）、生体の組織液の恒常性維持（非特許文献２）、脂質及びビタミンの輸送（非特許文献３）、免疫監視の調節において重要な役割を果たしている（非特許文献４）。心臓においても、リンパ管は正常な心拍出量の維持のために、体液のバランス維持を行っている。
　近年、リンパ管の形成促進効果（以下、リンパ管新生と呼ぶ）は心筋虚血及び心筋梗塞後の心拍出量回復のための治療標的として有用であることが報告されており、また、浮腫を軽減させるための治療ターゲットとしても注目されている（非特許文献１）。

　ＡＤＭは心血管系及びリンパ系の発達において重要な機能を担う心臓保護ペプチドである。ＡＤＭはリンパ管内皮細胞のバリアを安定化し、リンパ管新生を促進することが報告されている（非特許文献５）。臨床においても、急性心筋梗塞患者へＡＤＭを静脈内投与することによって有意な心血管系の改善をもたらすことが報告されている（非特許文献６）。

　ＨＨＥＸは、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２の直接的な転写調節因子として知られている他、ＶＥＧＦＣ／ＦＬＴ４／ＰＲＯＸ１シグナルを介してリンパ管新生を調節することが報告されている（非特許文献７）。

　また、間質性肺炎は、新型コロナウィルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）などのウイルス感染、加齢、喫煙などの危険因子や、膠原病やサルコイドーシスといった疾患などによって、肺胞の炎症反応が暴走状態（サイトカインストーム）となり、肺胞内で線維化が進行することで、肺のガス交換機能が損なわれる病態を指す（非特許文献８）。間質性肺炎のなかでも、発症要因を特定し得ない症状は特発性間質性肺炎（ＩＩＰｓ）と呼ばれ、本疾患は本邦における「難病（特定疾患）」に指定されている。ＩＩＰｓ患者の８０～９０％が該当する特発性肺線維症（ＩＰＦ）は特に現行治療に対して抵抗性を示し、診断後の平均生存期間が３～５年で、急性増悪後の平均生存期間は２か月以内と、多くのがんより予後不良な疾患として知られている。こうした背景から、ＩＰＦを含む間質性肺炎及び肺線維症の治療方法の開発が進められており、いくつかの医薬品が臨床応用されている。例えば、Ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅは強制換気量（ＦＶＣ）と６分間歩行距離の減少を遅らせ、特定の患者において死亡率を改善する可能性があることが示された。Ｎｉｎｔｅｄａｎｉｂもまた、ＦＶＣの減少を遅らせ、死亡率を低下させる傾向があることが示された。しかしながら、これらの治療方法では呼吸器症状の改善が認められず、急性増悪率も顕著な改善には至っていない。従って、肺機能は引き続き悪化の一途を辿ることが明らかとなっている。
　これらの問題点を克服するために、結合組織成長因子、インターロイキン（ＩＬ）－４及びＩＬ－１３抗体、ガレクチン－３阻害剤、リゾホスファチジン酸受容体拮抗剤、ホスホイノシトイド３キナーゼ経路阻害剤、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を始めとする数十種類の新規治療薬が開発されており、そのいくつかは臨床試験が進行しているが、肺線維症の急性増悪に対しては、現時点では有効な治療法が存在しない。

　近年、肺線維症は喘息や慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）と同様に、慢性的かつ反復的な炎症反応の賦活化が病態生理学的な発症要因として報告されている。健常肺においては、炎症性サイトカインがウイルス感染や傷害に対して肺の炎症反応の制御を担うことで組織の修復や恒常性維持に寄与しているが、肺線維症では炎症性サイトカインが過剰に産生され、炎症反応が暴走状態（サイトカインストーム）となることで、筋線維芽細胞病巣の形成が誘発され、その結果、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の過剰な沈着が生じ、線維化を誘導することが示されている（非特許文献９）。このような過剰な炎症反応による線維化の誘導には、リンパ管の構造的・機能的変化が関わっていることが示唆されている（非特許文献１０）。

　肺において、リンパ管は不連続な基底膜を持つ単一のリンパ内皮細胞（ＬＥＣ）壁で構成されており、末梢組織からリンパ節への抗原や抗原提示細胞の輸送管路や間質液のクリアランスとして機能している。線維症においてはリンパ管の障害が生じており、例えば放射線誘導性ＩＰＦ動物モデルでは、リンパ管密度の著しい減少が線維化の誘導に相関していることが報告されており（非特許文献１１）、ブレオマイシン誘導性ＩＰＦ動物モデルでは、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）－β陽性壁細胞が肺の損傷および修復における重要な分子であるヒアルロナンの排出を阻害することで肺のリンパ管障害を誘導していることが報告されている（非特許文献１２）。一方で、ヒトのＩＰＦは肺組織内のリンパ管密度が増加しているが、形成されたリンパ管は構造的・機能的な欠陥を有しており、ＰＤＧＦＲ陽性壁細胞の局在や断続的に破壊されたリンパ管の形成が観察される（非特許文献１３）。また、創傷治癒において線維症誘発性の線維芽細胞によるトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）－β１の過剰発現が、リンパ管内皮細胞の増殖と機能を阻害し、リンパ管を選択的に破壊することも報告されている（非特許文献１４）。

　本発明者らは、これまでに、心臓のリンパ管新生を効率的に誘導し、心不全の心収縮力を大きく改善することができる心臓由来のＶａｓｃｕｌａｒ　ｃｅｌｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ－１（ＶＣＡＭ－１、ＣＤ１０６）陽性線維芽細胞を見出しており（非特許文献１５）、成体心臓由来のＶＣＡＭ－１陽性線維芽細胞を作製する手法も見出している（特許文献１）。

国際公開第2020/045547号

Circulation. 2016;133: 1484-1497 Bull N Y Acad Med., 1938; 14: 231-251 Am J Physiol Endocrinol Metab., 2009; 296: E1183-E1194 Front Immunol., 2016; 7: 613 Peptides, 2008; 29: 2243-2249 J Cardiovasc Pharmacol., 2010; 56: 413-419 Nat Commun., 2018; 9; Article number 2704 Ann Intern Med., 2020;172(9):629-632 Semin Respir Crit Care Med., 2006;27:600-612 Lymphat Res Biol., 2009;7:197-203 Lymphat Res Biol., 2014;12:238-250 Blood, 2012;119:5931-5942 Lymphat Res Biol., 2010;8:199-207 Am J Physiol - Heart Circ Physiol., 2008;295:2113-2127 PLoS One., 2020;15:e0237810 Pulm Pharmacol Ther., 2012 Aug;25:281-285 Stem Cells Transl Med. 2017;6(10):1905-1916

　本発明は、リンパ管新生能を有する線維芽細胞及びそれを含む医薬組成物を提供することを課題とする。

　本発明者らは上記課題を解決すべく検討を進め、ＴＮＦ－α及びＩＬ－４と接触させた線維芽細胞が、ＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸの遺伝子発現レベルを有意に向上させることを見出し、本発明を完成させた。

　すなわち、本発明は以下の第１の側面（発明Ａ）を含む。
（Ａ１）ＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ高発現の線維芽細胞を含む医薬組成物。
（Ａ２）前記線維芽細胞が成体由来の線維芽細胞である、（Ａ１）に記載の医薬組成物。
（Ａ３）前記細胞のＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸの遺伝子発現量が、対照となる線維芽細胞と比較して、１．２０倍以上高いものである、（Ａ１）又は（Ａ２）に記載の医薬組成物。
（Ａ４）線維症を治療するための、（Ａ１）～（Ａ３）のいずれかに記載の医薬組成物。
（Ａ５）リンパ管新生能が低下している状態を改善するための、（Ａ１）～（Ａ４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（Ａ６）組織液の恒常性の障害を改善するための、（Ａ１）～（Ａ５）のいずれかに記載の医薬組成物。
（Ａ７）浮腫を軽減するための、（Ａ１）～（Ａ６）のいずれかに記載の医薬組成物。
（Ａ８）脂質及び／又はビタミンの輸送能の障害を改善するための、（Ａ１）～（Ａ７）のいずれかに記載の医薬組成物。
（Ａ９）免疫監視機構を活性化するための、（Ａ１）～（Ａ８）のいずれかに記載の医薬組成物。
（Ａ１０）注射用組成物である、（Ａ１）～（Ａ９）のいずれかに記載の医薬組成物。
（Ａ１１）前記細胞が、平面状又は立体状の細胞組織として構築されたものである、（Ａ１）～（Ａ９）のいずれかに記載の医薬組成物。
（Ａ１２）前記線維芽細胞が心臓由来の線維芽細胞である、（Ａ１）～（Ａ１１）のいずれかに記載の医薬組成物。

　また、本発明は以下の第２の側面（発明Ｂ）を含む。
（Ｂ１）対象において、線維症を治療する方法であって、ＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ高発現の線維芽細胞を含む医薬組成物を、該対象に投与又は移植することを含む、方法。
（Ｂ２）対象において、リンパ管新生能が低下している状態を改善する方法であって、ＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ高発現の線維芽細胞を含む医薬組成物を、該対象に投与又は移植することを含む、方法。
（Ｂ３）対象において、組織液の恒常性の障害を改善する方法であって、ＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ高発現の線維芽細胞を含む医薬組成物を、該対象に投与又は移植することを含む、方法。
（Ｂ４）対象において、浮腫を軽減する方法であって、ＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ高発現の線維芽細胞を含む医薬組成物を、該対象に投与又は移植することを含む、方法。
（Ｂ５）対象において、脂質及び／又はビタミンの輸送能の障害を改善する方法であって、ＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ高発現の線維芽細胞を含む医薬組成物を、該対象に投与又は移植することを含む、方法。
（Ｂ６）対象において、免疫監視機構を活性化する方法であって、ＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ高発現の線維芽細胞を含む医薬組成物を、該対象に投与又は移植することを含む、方法。
（Ｂ７）対象において、臓器不全を治療する方法であって、ＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ高発現の線維芽細胞を含む医薬組成物を、該対象に投与又は移植することを含む、方法。

　また、本発明は以下の第３の側面（発明Ｃ）を含む。
（Ｃ１）ＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ高発現の線維芽細胞を含む医薬組成物の、不全臓器組織及び／若しくはその周辺領域、又は線維化組織及び／若しくはその周辺領域に投与するための注射剤としての使用。
（Ｃ２）ＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ高発現の線維芽細胞を含む医薬組成物の、不全臓器組織及び／若しくはその周辺領域、又は線維化組織及び／若しくはその周辺領域に移植するための移植材料としての使用。

　本発明は以下の第４の側面（発明Ｄ）を含む。
（Ｄ１）ＡＤＭ高発現の線維芽細胞の製造方法であって、
　線維芽細胞に、ＴＮＦ－α及びＩＬ－４を接触させること、並びに
　前記接触させた線維芽細胞を、ＡＤＭが高発現になり得る条件下で培養すること、
を含む、ＡＤＭ高発現の線維芽細胞の製造方法。
（Ｄ２）前記線維芽細胞が、ＶＥＧＦ－Ｃ高発現である、（Ｄ１）に記載の方法。
（Ｄ３）前記線維芽細胞が、ＣＤ１０６陽性である、（Ｄ１）又は（Ｄ２）に記載の方法。
（Ｄ４）抗ＣＤ１０６抗体を用いて、ＡＤＭ高発現の線維芽細胞を選択又は濃縮することを含む、（Ｄ３）に記載の方法。
（Ｄ５）前記線維芽細胞が肺由来の線維芽細胞である、（Ｄ１）～（Ｄ４）のいずれかに記載の方法。
（Ｄ６）（Ｄ１）～（Ｄ５）のいずれかに記載する製造方法によって得られる、ＡＤＭ高発現の線維芽細胞。
（Ｄ７）（Ｄ６）に記載する細胞を含む、線維芽細胞集団。

　本発明は以下の第５の側面（発明Ｅ）を含む。
（Ｅ１）ＡＤＭ高発現の線維芽細胞。
（Ｅ２）ＶＥＧＦ－Ｃ高発現である、（Ｅ１）に記載の線維芽細胞。
（Ｅ３）ＣＤ１０６陽性である、（Ｅ１）又は（Ｅ２）に記載の線維芽細胞。
（Ｅ４）前記細胞のＶＥＧＦ－Ｃ及び／又はＡＤＭの遺伝子発現量が、対照となる線維芽細胞と比較して、それぞれ１．２０倍以上高いものである、（Ｅ１）～（Ｅ３）のいずれかに記載の細胞。
（Ｅ５）前記線維芽細胞が肺由来の線維芽細胞である、（Ｅ１）～（Ｅ４）のいずれかに記載の細胞。
（Ｅ６）（Ｅ１）～（Ｅ５）のいずれかに記載の細胞を含む、線維芽細胞集団。
（Ｅ７）ＣＤ１０６陽性である肺由来線維芽細胞を含む細胞集団であって、
　前記ＣＤ１０６陽性である肺由来線維芽細胞の割合（細胞数基準）が、前記細胞集団中に含まれる全線維芽細胞に対して１８．０１％超である、細胞集団。

　本発明は以下の第６の側面（発明Ｆ）を含む。
（Ｆ１）（Ｄ６）及び（Ｅ１）～（Ｅ５）のいずれかに記載の細胞又は（Ｄ７）及び（Ｅ６）～（Ｅ７）のいずれかに記載の細胞集団を含む、医薬組成物。
（Ｆ２）肺疾患を治療するための、（Ｆ１）に記載の医薬組成物。
（Ｆ３）前記肺疾患が、肺線維症又は間質性肺炎である、（Ｆ２）に記載の医薬組成物。
（Ｆ４）リンパ管新生能が低下している状態を改善するための、（Ｆ１）に記載の医薬組成物。
（Ｆ５）注射用組成物である、（Ｆ１）～（Ｆ４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（Ｆ６）前記細胞または前記細胞集団が、平面又は立体の形状の細胞組織として構築されたものである、（Ｆ１）～（Ｆ４）のいずれかに記載の医薬組成物。

　本発明は以下の第７の側面（発明Ｇ）を含む。
（Ｇ１）対象において、肺疾患を治療する方法であって、（Ｄ６）及び（Ｅ１）～（Ｅ５）のいずれかに記載の細胞、（Ｄ７）及び（Ｅ６）～（Ｅ７）のいずれかに記載の細胞集団又は（Ｆ１）に記載の医薬組成物を、該対象に投与又は移植することを含む、方法。
（Ｇ２）前記肺疾患が、肺線維症又は間質性肺炎である、（Ｇ１）に記載の方法。
（Ｇ３）対象において、リンパ管新生能が低下している状態を改善する方法であって、（Ｄ６）及び（Ｅ１）～（Ｅ５）のいずれかに記載の細胞、（Ｄ７）及び（Ｅ６）～（Ｅ７）のいずれかに記載の細胞集団又は（Ｆ１）に記載の医薬組成物を、該対象に投与又は移植することを含む、方法。

　本発明は以下の第８の側面（発明Ｈ）を含む。
（Ｈ１）（Ｄ６）及び（Ｅ１）～（Ｅ５）のいずれかに記載の細胞、（Ｄ７）及び（Ｅ６）～（Ｅ７）のいずれかに記載の細胞集団又は（Ｆ１）に記載の医薬組成物の、肺組織及び／又はその周辺領域に投与するための注射剤としての使用。
（Ｈ２）（Ｄ６）及び（Ｅ１）～（Ｅ５）のいずれかに記載の細胞、（Ｄ７）及び（Ｅ６）～（Ｅ７）のいずれかに記載の細胞集団又は（Ｆ１）に記載の医薬組成物の、肺組織及び／又はその周辺領域に移植するための移植材料としての使用。

　本発明により、リンパ管新生能を有する線維芽細胞を含む医薬組成物、すなわちＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ高発現細胞を含む医薬組成物を提供することができ、また該医薬組成物を用いた線維症を治療する手段やリンパ管新生能低下状態を改善する手段、組織液の恒常性や脂質及び／又はビタミンの輸送や免疫監視の調節や臓器不全を治療する手段を提供することができた。また、ＡＤＭ高発現の線維芽細胞を提供すること、及び該細胞を用いた肺疾患を治療する手段を提供することができた。

