WO2022168958A1 - 超長鎖多価不飽和脂肪酸組成物 - Google Patents

超長鎖多価不飽和脂肪酸組成物 Download PDF

Info

Publication number
WO2022168958A1
WO2022168958A1 PCT/JP2022/004520 JP2022004520W WO2022168958A1 WO 2022168958 A1 WO2022168958 A1 WO 2022168958A1 JP 2022004520 W JP2022004520 W JP 2022004520W WO 2022168958 A1 WO2022168958 A1 WO 2022168958A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
polyunsaturated fatty
less
fatty acids
content
derivatives
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/004520
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
峻允 関口
美咲 ▲高▼橋
龍太郎 江湖
誠造 佐藤
Original Assignee
日本水産株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 日本水産株式会社 filed Critical 日本水産株式会社
Priority to JP2022579628A priority Critical patent/JPWO2022168958A1/ja
Priority to EP22749829.2A priority patent/EP4289957A1/en
Publication of WO2022168958A1 publication Critical patent/WO2022168958A1/ja
Priority to US18/230,530 priority patent/US20240011061A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23D—EDIBLE OILS OR FATS, e.g. MARGARINES, SHORTENINGS, COOKING OILS
    • A23D9/00—Other edible oils or fats, e.g. shortenings, cooking oils
    • A23D9/02—Other edible oils or fats, e.g. shortenings, cooking oils characterised by the production or working-up
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B1/00—Production of fats or fatty oils from raw materials
    • C11B1/10—Production of fats or fatty oils from raw materials by extracting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
    • C11C3/00—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom
    • C11C3/04—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom by esterification of fats or fatty oils
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01199—Very-long-chain 3-oxoacyl-CoA synthase (2.3.1.199)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/85—Saccharomyces
    • C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae

