WO2022167601A1 - Device and method for photometric mass measurement - Google Patents

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WO2022167601A1
WO2022167601A1 PCT/EP2022/052752 EP2022052752W WO2022167601A1 WO 2022167601 A1 WO2022167601 A1 WO 2022167601A1 EP 2022052752 W EP2022052752 W EP 2022052752W WO 2022167601 A1 WO2022167601 A1 WO 2022167601A1
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laser light
examined
light
frequency
laser
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PCT/EP2022/052752
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Axel Schönbeck
Roman Schnabel
Roland Thünauer
Jens Bosse
Jan Südbeck
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Universität Hamburg
Heinrich-Pette-Institut
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    • G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
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    • G01N2021/4704—Angular selective
    • G01N2021/4707—Forward scatter; Low angle scatter

Definitions

  • the present invention relates to a device and a method for photometric mass determination, the objects to be examined being individual biomolecules and/or viruses.
  • interferometric techniques are used for the photometric determination of the mass of biomolecules and viruses.
  • Such a so-called “mass photometry” provides that the object to be measured is located near the surface of a glass sample holder. Using a high-quality but conventional laser beam, light falls through the transparent slide (sample slide) onto the object to be measured and is scattered or diffracted by it.
  • the word scattering also includes diffraction. Some of the scattered light is reflected back together with light reflected from the adjacent glass surface. Scattered light and reflected light interfere. Finally, the interference pattern is detected with a CMOS camera.
  • a basically similar setup for the interferometric scattering method is known from Kukura Philipp et al., “High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus”, Nature Methods, vol. 6, no. 12, December 2009, 923-27.
  • the setup shown here serves to detect the backscattered light and also to measure the virus marked with a quantum dot.
  • WO 2017/041809 A1 describes the detection of individual proteins, in which the proteins are separated with regard to specific properties such as mass, charge, shape etc. and then examined interferometrically, with the scattered light interfering with the reflected light (iSCAT).
  • GB 25 52 195 A discloses an iSCAT microscope in which the amplitude of a reference field is influenced with the aid of a filter and optimized for detection.
  • the invention is based on the object of providing a device and method for photometric mass determination which have an improved signal-to-noise ratio.
  • the object is achieved by a device having the features of claim 1 and by a method having the features of claim 14.
  • the device according to the invention is a photometric mass determination device.
  • the device according to the invention is a mass determination device which carries out a mass determination according to photometric principles.
  • the device has at least one laser source and an optical measuring device that is suitable for measuring an incident light beam.
  • the at least one laser source is aimed at the object to be examined, which can consist of a single biomolecule, a virus or the like.
  • the optical measuring device is also designed to detect scattered laser light on the object to be examined, which interferes with non-scattered laser light.
  • the laser beam has squeezed laser light. When speaking of scattered laser light, this not only refers to an interaction with structures whose dimensions exceed the wavelength of the light, but also to interactions with structures whose dimensions are smaller, sometimes significantly smaller, than the wavelength of the laser light. Thus, scattering also includes diffraction phenomena.
  • Squeezed light also known as squeezed light
  • squeezed light is a special quantum state whose fuzziness is reduced for some phases and increased for others compared to a coherent state.
  • the coherent, classic laser light has a photon number statistic, which is a Poisson distribution.
  • the distribution has a certain standard deviation around a mean value that depends on the laser power.
  • a certain power-dependent number of photons is detected per time interval. If the average laser power remains the same, the measured number of photons fluctuates from measurement interval to measurement interval around the mean value according to the Poisson-distributed counting statistics.
  • the photon count statistics correspond to the already mentioned shot noise.
  • the extremely weak signals, which are to be expected from scattering from individual molecules, correspond to only a few photons.
  • Squeezed light is a special quantum mechanical state of laser light, which shows a reduced width of the photon counting statistics.
  • This squashed distribution is also known as sub-Poissonian.
  • the standard deviation of the distribution for squeezed laser light is reduced compared to conventional lasers, whereby the average laser power and thus the signal are not affected. With squeezed laser light, there is a reduction in the shot noise and thus an improved signal-to-noise ratio.
  • back-directed laser light and scattered light falls into the optical measuring device as back-reflected laser light together with back-scattered laser light.
  • the laser light passes through the object to be examined, is partially scattered, is then thrown back together with forward-scattered light on a preferably highly reflectively coated substrate and is scattered again on the object.
  • the reflected laser light contains a large part of the incident light as well as light scattered backwards and forwards on the object. Similar to typical iSC AT setups, the reflected light is detected here, but the reflection coefficients in conventional iSC AT setups are very small, so that it is not possible to use squeezed light in a typical iSCAT setup.
  • the attachment in front of the substrate also includes the case that the object to be examined is arranged directly on the substrate.
  • the object to be examined can also be applied directly to the highly reflective substrate, for example in a liquid.
  • a cover glass provided for the object to be examined can preferably also be equipped with an anti-reflection coating, so that losses are also minimized here and the use of squeezed laser light according to the invention is possible.
  • transmitted laser light falls into the optical measuring device together with light scattered forward on the object.
  • the light shines through the slide of the object to be examined, interferes with light scattered in the forward direction and is measured together with this.
  • known measuring devices for photometric mass determination such as iSCAT, always focus on interference with the reflected light beam.
  • the method according to the invention is based on an interference of the light scattered or diffracted in the forward direction with the transmitted light beam. This procedure has the advantage, particularly when using squeezed laser light, that the quantum mechanical state with its narrow (squeezed) number of photons is retained and is not canceled out by a division into different directions. A highly reflective mirror is not required.
  • the laser light directed onto the object to be examined is guided over a spatial region of the sample at a predetermined frequency.
  • a scanning movement takes place in a scanning area. With a sample that is centered in the scanning area, the laser light well is illuminated, two scattering processes take place during one period.
  • an evaluation device is preferably based on measurement signals with twice the scanning frequency in the case of the optical measuring device. If the target is not in the middle of the scan range, the same signal is produced at two unequal frequencies, the sum of which corresponds to twice the scan frequency. If several objects are scanned, additional frequencies are generated. Signals that cannot be assigned to these frequencies do not come from objects in the scanning area, but from the laser source itself, for example, and are thus recognized as false signals. If only twice the scanning frequency is available, this is proof that a centered object is measured in an optimal manner.
  • the scan area is actively centered over the object by maximizing the signal at twice the scan frequency.
  • a control unit can be provided which is designed to adjust the scanned area of the object to be examined in such a way that a component of the signal with double the frequency compared to other components of the signal is maximized. This adjustment can take place on the one hand on the object side, or by a corresponding change in the deflection of the laser beam, so that a center point of the scanning area for the laser light is shifted.
  • the control unit ensures that the laser light is scattered twice on the object to be examined during the scanning movement. If the object to be examined is located, for example, in the edge area of the scanning laser beam, the case can arise that the scattered light is detected only once.
  • the measurement signal is then amplified at twice the scanning frequency by shifting the scanning area in relation to the object to be examined or vice versa.
  • a frequency generator which also generates twice the frequency for the predetermined frequency. Since the measurement signal of optical measuring device is a very weak signal, it is important to be able to generate the frequency signals with great accuracy both in the movement of the laser light and in the evaluation of the signals of the optical measuring device.
  • the measurement signals are preferably evaluated via a lock-in amplifier to which a signal with twice the frequency is present as a reference signal.
  • the phase of the reference signal can be determined in a manner known per se. With the use of a lock-in amplifier, the occurring, very weak electrical signals of the optical measuring device can be amplified and evaluated.
  • a photodiode (PIN photodiode) is provided as the optical measuring device, which preferably has a quantum efficiency of over 50% and can therefore maintain the lower quantum noise of the squeezed laser light in the photovoltage.
  • a single PIN diode has no spatial resolution. It measures the power of the light beam over its entire area. A signal leads to reduced light output at double the scanning frequency.
  • a preferred embodiment uses a photodiode with a quantum efficiency of over 90%.
  • a preferred embodiment uses a balanced detector consisting of two photodiodes, which can read out the light at any phase of the optical oscillation.
  • a preferred embodiment uses a high quantum efficiency photodetector with additional spatial resolution, such as a quadrant photodiode having 4 segments.
  • a CMOS chip can also be used if its quantum efficiency is high enough.
  • conventional and squeezed laser light are used in combination for the measurement.
  • Conventional laser light is used to achieve the strongest possible signal for the measurement.
  • squeezed light with a vanishing or no portion of conventional laser light is used for objects that are particularly sensitive to light.
  • the signal corresponds to a decrease in the degree of squeezing. The more light the biomolecule scatters or diffracts, the more the breadth of the photon statistics approaches that of the conventional laser.
  • the device uses two light-collecting and focusing imaging optics with high transmission.
  • a first imaging optic focuses the laser light onto the object to be examined.
  • a second imaging optic focuses the transmitted laser light onto the optical measuring device.
  • the object according to the invention is also achieved by a method having the features of claim 14.
  • the method is a measuring method used for photometric mass determination.
  • laser light is directed onto an object to be examined, in particular onto individual biomolecules or viruses, and laser light scattered on the object to be examined is measured.
  • the scattered laser light that interferes with non-scattered laser light is preferably measured.
  • the method provides for the laser beam to have squeezed laser light.
  • the squeezed laser light has the advantage of having narrower photon count statistics and thus improving the signal-to-noise ratio.
  • the method according to the invention also provides that the scattered light is measured together with transmitted laser light.
  • the laser beam is guided over a region of the object to be measured at a predetermined frequency f.
  • the measurement signals are evaluated with twice the frequency 2f.
  • the frequency is above 200 Hz, preferably above 1 kHz. Higher frequencies have proven to be particularly advantageous.