各培養条件における成体由来心臓線維芽細胞の特徴を表す図である。Ａは、培養した心臓線維芽細胞の顕微鏡写真である（スケールバー：５００μｍ）。無処置（ＮＴ）はサイトカインを添加していない無処置の心臓線維芽細胞を表し、＋ＣＫｓはＴＮＦ－αとＩＬ－４を添加した心臓線維芽細胞を表す。Ｂはフローサイトメトリの解析図である。散布図は横軸がＣＤ９０発現量を示し、縦軸がＣＤ１０６発現量を示す。ヒストグラムはそれぞれＣＤ９０発現量及びＣＤ１０６発現量を示す。各培養条件における成体由来心臓線維芽細胞のリンパ管新生遺伝子の発現量を表す図である。Ａは、ＡＤＭのｍＲＮＡ発現量を示すリアルタイム定量ＲＴ－ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）の解析結果である。すべての群における線維芽細胞のＡＤＭ遺伝子発現量は、β－Ａｃｔｉｎの遺伝子発現量で標準化し、各条件の遺伝子発現量の差をＦｏｌｄ　ｉｎｃｒｅａｓｅで表した。ＮＴは無処置の心臓線維芽細胞を表し、＋ＣＫｓはＴＮＦ－αとＩＬ－４を添加した心臓線維芽細胞を表す。Ｂは、ＨＨＥＸのｍＲＮＡ発現量を示すＲＴ－ｑＰＣＲの解析結果である。ＡＤＭと同様に、すべての群のＨＨＥＸ遺伝子発現量は、β－Ａｃｔｉｎで標準化し、Ｆｏｌｄ　ｉｎｃｒｅａｓｅで表した（＊＊Ｐ＜０．０１　ｖｓ.　ＮＴ）。ヒト成体由来心臓線維芽細胞のリンパ管新生効果を表す図である。Ａは、蛍光顕微鏡観察による各種ヒト心臓線維芽細胞の心臓リンパ管の脈管形成効果を示す写真である。キャピラリー様構造はＶａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ（ＶＥ）－Ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性細胞を示し、心臓由来細胞から回収したリンパ管内皮細胞により形成された脈管を指す。その他の細胞領域はＶｉｍｅｎｔｉｎで各種の心臓線維芽細胞を示す．核はＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８で示した（１０×倍率）。ＮＴは無処置の心臓線維芽細胞を表し、＋ＣＫｓはＴＮＦ－αとＩＬ－４を添加した心臓線維芽細胞を表す。Ｂは、蛍光顕微鏡観察画像の定量評価を表す。ＮＴの値を１とし、Ｆｏｌｄ　ｉｎｃｒｅａｓｅで表した（＊＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．ＮＴ、＊Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＮＴ、Ｎ＝１２）。各種の線維芽細胞のフローサイトメトリ解析図を表す図である。上段は、ヒト成体由来心臓線維芽細胞（Ａ－ＨＣＦ）、成体由来心臓線維芽細胞にＴＮＦ－α及びＩＬ－４を添加し、７２時間培養した成体由来心臓線維芽細胞（ｕＡ－ＨＣＦ）及び成体由来心臓線維芽細胞にＴＮＦ－αとＩＬ－４を添加し、７２時間培養した後に、ＣＤ９０を指標にセルソーティングしたＣＤ９０陽性成体由来心臓線維芽細胞（ｕＡ９０－ＨＣＦ）におけるＣＤ９０発現量及びＣＤ１０６発現量を示す。下段は、ヒト胎児由来心臓線維芽細胞（Ｆ－ＨＣＦ）、ＣＤ１０６陰性胎児由来心臓線維芽細胞（Ｆ－ＶＮＣＦ）及びＣＤ１０６陽性胎児由来心臓線維芽細胞（Ｆ－ＶＣＦ）におけるＣＤ９０発現量及びＣＤ１０６発現量を示す。ヒト成体由来心臓線維芽細胞による線維症治療効果を表す図である。Ａは、各種成体由来心臓線維芽細胞（＋Ａ－ＨＣＦｓ、＋ｕＡ－ＨＣＦｓ、＋ｕＡ９０－ＨＣＦｓ）を投与した慢性心不全ラット心臓組織のシリウスレッド（ＳＲ）染色画像を表す顕微鏡写真である。Ｂは、各種成体由来心臓線維芽細胞を投与した慢性心不全ラット心臓組織の線維化領域の定量評価を示す図である（Ｎ＝４）。Ｃは、胎児由来心臓線維芽細胞（＋Ｆ－ＶＣＦ）を投与した慢性心不全ラット心臓組織のシリウスレッド染色画像を表す顕微鏡写真である。Ｄは、胎児由来心臓線維芽細胞（＋Ｆ－ＶＣＦ）を投与した慢性心不全ラット心臓組織の線維化領域の定量評価を示す図である（ＮＳ＝ｎｏｔ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ、Ｎ＝４、＊＊Ｐ＜０．０１　ｖｓ．　Ｃｏｎｔｒｏｌ、＊Ｐ＜０．０５　ｖｓ．　Ｃｏｎｔｒｏｌ、††Ｐ＜０．０１　ｖｓ．　Ｓｈａｍ、†Ｐ＜０．０５　ｖｓ．　Ｓｈａｍ、‡Ｐ＜０．０５　ｖｓ．　＋Ａ－ＨＣＦｓ）。ヒト成体由来心臓線維芽細胞による線維症治療効果を表す図である。Ａは、各種成体由来心臓線維芽細胞（＋Ａ－ＨＣＦｓ、＋ｕＡ－ＨＣＦｓ、＋ｕＡ９０－ＨＣＦｓ）を投与した慢性心不全ラット心臓組織のヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色画像を表す顕微鏡写真である。Ｂは、Ａに記載されるａ～ｌの部分を拡大した顕微鏡写真である。Ｃは、病理学的定性スコアリングを示す表である。病理変化の程度は、変化なし（スコア０）、軽度（スコア１）、中等度（スコア２）、重度（スコア３）として定性的に評価した。スコアリング項目は、炎症細胞の凝集（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｃｅｌｌ　ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）、線維芽細胞の増殖（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、線維症（Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、石灰化（Ｌｉｍｅ　ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）、及び左室壁の菲薄化（Ｔｈｉｎｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｌｅｆｔ　ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）である。ヒト成体由来心臓線維芽細胞による心筋内のリンパ管新生効果を示す。成体由来心臓線維芽細胞（＋Ａ－ＨＣＦｓ、＋ｕＡ－ＨＣＦｓ、＋ｕＡ９０－ＨＣＦｓ）を投与した慢性心不全ラット心臓組織のＬｙｖｅ－１染色画像を表す顕微鏡写真である（ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）。右列の各パネルは、それぞれ左列の各パネル中の四角枠内を拡大したものである。ラット心臓のリンパ管内皮細胞の局在を示す図である。成体由来心臓線維芽細胞（＋Ａ－ＨＣＦｓ、＋ｕＡ－ＨＣＦｓ、＋ｕＡ９０－ＨＣＦｓ）を投与した慢性心不全モデルラット心臓組織の免疫組織染色画像を表す顕微鏡写真である。＋ｕＡ９０－ＨＣＦｓは、低倍率及び高倍率の写真を示す。心筋構造をｃＴｎＴで示し、中央の管腔構造をＰｒｏｘ－１またはＶＥＧＦＲ３で示し、核をＤＡＰＩで示した。ヒト成体由来肺線維芽細胞の形態とリンパ管新生能を示す図である。Ａは、ヒト肺線維芽細胞の明視野観察像を示す顕微鏡写真である（５×倍率）。Ｂは、ヒト肺線維芽細胞（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と、ＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ－４（２ｎｇ／ｍＬ）を添加して２４時間培養したヒト肺線維芽細胞（＋Ｆａｃｔｏｒ－Ｘ）の明視野観察像を示す顕微鏡写真である（５×倍率）。Ｃ及びＤは、フローサイトメトリ（ＦＣＭ）解析による各種ヒト肺線維芽細胞のＣＤ９０（線維芽細胞マーカー）及びＣＤ１０６（ＶＣＡＭ－１）陽性細胞率を示す（Ｎ＝３、＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定による、Ｎ．Ｓ．は有意差なしを表す）。Ｅは、ＲＴ－ｑＰＣＲ解析による各種ヒト肺線維芽細胞のｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）－Ｃ及びＡｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ（ＡＤＭ）遺伝子発現量の相対比較図を示す。Ｃｏｎｔｒｏｌの遺伝子発現量を１として表した（Ｎ＝３、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定による）。ヒト肺由来細胞から回収したリンパ管内皮細胞の形態とヒト成体由来肺線維芽細胞のリンパ管新生効果を示す図である。Ａは、ヒト微小血管内皮細胞の明視野観察像を示す顕微鏡写真である（５×倍率）。Ｂは、ＦＣＭ解析によるヒト微小血管内皮細胞のＶａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ（ＶＥ）－Ｃａｄｈｅｒｉｎ及びＰｏｄｏｐｌａｎｉｎ（ＰＤＰＮ）陽性細胞率を示す（各グラフ中、左側のピークはアイソタイプコントロール染色サンプルを示し、右側のピークは各種抗体染色サンプルを示す）。Ｃは、蛍光顕微鏡観察による各種ヒト肺線維芽細胞の肺リンパ管の脈管形成効果を示す写真である。キャピラリー様構造はＶＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性細胞を示し、肺由来細胞から回収したリンパ管内皮細胞により形成された脈管を指す。その他の細胞領域はＶｉｍｅｎｔｉｎで各種肺線維芽細胞を示す。核はＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８で示した（１０×倍率）。マウス成体由来肺線維芽細胞の形態とリンパ管新生能を示す図である。Ａは、マウス肺線維芽細胞の明視野観察像を示す顕微鏡写真である（５×倍率）。Ｂは、ＦＣＭ解析によるマウス肺線維芽細胞のＶＣＡＭ－１陽性細胞率を示す（各グラフ中、左側のピークはアイソタイプコントロール染色サンプルを示し、右側のピークは各種抗体染色サンプルを示す）。Ｃは、ＲＴ－ｑＰＣＲ解析による各種マウス肺線維芽細胞のＶＥＧＦ－Ｃ及びＡＤＭ遺伝子発現量の相対比較を示す。Ｃｏｎｔｒｏｌの遺伝子発現量を１として表した（Ｎ＝３、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定による）。ＡＤＭ高発現且つＶＣＡＭ－１発現向上型成体由来肺線維芽細胞（ＶＰＦ）による間質性肺炎・肺線維症の治療効果を示す図である。Ａは、動物実験デザインを示す。ブレオマイシン溶液投与７日後の病態モデルマウスに細胞を投与し、その４週間後にマウスを犠牲死して肺を採材した。Ｂは、各群のＫａｐｌａｎ－ｍｅｉｅｒ法による生存分析図を示す。ドットは打ち切り点を指す。Ｃは、各群のシリウスレッド染色画像を表す顕微鏡写真である。投与２週後における各種線維芽細胞の治療効果を示す図である。Ａは、生存分析図を示す。ＰＦ投与群（＋ｍＰＦ）はｎ＝７、ｍＶＰＦ投与群（＋ｍＶＰＦ）はｎ＝５、生理食塩液投与群（Ｃｔｒｌ）はｎ＝１１で実施した。Ｐ値はログランク（マンテル・コックス）検定で算出した。Ｂは、各群の肺の線維化領域と肺胞構造を示す顕微鏡写真である。細胞投与１４日後に採材した肺組織をＭａｓｓｏｎ’ｓ　Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色した。ＢＬＭは細胞投与０日の肺組織を示し、Ｃｔｒｌは生理食塩液投与群の肺組織を示す（スケールバー：５００μｍ）。Ｃは、各群の肺の線維化領域の定量評価（ＢＬＭ：ｎ＝５、Ｃｔｒｌ：ｎ＝６、＋ｍＰＦ：ｎ＝４、＋ｍＶＰＦ：ｎ＝５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＝０．０００６、ｎｓは有意差なしを表す、ｏｒｄｉｎａｒｙ　ｏｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ　ｗｉｔｈ　Ｔｕｋｅｙ’ｓ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ　ｔｅｓｔ）。プライマリーにより回収したｒＰＦとｒＶＰＦの細胞特性を示す図である。Ａは、各継代数のｒＰＦの様子を示す顕微鏡写真である。ＰＮはＰａｓｓａｇｅ　ｎｕｍｂｅｒ（継代数）を指す。Ｂは、ｒＰＦとｒＶＰＦの明視野観察画像を示す写真である。Ｃは、フローサイトメトリ解析図を示す。投与２週後における各種線維芽細胞の治療効果を示す図である。Ａは、各群の肺の線維化領域と肺胞構造を示す顕微鏡写真である。細胞投与０日又は１４日後に採材した肺組織をＭａｓｓｏｎ’s　Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色した。ＢＬＭは細胞投与０日の肺組織を示し、Ｃｔｒｌは生理食塩液投与群の肺組織を示す。Ｂは、各群の肺の線維化領域の定量評価を示すグラフである（ＢＬＭ：ｎ＝５、Ｃｔｒｌ：ｎ＝６、＋ｒＰＦ：ｎ＝７、＋ｒＶＰＦ：ｎ＝８、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＝０．０００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎｓは有意差なしを表す、ｏｒｄｉｎａｒｙ　ｏｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ　ｗｉｔｈ　Ｔｕｋｅｙ’ｓ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ　ｔｅｓｔにより計算）。フローサイトメトリ（ＦＣＭ）解析による各種ヒト肺線維芽細胞のＣＤ９０（線維芽細胞マーカー）及びＣＤ１０６（ＶＣＡＭ－１）陽性細胞率を示す（Ｎ＝５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎｓは有意差なしを表す、２－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ　ｗｉｔｈ　Ｔｕｋｅｙ’ｓ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ　ｔｅｓｔにより計算）。ｈＰＦはヒト肺線維芽細胞を指し、ｈＰＦ＋ＣＫｓはＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ－４（２ｎｇ／ｍＬ）を添加して７２時間培養したヒト肺線維芽細胞を指す。ｈＶＰＦはＣＤ１０６を指標にセルソーティングを行ったｈＰＦ＋ＣＫｓを指す。

　以下、本発明について具体的実施形態を用いて詳細に説明するが、本発明は示された具体的実施形態にのみ限定されるものではない。

＜ＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ高発現の線維芽細胞を含む医薬組成物＞
　第１の発明の一実施形態は、ＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ高発現の線維芽細胞を含む医薬組成物である。

　線維芽細胞の由来に制限はなく、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）及びＭｕｓｅ細胞等の多能性幹細胞や、間葉系幹細胞などの成体幹細胞を分化させて用いてもよい。また、動物（ヒトを含む）から採取したプライマリー細胞を用いてもよく、株化した細胞を用いてもよい。
　線維芽細胞の由来臓器は、例えば、心臓由来、腎臓由来、皮膚由来、肺由来などが挙げられる。
　線維芽細胞は、特に限定されないが、成体由来であることが好ましい。
　ＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ高発現の線維芽細胞の由来となる線維芽細胞は、ＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸはもともと一定量発現していてもよく、全く発現していなくてもよい。
　また、本実施形態において線維芽細胞とは、通常の線維芽細胞が発現している細胞表面マーカーを発現している細胞のことであってもよく、さらに後述の本発明の細胞の製造方法によって、追加で他のマーカーが発現した又は一部のマーカーが発現していない細胞であってもよい。

　ＡＤＭが高発現であるとは、特に限定されないが、例えば、ｍＲＮＡ発現量をＲＴ－ｑＰＣＲで測定した時に、対照となる線維芽細胞のｍＲＮＡ発現量を１とした場合、本実施形態の医薬組成物中の線維芽細胞におけるＡＤＭのｍＲＮＡ発現量が、１．２０倍以上、１．４０倍以上、１．５０倍以上、１．６０倍以上、１．７０倍以上、１．８０倍以上、１．９０倍以上、２．００倍以上、２．３０倍以上、３．００倍以上、４．００倍以上、５．００倍以上、６．００倍以上、７．００倍以上、８．００倍以上、９．００倍以上、１０．０倍以上、又はそれ以上の倍数増加していることが好ましい。
　なお、対照となる線維芽細胞のｍＲＮＡ発現量とは、未処置の線維芽細胞におけるｍＲＮＡ発現量であってもよく、また処置後の細胞全体の平均ｍＲＮＡ発現量であってもよい。
　またタンパク質発現量をフローサイトメトリ法によって測定した時に、ＡＤＭポジティブ（以下、ＡＤＭ＋とも言う）線維芽細胞の割合が細胞数基準でそれぞれ０．１％以上であってよく、１％以上であってよく、２％以上であってよく、４％以上であってよく、５％以上であってよく、１０％以上であってよく、２０％以上であってよく、３０％以上であってよく、４０％以上であってよく、５０％以上であってよく、６０％以上であってよく、７０％以上であってよく、８０％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってよく、９８％以上であってよく、９９％以上であってよい。

　ＨＨＥＸが高発現であるとは、特に限定されないが、例えば、ｍＲＮＡ発現量をＲＴ－ｑＰＣＲで測定した時に、対照となる線維芽細胞のｍＲＮＡ発現量を１とした場合、本実施形態の医薬組成物中の線維芽細胞におけるＨＨＥＸのｍＲＮＡ発現量が、１．２０倍以上、１．４０倍以上、１．５０倍以上、１．６０倍以上、１．７０倍以上、１．８０倍以上、１．９０倍以上、２．００倍以上、２．５８倍以上、３．００倍以上、４．００倍以上、５．００倍以上、６．００倍以上、７．００倍以上、８．００倍以上、９．００倍以上、１０．０倍以上、又はそれ以上の倍数増加していることが好ましい。
　なお、対照となる線維芽細胞のｍＲＮＡ発現量とは、未処置の線維芽細胞におけるｍＲＮＡ発現量であってもよく、また処置後の細胞全体の平均ｍＲＮＡ発現量であってもよい。
　またタンパク質発現量をフローサイトメトリ法によって測定した時に、ＨＨＥＸポジティブ（以下、ＨＨＥＸ＋とも言う）線維芽細胞の割合が細胞数基準でそれぞれ０．０３％以上であってよく、０．１％以上であってよく、１％以上であってよく、２％以上であってよく、４％以上であってよく、５％以上であってよく、１０％以上であってよく、２０％以上であってよく、３０％以上であってよく、４０％以上であってよく、５０％以上であってよく、６０％以上であってよく、７０％以上であってよく、８０％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってよく、９８％以上であってよく、９９％以上であってよい。

　本実施形態において、リンパ管新生促進因子とは、好ましくはＡＤＭ又はＨＨＥＸの遺伝子又タンパク質のことである。
　リンパ管新生促進因子の有する塩基配列やアミノ酸配列は特に限定されないが、例えば、ＡＤＭは、配列番号１で表される塩基配列を有する遺伝子、又はその塩基配列と９０％以上、９５％以上若しくは９８％以上同一の塩基配列を有する遺伝子であって、配列番号１で表される塩基配列の全体又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、リンパ管新生能を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよく、ＨＨＥＸは、配列番号２で表される塩基配列を有する遺伝子、又はその塩基配列と９０％以上、９５％以上若しくは９８％以上同一の塩基配列を有する遺伝子であって、配列番号２で表される塩基配列の全体又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、リンパ管新生能を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。