Definitions

  • the present invention relates to the technical field of microbial oils containing very long-chain polyunsaturated fatty acids and/or derivatives thereof, and methods for producing the same.
  • VLC-PUFA Very long chain polyunsaturated fatty acids
  • DHA and EPA long chain polyunsaturated fatty acids
  • Ultra-long-chain unsaturated fatty acids are very small in terms of the ratio of lipids constituting the body, but they play an important role physiologically and pathologically.
  • ELOVL4 very long chain fatty acid elongase
  • Non-Patent Document 2 Biochimica et Biophysica Acta 1801 (2010) 1145-1154.
  • the elovl4b gene of black sea bream is cloned and expressed in yeast to determine the function of ELOVL4b
  • Non-Patent Document 3 Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 212 (2017) 41-50.
  • the function of ELOVL4a has been determined by cloning the elovl4a gene of African clara and expressing it in yeast (Non-Patent Document 4: Lipids (2017) 52:837-848).
  • ⁇ -3 VLC-PUFA which is a type of very long-chain unsaturated fatty acid VLC-PUFA, has anti-inflammatory effects, protective effects on cells and tissues, and inhibitory effects on age-related cell senescence.
  • Patent Document 1 US2020/0009100.
  • Patent Document 2 As a method for producing ultralong-chain unsaturated fatty acids, a method of extracting from fish oil (Patent Document 2: WO2020/117070), a method of extracting from natural oils such as fish oil, squid oil, algae oil and krill oil (Patent Document 3: Japanese National Publication of International Patent Application No. 2018-514644) and a method of producing VLC-PUFA by chemical synthesis have been reported (Patent Document 4: WO2011/053892). A method of introducing an elongase or a desaturase into cells (Patent Document 5: Japanese National Publication of International Patent Application No. 2012-509059, Non-Patent Document 5: PNAS December 4, 2001 vol. 98 no.
  • Non-Patent Document 3 US2012/0071558
  • Non-Patent Document 1 PNAS (2008) vol. 105, No. 35 , 12843-12848
  • Non-Patent Document 6 Polyunsaturated Fatty Acid Metabolism. 2018, Pages 31-60).
  • An object of the present disclosure is to provide an ultra-long-chain polyunsaturated fatty acid and/or a derivative thereof.
  • Ultra-long-chain polyunsaturated fatty acids and/or their derivatives could be produced by conventional techniques, but their concentrations were low.
  • the concentration of total VLC-PUFAs in the microbial oil is less than 0.8% and the concentration of each VLC-PUFA is 0.5%. was found to be less than
  • the present disclosure provides an ultra-long-chain polyunsaturated fatty acid and/or a derivative thereof at an increased concentration, and further provides a composition containing the ultra-long-chain polyunsaturated fatty acid and/or a derivative thereof. for the purpose.
  • the present inventors have conducted intensive research on cells that produce ultralong-chain unsaturated fatty acids and culture conditions.
  • the present inventors have found that by inducing the expression of the PUFA chain elongase gene, it is possible to produce very long-chain polyunsaturated fatty acids, leading to the present invention.
  • the present invention relates to: [1] a cell expressing a PUFA chain elongase and/or a lysate thereof; A composition comprising a polyunsaturated fatty acid having 30 or more carbon atoms and/or a derivative thereof.
  • the polyunsaturated fatty acid having 30 or more carbon atoms is: (1) a polyunsaturated fatty acid with 30 carbon atoms; (2) polyunsaturated fatty acids with 32 carbon atoms; (3) a 34-carbon polyunsaturated fatty acid; and (4) a 36-carbon polyunsaturated fatty acid;
  • the composition according to item 2 wherein the content of one polyunsaturated fatty acid and/or derivative thereof selected from the group consisting of (1) to (4) is 0.5% by area or more. .
  • the content of polyunsaturated fatty acids and/or derivatives thereof of (1) to (4) is 1.0 area% or more, 1.5 area% or more, 2.0 area% or more, or 2.5
  • the ratio of the content of stearic acid and/or derivatives thereof to the total content of polyunsaturated fatty acids and/or derivatives thereof in (1) to (4) is less than 6.0, less than 5.0, A composition according to any one of items 2 to 4, which is less than 2.5, or less than 2.0.
  • the polyunsaturated fatty acid and/or derivative thereof in the composition satisfies the following conditions: (1) The ratio of the content of stearic acid and/or derivatives thereof to the content of polyunsaturated fatty acids with 30 carbon atoms and/or derivatives thereof is less than 50, less than 30, less than 20, or less than 10.
  • the ratio of the content of stearic acid and/or derivatives thereof to the content of polyunsaturated fatty acids having 32 carbon atoms and/or derivatives thereof is less than 15, less than 10, or less than 5;
  • the ratio of the content of stearic acid and/or derivatives thereof to the content of polyunsaturated fatty acids having 34 carbon atoms and/or derivatives thereof is less than 10, less than 5, or less than 2; and
  • the ratio of the content of stearic acid and/or derivatives thereof to the content of polyunsaturated fatty acids with 36 carbon atoms and/or derivatives thereof is less than 20;
  • At least one fatty acid among constituent fatty acids of cholesterol esters, phospholipids, glycolipids, monoglycerides, diglycerides and triglycerides is polyunsaturated fatty acids (1) to (4), and cholesterol esters, phospholipids and glycolipids , monoglycerides, diglycerides and triglycerides, the fatty acid other than the polyunsaturated fatty acids of (1) to (4) is a fatty acid having 8 to 22 hydrocarbons, any one of items 2 to 9 13.
  • the PUFA chain elongase is: a) a non-mammalian ELOVL4; or b) a protein consisting of an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to the amino acid sequence encoding non-mammalian ELOVL4 and having PUFA chain elongation activity.
  • the content of polyunsaturated fatty acids with 30 or more carbon atoms and/or derivatives thereof is 1.0 area% or more, 1.5 area% or more, 2.0 area% or more, or 2.5 area% or more Crude oil containing [17]
  • the polyunsaturated fatty acid having 30 or more carbon atoms is: (1) a polyunsaturated fatty acid with 30 carbon atoms; (2) polyunsaturated fatty acids with 32 carbon atoms; (3) a 34-carbon polyunsaturated fatty acid; and (4) a 36-carbon polyunsaturated fatty acid; 17.
  • the crude oil according to item 16 comprising at least one polyunsaturated fatty acid selected from the group consisting of [18]
  • the content of polyunsaturated fatty acids and/or derivatives thereof of (1) to (4) is 1.0 area% or more, 1.5 area% or more, 2.0 area% or more, or 2.5 19.
  • the ratio of the content of stearic acid and/or derivatives thereof to the total content of polyunsaturated fatty acids and/or derivatives thereof of (1) to (4) is less than 6.0, less than 5.0, 20.
  • the polyunsaturated fatty acid and/or derivative thereof in the crude oil is under the following conditions: (1) The ratio of the content of stearic acid and/or derivatives thereof to the content of polyunsaturated fatty acids with 30 carbon atoms and/or derivatives thereof is less than 50, less than 30, less than 20, or less than 10.
  • the ratio of the content of stearic acid and/or derivatives thereof to the content of polyunsaturated fatty acids having 32 carbon atoms and/or derivatives thereof is less than 15, less than 10, or less than 5;
  • the ratio of the content of stearic acid and/or derivatives thereof to the content of polyunsaturated fatty acids having 34 carbon atoms and/or derivatives thereof is less than 10, less than 5, or less than 2; and
  • the ratio of the content of stearic acid and/or derivatives thereof to the content of polyunsaturated fatty acids with 36 carbon atoms and/or derivatives thereof is less than 20;
  • At least one fatty acid among the constituent fatty acids of cholesterol ester, phospholipid, glycolipid, monoglyceride, diglyceride and triglyceride is polyunsaturated fatty acid of (1) to (4), and cholesterol ester, phospholipid, glycolipid , monoglyceride, diglyceride and triglyceride constituent fatty acids, fatty acids other than polyunsaturated fatty acids (1) to (4) are fatty acids having 8 to 22 hydrocarbons, any one of items 17 to 24 Crude oil as described above.
  • the PUFA chain elongase gene is: a) a polynucleotide encoding a non-mammalian ELOVL4; or b) a polynucleotide of a nucleotide sequence having at least 90% sequence identity to the nucleotide sequence of a polynucleotide encoding a non-mammalian ELOVL4, wherein said polynucleotide the protein encoded by the nucleotide has PUFA chain elongation activity; 31.
  • the crude oil of item 29 or 30, comprising [32]
  • the content of polyunsaturated fatty acids with 30 or more carbon atoms and/or derivatives thereof is 1.0 area% or more, 1.5 area% or more, 2.0 area% or more, or 2.5 area% or more and a composition having a total content of acylcholesterol, phospholipids, glycolipids, monoglycerides, diglycerides and triglycerides of 70% by weight or more.
  • the polyunsaturated fatty acid having 30 or more carbon atoms is: (1) a polyunsaturated fatty acid with 30 carbon atoms; (2) polyunsaturated fatty acids with 32 carbon atoms; (3) a 34-carbon polyunsaturated fatty acid; and (4) a 36-carbon polyunsaturated fatty acid; 33.
  • the content of the polyunsaturated fatty acids and/or derivatives thereof of (1) to (4) is 1.0 area% or more, 1.5 area% or more, 2.0 area% or more, or 2.5 35.
  • the composition according to item 33 or 34 comprising an area % or more of a polyunsaturated fatty acid having 30 or more carbon atoms and/or a derivative thereof.
  • the ratio of the content of stearic acid and/or derivatives thereof to the total content of polyunsaturated fatty acids and/or derivatives thereof of (1) to (4) is less than 6.0, less than 5.0, 36.
  • the composition of any one of items 33-35 which is less than 2.5, or less than 2.0.
  • the polyunsaturated fatty acid and/or derivative thereof in the composition is under the following conditions: (1) The ratio of the content of stearic acid and/or derivatives thereof to the content of polyunsaturated fatty acids with 30 carbon atoms and/or derivatives thereof is less than 50, less than 30, less than 20, or less than 10.
  • the ratio of the content of stearic acid and/or derivatives thereof to the content of polyunsaturated fatty acids having 32 carbon atoms and/or derivatives thereof is less than 15, less than 10, or less than 5;
  • the ratio of the content of stearic acid and/or derivatives thereof to the content of polyunsaturated fatty acids having 34 carbon atoms and/or derivatives thereof is less than 10, less than 5, or less than 2; and
  • the ratio of the content of stearic acid and/or derivatives thereof to the content of polyunsaturated fatty acids with 36 carbon atoms and/or derivatives thereof is less than 20; 37.
  • composition according to any one of items 33 to 36 satisfying at least one of [38]
  • the composition according to any one of items 33 to 37 comprising an impurity having a chemical formula of C23H36O3.
  • the composition according to any one of Items 32 to 38 wherein the content of cholesterol esters, phospholipids, glycolipids, monoglycerides, diglycerides and triglycerides is 70% by weight or more relative to the total weight of the composition. thing.
  • Any one of items 33 to 39, wherein at least one fatty acid among constituent fatty acids of cholesterol esters, phospholipids, glycolipids, monoglycerides, diglycerides and triglycerides is the polyunsaturated fatty acid of (1) to (4) 13.
  • composition of claim 1 At least one fatty acid among the constituent fatty acids of cholesterol esters, phospholipids, glycolipids, monoglycerides, diglycerides and triglycerides is polyunsaturated fatty acids (1) to (4), and cholesterol esters, phospholipids and glycolipids , monoglyceride, diglyceride and triglyceride constituent fatty acids, fatty acids other than polyunsaturated fatty acids (1) to (4) are fatty acids having 8 to 22 hydrocarbons, any one of items 33 to 40 13.
  • the composition of claim 1. [42] The composition according to any one of items 32 to 41, comprising 0.5 area % or more of PUFA.
  • the content of polyunsaturated fatty acids with 30 or more carbon atoms and/or derivatives thereof is 1.0 area% or more, 1.5 area% or more, 2.0 area% or more, or 2.5 area% or more is a microbial oil.
  • the polyunsaturated fatty acid having 30 or more carbon atoms is: (1) a polyunsaturated fatty acid with 30 carbon atoms; (2) polyunsaturated fatty acids with 32 carbon atoms; (3) a 34-carbon polyunsaturated fatty acid; and (4) a 36-carbon polyunsaturated fatty acid; 45.
  • the microbial oil of claim 44 comprising at least one polyunsaturated fatty acid selected from the group consisting of: [46]
  • the microbial oil according to item 45 wherein the content of one polyunsaturated fatty acid and/or derivative thereof selected from the group consisting of (1) to (4) is 0.5% by area or more. .
  • the polyunsaturated fatty acid and/or derivative content of (1) to (4) is 1.0 area% or more, 1.5 area% or more, 2.0 area% or more, or 2.5 47.
  • the microbial oil according to item 45 or 46 comprising polyunsaturated fatty acids having 30 or more carbon atoms and/or derivatives thereof in an area % or more.
  • the ratio of the content of stearic acid and/or derivatives thereof to the total content of polyunsaturated fatty acids and/or derivatives thereof of (1) to (4) is less than 6.0, 48.
  • the polyunsaturated fatty acid and/or derivative thereof in the microbial oil has the following conditions: (1) The ratio of the content of stearic acid and/or derivatives thereof to the content of polyunsaturated fatty acids with 30 carbon atoms and/or derivatives thereof is less than 50, less than 30, less than 20, or less than 10.
  • the ratio of the content of stearic acid and/or derivatives thereof to the content of polyunsaturated fatty acids having 32 carbon atoms and/or derivatives thereof is less than 15, less than 10, or less than 5;
  • the ratio of the content of stearic acid and/or derivatives thereof to the content of polyunsaturated fatty acids having 34 carbon atoms and/or derivatives thereof is less than 10, less than 5, or less than 2; and
  • the ratio of the content of stearic acid and/or derivatives thereof to the content of polyunsaturated fatty acids with 36 carbon atoms and/or derivatives thereof is less than 20; 49.
  • the microbial oil according to any one of items 44 to 51, wherein the content of cholesterol esters, phospholipids, glycolipids, monoglycerides, diglycerides and triglycerides is 70% by weight or more based on the total weight.
  • At least one fatty acid among the constituent fatty acids of cholesterol esters, phospholipids, glycolipids, monoglycerides, diglycerides and triglycerides is polyunsaturated fatty acids (1) to (4), and cholesterol esters, phospholipids and glycolipids , monoglycerides, diglycerides and triglycerides, the fatty acid other than the polyunsaturated fatty acids of (1) to (4) is a fatty acid having 8 to 22 hydrocarbons, any one of items 45 to 53 Microbial oil according to paragraph.
  • the microbial oil of item 55 wherein said PUFAs comprise externally added non-produced PUFAs.
  • the microbial oil according to item 59, wherein the PUFA chain elongase gene is expressed by an inducible promoter.
  • the PUFA chain elongase gene is a) a polynucleotide encoding a non-mammalian ELOVL4; or b) a polynucleotide of a nucleotide sequence having at least 90% sequence identity to the nucleotide sequence of a polynucleotide encoding a non-mammalian ELOVL4, wherein said polynucleotide 61.
  • the microbial oil of items 59 or 60 comprising a polynucleotide, wherein the protein encoded by the nucleotide has PUFA chain elongation activity.
  • the polyunsaturated fatty acid having 30 or more carbon atoms is: (1) a polyunsaturated fatty acid with 30 carbon atoms; (2) polyunsaturated fatty acids with 32 carbon atoms; (3) a 34-carbon polyunsaturated fatty acid; and (4) a 36-carbon polyunsaturated fatty acid; 70.
  • the polyunsaturated fatty acid and/or derivative content of (1) to (4) is 1.0 area% or more, 1.5 area% or more, 2.0 area% or more, or 2.5 72.
  • the ratio of the content of stearic acid and/or derivatives thereof to the total content of polyunsaturated fatty acids and/or derivatives thereof of (1) to (4) is less than 6.0, less than 5.0; 73.
  • the production method according to any one of items 70 to 72 which is less than 2.5 or less than 2.0.
  • the polyunsaturated fatty acid and/or its derivatives are: (1) The ratio of the content of stearic acid and/or derivatives thereof to the content of polyunsaturated fatty acids having 30 carbon atoms and/or derivatives thereof is less than 50, less than 30, less than 20, or less than 10.
  • the ratio of the content of stearic acid and/or derivatives thereof to the content of polyunsaturated fatty acids having 32 carbon atoms and/or derivatives thereof is less than 15, less than 10, or less than 5;
  • the ratio of the content of stearic acid and/or derivatives thereof to the content of polyunsaturated fatty acids having 34 carbon atoms and/or derivatives thereof is less than 10, less than 5, or less than 2; and
  • the ratio of the content of stearic acid and/or derivatives thereof to the content of polyunsaturated fatty acids with 36 carbon atoms and/or derivatives thereof is less than 20; 74.
  • composition capable of producing an ultra-long-chain polyunsaturated fatty acid and/or a derivative thereof at a high concentration, and containing the ultra-long-chain polyunsaturated fatty acid and/or a derivative thereof.
  • polyunsaturated fatty acids refer to unsaturated fatty acids having a valence of 2 or higher, preferably 3 or higher. The number of double bonds is not limited, but has 2-12.
  • Polyunsaturated fatty acids are n-3 ( ⁇ -3), n-6 ( ⁇ -6), n-7 ( ⁇ -7) or n-9 ( ⁇ -9) unsaturated fatty acids. It can be. From the viewpoint of physiological action, it may be n-3 ( ⁇ -3) or n-6 ( ⁇ -6).
  • polyunsaturated fatty acids with 20 to 29 carbon atoms are referred to as "PUFA” unless otherwise specified, and polyunsaturated fatty acids with 30 or more carbon atoms are referred to as very long chain polyunsaturated fatty acids (VLC- PUFA).
  • the number of carbon atoms in the polyunsaturated fatty acid means the number of carbon atoms in the constituent fatty acids.
  • polyunsaturated fatty acids having 20 to 29 carbon atoms include polyunsaturated fatty acids having 20 to 22 carbon atoms.
  • eicosadienoic acid C20: 2, n-9, EDA
  • dihomo- ⁇ -linolenic acid C20: 3, n-6, DGLA
  • mead acid C20: 3, n-9, MA
  • eicosatetraenoic acid C20: 4, n-3, ETA
  • arachidonic acid C20: 4, n-6, ARA
  • eicosapentaenoic acid C20: 5, n-3, EPA
  • docosatetraenoic acid C22: 4, n-6, ETA
  • docosapentaene acid C22:5,n-3,n-3DPA
  • docosapentaenoic acid C22:5,n-6,n-6DPA
  • docosahexaenoic acid C22:6,n-3,DHA
  • VLC-PUFA Very long chain polyunsaturated fatty acid
  • VLC-PUFA very long chain polyunsaturated fatty acid
  • “very long chain polyunsaturated fatty acid (VLC-PUFA)” refers to polyunsaturated fatty acids with 30 or more carbon atoms. Although the upper limit of the number of carbon atoms is not limited, it is less than 40 or less than 38 from the viewpoint of production by microorganisms.
  • polyunsaturated fatty acids with 31, 33, 35 carbon atoms, etc. can also be produced.
  • polyunsaturated fatty acids with 30 or more carbon atoms are: (1) a polyunsaturated fatty acid with 30 carbon atoms; (2) polyunsaturated fatty acids with 32 carbon atoms; (3) a 34-carbon polyunsaturated fatty acid; and (4) a 36-carbon polyunsaturated fatty acid; At least one polyunsaturated fatty acid selected from the group consisting of As an example, polyunsaturated fatty acids having 30 or more carbon atoms include all polyunsaturated fatty acids (1) to (4).
  • fatty acids refer to free fatty acids, and derivatives thereof include triglycerides, diglycerides, monoglycerides, phospholipids, glycolipids, acylcholesterol, and the like.
  • the crude oil, microbial oil or composition of the present disclosure comprises free fatty acids and derivatives thereof, and the content of monoglycerides, diglycerides, triglycerides, phospholipids, glycolipids and acyl cholesterols is 70% to 80% by weight. or more, or 90% by weight or more. If the content of triglycerides in the crude oil, microbial oil or composition of the present disclosure is 70% by weight or more, the hygroscopicity is not too low and, for example, good fluidity can be obtained.
  • the content of triglycerides in the crude oil, microbial oil or composition is 99% by weight or less.
  • the weight ratio of triglycerides in the microbial oil may be 100% by weight, ie the microbial oil may be substantially free of components other than triglycerides.
  • at least one of the triglyceride-constituting fatty acids is a polyunsaturated fatty acid (1) to (4).
  • At least one of the triglyceride-constituting fatty acids is polyunsaturated fatty acids (1) to (4), and among the triglyceride-constituting fatty acids, (1) to Fatty acids other than polyunsaturated fatty acids of (4) are fatty acids having 8 to 22 hydrocarbons.
  • the PUFA used as a substrate in the crude oil, microbial oil or composition of the present disclosure may be included.
  • the content of PUFA used as a substrate is not particularly limited as long as it exists. Above, 20 area % or more, 25 area % or more.
  • the upper limit of the content of PUFA used as a substrate is not particularly limited, but is, for example, 60 area % or less, 50 area % or less, or 40 area % or less.
  • the phospholipid content is 10 wt% or less, 5 wt% or less, or 1 wt% or less based on the total weight.
  • some phospholipids may be present, such as 0.1-10%, 0.5-7%, or even 1-5% by weight relative to the total weight of the microbial oil. good. Phospholipids are removed during the purification process. Refined oils are therefore substantially free of phospholipids.