  • Fig. 1 comparison of the widths of the photon count statistics of normal and squeezed laser light.
  • FIG. 3 shows an exemplary device for photometric mass determination with transmitted laser light and forward-scattered signal light
  • FIG. 4 shows a second exemplary embodiment for a photometric mass determination with transmitted laser light and forward-scattered signal light
  • 5 shows a third exemplary embodiment for a photometric mass determination with reflected laser light and backscattered signal light
  • 6 shows a fourth exemplary embodiment for a photometric mass determination with reflected laser light and backscattered signal light.
  • FIG. 1 shows in an exemplary representation the photon counting statistics of squeezed laser light in comparison to that of a conventional laser. If, for example, a light output and a measuring time are used that lead to an average of 10,000 registered photons, this number fluctuates with the best classic laser with repeated measurements with a standard deviation of 100 (root of 10,000). The standard deviation is half the width of the photon statistics and corresponds to the photon shot noise. It limits the measurement sensitivity. If squeezed light with a squeeze factor of lOdB is used, the standard deviation is reduced to approx. 32 (root of 1000). Each individual measurement is therefore just as good as an average of 10 measurements with a classic laser of the same power. The total measurement time is reduced by a factor of 10.
  • FIG. 2 The effect of using the squeezed laser light can be seen in FIG.
  • FIG. 2 On the left-hand side of FIG. 2 one can see how the use of squeezed light reduces the spectrally broken down shot noise of the laser and a significantly improved signal-to-shot noise is thus made possible.
  • the noise power is plotted against the frequency in the diagrams.
  • the noise power integrated over all measurement frequencies corresponds to the variance of the photon number uncertainty, i.e. the square of the standard deviation in Figure 1.
  • a possible embodiment of the measuring device is shown in FIG.
  • the optical elements relevant to the functional principle are shown in the figure and further elements have been left out for a better overview.
  • squeezed laser light 12 is superimposed and deflected by a scanning element 14 .
  • the value of 99% is only an approximation.
  • the scanning element performs a spatially limited movement with a frequency f.
  • the scan element 14 can be configured as a gal vo scanner, a micromirror, an acoustooptic deflector or as an electro optic deflector (EOD). Romer G. et al.
  • the lens 16 deflects the laser beam deflected by the scanning element onto the sample holder with the sample. Due to the movement of the scanning element, a finite area with the frequency f is swept on the sample holder 18, which also functions as a scanning frequency. As the schematic enlargement 20 shows, this means that an object to be examined, which can also be present in a solution on a slide, is scanned twice per scan period. The light scattered on the object interferes with the transmitted laser light and is focused by a second lens 22 onto a PIN photodiode. The measurement signal from the PIN photodiode 24 goes to a lock-in amplifier, which particularly amplifies signals at twice the frequency 2f.
  • the reference signals with frequency f and 2f come from a frequency generator 28.
  • the frequency generator provides a signal 30 with the frequency f to the scan element, which scans the area with this frequency, with one or more amplifiers being able to be connected between the frequency generator and the scan element, for example to provide the required voltage of some To provide 100 V for an EOD.
  • a second signal 32 with twice the frequency 2f is applied to the lock-in amplifier 26 as a reference signal. The phase angle between the measurement signal and the reference signal 26 can be adjusted.
  • FIG. 4 shows an alternative structure, identical elements being identified by identical reference symbols.
  • the squeezed laser light 12 and conventional laser light are superimposed via a 50/50 beam splitter 42 .
  • the beam splitter 42 is given here as 50/50 by way of example; however, any beam splitter ratio can be used, for example 30/70 or 80/20.
  • While one beam passes through the sample holder 18 analogously to FIG. 3 and is detected in the first PIN diode 24 , the second part of the radiator is detected in a second PIN diode 34 . Both measurement signals are subtracted from one another in a subtractor before they are amplified in a lock-in amplifier 40 .
  • variable amplifier or attenuator 36 is installed to balance the electrical signals from diodes 34 and 24, so that after the subtraction the noise, which is identical in both signals, is subtracted to zero as well as possible.
  • FIG. 5 shows the incident laser light 50, in which conventional and squeezed laser light are already superimposed. In principle, it is also possible to use only squeezed laser light in 50 Aii.
  • the total laser light is deflected at a scanning frequency in the scanning element, which is designed, for example, as an electro-optical deflector (EOD).
  • EOD electro-optical deflector
  • the deflected laser light is directed to a sample holder 56 via a lens 54 .
  • the lens 54 can have one or more lenses connected in front, which are also to be understood as part of the lens.
  • the object holder 56 has a cover glass 58 which is equipped with an anti-reflection layer.
  • the incident laser light is reflected on a substrate 60 with a highly reflective coating. This can be, for example, a highly reflective mirror.
  • the sample is located between the cover glass 58 and the substrate 60, with the object or objects 62 to be examined.
  • a Faraday isolator optical elements with an equivalent effect, e.g., a combination of a quarter-wave plate and a polarizing beam splitter cube (PBS) can be used.
  • the reflected beam 65 is separated from the original (incoming) beam path by the Faraday isolator and detected on a PIN photodiode 66 .
  • the signal component with double the scanning frequency 2f is particularly amplified via a lock-in amplifier 68, to which double the scanning frequency 2f is applied.
  • the frequencies f for the scan element 52 and 2f for the lock-in amplifier come from a frequency generator 70.
  • FIG. 6 shows the fourth exemplary embodiment, which works with two PIN photodiodes 72, 74.
  • the incident laser light 76 and the squeezed laser light 78 are superimposed on a 50/50 beam splitter 80 and passed to the scanning element 82 and the PIN photodiode 72 .
  • the laser light directed onto the object carrier 88 is deflected by the scanning element 82 with a frequency f and is directed onto the object carrier 88 via the lens 86, with one or more lenses being able to be arranged in front of the lens if required.
  • the slide 88 has an antireflection layer on the cover glass 90 and a substrate 92 with a highly reflective coating.
  • the signals of the two photodiodes 72, 74 are subtracted from one another 96.
  • the difference signal is present at the lock-in amplifier 98, which evaluates the signal with regard to double the scanning frequency 2f.
  • a variable amplifier or attenuator 100 is provided, which equalizes the electrical signals from the photodiode 72 with respect to those from the photodiode 74.
  • the use of squeezed light is associated with the following features.
  • Transmitted or reflected laser light is detected.
  • a modulation of the detected signal is generated by transversely scanning the laser beam relative to the sample.
  • the modulation in the laser light resulting from the scanning is used for the selective detection of the relevant measurement signals via a lock-in amplifier.
  • These features help shift the measurement signal into a shot-noise limited range.
  • the frequency range relevant to the modulation is above 200 Hz, preferably above 1 kHz, preferably even higher. Avoiding optical losses due to weak reflection avoids reducing the squeeze factor.
  • the squeezed laser light on the photoelectric detector is amplitude-modulated by the scattering at the biomolecule at twice the scanning frequency, or amplitude-modulated at two frequencies, which add up to double the scanning frequency.
  • the fact that the scanning frequency is high means that disruptive influences, such as scattered light from unwanted sources, are suppressed.
  • the transmitted light is coupled into a second imaging optics with the highest possible numerical aperture and little optical loss. A high numerical aperture is important in order to be able to strongly focus the light.
  • an imaging optics is required, whereby the Effort for the measuring device reduced. With both approaches, the scattered light is focused onto the detection diode. This measures the modulated light output.
  • the modulation depth i.e.
  • the difference between the maximum and minimum detected intensity varies with the size of the molecule, because larger molecules scatter more light.
  • the measurable contrast as a photometric variable and the molecular mass in this structure.
  • the modulation depth of the laser light output is also low.
  • the intensity maximum and minimum therefore differ only slightly from the average power measured at the diode.
  • the modulation frequency is known, the signal can be filtered with a lock-in amplifier and thus visualized with a good signal-to-noise ratio.

Abstract

A device for photometric mass measurement, which has at least one laser source and an optical measuring unit. At least one laser source is directed onto the object to be examined, in particular individual biomolecules or viruses, and the optical measuring unit detects light scattered on the object to the examined, the laser beam comprising squeezed light.

Description

Vorrichtung und Verfahren zur photometrischen Massenbestimmung Device and method for photometric mass determination
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur photometrischen Massenbestimmung, wobei es sich bei den zu untersuchenden Objekten um einzelne Biomoleküle und/oder Viren handelt. The present invention relates to a device and a method for photometric mass determination, the objects to be examined being individual biomolecules and/or viruses.
In der Biologie und den Lebenswissenschaften ist es wichtig, die Masse einzelner Biomoleküle oder Viren genau zu bestimmen oder generell einzelne Partikel in einer Lösung zu detektieren. Die Massenbestimmung muss idealerweise ohne eine Markierung der Moleküle durch beispielsweise Fluoreszenzmarker erfolgen, um das Messergebnis nicht zu verfälschen. Eine genaue Bestimmung der Molekülmasse ist umso schwieriger, je kleiner das zu messende Biomolekül ist. In biology and life sciences, it is important to precisely determine the mass of individual biomolecules or viruses, or generally to detect individual particles in a solution. Ideally, the mass determination must be carried out without labeling the molecules, for example with fluorescent markers, in order not to falsify the measurement result. An exact determination of the molecular mass is all the more difficult the smaller the biomolecule to be measured is.