　本実施形態の医薬組成物中の線維芽細胞は、細胞表面マーカーとしてＣＤ１０６を発現していてもよい。

　本実施形態の医薬組成物中の線維芽細胞は、上述のＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ高発現の線維芽細胞を含む、線維芽細胞集団であってもよい。
　本実施形態において、後述のＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ高発現の線維芽細胞の製造方法によって製造された線維芽細胞を含む線維芽細胞集団のうちＣＤ１０６陽性細胞の割合は高くてもよいが、その逆は必ずしも成り立たなくてもよい。

（線維芽細胞の準備）
　線維芽細胞の準備において、線維芽細胞の由来は特に限定はされず、既に述べたとおりである。一方で、自己由来の細胞であってよく、例えば心臓疾患を患っている患者の心臓組織から単離した心臓線維芽細胞や、患者の成体（体性）幹細胞を分化させて単離した腎臓線維芽細胞を準備する。また、自己の細胞由来のｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を分化させて、回収した線維芽細胞であってもよい。加えて、自己以外の細胞であってよく、例えば心臓細胞を提供するドナー由来の心臓組織や、動物等を利用して作製した心臓組織から単離した心臓線維芽細胞や、ドナーの成体（体性）幹細胞を分化させて単離した心臓線維芽細胞を準備する。また、ドナー由来のｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の多能性幹細胞を分化させて、回収した線維芽細胞であってもよい。

（線維芽細胞の分離）
　準備された線維芽細胞は、典型的にはディスパーゼ、コラゲナーゼのような酵素により処理されることで分離され得る。分離はディスパーゼ、コラゲナーゼのような酵素により行われる他、必要とされる分離が可能であれば、その他の処理、例えば機械的処理であってよい。

（ＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ高発現の線維芽細胞の製造方法）
線維芽細胞にＴＮＦ－α及びＩＬ－４を接触させること、並びに前記接触させた線維芽細胞を、ＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ高発現になり得る条件下で培養すること、を含むものである。

　線維芽細胞とＴＮＦ－α及びＩＬ－４との接触の方法はＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ高発現の線維芽細胞の誘導が顕著に害されない限り特段限定されず、典型的には線維芽細胞を含む培地にＴＮＦ－α及びＩＬ－４を添加することであるが、これに限られない。ＴＮＦ－α及びＩＬ－４は、１種類のみ添加してもよく、複数種類を添加してもよい。複数種類の場合は、それぞれ別々に線維芽細胞と接触させてもよく、同時に接触させてもよい。例えば、ＴＮＦ－α及びＩＬ－４を水、培地、血清、またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた後で、培地に添加してもよい。

　ＴＮＦ－α及びＩＬ－４を添加した培地で線維芽細胞を培養できることから、線維芽細胞におけるＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸの発現レベルを維持したまま線維芽細胞を培養できる。そのため、高いＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ発現レベルを有する線維芽細胞を製造することができる。

　ＴＮＦ－α及びＩＬ－４を培地（ｍＬ）に添加する場合、ＴＮＦ－αの添加量は特段限定されないが、通常０.１ｎｇ／ｍＬ以上であり、０．５ｎｇ／ｍＬ以上であってよく、１ｎｇ／ｍＬ以上であってよく、１０ｎｇ／ｍＬ以上であってよく、５０ｎｇ／ｍＬ以上であってよい。上限は特に限定されず、通常５００ｎｇ／ｍＬ以下であり、１００ｎｇ／ｍＬ以下であってよい。
　また、ＩＬ－４の添加量は特段限定されないが、通常０．１ｎｇ／ｍＬ以上であり、０．５ｎｇ／ｍＬ以上であってよく、１ｎｇ／ｍＬ以上であってよく、２ｎｇ／ｍＬ以上であってよい。上限は特に限定されず、通常１０ｎｇ／ｍＬ以下であり、５ｎｇ／ｍＬ以下であってよく、１ｎｇ／ｍＬ以下であってよい。
　添加するＴＮＦ－αとＩＬ－４の比（重量比）は、ＴＮＦ－α：ＩＬ－４で通常１００００：１～１：１であり、５００００：１～１０：１であってもよい。また、１：１～１：１００００であり、１：１０～１：５００００であってもよい。

　ＴＮＦ－α及びＩＬ－４を接触させた線維芽細胞を更に培養することで、ＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ＋線維芽細胞を製造することができる。
　線維芽細胞の培養は、線維芽細胞がＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸポジティブになり得る条件下であれば特段限定されず、既知の細胞培養方法により行ってよい。

　培養に用いられる培地は、培養する細胞の種類等により適宜設定可能であるが、例えば、ＤＭＥＭ、α－ＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０、ＨＦＤＭ－１（＋）等が使用可能である。該培地にＦＣＳやＦＢＳ等の栄養物質や増殖因子、サイトカイン、抗生物質等を添加してもよい。さらに、ＴＮＦ－α及びＩＬ－４を含む培地で培養してもよい。
　培養期間は、培養した細胞が所望の細胞数となるまで、及び／又は培養した細胞が所望の機能が備わるまで等の目的に応じて培養時間や培養日数を適宜設定できる。例えば、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１５時間、１８時間、２１時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、２週間、１か月、２か月、３か月、６か月等の期間があげられる。
　培養温度は、培養する細胞の種類に合わせて適宜設定可能であるが、例えば１０℃以上、１５℃以上、２０℃以上、２５℃以上、３０℃以上であってよく、また６０℃以下、５５℃以下、５０℃以下、４５℃以下、４０℃以下であってよい。
　培養は複数回行ってもよい。例えば選択又は濃縮により所望の線維芽細胞の純度を向上させ、その都度培養を行うことができる。

　線維芽細胞の製造において、さらに抗ＣＤ１０６抗体を用いてＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸを高発現する線維芽細胞を選択又は濃縮することを含んでもよい。選択又は濃縮の方法は特に限定されず、当業者に既知の方法で行うことができ、例えば、ヒトＣＤ１０６（ＶＣＡＭ－１）－ビオチン（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）で一次免疫染色を実施し、抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）で二次免疫染色し、染色した細胞をａｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）で、回収することによって行うことができる。また、選択又は濃縮はどのタイミングで行ってもよい。
　抗ＣＤ１０６抗体は、既知のものを使用することが可能であり、市販品を入手して使用できる。
　抗ＣＤ１０６抗体を用いて選択又は濃縮することで、線維芽細胞集団におけるＣＤ１０６陽性線維芽細胞の割合を増加させることができ、さらにはＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ＋線維芽細胞の割合を増加させることができる。

　培養した線維芽細胞の回収は、例えば、トリプシン等のプロテアーゼにより細胞を剥離して回収してよいが、温度応答性培養皿を使用して、温度変化により細胞を剥離させ、回収してもよく、セルスクレーパーなどの器具を使用して細胞を剥離させ、回収してもよい。

　本実施形態の医薬組成物を生体内に投与又は移植することにより、生体内でリンパ管新生を促進させることができる。そのため、特に限定されないが、例えば臓器組織の障害、欠損、機能不全に起因する、リンパ管新生能が低下している状態を改善することや、組織液の恒常性の障害や脂質及び／又はビタミンの輸送能の障害を改善することや、免疫監視機構を活性化することができる。また、臓器不全を有する患者に投与することができるものであってもよく、これにより臓器不全を治療することができるものであってもよい。
　臓器不全としては、臓器が期待される機能を実行しない状態のこと及び／又は臨床的介入なしには正常な恒常性を維持できない程度の臓器機能障害のことを言う。具体的な臓器としては、特に限定されないが、例えば心臓、腎臓、副腎、甲状腺、副甲状腺、声帯、胸腺、大脳、小脳、脳幹、脊髄、末梢神経、皮膚、筋肉、眼球、舌、食道、胃、胆嚢、胆管、膵臓、膵管、肝臓、脾臓、小腸、大腸、直腸、肛門、気管、気管支、肺、膀胱、尿管、前立腺、動脈、静脈、リンパ管、リンパ節、骨、骨髄、軟骨、腱、歯、睾丸、精管、陰茎、子宮、卵巣、卵管、膣などが挙げられる。例えば、心臓や腎臓において臓器不全とは、臓器の機能が正常時と比較して低下した状態のことであってもよく、特に臓器の機能が正常時と比較して３０％以下に低下した状態のことであってもよい。
　本実施形態の医薬組成物を生体内に投与又は移植することにより、線維症を治療又は改善することができる。線維症の発症部位は特に限定されず、例えば、心臓、肺、腎臓などが挙げられる。

　本実施形態の医薬組成物を生体に投与又は移植する方法は、特に限定されないが、例えば注射により投与できる。医薬組成物を不全臓器若しくはその梗塞周辺領域（例えば、被膜下など）、又は線維症を発症した臓器における損傷領域、線維化領域若しくはその周辺領域に直接投与又は移植することで、上記の疾患状態の改善や臓器不全の治療が可能となる。また、医薬組成物は、静脈、動脈、リンパ節、リンパ管、骨髄、皮下、海綿体、腹腔内、筋肉、髄腔内、関節腔へ投与してもよい。静脈、動脈、リンパ管への投与は、脈管内への注射によるものでもよく、カテーテルにより注入されるものでもよく、その他の既知の手法を用いてもよい。
　注射の方法は特段限定されず、有針注射、無針注射等既知の注射手法を適用することができ、注入に用いるカテーテルの方法も既知の方法を適用することができ、特段限定されない。

　また、本実施形態の医薬組成物は、特に限定されないが、人工臓器材料として生体に適用されるものでもよく、例えば、その人工臓器材料は、細胞が平面状又は立体状の細胞組織として構築されたものでもよい。この平面状又は立体状の細胞組織は、線維芽細胞を単独で培養したものでもよく、又は線維芽細胞と他の細胞、例えば腎細胞を共培養した上で平面状又は立体状の細胞組織としたものでもよい。平面状又は立体状の細胞組織としては、特に限定されないが、例えば細胞シートや、セルファイバー、３Ｄプリンタにて形成された組織などが例示される。
　本実施形態において、平面状又は立体状の細胞組織の大きさや形状は、壊死、損傷又は線維化した臓器組織及び／又はその周辺領域及び／又は病変領域に適用できる限り特に限定されない。また平面状とは、単層又は複数層のいずれでもよい。
　なお、細胞培養における培地組成、温度、湿度といった条件は、ＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ＋線維芽細胞を培養することができ、かつ平面状又は立体状の細胞組織を構築できる限り特に限定されない。
　このような平面状又は立体状の細胞組織を壊死、損傷又は線維化した臓器組織及び／又はその周辺領域に適用することで、又は人工臓器として壊死、損傷又は線維化した臓器組織及び／又はその周辺領域と交換することで、リンパ管新生能が低下している状態を改善することや、組織液の恒常性の障害や脂質及び／又はビタミンの輸送能の障害を改善することや、免疫監視機構を活性化することや、臓器不全を治療することや、線維症を治療若しくは改善することができる。

　医薬組成物に含まれるＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ＋線維芽細胞の割合は、患者への投与又は移植の態様等に基づいて適宜設定され、有効成分として治療上有効量のＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ＋線維芽細胞が含まれていればよい。
　医薬組成物中に他の線維芽細胞を含む場合、例えば、医薬組成物に含まれる線維芽細胞全量に対し、ＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ＋線維芽細胞の割合は細胞数基準で０．０３％以上であってよく、０．１％以上であってよく、１％以上であってよく、２％以上であってよく、４％以上であってよく、５％以上であってよく、１０％以上であってよく、２０％以上であってよく、３０％以上であってよく、４０％以上であってよく、５０％以上であってよく、６０％以上であってよく、７０％以上であってよく、８０％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってよく、９８％以上であってよく、９９％以上であってよい。
　また、ヒト由来の線維芽細胞を用いた場合、医薬組成物に含まれるＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ＋線維芽細胞数において、対照となる線維芽細胞のＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ発現量に対する、ＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ＋線維芽細胞のＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ発現量は、１．２０倍以上、１．４０倍以上、１．５０倍以上、１．６０倍以上、１．７０倍以上、１．８０倍以上、１．９０倍以上、２．００倍以上、３．００倍以上、４．００倍以上、５．００倍以上、６．００倍以上、７．００倍以上、８．００倍以上、９．００倍以上、１０．０倍以上であってよい。
　また、医薬組成物に含まれるＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ＋線維芽細胞数は、例えば１．０×１０^２ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１．０×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、５．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１．０×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上とすることができる。注射用組成物に含まれるＣＤ１０６陽性線維芽細胞数は、疾患の程度に応じてさらに増減させてもよい。

　医薬組成物による上記治療及び／又は上記改善の効果の確認方法は、特に限定されず、例えば組成物投与又は移植前と比較して組成物投与又は移植後のリンパ管新生が増加することや、組成物投与又は移植前と比較して組成物投与又は移植後の臓器の機能性が回復すること、組成物投与又は移植前と比較して組成物投与又は移植後の臓器の損傷の程度や線維化の程度が軽減することなどが例示される。

　医薬組成物は、医薬組成物として生理学的に許容される他の成分を含有してもよい。このような他の成分としては、生理食塩水、細胞保存液、細胞培養液、ハイドロゲル、細胞外マトリクス、凍結保存液等があげられる。

　第１の発明の別の実施形態としては、上記ＡＤＭ及び／若しくはＨＨＥＸ高発現細胞を含む医薬組成物を、線維化組織及び／又はその周辺領域に投与又は移植することにより、線維症を治療又は改善する方法であり得る。
　また、第１の発明の別の実施形態としては、上記ＡＤＭ及び／若しくはＨＨＥＸ高発現細胞を含む医薬組成物を、不全臓器組織及び／又はその周辺領域に投与又は移植することにより、リンパ管新生能が低下している状態を改善することや、組織液の恒常性の障害改善や、浮腫を軽減することや、脂質及び／又はビタミンの輸送能の障害を改善することや、免疫監視機構を活性化することや、臓器不全を治療する方法であり得る。

　また、第１の発明の別の実施形態としては、上記ＡＤＭ及び／若しくはＨＨＥＸ＋細胞を含む組成物の、不全臓器組織及び／若しくはその周辺領域、又は線維化組織及び／若しくはその周辺領域に投与又は移植するための注射剤又は移植材料としての使用であり得る。

＜ＡＤＭ高発現の線維芽細胞＞
　第２の発明の一実施形態は、ＡＤＭ高発現の線維芽細胞である。本実施形態の線維芽細胞は、好ましくはＣＤ１０６陽性である。さらにＶＥＧＦ－Ｃ高発現であってもよい。

　線維芽細胞の由来に制限はなく、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）及びＭｕｓｅ細胞等の多能性幹細胞や、間葉系幹細胞などの成体幹細胞を分化させて用いてもよい。また、動物（ヒトを含む）から採取したプライマリー細胞を用いてもよく、株化した細胞を用いてもよい。
　線維芽細胞の由来臓器は、例えば、肺由来、心臓由来、腎臓由来、皮膚由来などが挙げられる。
　線維芽細胞は、特に限定されないが、成体由来であることが好ましい。
　本実施形態の細胞の由来となる線維芽細胞は、ＶＥＧＦ－ＣやＡＤＭをもともと一定量発現していてもよく、全く発現していなくてもよい。
　また、本実施形態において線維芽細胞とは、通常の線維芽細胞が発現している細胞表面マーカーを発現している細胞のことであってもよく、さらに後述の本発明の細胞の製造方法によって、追加で他のマーカーが発現した又は一部のマーカーが発現していない細胞であってもよい。

　ＶＥＧＦ－Ｃが高発現であるとは、特に限定されないが、例えば、ｍＲＮＡ発現量をＲＴ－ｑＰＣＲで測定した時に、対照となる線維芽細胞のｍＲＮＡ発現量を１とした場合、本実施形態の細胞におけるＶＥＧＦ－ＣのｍＲＮＡ発現量が、１．２０倍以上、１．４０倍以上、１．５０倍以上、１．６０倍以上、１．７０倍以上、１．８０倍以上、１．９０倍以上、２．００倍以上、２．６０倍以上、２．９９倍以上、３．００倍以上、３．３８倍以上、３．５２倍以上、４．００倍以上、４．１１倍以上、４．７０倍以上、５．００倍以上、６．００倍以上、７．００倍以上、８．００倍以上、９．００倍以上、１０．０倍以上、又はそれ以上の倍数増加していることが好ましい。
　なお、対照となる線維芽細胞のｍＲＮＡ発現量とは、未処置の線維芽細胞におけるｍＲＮＡ発現量であってもよく、また処置後の細胞全体の平均ｍＲＮＡ発現量であってもよい。
　またタンパク質発現量をフローサイトメトリ法によって測定した時に、ＶＥＧＦ－Ｃポジティブ（以下、ＶＥＧＦ－Ｃ＋とも言う）線維芽細胞の割合が細胞数基準でそれぞれ０．０３％以上であってよく、０．１％以上であってよく、１％以上であってよく、２％以上であってよく、４％以上であってよく、５％以上であってよく、１０％以上であってよく、２０％以上であってよく、３０％以上であってよく、４０％以上であってよく、５０％以上であってよく、６０％以上であってよく、７０％以上であってよく、８０％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってよく、９８％以上であってよく、９９％以上であってよい。