  • the content of VLC-PUFA is 1.0 area% or more, 1.5 area% or more, 2.0 area% or more as a constituent fatty acid of the oil , or 2.5 area % or more.
  • Specific host-derived constituent fatty acids contained in the compositions, crude or microbial oils of the present disclosure include palmitic acid (C16:0), stearic acid (C18:0), C16:1 fatty acids, and C18:1 Fatty acids are mentioned.
  • palmitic acid C16:0
  • stearic acid C18:0
  • C16:1 fatty acids C18:1 Fatty acids are mentioned.
  • saturated fatty acids are associated with the risk of cardiovascular disease and increase the melting point of the oil, so it is desirable to reduce the content of palmitic acid and stearic acid in particular.
  • the ratio of the content of stearic acid and / or derivatives thereof to the total content of very long-chain polyunsaturated fatty acids having 30 or more carbon atoms and / or derivatives thereof is , less than 5.0, less than 2.5, or less than 2.0.
  • the compositions, crude oils or microbial oils of the present disclosure may meet the following conditions: (1) The ratio of the content of stearic acid and/or derivatives thereof to the content of polyunsaturated fatty acids with 30 carbon atoms and/or derivatives thereof is less than 50, less than 30, less than 20, or less than 10.
  • the ratio of the content of stearic acid and/or derivatives thereof to the content of polyunsaturated fatty acids having 32 carbon atoms and/or derivatives thereof is less than 15, less than 10, or less than 5;
  • the ratio of the content of stearic acid and/or derivatives thereof to the content of polyunsaturated fatty acids having 34 carbon atoms and/or derivatives thereof is less than 10, less than 5, or less than 2; and
  • the ratio of the content of stearic acid and/or derivatives thereof to the content of polyunsaturated fatty acids with 36 carbon atoms and/or derivatives thereof is less than 20; satisfy at least one of
  • compositions, crude or microbial oils of the present disclosure were subjected to compositional analysis of fatty acids by gas chromatography-mass spectrometry and found to contain impurities having the composition of C23H36O3. Therefore, the compositional impurities of C23H36O3 help identify the microbial oils of the present disclosure.
  • C23H36O3 may be identified by any technique, but is identified by gas chromatography and/or mass spectrometry techniques described in Examples as an example. In this case, the material in the fraction with an APGC retention time of 18.034 minutes can be identified as an impurity, and the material with an estimated [M+H] + of 361.2710 can be identified as an impurity.
  • the ratio of the content of impurities in the composition of C23H36O3 to the total content of very long-chain polyunsaturated fatty acids with 30 or more carbon atoms and/or derivatives thereof is 0 less than 0.17, less than 0.16, less than 0.12, or less than 0.10.
  • the compositions, crude oils or microbial oils of the present disclosure may meet the following conditions: (1) The ratio of the content of impurities in the composition of C23H36O3 to the content of polyunsaturated fatty acids with 30 carbon atoms and/or derivatives thereof is less than 15, less than 5, less than 3, or less than 1.5.
  • the ratio of the content of impurities in the composition of C23H36O3 to the content of polyunsaturated fatty acids with 32 carbon atoms and/or derivatives thereof is less than 0.3;
  • the ratio of the content of impurities in the composition of C23H36O3 to the content of unsaturated fatty acids and/or derivatives thereof satisfies at least one of less than 0.35, less than 0.3, or less than 0.2. .
  • the ratio of the content of the specific host-derived constituent fatty acid to the content of the very long-chain polyunsaturated fatty acid is defined as the content of the specific constituent fatty acid derived from the host ratio/content of VLC-PUFA”.
  • the ratio of the content of the composition of C23H36O3 to the content of the ultra-long-chain polyunsaturated fatty acid is represented by "the content of impurities in the composition of C23H36O3/the content of VLC-PUFA".
  • Fatty acid composition can be determined according to conventional fatty acid analysis.
  • an oil to be measured is esterified using a lower alcohol and a catalyst to obtain a fatty acid lower alcohol ester.
  • the resulting fatty acid lower alcohol ester is then analyzed using gas chromatography.
  • a peak corresponding to each fatty acid is identified in the resulting gas chromatography, and the peak area of each fatty acid can be determined using, for example, the Agilent ChemStation integration algorithm (Revision C.01.03 [37], Agilent Technologies). .
  • “Area %" used in the fatty acid composition in the present disclosure refers to the ratio (percentage) of the peak area of each component to the total peak area in the chromatogram obtained by fatty acid analysis.
  • the content of the components of that peak as determined by an analytical chart obtained by gas chromatography or thin layer chromatography/flame ionization detector (TLC/FID) of an oil having various fatty acids as constituents. is shown.
  • Fatty acid composition was determined by gas chromatography, for example according to the method given in the Examples.
  • Lipid composition was determined by TLC/FID. Detailed conditions are shown in Examples.
  • fatty acid may refer not only to free saturated or unsaturated fatty acids themselves, but also to fatty acids as building blocks contained in alkyl esters, triglycerides, diglycerides, monoglycerides, phospholipids, steryl esters, etc. , can also be called constituent fatty acids.
  • the forms of compounds containing fatty acids may be omitted unless otherwise specified.
  • Examples of the form of the fatty acid-containing compound include a free fatty acid form, a fatty acid alkyl ester form, a glyceryl ester form, a phospholipid form, a steryl ester form, and the like.
  • Compounds containing the same fatty acid may be present in the oil in a single form or as a mixture of two or more forms.
  • composition A "composition” of the present disclosure is a lipid composition containing a very long chain polyunsaturated fatty acid and/or a derivative thereof.
  • the compositions of the present disclosure are characterized by further containing cells and/or lysates thereof that produce very long chain polyunsaturated fatty acids and/or derivatives thereof.
  • the compositions of the present disclosure are characterized by the content of very long chain polyunsaturated fatty acids and/or derivatives thereof and the total content of acyl cholesterol, phospholipids, glycolipids, monoglycerides, diglycerides and triglycerides. Attached. Acylcholesterol, phospholipids, glycolipids, monoglycerides, diglycerides and triglycerides are commonly removed during concentration to increase the concentration of very long chain polyunsaturated fatty acids and/or their derivatives.
  • compositions of the present disclosure contain high concentrations of very long chain polyunsaturated fatty acids and/or derivatives thereof, such as 1.0 area % or more, 1.5 area % or more, 2.0 area % or more, or It contains ultra-long-chain polyunsaturated fatty acids and/or derivatives thereof at a concentration of 2.5 area % or more. Furthermore, the composition of the present disclosure has a total acylcholesterol, phospholipid, glycolipid, monoglyceride, diglyceride and triglyceride content of 70% or more by weight.
  • the cells contained in the composition of the present disclosure are cells in which the PUFA chain elongase gene is expressed. Such cells produce the very long chain polyunsaturated fatty acids and/or derivatives thereof included in the compositions of the present disclosure. Such cells may be animal cells, plant cells, or microorganisms.
  • Crushed material is a product obtained by disrupting cells, and includes arbitrary components such as cell-derived lipids, proteins, sugar chains, and nucleic acids. Therefore, it is also possible to detect the components of the cells from which the very long chain unsaturated fatty acids and/or derivatives thereof contained in the composition are derived. Such components include cell-specific antigens and specific nucleic acids.
  • the introduced PUFA chain elongase gene can be detected by probes, PCR, and the like. Specifically, the presence of the introduced PUFA chain elongase gene can be detected by performing PCR using a predetermined primer set, optionally by performing nested PCR.
  • Microbial oil broadly means all lipids obtained from microorganisms, and as a term that refers to both crude oil and refined oil without distinction in the present disclosure use. Microbial oil is obtained by culturing microorganisms in an appropriate medium and collecting the microbial cells by a method such as solvent extraction. Even if the microbial oil is a refined oil, the microbial oil has been refined only to the extent that some constituents characteristic of the microorganism remain, and can be distinguished from concentrates of specific fats and oils.
  • the microbial oils of the present disclosure are characterized by their content of very long chain polyunsaturated fatty acids (VLC-PUFAs).
  • the microbial oils of the present disclosure are also further characterized by the ratio of the content of specific host-derived constituent fatty acids to the content of VLC-PUFAs contained in the microbial oil.
  • the ratio of the content of specific host-derived constituent fatty acids to the content of VLC-PUFAs By reducing the ratio of the content of specific host-derived constituent fatty acids to the content of VLC-PUFAs, the effect of host-derived fatty acids is reduced, and when VLC-PUFAs are purified from microbial oils, host-derived fatty acids are reduced. The risk of containing impurities can be reduced.
  • the ratio of the content of specific host-derived constituent fatty acids to the content of VLC-PUFA is low, the lipid dose can be reduced when administering VLC-PUFA as an active ingredient.
  • a microbial oil of the present disclosure refers to an oil obtained from any microorganism. Depending on the type of microorganism, it can also be referred to as yeast oil, fungal oil or algae oil. Also, instead of microorganisms, cells can be used to obtain oil, which can also be called cell oil.
  • Crude oil refers to oil that has been pressed or extracted from oil raw materials.
  • crude microbial oil refers to a lipid mixture obtained by simply extracting lipids from microbial cells. Impurities such as phospholipids and cholesterol are removed from crude oil to obtain refined oil. Since crude oil is fat before refining, its fatty acid composition depends on the fatty acid composition in the oil feedstock.
  • the crude oil of the present disclosure has a content of ultra-long-chain polyunsaturated fatty acids and/or derivatives thereof of 1.0 area% or more, 1.5 area% or more, 2.0 area% or more, or 2.5 area% % or more.
  • “Refined oil” includes degumming process, deacidification process, decolorization process, deodorization process, etc. in combination with some or all of them, and removes substances other than the target such as phospholipids and sterols. It means the oil obtained after the refining process. Purification steps increase the proportion of triglycerides.
  • oil is generally defined as a liquid among water-immiscible combustible substances that phase separate from water.
  • ⁇ fat'' is defined as a solid flammable substance that does not mix with water and phase-separates, and both are collectively called ⁇ oil and fat''.
  • Lipid is generally defined as a substance of biological origin that is insoluble in water. Conventionally, animal fats and oils are called “fat”, and vegetable fats and oils derived from fish are called “oils”. Even solids exist. Thus, in this disclosure, the term “oil” does not necessarily imply liquid, and may be used interchangeably with “fat” or "lipid” for convenience.
  • oil and fat narrowly mean triglycerides, but in the present disclosure, along with triglycerides, they include other lipid components such as diglycerides, monoglycerides, phospholipids, glycolipids, cholesterol, and free fatty acids.
  • Microorganisms include eubacteria, archaea, eukaryotes, and the like.
  • Eukaryotes include algae, protists, fungi, slime molds, and the like.
  • ascomycetes such as yeast and filamentous fungi such as molds can be used.
  • Yeast is used as an example of the present disclosure.
  • cells can be used instead of microorganisms.
  • Mammalian cells, plant cells, insect cells and the like can be used as cells that produce VLC-PUFA. From the viewpoint of producing VLC-PUFA, microorganisms or cells transfected with a PUFA chain elongase gene are used.
  • Chain elongase refers to an enzyme that has the activity of extending the chain length of fatty acids.
  • Various enzymes are known as chain elongases, and one example is an enzyme belonging to the ELOVL family. From the viewpoint of producing VLC-PUFA, it is preferable to use a PUFA chain elongase having PUFA chain elongation activity using PUFA as a substrate.
  • ELOVL4 with PUFA as a substrate can be used as a PUFA chain elongase.
  • ELOVL4 which uses such PUFAs as substrates, may also include enzymes that cannot produce VLC-PUFAs of C30 or higher.
  • a chain elongase capable of producing VLC-PUFA of C30 or higher such as ELOVL4 capable of producing VLC-PUFA of C30 or higher, is preferable.
  • Fish ELOVL4 includes ELOVL4a and ELOVL4b, and any of them may be used.
  • Any enzyme may be used as such an enzyme, but an example is: a) a specific ELOVL4; or b) at least 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% of the amino acid sequence encoding a specific ELOVL4. , or a protein consisting of amino acid sequences with 99% sequence identity, containing a consensus sequence for chain elongases, and having PUFA chain elongating activity can be used.
  • Consensus sequences of chain elongases include histidine cluster motifs (amino acid sequence: HXXHH, where X represents any amino acid) and/or dilysine motifs (amino acid sequence: XKXKXX or KKXX, where X represents any amino acid). (Mol Vis. 2003 Jul 3; 9: 301-307.).
  • the PUFA chain elongase gene is operably linked downstream of the expression promoter and introduced into the host.
  • Such an expression promoter may be any expression promoter that is expressed in the host.
  • the expression promoter may be either an inducible expression promoter or a constitutive expression promoter.
  • An inducible expression promoter is used from the viewpoint of promoting the expression of PUFA chain elongase at a predetermined timing. Any inducible expression promoter can be used as the inducible expression promoter, and as an example, a galactose-inducible promoter can be used.
  • Examples of PUFA chain elongase genes include the following: a) a specific ELOVL4-encoding polynucleotide; or b) at least 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% of the specific ELOVL4-encoding polynucleotide, A polynucleotide having a base sequence with 97%, 98% or 99% sequence identity, wherein the protein encoded by the polynucleotide has PUFA chain elongation activity can be used. By introducing these polynucleotides, VLC-PUFA of C30 or higher can be produced.
  • a particular ELOVL4 may be ELOVL4 from any species.
  • Non-mammalian ELOVL4 is used from the viewpoint of increasing the amount of VLC-PUFA produced.
  • ELOVL4 of birds, fish, reptiles and amphibians is used, especially fish ELOVL4 is used.
  • Fish ELOVL4 includes ELOVL4a and ELOVL4b, and any of them may be used.
  • black sea bream ELOVL4b or African clara ELOVL4a can be used.
  • Black sea bream ELOVL4b has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO:11.
  • a polynucleotide encoding such an amino acid sequence includes SEQ ID NO:12. African Clara ELOVL4a has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:13.
  • a polynucleotide encoding such an amino acid sequence includes SEQ ID NO:14.
  • VLC-PUFA and/or Derivatives Thereof (6-1) Production Step VLC-PUFA and/or derivatives thereof can be produced by the production method of the present disclosure.
  • the manufacturing method of the present disclosure is as follows: introducing a PUFA chain elongase expression system into cells; The method is characterized by comprising the steps of: regulating the transfected cells to a state of high VLC-PUFA content; and inducing the expression of PUFA chain elongase in the conditioned cells.
  • VLC-PUFAs and/or derivatives thereof are produced by such production methods and accumulate in the culture.
  • a culture having a high VLC-PUFA and/or derivative thereof content can be obtained by performing the production method steps described above.
  • “Culture” means everything obtained by culturing, including cell oil, cell body and medium.
  • a “culture containing cell bodies” particularly means a culture in which “cells” are cultured, before the cells are separated from the medium.
  • Cells containing cell oil can be obtained from the culture.
  • Cells may include both live and dead cells. Dried cells are also included.
  • the expression cells refers to the substantially water-free cell dry matter, as well as the dry matter containing residual medium components, filter aids, and the like.
  • the phrase "substantially free of water” means a water content below which cell survival may be difficult. This amount is generally no greater than 15%, or no greater than 10%, by weight of water.
  • cell oils and/or cells comprising VLC-PUFAs are provided.
  • cell oils and/or cell bodies containing 1.0 area% or more polyunsaturated fatty acids having 30 or more carbon atoms and/or derivatives thereof unknown.
  • the use of cell oils of the present disclosure and cell bodies of the present disclosure can efficiently provide oils containing VLC-PUFAs at higher concentrations than conventional oils.
  • the step of introducing a PUFA chain elongase expression system into cells can be carried out by introducing a vector containing a PUFA chain elongase gene operably linked downstream of an expression promoter into cells according to a standard method. .
  • the type of vector and introduction method can be appropriately selected according to the host cell.
  • a PUFA chain elongase expression system may be introduced by genome editing. Genome editing may be performed so that a chain elongase capable of producing VLC-PUFA of C30 or higher is expressed by modifying a gene encoding an existing PUFA chain elongase, or a new VLC-PUFA may be integrated into the genome.
  • the step of adjusting the introduced cells to a state of high VLC-PUFA content includes the step of culturing the introduced cells, and by inducing the expression of the PUFA chain elongase gene, the VLC-PUFA content is high.
  • a step of adjusting the turbidity and/or adding a substrate may be further included.
  • Culture of the transfected cells can be aeration-stirring culture, shaking culture, or stationary culture, which can be appropriately selected according to the cells to be cultured. When yeast is used as an example, culture is usually carried out for 1 to 7 days in the aeration and agitation culture. As for the aeration rate in the aeration-stirring culture, the aeration rate normally used may be applied as it is. Any medium known in the technical field can be used for the medium used in the culture, depending on the cells to be used.
  • any of the commonly used carbon sources can be used, including glucose, fructose, xylose, saccharose, maltose, soluble starch, molasses, glycerol, mannitol, etc., although the carbon source may be any of these. It is not limited.
  • nitrogen sources natural nitrogen sources such as peptone, yeast extract, malt extract, meat extract, casamino acids and corn steep liquor, organic nitrogen sources such as urea, and inorganic nitrogen sources such as sodium nitrate, ammonium nitrate and ammonium sulfate are used. be able to.
  • inorganic salts such as phosphates, magnesium sulfate, iron sulfate and copper sulfate, vitamins, and the like can also be used as trace nutrients as needed.
  • the aqueous medium that can be used as the base material of the liquid medium is basically water, and distilled water or purified water can be used.
  • a substrate for VLC-PUFA can be added to the medium to promote the productivity of VLC-PUFA.
  • PUFAs can be added as substrates for VLC-PUFAs.
  • the PUFA added as a substrate for VLC-PUFA can be appropriately selected according to the desired VLC-PUFA. Examples of such PUFAs include eicosapentaenoic acid (C20:5, n-3), docosapentaenoic acid (C22:5, n-3), docosahexaenoic acid (C20:6, n-3), arachidonic acid (C20: 4,n-6), docosapentaenoic acid (C22:5,n-6), and the like, but are not limited thereto.
  • PUFA can be added to the medium at a concentration of 0.01 to 5%, for example. 3% and 1% may be used as the upper limit of the PUFA concentration from the viewpoint of not reducing the growth of microorganisms. From the viewpoint of increasing the production of VLC-PUFA, 0.05% and 0.1% can be used as the lower limit of the PUFA concentration.
  • the PUFA may be contained in the medium from the beginning, or may be added at the timing when the expression-inducing treatment of the PUFA chain elongase gene is performed.
  • Hosts capable of producing PUFAs are limited. For example, in yeast, PUFAs cannot be produced without artificial manipulations such as the introduction of foreign genes and genome editing. Such hosts can be referred to as non-PUFA-producing hosts. When non-PUFA-producing hosts are used, all PUFAs contained in the culture are derived from the added substrate.
  • incubator used in the production process, and any incubator that is normally used for culturing microorganisms can be used.
  • An incubator can be appropriately selected according to the scale of culture.