Aktuell werden zur photometrischen Massenbestimmung von Biomolekülen und Viren interferometrische Techniken eingesetzt. Eine solche, sogenannte „mass photometry“ sieht vor, dass das zu vermessende Objekt sich in der Nähe der Oberfläche eines gläsernen Probenhalters befindet. Über einen qualitativ hochwertigen aber konventionellen Laserstrahl fällt Licht durch den transparenten Objektträger (Probenträger) auf das zu vermessende Objekt und wird an diesem gestreut bzw. gebeugt. Im folgenden Text inkludiert das Wort Streuung auch Beugung. Ein Teil des gestreuten Lichts wird zusammen mit von der anliegenden Glasoberfläche reflektierten Licht zurückgeworfen. Gestreutes Licht und reflektiertes Licht interferieren. Das Interferenzmuster wird schließlich mit einer CMOS-Kamera detektiert. Currently, interferometric techniques are used for the photometric determination of the mass of biomolecules and viruses. Such a so-called "mass photometry" provides that the object to be measured is located near the surface of a glass sample holder. Using a high-quality but conventional laser beam, light falls through the transparent slide (sample slide) onto the object to be measured and is scattered or diffracted by it. In the following text, the word scattering also includes diffraction. Some of the scattered light is reflected back together with light reflected from the adjacent glass surface. Scattered light and reflected light interfere. Finally, the interference pattern is detected with a CMOS camera.
Aus Daniel Cole et al., “Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture- shaped interferometric scattering microscopy, ACS Photonics, 4, 2, 211 - 216 (2017)” ist folgender Zusammenhang bekannt:
Figure imgf000004_0001
wobei Eine die Feldstärke in dem einfallenden elektrischen Feld, r2 der Reflektivität des Übergangs Luft-Glasprobenhalter, | s | der Streuamplitude der Probe und (p die Phasendifferenz zwischen einfallendem und reflektierendem Feld entspricht. Im Falle schwacher Streuung, wie sie an Molekülen zu erwarten ist ( | s | ~ 0), ergibt sich ein interferometri scher Kontrast als Verhältnis von detektierter Leistung mit Streuung Idet zu detektierter Leistung ohne Streuung Inos zu folgendem Ausdruck:
Figure imgf000004_0002
The following relationship is known from Daniel Cole et al., "Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy, ACS Photonics, 4, 2, 211 - 216 (2017)":
Figure imgf000004_0001
where A is the field strength in the incident electric field, r 2 is the reflectivity of the air-glass sample holder interface, | s | corresponds to the scattering amplitude of the sample and (p corresponds to the phase difference between the incident and reflected fields. In the case of weak scattering, as is to be expected from molecules ( | s | ~ 0), an interferometric contrast results as the ratio of detected power to scattering Idet to detected power without scattering I nos to the following expression:
Figure imgf000004_0002
Für die Massenbestimmung wird nun der Zusammenhang zwischen interferometri schem Kontrast und der Molekülmasse ausgenutzt. Da jedoch | s | auch für große Moleküle klein ist, kann mit heutiger CMOS -Technologie nur dann ein für die Auswertung brauchbares Bild erzeugt werden, wenn mehrere Aufnahmen desselben Moleküls gemittelt werden. Wenn Mittelungen das Bild verbessern können, sind die Aufnahmen limitiert durch das Photonenschrotrauschen. Das Schrotrauschen bildet ein Limit für das maximal erreichbare Signal -zu-Rauschen- Verhältnis bei einer festen zur Messung verwendeten Photonenzahl. Eine bessere Messauflösung kann nur durch weiteres Mitteln, also längere Messzeit oder durch höhere Laserleistung erzielt werden. Beide Ansätze sind in der Praxis nicht praktikabel, da eine längere Messzeit zu einer Degeneration der Probe führen kann oder schlicht zu lang für die Arbeitsabläufe ist. Eine höhere Laserleistung kann zur Zerstörung der Probe aufgrund der eingetragenen Wärme führen. The relationship between interferometric contrast and the molecular mass is now used to determine the mass. However, since | s | is small even for large molecules, today's CMOS technology can only generate an image that can be used for evaluation if several images of the same molecule are averaged. If averaging can improve the image, the exposures are limited by photon shot noise. The shot noise forms a limit for the maximum achievable signal-to-noise ratio with a fixed number of photons used for the measurement. A better measurement resolution can only be achieved by further averaging, i.e. longer measurement time or by higher laser power. Both approaches are impractical in practice, since a longer measurement time can lead to sample degeneration or is simply too long for the workflow. A higher laser power can lead to the destruction of the sample due to the heat introduced.
Auch Marek Piliarik und Vahid Sandoghdar, ..Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites“, Nature Communications 5, 4495 (2014) zeigen einen Aufbau für eine Massenphotometrie. Ein Laserstrahl bei 405 Nanometer wird über eine Linse und ein Mikroskopobjektiv auf die Probe geleitet. Reflektiertes und gestreutes Licht werden über eine Abbildungslinse auf eine CMOS-Kamera fokussiert, wo sie dann photometrisch ausgewertet werden. Also Marek Piliarik and Vahid Sandoghdar, ..Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites", Nature Communications 5, 4495 (2014) show a setup for mass photometry. A laser beam at 405 nanometers is directed onto the sample via a lens and a microscope objective. Reflected and scattered light is focused on a CMOS camera via an imaging lens, where it is then evaluated photometrically.
Ein im Prinzip ähnlicher Aufbau für das interferometrische Streuverfahren ist aus Kukura Philipp et al., “ High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus“, Nature Methods, vol. 6, No. 12, December 2009, 923-27 bekannt. Der hier gezeigte Aufbau dient dazu, einerseits das zurückgestreute Licht zu detektieren und ebenfalls den mit einem Quantenpunkt „quantum dot“) als Markierung gekennzeichneten Virus zu vermessen. A basically similar setup for the interferometric scattering method is known from Kukura Philipp et al., “High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus”, Nature Methods, vol. 6, no. 12, December 2009, 923-27. The setup shown here serves to detect the backscattered light and also to measure the virus marked with a quantum dot.
In WO 2017/041809 Al ist die Detektion einzelner Proteine beschrieben, bei der die Proteine im Hinblick auf bestimmte Eigenschaften wie Masse, Ladung, Form etc. getrennt und dann interferometrisch untersucht werden, wobei das gestreute Licht mit dem reflektierten Licht interferiert (iSCAT). WO 2017/041809 A1 describes the detection of individual proteins, in which the proteins are separated with regard to specific properties such as mass, charge, shape etc. and then examined interferometrically, with the scattered light interfering with the reflected light (iSCAT).
Aus WO 2019/110977 Al ist bekannt geworden, die Konzentration von Partikeln in einer Lösung zu bestimmen. Dabei wird auf die Bindungsrate der Partikel mit der Oberfläche des Probenhalters durch von den Partikeln gestreutes Licht geschlossen und diese Bindungsrate mit einer Kalibrierungskurve abgeglichen. It has become known from WO 2019/110977 A1 to determine the concentration of particles in a solution. The binding rate of the particles with the surface of the sample holder is thereby deduced from the light scattered by the particles and this binding rate is compared with a calibration curve.
Aus GB 25 52 195 A ist ein iSCAT-Mikroskop bekannt, bei dem die Amplitude eines Referenzfeldes mit Hilfe eines Filters beeinflusst und für die Detektion optimiert wird. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Vorrichtung und Verfahren zur photometrischen Massenbestimmung bereitzustellen, die ein verbessertes Signal-zu- Rauschen Verhältnis besitzen. GB 25 52 195 A discloses an iSCAT microscope in which the amplitude of a reference field is influenced with the aid of a filter and optimized for detection. The invention is based on the object of providing a device and method for photometric mass determination which have an improved signal-to-noise ratio.
Erfmdungsgemäß wird die Aufgabe durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen aus Anspruch 1 und durch ein Verfahren mit den Merkmalen aus Anspruch 14 gelöst. According to the invention, the object is achieved by a device having the features of claim 1 and by a method having the features of claim 14.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist eine photometrische Massenbestimmungsvorrichtung. Es handelt sich bei der erfmdungsgemäßen Vorrichtung um eine Massenbestimmungsvorrichtung, die eine Massenbestimmung nach photometrischen Prinzipien vornimmt. Die Vorrichtung besitzt mindestens eine Laserquelle und eine optische Messeinrichtung, die geeignet ist, einen einfallenden Lichtstrahl zu messen. Die mindestens eine Laserquelle ist erfmdungsgemäß auf das zu untersuchende Objekt gerichtet, das aus einem einzelnen Biomolekül, einem Virus oder dergleichen bestehen kann. Die optische Messeinrichtung ist zudem ausgebildet, an dem zu untersuchenden Objekt gestreutes Laserlicht zu erfassen, das mit nichtgestreutem Laserlicht interferiert. Erfmdungsgemäß ist vorgesehen, dass der Laserstrahl gequetschtes Laserlicht aufweist. Wenn von gestreutem Laserlicht gesprochen wird, bezieht sich dies nicht nur auf eine Wechselwirkung mit Strukturen, deren Abmessungen die Wellenlänge des Lichts übersteigt, sondern auch auf die Wechselwirkung mit Strukturen, deren Abmessungen kleiner, mitunter deutlich kleiner als die Wellenlänge des Laserlichts sind. Somit umfasst die Streuung auch Phänomene der Beugung. The device according to the invention is a photometric mass determination device. The device according to the invention is a mass determination device which carries out a mass determination according to photometric principles. The device has at least one laser source and an optical measuring device that is suitable for measuring an incident light beam. According to the invention, the at least one laser source is aimed at the object to be examined, which can consist of a single biomolecule, a virus or the like. The optical measuring device is also designed to detect scattered laser light on the object to be examined, which interferes with non-scattered laser light. According to the invention, it is provided that the laser beam has squeezed laser light. When speaking of scattered laser light, this not only refers to an interaction with structures whose dimensions exceed the wavelength of the light, but also to interactions with structures whose dimensions are smaller, sometimes significantly smaller, than the wavelength of the laser light. Thus, scattering also includes diffraction phenomena.