　ＡＤＭが高発現であるとは、特に限定されないが、例えば、ｍＲＮＡ発現量をＲＴ－ｑＰＣＲで測定した時に、対照となる線維芽細胞のｍＲＮＡ発現量を１とした場合、本実施形態の細胞におけるＡＤＭのｍＲＮＡ発現量が、１．２０倍以上、１．４０倍以上、１．４３倍以上、１．５０倍以上、１．６０倍以上、１．７０倍以上、１．８０倍以上、１．９０倍以上、１．９１倍以上、１．９７倍以上、２．００倍以上、２．４６倍以上、３．００倍以上、３．１５倍以上、４．００倍以上、５．００倍以上、６．００倍以上、７．００倍以上、８．００倍以上、９．００倍以上、１０．０倍以上、又はそれ以上の倍数増加していることが好ましい。
　なお、対照となる線維芽細胞のｍＲＮＡ発現量とは、未処置の線維芽細胞におけるｍＲＮＡ発現量であってもよく、また処置後の細胞全体の平均ｍＲＮＡ発現量であってもよい。
　またタンパク質発現量をフローサイトメトリ法によって測定した時に、ＡＤＭポジティブ（以下、ＡＤＭ＋とも言う）線維芽細胞の割合が細胞数基準でそれぞれ０．１％以上であってよく、１％以上であってよく、２％以上であってよく、４％以上であってよく、５％以上であってよく、１０％以上であってよく、２０％以上であってよく、３０％以上であってよく、４０％以上であってよく、５０％以上であってよく、６０％以上であってよく、７０％以上であってよく、８０％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってよく、９８％以上であってよく、９９％以上であってよい。

　本実施形態において、ＶＥＧＦ－Ｃ及びＡＤＭの有する塩基配列及びアミノ酸配列は特に限定されないが、例えば、ＶＥＧＦ－Ｃは、配列番号１３又は１４で表される塩基配列を有する遺伝子、又はその塩基配列と９０％以上、９５％以上若しくは９８％以上同一の塩基配列を有する遺伝子であって、配列番号１３又は１４で表される塩基配列の全体又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＶＥＧＦ－Ｃの活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよく、ＡＤＭは、配列番号１又は１５で表される塩基配列を有する遺伝子、又はその塩基配列と９０％以上、９５％以上若しくは９８％以上同一の塩基配列を有する遺伝子あって、配列番号１又は１５で表される塩基配列の全体又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＡＤＭの活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。

　本実施形態の細胞は、好ましくは細胞表面マーカーとしてＣＤ１０６を発現する。

　本実施形態は、上述のＡＤＭ高発現の線維芽細胞を含む、線維芽細胞集団であってもよい。

（線維芽細胞の準備）
　線維芽細胞の準備において、線維芽細胞の由来は特に限定はされず、既に述べたとおりである。一方で、自己由来の細胞であってよく、例えば肺疾患を患っている患者の肺組織から単離した肺線維芽細胞や、患者の成体（体性）幹細胞を分化させて単離した肺線維芽細胞を準備してもよい。また、自己の細胞由来のｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を分化させて、回収した線維芽細胞であってもよい。加えて、自己以外の細胞であってよく、例えば肺細胞を提供するドナー由来の肺組織や、動物等を利用して作製した肺組織から単離した肺線維芽細胞や、ドナーの成体（体性）幹細胞を分化させて単離した肺線維芽細胞を準備してもよい。また、ドナー由来のｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の多能性幹細胞を分化させて、回収した線維芽細胞であってもよい。

（線維芽細胞の培養）
　線維芽細胞を、ＴＮＦ－α及びＩＬ－４と、後述の方法で接触させてもよく、所望の細胞数となるまで、及び／又は所望の機能が備わるまで等の目的で、培養に供してもよい。培養の条件に制限はなく、既知の細胞培養方法により行ってよい。
　培養に用いられる培地は、培養する細胞の種類等により適宜設定可能であるが、例えば、ＨＦＤＭ－１（＋）、ＤＭＥＭ、α－ＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０等が使用可能である。該培地にＮＢＣＳ、ＦＣＳやＦＢＳ等の栄養物質や増殖因子、サイトカイン、抗生物質等を添加してもよい。さらに、ＴＮＦ－α及びＩＬ－４を含む培地で培養してもよい。
　培養期間は、培養した細胞が所望の細胞数となるまで、及び／又は培養した細胞が所望の機能が備わるまで等の目的に応じて培養時間や培養日数を適宜設定できる。例えば、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１５時間、１８時間、２１時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、２週間、１か月、２か月、３か月、６か月等の期間があげられる。
　培養温度は、培養する細胞の種類に合わせて適宜設定可能であるが、例えば１０℃以上、１５℃以上、２０℃以上、２５℃以上、３０℃以上であってよく、また６０℃以下、５５℃以下、５０℃以下、４５℃以下、４０℃以下であってよい。
　培養は複数回行ってもよい。例えば選択又は濃縮により所望の線維芽細胞の純度を向上させ、その都度培養を行うことができる。

（線維芽細胞の回収）
　培養した線維芽細胞の回収は、トリプシン等のプロテアーゼにより細胞を剥離して回収してよいが、温度応答性培養皿を使用して、温度変化により細胞を剥離させ、回収してもよく、セルスクレーパーなどの器具を使用して細胞を剥離させ、回収してもよい。

　第２の発明の別の実施形態は、ＡＤＭ高発現の線維芽細胞の製造方法であって、線維芽細胞に、ＴＮＦ－α及びＩＬ－４を接触させること、並びに前記接触させた線維芽細胞を、ＡＤＭが高発現になり得る条件下で培養することを含む、ＡＤＭ高発現の線維芽細胞の製造方法である。本実施形態の線維芽細胞は、好ましくはＣＤ１０６陽性である。さらにＶＥＧＦ－Ｃ高発現であってもよい。

　線維芽細胞とＴＮＦ－α及びＩＬ－４との接触の方法はＡＤＭ高発現の線維芽細胞の誘導、又はＡＤＭ高発現並びにＶＥＧＦ－Ｃ高発現及び／若しくはＣＤ１０６陽性である線維芽細胞の誘導が顕著に害されない限り特段限定されず、典型的には線維芽細胞を含む培地にＴＮＦ－α及びＩＬ－４を添加することであるが、これに限られない。ＴＮＦ－α及びＩＬ－４は、それぞれ別々に線維芽細胞と接触させてもよく、同時に接触させてもよい。例えば、ＴＮＦ－α及びＩＬ－４を水、培地、血清、またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた後で、培地に添加してもよい。

　本実施形態では、ＴＮＦ－α及びＩＬ－４を添加した培地で線維芽細胞を培養できることから、線維芽細胞におけるＡＤＭの発現レベルを維持したまま、さらにはＶＥＧＦ－Ｃの発現レベルを維持したまま、線維芽細胞を培養できる。そのため、高いＡＤＭ発現レベル、さらには高いＶＥＧＦ－Ｃの発現レベルを有する線維芽細胞を製造することができる。

　ＴＮＦ－α及びＩＬ－４を培地（ｍＬ）に添加する場合、ＴＮＦ－αの添加量は特段限定されないが、通常０.１ｎｇ／ｍＬ以上であり、０．５ｎｇ／ｍＬ以上であってよく、１ｎｇ／ｍＬ以上であってよく、１０ｎｇ／ｍＬ以上であってよく、５０ｎｇ／ｍＬ以上であってもよい。上限は特に限定されず、通常５００ｎｇ／ｍＬ以下であり、１００ｎｇ／ｍＬ以下であってよい。
　また、ＩＬ－４の添加量は特段限定されないが、通常０．１ｎｇ／ｍＬ以上であり、０．５ｎｇ／ｍＬ以上であってよく、１ｎｇ／ｍＬ以上であってよく、２ｎｇ／ｍＬ以上であってよい。上限は特に限定されず、通常１０ｎｇ／ｍＬ以下であり、５ｎｇ／ｍＬ以下であってよく、２ｎｇ／ｍＬ以下であってよい。
　添加するＴＮＦ－αとＩＬ－４の比（重量比）は、ＴＮＦ－α：ＩＬ－４で通常１００００：１～１：１であり、５００００：１～１０：１であってもよい。また、１：１～１：１００００であり、１：１０～１：５００００であってもよい。

　ＴＮＦ－α及びＩＬ－４を接触させた線維芽細胞を更に培養することで、ＡＤＭ高発現の線維芽細胞を製造することができる。該線維芽細胞は、さらにＶＥＧＦ－Ｃ高発現であってもよい。
　線維芽細胞の培養は、線維芽細胞がＡＤＭ高発現になり得る条件下であれば特段限定されず、既知の細胞培養方法により行ってよい。また、ＶＥＧＦ－Ｃ高発現になり得る条件下であってもよい。ＣＤ１０６陽性になり得る条件下であることが好ましい。上記線維芽細胞の製造方法における（線維芽細胞の培養）の項に記載される方法が例示される。

　本実施形態は、線維芽細胞がＣＤ１０６陽性である場合、抗ＣＤ１０６抗体を用いてＡＤＭ高発現のＣＤ１０６陽性線維芽細胞を選択又は濃縮することができる。該線維芽細胞はさらにＶＥＧＦ－Ｃ高発現であってもよい。選択又は濃縮の方法は特に限定されず、当業者に既知の方法で行うことができ、例えば、ヒトＣＤ１０６（ＶＣＡＭ－１）－ビオチン（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）で一次免疫染色を実施し、抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）で二次免疫染色し、染色した細胞をａｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）で、回収することによって行うことができる。また、選択又は濃縮はどのタイミングで行ってもよい。
　抗ＣＤ１０６抗体は、既知のものを使用することが可能であり、市販品を入手して使用できる。
　抗ＣＤ１０６抗体を用いて選択又は濃縮することで、線維芽細胞集団におけるＡＤＭ高発現の線維芽細胞の割合を増加させることができる。

　培養した線維芽細胞の回収は、上記線維芽細胞の製造方法における（線維芽細胞の回収）の項に記載される方法が例示される。

　本実施形態のＡＤＭ高発現の線維芽細胞の製造方法により、ＡＤＭ高発現の線維芽細胞が得られ、該線維芽細胞又は該細胞を含む線維芽細胞集団が第２の発明の別の実施形態である。該線維芽細胞はさらにＶＥＧＦ－Ｃ高発現であってもよく、ＣＤ１０６陽性であってもよい。線維芽細胞は、ＴＮＦ－α及びＩＬ－４により刺激されることで、ＡＤＭやＶＥＧＦ－Ｃの発現量が高まるため、ＡＤＭ高発現の線維芽細胞、さらにＶＥＧＦ－Ｃ高発現である線維芽細胞は、リンパ管新生能が低下する疾患や、肺線維症又は間質性肺炎等の肺疾患に対する治療用組成物として好適に使用できる。本実施形態において、線維芽細胞の由来は特に限定されないが、好ましくは肺由来である。
　別の実施形態としては、上述のＡＤＭ高発現の線維芽細胞により得られた細胞を含む、線維芽細胞集団であってもよい。

＜ＣＤ１０６陽性の肺由来線維芽細胞を含む細胞集団＞
　第２の発明の別の実施形態は、ＣＤ１０６陽性の肺由来線維芽細胞を含む細胞集団である。本実施形態の線維芽細胞は、ＡＤＭ高発現であってもよく、ＶＥＧＦ－Ｃ高発現であってもよい。

　線維芽細胞の由来に制限はなく、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）及びＭｕｓｅ細胞等の多能性幹細胞や、間葉系幹細胞などの成体幹細胞を分化させて用いてもよい。また、動物（ヒトを含む）から採取したプライマリー細胞を用いてもよく、株化した細胞を用いてもよい。
　線維芽細胞は、特に限定されないが、成体由来であることが好ましい。
　本実施形態の細胞の由来となる線維芽細胞は、ＶＥＧＦ－ＣやＡＤＭをもともと一定量発現していてもよく、全く発現していなくてもよい。
　また、本実施形態において線維芽細胞とは、通常の線維芽細胞が発現している細胞表面マーカーを発現している細胞のことであってもよく、さらに後述の本発明の細胞の製造方法によって、追加で他のマーカーが発現した又は一部のマーカーが発現していない細胞であってもよい。

　線維芽細胞集団において、全線維芽細胞に対するＣＤ１０６陽性の線維芽細胞の割合は特段限定されないが、細胞数基準で、１８．０１％超であってよく、２７．９７％超であってよく、３０％超であってよく、３１．３８％超であってよく、３４．７９％超であってよく、４０％超であってよく、５０％超であってよく、６０％超であってよく、７０％超であってよく、８０％超であってよく、９０％超であってよく、９５％超であってよく、９７．１０％超であってよい。また、細胞数基準で、１８．０１％以上であってよく、２７．９７％以上であってよく、３０％以上であってよく、３１．３８％以上であってよく、３４．７９％以上であってよく、４０％以上であってよく、５０％以上であってよく、６０％以上であってよく、７０％以上であってよく、８０％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってよく、９７．１０％以上であってよい。

　本実施形態の線維芽細胞集団は、さらにＣＤ９０陽性の線維芽細胞集団であってもよい。このとき、線維芽細胞集団において、全線維芽細胞に対するＣＤ１０６陽性かつＣＤ９０陽性の線維芽細胞の割合は特段限定されないが、細胞数基準で、１７．９７％超であってよく、２７．９１％超であってよく、３０％超であってよく、３１．２１％超であってよく、３４．５１％超であってよく、４０％超であってよく、５０％超であってよく、６０％超であってよく、７０％超であってよく、８０％超であってよく、９０％超であってよく、９５％超であってよく、９６．２９％超であってよい。また、細胞数基準で、１７．９７％以上であってよく、２７．９１％以上であってよく、３０％以上であってよく、３１．２１％以上であってよく、３４．５１％以上であってよく、４０％以上であってよく、５０％以上であってよく、６０％以上であってよく、７０％以上であってよく、８０％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってよく、９６．２９％以上であってよい。

　ＡＤＭ高発現であることやＶＥＧＦ－Ｃ高発現であることに関しては、上述の＜ＡＤＭ高発現の線維芽細胞＞の項における記載を援用することができる。

（ＣＤ１０６陽性線維芽細胞のセルソーティング）
　線維芽細胞がＣＤ１０６陽性である場合、線維芽細胞はＣＤ１０６陽性線維芽細胞の選択又は濃縮に供してもよい。選択又は濃縮を経ずともＣＤ１０６陽性線維芽細胞を入手できる場合には、選択又は濃縮は省略し得る。ＣＤ１０６陽性線維芽細胞の選択又は濃縮には、抗ＣＤ１０６抗体（抗ＶＣＡＭ－１抗体）を用いた、フローサイトメトリ法、磁気ビーズ法、アフィニティーカラム法、又はパニング法等の方法が例示される。具体的には磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）や蛍光標識細胞分離法（ＦＡＣＳ）などを用いることができる。抗ＣＤ１０６抗体は市販のものを用いてよく、また既知の方法により作製したものを用いてもよい。また、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれを用いてもよいが、特異性の観点からモノクローナル抗体を用いることが好ましい。更には、薬剤耐性遺伝子を導入し、ＣＤ１０６陰性線維芽細胞を除外することで、ＣＤ１０６陽性線維芽細胞を得てもよい。また、蛍光タンパク質コード遺伝子を導入し、蛍光タンパク質ポジティブ細胞を、ＦＡＣＳなどを用いて単離してもよい。また、リアルタイムＰＣＲ、次世代シーケンサー及びｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等の手法を用いて、細胞におけるＣＤ１０６遺伝子の発現を確認し、ＣＤ１０６遺伝子の発現群を単離してもよい。

＜ＡＤＭ高発現の線維芽細胞又はその細胞集団を含む医薬組成物、又はＣＤ１０６陽性の肺由来線維芽細胞の細胞集団を含む医薬組成物＞
　第２の発明の別の実施形態は、上記ＡＤＭ高発現の線維芽細胞又はその細胞集団を含む医薬組成物、又は上記ＣＤ１０６陽性の肺由来線維芽細胞の細胞集団を含む医薬組成物である。本実施形態の線維芽細胞は、好ましくはＣＤ１０６陽性である。さらにＶＥＧＦ－Ｃ高発現であってもよい。
　ＡＤＭ及びＶＥＧＦ－Ｃはリンパ管新生因子であるため、例えば、本実施形態の医薬組成物を生体の肺などの臓器またはその周辺領域に投与又は移植することにより、肺などの臓器においてリンパ管新生能が低下している状態を改善することができる。そのため、特に限定されないが、例えば肺などの臓器において、リンパ管新生能が低下している状態を改善することができる。特に肺線維症又は間質性肺炎といった肺疾患の治療に有用である。本実施形態において、線維芽細胞の由来は特に限定されないが、好ましくは肺由来である。

　本実施形態の医薬組成物を生体に投与又は移植する方法は、特に限定されないが、例えば注射により投与できる。医薬組成物を肺などの臓器における損傷領域、線維化領域若しくはその周辺領域に直接投与又は移植することで、上記の疾患状態の改善や肺などの臓器疾患の治療が可能となる。また、医薬組成物は、静脈、動脈、リンパ節、リンパ管、骨髄、皮下、海綿体、腹腔内、筋肉、髄腔内、関節腔へ投与してもよい。静脈、動脈、リンパ管への投与は、脈管内への注射によるものでもよく、カテーテルにより注入されるものでもよく、その他の既知の手法を用いてもよい。
　注射の方法は特段限定されず、有針注射、無針注射等既知の注射手法を適用することができ、注入に用いるカテーテルの方法も既知の方法を適用することができ、特段限定されない。