  • the step of inducing the expression of the PUFA chain elongase in the conditioned cells includes performing an induction treatment at a predetermined timing according to the expression system of the PUFA chain elongase.
  • PUFA chain elongase is expressed by adding galactose or its analogues to the medium.
  • the induction treatment is carried out during the stationary phase of the culture or during the period when cell growth is stagnant due to stress. Stationary phase is brought about by depletion of carbon sources such as sugars, and can be said to be a stress state of nutrient starvation. In addition to nutrient starvation stress, temperature condition stress, light condition stress, etc.
  • Temperature condition stress includes low temperature stress or high temperature stress (heat shock).
  • Light condition stress includes UV irradiation and lack of light of a specific wavelength.
  • An example of the stationary phase is when the turbidity reaches 1.5 to 11 after culturing microorganisms. Turbidity can be measured using a spectrophotometer, and a double beam spectrophotometer (U2910, manufactured by HITACHI) was used in this example. When the turbidity reaches 1.5 to 11, the elovl4 gene is induced to increase the content of VLC-PUFA produced.
  • the reasons for the production of high concentrations of VLC-PUFAs during periods of stress-induced cell growth stagnation include the following: (1) A state in which fatty acids serving as substrates for VLC-PUFA are increased, that is, a state in which C16 and C18, which are required in large amounts during cell growth, can be supplied in large amounts due to stagnant cell growth, (2) A state in which the activity, stability, or localization of PUFA chain elongases, or a combination thereof, contributes to higher VLC-PUFA production with stationary phase or stagnation of cell growth in culture. and/or (3) the degradation of VLC-PUFA itself is in a state where it decreases with stationary phase or stagnation of cell growth in culture.
  • the separation step includes separating cultured cells from the medium used for culture (hereinafter referred to as a cell separation step), and collecting cell oil containing VLC-PUFA from the cultured cells (hereinafter, cell oil collection step ), i.e. obtaining a crude oil.
  • cell oil containing VLC-PUFA is collected from the cells using a separation method and an extraction method according to the culture form.
  • cell bodies When a liquid medium is used, cell bodies can be separated from the medium after the culture is completed by conventional solid-liquid separation means such as centrifugation and/or filtration. Cell bodies are thoroughly washed with water and then optionally dried. Drying can be performed by freeze-drying, air-drying, heat-drying, or the like.
  • solid medium and cell bodies When cultured in a solid medium, the solid medium and cell bodies can be crushed with a homogenizer or the like without separating the cell bodies and the medium, and the resulting crushed product can be directly subjected to the cell oil collection step.
  • the cell oil collection step can include extracting the dried cells obtained in the cell separation step by using an organic solvent under a nitrogen stream.
  • Organic solvents that can be used include ether, hexane, methanol, ethanol, chloroform, dichloromethane, petroleum ether, and the like. Alternatively, good results can be obtained by alternating extractions with methanol and petroleum ether or extraction with a one-phase solvent of chloroform-methanol-water. Evaporation of the organic solvent from the extract under reduced pressure yields a cell oil containing VLC-PUFAs.
  • Hexane is most commonly used when harvesting triglycerides.
  • wet cells can be used for extraction.
  • a water-miscible solvent such as methanol, ethanol, etc., or a water-miscible mixed solvent containing this solvent with water and/or other solvents is used. Other procedures are the same as above.
  • the crude oil of the collected cell oil can be refined by the method used for refining vegetable oil, fish oil, etc.
  • Degumming, deacidification, decolorization and deodorization are exemplified as the processes for refining fats and oils that are usually performed. Such processing may be performed by any method. Degumming refers to water washing. Distillation is exemplified as the deacidification treatment. Examples of the decolorization treatment include treatment with activated clay, activated carbon, silica gel, and the like. Steam distillation etc. are illustrated as deodorization.
  • Cellular oils, microbial oils, crude oils, or compositions containing VLC-PUFA can be used, for example, in foods, supplements, pharmaceuticals, cosmetics, animal feeds, and the like.
  • the present disclosure relates to pharmaceutical compositions, cosmetic compositions, foods, supplements, or animal feeds comprising cell oils, microbial oils, crude oils, or compositions according to the disclosure.
  • Another aspect also relates to a cell oil, microbial oil, crude oil or composition for use as a medicament.
  • Use of the present disclosure as a pharmaceutical, cosmetic, food, supplement, or animal feed can be used for the prevention, treatment, or amelioration of cellular senescence or Stargardt's disease.
  • Yet another aspect relates to a method of treating or preventing cellular senescence or Stargardt's disease comprising administering to a subject a cellular oil, microbial oil, crude oil, or composition of the present disclosure.
  • the method comprises administering a cellular oil, microbial oil, crude oil, or composition of the present disclosure to a subject suffering from or at risk of suffering from cellular senescence or Stargardt's disease.
  • the cell oil, microbial oil, crude oil, or composition of the present disclosure may be administered with any other therapeutic agent (eg, corticosteroids, etc.) used in the pharmaceutical applications described above.
  • any other therapeutic agent eg, corticosteroids, etc.
  • the term "process” includes not only an independent process but also a process that cannot be clearly distinguished from other processes as long as the intended purpose of the process is achieved.
  • a numerical range indicated using “-” shall indicate a range including the numerical values described before and after it as the minimum and maximum values, respectively.
  • the content of each component in the mixture means the total content of the multiple substances present in the mixture when there are multiple substances corresponding to each component in the mixture, unless otherwise specified. do.
  • the terms “less than” or “less than” with respect to percentages include 0%, i.e., “does not contain,” unless a lower limit is specified, or a range that includes values that are undetectable by current means. is meant to contain
  • Example 1 Production of mouse-derived ELOVL4 gene-expressing strain Mouse (Mus muscules)-derived ELOVL4 gene (ACCESSION No. AF277093) with codons optimized for expression in budding yeast (hereinafter referred to as MmELOVL4) was artificially synthesized. . Using the synthesized DNA fragment as a template, the primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 shown in Table 3 was used to amplify the MmELOVL4 gene fragment.
  • the amplified fragment was fused with pYES2 NT/A vector (Thermo Fisher SCIENTIFIC) cleaved with restriction enzymes HindIII and KpnI using In-Fusion HD Cloning Kit (TAKARA Clontech) to construct a plasmid for expressing the MmELOV4 gene. .
  • This expression plasmid consists of an insert sequence in which the Gal1 promoter sequence, MmELOVL4 gene, and CYC1 terminator sequence are linked in that order, and the pYES2NT/A vector sequence containing the ura3 gene.
  • the prepared MmELOVL4 expression plasmid was transferred to budding yeast S. cerevisiae by the lithium acetate method.
  • cerevisiae strain INVSc1 Thermo Fisher SCIENTIFIC
  • genetic recombinants were obtained using uracil auxotrophy as an index.
  • S. cerevisiae into which the pYES2 NT/A vector was introduced was also used.
  • Cerevisiae strain INVSc1 was also obtained.
  • the S. cerevisiae INVSc1 strain was cultured in 5 ml of YPD medium (Polypepton 20 g/L, Yeast extract 10 g/L, Glucose 20 g/L) at 28° C., 180 rpm for 16 hours.
  • YPD medium Polypepton 20 g/L, Yeast extract 10 g/L, Glucose 20 g/L
  • 0.5 ml of the culture solution was aseptically collected in a 1.5 ml centrifuge tube, centrifuged at 3000 xg for 3 minutes, and the supernatant was discarded.
  • SD-ura agar medium Minimal SD Agar Base (Takara Clontech) 46.7 g / L, -Ura DO Supplement (Takara Clontech) 0.77 g / L, purified agar powder (Nacalai Tesque) 15 g / L, pH 5 (adjusted to .8)) and cultured statically at 28° C. for 2 to 3 days.
  • Those that formed colonies on the SD-ura agar medium were obtained as gene recombinant candidate strains, and the presence or absence of insertion of each gene was determined based on the presence or absence of target gene amplification by PCR.
  • Example 2 Preparation of ELOVL4b Gene-Expressing Strain Derived from Black Sea Bream
  • An ELOVL4b gene (ACCESSION No. KU372150) derived from black sea bream (Acanthopagrus schlegelii) whose codons were optimized for expression in budding yeast (hereinafter referred to as AsELOVL4b) was artificially synthesized. .
  • the AsELOVL4b gene fragment was amplified using the primer pair of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 shown in Table 3.
  • the amplified fragment was fused with pYES2 NT/A vector (Thermo Fisher SCIENTIFIC) cleaved with restriction enzymes HindIII and KpnI using In-Fusion HD Cloning Kit (TAKARA Clontech) to construct an AsELOV4b gene expression plasmid.
  • This expression plasmid consists of an insert sequence in which the Gal1 promoter sequence, the AsELOVL4b gene and the CYC1 terminator sequence are linked in this order, and the pYES2 NT/A vector sequence containing the ura3 gene.
  • the prepared AsELOVL4b expression plasmid was transformed into budding yeast S. cerevisiae by the lithium acetate method described in Example 1. cerevisiae INVSc1 strain (Thermo Fisher SCIENTIFIC), and genetic recombinants were obtained using uracil auxotrophy as an index.
  • Example 3 Preparation of Constitutively Expressing AsELOVL4b Gene Expression Strain
  • a phosphoglycerate kinase 1 promoter (hereinafter referred to as PGK1 promoter) was artificially synthesized.
  • a PGK1 promoter fragment was amplified using the synthesized DNA fragment as a template and the primer pair of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 shown in Table 3.
  • the AsELOVL4b expression plasmid prepared in Example 2 as a template, the AsELOVL4b expression vector sequence other than the Gal1 promoter sequence was amplified using the primer pair of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 shown in Table 3.
  • each amplified fragment was fused using In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by TAKARA Clontech) to construct a plasmid for constitutively expressing AsELOVL4b gene.
  • This expression plasmid consists of an insert sequence in which the PGK1 promoter sequence, the AsELOVL4b gene, and the CYC1 terminator sequence are linked in that order, and the pYES2NT/A vector sequence containing the ura3 gene.
  • the constructed constitutively-expressing AsELOVL4b expression plasmid was transferred to budding yeast S. cerevisiae by the lithium acetate method described in Example 1. It was introduced into the cerevisiae INVSc1 strain (manufactured by Thermo Fisher Scientific), and genetic recombinants were obtained using uracil auxotrophy as an indicator.
  • Example 4 Production of VLC-PUFA by MmELOVL4 and AsELOVL4b Gene Expression Strains 5 ml each of the MmELOVL4 gene expression strain, the AsELOVL4b gene expression strain, and the pYES NT/A vector-introduced strain prepared by the methods described in Examples 1 and 2.
  • SD-ura liquid medium Minimal SD Agar Base (manufactured by Takara Clontech) 46.7 g / L, -Ura DO Supplement (manufactured by Takara Clontech) 0.77 g / L, adjusted to pH 5.8)
  • each culture solution was inoculated into 5 ml of uracil-restricted raffinose liquid medium (Minimal SD Base/Raf (manufactured by Takara Clontech) 37 g/L, -Ura DO Supplement 0.77 g/L, adjusted to pH 5.8)). and cultured until the turbidity of the culture solution reached 1.0. Thereafter, a 40% galactose solution was added in an amount 1/20 times the volume of the culture medium, and EPA was further added in an amount 1/1000 times the volume (5 ⁇ l) of the medium.
  • uracil-restricted raffinose liquid medium Minimal SD Base/Raf (manufactured by Takara Clontech) 37 g/L, -Ura DO Supplement 0.77 g/L, adjusted to pH 5.8
  • a 40% galactose solution was added in an amount 1/20 times the volume of the culture medium, and EPA was further added in an amount 1/1000 times the
  • the cells were cultured for 2 to 5 days, and the entire culture was aseptically collected in a 15 ml centrifuge tube and centrifuged at 3000 xg for 3 minutes to collect the cells. Then, after freezing at -80°C, it was subjected to a freeze dryer (TAITEC, VA-140S) to obtain freeze-dried cells. A portion of the obtained freeze-dried cells was used as a sample for fatty acid composition measurement.
  • TITEC freeze dryer
  • Total lipids ie, microbial oils A, B, and C were obtained from the obtained freeze-dried cells of the MmEV4 gene-expressing strain, the AsEV4b gene-expressing strain, and the pYES NT/A-introduced strain, as follows.
  • the obtained microbial oils A to C were converted to fatty acid methyl esters and subjected to fatty acid analysis.
  • Total lipids were extracted from lyophilized cells with chloroform:methanol (2:1, v/v) according to the method of Folch et al. (J. Biological and Chemistry. 226:497-509 (1957)). The obtained total lipid was methyl-esterified to obtain a fatty acid methyl ester (FAME). FAME analysis was performed on the obtained FAME by gas chromatography. The gas chromatograph conditions were set as follows.
  • ⁇ Gas chromatography separation conditions > ⁇ Apparatus Agilent 7890B (Agilent Technologies, Inc.) ⁇ Column DB-17ht 0.250 mm ⁇ 30 m, film thickness 0.15 ⁇ m (Agilent Technologies, Inc.) ⁇ Carrier gas conditions: constant flow, helium 1.0 ml/min, separation ratio 10:1 ⁇ Column temperature conditions: 180°C for 5 minutes, temperature rise to 300°C at 4°C/min, 300°C for 10 minutes ⁇ Inlet temperature: 300°C ⁇ Injection volume 1 ⁇ L
  • Detection APCI source ((Atmospheric Pressure Gas Chromatography: APGC) (Waters Corporation) ⁇ Mass spectrometer A Quadrupole, A Collision Cell, Time of Flight Analyzer (Xevo G2-XS QTof) (Waters Corporation) ⁇ Ion source API, Positive mode, Sensitive mode ⁇ Data acquisition mode MS E ⁇ Ionization process wet (ethanol) ⁇ Collision energy: low energy 6 eV, high energy 20-50 eV m/z 50-650 ⁇ Corona voltage 3.0 ⁇ A ⁇ Source temperature 150°C ⁇ Cone voltage 10V ⁇ Gas flow rate 100L/hr ⁇ Auxiliary gas flow rate 100L/hr ⁇ Analysis software MassLynx
  • a compound with an APGC retention time of 18.034 minutes could not be estimated, and such a compound was designated as Impurity X. Impurity information is provided below. ⁇ APGC retention time 18.034 minutes ⁇ Estimated chemical formula C 23 H 36 O 3 ⁇ Measurement m/z [M+H] + 361.2710
  • fatty acid compositions of microbial oils A-C are listed in Table 5.
  • EPA-derived VLC-PUFAs C30:5, C32:5, C34:5 and C36:5 could not be detected from the microbial oil A obtained from the MmELOVL4-expressing strain.
  • C32:5 and C34:5, which are chain extension products of EPA could be detected from the microbial oil B obtained from the AsELOVL4b-expressing strain.
  • Microbial oil B contained 0.32 area % and 0.46 area % of C32:5 and C34:5, respectively, based on total fatty acids.
  • Example 5 Production of VLC-PUFA by Constitutively Expressing AsELOVL4b Gene Expression Strain From the constitutive AsELOVL4b gene expression strain prepared by the method described in Example 3, microbial oil D was obtained by the method described in Example 4, and fatty acid analysis. served to For comparison, the microbial oil B obtained in Example 4 (inducible promoter (Gal1promoter) type AsELOVL4b gene expression strain) was used. The fatty acid compositions of microbial oils B and D are listed in Table 6. EPA-derived VLC-PUFAs C32:5 and C34:5 could be detected from the microbial oil D obtained from the constitutively expressing AsELOVL4b-expressing strain.
  • Microbial oil D contained 0.32 area % and 0.28 area % of C32:5 and C34:5, respectively, relative to the total area value of all fatty acids.
  • the ratio of total EPA-derived VLC-PUFA (sum of C32:5 and C34:5) to impurity X (impurity X/VLC-PUFA) was 0.17. From the above results, when a constitutive expression type promoter was used, the ratio of VLC-PUFA contained in the microbial oil obtained did not increase, but the ratio of host-derived fatty acids increased.
  • Example 6 Investigation of expression induction timing and production of VLC-PUFA by AsELOVL4b gene expression strain
  • the AsELOVL4b gene expression strain prepared by the method described in Example 2 was placed in 5 ml of SD-ura liquid medium at 28°C, 180 rpm for 16 hours. cultured. 0.1 ml of the culture solution was inoculated into 5 ml of uracil-limited raffinose medium (Minimal SD Base/Raf (manufactured by Takara Clontech) 37 g/L, -Ura DO Supplement 0.77 g/L, adjusted to pH 5.8), Culture was continued until the turbidity of the culture solution reached 1.0, 2.3, 4.8, 9.6 and 11.2, respectively.
  • uracil-limited raffinose medium Minimal SD Base/Raf (manufactured by Takara Clontech) 37 g/L, -Ura DO Supplement 0.77 g/L, adjusted to pH 5.8
  • a 40% galactose solution was added in an amount 1/20 times the volume of the culture medium, and EPA was further added in an amount 1/1000 times the volume (5 ⁇ l) of the medium.
  • the cells were cultured for 2 to 5 days, and the entire culture was aseptically collected in a 15 ml centrifuge tube and centrifuged at 3000 xg for 3 minutes to collect the cells. Thereafter, after freezing at ⁇ 80° C., it was subjected to a freeze dryer to obtain freeze-dried cells.
  • Microbial oils EI were obtained and subjected to fatty acid analysis.
  • the fatty acid compositions of microbial oils E to I are listed in Table 7.
  • EPA-derived VLC-PUFAs C30:5, C32:5, and C34:5 could be detected in microbial oils EH.
  • EPA-derived VLC-PUFAs C32:5 and C34:5 could be detected.
  • microbial oils F, G, and H the ratios of C30:5, C32:5, and C34:5 to the total area value of all fatty acids were higher than in microbial oils E and I.
  • the ratio of the total EPA-derived VLC-PUFA (the sum of C30:5, C32:5, and C34:5) to stearic acid, a fatty acid derived from the host budding yeast (stearic acid VLC-PUFA) It was lower than the microbial oils E and I, and could be reduced to less than 6. Furthermore, the ratio of total EPA-derived VLC-PUFA (sum of C32:5 and C34:5) to impurity X (impurity X/VLC-PUFA) was less than 0.16.
  • Example 7 Examination of PUFA to be added
  • the AsELOVL4b gene expression strain prepared by the method described in Example 2 was cultured by the method described in Example 6, replacing the PUFA to be added with arachidonic acid (ARA).
  • Microbial Oil J was obtained from lyophilized cells of the CgELOVL4-expressing strain with a culture turbidity of 4.8 in uracil-limited raffinose medium and subjected to fatty acid analysis.
  • the fatty acid composition of Microbial Oil J is listed in Table 8.
  • ARA-derived VLC-PUFAs C30:4, C32:4, and C34:4 could be detected from the microbial oil J obtained from the AsELOVL4b-expressing strain.
  • Microbial oil J contained 0.58 area %, 0.86 area %, and 0.15 area % of C30:4, C32:4, and C34:4, respectively, relative to the total area value of all fatty acids.
  • the ratio of total VLC-PUFAs from ARA sum of C32:5 and C34:5) to impurity X2 (impurity X2 VLC-PUFA) was less than 0.16. As a result, it was confirmed that it is possible to produce VLC-PUFA using PUFA other than EPA as a substrate.
  • Example 8 Production of VLC-PUFA by CgELOVL4a Gene Expression Strain ELOVL4a gene (ACCESSION No. KY801284) derived from African Clara (Clarias gariepinus) codon-optimized for expression in budding yeast (hereinafter referred to as CgELOVL4a) was artificially synthesized. Using the synthesized DNA fragment as a template, the CgELOVL4a gene fragment was amplified using the primer pair of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 shown in Table 3.
  • the amplified fragment was fused with pYES2 NT/A vector (Thermo Fisher SCIENTIFIC) cleaved with restriction enzymes HindIII and KpnI using In-Fusion HD Cloning Kit (TAKARA Clontech) to construct a CgELOV4 gene expression plasmid.
  • This expression plasmid consists of an insert sequence in which the Gal1 promoter sequence, the CgELOVL4a gene and the CYC1 terminator sequence are linked in this order, and the pYES2 NT/A vector sequence containing the ura3 gene.
  • the constructed CgELOVL4a expression plasmid was cloned into budding yeast S. cerevisiae by the lithium acetate method described in Example 1.
  • Thermo Fisher SCIENTIFIC Bactet al.
  • the obtained CgELOVL4a gene-expressing strain is cultured by the method described in Example 6, and the microbial oil K is obtained from the freeze-dried cells of the CgELOVL4a-expressing strain whose culture in the uracil-limited raffinose medium has a turbidity of 4.8, Subjected to fatty acid analysis.
  • the fatty acid composition of Microbial Oil K is listed in Table 9.
  • EPA-derived VLC-PUFAs C32:5, C34:5, and C36:5 could be detected from the microbial oil K obtained from the CgELOVL4a-expressing strain.
  • Microbial oil K contained 0.16 area %, 0.79 area %, and 0.59 area % of C32:5, C34:5, and C36:5, respectively, based on the total area value of all fatty acids.
  • the ratio of total EPA-derived VLC-PUFA (sum of C32:5, C34:5 and C36:5) to stearic acid, a fatty acid derived from the host budding yeast (stearic acid VLC-PUFA), was 4. .8.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Fats And Perfumes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