Bei gequetschtem Licht, auch squeezed light genannt, handelt es sich um einen speziellen Quantenzustand, dessen Unschärfe im Vergleich zu einem kohärenten Zustand für manche Phasen reduziert und für andere erhöht ist. Das kohärente, klassische Laserlicht besitzt eine Photonenzahl Statistik, welche eine Poisson- Verteilung aufweist. Die Verteilung hat eine gewisse Standardabweichung um einen Mittelwert, welcher von der Laserleistung abhängig ist. Im Mittel wird pro Zeitintervall eine gewisse leistungsabhängige Photonenzahl detektiert. Bei gleichbleibender mittlerer Laserleistung fluktuiert die gemessene Photonenzahl von Messintervall zu Messintervall um den Mittelwert entsprechend der Poisson- verteilten Zählstatistik. Die Photonenzähl Statistik entspricht dem bereits angesprochenen Schrotrauschen. Die extrem schwachen Signale, wie sie von der Streuung an einzelnen Molekülen zu erwarten sind, entsprechen nur wenigen Photonen. Diese heben sich kaum von der Poisson-verteilten Zählstatistik ab. Bei gequetschtem Licht handelt es sich um einen speziellen quantenmechanischen Zustand des Laserlichts, welcher eine reduzierte Breite der Photonenzähl Statistik aufweist. Diese gequetschte Verteilung wird auch als sub-poissonisch bezeichnet. Die Standardabweichung der Verteilung für gequetschtes Laserlicht ist im Vergleich zum konventionellen Laser reduziert, wobei die mittlere Laserleistung und damit das Signal nicht beeinflusst wird. Bei gequetschtem Laserlicht tritt also eine Reduktion des Schrotrauschens auf und damit ein verbessertes Signal-zu-Rausch-Verhältnis. Squeezed light, also known as squeezed light, is a special quantum state whose fuzziness is reduced for some phases and increased for others compared to a coherent state. The coherent, classic laser light has a photon number statistic, which is a Poisson distribution. The distribution has a certain standard deviation around a mean value that depends on the laser power. On average, a certain power-dependent number of photons is detected per time interval. If the average laser power remains the same, the measured number of photons fluctuates from measurement interval to measurement interval around the mean value according to the Poisson-distributed counting statistics. The photon count statistics correspond to the already mentioned shot noise. The extremely weak signals, which are to be expected from scattering from individual molecules, correspond to only a few photons. These hardly differ from the Poisson distributed counting statistics. Squeezed light is a special quantum mechanical state of laser light, which shows a reduced width of the photon counting statistics. This squashed distribution is also known as sub-Poissonian. The standard deviation of the distribution for squeezed laser light is reduced compared to conventional lasers, whereby the average laser power and thus the signal are not affected. With squeezed laser light, there is a reduction in the shot noise and thus an improved signal-to-noise ratio.
In einer bevorzugten Weiterbildung fällt rückgerichtetes Laser- und Streulicht als rückreflektiertes Laserlicht zusammen mit rückgestreutem Laserlicht in die optische Messeinrichtung. Das Laserlicht passiert das zu untersuchenden Objekt, wird teilweise gestreut, wird anschließend zusammen mit vorwärtsgestreutem Licht an einem bevorzugt hoch reflektiv beschichteten Substrat zurückgeworfen und wird erneut am Objekt gestreut. Das zurückgeworfene Laserlicht enthält einen Großteil des eingestrahlten Lichts sowie an dem Objekt rückwärts und vorwärts gestreutes Licht. Ähnlich wie typische i SC AT -Aufbauten wird hier das rückgerichtete Licht detektiert, jedoch sind die Reflexionskoeffizienten bei herkömmlichen i SC AT -Aufbauten sehr klein, so dass ein Einsatz von gequetschtem Licht in einem typischen iSCAT-Aufbaut nicht möglich ist. Dies hat seine Ursache in der schwachen Reflexion und wird in der bevorzugten Ausgestaltung behoben, indem das zu untersuchende Objekt vor oder auf einem hoch reflektiv beschichteten Substrat aufgebracht wird, wobei die Anbringung vor dem Substrat auch den Fall mit einschließt, dass das zu untersuchende Objekt direkt auf dem Substrat angeordnet ist. Das zu untersuchende Objekt kann beispielsweise in einer Flüssigkeit auch direkt auf das hoch reflektive Substrat aufgebracht werden. Ein für das zu untersuchende Objekt vorgesehenes Abdeckglas kann bevorzugt außerdem mit einer Antireflex-Beschichtung ausgestattet sein, so dass auch hier Verluste minimiert werden und der erfindungsgemäße Einsatz von gequetschtem Laserlicht möglich ist. In a preferred development, back-directed laser light and scattered light falls into the optical measuring device as back-reflected laser light together with back-scattered laser light. The laser light passes through the object to be examined, is partially scattered, is then thrown back together with forward-scattered light on a preferably highly reflectively coated substrate and is scattered again on the object. The reflected laser light contains a large part of the incident light as well as light scattered backwards and forwards on the object. Similar to typical iSC AT setups, the reflected light is detected here, but the reflection coefficients in conventional iSC AT setups are very small, so that it is not possible to use squeezed light in a typical iSCAT setup. This is due to the weak reflection and is reflected in the preferred embodiment solved by the object to be examined is applied in front of or on a highly reflective coated substrate, the attachment in front of the substrate also includes the case that the object to be examined is arranged directly on the substrate. The object to be examined can also be applied directly to the highly reflective substrate, for example in a liquid. A cover glass provided for the object to be examined can preferably also be equipped with an anti-reflection coating, so that losses are also minimized here and the use of squeezed laser light according to the invention is possible.
In einer alternativen Weiterbildung fällt transmittiertes Laserlicht zusammen mit am Objekt vorwärtsgestreuten Licht in die optische Messeinrichtung. Das Licht durchleuchtet den Objektträger des zu untersuchenden Objekts, interferiert mit in Vorwärtsrichtung gestreutem Licht und wird zusammen mit diesem gemessen. Bekannte Messeinrichtungen zur photometrischen Massenbestimmung, wie beispielsweise iSCAT, stellen im Gegensatz dazu stets auf die Interferenzen mit dem reflektierten Lichtstrahl ab. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt auf eine Interferenz des in Vorwärtsrichtung gestreuten oder gebeugten Lichts mit dem transmittierten Lichtstrahl ab. Diese Vorgehensweise hat insbesondere bei der Verwendung von gequetschtem Laserlicht den Vorteil, dass der quantenmechanische Zustand mit seiner schmalen (gequetschten) Photonenzahl Statistik erhalten bleibt und nicht durch eine Aufteilung in unterschiedliche Richtungen aufgehoben wird. Ein hochreflektierender Spiegel wird nicht benötigt. In an alternative development, transmitted laser light falls into the optical measuring device together with light scattered forward on the object. The light shines through the slide of the object to be examined, interferes with light scattered in the forward direction and is measured together with this. In contrast, known measuring devices for photometric mass determination, such as iSCAT, always focus on interference with the reflected light beam. The method according to the invention is based on an interference of the light scattered or diffracted in the forward direction with the transmitted light beam. This procedure has the advantage, particularly when using squeezed laser light, that the quantum mechanical state with its narrow (squeezed) number of photons is retained and is not canceled out by a division into different directions. A highly reflective mirror is not required.
In einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung wird das auf das zu untersuchende Objekt gerichtete Laserlicht mit einer vorgegebenen Frequenz über einen räumlichen Bereich der Probe geführt. Es erfolgt eine Scanbewegung in einem Scanbereich. Bei einer zentriert im Scanbereich liegenden Probe, die von dem Laserlicht gut ausgeleuchtet wird, finden zwei Streuvorgänge während einer Periodendauer statt. Insofern stellt eine Auswerteeinrichtung bevorzugt bei der optischen Messeinrichtung auf Messsignale mit der doppelten Scanfrequenz ab. Wenn sich das Messobjekt nicht in der Mitte des Scan-Bereichs befindet, so entsteht dasselbe Signal bei zwei ungleichen Frequenzen, deren Summe der doppelten Scanfrequenz entspricht. Werden mehrere Objekte abgefahren, so entstehen weitere Frequenzen. Signale, die nicht diesen Frequenzen zugeordnet werden können, stammen nicht von Objekten im Scanbereich, sondern zum Beispiel von der Laserquelle selbst und werden so als Falschsignale erkannt. Liegt ausschließlich die doppelte Scanfrequenz vor, so ist dieses ein Nachweis, dass ein zentriertes Objekt in optimaler Weise vermessen wird. In a preferred development of the invention, the laser light directed onto the object to be examined is guided over a spatial region of the sample at a predetermined frequency. A scanning movement takes place in a scanning area. With a sample that is centered in the scanning area, the laser light well is illuminated, two scattering processes take place during one period. In this respect, an evaluation device is preferably based on measurement signals with twice the scanning frequency in the case of the optical measuring device. If the target is not in the middle of the scan range, the same signal is produced at two unequal frequencies, the sum of which corresponds to twice the scan frequency. If several objects are scanned, additional frequencies are generated. Signals that cannot be assigned to these frequencies do not come from objects in the scanning area, but from the laser source itself, for example, and are thus recognized as false signals. If only twice the scanning frequency is available, this is proof that a centered object is measured in an optimal manner.