　また、本実施形態の医薬組成物は、特に限定されないが、人工臓器材料として生体に適用されるものでもよく、例えば、その人工臓器材料は、細胞が平面状又は立体状の細胞組織として構築されたものでもよい。この平面状又は立体状の細胞組織は、線維芽細胞を単独で培養したものでもよく、又は線維芽細胞と他の細胞、例えば肺細胞を共培養した上で平面状又は立体状の細胞組織としたものでもよい。平面状又は立体状の細胞組織としては、特に限定されないが、例えば細胞シートや、セルファイバー、３Ｄプリンタにて形成された組織などが例示される。
　本実施形態において、平面状又は立体状の細胞組織の大きさや形状は、損傷又は線維化した肺組織及び／又はその周辺領域及び／又は病変領域に適用できる限り特に限定されない。また平面状とは、単層又は複数層のいずれでもよい。
　なお、細胞培養における培地組成、温度、湿度といった条件は、ＶＥＧＦ－Ｃ及び／又はＡＤＭ高発現のＣＤ１０６陽性線維芽細胞を培養することができ、かつ平面状又は立体状の細胞組織を構築できる限り特に限定されない。例えば、上記線維芽細胞の製造方法における（線維芽細胞の培養）及び／又は（線維芽細胞の回収）の項に記載した培養条件に準じるものが例示できる。
　このような平面状又は立体状の細胞組織を、損傷又は線維化した臓器組織及び／又はその周辺領域に適用することで、又は人工臓器として、損傷又は線維化した臓器組織及び／又はその周辺領域と交換することで、リンパ管新生能が低下している状態を改善することや、肺線維症又は間質性肺炎といった肺疾患を治療することができる。

　医薬組成物に含まれるＡＤＭ高発現の線維芽細胞の割合は、患者への投与又は移植の態様等に基づいて適宜設定され、有効成分として治療上有効量のＡＤＭ高発現の線維芽細胞が含まれていればよい。
　医薬組成物中に他の線維芽細胞を含む場合、例えば、医薬組成物に含まれる線維芽細胞全量に対し、ＡＤＭ高発現の線維芽細胞の割合は細胞数基準で０．０３％以上であってよく、０．１％以上であってよく、１％以上であってよく、２％以上であってよく、４％以上であってよく、５％以上であってよく、１０％以上であってよく、２０％以上であってよく、３０％以上であってよく、４０％以上であってよく、５０％以上であってよく、６０％以上であってよく、７０％以上であってよく、８０％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってよく、９８％以上であってよく、９９％以上であってよい。

　医薬組成物に含まれるＣＤ１０６陽性の肺由来線維芽細胞の割合は、患者への投与又は移植の態様等に基づいて適宜設定され、有効成分として治療上有効量のＡＤＭ高発現の線維芽細胞が含まれていればよい。具体的には、上記＜ＣＤ１０６陽性の肺由来線維芽細胞を含む細胞集団＞の項に記載したＣＤ１０６陽性の肺由来線維芽細胞の割合を援用できる。

　また、医薬組成物に含まれるＡＤＭ高発現の線維芽細胞数又はＣＤ１０６陽性の肺由来線維芽細胞数は、例えば１．０×１０^２ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１．０×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、５．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１．０×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上とすることができる。注射用組成物に含まれる該細胞数は、疾患の程度に応じてさらに増減させてもよい。

　医薬組成物による上記治療及び／又は上記改善の効果の確認方法は、特に限定されず、例えば組成物投与又は移植前と比較して組成物投与又は移植後のリンパ管新生が増加することや、組成物投与又は移植前と比較して組成物投与又は移植後の肺などの臓器の機能性が回復すること、組成物投与又は移植前と比較して組成物投与又は移植後の肺などの臓器の損傷の程度や線維化の程度が軽減することなどが例示される。

　第２の発明の別の実施形態としては、上記ＡＤＭ高発現の線維芽細胞、その細胞集団、ＣＤ１０６陽性の肺由来線維芽細胞の細胞集団、またはこれらを含む医薬組成物を、肺などの臓器組織及び／又はその周辺領域に投与又は移植することにより、肺線維症又は間質性肺炎といった肺疾患を治療する方法であり得る。本実施形態の線維芽細胞は、好ましくはＣＤ１０６陽性である。さらにＶＥＧＦ－Ｃ高発現であってもよい。
　また、第２の発明の別の実施形態としては、上記ＡＤＭ高発現の線維芽細胞、その細胞集団、ＣＤ１０６陽性の肺由来線維芽細胞の細胞集団、またはこれらを含む医薬組成物を、肺などの臓器組織及び／又はその周辺領域に投与又は移植することにより、リンパ管新生能が低下している状態を改善する方法であり得る。本実施形態の線維芽細胞は、好ましくはＣＤ１０６陽性である。さらにＶＥＧＦ－Ｃ高発現であってもよい。

　また、第２の発明の別の実施形態としては、上記ＡＤＭ高発現の線維芽細胞、その細胞集団又はこれらを含む組成物の、肺などの臓器組織及び／又はその周辺領域に投与又は移植するための注射剤又は移植材料としての使用であり得る。本実施形態の線維芽細胞は、好ましくはＣＤ１０６陽性である。さらにＶＥＧＦ－Ｃ高発現であってもよい。

　以下実施例により、本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲が実施例のみに限定されないことは言うまでもない。

＜実施例Ａ：ＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ高発現の線維芽細胞を含む医薬組成物に関する実施例＞
＜ヒト成体由来心臓線維芽細胞のＣＤ１０６陽性細胞率の上昇＞
　ヒト成体心臓をＳｃｉｅｎｃｅ　Ｃａｒｅから購入し、Ｌｉｂｅｒａｓｅ　ＭＮＰ－Ｓ（Ｒｏｃｈｅ）で酵素処理した後に、ヒト成体由来心臓線維芽細胞を単離した。この細胞を１％新生仔ウシ血清（ｎｅｗｂｏｒｎ　ｃａｌｆ　ｓｅｒｕｍ（ＮＢＣＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）を添加したリコンビナントヒト上皮細胞成長因子（ｒｈ－ＥＧＦ）含有線維芽細胞用無血清培養液（ＨＦＤＭ－１（＋）、Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　＆　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）にて培養した。５回の継代後に細胞培養皿にて培養し、未処理で培養した群（ＮＴ）と、ＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍＬ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）とＩＬ－４（２ｎｇ／ｍＬ）（Ｗａｋｏ）を２剤混合で処置した群（＋ＣＫｓ）を設けた。すべての群は、１％ＮＢＣＳを添加したＨＦＤＭ－１（＋）を基本培地とし、１日間（２４時間）培養した。

＜フローサイトメトリ＞
　線維芽細胞は、ＢＶ４２１　マウス抗ヒトＣＤ１０６（ＶＣＡＭ１）抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とヒトＣＤ９０－ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ　Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で免疫蛍光染色した。アイソタイプコントロールは、ＢＶ４２１　マウスＩｇＧ１；κアイソタイプコントロール（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とＲＥＡコントロール（Ｓ）－ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を用いた。細胞は生細胞のまま抗体と３０分間、４℃で反応させた。
　免疫蛍光染色した細胞はフローサイトメーター（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　１０、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）で解析した。ＦＳＣ－Ａ及びＳＳＣ－Ａで細胞領域を認識後、ＣＤ１０６タンパク質に対する陽性細胞率（％、細胞数換算）を評価した。

＜ヒト成体由来心臓線維芽細胞のＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ遺伝子の発現上昇＞
　ヒト成体由来心臓線維芽細胞は、細胞培養皿にて培養し、未処理で培養した群（ＮＴ）と、ＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍＬ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）とＩＬ－４（２ｎｇ／ｍＬ）（Ｗａｋｏ）を２剤混合で処置した群（＋ＣＫｓ）を設けた。すべての群は、１％ＮＢＣＳを添加したＨＦＤＭ－１（＋）を基本培地とし、１日間（２４時間）培養した。

＜プライマーとプローブの作製＞
　使用したプライマーは、ＮＣＢＩに公開されているヒトｍＲＮＡ配列（ＡＤＭ，ＮＭ＿００１１２４．３（配列番号１）；ＨＨＥＸ，ＮＭ＿００２７２９．５（配列番号２）；ＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ），ＮＭ＿００１１０１．５（配列番号３））を基に、最近接塩基対法で計算されるアニール温度が６０℃前後であって、1つ以上のイントロンを挟むように配列を設計した（配列番号４～９）。５’ヌクレアーゼプローブ配列も同じく公開ヒトｍＲＮＡ配列データを基に設計しており、このプローブのアニール温度はプライマーより５℃以上高く、またこのプローブの結合位置が、測定対象の遺伝子上における、フォワードプライマーの結合位置とリバースプライマーの結合位置の間の塩基に結合するように設計した。またプローブの５’末端には蛍光色素６－ＦＡＭを、そこから９塩基分３’側にはクエンチャー色素ＺＥＮ、そして３’末端には２つ目のクエンチャー色素Ｉｏｗａ　Ｂｌａｃｋ　ＦＱを結合させたデュアルクエンチャープローブとし、ＲＴ－ＰＣＲ解析におけるバックグラウンドシグナルを低減させている（配列番号１０～１２）。以上のプライマーとプローブは全てＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社に合成を委託した（表１）。

＜ＲＮＡ抽出＞
　心臓線維芽細胞からの全ＲＮＡの抽出は、Ｑｉａｇｅｎ　ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌｕｓ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。その際、細胞ライセートの調製はＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行い、ＤＮａｓｅ処理を含めたその他の操作は、キットのメーカーの推奨プロトコルに従った。得られた全ＲＮＡの濃度測定は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ　Ｏｎｅ／Ｏｎｅ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、波長２６０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に、タンパク質の混入度を示すＡ２６０／Ａ２８０の値を算出し、Ａ２６０／Ａ２８０＞２.０であることを確認した。

＜リアルタイム定量ＲＴ－ＰＣＲ＞
　Ｏｎｅ　Ｓｔｅｐ　ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　３　ＲＴ－ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ,ｗｉｔｈ　ＵＮＧ　Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用いて、逆転写反応とＲＴ－ＰＣＲを同じチューブでまとめて行った。反応は、１×Ｏｎｅ　Ｓｔｅｐ　ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　３　ＲＴ－ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ,ｗｉｔｈ　ＵＮＧ、０．２μＭ　Ｆｏｒｗａｒｄ　＆　Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー、０．２μＭ　特異的プローブ、１０ｎｇ　鋳型ＲＮＡ溶液を含む反応液（総量１２．５μＬ）で行った。最初に５２℃で５分間加温することにより逆転写反応を行い、その後、逆転写酵素を失活させるために９５℃で１０秒間加熱した。続いて９５℃で５秒間、６０℃で３０秒間を加熱するサイクルを４０回繰り返し、サイクルごとの蛍光強度を測定した。一連の反応と測定は、Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　３（ＴａＫａＲａ）を用いて行った。同時に、検量線作成のための標品として、ＡＤＭとＨＨＥＸの発現を確認済のサンプルより抽出したＲＮＡ溶液を用い、１μｇから１０倍ずつ４段階希釈したＲＮＡ溶液を用いて上記の測定を行った。すべてのサンプルは、Ｎ＝３で測定を行った。
　ＰＣＲ終了後、得られた増幅曲線について標的遺伝子ごとに蛍光強度のベースラインと閾値を設定し、その閾値に蛍光シグナルが到達したサイクル数（Ｃｔ値）をサンプルごとに求めた。これらの解析はＴｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　３　Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて行った。それぞれの遺伝子の検量線は、相関係数が０．９８以上で増幅効率が９０％以上であり検量線として十分と考えられたため、対象サンプルのＣｔ値を検量線に当てはめ目的とする遺伝子のｍＲＮＡ含有量を相対値として算出した。この相対値をβ－Ａｃｔｉｎの値で標準化した。

＜リンパ管の脈管形成アッセイ＞
　リンパ管の脈管形成アッセイは、当業者に既知の手法により、心臓由来細胞から回収したヒトリンパ管内皮細胞と各種のヒト心臓線維芽細胞を共培養し、各種の心臓線維芽細胞による心臓リンパ管新生効果の評価を行った（非特許文献１５）。具体的には、ヒト心臓由来細胞から回収したヒトリンパ管内皮細胞と各種のヒト成体由来心臓線維芽細胞を２．４５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の濃度で２：８の割合で播種し、ＥＧＭ－２ＭＶ　Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ－２ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で３日間共培養した。共培養後、細胞は４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸで膜透過処理後、免疫蛍光染色を行った。一次抗体は、抗ＶＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎウサギポリクローナル抗体（ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）と抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎマウスポリクローナル抗体（ａｂｃａｍ）を使用した。二次抗体は、ヤギ抗ウサギＩｇＧ　Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８）（ａｂｃａｍ）とヤギ抗マウスＩｇＧ　Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７）（ａｂｃａｍ）を使用した。核染色はＨｏｅｃｈｓｔ　３３２５８　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（同仁化学研究所、熊本、日本）で行った。染色サンプルは、ＩＮ　Ｃｅｌｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　２２００（Ｃｙｔｉｖａ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）で撮影した。
　定量評価は、Ａｎａｌｙｚｅｒ　ｆｏｒ　ＩｍａｇｅＪ（ｖ．　１．０．ｃ，Ｇｉｌｌｅｓ　Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ，２０１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ　ｏｎｌｉｎｅ：ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／ｍａｃｒｏｓ／ｔｏｏｌｓｅｔｓ／Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ％２０Ａｎａｌｙｚｅｒ．ｔｘｔ)を使用した。具体的には、Ｉｃｙ（ｖ.２．０．３．０；ＢｉｏＩｍａｇｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｌａｂ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ　Ｐａｓｔｅｕｒ）で、関心のあるチャネルを抽出し、背景をサブトラクター化した。その後、ａｎｉｓｏｔｒｏｐｉｃ　ＰＤＥ－ｂａｓｅｄ　ｆｉｌｔｅｒ（Ｉｃｙプラグイン：“Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｆｉｌｔｅｒ”，ｖ．０．１．０．１）を適用して画像を補正し、フィルタリングされた画像のコントラストを強調して正規化し、背景を差し引くことでＲＯＩを定義した。最後に、得られた画像をＡｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　Ａｎａｌｙｚｅｒマクロで解析した。詳細なプロトコルは、ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１７５０４／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｉｏ．ｂｈｔａｊ６ｉｅにオンラインで公開した。
　定量データは、成熟リンパ管の全長とジャンクション数を図示し、ＮＴの平均値を１として、Ｆｏｌｄ　ｉｎｃｒｅａｓｅで表した。

＜移植用細胞の調製＞
　細胞は、次のメーカーから購入した：ヒト成体由来心臓線維芽細胞（Ｌｏｎｚａ）；ヒト胎児由来心臓線維芽細胞（Ｃｅｌｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。細胞は線維芽細胞培養培地（ＨＦＤＭ－１（＋）ｍｅｄｉｕｍ（株式会社細胞科学研究所、宮城、日本）で拡大培養し、移植実験に用いた。

＜セルソーティング＞
　線維芽細胞は、ヒトＣＤ１０６（ＶＣＡＭ－１）－ビオチン（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）、またはヒトＣＤ９０－ビオチン（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）で一次免疫染色を実施し、抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）で二次免疫染色した。染色した細胞は、ａｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）で、ＣＤ１０６とＣＤ９０陽性細胞を回収した。

＜慢性心不全モデルラットの作製＞
　本研究で行った全ての動物実験のプロトコルは、ＬＳＩメディエンス（東京、日本）の倫理審査委員会の承認を受けた。なお、全ての動物に苦痛軽減措置を実施した。
　ヌードラット（Ｆ３４４／Ｎ　Ｊｃｌ－ｒｎｕ／ｒｎｕ）８週齢、雄は日本クレア（東京、日本）から購入した。１週間以上の馴化後、動物は実験動物用吸入麻酔器（ソフトランダー（新鋭工業株式会社、埼玉、日本）を用いて、２％イソフルラン（麻酔補助剤；笑気：酸素＝７：３）で吸入麻酔し、刈毛した。すばやく気管挿管を行い、そのまま０．５－２％イソフルラン（麻酔補助剤；笑気：酸素＝７：３）吸入麻酔ガスを人工呼吸器に接続して、麻酔を維持した。人工呼吸管理のもと、仰臥位に固定し、左第３肋骨から第５肋骨までの間で２～３本、肋軟骨の位置で縦方向に切断して開胸した。開創器により、術野を拡大後、心嚢膜を剥離して心臓を露出させた。左心房を持ち上げ、血管用糸付弱弯丸針（６－０：ネスコスーチャー）を用いて左心室の深さ約２ｍｍ、長さ４－５ｍｍに糸を通した。糸の両端を合わせてポリエチレンチューブで作製したスネアを通し、動脈クレンメを用いて糸を絞り（スネア法）冠動脈を３０分間虚血した。３０分後、再灌流させ、状態が安定したら、出血がない事を確認し、胸腔ドレナージを行い、筋層及び皮膚を縫合した。皮膚は、皮内縫合を行うが、通常縫合を行った場合には、術後状態を観察しながら抜糸を行った。モデル作製後１週間の細胞投与日前日に、超音波画像診断装置（Ｘａｒｉｏ　ＳＳＡ－６６０Ａ、東芝メディカルシステムズ、栃木、日本）を用いて心エコーを測定した。左室駆出率（ＬＶＥＦ＝（ＬＶＩＤｄ３－ＬＶＩＤｓ３）／ＬＶＩＤｄ３）が５５％以下の個体を慢性心不全モデルとみなし、線維芽細胞の投与実験を行った。

＜慢性心不全モデルラットへの線維芽細胞の投与＞
　投与試験当日に凍結保存した各種の線維芽細胞を解凍し、ｈｉｇｈ－ｇｌｕｃｏｓｅ　ＤＭＥＭ＋１０％ＮＢＣＳで希釈し、生存細胞数として、各個体につき、２．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／５０μＬの細胞懸濁液を投与した。動物は、モデル作製時と同一の手法で麻酔を維持し、人工呼吸管理のもと、梗塞巣の２ヶ所に分けて、３０Ｇ針付きカテーテルを用いて細胞懸濁液を５０μＬ全量投与した。状態が安定した後に、投与液の漏出及び出血がない事を確認し、胸腔ドレナージを行い、筋層及び皮膚を縫合した。皮膚は、皮内縫合を行うが、通常縫合を行った場合には、術後状態を観察しながら抜糸を行った。