超長鎖多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体を提供することを目的とする。超長鎖多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体については、従来技術でも物質生産することが可能ではあったが、その濃度は低かった。超長鎖多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体について物質生産が可能ではあったが、十分な濃度で得られず、組成物として利用するには至っていなかった。本発明は、濃度を高めて超長鎖多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体を提供する。さらには超長鎖多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体を含む組成物として提供することを目的とする。

Description

超長鎖多価不飽和脂肪酸組成物
　本発明は、超長鎖多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体を含む微生物油、及びその製造方法の技術分野に関する。
　超長鎖多価不飽和脂肪酸（ｖｅｒｙ　ｌｏｎｇ　ｃｈａｉｎ　ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄｓ：　ＶＬＣ－ＰＵＦＡ）は、ＤＨＡやＥＰＡ等の長鎖多価不飽和脂肪酸よりもさらに長い炭素数を有する多価不飽和脂肪酸である。超長鎖不飽和脂肪酸の定義は明確に定まっていないが、Ｃ２６以上、Ｃ２８以上、又はＣ３０以上の長鎖不飽和脂肪酸として定義されることもある。超長鎖不飽和脂肪酸は生体構成脂質の割合からすると、微量ではあるが、生理・病理的に重要な役割を担っている。遺伝性の黄斑変性症であるシュタルガルト病についての研究や、ノックアウトマウスの解析から、超長鎖不飽和脂肪酸が、網膜光受容体の機能や皮膚バリア－形成に関与すること明らかにされた。また、Ｃ２８～Ｃ３８の超長鎖不飽和脂肪酸は、超長鎖脂肪酸延長酵素（ＥＬＯＶＬ４）により合成されると報告されている（非特許文献１：PNAS (2008) vol. 105, No.35, 12843-12848）。哺乳動物ではＥＬＯＶＬ４は、網膜で多く発現し、脳、皮膚、精巣でも発現がみられる。また、ＶＬＣ－ＰＵＦＡの伸長に関わるＥＬＯＶＬ４について、ゼブラフィッシュの胚形成における発現解析が報告されている（非特許文献２：Biochimica et Biophysica Acta 1801 (2010) 1145-1154）。クロダイのｅｌｏｖｌ４ｂ遺伝子をクローニングし、酵母に発現させて、ＥＬＯＶＬ４ｂの機能決定が行われている（非特許文献３：Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 212 (2017) 41-50）。アフリカンクララのｅｌｏｖｌ４ａ遺伝子をクローニングし、酵母に発現させてＥＬＯＶＬ４ａの機能決定が行われている（非特許文献４：Lipids (2017) 52:837-848）。
　超長鎖不飽和脂肪酸ＶＬＣ－ＰＵＦＡの一種であるω－３ＶＬＣ－ＰＵＦＡが、抗炎症作用を有し、また細胞や組織の保護効果、加齢性の細胞老化の抑制効果を有することが示されている（特許文献１：ＵＳ２０２０／０００９１００）。
　超長鎖不飽和脂肪酸を製造する方法として、魚油から抽出する方法（特許文献２：ＷＯ２０２０／１１７０７０）、魚油、イカ油、藻類油およびオキアミ油等の天然油から抽出する方法（特許文献３：特表２０１８－５１４６４４号公報）、ＶＬＣ－ＰＵＦＡを化学合成で製造する方法が報告されている（特許文献４：ＷＯ２０１１／０５３８９２）。エロンガーゼやデサチュラーゼを細胞に導入した方法（特許文献５：特表２０１２－５０９０５９号公報、非特許文献５：PNAS December 4, 2001 vol. 98 no. 25;14304 -14309）が報告されている。また、哺乳動物細胞にＥＬＯＶＬ４遺伝子を導入した方法（特許文献３：ＵＳ２０１２／００７１５５８）、培養細胞にラット・マウスＥＬＯＶＬ４を導入した方法（非特許文献１：PNAS (2008) vol. 105, No.35, 12843-12848）、酵母にＥＬＯＶＬ４を導入した方法（非特許文献６：Polyunsaturated Fatty Acid Metabolism. 2018, Pages 31-60）が報告されている。
米国特許出願公開第２０２０／０００９１００号明細書 国際公開第２０２０／１１７０７０号 特表２０１８－５１４６４４号公報 国際公開第２０１１／０５３８９２号 特表２０１２－５０９０５９号公報
PNAS (2008) vol. 105, No.35, 12843-12848） Biochimica et Biophysica Acta 1801 (2010) 1145-1154 Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 212 (2017) 41-50 Lipids (2017) 52:837-848 PNAS December 4, 2001 vol. 98 no. 25;14304-14309 Polyunsaturated Fatty Acid Metabolism. 2018, Pages 31-60）
　本開示は、超長鎖多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体を提供することを目的とする。超長鎖多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体については、従来技術でも物質生産することが可能ではあったが、その濃度は低かった。具体的に、先行技術に沿ってＶＬＣ－ＰＵＦＡを含む微生物油を生産しようと試みると、微生物油中の総ＶＬＣ－ＰＵＦＡの濃度は０．８％未満、各ＶＬＣ－ＰＵＦＡの濃度は０．５％未満であることが分かった。このように従来技術では、超長鎖多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体について物質生産が可能ではあったが、十分な濃度で得られず、組成物として利用するには至っていない。
　そこで、本開示では、濃度を高めて超長鎖多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体を提供すること、さらには超長鎖多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体を含む組成物として提供することを目的とする。
　本発明者らが、超長鎖不飽和脂肪酸を産生する細胞、及び培養条件について鋭意研究を行った結果、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）鎖長延長酵素遺伝子を導入された細胞を培養し、ＰＵＦＡ鎖長延長酵素遺伝子の発現を誘導することで、超長鎖多価不飽和脂肪酸を生産できることを見出し本発明に至った。そこで、本発明は下記に関する：
［１］　ＰＵＦＡ鎖長延長酵素を発現させた細胞及び／又はその破砕物と、
炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体を含む、組成物。
［２］　前記炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸が、以下の：
（１）　炭素数３０の多価不飽和脂肪酸；
（２）　炭素数３２の多価不飽和脂肪酸；
（３）　炭素数３４の多価不飽和脂肪酸；及び
（４）　炭素数３６の多価不飽和脂肪酸；
　からなる群から選ばれる少なくとも１の多価不飽和脂肪酸を含む、項目１に記載の組成物。
［３］　（１）～（４）からなる群より選ばれる１種の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の含有率が、０．５面積％以上である、項目２に記載の組成物。
［４］　（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の含有率が１．０面積％以上、１．５面積％以上、２．０面積％以上、又は２．５面積％以上である、項目２又は３に記載の組成物。
［５］　（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の総含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、６．０未満、５．０未満、２．５未満、又は２．０未満である、項目２～４のいずれか一項に記載の組成物。
［６］　前記組成物中の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体が、以下の条件：
（１）　炭素数３０の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、５０未満、３０未満、２０未満、又は１０未満であり；
（２）　炭素数３２の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、１５未満、１０未満、又は５未満であり；
（３）　炭素数３４の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、１０未満、５未満、又は２未満であり；及び
（４）　炭素数３６の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、２０未満である；
　のうちの少なくとも１を満たす、項目２～５のいずれか一項に記載の組成物。
［７］　化学式がＣ２３Ｈ３６Ｏ３である不純物を含む、項目１～６のいずれか一項に記載の組成物。
［８］　コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの含有率が、組成物の全重量に対して７０重量％以上である、項目１～７のいずれか一項に記載の組成物。
［９］　コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの構成脂肪酸の少なくとも一つの脂肪酸が（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸である、項目２～８のいずれか一項に記載の組成物。
［１０］　コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの構成脂肪酸の少なくとも一つの脂肪酸が（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸であり、コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの構成脂肪酸のうち、（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸以外の脂肪酸が、炭化水素数が８～２２の脂肪酸である、項目２～９のいずれか一項に記載の組成物。
［１１］　０．５％面積％以上のＰＵＦＡを含む、項目１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
［１２］　前記ＰＵＦＡが、外部添加された非生産のＰＵＦＡを含む、項目１１に記載の組成物。
［１３］　前記細胞が、酵母である、項目１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
［１４］　前記ＰＵＦＡ鎖長延長酵素が、以下の：
ａ）非哺乳動物ＥＬＯＶＬ４；又は
ｂ）非哺乳動物ＥＬＯＶＬ４をコードするアミノ酸配列に対し、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つＰＵＦＡ鎖長延長活性を有する、タンパク質
である、項目１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
［１５］　前記ＰＵＦＡ鎖長延長酵素の遺伝子が、誘導型プロモーターによって発現されている、項目１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
［１６］　炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の含有率が１．０面積％以上、１．５面積％以上、２．０面積％以上、又は２．５面積％以上を含む粗油。
［１７］　前記炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸が、以下の：
（１）　炭素数３０の多価不飽和脂肪酸；
（２）　炭素数３２の多価不飽和脂肪酸；
（３）　炭素数３４の多価不飽和脂肪酸；及び
（４）　炭素数３６の多価不飽和脂肪酸；
　からなる群から選ばれる少なくとも１の多価不飽和脂肪酸を含む、項目１６に記載の粗油。
［１８］ （１）～（４）からなる群より選ばれる１種の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の含有率が、０．５面積％以上である、項目１７に記載の粗油。
［１９］　（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の含有率が１．０面積％以上、１．５面積％以上、２．０面積％以上、又は２．５面積％以上である、項目１７又は１８に記載の粗油。
［２０］　（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の総含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、６．０未満、５．０未満、２．５未満、又は２．０未満である、項目１７～１９のいずれか一項に記載の粗油。
［２１］　前記粗油中の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体が、以下の条件：
（１）　炭素数３０の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、５０未満、３０未満、２０未満、又は１０未満であり；
（２）　炭素数３２の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、１５未満、１０未満、又は５未満であり；
（３）　炭素数３４の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、１０未満、５未満、又は２未満であり；及び
（４）　炭素数３６の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、２０未満である；
　のうちの少なくとも１を満たす、項目１６～２０のいずれか一項に記載の粗油。
［２２］　化学式がＣ２３Ｈ３６Ｏ３である不純物を含む、項目１６～２１のいずれか一項に記載の粗油。
［２３］　コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの含有率が、全重量に対して７０重量％以上である、項目１６～２２のいずれか一項に記載の粗油。
［２４］　コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの構成脂肪酸の少なくとも一つの脂肪酸が（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸である、項目１７～２３のいずれか一項に記載の粗油。
［２５］　コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの構成脂肪酸の少なくとも一つの脂肪酸が（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸であり、コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの構成脂肪酸のうち、（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸以外の脂肪酸が、炭化水素数が８～２２の脂肪酸である、項目１７～２４のいずれか一項に記載の粗油。
［２６］　０．５面積％以上のＰＵＦＡを含む、項目１６～２５のいずれか一項に記載の粗油。
［２７］　前記ＰＵＦＡが、外部添加された非生産のＰＵＦＡを含む、項目２６に記載の粗油。
［２８］　前記粗油が、酵母由来の粗油である、項目１６～２７のいずれか一項に記載の粗油。
［２９］　前記酵母が、ＰＵＦＡ鎖長延長酵素遺伝子を発現させた酵母である、項目２８に記載の粗油。
［３０］　前記ＰＵＦＡ鎖長延長酵素遺伝子が、誘導型プロモーターによって発現されている、項目２９に記載の粗油。
［３１］　前記ＰＵＦＡ鎖長延長酵素遺伝子が、以下の：
ａ）非哺乳動物ＥＬＯＶＬ４をコードするポリヌクレオチド；又は
ｂ）非哺乳動物ＥＬＯＶＬ４をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に対し、少なくとも９０％の配列同一性を有する塩基配列のポリヌクレオチドであって、当該ポリヌクレオチドがコードするタンパク質がＰＵＦＡ鎖長延長活性を有する、
　を含む、項目２９又は３０に記載の粗油。
［３２］　炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の含有率が１．０面積％以上、１．５面積％以上、２．０面積％以上、又は２．５面積％以上、且つ、アシルコレステロール、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの合計の含有率が７０重量％以上である組成物。
［３３］　前記炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸が、以下の：
（１）　炭素数３０の多価不飽和脂肪酸；
（２）　炭素数３２の多価不飽和脂肪酸；
（３）　炭素数３４の多価不飽和脂肪酸；及び
（４）　炭素数３６の多価不飽和脂肪酸；
　からなる群から選ばれる少なくとも１の多価不飽和脂肪酸を含む、項目３２に記載の組成物。
［３４］　（１）～（４）からなる群より選ばれる１種の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の含有率が、０．５面積％以上である、項目３３に記載の組成物。
［３５］　（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の含有率が１．０面積％以上、１．５面積％以上、２．０面積％以上、又は２．５面積％以上の炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体を含む、項目３３又は３４に記載の組成物。
［３６］　（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の総含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、６．０未満、５．０未満、２．５未満、又は２．０未満である、項目３３～３５のいずれか一項に記載の組成物。
［３７］　前記組成物中の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体が、以下の条件：
（１）　炭素数３０の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、５０未満、３０未満、２０未満、又は１０未満であり；
（２）　炭素数３２の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、１５未満、１０未満、又は５未満であり；
（３）　炭素数３４の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、１０未満、５未満、又は２未満であり；及び
（４）　炭素数３６の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、２０未満である；
　のうちの少なくとも１を満たす、項目３３～３６のいずれか一項に記載の組成物。
［３８］　化学式がＣ２３Ｈ３６Ｏ３である不純物を含む、項目３３～３７のいずれか一項に記載の組成物。
［３９］　コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの含有率が、組成物の全重量に対して７０重量％以上である、項目３２～３８のいずれか一項に記載の組成物。
［４０］　コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの構成脂肪酸の少なくとも一つの脂肪酸が（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸である、項目３３～３９のいずれか一項に記載の組成物。
［４１］　コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの構成脂肪酸の少なくとも一つの脂肪酸が（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸であり、コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの構成脂肪酸のうち、（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸以外の脂肪酸が、炭化水素数が８～２２の脂肪酸である、項目３３～４０のいずれか一項に記載の組成物。
［４２］０．５面積％以上のＰＵＦＡを含む、項目３２～４１のいずれか一項に記載の組成物。
［４３］　前記ＰＵＦＡが、外部添加された非生産のＰＵＦＡを含む、項目４２に記載の組成物。
［４４］ 炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の含有率が１．０面積％以上、１．５面積％以上、２．０面積％以上、又は２．５面積％以上である、微生物油。
［４５］ 前記炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸が以下の：
（１）　炭素数３０の多価不飽和脂肪酸；
（２）　炭素数３２の多価不飽和脂肪酸；
（３）　炭素数３４の多価不飽和脂肪酸；及び
（４）　炭素数３６の多価不飽和脂肪酸；
　からなる群から選ばれる少なくとも１の多価不飽和脂肪酸を含む、請求項４４に記載の微生物油。
［４６］ （１）～（４）からなる群より選ばれる１種の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の含有率が、０．５面積％以上である、項目４５に記載の微生物油。
［４７］　（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の含有率が１．０面積％以上、１．５面積％以上、２．０面積％以上、又は２．５面積％以上の炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体を含む、項目４５又は４６に記載の微生物油。
［４８］　前記微生物油中、（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の総含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、６．０未満、５．０未満、２．５未満、又は２．０未満である、項目４５～４７のいずれか一項に記載の微生物油。
［４９］　前記微生物油中の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体が、以下の条件：
（１）　炭素数３０の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、５０未満、３０未満、２０未満、又は１０未満であり；
（２）　炭素数３２の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、１５未満、１０未満、又は５未満であり；
（３）　炭素数３４の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、１０未満、５未満、又は２未満であり；及び
（４）　炭素数３６の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、２０未満である；
　のうちの少なくとも１を満たす、項目４５～４８のいずれか一項に記載の微生物油。
［５０］　化学式がＣ２３Ｈ３６Ｏ３である不純物を含む、項目４４～４８のいずれか一項に記載の微生物油。
［５１］　コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの含有率が、全重量に対して７０重量％以上である、項目４４～５０のいずれか一項に記載の微生物油。
［５２］　コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの含有率が、全重量に対して７０重量％以上である、項目４４～５１のいずれか一項に記載の微生物油。
［５３］　コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの構成脂肪酸の少なくとも一つの脂肪酸が（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸である、項目４５～５２のいずれか一項に記載の微生物油。
［５４］　コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの構成脂肪酸の少なくとも一つの脂肪酸が（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸であり、コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの構成脂肪酸のうち、（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸以外の脂肪酸が、炭化水素数が８～２２の脂肪酸である、項目４５～５３のいずれか一項に記載の微生物油。
［５５］　０．５面積％以上のＰＵＦＡを含む、項目４４～５４のいずれか一項に記載の微生物油。
［５６］　前記ＰＵＦＡが、外部添加された非生産のＰＵＦＡを含む、項目５５に記載の微生物油。
［５７］　微生物油が粗油である、項目４４～５６のいずれか一項に記載の微生物油。
［５８］　微生物油が酵母油である、項目４４～５７のいずれか一項に記載の微生物油。
［５９］　前記酵母油が、ＰＵＦＡ鎖長延長酵素遺伝子を発現させた酵母由来の油である、項目５８に記載の微生物油。
［６０］　前記ＰＵＦＡ鎖長延長酵素遺伝子が、誘導型プロモーターによって発現されている、項目５９に記載の微生物油。
［６１］　前記ＰＵＦＡ鎖長延長酵素遺伝子が、
ａ）非哺乳動物ＥＬＯＶＬ４をコードするポリヌクレオチド；又は
ｂ）非哺乳動物ＥＬＯＶＬ４をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に対し、少なくとも９０％の配列同一性を有する塩基配列のポリヌクレオチドであって、当該ポリヌクレオチドがコードするタンパク質がＰＵＦＡ鎖長延長活性を有する、ポリヌクレオチド
　を含む、項目５９又は６０に記載の微生物油。
［６２］　ＰＵＦＡ鎖長延長酵素の発現系を細胞に導入する工程、
前記導入済細胞をＶＬＣ－ＰＵＦＡ高含有となる状態に調整する工程、
前記調整済細胞でＰＵＦＡ鎖長延長酵素の発現を誘導する工程、
を含む、多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の製造方法。
［６３］　前記細胞が、酵母である、項目６２に記載の製造方法。
［６４］　前記ＰＵＦＡ鎖長延長酵素が、非哺乳動物ＥＬＯＶＬ４である、項目６２又は６３に記載の製造方法。
［６５］　前記ＰＵＦＡ鎖長延長酵素の遺伝子が、誘導型プロモーターによって発現されている、項目６２～６４のいずれか一項に記載の製造方法。
［６６］　前記誘導型プロモーターが、ガラクトース誘導性であり、ガラクトースの添加によりeｌｏｖｌ４遺伝子発現が誘導される、項目６５に記載の製造方法。
［６７］　前記ＶＬＣ－ＰＵＦＡ高含有となる状態に調整する工程が、炭素鎖長１８～２２多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体を添加された培地で培養する工程である、項目６２～６６のいずれか一項に記載の製造方法。
［６８］　ＰＵＦＡ鎖長延長酵素の発現が、培養液の濁度１．５～１１の範囲で誘導される、項目６２～６７のいずれか一項に記載の製造方法。
［６９］　製造される多価不飽和脂肪酸が、炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体を含む、項目６２～６８のいずれか一項に記載の製造方法。
［７０］　前記炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸が、以下の：
（１）　炭素数３０の多価不飽和脂肪酸；
（２）　炭素数３２の多価不飽和脂肪酸；
（３）　炭素数３４の多価不飽和脂肪酸；及び
（４）　炭素数３６の多価不飽和脂肪酸；
　からなる群から選ばれる少なくとも１の多価不飽和脂肪酸を含む、項目６９に記載の製造方法。
［７１］ （１）～（４）からなる群より選ばれる１種の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の含有率が、０．５面積％以上である、項目７０に記載の製造方法。
［７２］　（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の含有率が１．０面積％以上、１．５面積％以上、２．０面積％以上、又は２．５面積％以上の炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体を含む、項目７０又は７１に記載の製造方法。
［７３］　（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の総含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、６．０未満、５．０未満、２．５未満、又は２．０未満である、項目７０～７２のいずれか一項に記載の製造方法。
［７４］　多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体が、以下の条件：
（１）　炭素数３０の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、５０未満、３０未満、２０未満、又は１０未満であり；