In einer bevorzugten Ausgestaltung wird der Scan-Bereich aktiv über dem Objekt zentriert, indem das Signal bei doppelter Scanfrequenz maximiert wird. Dazu kann eine Steuereinheit vorgesehen sein, die dazu ausgebildet ist, den gescannten Bereich des zu untersuchenden Objektes so zu verstellen, dass ein Anteil des Signals mit einer doppelten Frequenz gegenüber anderen Anteilen des Signals maximiert wird. Dieses Verstellen kann einerseits objektseitig erfolgen, oder durch eine entsprechende Änderung des Laserstrahls in seiner Auslenkung, so dass ein Mittelpunkt des Scanbereichs für das Laserlicht sich verschiebt. Bei diesem Verfahren wird mit der Steuereinheit sichergestellt, dass während der Scanbewegung des Laserlichts zwei Mal an dem zu untersuchenden Objekt gestreut wird. Sollte das zu untersuchende Objekt beispielsweise im Randbereich des scannenden Laserstrahls liegen, so kann der Fall auftreten, dass nur einmal das gestreute Licht erfasst wird. Dann wird das Messsignal mit der doppelten Scanfrequenz dadurch verstärkt, dass der Scanbereich gegenüber dem zu untersuchenden Objekt oder umgekehrt verschoben wird. In a preferred embodiment, the scan area is actively centered over the object by maximizing the signal at twice the scan frequency. For this purpose, a control unit can be provided which is designed to adjust the scanned area of the object to be examined in such a way that a component of the signal with double the frequency compared to other components of the signal is maximized. This adjustment can take place on the one hand on the object side, or by a corresponding change in the deflection of the laser beam, so that a center point of the scanning area for the laser light is shifted. With this method, the control unit ensures that the laser light is scattered twice on the object to be examined during the scanning movement. If the object to be examined is located, for example, in the edge area of the scanning laser beam, the case can arise that the scattered light is detected only once. The measurement signal is then amplified at twice the scanning frequency by shifting the scanning area in relation to the object to be examined or vice versa.
In einer bevorzugten Ausgestaltung ist ein Frequenzgenerator vorgesehen, der für die vorbestimmte Frequenz auch die doppelte Frequenz erzeugt. Da das Messsignal der optischen Messeinrichtung ein sehr schwaches Signal ist, ist es wichtig, die Frequenzsignale mit großer Genauigkeit sowohl bei der Bewegung des Laserlichts als auch bei der Auswertung der Signale der optischen Messeinrichtung erzeugen zu können. Bevorzugt erfolgt die Auswertung der Messsignale über einen Lock-in- Verstärker, an dem ein Signal mit der doppelten Frequenz als Referenzsignal anliegt. Die Phase des Referenzsignals kann hierbei auf an sich bekannte Weise bestimmt werden. Mit der Verwendung eines Lock-in- Verstärkers können die auftretenden, sehr schwachen elektrischen Signale der optischen Messeinrichtung verstärkt und ausgewertet werden. In a preferred embodiment, a frequency generator is provided which also generates twice the frequency for the predetermined frequency. Since the measurement signal of optical measuring device is a very weak signal, it is important to be able to generate the frequency signals with great accuracy both in the movement of the laser light and in the evaluation of the signals of the optical measuring device. The measurement signals are preferably evaluated via a lock-in amplifier to which a signal with twice the frequency is present as a reference signal. The phase of the reference signal can be determined in a manner known per se. With the use of a lock-in amplifier, the occurring, very weak electrical signals of the optical measuring device can be amplified and evaluated.
In einer typischen Ausgestaltung ist als optische Messeinrichtung eine Photodiode (PIN-Photodiode) vorgesehen, die bevorzugt eine Quanteneffizienz von über 50% aufweist und damit das geringere Quantenrauschen des gequetschten Laserlichts in der Photospannung aufrechterhalten kann. Eine einzelne PIN-Diode besitzt keine räumliche Auflösung. Sie misst die Leistung des Lichtstrahls über seine gesamte Fläche. Ein Signal führt zu verringerter Lichtleistung bei doppelter Scanfrequenz.In a typical configuration, a photodiode (PIN photodiode) is provided as the optical measuring device, which preferably has a quantum efficiency of over 50% and can therefore maintain the lower quantum noise of the squeezed laser light in the photovoltage. A single PIN diode has no spatial resolution. It measures the power of the light beam over its entire area. A signal leads to reduced light output at double the scanning frequency.
Eine bevorzugte Ausgestaltung verwendet eine Photodiode mit einer Quanteneffizienz von über 90%. Eine bevorzugte Ausgestaltung verwendet einen balancierten Detektor bestehend aus zwei Photodioden, der das Licht zu beliebigen Phasen der optischen Schwingung auslesen kann. Eine bevorzugte Ausgestaltung verwendet einen Photodetektor mit hoher Quanteneffizienz mit zusätzlich räumlicher Auflösung, beispielsweise eine Quadranten-Photodiode, die 4 Segmente besitzt. Auch ein CMOS-Chip kann eingesetzt werden, wenn seine Quanteneffizienz hoch genug ist. A preferred embodiment uses a photodiode with a quantum efficiency of over 90%. A preferred embodiment uses a balanced detector consisting of two photodiodes, which can read out the light at any phase of the optical oscillation. A preferred embodiment uses a high quantum efficiency photodetector with additional spatial resolution, such as a quadrant photodiode having 4 segments. A CMOS chip can also be used if its quantum efficiency is high enough.
In einer typischen Ausgestaltung wird herkömmliches und gequetschtes Laserlicht miteinander kombiniert für die Messung verwendet. Das herkömmliche Laserlicht wird dabei eingesetzt, um ein möglichst starkes Signal für die Messung zu erzielen. In einer Ausgestaltung für besonders lichtempfindliche Objekte wird gequetschtes Licht mit verschwindendem oder ohne Anteil an herkömmlichen Laserlicht verwendet. In diesem Fall entspricht das Signal einer Abnahme des Quetschgrades. Je mehr Licht das Biomolekül streut bzw. beugt, desto mehr nähert sich die Breite der Photonenstatistik der des herkömmlichen Lasers an. In a typical configuration, conventional and squeezed laser light are used in combination for the measurement. Conventional laser light is used to achieve the strongest possible signal for the measurement. In one embodiment for objects that are particularly sensitive to light, squeezed light with a vanishing or no portion of conventional laser light is used. In this case, the signal corresponds to a decrease in the degree of squeezing. The more light the biomolecule scatters or diffracts, the more the breadth of the photon statistics approaches that of the conventional laser.
In einer bevorzugten Ausgestaltung verwendet die Vorrichtung zwei lichtsammelnde und fokussierende Abbildungsoptiken hoher Transmission. Eine erste Abbildungsoptik fokussiert das Laserlicht auf das zu untersuchende Objekt. Eine zweite Abbildungsoptik fokussiert das transmittierte Laserlicht auf die optische Messeinrichtung. In a preferred embodiment, the device uses two light-collecting and focusing imaging optics with high transmission. A first imaging optic focuses the laser light onto the object to be examined. A second imaging optic focuses the transmitted laser light onto the optical measuring device.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird ebenfalls durch ein Verfahren mit den Merkmalen aus Anspruch 14 gelöst. Das Verfahren ist ein Messverfahren, das zu einer photometrischen Massenbestimmung dient. Bei dem Messverfahren wird Laserlicht auf ein zu untersuchendes Objekt, insbesondere auf einzelne Biomoleküle oder Viren gerichtet und an dem zu untersuchenden Objekt gestreutes Laserlicht gemessen. Bevorzugt wird das gestreute Laserlicht gemessen, das mit nicht gestreutem Laserlicht interferiert. Erfindungsgemäß ist bei dem Verfahren vorgesehen, dass der Laserstrahl gequetschtes Laserlicht aufweist. Das gequetschte Laserlicht besitzt den Vorteil, eine schmalere Photonenzähl Statistik aufzuweisen und so das Signal-zu-Rauschen- Verhältnis zu verbessern. The object according to the invention is also achieved by a method having the features of claim 14. The method is a measuring method used for photometric mass determination. In the measurement method, laser light is directed onto an object to be examined, in particular onto individual biomolecules or viruses, and laser light scattered on the object to be examined is measured. The scattered laser light that interferes with non-scattered laser light is preferably measured. According to the invention, the method provides for the laser beam to have squeezed laser light. The squeezed laser light has the advantage of having narrower photon count statistics and thus improving the signal-to-noise ratio.
Das erfindungsgemäße Verfahren sieht ebenfalls vor, dass das gestreute Licht zusammen mit transmittiertem Laserlicht gemessen wird. Dies bedeutet, der Objekthalter wird durchleuchtet, Laserlicht wird an dem zu untersuchenden Objekt gestreut und interferiert mit dem nicht gestreuten Licht. In einer bevorzugten Weiterbildung wird der Laserstrahl mit einer vorbestimmten Frequenz f über einen Bereich des zu messenden Objekts geführt. Die Messsignale werden mit der doppelten Frequenz 2f ausgewertet. In einer bevorzugten Ausgestaltung liegt die Frequenz oberhalb von 200 Hz, bevorzugt oberhalb von 1 kHz. Höhere Frequenzen haben sich als besonders vorteilhaft erwiesen. The method according to the invention also provides that the scattered light is measured together with transmitted laser light. This means that the object holder is x-rayed, laser light is scattered on the object to be examined and interferes with the light that is not scattered. In a preferred development, the laser beam is guided over a region of the object to be measured at a predetermined frequency f. The measurement signals are evaluated with twice the frequency 2f. In a preferred embodiment, the frequency is above 200 Hz, preferably above 1 kHz. Higher frequencies have proven to be particularly advantageous.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Figuren näher erläutert. Es zeigen: The invention is explained in more detail below with reference to the figures. Show it:
Fig. 1 den Vergleich der Breiten der Photonenzähl Statistiken von normalem und gequetschtem Laserlicht. Fig. 1 comparison of the widths of the photon count statistics of normal and squeezed laser light.