＜心臓の採材と組織染色＞
　細胞投与１８週後のラットを犠牲死し、心臓を採材した。採材した心臓は４％パラホルムアルデヒドでの固定後、パラフィン包埋によりパラフィン切片を作成し、また凍結切片を作成した。パラフィン切片は、シリウスレッド（ＳＲ）染色、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色を行い、またｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎに用いた。成体由来心臓線維芽細胞投与群はバーチャルスライドスキャナ（ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ　Ｓ２１０、浜松ホトニクス、静岡、日本）で撮像した。胎児由来心臓線維芽細胞投与群はＡｐｅｒｉｏ　ＳｃａｎＳｃｏｐｅ　ｓｌｉｄｅ　ｓｃａｎｎｅｒで撮像した。ＳＲ染色画像は、成体由来心臓線維芽細胞投与群はＩｍａｇｅ　Ｊを用いて、胎児由来心臓線維芽細胞投与群はＨＡＬＯ（Ｉｎｄｉｃａ　Ｌａｂｓ、Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ、ＮＭ）で線維化領域を定量した。ＨＥ染色画像は定性的スコアリングで次の項目を評価した：Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｃｅｌｌ　ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ、ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ、ｆｉｂｒｏｓｉｓ、ｌｉｍｅ　ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ、ｔｈｉｎｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｌｅｆｔ　ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ。病理変化の程度は、変化なし（スコア０）、軽度（スコア１）、中等度（スコア２）、重度（スコア３）として定性的に評価した。ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎは、ＲＮＡｓｃｏｐｅ　Ｔａｒｇｅｔ　Ｐｒｏｂｅ　Ｒｎ－Ｌｙｖｅ－１－Ｃ２（Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を用い、メーカー推奨プロトコルに従って染色を行った。なお、プローブの処理はＨｙｂＥＺ　Ｏｖｅｎ（Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ）で実施した。凍結切片は、抗ｃａｒｄｉａｃ　ｔｒｏｐｏｎｉｎ　Ｔ（ｃＴｎＴ）抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、抗ｐｒｏｓｐｅｒｏ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｈｏｍｅｏｂｏｘ　１（Ｐｒｏｘ－１)抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、Ｒｏｓｅｍｏｎｔ、ＩＬ）、及び抗Ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　３（ＶＥＧＦＲ３）抗体（Ｂｉｏｓｓ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）で免疫組織染色を行い、ＦＶ１２００共焦点レーザー顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、東京、日本）にて撮像を行った。

＜統計解析＞
　ＮＴ群と、＋ＣＫｓ群の平均値の比較は、スチューデントのｔ検定で統計解析を行った。

＜実施例Ａ１：ＴＮＦ－α及びＩＬ－４との接触による成体由来心臓線維芽細胞のＣＤ１０６陽性細胞率向上＞
　ヒト成体由来心臓線維芽細胞を細胞培養皿にて培養し、ＮＴ群と、＋ＣＫｓ群を設けた。すべての群のヒト成体由来心臓線維芽細胞は、平らで紡錘形の形状であり、典型的な線維芽細胞様の形状であった（図１Ａ）。
　フローサイトメトリでＣＤ９０、ＣＤ１０６、ＣＤ９０及びＣＤ１０６両陽性細胞率（％）を評価したところ、ＮＴ群はそれぞれ、４８．８８％（ＣＤ９０）、０．２０％（ＣＤ１０６）、０．１４％（両陽性、ＤＰ）であったのに対して、＋ＣＫｓ群はそれぞれ、５７.５５％（ＣＤ９０）、５０．７８％（ＣＤ１０６）、３４．７６％（ＤＰ）となり、ＣＤ９０陽性細胞率、ＣＤ１０６陽性細胞率、両陽性細胞率（％）が大きく向上した（図１Ｂ）。本結果より、ＴＮＦ－α及びＩＬ－４を線維芽細胞と接触させることにより、線維芽細胞のＣＤ９０、ＣＤ１０６、両陽性細胞率（％）が向上することが示された。

＜実施例Ａ２：ＴＮＦ－α及びＩＬ－４との接触により、成体由来心臓線維芽細胞においてＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸの発現量が増強した＞
　すべての群（ＮＴ群、＋ＣＫｓ群）の成体由来心臓線維芽細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡサンプルの品質チェックを行った後、プローブ検出系（５’ヌクレアーゼ法）によりｍＲＮＡコピー数と相関した蛍光強度を検出し、検量線法によりｍＲＮＡコピー数の相対量を算出した（Ｎ＝３）。すべての群の線維芽細胞のＡＤＭ及びＨＨＥＸの遺伝子発現量を、β－Ａｃｔｉｎの遺伝子発現量で標準化し、ＮＴ群のＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸの遺伝子発現量（平均値）を１．００として、Ｆｏｌｄ　ｉｎｃｒｅａｓｅで表した。その結果、ＡＤＭの発現量は、＋ＣＫｓ群で２．３０倍向上したことが示され、有意なｍＲＮＡの発現量の差が確認された（図２Ａ）。一方で、ＨＨＥＸの発現量は、＋ＣＫｓ群で２．５８倍向上したことが示され、すべての群間で有意なｍＲＮＡの発現量の差が確認された（図２Ｂ）。これらの結果から、ＴＮＦ－α及びＩＬ－４を線維芽細胞と接触させることにより、線維芽細胞のＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸの遺伝子発現量が向上することが示された。

＜実施例Ａ３：ＴＮＦ－α及びＩＬ－４と接触させた成体由来心臓線維芽細胞は心臓リンパ管の新生効果が高い＞
　ＴＮＦ－αとＩＬ－４で処理した成体由来心臓線維芽細胞のリンパ管新生効果を評価するため、リンパ管内皮細胞を含有するヒト心臓血管内皮細胞を拡大培養した。内皮細胞マーカーであるＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎとＰＤＰＮに両陽性のリンパ管内皮細胞を用いて試験を行った。
　心臓由来細胞から回収したヒトリンパ管内皮細胞と各種のヒト成体由来心臓線維芽細胞を共培養し、免疫蛍光染色によってリンパ管を観察したところ、未処理の成体由来心臓線維芽細胞（ＮＴ）はリンパ管が分断された不連続な脈管形成を示すのに対し、ＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ－４（２ｎｇ／ｍＬ）を添加し、２４時間培養した成体由来心臓線維芽細胞（＋ＣＫｓ）は、分断されることのない連続的な脈管を形成することが明らかとなった（図３Ａ）。また、定量解析の結果からも、＋ＣＫｓは有意に成熟リンパ管の全長を伸長し、ＮＴに対して２．２１±０．７６倍だった（図３Ｂ）。ジャンクション数も有意な増大が認められ、＋ＣＫｓはＮＴに対し、１．８４±０．６５倍増大していた（図３Ｂ）。本結果から、ＴＮＦ－αとＩＬ－４で処理した成体由来心臓線維芽細胞はリンパ管新生効果が高い細胞であることが明らかとなった。

＜実施例Ａ４：ＴＮＦ－α及びＩＬ－４と接触させ、ＣＤ９０及びＣＤ１０６両陽性となった成体由来心臓線維芽細胞は線維症治療効果を有する＞
　リンパ管新生は臓器組織の障害に伴い形成される瘢痕形成（線維症）を治療できることが多くの先行研究により報告されている。本効果を確かめるため、まず次の成体由来心臓線維芽細胞を用意した（図４）：未処理の成体由来心臓線維芽細胞（Ａ－ＨＣＦ）；ＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ－４（２ｎｇ／ｍＬ）を添加し、７２時間培養した成体由来心臓線維芽細胞（ｕＡ－ＨＣＦ）；ｕＡ－ＨＣＦのうちＣＤ９０とＣＤ１０６両陽性である細胞集団を、ＣＤ９０を指標としてＭＡＣＳでセルソーティングし、回収した細胞群（ｕＡ９０－ＨＣＦ）。なお、天然に存在するＣＤ９０及びＣＤ１０６両陽性心臓線維芽細胞との比較のために、胎児由来心臓線維芽細胞を、ＣＤ１０６を指標としてＭＡＣＳでセルソーティングし、回収した（Ｆ－ＶＣＦ）。各々の線維芽細胞の特徴をＦＣＭで評価した結果を図４に示す。
　慢性心不全モデルラットに次の細胞を投与し、シリウスレッド染色で線維症領域の観察を行った（図５）。試験１：Ａ－ＨＣＦ投与群；ｕＡ－ＨＣＦ投与群；ｕＡ９０－ＨＣＦ投与群；Ｃｏｎｔｒｏｌ群（培地だけを投与した群）；Ｓｈａｍ群（偽手術のみを行い心不全を発症していない群）の各群において顕微鏡観察を行った（図５Ａ及びＢ）。試験２：Ｆ－ＶＣＦ投与群、Ｃｏｎｔｒｏｌ群（培地だけを投与した群）の各群において顕微鏡観察を行った（図５Ｃ及びＤ）。その結果、ＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ－４（２ｎｇ／ｍＬ）を添加した線維芽細胞は心筋線維化領域の面積が少なく，特にＴＮＦ－αとＩＬ－４の効果によってＣＤ９０とＣＤ１０６両陽性となった細胞集団のみを投与した群（ｕＡ９０－ＨＣＦ）では著しく線維化領域が小さかった。興味深いことに天然に存在するＣＤ９０及びＣＤ１０６両陽性心臓線維芽細胞（Ｆ－ＶＣＦ）投与群を投与した結果では線維化領域の治療効果は認められなかった。以上の結果から、ＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ－４（２ｎｇ／ｍＬ）を添加し、人工的に作製したリンパ管新生線維芽細胞の線維症に対する機能性の違いを見出すことができた。また、各種の成体由来心臓線維芽細胞を投与した群のＨＥ染色画像をもとに病理評価を行ったところ、ＳＲ染色結果と同様に、ＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ－４（２ｎｇ／ｍＬ）を添加した線維芽細胞はＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、Ｆｉｂｒｏｓｉｓ、Ｌｉｍｅ　ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎのスコアが減少傾向にあり、特にＴＮＦ－αとＩＬ－４の効果によってＣＤ９０とＣＤ１０６両陽性となった細胞集団のみを投与した群（ｕＡ９０－ＨＣＦ）では著しくそれぞれの値が減少した（図６）。
　次に、ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎで、リンパ管細胞内皮マーカーであるｌｙｍｐｈａｔｉｃ　ｖｅｓｓｅｌ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　１（Ｌｙｖｅ－１）を染色し、心筋梗塞巣に動員するリンパ管内皮細胞を観察した。その結果、ＳＲ染色やＨＥ染色の結果と同様に、ＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ－４（２ｎｇ／ｍＬ）を添加した線維芽細胞はリンパ管内皮細胞の動員効果（リンパ管新生効果）が高く、特にＴＮＦ－αとＩＬ－４の効果によってＣＤ９０とＣＤ１０６両陽性となった細胞集団のみを投与した群（ｕＡ９０－ＨＣＦ）では著しくその効果が増大した（図７）。

＜実施例Ａ５：ＣＤ９０及びＣＤ１０６両陽性の心臓線維芽細胞による生体内のリンパ管新生効果＞
　慢性心不全モデルラットに、線維芽細胞（Ａ－ＨＣＦ、ｕＡ－ＨＣＦ、又はｕＡ９０－ＨＣＦ）又はＶｅｈｉｃｌｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（培地のみ）を経心外膜心筋内投与し、各群の生体内におけるリンパ管新生を観察した（図８）。免疫組織化学的観察の結果、ｕＡ９０－ＨＣＦ投与群でのみリンパ管内皮細胞（ＬＥＣ）マーカーであるＰｒｏｘ－１及びＶＥＧＦＲ３の局在が確認できたが、他の群ではＬＥＣの局在が確認できなかった（図８）。

＜実施例Ｂ：ＡＤＭ高発現の線維芽細胞に関する実施例＞
＜ヒト肺線維芽細胞の培養とＡＤＭ高発現且つＶＣＡＭ－１発現向上型線維芽細胞の作製＞
　ヒト成体肺線維芽細胞はＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、５％（ｖ／ｖ）ＮＢＣＳ（Ｎｅｗｂｏｒｎ　Ｃａｌｆ　Ｓｅｒｕｍ）を添加した線維芽細胞培養培地（ＨＦＤＭ－１（＋）ｍｅｄｉｕｍ（株式会社細胞科学研究所、宮城、日本）で拡大培養した。ヒト肺微小血管内皮細胞はＬｏｎｚａ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入し、ＥＢＭ－２培地（Ｌｏｎｚａ）で拡大培養した。明視野観察は、Ｌｅｉｃａ　ＤＭｉ１（Ｌｅｉｃａ　ＧｍｂＨ、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で行った。
　ＡＤＭ高発現且つＶＣＡＭ－１発現向上型線維芽細胞を作製するために、ヒト肺線維芽細胞を細胞培養皿にて拡大培養し、未処理で培養した群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と、ＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍＬ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｃｒａｎｂｕｒｙ、ＮＪ）とＩＬ－４（２ｎｇ／ｍＬ）（富士フイルム和光純薬株式会社、大阪、日本）を２剤混合で処置した群（＋Ｆａｃｔｏｒ－Ｘ）を設けた。すべての群は、５％ＮＢＣＳを添加したＨＦＤＭ－１（＋）を基本培地とし、１日間（２４時間）培養した。

＜フローサイトメトリ＞
　ヒト肺線維芽細胞は、ヒトＣＤ９０－ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ　Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＢＶ４２１　マウス抗ヒトＣＤ１０６（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で免疫蛍光染色した。アイソタイプコントロールは、ＲＥＡコントロール（Ｓ）－ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）及びＢＶ４２１　マウスＩｇＧ１　κアイソタイプコントロール（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。一方で、マウス肺線維芽細胞は、マウスＣＤ９０．２－ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）及びマウスＣＤ１０６（ＶＣＡＭ－１）－ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）で免疫蛍光染色した。アイソタイプコントロールは、ラットＩｇＧ２ｂ－ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）及びラットＩｇＧ２ａ－ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を用いた。細胞は生細胞のまま抗体と３０分間、４℃で反応させた。免疫蛍光染色した細胞はフローサイトメーター（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　１０、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）で解析した。ＦＳＣ－Ａ及びＳＳＣ－Ａで細胞領域を認識後、ＣＤ９０及びＣＤ１０６タンパク質に対する陽性細胞率（％、細胞数換算）を評価した。

＜肺線維芽細胞の遺伝子発現量評価＞
　使用したプライマーは、ＮＣＢＩに公開されているヒトｍＲＮＡ配列（ＶＥＧＦ－Ｃ，ＮＭ＿００５４２９．５（配列番号１３）；ＡＤＭ，ＮＭ＿００１１２４．３（配列番号１）；ＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ），ＮＭ＿００１１０１．５（配列番号３））およびマウスｍＲＮＡ配列（ＶＥＧＦ－Ｃ，ＮＭ＿００９５０６．２（配列番号１４）；ＡＤＭ，ＮＭ＿００９６２７．２（配列番号１５）；ＧＡＰＤＨ，ＮＭ＿００１２８９７２６．１（配列番号１６））を基に、最近接塩基対法で計算されるアニール温度が６０℃前後であって、１つ以上のイントロンを挟むように配列を設計した（配列番号１７～１８（ヒトＶＥＧＦ－Ｃプライマー）、配列番号４～５（ヒトＡＤＭプライマー）、配列番号８～９（ヒトＡＣＴＢプライマー）、配列番号１９～２４（マウスＶＥＧＦ－Ｃプライマー、マウスＡＤＭプライマー、マウスＧＡＰＤＨプライマー））。５’ヌクレアーゼプローブ配列も同じく公開ヒト及びマウスｍＲＮＡ配列データを基に設計しており、このプローブのアニール温度はプライマーより５℃以上高く、またこのプローブの結合位置が、測定対象の遺伝子上における、フォワードプライマーの結合位置とリバースプライマーの結合位置の間の塩基に結合するように設計した。またプローブの５’末端には蛍光色素６－ＦＡＭを、そこから９塩基分３’側にはクエンチャー色素ＺＥＮ、そして３’末端には２つ目のクエンチャー色素Ｉｏｗａ　Ｂｌａｃｋ　ＦＱを結合させたデュアルクエンチャープローブとし、ＲＴ－ＰＣＲ解析におけるバックグラウンドシグナルを低減させている（配列番号２５（ヒトＶＥＧＦ－Ｃプローブ）、配列番号１０（ヒトＡＤＭプローブ）、配列番号１２（ヒトＡＣＴＢプローブ）、配列番号２６～２８（マウスＶＥＧＦ－Ｃプローブ、マウスＡＤＭプローブ、マウスＧＡＰＤＨプローブ））。以上のプライマーとプローブは全てＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社に合成を委託した（表２）。