（２）　炭素数３２の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、１５未満、１０未満、又は５未満であり；
（３）　炭素数３４の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、１０未満、５未満、又は２未満であり；及び
（４）　炭素数３６の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、２０未満である；
　のうちの少なくとも１を満たす、項目７０～７３のいずれか一項に記載の製造方法。
［７５］　前記多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体が、化学式がＣ２３Ｈ３６Ｏ３である不純物を含む、項目７０～７４のいずれか一項に記載の製造方法。
［７６］　項目６２～７５のいずれか一項に記載の方法により製造された微生物油。
　超長鎖多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体を高濃度で生産することができ、また超長鎖多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体を含む組成物を提供する。
（１）多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）
　本開示において、多価不飽和脂肪酸は、二価以上、好ましくは三価以上の不飽和脂肪酸のことをいう。二重結合の数は限定されないが、２～１２個を有する。多価不飽和脂肪酸は、ｎ－３（ω－３）系、ｎ－６（ω－６）系、ｎ－７（ω－７）又はｎ－９（ω－９）系の不飽和脂肪酸であってもよい。生理作用の観点から、ｎ－３（ω－３）系又はｎ－６（ω－６）系であってもよい。本開示において、炭素数２０～２９の多価不飽和脂肪酸を、特に断らない限り「ＰＵＦＡ」と称し、さらに炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸を超長鎖多価不飽和脂肪酸（ＶＬＣ－ＰＵＦＡ）と称する。多価不飽和脂肪酸の炭素数は、構成脂肪酸の炭素数を意味する。
　炭素数２０～２９の多価不飽和脂肪酸としては、例えば、炭素数２０以上２２以下の多価不飽和脂肪酸を挙げることができ、具体的には、エイコサジエン酸（Ｃ２０：２，ｎ－９、ＥＤＡ）、ジホモ－γ－リノレン酸（Ｃ２０：３，ｎ－６、ＤＧＬＡ）、ミード酸（Ｃ２０：３，ｎ－９、ＭＡ）、エイコサテトラエン酸（Ｃ２０：４，ｎ－３、ＥＴＡ）、アラキドン酸（Ｃ２０：４，ｎ－６、ＡＲＡ）、エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５，ｎ－３、ＥＰＡ）、ドコサテトラエン酸（Ｃ２２：４，ｎ－６、ＥＴＡ）、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５，ｎ－３、ｎ－３ＤＰＡ）、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５，ｎ－６、ｎ－６ＤＰＡ）及びドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６，ｎ－３、ＤＨＡ）等を挙げることができる。これらのＰＵＦＡを基質として、ＶＬＣ－ＰＵＦＡを調製することができる。
（２）超長鎖多価不飽和脂肪酸（ＶＬＣ－ＰＵＦＡ）
　本開示において、「超長鎖多価不飽和脂肪酸（ＶＬＣ－ＰＵＦＡ）」とは、炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸をいう。炭素数の上限は限定されないが、微生物が産生する観点から、４０未満又は３８未満である。炭素数が奇数となる多価不飽和脂肪酸を基質として用いることで、炭素数３１、３３、３５等の多価不飽和脂肪酸も生産することができる。
　本開示において、炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸は、以下の：
（１）　炭素数３０の多価不飽和脂肪酸；
（２）　炭素数３２の多価不飽和脂肪酸；
（３）　炭素数３４の多価不飽和脂肪酸；及び
（４）　炭素数３６の多価不飽和脂肪酸；
　からなる群から選ばれる少なくとも１の多価不飽和脂肪酸を含む。一例として、炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸は（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸の全てを含む。
　本開示において、脂肪酸は、遊離の脂肪酸を指し、その誘導体としてトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、リン脂質、糖脂質及びアシルコレステロール等が挙げられる。本開示の粗油、微生物油又は組成物は、遊離の脂肪酸と、その誘導体を含み、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、糖脂質及びアシルコレステロールの含有率は、７０重量％以上、８０重量％以上、又は９０重量％以上である。本開示の粗油、微生物油又は組成物におけるトリグリセリドの含有率が７０重量％以上であれば、吸湿性が低すぎることがなく、例えば、良好な流動性が得られ得る。粗油、微生物油又は組成物中のトリグリセリドの含有率の上限値については特に制限はないが、一般にトリグリセリドの微生物油中における重量比は９９重量％以下である。微生物油におけるトリグリセリドの重量比は、１００重量％、即ち、微生物油が、トリグリセリド以外の成分を実質的に含まなくてもよい。本開示の粗油、微生物油又は組成物において、トリグリセリドの構成脂肪酸の少なくとも一つの脂肪酸が（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸である。本開示の粗油、微生物油又は組成物において、トリグリセリドの構成脂肪酸の少なくとも一つの脂肪酸が（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸であり、トリグリセリドの構成脂肪酸のうち、（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸以外の脂肪酸が、炭化水素数が８～２２の脂肪酸である。
　本開示の粗油、微生物油又は組成物において、基質として用いられたＰＵＦＡが含まれていてもよい。基質として用いられたＰＵＦＡの含量は、存在すれば特に限定されないが、一例として、０．５面積％以上、１．０面積％以上、５．０面積％以上、１０面積％以上、１５面積％以上、２０面積％以上、２５面積％以上である。基質として用いられたＰＵＦＡの含量上限は特に限定されないが、一例として６０面積％以下、５０面積％以下、４０面積％以下である。
　本開示の粗油、微生物油又は組成物において、リン脂質含有率は、全重量に対して１０重量％以下、５重量％、又は１重量％以下である。しかしながら、リン脂質は、いくらか存在してもよく、例えば、微生物油の全重量に対して、０．１～１０重量％、０．５～７重量％、又は１～５重量％であってもよい。リン脂質は精製過程で除かれる。したがって、精製油にはリン脂質は実質的に含まれない。
　本開示の組成物、粗油又は微生物油において、ＶＬＣ－ＰＵＦＡの含有率は、油の構成脂肪酸として、含有率が１．０面積％以上、１．５面積％以上、２．０面積％以上、又は２．５面積％以上である。
　本開示の組成物、粗油又は微生物油に含まれる宿主由来の特定の構成脂肪酸として、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、Ｃ１６：１の脂肪酸、及びＣ１８：１の脂肪酸が挙げられる。本開示では、超長鎖多価不飽和脂肪酸の生産率を高める観点から、産生した超長鎖多価不飽和脂肪酸に対する、宿主由来の特定の構成脂肪酸の比が低減されることが好ましい。また、飽和脂肪酸は、心血管疾患のリスクと関係し、また油の融点を上昇させてしまうため、特にパルミチン酸及びステアリン酸の含有量を低減させることが所望される。
　本開示の組成物、粗油又は微生物油において、炭素数３０以上の超長鎖多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の総含有率に対する、ステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、５．０未満、２．５未満、又は２．０未満である。さらに、本開示の組成物、粗油又は微生物油は、以下の条件：
（１）　炭素数３０の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、５０未満、３０未満、２０未満、又は１０未満であり；
（２）　炭素数３２の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、１５未満、１０未満、又は５未満であり；
（３）　炭素数３４の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、１０未満、５未満、又は２未満であり；及び
（４）　炭素数３６の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、２０未満である；
のうちの少なくとも１を満たす。
　本開示の組成物、粗油又は微生物油について、ガスクロマトグラフィー質量分析により脂肪酸の組成分析を行ったところ、Ｃ２３Ｈ３６Ｏ３の組成を有する不純物が含まれることを見出した。したがって、Ｃ２３Ｈ３６Ｏ３の組成の不純物は、本開示の微生物油の特定に役立つ。一方、超長鎖多価不飽和脂肪酸の含有率を高める観点から、産生した超長鎖多価不飽和脂肪酸に対する、Ｃ２３Ｈ３６Ｏ３の組成の不純物の比が低減されることが好ましい。Ｃ２３Ｈ３６Ｏ３は、任意の手法で特定されてよいが、一例として実施例に記載のガスクロマトグラフィー及び/又は質量分析の手法により特定される。この場合、ＡＰＧＣ保持時間１８．０３４分の画分の物質を不純物として特定でき、また推定［Ｍ＋Ｈ］+が３６１．２７１０の物質を不純物として特定できる。
　本開示の組成物、粗油又は微生物油において、炭素数３０以上の超長鎖多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の総含有率に対する、Ｃ２３Ｈ３６Ｏ３の組成の不純物の含有率の比は、０．１７未満、０．１６未満、０．１２未満、又は０．１０未満である。さらに、本開示の組成物、粗油又は微生物油は、以下の条件：
（１）　炭素数３０の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するＣ２３Ｈ３６Ｏ３の組成の不純物の含有率の比が、１５未満、５未満、３未満、又は１．５未満であり；
（２）　炭素数３２の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するＣ２３Ｈ３６Ｏ３の組成の不純物の含有率の比が、０．３未満であり；及び
（３）　炭素数３４の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するＣ２３Ｈ３６Ｏ３の組成の不純物の含有率の比が、０．３５未満、０．３未満、又は０．２未満であり
のうちの少なくとも１を満たす。
　本開示の組成物、粗油又は微生物油において、超長鎖多価不飽和脂肪酸の含有率に対する、宿主由来の特定の構成脂肪酸の含有率の比は、「宿主由来の特定の構成脂肪酸の含有率／ＶＬＣ－ＰＵＦＡの含有率」で表される。また、超長鎖多価不飽和脂肪酸の含有率に対する、Ｃ２３Ｈ３６Ｏ３の組成の含有率の比は、「Ｃ２３Ｈ３６Ｏ３の組成の不純物の含有率／ＶＬＣ－ＰＵＦＡの含有率」で表される。これらの比は、組成物、粗油又は微生物油に含まれる脂肪酸組成の分析による含有率の比である。
　脂肪酸組成は、常法の脂肪酸分析にしたがって求めることができる。一例として、測定対象となる油を、低級アルコールと触媒を用いてエステル化し、脂肪酸低級アルコールエステルを得る。次いで、得られた脂肪酸低級アルコールエステルを、ガスクロマトグラフィーを用いて分析する。得られたガスクロマトグラフィーにおいて各脂肪酸に相当するピークを同定し、例えばＡｇｉｌｅｎｔ　ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ積分アルゴリズム（リビジョンＣ．０１．０３［３７］、Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、各脂肪酸のピーク面積を求めることができる。
　本開示において脂肪酸組成において用いられる「面積％」とは、脂肪酸分析により得られたクロマトグラムにおいてそれぞれの成分のピーク面積の全ピーク面積に対する割合（百分率）を指す。一例として、構成成分として種々の脂肪酸を有する油のガスクロマトグラフィー又は薄層クロマトグラフィー／水素炎イオン化検出器（ＴＬＣ／ＦＩＤ）により得られた分析チャートによって決定されたそのピークの成分の含有率を示すものである。脂肪酸組成については、例えば実施例に示す方法に従った、ガスクロマトグラフィーにより決定した。脂質組成については、ＴＬＣ／ＦＩＤにより決定した。詳細な条件は実施例に示した。
　便宜上、用語「脂肪酸」は、遊離の飽和若しくは不飽和脂肪酸自体だけでなく、アルキルエステル、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、リン脂質、ステリルエステル等中に含まれる構成単位としての脂肪酸を意味することがあり、構成脂肪酸とも言い換えられうる。本開示において、特に断らない限り、脂肪酸を含む化合物の形態については省略する場合がある。脂肪酸を含む化合物の形態としては、遊離脂肪酸形態、脂肪酸アルキルエステル形態、グリセリルエステル形態、リン脂質の形態、ステリルエステル形態等を挙げることができる。同一の脂肪酸を含む化合物は、油中、単一の形態で含まれていてもよく、２つ以上の形態の混合物として含まれていてもよい。
　脂肪酸を表記する際に、炭素数、二重結合の数及び二重結合の場所を、それぞれ数字とアルファベットを用いて簡略的に表した数値表現を用いることがある。たとえば、炭素数２０の飽和脂肪酸は「Ｃ２０：０」と表記され、炭素数２０で炭素鎖に二重結合を３つ有する三価不飽和脂肪酸は「Ｃ２０：３」と表記される。たとえば、ベヘン酸は「Ｃ２２：０」、アラキドン酸は「Ｃ２０：４，ｎ－６」等と表記され得る。「ｎ－」は、脂肪酸のメチル末端から数えた最初の二重結合の位置を示し、たとえば「ｎ－６」であれば、二重結合の位置が脂肪酸のメチル末端から数えて６番目であることを示し、「ｎ－３」であれば、二重結合の位置が脂肪酸のメチル末端から数えて３番目であることを示す。この方法は当業者には周知であり、この方法に従って表記された脂肪酸については、当業者であれば容易に特定することができる。
（３）組成物
　本開示の「組成物」は、超長鎖多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体を含有する脂質組成物である。一の例では、本開示の組成物は、超長鎖多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体を産生する細胞及び/又はその破砕物をさらに含有することで特徴づけられる。
　別の例では、本開示の組成物は、超長鎖多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の含有率とアシルコレステロール、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの合計の含有率により特徴付けられる。アシルコレステロール、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドは、超長鎖多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の濃度を上げるために濃縮する際には、通常除去される。
　本開示の組成物は、高濃度の超長鎖多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体を含有し、例えば１．０面積％以上、１．５面積％以上、２．０面積％以上、又は２．５面積％以上の濃度で超長鎖多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体を含有する。さらに、本開示の組成物は、アシルコレステロール、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの合計の含有率が７０重量％以上である。
　本開示の組成物に含まれる細胞は、ＰＵＦＡ鎖長延長酵素遺伝子が発現された細胞である。このような細胞によって、本開示の組成物に含まれる超長鎖多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体が産生される。このような細胞としては、動物細胞、植物細胞、微生物のいずれであってもよい。
　破砕物とは、細胞が破壊されて得られた物であり、細胞由来の脂質、タンパク質、糖鎖、核酸など任意の成分が含まれる。したがって、当該組成物中に含まれる、超長鎖不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の由来元の細胞の成分を検出することもできる。このような成分としては、当該細胞特異的の抗原、特異的核酸が挙げられる。特に導入されたＰＵＦＡ鎖長延長酵素遺伝子について、プローブやＰＣＲなどにより検出することができる。具体的には、所定のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うこと、場合によりネステッドＰＣＲを行うことで導入されたＰＵＦＡ鎖長延長酵素の遺伝子の存在を検出しうる。
（４）微生物油
　本開示において、微生物油とは、特記しない限り、微生物から得られたすべての脂質を広く意味し、本開示において粗油及び精製油の双方を区別することなく指称する用語として用いる。微生物油は、微生物を適切な培地中で培養し、その微生物菌体から溶媒抽出などの方法により採取することにより得られる。微生物油が精製油である場合であっても、微生物油は、微生物に特徴的な何らかの成分が残る程度までしか精製されておらず、特定の油脂の濃縮物とは区別しうる。本開示の微生物油は、超長鎖多価不飽和脂肪酸（ＶＬＣ－ＰＵＦＡ）の含有率により特徴づけられる。また、本開示の微生物油は、さらに微生物油に含有されるＶＬＣ－ＰＵＦＡの含有率に対する宿主由来の特定の構成脂肪酸の含有率の比によっても特徴づけられる。ＶＬＣ－ＰＵＦＡの含有率に対する宿主由来の特定の構成脂肪酸の含有率の比が低下することにより、宿主由来の脂肪酸の影響が小さくなり、また微生物油からＶＬＣ－ＰＵＦＡを精製する際に宿主由来の不純物を含有するリスクを低減することができる。ＶＬＣ－ＰＵＦＡの含有率に対する宿主由来の特定の構成脂肪酸の含有率の比が低いと、ＶＬＣ－ＰＵＦＡを有効成分として投与するにあたり、脂質投与量を低減することができる。
　本開示の微生物油は、任意の微生物から得られた油を指す。微生物の種類に応じて、酵母油、真菌油、藻類油ということもできる。また、微生物の代わりに、細胞を用いて油を得ることもでき、細胞油ということもできる。
　「粗油」とは、油糧原料から圧搾又は抽出した状態の油のことを指す。本開示において微生物油の粗油とは、微生物菌体から、脂質を単に抽出することにより得られた状態である脂質の混合物を、微生物油の「粗油」と称する。粗油から、リン脂質やコレステロールなどの不純物を取り除き精製油が得られる。粗油は精製が行われる前の油脂であることから、その脂肪酸組成は、油糧原料中の脂肪酸組成に依存する。本開示の粗油は、超長鎖多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の含有率が１．０面積％以上、１．５面積％以上、２．０面積％以上、又は２．５面積％以上を含んでいることによりを特徴付けられる。
　「精製油」とは、脱ガム工程、脱酸工程、脱色工程、脱臭工程等を、これらのいくつか又はそのすべてを組み合わせて含み、リン脂質及びステロールなど目的物以外の物質を除去するための精製工程後に得られた油を意味する。精製工程により、トリグリセリドの割合が高まる。
　用語「油(oil)」は、一般に、水と相分離する水に混じらない可燃性の物質のうち液体のものとして定義される。また、「脂（fat)」は、水と相分離する水に混じらない可燃性の物質のうち固体のものとして定義され、その両方を合わせて「油脂(oil and fat)」と呼ばれる。用語「脂質（Lipid)」は、一般に、生物由来であって、水に不溶の物質として定義される。慣用的には動物性の油脂を「脂」と呼び、植物性油脂又は魚由来の油脂を「油」と呼ぶが、固体となるか液体となるかは、組成によるものであり、植物油や魚油であっても固体のものが存在する。したがって、本開示において、用語「油」は、必ずしも液体であることを意味するものではなく、便宜上「油脂」又は「脂質」と互換的に使用されうる。
　用語「油」及び「油脂」は、狭義にはトリグリセリドを意味するが、本開示においてはトリグリセリドとともに、ジグリセリド、モノグリセリド、リン脂質、糖脂質、コレステロール、遊離脂肪酸等の他の脂質成分を含む。
（５）微生物
　本開示において「微生物」とは、真正細菌、古細菌、真核生物等が挙げられる。真核生物として藻類、原生生物、菌類、粘菌などが挙げられる。菌類の一例として、酵母等の子嚢菌、カビなどの糸状菌が用いられうる。本開示の一例として、酵母が使用される。また別の例では、微生物に代えて、細胞を使用することもできる。ＶＬＣ－ＰＵＦＡを産生する細胞として、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等を使用することができる。ＶＬＣ－ＰＵＦＡを産生する観点から、ＰＵＦＡ鎖長延長酵素の遺伝子を遺伝子導入された微生物又は細胞が用いられる。
　「鎖長延長酵素」とは、脂肪酸の鎖長を延長する活性を有する酵素をいう。鎖長延長酵素としては、種々の酵素が知られているが、一例としてＥＬＯＶＬファミリーに属する酵素が挙げられる。ＶＬＣ－ＰＵＦＡを産生する観点から、ＰＵＦＡを基質として、ＰＵＦＡの鎖長の伸長活性を有するＰＵＦＡ鎖長延長酵素を使用することが好ましい。ＰＵＦＡ鎖長延長酵素として、ＥＬＯＶＬ４の中で、ＰＵＦＡを基質とするＥＬＯＶＬ４を使用することができる。このようなＰＵＦＡを基質とするＥＬＯＶＬ４には、Ｃ３０以上のＶＬＣ－ＰＵＦＡを生産できない酵素も含まれうる。したがって、ＶＬＣ－ＰＵＦＡを産生する観点から、Ｃ３０以上のＶＬＣ－ＰＵＦＡを産生可能な鎖長延長酵素、例えばＣ３０以上のＶＬＣ－ＰＵＦＡを産生可能なＥＬＯＶＬ４が好ましい。魚類のＥＬＯＶＬ４には、ＥＬＯＶＬ４ａとＥＬＯＶＬ４ｂとが存在し、そのいずれであってもよい。
　このような酵素としては任意の酵素を使用してもよいが、一例として以下の：
　ａ）特定のＥＬＯＶＬ４；又は
　ｂ）特定のＥＬＯＶＬ４をコードするアミノ酸配列に対し、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、鎖長延長酵素の共通配列を含み、且つＰＵＦＡ鎖長延長活性を有する、タンパク質
　を使用することができる。鎖長延長酵素の共通配列としては、ヒスチジンクラスター モチーフ（アミノ酸配列：HXXHH、ここでXは任意のアミノ酸を表す）及び/又はジリジンモチーフ（アミノ酸配列：XKXKXX またはKKXX、ここでXは任意のアミノ酸を表す）が挙げられる（Mol Vis. 2003 Jul 3; 9: 301-307.）。
　ＰＵＦＡ鎖長延長酵素の遺伝子は、発現プロモーターの下流に作動可能に連結され、宿主に遺伝子導入される。かかる発現プロモーターとしては、宿主において発現する任意の発現プロモーターであってよい。発現プロモーターは、誘導発現プロモーター又は恒常発現プロモーターのいずれであってもよい。所定のタイミングでＰＵＦＡ鎖長延長酵素の発現を促進する観点から、誘導発現プロモーターが使用される。誘導発現プロモーターとしては、任意の誘導発現プロモーターを使用できるが、一例として、ガラクトース誘導プロモーターを使用しうる。ガラクトース誘導プロモーター制御下に作動可能に連結されたＰＵＦＡ鎖長延長酵素遺伝子が、微生物に導入された場合、誘導物質、例えばガラクトース又はそのアナログを添加することで、ＰＵＦＡ鎖長延長酵素遺伝子が発現する。ＰＵＦＡ鎖長延長酵素遺伝子としては、一例として以下の：
ａ）特定のＥＬＯＶＬ４をコードするポリヌクレオチド；又は
ｂ）特定のＥＬＯＶＬ４をコードするポリヌクレオチドに対し、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が、ＰＵＦＡ鎖長延長活性を有する、ポリヌクレオチド
を用いることができる。これらのポリヌクレオチドを導入することで、Ｃ３０以上のＶＬＣ－ＰＵＦＡを産生することができる。
　特定のＥＬＯＶＬ４は、任意の種由来のＥＬＯＶＬ４であってよい。ＶＬＣ－ＰＵＦＡの産生量を高める観点から、非哺乳動物ＥＬＯＶＬ４が使用される。非哺乳動物ＥＬＯＶＬ４としては、鳥類、魚類、爬虫類、両生類のＥＬＯＶＬ４が使用され、特に魚類のＥＬＯＶＬ４が利用される。魚類のＥＬＯＶＬ４には、ＥＬＯＶＬ４ａとＥＬＯＶＬ４ｂとが存在し、そのいずれであってもよい。一例として魚類ＥＬＯＶＬ４として、クロダイのＥＬＯＶＬ４ｂ又は、アフリカンクララのＥＬＯＶＬ４ａを使用することができる。クロダイのＥＬＯＶＬ４ｂは、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を有する。かかるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１２が挙げられる。アフリカンクララのＥＬＯＶＬ４ａは、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を有する。かかるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１４が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（６）ＶＬＣ－ＰＵＦＡ及び/又はその誘導体の生産
（６－１）生産工程
　ＶＬＣ－ＰＵＦＡ及び/又はその誘導体は、本開示の製造方法により製造することができる。本開示の製造方法は、以下の：
　ＰＵＦＡ鎖長延長酵素の発現系を細胞に導入する工程、
　前記導入済細胞をＶＬＣ－ＰＵＦＡ高含有となる状態に調整する工程、及び
　前記調整済細胞でＰＵＦＡ鎖長延長酵素の発現を誘導する工程
　を含むことにより特徴づけられる。かかる製造方法によりＶＬＣ－ＰＵＦＡ及び/又はその誘導体が生成し、培養物中に蓄積する。上述の製造方法工程を行うことで、ＶＬＣ－ＰＵＦＡ及び/又はその誘導体の含有率が高い培養物を得ることができる。
　培養物は、培養により得られたもの全てを意味し、細胞油、細胞体及び培地を含む。「細胞体を含む培養物」は、特に「細胞」が培養された培養物であって、細胞が培地から分離される前の状態を意味する。培養物からは、細胞油を含有する細胞を得ることができる。生細胞も死細胞も細胞に含まれていてもよい。乾燥させた細胞も含まれる。細胞との表現は、実質的に水を含まない細胞の乾燥物と、残存培地成分、濾過助剤などを含有する乾燥物とを意味する。「実質的に水を含まない」とは、細胞の生存が困難となり得る水分量以下となる水分量を意味する。この量は、一般に、水分量が１５重量％以下、又は１０重量％以下である。本開示によれば、ＶＬＣ－ＰＵＦＡを含む細胞油及び／又は細胞が提供される。このような細胞油及び／又は細胞体のうち、１．０面積％以上の炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体を含む、細胞油及び／又は細胞体はこれまでに知られていない。このため、本開示の細胞油及び本開示の細胞体を使用することにより、従来の油よりも高濃度のでＶＬＣ－ＰＵＦＡを含有する油を効率よく提供することができる。
　ＰＵＦＡ鎖長延長酵素の発現系を細胞に導入する工程は、発現プロモーターの下流に作動可能に連結されたＰＵＦＡ鎖長延長酵素遺伝子を含むベクターを、定法に従い細胞に遺伝子導入することにより行われうる。ベクターの種類や導入方法は宿主細胞に応じて適宜選択することができる。また、別の手法では、ゲノム編集によりＰＵＦＡ鎖長延長酵素の発現系を導入してもよい。既存のＰＵＦＡ鎖長延長酵素をコードする遺伝子を改変することで、Ｃ３０以上のＶＬＣ－ＰＵＦＡを産生可能な鎖長延長酵素が発現するようにゲノム編集を行ってもよいし、新たにＶＬＣ－ＰＵＦＡを産生可能な鎖長延長酵素をゲノムに組み込んでもよい。
　導入済細胞をＶＬＣ－ＰＵＦＡ高含有となる状態に調整する工程とは、導入済細胞を培養する工程を含み、ＰＵＦＡ鎖長延長酵素遺伝子の発現を誘導することで、ＶＬＣ－ＰＵＦＡが高含有となるよう、濁度を調整する工程及び/又は基質を添加する工程をさらに含んでもよい。導入済細胞の培養は、通気攪拌培養、振とう培養、又は静置培養とすることができ、培養する細胞に応じて適宜選択することができる。一例として酵母を用いる場合、通気撹拌培養では通常１日間～７日間培養が行われる。通気撹拌培養における通気量は、通常、用いられる通気量をそのまま適用すればよい。培養において用いられる培地は、使用する細胞に応じて、本技術分野に周知の任意の培地を用いることができる。
　液体培地の場合に、グルコース、フルクトース、キシロース、サッカロース、マルトース、可溶性デンプン、糖蜜、グリセロール、マンニトール等を含む一般的に使用されている炭素源のいずれもが使用できるが、炭素源は、これらに限られるものではない。
　窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、コーンスティプリカー等の天然窒素源、尿素等の有機窒素源、及び硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素源を用いることができる。この他に、必要に応じて、リン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅等の無機塩及びビタミン等も微量栄養源として使用できる。液体培地の基材として使用可能な水性媒体は、基本的に水であり、蒸留水又は精製水を用いることができる。