Fig. 2 die Reduzierung der spektralen Rauschleistung durch gequetschtes Laserlicht bei Erhalt des Signals, also die Verbesserung des Signal-zu- Rausch-Verhältnisses. 2 shows the reduction in spectral noise power due to squeezed laser light when the signal is retained, ie the improvement in the signal-to-noise ratio.
Fig. 3 eine beispielhafte Vorrichtung für eine photometrische Massenbestimmung mit transmittiertem Laserlicht und vorwärtsgestreutem Signallicht, 3 shows an exemplary device for photometric mass determination with transmitted laser light and forward-scattered signal light,
Fig. 4 ein zweites Ausführungsbeispiel für eine photometrische Massenbestimmung mit transmittiertem Laserlicht und vorwärtsgestreutem Signallicht, 4 shows a second exemplary embodiment for a photometric mass determination with transmitted laser light and forward-scattered signal light,
Fig. 5 ein drittes Ausführungsbeispiel für eine photometrische Massenbestimmung mit reflektiertem Laserlicht und rückgestreutem Signallicht, Fig. 6 ein viertes Ausführungsbeispiel für eine photometrische Massenbestimmung mit reflektiertem Laserlicht und rückgestreutem Signallicht. 5 shows a third exemplary embodiment for a photometric mass determination with reflected laser light and backscattered signal light, 6 shows a fourth exemplary embodiment for a photometric mass determination with reflected laser light and backscattered signal light.
Figur 1 zeigt in einer beispielhaften Darstellung die Photonenzähl Statistik von gequetschtem Laserlicht im Vergleich zu der eines konventionellen Lasers. Werden beispielsweise eine Lichtleistung und eine Messzeit verwendet, die im Mittel zu 10.000 registrierten Photonen führen, so schwankt diese Zahl beim besten klassischen Laser bei wiederholtem Messen mit einer Standardabweichung von 100 (Wurzel von 10.000). Die Standardabweichung ist die halbe Breite der Photonenstatistik und entspricht dem Photonenschrotrauschen. Sie begrenzt die Messempfindlichkeit. Verwendet man gequetschtes Licht mit einem Quetschfaktor von lOdB, reduziert sich die Standardabweichung auf ca. 32 (Wurzel von 1000). Jede einzelne Messung ist damit bereits genauso gut wie eine Mittelung aus 10 Messungen mit einem klassischen Laser derselben Leistung. Die Gesamtmesszeit verkürzt sich um den Faktor 10. FIG. 1 shows in an exemplary representation the photon counting statistics of squeezed laser light in comparison to that of a conventional laser. If, for example, a light output and a measuring time are used that lead to an average of 10,000 registered photons, this number fluctuates with the best classic laser with repeated measurements with a standard deviation of 100 (root of 10,000). The standard deviation is half the width of the photon statistics and corresponds to the photon shot noise. It limits the measurement sensitivity. If squeezed light with a squeeze factor of lOdB is used, the standard deviation is reduced to approx. 32 (root of 1000). Each individual measurement is therefore just as good as an average of 10 measurements with a classic laser of the same power. The total measurement time is reduced by a factor of 10.
Der Effekt der Verwendung des gequetschten Laserlichts wird in Figur 2 deutlich. Auf der linken Seite von Figur 2 sieht man, wie sich durch die Verwendung von gequetschtem Licht das spektral zerlegte Schrotrauschen des Lasers reduziert und so ein deutlich verbessertes Signal-zu-Schrotrauschen ermöglicht wird. Rechts ist zu erkennen, wie schwache Signale, welche ohne gequetschtes Licht kaum zu erkennen sind, durch das gequetschte Licht deutlich sichtbar werden und ausgewertet werden können. In den Diagrammen ist die Rauschleistung über der Frequenz aufgetragen. Die Rauschleistung integriert über alle Messfrequenzen entspricht der Varianz der Photonenzahlunschärfe, also dem Quadrat der Standardabweichung in Figur 1. Eine mögliche Ausgestaltung der Messvorrichtung ist in Figur 3 dargestellt. In der Figur sind die für das Funktionsprinzip relevanten optischen Elemente dargestellt und zur besseren Übersicht weitere Elemente fortgelassen worden. Ausgehend von einem Laserstrahl 10 wird gequetschtes Laserlicht 12 überlagert und von einem Scanelement 14 abgelenkt. Die Überlagerung erfolgt an einem beidseitig beschichteten Spiegel, wobei die Seite mit R = 99% in der Figur 3, die das gequetschte Laserlicht reflektierende Seite ist. Der Wert von 99% ist nur eine ungefähre Angabe. Das Scanelement führt eine räumlich begrenzte Bewegung mit einer Frequenz f durch. Das Scanelement 14 kann hierbei als Gal vo- Scanner, ein Micromirror, ein Acoustooptic deflector oder als ein Electro optic deflector (EOD) ausgebildet sein. Römer G. et al. in „Elektro-optik und Acoustooptik-Laserbeamscanners“, Physics Procedia 56 (214) 29-39 beschreiben verschiedene Formen von Laserstrahlscannern. Diese unterscheiden sich in einer Reihe von Kenngrößen. Bei dem akusto-opti sehen Deflektor (AOD) wird der Brechungsindex eines Materials durch eine stehende akustische Welle verändert, um den Laserstrahl abzulenken. Derartige AOD- Deflektoren können paarweise angeordnet werden, um eine Ablenkung in X- und in Y-Richtung zu erzielen. Auch elektro-optische Deflektoren EOD beruhen auf einer Änderung des Brechungsindex allerdings als Ergebnis eines angelegten elektrischen Feldes. Das Objektiv 16 lenkt den durch das Scanelement abgelenkten Laserstahl auf den Probenhalter mit der Probe. Durch die Bewegung des Scanelements wird auf dem Probenhalter 18 ein endlicher Bereich mit der Frequenz f überstrichen, die auch als eine Scanfrequenz funktioniert. Wie die schematische Vergrößerung 20 zeigt, führt dies dazu, dass ein zu untersuchendes Objekt, das auch in einer Lösung auf einem Objektträger vorliegen kann, zwei Mal pro Scanperiode überstrichen wird. Das an dem Objekt gestreute Licht interferiert mit dem transmittierten Laserlicht und wird durch ein zweites Objektiv 22 auf eine PIN-Photodiode fokussiert. Das Messsignal der PIN-Photodiode 24 geht an einen Lock-in- Verstärker, der Signale der doppelten Frequenz 2f besonders verstärkt. Die Referenzsignale mit der Frequenz f und 2f stammen von einem Frequenzgenerator 28. Der Frequenzgenerator stellt ein Signal 30 mit der Frequenz f dem Scanelement zur Verfügung, das mit dieser Frequenz den Bereich abscannt, wobei zwischen Frequenzgenerator und Scanelement noch ein oder mehrere Verstärker geschaltet sein können, beispielsweise um die erforderliche Spannung von einigen 100 V für ein EOD bereit zu stellen. Ein zweites Signal 32 mit der doppelten Frequenz 2f wird an den Lock-in- Verstärker 26 als Referenzsignal angelegt. Die Phasenlage zwischen Messsignal und Referenzsignal 26 kann eingestellt werden. The effect of using the squeezed laser light can be seen in FIG. On the left-hand side of FIG. 2 one can see how the use of squeezed light reduces the spectrally broken down shot noise of the laser and a significantly improved signal-to-shot noise is thus made possible. On the right you can see how weak signals, which can hardly be seen without squeezed light, become clearly visible and can be evaluated by the squeezed light. The noise power is plotted against the frequency in the diagrams. The noise power integrated over all measurement frequencies corresponds to the variance of the photon number uncertainty, i.e. the square of the standard deviation in Figure 1. A possible embodiment of the measuring device is shown in FIG. The optical elements relevant to the functional principle are shown in the figure and further elements have been left out for a better overview. Coming from a laser beam 10 , squeezed laser light 12 is superimposed and deflected by a scanning element 14 . The superimposition takes place on a mirror coated on both sides, the side with R=99% in FIG. 3 being the side reflecting the squeezed laser light. The value of 99% is only an approximation. The scanning element performs a spatially limited movement with a frequency f. The scan element 14 can be configured as a gal vo scanner, a micromirror, an acoustooptic deflector or as an electro optic deflector (EOD). Romer G. et al. in "Elektro-optik und Acoustooptik- Laserbeamscanners", Physics Procedia 56 (214) 29-39 describe different forms of laser beam scanners. These differ in a number of parameters. With the acousto-optical deflector (AOD), the refractive index of a material is changed by a standing acoustic wave in order to deflect the laser beam. Such AOD deflectors can be arranged in pairs to provide deflection in both the X and Y directions. Electro-optical deflectors EOD are also based on a change in the refractive index, albeit as a result of an applied electric field. The lens 16 deflects the laser beam deflected by the scanning element onto the sample holder with the sample. Due to the movement of the scanning element, a finite area with the frequency f is swept on the sample holder 18, which also functions as a scanning frequency. As the schematic enlargement 20 shows, this means that an object to be examined, which can also be present in a solution on a slide, is scanned twice per scan period. The light scattered on the object interferes with the transmitted laser light and is focused by a second lens 22 onto a PIN photodiode. The measurement signal from the PIN photodiode 24 goes to a lock-in amplifier, which particularly amplifies signals at twice the frequency 2f. The reference signals with frequency f and 2f come from a frequency generator 28. The frequency generator provides a signal 30 with the frequency f to the scan element, which scans the area with this frequency, with one or more amplifiers being able to be connected between the frequency generator and the scan element, for example to provide the required voltage of some To provide 100 V for an EOD. A second signal 32 with twice the frequency 2f is applied to the lock-in amplifier 26 as a reference signal. The phase angle between the measurement signal and the reference signal 26 can be adjusted.