　肺線維芽細胞からの全ＲＮＡの抽出は、Ｑｉａｇｅｎ　ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌｕｓ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。その際、細胞ライセートの破砕はＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行い、ＤＮａｓｅ処理を含めたその他の操作は、キットのメーカーの推奨プロトコルに従った。得られた全ＲＮＡの濃度測定は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ　Ｏｎｅ／Ｏｎｅ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、波長２６０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に、タンパク質の混入度を示すＡ２６０／Ａ２８０の値を算出し、Ａ２６０／Ａ２８０＞２．０であることを確認した。
　リアルタイム定量ＲＴ－ＰＣＲは、Ｏｎｅ　Ｓｔｅｐ　ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　３　ＲＴ－ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ，ｗｉｔｈ　ＵＮＧ　Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用いて、逆転写反応とＲＴ－ＰＣＲを同じチューブでまとめて行った。反応は、１×Ｏｎｅ　Ｓｔｅｐ　ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　３　ＲＴ－ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ，ｗｉｔｈ　ＵＮＧ，０．２μＭ　フォワード＆リバースプライマー、０．２μＭ　特異的プローブ、１０ｎｇ（ヒト肺線維芽細胞）または１００ｎｇ（マウス肺線維芽細胞）　鋳型ＲＮＡ溶液を含む反応液（総量１５μＬ）で行った。最初に５２℃で５分間加温することにより逆転写反応を行い、その後、逆転写酵素を失活させるために９５℃で１０秒間加熱した。続いて９５℃で５秒間、６０℃で３０秒間を加熱するサイクルを４０回繰り返し、サイクルごとの蛍光強度を測定した。一連の反応と測定は、７５００　Ｒａｓｔ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。同時に、検量線作成のための標品として、ＡＤＭとＶＥＧＦ－Ｃの発現を確認済のサンプルより抽出したＲＮＡ溶液を用い、１μｇから１０倍ずつ４段階希釈したＲＮＡ溶液を用いて上記の測定を行った。すべてのサンプルは、Ｎ＝３で測定を行った。
　ＰＣＲ終了後、得られた増幅曲線について標的遺伝子ごとに蛍光強度のベースラインと閾値を設定し、その閾値に蛍光シグナルが到達したサイクル数（Ｃｔ値）をサンプルごとに求めた。それぞれの遺伝子の検量線は、相関係数が０．９９以上で増幅効率が８５％以上であり検量線として十分と考えられたため、対象サンプルのＣｔ値を検量線に当てはめ目的とする遺伝子のｍＲＮＡ含有量を相対値として算出した。この相対値を同様にして算出したハウスキーピング遺伝子（β－ＡｃｔｉｎまたはＧＡＰＤＨ）の値で標準化した。また、線維芽細胞の遺伝子発現量は、ハウスキーピング遺伝子発現量で標準化したＣｏｎｔｒｏｌの遺伝子発現量を１として、Ｆｏｌｄ　ｉｎｃｒｅａｓｅで表した。

＜リンパ管の脈管形成アッセイ＞
　リンパ管の脈管形成アッセイは、当業者に既知の手法により、ヒト肺由来細胞から回収したリンパ管内皮細胞と各種ヒト肺線維芽細胞を共培養し、各種肺線維芽細胞による肺リンパ管新生効果の評価を行った（非特許文献１５）。具体的には、ヒト肺由来細胞から回収したリンパ管内皮細胞と各種ヒト成体由来肺線維芽細胞を２．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の濃度で１：９の割合で播種し、ＥＢＭ－２培地で３日間共培養した。共培養後、細胞は４％パラホルムアルデヒドで固定し、免疫蛍光染色を行った。一次抗体は、抗ＶＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎウサギポリクローナル抗体（ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）と抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎマウスポリクローナル抗体（ａｂｃａｍ）を使用した。二次抗体は、ヤギ抗ウサギＩｇＧ　Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８）（ａｂｃａｍ）とヤギ抗マウスＩｇＧ　Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７）（ａｂｃａｍ）を使用した。核染色はＨｏｅｃｈｓｔ　３３２５８　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（同仁化学研究所、熊本、日本）で行った。染色サンプルは、ＩＮ　Ｃｅｌｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　２２００（Ｃｙｔｉｖａ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）で撮影した。

＜マウス肺線維芽細胞の単離・初代培養とＡＤＭ高発現且つＶＣＡＭ－１発現向上型線維芽細胞の作製＞
　本研究で行った全ての動物実験は、ナノ医療イノベーションセンター（神奈川、日本）の倫理審査委員会の承認を受けた（動物実験計画書承認番号：Ａ２０－００３）。なお、全ての動物に苦痛軽減措置を実施した。
　マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ（オス、１０週齢）は日本チャールス・リバー（神奈川、日本）から購入した。マウス成体由来肺線維芽細胞は、肺組織から回収したプライマリー細胞であり、このプライマリー細胞を拡大培養したものである。具体的には、回収した成体マウス肺組織（Ｃ５７ＢＬ／６マウス、１０週齢）をメスで１ｍｍ角にミンスし、０．１４　Ｗｕｎｓｃｈ　ｕｎｉｔｓ／ｍＬのＬｉｂｅｒａｓｅ　ＴＭ（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加して３７℃インキュベータ内で酵素処理を行い、プライマリー肺線維芽細胞の単離・培養を行った。なお、培養培地は１５％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いた。明視野観察は、Ｌｅｉｃａ　ＤＭｉ１（Ｌｅｉｃａ　ＧｍｂＨ、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で行った。
　ＡＤＭ高発現且つＶＣＡＭ－１発現向上型成体由来肺線維芽細胞（ＶＰＦ）を作製するために、マウス成体由来肺線維芽細胞を細胞培養皿にて拡大培養し、未処理で培養した群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と、リコンビナントマウスＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍＬ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）とリコンビナントマウスＩＬ－４（２ｎｇ／ｍＬ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を２剤混合で処置した群（＋Ｆａｃｔｏｒ－Ｘ）を設けた。すべての群を、１５％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を基本培地とし、３日間（７２時間）培養することでＡＤＭ高発現且つＶＣＡＭ－１発現向上型成体由来肺線維芽細胞（ＶＰＦ）を作成した。このＶＰＦを後述の実施例Ｂ３及びＢ４で用いた。
　また、同様の手法により、日本チャールス・リバー（神奈川、日本）から購入したＣ５７ＢＬ／６マウス（メス、１０週齢）から肺を採材し、初代培養により肺線維芽細胞（ＰＦ）の拡大培養を行い、さらにＡＤＭ高発現且つＶＣＡＭ１発現向上型ＰＦ（ＶＰＦ）を作製した。このＶＰＦを後述の実施例Ｂ５で用いた。
　なお、本明細書や図等において、マウス由来のＰＦをｍＰＦということもあり、ラット由来のＰＦをｒＰＦということもある。また、マウス由来のＶＰＦをｍＶＰＦということもあり、ラット由来のＶＰＦをｒＶＰＦということもある。

＜マウス間質性肺炎・肺線維症モデルの作製＞
　間質性肺炎及び肺線維症に対するＡＤＭ高発現且つＶＣＡＭ－１発現向上型成体由来肺線維芽細胞（ＶＰＦ）の治療効果を評価するため、ブレオマイシン誘導性マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊモデルを日本チャールス・リバーから購入した。ブレオマイシンによる間質性肺炎及び肺線維症の誘導は当業者に既知の手法により行った（非特許文献１６）。具体的には、ブレオマイシン溶液（０．９％生理食塩液中、１Ｕ／ｍｌ）をｌｉｑｕｉｄ　ＭｉｃｒｏＳｐｒａｙｅｒ（ＰｅｎｎＣｅｎｔｕｒｙ、Ｗｙｎｄｍｏｏｒ、ＰＡ）に充填し、５０ｍＬ中、２ｍｇ／ｋｇの濃度でマウス（オス、９週齢）の肺に深麻酔下で経気道投与し、ブレオマイシン溶液の投与７日後のマウスを間質性肺炎・肺線維症モデルとみなした。

＜マウス間質性肺炎・肺線維症モデルへの細胞投与及び投与後のＶＰＦの治療効果の評価＞
　間質性肺炎・肺線維症モデルマウスに、線維芽細胞を尾静脈経由で静脈投与した。各種線維芽細胞は、１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ生理食塩液／ｂｏｄｙで投与した。それぞれのマウスにｍＰＦ、ｍＶＰＦまたはコントロールとしての生理食塩液（Ｃｔｒｌ）を投与した。
　各細胞の治療効果は、Ｋａｐｌａｎ－ｍｅｉｅｒ法による生存分析と病理学的評価により行った。実施例Ｂ３及びＢ４においては、試験終了時である細胞投与４週後（２８日後）に動物を犠牲死して肺を採材した。採材した肺は、４％パラホルムアルデヒドでの固定後、パラフィン包埋を行った。パラフィン切片はシリウスレッド（ＳＲ）染色し、バーチャルスライドスキャナ（ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ　Ｓ２１０、浜松ホトニクス、静岡、日本）で撮像した。また、実施例Ｂ５においては、試験終了時である細胞投与２週後（１４日後）に動物を犠牲死して肺を採材した。採材した肺は、４％パラホルムアルデヒドでの固定後、パラフィン包埋を行った。パラフィン切片はＭａｓｓｏｎ’s　Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色した後にＢＺ－Ｘ７１０（Ｋｅｙｅｎｃｅ、大阪、日本）で撮像した。撮像した画像は、ＩｍａｇｅＪ　ｓｏｆｔｗａｒｅで線維化領域の定量を行った。

＜ラット肺線維芽細胞の初代培養とＡＤＭ高発現且つＶＣＡＭ－１発現向上型線維芽細胞の作製＞
　日本チャールス・リバー（神奈川、日本）から購入したＷＫＹ／ＮＣｒｌＣｒｌｊラット（メス、６週齢）から肺を採材し、初代培養によりラット肺線維芽細胞（ｒＰＦ）の拡大培養を行った。具体的には、プライマリーにより回収したラット肺組織をメスで１ｍｍ角にミンスし、０．１４　Ｗｕｎｓｃｈ　ｕｎｉｔｓ／ｍＬのＬｉｂｅｒａｓｅ　ＴＭ（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加して３７℃インキュベータ内で酵素処理を行い、ＤＭＥＭ（Ｌｏｗ　Ｇｌｕｃｏｓｅ）で拡大培養を行った。
　ＡＤＭ高発現且つＶＣＡＭ－１発現向上型ｒＰＦ（ｒＶＰＦ）は、上述のｍＶＰＦの作製手法と同様の手法で作製した。具体的には、ｒＰＦにラット組換えＴＮＦ－α及びＩＬ－４を添加し（最終濃度：５０ｎｇ／ｍＬ　ＴＮＦ－α、２ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ－４）、７２時間の培養を行うことで作製した。ｒＶＰＦのＶＣＡＭ－１陽性細胞率はＭＡＣＳＱｕａｎｔ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ　Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でフローサイトメトリにより評価した。

＜ラット間質性肺炎・肺線維症モデルの作製＞
　病態モデルラットの作出は、日本チャールス・リバー（神奈川、日本）に委託した。BＮ／ＣｒｌＣｒｌｊラット（オス、６週齢）にブレオマイシン溶液（５ｍｇ／ｋｇ生理食塩液）をｌｉｑｕｉｄ　ＭｉｃｒｏＳｐｒａｙｅｒで単回気管内噴霧投与し、間質性肺炎・肺線維症モデルラットを作製した。なお、下記の理由により、このラットの系統を選択した：（１）ＢＮラットとＷＫＹラットはそれぞれ近交系統で免疫学的に乖離しており、両系統の選択は他家細胞医薬品の有効性試験として広く使用されている；（２）本系統において間質性肺炎・肺線維症モデル作製の報告がある（非特許文献１７）。

＜ラット間質性肺炎・肺線維症モデルへの細胞投与及び投与２週後の治療効果の評価＞
　ブレオマイシン溶液を投与して５日後の間質性肺炎・肺線維症モデルラットに、次の種類の細胞を５．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／５００μＬ生理食塩液／ｂｏｄｙで経静脈投与した。それぞれのラットにｒＰＦ、ｒＶＰＦまたはコントロールとしての生理食塩液（Ｃｔｒｌ）を投与した。
　各細胞の治療効果は、Ｋａｐｌａｎ－ｍｅｉｅｒ法による生存分析と病理学的評価により行った。試験終了時である細胞投与２週後（１４日後）に動物を犠牲死して肺を採材した。採材した肺は，４％パラホルムアルデヒドで固定後、パラフィン包埋を行った。パラフィン切片はＭａｓｓｏｎ’s　Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色した後にＢＺ－Ｘ７１０（Ｋｅｙｅｎｃｅ、大阪、日本）で撮像した。撮像した画像は、ＩｍａｇｅＪ　ｓｏｆｔｗａｒｅで線維化領域の定量を行った。

＜ヒト肺線維芽細胞の培養とＶＣＡＭ－１発現向上型線維芽細胞の作製＞
　ヒト成体肺線維芽細胞はＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、５％（ｖ／ｖ）ＮＢＣＳ（Ｎｅｗｂｏｒｎ　Ｃａｌｆ　Ｓｅｒｕｍ）を添加した線維芽細胞培養培地（ＨＦＤＭ－１（＋）ｍｅｄｉｕｍ（株式会社細胞科学研究所、宮城、日本）で拡大培養した。
　ＶＣＡＭ－１発現向上型線維芽細胞を作製するために、ヒト肺線維芽細胞を細胞培養皿にて拡大培養し、未処理で培養した群（ｈＰＦ）と、ＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍＬ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｃｒａｎｂｕｒｙ、ＮＪ）とＩＬ－４（２ｎｇ／ｍＬ）（富士フイルム和光純薬株式会社、大阪、日本）を２剤混合で処置した群（ｈＰＦ＋ＣＫｓ）を設けた。すべての群は、５％ＮＢＣＳを添加したＨＦＤＭ－１（＋）を基本培地とし、３日間（７２時間）培養した。ｈＶＰＦはｈＰＦ＋ＣＫｓを抗ＣＤ１０６（ＶＣＡＭ－１）－Ｂｉｏｔｉｎ，ｈｕｍａｎ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ　Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とＡｎｔｉ－Ｂｉｏｔｉｎ　ｍｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）で免疫染色し、ａｕｔｏＭＡＣＳ　ｐｒｏ　Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）でセルソーティングにより回収した。

＜統計解析＞
　実験結果は平均値±標準偏差（ＳＤ）で表した。有意差検定はＫａｐｌａｎ－ｍｅｉｅｒ法による生存分析はログランク（マンテル・コックス）検定及びログランク・トレンド検定で算出し、その他の実験はスチューデントのｔ検定で算出した。Ｐ＜０．０５を有意差とみなした。
　また、線維化領域の統計解析及びフローサイトメトリによる細胞特性解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍ　９　ｆｏｒ　Ｗｉｎｄｏｗｓ　６４－ｂｉｔ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　９．２．０（３３２）で行った。マウスへの同系移植実験においては、ｏｒｄｉｎａｒｙ　ｏｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡを実施し、Ｃｔｒｌを基準としたｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓをＤｕｎｎｅｔｔ’s　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ　ｔｅｓｔで実施した。ラットへの同種移植実験においては、ｏｒｄｉｎａｒｙ　ｏｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡを実施し、各群のｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓをＴｕｋｅｙ‘s　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ　ｔｅｓｔで実施した。ヒト肺線維芽細胞の細胞特性解析においては、２－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡを実施し、各群のｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓをＴｕｋｅｙ‘s　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ　ｔｅｓｔで実施した。いずれの試験においても、Ｐ＜０．０５を有意差とみなした。

＜実施例Ｂ１：ＡＤＭ高発現且つＶＣＡＭ－１発現向上型線維芽細胞のリンパ管新生能＞
　ヒト成体由来肺線維芽細胞は細胞培養皿にて接着培養により拡大培養した。明視野観察により、培養したヒト成体由来肺線維芽細胞は紡錘型の線維芽細胞様形態であることを示した（図９Ａ）。培養したヒト成体由来肺線維芽細胞にＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ－４（２ｎｇ／ｍＬ）を２剤混合（Ｆａｃｔｏｒ－Ｘ）で添加して２４時間培養し（図９Ｂ）、フローサイトメトリ（ＦＣＭ）で線維芽細胞マーカーであるＣＤ９０とＶＣＡＭ－１（ＣＤ１０６）の陽性細胞率を評価した（図９Ｃ及び９Ｄ）。ヒト成体由来肺線維芽細胞はほぼ全ての細胞がＣＤ９０に陽性で、未処理のヒト成体由来肺線維芽細胞（Ｃｏｎｔｒｏｌ）のＣＤ９０陽性細胞率は９６．００±４．３３％であったのに対し、ＴＮＦ－αとＩＬ－４を添加したヒト成体由来肺線維芽細胞（＋Ｆａｃｔｏｒ－Ｘ）のＣＤ９０陽性細胞率は９５．５６±４．５１％だった。また、ＣｏｎｔｒｏｌのＣＤ１０６陽性細胞率が６．０３±１．９１％であったのに対し、＋Ｆａｃｔｏｒ－ＸのＣＤ１０６陽性細胞率は３１．９６±５．７８％だった。ＣＤ９０とＣＤ１０６の両陽性（Ｄｏｕｂｌｅ（＋））細胞率は、Ｃｏｎｔｒｏｌが５．８６±１．９４％であったのに対し、＋Ｆａｃｔｏｒ－Ｘは３１．２５±６．２７％だった。これらの結果から、ＴＮＦ－αとＩＬ－４は有意にヒト肺線維芽細胞のＣＤ１０６陽性細胞率を向上することが明らかとなった。
　次に、Ｆａｃｔｏｒ－ＸによってＣＤ１０６陽性細胞率の向上したヒト成体由来肺線維芽細胞のリンパ管新生能の評価を行うため、リンパ管新生因子として代表的なＶＥＧＦ－ＣとＡＤＭの遺伝子発現レベルをＲＴ－ｑＰＣＲで評価した（図９Ｅ）。その結果、ＶＥＧＦ－ＣとＡＤＭの遺伝子発現量は、Ｆａｃｔｏｒ－Ｘの添加によってそれぞれ２．９９±０．３９倍、２．４６±０．６９倍高く発現しており、両群には有意な差が認められた。以上の結果から、ＴＮＦ－αとＩＬ－４によってＶＣＡＭ－１発現レベルを向上させたヒト肺線維芽細胞はリンパ管新生遺伝子を高発現しており、肺のリンパ管新生能に富む細胞であることが示唆された。