　ＶＬＣ－ＰＵＦＡの生産性を促進するため、ＶＬＣ－ＰＵＦＡの基質を培地に添加することができる。ＶＬＣ－ＰＵＦＡの基質として、ＰＵＦＡを添加することができる。ＶＬＣ－ＰＵＦＡの基質として添加されるＰＵＦＡには、所望されるＶＬＣ－ＰＵＦＡに応じて適宜選択することができる。かかるＰＵＦＡの一例として、エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５，ｎ－３）、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５，ｎ－３）、ドコサヘキサエン酸（Ｃ２０：６，ｎ－３）、アラキドン酸（Ｃ２０：４，ｎ－６）、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５，ｎ－６）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＰＵＦＡは、一例として培地中に０．０１～５％の濃度になるよう添加されうる。微生物の増殖性を低減させない観点から、ＰＵＦＡ濃度の上限として３％、１％が使用されうる。ＶＬＣ－ＰＵＦＡの生産量を高める観点から、ＰＵＦＡ濃度の下限として０．０５％、０．１％が使用されうる。ＰＵＦＡは、最初から培地中に含まれてもよいし、ＰＵＦＡ鎖長延長酵素の遺伝子の発現誘導処理が行われるタイミングで添加されてもよい。ＰＵＦＡを生産できる宿主は限られており、例えば酵母では、外来からの遺伝子の導入、ゲノム編集に例示される人工的な操作がなければＰＵＦＡを生産することはできない。このような宿主はＰＵＦＡ非生産性の宿主ということができる。ＰＵＦＡ非生産性の宿主を用いたときは、培養物に含まれるＰＵＦＡは全て添加された基質に由来するものである。
　生産工程に用いられる培養器については特に制限はなく、通常、微生物の培養に用いられる培養器であればいずれも使用可能である。培養器は、培養のスケールに応じて適宜選択可能である。
　前記調整済細胞でＰＵＦＡ鎖長延長酵素の発現を誘導する工程は、所定のタイミングで、ＰＵＦＡ鎖長延長酵素の発現系に応じた誘導処理を行うことを含む。発現系としてガラクトース誘導型プロモーターを用いる場合、ガラクトース又はそのアナログを培地に添加することでＰＵＦＡ鎖長延長酵素が発現する。誘導処理は、培養における静止期又はストレスで細胞増殖が停滞している時期に行われる。静止期は、糖などの炭素源の枯渇によってもたらされ、栄養飢餓のストレス状態ともいえる。栄養飢餓のストレス以外にも、温度条件ストレス、光条件ストレスなどによっても、細胞増殖が停滞しうる。温度条件ストレスとしては低温ストレス又は高温ストレス（ヒートショック）が挙げられる。光条件ストレスとは、紫外線照射や特定波長の光の不足なども挙げられる。静止期としては、一例として微生物を培養後、濁度が１．５～１１になった場合が挙げられる。濁度は、分光光度計を用いて測定することができ、本実施例ではダブルビーム分光光度計（U2910、HITACHI製）を用いた。濁度が１．５～１１になった場合にｅｌｏｖｌ４遺伝子の誘導処理を行うことで、生成するＶＬＣ－ＰＵＦＡの含有率を増加する。ストレスで細胞増殖が停滞している時期で、ＶＬＣ－ＰＵＦＡが高い濃度で生成する理由としては、理論に限定されることを意図するものではないが、以下の：
（１）ＶＬＣ－ＰＵＦＡの基質となる脂肪酸が多くなる状態、すなわち細胞増殖時に多く必要となるＣ１６やＣ１８が、細胞増殖が停滞することにより、多く供給できるようになる状態であること、
（２）ＰＵＦＡ鎖長延長酵素の活性、安定性、局在の何れか又はその組み合わせが、培養における静止期又は細胞増殖の停滞に伴って、よりＶＬＣ－ＰＵＦＡの高い生産に寄与する状態であること、及び/又は
（３）ＶＬＣ－ＰＵＦＡ自体の分解が、培養における静止期又は細胞増殖の停滞に伴って、減少する状態であること
　が考えられうる。
（６－２）分離工程
　分離工程では、生産工程の間で生産されたＶＬＣ－ＰＵＦＡを含む細胞油を培養物から分離する。分離工程は、培養に用いられた培地から培養細胞を分離すること（以下、細胞分離工程とする）、及び、培養細胞からＶＬＣ－ＰＵＦＡを含む細胞油を採取すること（以下、細胞油採取工程とする）、すなわち、粗油を得ることを含む。細胞分離工程及び細胞油採取工程では、培養形態に応じた分離方法及び抽出方法を用いて、細胞からＶＬＣ－ＰＵＦＡを含む細胞油を採取する。
　液体培地を使用した場合には、培養終了後、培地より、遠心分離及び／又は濾過等の常用の固液分離手段により細胞体を分離することができる。細胞体は充分水洗いし、それから場合により乾燥させる。乾燥は凍結乾燥、風乾、加熱乾燥等によって行うことができる。
　固体培地で培養した場合には、細胞体と培地とを分離することなく、固体培地と細胞体とをホモジナイザー等で破砕し、得られた破砕物を細胞油採取工程に直接供することができる。
　細胞油採取工程は、細胞分離工程で得られた乾燥細胞を、窒素気流下で、有機溶媒を使用することによって抽出処理することを含むことができる。用いられる有機溶媒としては、エーテル、ヘキサン、メタノール、エタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、石油エーテル等が含まれる。あるいは、メタノールと石油エーテルの交互抽出又はクロロホルム－メタノール－水の一層系の溶媒を用いた抽出によって、良好な結果を得ることができる。抽出物から減圧下で有機溶媒を留去することにより、ＶＬＣ－ＰＵＦＡを含有する細胞油が得られる。トリグリセリドを採取する場合、ヘキサンが最も一般的に用いられる。また、上記の方法に代えて、湿細胞を用いて抽出を行うことができる。メタノール、エタノール等の、水に対して相溶性の溶媒、又はこの溶媒と水及び／又は他の溶媒と含む、水に対して相溶性の混合溶媒を使用する。その他の手順は上記と同様である。
　採取した細胞油の粗油は、植物油、魚油などの精製に用いられる方法で精製することができる。通常行われる油脂の精製工程としては、脱ガム、脱酸、脱色及び脱臭が例示される。このような処理は、どのような方法で行ってもよい。脱ガムとしては水洗処理が示される。脱酸処理としては、蒸留処理が例示される。脱色処理としては、活性白土、活性炭、シリカゲル等での処理が例示される。脱臭としては、水蒸気蒸留等が例示される。
　ＶＬＣ－ＰＵＦＡを含む、細胞油、微生物油、粗油、又は組成物は、例えば食品、サプリメント、医薬品、化粧品、動物飼料等に用いることができる。本開示は、本開示にかかる細胞油、微生物油、粗油、又は組成物を含む医薬組成物、化粧用組成物、食品、サプリメント、又は動物飼料に関する。また、別の態様では、医薬として使用するための細胞油、微生物油、粗油、又は組成物にも関する。本開示の医薬品、化粧品、食品、サプリメント、又は動物飼料としての使用は、細胞老化又はシュタルガルト病の予防、治療又は寛解のために用いられうる。さらに別の態様では、本開示にかかる細胞油、微生物油、粗油、又は組成物を対象に投与することを含む、細胞老化又はシュタルガルト病の治療又は予防方法に関する。当該方法は、本開示にかかる細胞油、微生物油、粗油、又は組成物を、細胞老化又はシュタルガルト病に罹患している又は罹患するリスクのある対象に、投与することを含む。
　場合によって、本開示の細胞油、微生物油、粗油、又は組成物は、上述した医薬用途に用いられる他のいかなる治療剤（例えばコルチコステロイド等）と共に、投与されてもよい。
　本開示において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。本開示において「～」を用いて示された数値範囲は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示すものとする。本開示において、混合物中の各成分の含有率は、混合物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、混合物中に存在する当該複数の物質の合計の含有率を意味する。本開示において、パーセントに関して「以下」又は「未満」との用語は、下限値を特に記載しない限り０％、即ち「含有しない」場合を含み、又は、現状の手段では検出不可の値を含む範囲を含むことを意味する。
　本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
　以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
実施例１：マウス由来ＥＬＯＶＬ４遺伝子発現株の作製
　出芽酵母での発現のためにコドンを最適化したマウス（Mus muscules）由来のＥＬＯＶＬ４遺伝子（ACCESSION No. AF277093）（以下ＭｍＥＬＯＶＬ４と記載）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表３に示す配列番号１及び配列番号２のプライマー対を用いてＭｍＥＬＯＶＬ４遺伝子断片を増幅した。増幅した断片と、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩで切断したｐＹＥＳ２　ＮＴ／Ａベクター（Thermo Fisher SCIENTIFIC社）をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（TAKARA Clontech社）を用いて融合し、ＭｍＥＬＯＶ４遺伝子発現用プラスミドを構築した。
　なお、本発現用プラスミドは、Ｇａｌ１プロモーター配列、ＭｍＥＬＯＶＬ４遺伝子、ＣＹＣ１ターミネーター配列の順に連結したインサート配列と、ｕｒａ３遺伝子を含むｐＹＥＳ２　ＮＴ／Ａベクター配列からなる。
　作成したＭｍＥＬＯＶＬ４発現用プラスミドを酢酸リチウム法で出芽酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＩＮＶＳｃ１株（Thermo Fisher SCIENTIFIC社）に導入し、ウラシル要求性を指標に遺伝子組換え体を取得した。また、比較対象として、ｐＹＥＳ２　ＮＴ／Ａベクターを導入したＳ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＩＮＶＳｃ１株も取得した。
　酢酸リチウム法での導入は以下の通りの手順で行った：
　Ｓ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＩＮＶＳｃ１株を５ｍｌのＹＰＤ培地（Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ　２０ｇ／Ｌ，　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　１０ｇ／Ｌ，　Ｇｌｕｃｏｓｅ　２０ｇ／Ｌ）で２８℃、１８０ｒｐｍ、１６時間培養した。培養液０．５ｍｌを１．５ｍｌ遠心チューブに無菌的に採取し、３０００ｘｇ，３分間，遠心分離し、上清を捨てた。沈殿に１００μｌの酢酸リチウム溶液（０．２Ｍ酢酸リチウム、４０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール４０００、０．１Ｍ　Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）とともに１μｇのＭｍＥＬＯＶＬ４発現用プラスミドを加え、懸濁させた。懸濁液を入れた１．５ｍｌ遠心チューブを４３．５℃の水槽にて４５分間加温した。その後、ＳＤ－ｕｒａ寒天培地（Ｍｉｎｉｍａｌ　ＳＤ　Ａｇａｒ　Ｂａｓｅ（Takara Clontech社）４６．７ｇ／Ｌ、－Ｕｒａ　ＤＯ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Takara Clontech社）０．７７ｇ／Ｌ、精製寒天末（ナカライテスク）１５ｇ／Ｌ、ｐＨ５．８に調整））に全量塗布し、２８℃、２～３日間静置培養した。ＳＤ－ｕｒａ寒天培地上でコロニー形成したものを遺伝子組換え体候補株として取得し、各遺伝子の挿入の有無をＰＣＲ法による目的遺伝子増幅の有無を基準に判断した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例２：クロダイ由来ＥＬＯＶＬ４ｂ遺伝子発現株の作製
　出芽酵母での発現のためにコドンを最適化したクロダイ（Ａｃａｎｔｈｏｐａｇｒｕｓ　ｓｃｈｌｅｇｅｌｉｉ）由来のＥＬＯＶＬ４ｂ遺伝子（ACCESSION No. KU372150）（以下ＡｓＥＬＯＶＬ４ｂと記載）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表３に示す配列番号３及び配列番号４のプライマー対を用いてＡｓＥＬＯＶＬ４ｂ遺伝子断片を増幅した。増幅した断片と、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩで切断したｐＹＥＳ２　ＮＴ／Ａベクター（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　　ＨＤ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ　Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて融合し、ＡｓＥＬＯＶ４ｂ遺伝子発現用プラスミドを構築した。
　なお、本発現用プラスミドは、Ｇａｌ１プロモーター配列、ＡｓＥＬＯＶＬ４ｂ遺伝子、ＣＹＣ１ターミネーター配列の順に連結したインサート配列と、ｕｒａ３遺伝子を含むｐＹＥＳ２　ＮＴ／Ａベクター配列からなる。
　作成したＡｓＥＬＯＶＬ４ｂ発現用プラスミドを実施例１に記載した酢酸リチウム法で出芽酵母　Ｓ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＩＮＶＳｃ１株（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）に導入し、ウラシル要求性を指標に遺伝子組換え体を取得した。
実施例３：恒常発現型ＡｓＥＬＯＶＬ４ｂ遺伝子発現株の作製
　ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ　ｋｉｎａｓｅ　１プロモーター（以下ＰＧＫ１プロモーターと記載）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表３に示す配列番号５及び配列番号６のプライマー対を用いてＰＧＫ１プロモーター断片を増幅した。さらに、実施例２で作成したＡｓＥＬＯＶＬ４ｂ発現用プラスミドを鋳型として、表３に示す配列番号７及び配列番号８のプライマー対を用いて、Ｇａｌ１プロモーター配列以外のＡｓＥＬＯＶＬ４ｂ発現用ベクターの配列を増幅した。その後、増幅した各断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（TAKARA Clontech社製）を用いて融合し、恒常発現型ＡｓＥＬＯＶＬ４ｂ遺伝子発現用プラスミドを構築した。
　なお、本発現用プラスミドは、ＰＧＫ１プロモーター配列、ＡｓＥＬＯＶＬ４ｂ遺伝子、ＣＹＣ１ターミネーター配列の順に連結したインサート配列と、ｕｒａ３遺伝子を含むｐＹＥＳ２　ＮＴ／Ａベクター配列からなる。
作成した恒常発現型ＡｓＥＬＯＶＬ４ｂ発現用プラスミドを実施例１に記載した酢酸リチウム法で出芽酵母　Ｓ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＩＮＶＳｃ１株（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）に導入し、ウラシル要求性を指標に遺伝子組換え体を取得した。
実施例４：ＭｍＥＬＯＶＬ４およびＡｓＥＬＯＶＬ４ｂ遺伝子発現株によるＶＬＣ-ＰＵＦＡの生産
　実施例１および実施例２記載の方法で作成したＭｍＥＬＯＶＬ４遺伝子発現株、ＡｓＥＬＯＶＬ４ｂ遺伝子発現株、そしてｐＹＥＳ　ＮＴ／Ａベクター導入株をそれぞれ５ｍｌのＳＤ－ｕｒａ液体培地（Ｍｉｎｉｍａｌ　ＳＤ　Ａｇａｒ　Ｂａｓｅ（Takara Clontech社製）４６．７ｇ／Ｌ、－Ｕｒａ　ＤＯ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔａｋａｒａ　Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）０．７７ｇ／Ｌ、ｐＨ５．８に調整））で２８℃、１８０ｒｐｍ、１６時間培養した。各培養液０．１ｍｌを５ｍｌのウラシル制限ラフィノース液体培地（Ｍｉｎｉｍａｌ　ＳＤ　Ｂａｓｅ／　Ｒａｆ（Ｔａｋａｒａ　Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）　３７ｇ／Ｌ、－Ｕｒａ　ＤＯ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　０．７７ｇ／Ｌ、ｐＨ５．８に調整））に植菌し、培養液の濁度が１．０になるまで培養した。その後、４０％ガラクトース溶液を培養液の１／２０倍量添加し、さらにＥＰＡを培地の１／１０００倍量（５μｌ）添加した。ガラクトース溶液とＥＰＡ添加後にさらに２～５日間培養し、培養液全量を１５ｍｌ遠心チューブに無菌的に採取し、３０００ｘｇ，　３分間，　遠心分離し、細胞を回収した。その後、－８０℃で凍結した後に凍結乾燥機（ＴＡＩＴＥＣ社製、ＶＡ－１４０Ｓ）に供し、凍結乾燥細胞を得た。得られた凍結乾燥細胞の一部を脂肪酸組成測定用の試料として使用した。
　取得したＭｍＥＶ４遺伝子発現株、ＡｓＥＶ４ｂ遺伝子発現株、ｐＹＥＳ　ＮＴ／Ａ導入株の凍結乾燥細胞から、以下のようにして、総脂質、即ち微生物油Ａ、Ｂ、Ｃを得た。取得した微生物油Ａ～Ｃを脂肪酸メチルエステルへと変換し、脂肪酸分析に供した。
　Ｆｏｌｃｈらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙ．２２６：４９７－５０９（１９５７））に従って、クロロホルム：メタノール（２：１、ｖ／ｖ）で凍結乾燥菌体から総脂質を抽出した。得られた総脂質に対し、メチルエステル化して、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を得た。得られたＦＡＭＥに対して、ガスクロマトグラフィーによりＦＡＭＥ分析を行った。ガスクロマトグラフの条件は以下のとおりに設定した。
・カラム　　　ＤＢ－１７ht　０．２５０ｍｍ×３０ｍ、膜厚０．１５μｍ（アジレント・テクノロジー株式会社）
・キャリアーガス条件　　ヘリウム　１．０ｍｌ／分、分離比５０：１
・カラム温度条件　　１８０℃で５分、３２０℃まで１℃／分で昇温、３２０℃で１０分
・検出　　ＦＩＤ
・検出器温度　　３２０℃
・注入口温度　　３００℃
・注入量　　１μＬ
　また、ガスクロマトグラフィー質量分析の条件は以下のとおりに設定した。
＜ガスクロマトグラフィー分離条件＞
・装置　　　Ａｇｉｌｅｎｔ　７８９０Ｂ（アジレント・テクノロジー株式会社）
・カラム　　　ＤＢ－１７ht　０．２５０ｍｍ×３０ｍ、膜厚０．１５μｍ（アジレント・テクノロジー株式会社）
・キャリアーガス条件　　　コンスタントフロー、ヘリウム　１．０ｍｌ／分、分離比１０：１
・カラム温度条件　　　１８０℃で５分、３００℃まで４℃／分で昇温、３００℃で１０分
・注入口温度　　　３００℃
・注入量　　　１μＬ
＜質量分析条件＞
・検出　　　ＡＰＣＩ　ソース（（Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ　Ｐｒｅｓｓｕｒｅ　Ｇａｓ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＡＰＧＣ）（ウォーターズ株式会社）
・質量分析計　　　Ａ　Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ，　Ａ　Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ　Ｃｅｌｌ，　Ｔｉｍｅ　ｏｆ　Ｆｌｉｇｈｔ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｘｅｖｏ　Ｇ２－ＸＳ　ＱＴｏｆ）（ウォーターズ株式会社）
・イオン源　　　ＡＰＩ、Ｐｏｓｉｔｉｖｅモード、Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅモード
・データ取得モード　　　ＭＳE
・イオン化プロセス　　　wet(エタノール)
・衝突エネルギー　　　低エネルギー６ｅＶ、高エネルギー２０～５０eV ｍ／ｚ　５０－６５０
・コロナ電圧　　　３．０μＡ
・ソース温度　　　１５０℃
・コーン電圧　　　１０Ｖ
・ガス流量　　　１００Ｌ／ｈｒ
・補助ガス流量　　　１００Ｌ／ｈｒ
・解析ソフトウェア　　　ＭａｓｓＬｙｎｘ
また、各化合物の情報を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ＡＰＧＣ保持時間が１８．０３４分に相当する化合物について、化合物の推定ができず、かかる化合物を不純物Ｘとした。不純物の情報を以下に示す。
・ＡＰＧＣ保持時間　　　１８．０３４分
・推定化学式　　　Ｃ23Ｈ36Ｏ3
・測定ｍ／ｚ　　　［Ｍ＋Ｈ］+３６１．２７１０
　微生物油Ａ～Ｃの脂肪酸組成を表５に記載した。
　ＭｍＥＬＯＶＬ４発現株から取得した微生物油Ａから、ＥＰＡ由来のＶＬＣ－ＰＵＦＡであるＣ３０：５、Ｃ３２：５、Ｃ３４：５、Ｃ３６：５を検出することが出来なかった。
　一方、ＡｓＥＬＯＶＬ４ｂ発現株から取得した微生物油Ｂから、ＥＰＡの鎖長延長物であるＣ３２：５、Ｃ３４：５を検出することが出来た。微生物油Ｂは、Ｃ３２：５、Ｃ３４：５を全脂肪酸に対して、それぞれ０．３２面積％、０．４６面積％含有していた。ＥＰＡ由来の総ＶＬＣ－ＰＵＦＡ（Ｃ３２：５とＣ３４：５の合計値）と、宿主である出芽酵母由来の脂肪酸であるステアリン酸との比率（ステアリン酸／ＶＬＣ－ＰＵＦＡ）は、７．２０であった。さらに、ＥＰＡ由来の総ＶＬＣ－ＰＵＦＡ（Ｃ３２：５とＣ３４：５の合計値）と、不純物Ｘとの比率（不純物Ｘ／ＶＬＣ－ＰＵＦＡ）は、０．２６であった。また、ｐＹＥＳ２　ＮＴ／Ａ　導入株から取得した微生物油Ｃから、ＥＰＡ由来のＶＬＣ－ＰＵＦＡであるＣ３０：５、Ｃ３２：５、Ｃ３４：５、Ｃ３６：５を検出することが出来なかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
実施例５：恒常発現型ＡｓＥＬＯＶＬ４ｂ遺伝子発現株によるＶＬＣ－ＰＵＦＡの生産
　実施例３記載の方法で作成した恒常型ＡｓＥＬＯＶＬ４ｂ遺伝子発現株から、実施例４記載の方法で微生物油Ｄを取得し、脂肪酸分析に供した。比較として、実施例４で得られた微生物油Ｂ（誘導発現型プロモーター（Ｇａｌ１ｐｒｏｍｏｔｅｒ）型ＡｓＥＬＯＶＬ４ｂ遺伝子発現株）を使用した。
　微生物油ＢおよびＤの脂肪酸組成を表６に記載した。
　恒常発現型ＡｓＥＬＯＶＬ４ｂ発現株から取得した微生物油Ｄから、ＥＰＡ由来のＶＬＣ－ＰＵＦＡであるＣ３２：５、Ｃ３４：５を検出することが出来た。微生物油Ｄは、Ｃ３２：５、Ｃ３４：５を全脂肪酸の総面積値に対して、それぞれ０．３２面積％、０．２８面積％含有していた。ＥＰＡ由来の総ＶＬＣ－ＰＵＦＡ（Ｃ３２：５とＣ３４：５の合計値）と、宿主である出芽酵母由来の脂肪酸であるステアリン酸との比率（ステアリン酸／ＶＬＣ－ＰＵＦＡ）は、１５．５であった。さらに、ＥＰＡ由来の総ＶＬＣ－ＰＵＦＡ（Ｃ３２：５とＣ３４：５の合計値）と、不純物Ｘとの比率（不純物Ｘ／ＶＬＣ－ＰＵＦＡ）は、０．１７であった。
　以上の結果から、恒常発現型プロモーターを使用した場合、取得出来る微生物油に含まれるＶＬＣ－ＰＵＦＡの割合は増加せず、宿主由来の脂肪酸との比率が増加した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
実施例６：発現誘導時期の検討と、ＡｓＥＬＯＶＬ４ｂ遺伝子発現株によるＶＬＣ－ＰＵＦＡの生産
　実施例２記載の方法で作成したＡｓＥＬＯＶＬ４ｂ遺伝子発現株を５ｍｌのＳＤ－ｕｒａ液体培地で２８℃、１８０ｒｐｍ、１６時間培養した。培養液０．１ｍｌを５ｍｌのウラシル制限ラフィノース培地（Ｍｉｎｉｍａｌ　ＳＤ　Ｂａｓｅ／　Ｒａｆ（Ｔａｋａｒａ　Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）　３７ｇ／Ｌ、－Ｕｒａ　ＤＯ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　０．７７ｇ／Ｌ、ｐＨ５．８に調整））に植菌し、培養液の濁度がそれぞれ１．０、２．３、４．８、９．６、１１．２になるまで培養した。その後、４０％ガラクトース溶液を培養液の１／２０倍量添加し、さらにＥＰＡを培地の１／１０００倍量（５μｌ）添加した。ガラクトース溶液とＥＰＡ添加後にさらに２～５日間培養し、培養液全量を１５ｍｌ遠心チューブに無菌的に採取し、３０００ｘｇ，　３分間，　遠心分離し、細胞を回収した。その後、－８０℃で凍結した後に凍結乾燥機に供し、凍結乾燥細胞を得た。実施例４記載の方法に従って、ウラシル制限ラフィノース培地での培養液の濁度が１．０、２．３、４．８、９．６．１１．２であるＡｓＥＬＯＶＬ４ｂ発現株の凍結乾燥細胞から、それぞれ微生物油Ｅ～Ｉを取得し、脂肪酸分析に供した。微生物油Ｅ～Ｉの脂肪酸組成を表７に記載した。
　微生物油Ｅ～Ｈで、ＥＰＡ由来のＶＬＣ－ＰＵＦＡであるＣ３０：５、Ｃ３２：５、Ｃ３４：５を検出することが出来た。微生物油ＩでＥＰＡ由来のＶＬＣ－ＰＵＦＡであるＣ３２：５、Ｃ３４：５を検出することが出来た。
　微生物油Ｆ、Ｇ、Ｈにおいて、Ｃ３０：５、Ｃ３２：５、Ｃ３４：５の全脂肪酸の総面積値に対する割合が微生物油Ｅ、Ｉと比較して高かった。
　さらに、ＥＰＡ由来の総ＶＬＣ－ＰＵＦＡ（Ｃ３０：５、Ｃ３２：５、Ｃ３４：５の合計値）と、宿主である出芽酵母由来の脂肪酸であるステアリン酸との比率（ステアリン酸ＶＬＣ－ＰＵＦＡ）も微生物油Ｅ、Ｉと比較して低く、６未満に低減することが出来た。
さらに、ＥＰＡ由来の総ＶＬＣ－ＰＵＦＡ（Ｃ３２：５とＣ３４：５の合計値）と、不純物Ｘとの比率（不純物Ｘ／ＶＬＣ－ＰＵＦＡ）は、０．１６未満であった。
　以上の結果から、誘導型プロモーターを使用し、その発現誘導の時期を培養液の濁度が２．３～９．６とすることで、取得出来る微生物油に含まれるＶＬＣ－ＰＵＦＡの割合を増加させ、宿主由来の脂肪酸との比率を低減し、不純物Ｘとの比率も低減することが出来た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
実施例７：添加するＰＵＦＡの検討
実施例２記載の方法で作成したＡｓＥＬＯＶＬ４ｂ遺伝子発現株を、添加するＰＵＦＡをアラキドン酸（ＡＲＡ）に変えて、実施例６記載の方法で培養し、ウラシル制限ラフィノース培地での培養液の濁度が４．８であるＣｇＥＬＯＶＬ４発現株の凍結乾燥細胞から、微生物油Ｊを取得し、脂肪酸分析に供した。
微生物油Ｊの脂肪酸組成を表８に載した。
ＡｓＥＬＯＶＬ４ｂ発現株から取得した微生物油Ｊから、ＡＲＡ由来のＶＬＣ－ＰＵＦＡであるＣ３０：４、Ｃ３２：４、Ｃ３４：４を検出することが出来た。微生物油Ｊは、Ｃ３０：４、Ｃ３２：４、Ｃ３４：４を全脂肪酸の総面積値に対して、それぞれ０．５８面積％、０．８６面積％、０．１５面積％含有していた。
ＡＲＡ由来の総ＶＬＣ－ＰＵＦＡ（Ｃ３０：４、Ｃ３２：４、Ｃ３４：４の合計値）と、宿主である出芽酵母由来の脂肪酸であるステアリン酸との比率（ステアリン酸ＶＬＣ－ＰＵＦＡ）は、２．４であった。
さらに、ＡＲＡ由来の総ＶＬＣ－ＰＵＦＡ（Ｃ３２：５とＣ３４：５の合計値）と、不純物Ｘ２との比率（不純物Ｘ２ＶＬＣ－ＰＵＦＡ）は、０．１６未満であった。
　これにより、ＥＰＡ以外のＰＵＦＡを基質として、ＶＬＣ－ＰＵＦＡを生産することも可能であることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
実施例８：ＣｇＥＬＯＶＬ４ａ遺伝子発現株によるＶＬＣ－ＰＵＦＡの生産
　出芽酵母での発現のためにコドンを最適化したアフリカンクララ（Ｃｌａｒｉａｓ　ｇａｒｉｅｐｉｎｕｓ）由来のＥＬＯＶＬ４ａ遺伝子（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　Ｎｏ．　ＫＹ８０１２８４）（以下ＣｇＥＬＯＶＬ４ａと記載）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表３に示す配列番号９及び配列番号１０のプライマー対を用いてＣｇＥＬＯＶＬ４ａ遺伝子断片を増幅した。増幅した断片と、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩで切断したｐＹＥＳ２　ＮＴ／Ａベクター（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　　ＨＤ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ　Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて融合し、ＣｇＥＬＯＶ４遺伝子発現用プラスミドを構築した。
　なお、本発現用プラスミドは、Ｇａｌ１プロモーター配列、ＣｇＥＬＯＶＬ４a遺伝子、ＣＹＣ１ターミネーター配列の順に連結したインサート配列と、ｕｒａ３遺伝子を含むｐＹＥＳ２　ＮＴ／Ａベクター配列からなる。
作成したＣｇＥＬＯＶＬ４a発現用プラスミドを実施例１に記載した酢酸リチウム法で出芽酵母　Ｓ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＩＮＶＳｃ１株（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）に導入し、ウラシル要求性を指標に遺伝子組換え体を取得した。
取得したＣｇＥＬＯＶＬ４a遺伝子発現株を実施例６記載の方法で培養し、ウラシル制限ラフィノース培地での培養液の濁度が４．８であるＣｇＥＬＯＶＬ４a発現株の凍結乾燥細胞から、微生物油Ｋを取得し、脂肪酸分析に供した。
微生物油Ｋの脂肪酸組成を表９に記載した。
　ＣｇＥＬＯＶＬ４a発現株から取得した微生物油Ｋから、ＥＰＡ由来のＶＬＣ－ＰＵＦＡであるＣ３２：５、Ｃ３４：５、Ｃ３６：５を検出することが出来た。微生物油Ｋは、Ｃ３２：５、Ｃ３４：５、Ｃ３６：５を全脂肪酸の総面積値に対して、それぞれ０．１６面積％、０．７９面積％、０．５９面積％含有していた。ＥＰＡ由来の総ＶＬＣ－ＰＵＦＡ（Ｃ３２：５とＣ３４：５とＣ３６：５の合計値）と、宿主である出芽酵母由来の脂肪酸であるステアリン酸との比率（ステアリン酸ＶＬＣ－ＰＵＦＡ）は、４．８であった。さらに、ＥＰＡ由来の総ＶＬＣ－ＰＵＦＡ（Ｃ３２：５とＣ３４：５とＣ３６：５の合計値）と、不純物Ｘとの比率（不純物Ｘ／ＶＬＣ－ＰＵＦＡ）は、０．１２であった。
これにより、クロダイ以外のＥＬＯＶＬ４を使用することで、発明の効果を保持したまま、Ｃ３６：５を含む新たなＶＬＣ－ＰＵＦＡ含有微生物油を取得出来ることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010