Figur 4 zeigt einen alternativen Aufbau, wobei gleiche Elemente mit gleichen Bezugszeichen gekennzeichnet sind. Über einen 50/50-Strahlteiler 42 werden das gequetschte Laserlicht 12 und herkömmliches Laserlicht überlagert. Der Strahlteiler 42 ist hier beispielhaft mit 50/50 angegeben; es kann jedoch mit jedem Strahlteilerverhältnis gearbeitet werden, beispielsweise auch 30/70 oder 80/20. Während der eine Strahl analog zu Figur 3 den Probenhalter 18 durchläuft und in der ersten PIN-Diode 24 erfasst wird, wird der zweite Teil des Strahlers in einer zweiten PIN-Diode 34 erfasst. Beide Messsignale werden in einem Subtraktor voneinander subtrahiert, bevor sie in einem Lock-in- Verstärker 40 verstärkt werden. Um mit der Subtraktion das technische Rauschen der Messung zu unterdrücken, ist ein variabler Verstärker oder Abschwächer 36 eingebaut, um die elektrischen Signale von Diode 34 und 24 auszugleichen, so dass nach der Subtraktion das in beiden Signalen identische Rauschen möglichst gut zu Null subtrahiert wird. FIG. 4 shows an alternative structure, identical elements being identified by identical reference symbols. The squeezed laser light 12 and conventional laser light are superimposed via a 50/50 beam splitter 42 . The beam splitter 42 is given here as 50/50 by way of example; however, any beam splitter ratio can be used, for example 30/70 or 80/20. While one beam passes through the sample holder 18 analogously to FIG. 3 and is detected in the first PIN diode 24 , the second part of the radiator is detected in a second PIN diode 34 . Both measurement signals are subtracted from one another in a subtractor before they are amplified in a lock-in amplifier 40 . In order to suppress the technical noise of the measurement with the subtraction, a variable amplifier or attenuator 36 is installed to balance the electrical signals from diodes 34 and 24, so that after the subtraction the noise, which is identical in both signals, is subtracted to zero as well as possible.
Figur 5 zeigt das einfallende Laserlicht 50, bei dem bereits herkömmliches und gequetschtes Laserlicht überlagert sind. Grundsätzlich ist es auch möglich, in 50 ausschließlich gequetschtes Laserlicht einzusetzen Aii Das Gesamtlaserlicht wird in dem Scanelement, das beispielsweise als ein elektro-optischer Deflektor (EOD) ausgebildet ist, mit einer Scanfrequenz abgelenkt. Das abgelenkte Laserlicht wird über ein Objektiv 54 auf einen Probenhalter 56 gerichtet. Das Objektiv 54 kann eine oder mehrere vorgeschaltete Linsen aufweisen, die ebenfalls als Teil des Objektivs zu verstehen sind. Der Objekthalter 56 besitzt ein Abdeckglas 58, das mit einer Antireflex-Schicht ausgestattet ist. Reflektiert wird das einfallende Laserlicht an einem hoch reflektiv beschichteten Substrat 60. Hierbei kann es sich beispielsweise um einen hochreflektierenden Spiegel handeln. Zwischen Abdeckglas 58 und Substrat 60 befindet sich die Probe, mit dem oder den zu untersuchenden Objekten 62. Das reflektierte Laserlicht wird über die Optik 54 zurück an einen Faraday-Isolator 64 geworfen. Statt eines Faraday-Isolators können auch optische Elemente mit äquivalentem Effekt, z. B. eine Kombination aus Lamb da- Viertel -Platte und einem polarisierendem Strahlteilerwürfel (PBS) verwendet werden. Durch den Faraday- Isolator wird der reflektierte Strahl 65 von dem ursprünglichen (hinlaufenden) Strahlengang getrennt und auf eine PIN-Photodiode 66 detektiert. Über einen Lock- in-Verstärker 68, an dem die doppelte Scanfrequenz 2f anliegt, wird der Signalanteil mit der doppelten Scanfrequenz 2f besonders verstärkt. Die Frequenzen f für das Scanelement 52 und 2f für den Lock-in- Verstärker stammen von einem Frequenzgenerator 70. FIG. 5 shows the incident laser light 50, in which conventional and squeezed laser light are already superimposed. In principle, it is also possible to use only squeezed laser light in 50 Aii. The total laser light is deflected at a scanning frequency in the scanning element, which is designed, for example, as an electro-optical deflector (EOD). The deflected laser light is directed to a sample holder 56 via a lens 54 . The lens 54 can have one or more lenses connected in front, which are also to be understood as part of the lens. The object holder 56 has a cover glass 58 which is equipped with an anti-reflection layer. The incident laser light is reflected on a substrate 60 with a highly reflective coating. This can be, for example, a highly reflective mirror. The sample is located between the cover glass 58 and the substrate 60, with the object or objects 62 to be examined. Instead of a Faraday isolator, optical elements with an equivalent effect, e.g. For example, a combination of a quarter-wave plate and a polarizing beam splitter cube (PBS) can be used. The reflected beam 65 is separated from the original (incoming) beam path by the Faraday isolator and detected on a PIN photodiode 66 . The signal component with double the scanning frequency 2f is particularly amplified via a lock-in amplifier 68, to which double the scanning frequency 2f is applied. The frequencies f for the scan element 52 and 2f for the lock-in amplifier come from a frequency generator 70.
Figur 6 zeigt das vierte Ausführungsbeispiel, das mit zwei PIN-Photodioden 72, 74 arbeitet. An einem 50/50-Strahlteiler 80 wird das einfallende Laserlicht 76 und das gequetschte Laserlicht 78 überlagert und an das Scanelement 82 sowie die PIN- Photodiode 72 geleitet. Das auf den Objektträger 88 gerichtete Laserlicht wird von dem Scanelement 82 mit einer Frequenz f abgelenkt und über das Objektiv 86 auf den Objektträger 88 gerichtet, wobei dem Objektiv bei Bedarf eine oder mehrere Linsen vorgeschaltet sein können. Der Objektträger 88 besitzt, wie auch in dem dritten Ausführungsbeispiel, eine Antireflex-Schicht am Abdeckglas 90 sowie ein hoch reflektiv beschichtetes Substrat 92. Das reflektierte Laserlicht wird an dem Faraday- Isolator 94 ausgekoppelt und auf eine zweite PIN-Photodiode 74 gelenkt. Die Signale der beiden Photodioden 72, 74 werden voneinander subtrahiert 96. Das Differenzsignal liegt an dem Lock-in- Verstärker 98 an, der das Signal im Hinblick auf die doppelte Scanfrequenz 2f auswertet. Zur Verbesserung der Signalwerte bei der Subtraktion 96 ist ein variabler Verstärker oder Abschwächer 100 vorgesehen, der die elektrischen Signale der Photodiode 72 gegenüber denen der Photodiode 74 ausgleicht. FIG. 6 shows the fourth exemplary embodiment, which works with two PIN photodiodes 72, 74. The incident laser light 76 and the squeezed laser light 78 are superimposed on a 50/50 beam splitter 80 and passed to the scanning element 82 and the PIN photodiode 72 . The laser light directed onto the object carrier 88 is deflected by the scanning element 82 with a frequency f and is directed onto the object carrier 88 via the lens 86, with one or more lenses being able to be arranged in front of the lens if required. As in the third exemplary embodiment, the slide 88 has an antireflection layer on the cover glass 90 and a substrate 92 with a highly reflective coating. The signals of the two photodiodes 72, 74 are subtracted from one another 96. The difference signal is present at the lock-in amplifier 98, which evaluates the signal with regard to double the scanning frequency 2f. To improve the signal values in the subtraction 96, a variable amplifier or attenuator 100 is provided, which equalizes the electrical signals from the photodiode 72 with respect to those from the photodiode 74.
In den vier vorstehenden Ausführungsbeispielen der Figuren 3 bis 6 geht der Einsatz von gequetschtem Licht mit folgenden Merkmalen einher. Es erfolgt die Detektion von transmittiertem oder reflektiertem Laserlicht. Es wird eine Modulation des detektierten Signals erzeugt, indem der Laserstrahl relativ zur Probe transversal gescannt wird. Die durch das Scannen entstehende Modulation im Laserlicht wird zur selektiven Detektion der relevanten Messsignale über einen Lock-in- Verstärker benutzt. Diese Merkmale helfen, das Messsignal in einen Schrotrausch-limitierten Bereich zu verschieben. Der für die Modulation relevante Frequenzbereich liegt dabei oberhalb von 200 Hz, bevorzugt oberhalb von 1 kHz, bevorzugt noch höher. Die Vermeidung von optischen Verlusten durch schwache Reflexion vermeidet eine Verringerung des Quetschfaktors. In the four above exemplary embodiments of FIGS. 3 to 6, the use of squeezed light is associated with the following features. Transmitted or reflected laser light is detected. A modulation of the detected signal is generated by transversely scanning the laser beam relative to the sample. The modulation in the laser light resulting from the scanning is used for the selective detection of the relevant measurement signals via a lock-in amplifier. These features help shift the measurement signal into a shot-noise limited range. The frequency range relevant to the modulation is above 200 Hz, preferably above 1 kHz, preferably even higher. Avoiding optical losses due to weak reflection avoids reducing the squeeze factor.