＜実施例Ｂ２：ＡＤＭ高発現且つＶＣＡＭ－１発現向上型線維芽細胞のリンパ管新生効果＞
　ヒト由来のＡＤＭ高発現且つＶＣＡＭ－１発現向上型成体由来肺線維芽細胞（ＶＰＦ）のリンパ管新生効果を評価するため、ヒト肺由来細胞から回収したリンパ管内皮細胞を含有するヒト肺微小血管内皮細胞を拡大培養した。明視野観察により、培養した細胞は、敷石状の形態を示し（図１０Ａ）、ＦＣＭ解析により本細胞は内皮細胞マーカーであるＶＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎに９９．７１±０．０９％陽性で（Ｎ＝３）、リンパ管内皮細胞マーカーであるＰＤＰＮに９６．７７±０．３７％陽性であることが明らかとなった（Ｎ＝３）（図１０Ｂ）。内皮細胞マーカーであるＶＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎとリンパ管内皮細胞マーカーであるＰＤＰＮに両陽性のリンパ管内皮細胞を用いて試験を行った。
　ヒト肺由来細胞から回収したリンパ管内皮細胞と各種ヒト成体由来肺線維芽細胞を共培養し、免疫蛍光染色によってリンパ管を観察したところ、未処理の成体由来肺線維芽細胞はリンパ管が分断された不連続な脈管形成を示すのに対し、ＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ－４（２ｎｇ／ｍＬ）を添加し、２４時間培養した成体由来肺線維芽細胞（＋Ｆａｃｔｏｒ－Ｘ）は、分断されることのない連続的な脈管を形成することが明らかとなった（図１０Ｃ）。本結果から、ＴＮＦ－αとＩＬ－４で処理した肺線維芽細胞はリンパ管新生効果が高い細胞であることが明らかとなった。

＜実施例Ｂ３：ＡＤＭ高発現且つＶＣＡＭ－１発現向上型線維芽細胞による間質性肺炎・肺線維症の治療効果＞
　リンパ管新生効果の高いＴＮＦ－αとＩＬ－４で処理した成体由来肺線維芽細胞の間質性肺炎・肺線維症の治療効果を評価するため、同系移植実験をデザインした。Ｃ５７ＢＬ／６成体マウスから肺由来の線維芽細胞を回収し、拡大培養を行った。明視野観察により、培養したプライマリー成体由来肺線維芽細胞は紡錘型の線維芽細胞様形態であることを示した（図１１Ａ）。培養したマウス成体由来肺線維芽細胞にＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ－４（２ｎｇ／ｍＬ）を添加して３日間培養し、それぞれのマウス成体由来肺線維芽細胞のＣＤ１０６陽性細胞率をＦＣＭにより評価した（図１１Ｂ）。その結果、Ｃｏｎｔｒｏｌは８４．８９±１１．４２％であったのに対し（Ｎ＝３）、Ｆａｃｔｏｒ－Ｘを添加した線維芽細胞は９６．５２±３．３２％であった（Ｎ＝３）。本結果から、マウス肺線維芽細胞は、ヒト肺線維芽細胞と比較して通常状態でもＣＤ１０６陽性細胞率が高めであるが、ＴＮＦ－αとＩＬ－４は種を超えてＣＤ１０６陽性細胞率を向上できることが分かった。
　マウス由来のＡＤＭ高発現且つＶＣＡＭ－１発現向上型成体由来肺線維芽細胞（ＶＰＦ）のリンパ管新生能を評価するために、それぞれの成体由来肺線維芽細胞のＶＥＧＦ－ＣとＡＤＭの遺伝子発現量をＲＴ－ｑＰＣＲで評価したところ、ヒト成体由来肺線維芽細胞と同様に、ＶＥＧＦ－ＣとＡＤＭの遺伝子発現量は、ＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ－４（２ｎｇ／ｍＬ）（Ｆａｃｔｏｒ－Ｘ）の添加によってそれぞれ４．１１±０．５９倍（Ｎ＝３）、１．７０±０．２７倍（Ｎ＝３）高く発現しており、両群には有意な差が認められた（図１１Ｃ）。本結果から、マウス肺線維芽細胞はヒト肺線維芽細胞と同様にＴＮＦ－αとＩＬ－４によってリンパ管新生遺伝子を有意に高発現させることが明らかとなり、マウス由来のＶＰＦもリンパ管新生能に富む細胞であることが明らかとなった。

＜実施例Ｂ４：ＡＤＭ高発現且つＶＣＡＭ－１発現向上型線維芽細胞による間質性肺炎・肺線維症の治療効果＞
　間質性肺炎・肺線維症に対するＡＤＭ高発現且つＶＣＡＭ－１発現向上型成体由来肺線維芽細胞（ＶＰＦ）の治療効果を評価するため、マウス間質性肺炎・肺線維症モデルに図１２Ａに記載の実験スケジュールで細胞を投与した。モデル動物は次の３群を設けた：マウス成体由来肺線維芽細胞投与群（＋ＰＦｓ、Ｎ＝８）、マウスＶＰＦ投与群（＋ＶＰＦｓ、Ｎ＝１０）、生理食塩水投与群（Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｎ＝１０）。
　Ｋａｐｌａｎ－ｍｅｉｅｒ法による生存分析で各群の生命予後に対する効果を評価したところ、Ｄａｙ２８の生存率はそれぞれ４０．００％（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、３７．５０％（＋ＰＦｓ）、８０．００％（＋ＶＰＦｓ）だった（図１２Ｂ）。また、生存期間中央値はそれぞれ１４．５日（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、１４日（＋ＰＦｓ）、８０％個体生存のため定義不可（＋ＶＰＦｓ）であり、ＶＰＦ投与による生命予後の改善が認められた。
　細胞投与４週後に肺を回収し、各群の肺組織をシリウスレッド染色し、病理学的観察により肺胞構造と線維症の進行の程度を評価したところ、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と＋ＰＦｓ群は肺胞構造の明瞭な区画が観察されず、気管支周辺を中心に線維化領域が確認されたのに対し、＋ＶＰＦｓ群は明瞭な肺胞区画が観察され、線維化領域は観察されなかった（図１２Ｃ）。

＜実施例Ｂ５：マウス間質性肺炎・肺線維症モデルへのｍＶＰＦの投与及び投与２週後の治療効果の評価＞
　さらに、マウス間質性肺炎・肺線維症モデルマウスにそれぞれｍＰＦ、ｍＶＰＦまたは生理食塩液（Ｃｔｒｌ）を投与し、投与後２週間の生存率を比較評価したところ、Ｃｔｒｌ群はＤａｙ１０とＤａｙ１４に２例ずつの死亡が確認され、生存率は６３．６４％を示した（７／１１例）（図１３Ａ）。一方で、ｍＰＦ投与群はＤａｙ７とＤａｙ９に１例ずつの死亡が確認され、生存率は７１．４３％（５／７例）であった。さらに、ｍＶＰＦ投与群では、１例も死亡が確認されず、生存率は１００％だった（５／５例）。本結果から、ｍＶＰＦの間質性肺炎・肺線維症に対する高い生存率改善効果が示唆された。
　次に、細胞投与１４日後に採材した肺組織のＭａｓｓｏｎ’ｓ　Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色を実施し、病理観察を行ったところ、ｍＶＰＦ投与群が最も少ない線維症領域を示し、正常な肺胞構造を示すことが明らかとなった（図１３Ｂ）。また、各群の線維化領域を定量評価したところ、ｍＶＰＦ投与群が最も線維化領域が少なく、Ｃｔｒｌ群と比較して有意にその領域が小さいことが明らかとなった（図１３Ｃ）。また、細胞投与０日の個体と比較し、Ｃｔｒｌ群は有意に線維化領域が増大したのに対し、その他の群（ｍＰＦ投与群、ｍＶＰＦ投与群）では有意差が見られなかった。また、ｍＰＦ投与群と比較して、ｍＶＰＦ投与群は線維化領域が小さいことも分かった。これらの結果から、ｍＶＰＦの同系移植・投与はブレオマイシン投与によるマウス間質性肺炎・肺線維症モデルの生存率を高め、線維化の病態進行を抑制する働きがあることが分かった。

＜実施例Ｂ６：ラット肺線維芽細胞の単離及びＶＣＡＭ－１陽性ラット肺線維芽細胞の作製＞
　ＷＫＹ／ＮＣｒｌＣｒｌｊラットから肺線維芽細胞（ｒＰＦ）を単離し、ＤＭＥＭ（Ｌｏｗ　Ｇｌｕｃｏｓｅ）培地で拡大培養を行った（図１４Ａ）。次に、ｒＰＦにラット組換えＴＮＦ－α（終濃度：５０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ－４（終濃度：２ｎｇ／ｍＬ）を添加しｒＶＰＦの作製を試みた（図１４Ｂ）。ＦＣＭ解析により、ｒＰＦはＶＣＡＭ－１（ＣＤ１０６）陽性細胞率が２５．１８％であったのに対し、ＴＮＦ－α及びＩＬ－４を添加し作製したｒＶＰＦは８０．０２％の陽性細胞率を示した（図１４Ｃ）。従って、ｒＰＦはｍＰＦと同様にＴＮＦ－α及びＩＬ－４に応答性を示し、ｒＶＰＦを作製できることが分かった。

＜実施例Ｂ７：ラット間質性肺炎・肺線維症モデルへのｒＶＰＦの投与及び投与２週後の治療効果の評価＞
　ラット間質性肺炎・肺線維症モデルマウスへそれぞれｒＰＦ、ｒＶＰＦ又は生理食塩液（Ｃｔｒｌ）を投与し、投与後２週間の生存率を比較評価したところ、ラットモデルはマウスモデルと異なり、細胞または生理食塩液投与後２週間ではどの群も死亡及び瀕死個体は確認されなかったため、各群間の生存率に差は見られなかった。
　一方で、細胞投与１４日後に採材した肺組織のＭａｓｓｏｎ’s　Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色を実施し、病理観察を行ったところ、各群間に大きな違いが確認された。ブレオマイシン投与後５日の細胞投与前の肺（ＢＬＭ）で確認された広範囲の線維症像は、生理食塩液投与（Ｃｔｒｌ）によって更に悪化し、肺全体で線維化及び異常な構造形成を示すことが分かった（図１５Ａ及び１５Ｂ）。一方で、ｒＰＦ及びｒＶＰＦ投与群では、線維化及び肺の異常な構造形成は限局的にしか確認されず、Ｃｔｒｌよりも有意に線維化領域が少なかった。その中でも、ｒＶＰＦ投与群は細胞投与前よりも線維化領域が有意に減少しており、線維化領域の改善効果を有することが分かった（図１５Ａ及び１５Ｂ）。これは、マウスへの同系移植実験の結果と類似しており、ＶＰＦは自家細胞医薬品としても他家細胞医薬品としても、肺線維症に対する改善・予防効果が示唆された。

＜実施例Ｂ８：ＶＣＡＭ－１発現向上型ヒト肺線維芽細胞の細胞特性解析＞
　ヒト成体由来肺線維芽細胞（ｈＰＦ）は細胞培養皿にて接着培養により拡大培養した。培養したｈＰＦにＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ－４（２ｎｇ／ｍＬ）を２剤混合（Ｆａｃｔｏｒ－Ｘ）で添加して７２時間培養し、ｈＰＦ＋ＣＫｓを作製した。ｈＰＦ＋ＣＫｓはＶＣＡＭ－１（ＣＤ１０６）を指標にセルソーティングし、ｈＶＰＦを作製した。
　フローサイトメトリ（ＦＣＭ）で線維芽細胞マーカーであるＣＤ９０とＶＣＡＭ－１（ＣＤ１０６）の陽性細胞率を評価した（図１６Ａ）。ヒト成体由来肺線維芽細胞はほぼ全ての細胞がＣＤ９０に陽性で、ｈＰＦのＣＤ９０陽性細胞率は９９．６８±０．０６％（Ｎ＝５）であったのに対し、ｈＰＦ＋ＣＫｓのＣＤ９０陽性細胞率は９８．８１±０．５１％（Ｎ＝５）であった。また、ｈＶＰＦのＣＤ９０陽性細胞率は９９．０８±０．４１％（Ｎ＝５）であり、各群に有意差は認められなかった（図１６Ｂ）。
　一方で、ｈＰＦのＶＣＡＭ－１（ＣＤ１０６）陽性細胞率は１５．４９±２．５２％（Ｎ＝５）であったのに対し、ｈＰＦ＋ＣＫｓのＣＤ１０６陽性細胞率は３１．３８±３．４１％（Ｎ＝５）であった。また、ｈＶＰＦのＣＤ１０６陽性細胞率は９８．１１±１．０１％（Ｎ＝５）であり、ｈＰＦ＋ＣＫｓはｈＰＦよりも有意にＣＤ１０６陽性細胞率が高く、ｈＶＰＦはｈＰＦ＋ＣＫｓよりも更に有意に陽性細胞率が高いことが分かった（図１６Ｂ）。
　ＣＤ９０とＣＤ１０６の両陽性細胞率（ＤＰ）も同様で、ｈＰＦのＤＰは１５．３８±２．５９％（Ｎ＝５）であったのに対し、ｈＰＦ＋ＣＫｓのＤＰは３１．２１±３．３０％（Ｎ＝５）であった。また、ｈＶＰＦのＤＰは９７．４７±１．１８％（Ｎ＝５）であり、ｈＰＦ＋ＣＫｓはｈＰＦよりも有意にＤＰが高く、ｈＶＰＦはｈＰＦ＋ＣＫｓよりも更に有意にＤＰが高いことが分かった（図１６Ｂ）。

　以上より、ＴＮＦ－αとＩＬ－４によって処理した線維芽細胞は、線維芽細胞のＡＤＭ高発現且つＶＣＡＭ－１陽性細胞率を向上すること、またＡＤＭ高発現且つＶＣＡＭ－１の発現を向上した線維芽細胞は、リンパ管新生能が向上するため、連続的なリンパ管の脈管形成を促進することが明らかとなった。そして当該線維芽細胞、特に肺由来の当該線維芽細胞の同系の経静脈投与により、マウス間質性肺炎・肺線維症の生命予後を有意に改善し、本細胞が線維症の改善に有効であることが明らかとなった。さらに、ＡＤＭ高発現且つＶＣＡＭ－１発現向上型成体由来線維芽細胞、特にＶＰＦは自家細胞医薬品としても他家細胞医薬品としても、肺線維症に対する改善・予防効果が示唆された。そのため、ＡＤＭ高発現且つＶＣＡＭ－１発現向上型成体由来線維芽細胞、特にＶＰＦの静脈投与は予後不良な疾患として知られているＩＰＦをはじめとする肺線維症の新規治療薬として期待できる。

Claims

　ＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸ高発現の線維芽細胞を含む医薬組成物。
　前記線維芽細胞が成体由来の線維芽細胞である、請求項１に記載の医薬組成物
　前記細胞のＡＤＭ及び／又はＨＨＥＸの遺伝子発現量が、対照となる線維芽細胞と比較して、１．２０倍以上高いものである、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
　線維症を治療するための、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
　リンパ管新生能が低下している状態を改善するための、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
　組織液の恒常性の障害を改善するための、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
　浮腫を軽減するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
　脂質及び／又はビタミンの輸送能の障害を改善するための、請求項１～７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
　免疫監視機構を活性化するための、請求項１～８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
　注射用組成物である、請求項１～９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
　前記細胞が、平面状又は立体状の細胞組織として構築されたものである、請求項１～９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
　前記線維芽細胞が心臓由来の線維芽細胞である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
　ＡＤＭ高発現の線維芽細胞の製造方法であって、
　線維芽細胞に、ＴＮＦ－α及びＩＬ－４を接触させること、並びに
　前記接触させた線維芽細胞を、ＡＤＭが高発現になり得る条件下で培養すること、
を含む、ＡＤＭ高発現の線維芽細胞の製造方法。
　前記線維芽細胞が、ＶＥＧＦ－Ｃ高発現である、請求項１３に記載の方法。
　前記線維芽細胞が、ＣＤ１０６陽性である、請求項１３又は１４に記載の方法。
　抗ＣＤ１０６抗体を用いて、ＡＤＭ高発現の線維芽細胞を選択又は濃縮することを含む、請求項１５に記載の方法。
　前記線維芽細胞が肺由来の線維芽細胞である、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の方法。
　請求項１３～１７のいずれか一項に記載する製造方法によって得られる、ＡＤＭ高発現の線維芽細胞。
　請求項１８に記載する細胞を含む、線維芽細胞集団。
　ＡＤＭ高発現の線維芽細胞。
　ＶＥＧＦ－Ｃ高発現である、請求項２０に記載の線維芽細胞。
　ＣＤ１０６陽性である、請求項２０又は２１に記載の線維芽細胞。
　前記細胞のＶＥＧＦ－Ｃ及び／又はＡＤＭの遺伝子発現量が、対照となる線維芽細胞と比較して、それぞれ１．２０倍以上高いものである、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の細胞。
　前記線維芽細胞が肺由来の線維芽細胞である、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の細胞。
　請求項２０～２４のいずれか一項に記載の細胞を含む、線維芽細胞集団。
　ＣＤ１０６陽性である肺由来線維芽細胞を含む細胞集団であって、
　前記ＣＤ１０６陽性である肺由来線維芽細胞の割合（細胞数基準）が、前記細胞集団中に含まれる全線維芽細胞に対して１８．０１％超である、細胞集団。
　請求項１８及び２０～２４のいずれか一項に記載の細胞又は請求項１９及び２５～２６のいずれか一項に記載の細胞集団を含む、医薬組成物。
　肺疾患を治療するための、請求項２７に記載の医薬組成物。
　前記肺疾患が、肺線維症又は間質性肺炎である、請求項２８に記載の医薬組成物。
　リンパ管新生能が低下している状態を改善するための、請求項２７に記載の医薬組成物。
　注射用組成物である、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
　前記細胞または前記細胞集団が、平面又は立体の形状の細胞組織として構築されたものである、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。