Claims (76)

  1. 　ＰＵＦＡ鎖長延長酵素を発現させた細胞及び／又はその破砕物と、
    炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体を含む、組成物。
  2. 　前記炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸が、以下の：
    （１）　炭素数３０の多価不飽和脂肪酸；
    （２）　炭素数３２の多価不飽和脂肪酸；
    （３）　炭素数３４の多価不飽和脂肪酸；及び
    （４）　炭素数３６の多価不飽和脂肪酸；
    　からなる群から選ばれる少なくとも１の多価不飽和脂肪酸を含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 　（１）～（４）からなる群より選ばれる１種の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の含有率が、０．５面積％以上である、請求項２に記載の組成物。
  4. 　（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の含有率が１．０面積％以上、１．５面積％以上、２．０面積％以上、又は２．５面積％以上である、請求項２又は３に記載の組成物。
  5. 　（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の総含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、６．０未満、５．０未満、２．５未満、又は２．０未満である、請求項２～４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 　前記組成物中の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体が、以下の条件：
    （１）　炭素数３０の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、５０未満、３０未満、２０未満、又は１０未満であり；
    （２）　炭素数３２の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、１５未満、１０未満、又は５未満であり；
    （３）　炭素数３４の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、１０未満、５未満、又は２未満であり；及び
    （４）　炭素数３６の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、２０未満である；
    　のうちの少なくとも１を満たす、請求項２～５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 　化学式がＣ２３Ｈ３６Ｏ３である不純物を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 　コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの含有率が、組成物の全重量に対して７０重量％以上である、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 　コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの構成脂肪酸の少なくとも一つの脂肪酸が（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸である、請求項２～８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 　コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの構成脂肪酸の少なくとも一つの脂肪酸が（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸であり、コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの構成脂肪酸のうち、（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸以外の脂肪酸が、炭化水素数が８～２２の脂肪酸である、請求項２～９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 　０．５％面積％以上のＰＵＦＡを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 　前記ＰＵＦＡが、外部添加された非生産のＰＵＦＡを含む、請求項１１に記載の組成物。
  13. 　前記細胞が、酵母である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 　前記ＰＵＦＡ鎖長延長酵素が、以下の：
    ａ）非哺乳動物ＥＬＯＶＬ４；又は
    ｂ）非哺乳動物ＥＬＯＶＬ４をコードするアミノ酸配列に対し、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つＰＵＦＡ鎖長延長活性を有する、タンパク質
    である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 　前記ＰＵＦＡ鎖長延長酵素の遺伝子が、誘導型プロモーターによって発現されている、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 　炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の含有率が１．０面積％以上、１．５面積％以上、２．０面積％以上、又は２．５面積％以上を含む粗油。
  17. 　前記炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸が、以下の：
    （１）　炭素数３０の多価不飽和脂肪酸；
    （２）　炭素数３２の多価不飽和脂肪酸；
    （３）　炭素数３４の多価不飽和脂肪酸；及び
    （４）　炭素数３６の多価不飽和脂肪酸；
    　からなる群から選ばれる少なくとも１の多価不飽和脂肪酸を含む、請求項１６に記載の粗油。
  18.  （１）～（４）からなる群より選ばれる１種の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の含有率が、０．５面積％以上である、請求項１７に記載の粗油。
  19. 　（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の含有率が１．０面積％以上、１．５面積％以上、２．０面積％以上、又は２．５面積％以上である、請求項１７又は１８に記載の粗油。
  20. 　（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の総含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、６．０未満、５．０未満、２．５未満、又は２．０未満である、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の粗油。
  21. 　前記粗油中の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体が、以下の条件：
    （１）　炭素数３０の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、５０未満、３０未満、２０未満、又は１０未満であり；
    （２）　炭素数３２の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、１５未満、１０未満、又は５未満であり
    （３）　炭素数３４の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、１０未満、５未満、又は２未満であり；及び
    （４）　炭素数３６の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、２０未満である；
    　のうちの少なくとも１を満たす、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の粗油。
  22. 　化学式がＣ２３Ｈ３６Ｏ３である不純物を含む、請求項１６～２１のいずれか一項に記載の粗油。
  23. 　コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの含有率が、全重量に対して７０重量％以上である、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の粗油。
  24. 　コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの構成脂肪酸の少なくとも一つの脂肪酸が（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸である、請求項１７～２３のいずれか一項に記載の粗油。
  25. 　コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの構成脂肪酸の少なくとも一つの脂肪酸が（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸であり、コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの構成脂肪酸のうち、（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸以外の脂肪酸が、炭化水素数が８～２２の脂肪酸である、請求項１７～２４のいずれか一項に記載の粗油。
  26. 　０．５面積％以上のＰＵＦＡを含む、請求項１６～２５のいずれか一項に記載の粗油。
  27. 　前記ＰＵＦＡが、外部添加された非生産のＰＵＦＡを含む、請求項２６に記載の粗油。
  28. 　前記粗油が、酵母由来の粗油である、請求項１６～２７のいずれか一項に記載の粗油。
  29. 　前記酵母が、ＰＵＦＡ鎖長延長酵素遺伝子を発現させた酵母である、請求項２８に記載の粗油。
  30. 　前記ＰＵＦＡ鎖長延長酵素遺伝子が、誘導型プロモーターによって発現されている、請求項２９に記載の粗油。
  31. 　前記ＰＵＦＡ鎖長延長酵素遺伝子が、以下の：
    ａ）非哺乳動物ＥＬＯＶＬ４をコードするポリヌクレオチド；又は
    ｂ）非哺乳動物ＥＬＯＶＬ４をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に対し、少なくとも９０％の配列同一性を有する塩基配列のポリヌクレオチドであって、当該ポリヌクレオチドがコードするタンパク質がＰＵＦＡ鎖長延長活性を有する、
    　を含む、請求項２９又は３０に記載の粗油。
  32. 　炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の含有率が１．０面積％以上、１．５面積％以上、２．０面積％以上、又は２．５面積％以上、且つ、アシルコレステロール、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの合計の含有率が７０重量％以上である組成物。
  33. 　前記炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸が、以下の：
    （１）　炭素数３０の多価不飽和脂肪酸；
    （２）　炭素数３２の多価不飽和脂肪酸；
    （３）　炭素数３４の多価不飽和脂肪酸；及び
    （４）　炭素数３６の多価不飽和脂肪酸；
    　からなる群から選ばれる少なくとも１の多価不飽和脂肪酸を含む、請求項３２に記載の組成物。
  34. 　（１）～（４）からなる群より選ばれる１種の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の含有率が、０．５面積％以上である、請求項３３に記載の組成物。
  35. 　（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の含有率が１．０面積％以上、１．５面積％以上、２．０面積％以上、又は２．５面積％以上の炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体を含む、請求項３３又は３４に記載の組成物。
  36. 　（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の総含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、６．０未満、５．０未満、２．５未満、又は２．０未満である、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の組成物。
  37. 　前記組成物中の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体が、以下の条件：
    （１）　炭素数３０の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、５０未満、３０未満、２０未満、又は１０未満であり；
    （２）　炭素数３２の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、１５未満、１０未満、又は５未満であり；
    （３）　炭素数３４の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、１０未満、５未満、又は２未満であり；及び
    （４）　炭素数３６の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、２０未満である；
    　のうちの少なくとも１を満たす、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の組成物。
  38. 　化学式がＣ２３Ｈ３６Ｏ３である不純物を含む、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の組成物。
  39. 　コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの含有率が、組成物の全重量に対して７０重量％以上である、請求項３２～３８のいずれか一項に記載の組成物。
  40. 　コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの構成脂肪酸の少なくとも一つの脂肪酸が（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸である、請求項３３～３９のいずれか一項に記載の組成物。
  41. 　コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの構成脂肪酸の少なくとも一つの脂肪酸が（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸であり、コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの構成脂肪酸のうち、（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸以外の脂肪酸が、炭化水素数が８～２２の脂肪酸である、請求項３３～４０のいずれか一項に記載の組成物。
  42.  ０．５面積％以上のＰＵＦＡを含む、請求項３２～４１のいずれか一項に記載の組成物。
  43. 　前記ＰＵＦＡが、外部添加された非生産のＰＵＦＡを含む、請求項４２に記載の組成物。
  44.  炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の含有率が１．０面積％以上、１．５面積％以上、２．０面積％以上、又は２．５面積％以上である、微生物油。
  45.  前記炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸が以下の：
    （１）　炭素数３０の多価不飽和脂肪酸；
    （２）　炭素数３２の多価不飽和脂肪酸；
    （３）　炭素数３４の多価不飽和脂肪酸；及び
    （４）　炭素数３６の多価不飽和脂肪酸；
    　からなる群から選ばれる少なくとも１の多価不飽和脂肪酸を含む、請求項４４に記載の微生物油。
  46.  （１）～（４）からなる群より選ばれる１種の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の含有率が、０．５面積％以上である、請求項４５に記載の微生物油。
  47. 　（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の含有率が１．０面積％以上、１．５面積％以上、２．０面積％以上、又は２．５面積％以上の炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体を含む、請求項４５又は４６に記載の微生物油。
  48. 　前記微生物油中、（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の総含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、６．０未満、５．０未満、２．５未満、又は２．０未満である、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の微生物油。
  49. 　前記微生物油中の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体が、以下の条件：
    （１）　炭素数３０の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、５０未満、３０未満、２０未満、又は１０未満であり；
    （２）　炭素数３２の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、１５未満、１０未満、又は５未満であり
    （３）　炭素数３４の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、１０未満、５未満、又は２未満であり；及び
    （４）　炭素数３６の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、２０未満である；
    　のうちの少なくとも１を満たす、請求項４５～４８のいずれか一項に記載の微生物油。
  50. 　化学式がＣ２３Ｈ３６Ｏ３である不純物を含む、請求項４４～４８のいずれか一項に記載の微生物油。
  51. 　コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの含有率が、全重量に対して７０重量％以上である、請求項４４～５０のいずれか一項に記載の微生物油。
  52. 　コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの含有率が、全重量に対して７０重量％以上である、請求項４４～５１のいずれか一項に記載の微生物油。
  53. 　コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの構成脂肪酸の少なくとも一つの脂肪酸が（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸である、請求項４５～５２のいずれか一項に記載の微生物油。
  54. 　コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの構成脂肪酸の少なくとも一つの脂肪酸が（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸であり、コレステロールエステル、リン脂質、糖脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの構成脂肪酸のうち、（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸以外の脂肪酸が、炭化水素数が８～２２の脂肪酸である、請求項４５～５３のいずれか一項に記載の微生物油。
  55. 　０．５面積％以上のＰＵＦＡを含む、請求項４４～５４のいずれか一項に記載の微生物油。
  56. 　前記ＰＵＦＡが、外部添加された非生産のＰＵＦＡを含む、請求項５５に記載の微生物油。
  57. 　微生物油が粗油である、請求項４４～５６のいずれか一項に記載の微生物油。
  58. 　微生物油が酵母油である、請求項４４～５７のいずれか一項に記載の微生物油。
  59. 　前記酵母油が、ＰＵＦＡ鎖長延長酵素遺伝子を発現させた酵母由来の油である、請求項５８に記載の微生物油。
  60. 　前記ＰＵＦＡ鎖長延長酵素遺伝子が、誘導型プロモーターによって発現されている、請求項５９に記載の微生物油。
  61. 　前記ＰＵＦＡ鎖長延長酵素遺伝子が、
    ａ）非哺乳動物ＥＬＯＶＬ４をコードするポリヌクレオチド；又は
    ｂ）非哺乳動物ＥＬＯＶＬ４をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に対し、少なくとも９０％の配列同一性を有する塩基配列のポリヌクレオチドであって、当該ポリヌクレオチドがコードするタンパク質がＰＵＦＡ鎖長延長活性を有する、ポリヌクレオチド
    　を含む、請求項５９又は６０に記載の微生物油。
  62.  ＰＵＦＡ鎖長延長酵素の発現系を細胞に導入する工程、
    前記導入済細胞をＶＬＣ－ＰＵＦＡ高含有となる状態に調整する工程、
    前記調整済細胞でＰＵＦＡ鎖長延長酵素の発現を誘導する工程、
    を含む、多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の製造方法。
  63. 　前記細胞が、酵母である、請求項６２に記載の製造方法。
  64. 　前記ＰＵＦＡ鎖長延長酵素が、非哺乳動物ＥＬＯＶＬ４である、請求項６２又は６３に記載の製造方法。
  65. 　前記ＰＵＦＡ鎖長延長酵素の遺伝子が、誘導型プロモーターによって発現されている、請求項６２～６４のいずれか一項に記載の製造方法。
  66. 　前記誘導型プロモーターが、ガラクトース誘導性であり、ガラクトースの添加によりeｌｏｖｌ４遺伝子発現が誘導される、請求項６５に記載の製造方法。
  67. 　前記ＶＬＣ－ＰＵＦＡ高含有となる状態に調整する工程が、炭素鎖長１８～２２多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体を含む培地で培養する工程である、請求項６２～６６のいずれか一項に記載の製造方法。
  68. 　ＰＵＦＡ鎖長延長酵素の発現が、培養液の濁度１．５～１１の範囲で誘導される、請求項６２～６７のいずれか一項に記載の製造方法。
  69. 　製造される多価不飽和脂肪酸が、炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体を含む、請求項６２～６８のいずれか一項に記載の製造方法。
  70. 　前記炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸が、以下の：
    （１）　炭素数３０の多価不飽和脂肪酸；
    （２）　炭素数３２の多価不飽和脂肪酸；
    （３）　炭素数３４の多価不飽和脂肪酸；及び
    （４）　炭素数３６の多価不飽和脂肪酸；
    　からなる群から選ばれる少なくとも１の多価不飽和脂肪酸を含む、請求項６９に記載の製造方法。
  71.  （１）～（４）からなる群より選ばれる１種の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の含有率が、０．５面積％以上である、請求項７０に記載の製造方法。
  72. 　（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の含有率が１．０面積％以上、１．５面積％以上、２．０面積％以上、又は２．５面積％以上の炭素数３０以上の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体を含む、請求項７０又は７１に記載の製造方法。
  73. 　（１）～（４）の多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体の総含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、６．０未満、５．０未満、２．５未満、又は２．０未満である、請求項７０～７２のいずれか一項に記載の製造方法。
  74. 　多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体が、以下の条件：
    （１）　炭素数３０の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、５０未満、３０未満、２０未満、又は１０未満であり；
    （２）　炭素数３２の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、１５未満、１０未満、又は５未満であり；
    （３）　炭素数３４の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、１０未満、５未満、又は２未満であり；及び
    （４）　炭素数３６の多価不飽和脂肪酸、及び/又はその誘導体の含有率に対するステアリン酸及び/又はその誘導体の含有率の比が、２０未満である；
    　のうちの少なくとも１を満たす、請求項７０～７３のいずれか一項に記載の製造方法。
  75. 　前記多価不飽和脂肪酸及び/又はその誘導体が、化学式がＣ２３Ｈ３６Ｏ３である不純物を含む、請求項７０～７４のいずれか一項に記載の製造方法。
  76. 　請求項６２～７５のいずれか一項に記載の方法により製造された微生物油。
PCT/JP2022/004520 2021-02-05 2022-02-04 超長鎖多価不飽和脂肪酸組成物 WO2022168958A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022579628A JPWO2022168958A1 (ja) 2021-02-05 2022-02-04
EP22749829.2A EP4289957A1 (en) 2021-02-05 2022-02-04 Ultra-long-chain polyunsaturated fatty acid composition
US18/230,530 US20240011061A1 (en) 2021-02-05 2023-08-04 Very Long Chain Polyunsaturated Fatty Acid Composition

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021017675 2021-02-05
JP2021-017675 2021-02-05

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US18/230,530 Continuation US20240011061A1 (en) 2021-02-05 2023-08-04 Very Long Chain Polyunsaturated Fatty Acid Composition

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022168958A1 true WO2022168958A1 (ja) 2022-08-11

Family

ID=82741578

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2022/004520 WO2022168958A1 (ja) 2021-02-05 2022-02-04 超長鎖多価不飽和脂肪酸組成物

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20240011061A1 (ja)
EP (1) EP4289957A1 (ja)
JP (1) JPWO2022168958A1 (ja)
WO (1) WO2022168958A1 (ja)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011053892A1 (en) 2009-10-31 2011-05-05 Martek Biosciences Corporation Synthesis and use of omega-3 and omega-6 very long chain polyunsaturated fatty acids (vlc-pufa)
US20120071558A1 (en) 2008-01-28 2012-03-22 Anderson Robert E Compositions of very long chain polyunsaturated fatty acids and methods of use
JP2012509059A (ja) 2008-11-18 2012-04-19 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼイション オメガ−３脂肪酸を産生するための酵素および方法
JP2018514644A (ja) 2015-05-13 2018-06-07 エーパックス ノルウェー アクスイェ セルスカプ 天然油由来の超長鎖多価不飽和脂肪酸
US20200009100A1 (en) 2017-03-20 2020-01-09 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Very-long-chain polyunsaturated fatty acids, elovanoid hydroxylated derivatives, and methods of use
WO2020117070A1 (en) 2018-12-06 2020-06-11 Epax Norway As Very long chain fatty acid compositions

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120071558A1 (en) 2008-01-28 2012-03-22 Anderson Robert E Compositions of very long chain polyunsaturated fatty acids and methods of use
JP2012509059A (ja) 2008-11-18 2012-04-19 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼイション オメガ−３脂肪酸を産生するための酵素および方法
WO2011053892A1 (en) 2009-10-31 2011-05-05 Martek Biosciences Corporation Synthesis and use of omega-3 and omega-6 very long chain polyunsaturated fatty acids (vlc-pufa)
JP2018514644A (ja) 2015-05-13 2018-06-07 エーパックス ノルウェー アクスイェ セルスカプ 天然油由来の超長鎖多価不飽和脂肪酸
US20200009100A1 (en) 2017-03-20 2020-01-09 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Very-long-chain polyunsaturated fatty acids, elovanoid hydroxylated derivatives, and methods of use
WO2020117070A1 (en) 2018-12-06 2020-06-11 Epax Norway As Very long chain fatty acid compositions

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, vol. 1801, 2010, pages 1145 - 1154
COMPARATIVE BIOCHEMISTRY AND PHYSIOLOGY, vol. 212, 2017, pages 41 - 50
FOLCH ET AL., J. BIOLOGICAL AND CHEMISTRY, vol. 226, 1957, pages 497 - 509
LIPIDS, vol. 52, 2017, pages 837 - 848
MOL VIS., vol. 9, 3 July 2003 (2003-07-03), pages 301 - 307
OBOH ANGELA; NAVARRO JUAN C.; TOCHER DOUGLAS R.; MONROIG OSCAR: "Elongation of very Long-Chain (>C24) Fatty Acids inClarias gariepinus: Cloning, Functional Characterization and Tissue Expression ofelovl4Elongases", LIPIDS, SPRINGER, DE, vol. 52, no. 10, 30 August 2017 (2017-08-30), DE , pages 837 - 848, XP036328483, ISSN: 0024-4201, DOI: 10.1007/s11745-017-4289-3 *
PNAS, vol. 105, no. 35, 2008, pages 12843 - 12848
PNAS, vol. 98, no. 25, 4 December 2001 (2001-12-04), pages 14304 - 14309
POLYUNSATURATED FATTY ACID METABOLISM, 2018, pages 31 - 60

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2022168958A1 (ja) 2022-08-11
EP4289957A1 (en) 2023-12-13
US20240011061A1 (en) 2024-01-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5954544B2 (ja) 脂質の生産のための遺伝的に改変された生物
Chen et al. Fatty acid and lipid class composition of the eicosapentaenoic acid-producing microalga, Nitzschia laevis
JP7308805B2 (ja) ジホモ－γ－リノレン酸含有微生物油及びジホモ－γ－リノレン酸含有微生物菌体
Iskandarov et al. Selection of a DGLA-producing mutant of the microalga Parietochloris incisa: I. Identification of mutation site and expression of VLC-PUFA biosynthesis genes
KR102202287B1 (ko) 미세조류 시조카이트리움 만그로베이의 바이오매스 및 이의 제조 방법
US20180312888A1 (en) Transgenic microalgae with increased production of at least one omega-3 long chain polyunsaturated fatty acid
US20230127275A1 (en) Production of short chain fatty acids
Liu et al. Metabolic engineering of the oleaginous alga Nannochloropsis for enriching eicosapentaenoic acid in triacylglycerol by combined pulling and pushing strategies
Řezanka et al. Enantiomeric separation of triacylglycerols containing very long chain fatty acids
WO2022168958A1 (ja) 超長鎖多価不飽和脂肪酸組成物
Irmak et al. Determination of the fatty-acid composition of four native microalgae species
JP2001245687A (ja) ｎ−４系及び／又はｎ−７系高度不飽和脂肪酸を含有する脂質及びその製造方法
EP2580229A2 (en) D5 desaturase-defective mutant gene and use thereof
WO2020138480A1 (ja) アラキドン酸含量が低減されたジホモ－γ－リノレン酸含有微生物油

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22749829

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022579628

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022749829

Country of ref document: EP

Effective date: 20230905