Das gequetschte Laserlicht auf dem photoelektrischen Detektor ist durch die Streuung am Biomolekül bei der doppelten Scanfrequenz amplitudenmoduliert, bzw. bei zwei Frequenzen amplitudenmoduliert, die in der Summe die doppelte Scanfrequenz ergeben. Dadurch dass die Scanfrequenz hoch ist, wird erreicht, dass störende Einflüsse, z.B. durch Streulicht aus unerwünschten Quellen, unterdrückt sind. Das transmittierte Licht koppelt in eine zweite Abbildungsoptik mit möglichst hoher numerischer Apertur und wenig optischem Verlust. Eine hohe numerische Apertur ist wichtig, um das Licht stark fokussieren zu können. Bei der Verwendung des reflektierten Laserlichts ist nur eine Abbildungsoptik erforderlich, wodurch sich der Aufwand für die Messvorrichtung verringert. Bei beiden Ansätzen wird das gestreute Licht auf die Detektionsdiode fokussiert. Diese misst die modulierte Lichtleistung. Die Modulationstiefe, also der Unterschied zwischen maximaler und minimal detektierter Intensität schwankt dabei mit der Größe des Moleküls, denn größere Moleküle streuen mehr Licht. Dadurch ist auch in diesem Aufbau ein Zusammenhang zwischen messbarem Kontrast als photometrischer Größe und der Molekülmasse gegeben. Da die Streuamplitude der Moleküle jedoch nur sehr klein ist, ist auch die Modulationstiefe der Laserlichtleistung gering. Intensitätsmaximum und Minimum unterscheiden sich also nur schwach von der an der Diode gemessenen mittleren Leistung. Da die Modulationsfrequenz jedoch bekannt ist, kann das Signal mit einem Lock-in- Verstärker gefiltert werden und so mit einem guten Signal zum Rauschen- Verhältnis sichtbar gemacht werden. The squeezed laser light on the photoelectric detector is amplitude-modulated by the scattering at the biomolecule at twice the scanning frequency, or amplitude-modulated at two frequencies, which add up to double the scanning frequency. The fact that the scanning frequency is high means that disruptive influences, such as scattered light from unwanted sources, are suppressed. The transmitted light is coupled into a second imaging optics with the highest possible numerical aperture and little optical loss. A high numerical aperture is important in order to be able to strongly focus the light. When using the reflected laser light only an imaging optics is required, whereby the Effort for the measuring device reduced. With both approaches, the scattered light is focused onto the detection diode. This measures the modulated light output. The modulation depth, i.e. the difference between the maximum and minimum detected intensity, varies with the size of the molecule, because larger molecules scatter more light. As a result, there is also a connection between the measurable contrast as a photometric variable and the molecular mass in this structure. However, since the scattering amplitude of the molecules is only very small, the modulation depth of the laser light output is also low. The intensity maximum and minimum therefore differ only slightly from the average power measured at the diode. However, since the modulation frequency is known, the signal can be filtered with a lock-in amplifier and thus visualized with a good signal-to-noise ratio.
Bezugszeichenliste Reference List
Laserstrahl gequetschtes Laserlicht Laser beam squeezed laser light
Scanelement scan item
Objektiv lens
Probenhalter sample holder
Vergrößerung zweites Objektiv Magnification second lens
PIN-Diode PIN diode
Lock-in- V erstärker Lock-in amplifier
F requenzgenerator frequency generator
Signal zweites Signal zweite PIN-Diode Signal second signal second PIN diode
Abschwächer attenuator
Substraktionspunkt subtraction point
Lock-in- V erstärker Lock-in amplifier
50/50-Strahlteiler 50/50 beamsplitter
Laserlicht laser light
Scanelement scan item
Objektiv lens
Probenhalter sample holder
Abdeckglas cover glass
Substrat substrate
Objekte objects
Faraday-Isolator reflektierter Strahl PIN-PhotodiodeFaraday isolator reflected beam PIN photodiode
Lock-in- V erstärkerLock-in amplifier
F requenzgenerator PIN-Photodiode PIN-Photodiode einfallendes Laserlicht gequetschtes Laserlicht 50/50-Strahlteiler ScanelementFrequency generator PIN photodiode PIN photodiode Incident laser light Squeezed laser light 50/50 beam splitter Scan element
Objektiv Objektträger Abdeckglas Substrat objective slide cover glass substrate
Faraday-Isolator Subtraktion Faraday isolator subtraction
Lock-in- V erstärker Abschwächer Lock-in amplifier Attenuator

Claims

Ansprüche: Expectations:
1. Vorrichtung zu photometrischen Massenbestimmung, die mindestens eine Laserquelle und eine optische Messeinrichtung aufweist, wobei mindestens eine Laserquelle auf das zu untersuchende Objekt, insbesondere einzelne Biomoleküle oder Viren, gerichtet ist und die optische Messeinrichtung an dem zu untersuchenden Objekt gestreutes Laserlicht erfasst, dadurch gekennzeichnet, dass der Laserstrahl gequetschtes Laserlicht aufweist. 1. Device for photometric mass determination, which has at least one laser source and an optical measuring device, wherein at least one laser source is aimed at the object to be examined, in particular individual biomolecules or viruses, and the optical measuring device detects laser light scattered on the object to be examined, characterized in that that the laser beam has squeezed laser light.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass rückreflektiertes zusammen mit rückgestreutem Laserlicht in die optische Messeinrichtung fällt. 2. Device according to claim 1, characterized in that reflected laser light falls into the optical measuring device together with backscattered laser light.
3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das zu untersuchende Objekt vor oder auf einem hoch reflektiv beschichteten Substrat angeordnet ist. 3. Device according to claim 2, characterized in that the object to be examined is arranged in front of or on a highly reflective coated substrate.
4. Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das zu untersuchende Objekt hinter einem mit einer Antireflex-Beschichtung versehenem Abdeckglas angeordnet ist. 4. Device according to claim 2 or 3, characterized in that the object to be examined is arranged behind a cover glass provided with an anti-reflective coating.
5. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass transmittiertes zusammen mit vorwärtsgestreutem Laserlicht in die optische Messeinrichtung fällt. 5. Device according to claim 1, characterized in that transmitted laser light falls into the optical measuring device together with forward-scattered laser light.
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das auf das zu untersuchende Objekt gerichtete Laserlicht mit einer vorgegebenen Frequenz (f) über einen transversal-räumlichen Bereich der Probe streicht. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine Auswerteeinrichtung für die optische Messeinrichtung vorgesehen ist, die Messsignale mit dem doppelten der vorgegebenen Frequenz auswertet. Vorrichtung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass ein Frequenzgenerator für die vorbestimmte Frequenz und die doppelte Frequenz vorliegt. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass für die Messsignale ein Lock-In Verstärker vorgesehen ist, an dem ein Signal mit der doppelten Frequenz als Referenz- Signal anliegt. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass als optische Messeinrichtung eine Photodiode vorgesehen ist. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass gequetschtes Laserlicht mit verschwindendem oder ohne Anteil an herkömmlichen Laserlicht miteinander kombiniert sind. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Laserlicht über eine erste Abbildungsoptik fokussiert auf das zu untersuchende Objekt fällt. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass eine Steuereinrichtung vorgesehen ist, die für ein gegebenes Messsignal den gescannten Bereich des zu untersuchenden Objekts so verstellt, dass ein Anteil des Signals mit der doppelten der vorgegebenen Frequenz zunimmt. Verfahren zur photometrischen Massenbestimmung, bei dem Laserlicht auf ein zu untersuchendes Objekt, insbesondere einzelne Biomoleküle oder Viren gerichtet und an dem zu untersuchenden Objekt gestreutes Laserlicht gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, dass der Laserstrahl gequetschtes Laserlicht aufweist. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das gestreute Licht zusammen mit transmittiertem oder reflektiertem Laserlicht gemessen wird. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Laserstrahl mit einer vorbestimmten Frequenz (f) den Bereich des zu messenden Objekts scannt und die Messsignale bei Frequenzen ausgewertet werden, die sich durch die vorgegebene Frequenz ergeben. Verfahren nach Anspruchlö, dadurch gekennzeichnet, dass die vorbestimmte Frequenz (f) oberhalb von 200 Hz, bevorzugt oberhalb von 1 kHz liegt. 6. Device according to one of claims 1 to 5, characterized in that the laser light directed onto the object to be examined sweeps with a predetermined frequency (f) over a transversal-spatial area of the sample. Device according to Claim 6, characterized in that an evaluation device is provided for the optical measuring device, which evaluates measurement signals with twice the predetermined frequency. Device according to Claim 6 or 7, characterized in that there is a frequency generator for the predetermined frequency and twice the frequency. Device according to Claim 8, characterized in that a lock-in amplifier is provided for the measurement signals, at which a signal with twice the frequency is present as a reference signal. Device according to one of Claims 1 to 9, characterized in that a photodiode is provided as the optical measuring device. Device according to one of Claims 1 to 10, characterized in that squeezed laser light is combined with one another with vanishing or no proportion of conventional laser light. Device according to one of Claims 1 to 11, characterized in that the laser light falls onto the object to be examined in a focused manner via a first imaging optics. Device according to one of Claims 6 to 12, characterized in that a control device is provided which, for a given measurement signal, adjusts the scanned area of the object to be examined in such a way that a proportion of the signal increases with twice the predetermined frequency. Method for photometric mass determination, in which laser light is directed onto an object to be examined, in particular individual biomolecules or viruses, and laser light scattered on the object to be examined is measured, characterized in that the laser beam has squeezed laser light. Method according to Claim 14, characterized in that the scattered light is measured together with transmitted or reflected laser light. Method according to Claim 14 or 15, characterized in that the laser beam scans the area of the object to be measured at a predetermined frequency (f) and the measurement signals are evaluated at frequencies which result from the predetermined frequency. Method according to Claim 1, characterized in that the predetermined frequency (f) is above 200 Hz, preferably above 1 kHz.
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