WO2022163564A1 - フィロウイルス科ウイルス複製阻害剤 - Google Patents

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健司 小川
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国立研究開発法人理化学研究所
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters

Definitions

  • the present invention relates to a Filoviridae virus replication inhibitor, a pharmaceutical composition for treating a Filoviridae virus infection, a method for inhibiting replication of a Filoviridae virus, and a method for evaluating replication activity of a Filoviridae virus.
  • Ebola virus disease (Ebola hemorrhagic fever) is an acute febrile infectious disease with an extremely high fatality rate caused by Ebola virus (EBOV) infection. Since the first case of infection was reported in Sudan in 1976 (284 cases, 151 deaths, 51% case fatality rate), there have been more than 20 outbreaks, mainly in Central Africa. In particular, the outbreak in West Africa in 2014, which was the worst case of infection in history, not only reached 27,550 infected people and 11,235 deaths (fatality rate of 41%). It is still fresh in our memory that the infection spread to other Western countries and witnessed the rage.
  • EBOV Ebola virus disease
  • Non-Patent Document 1 discloses a method for treating Ebola hemorrhagic fever.
  • New viral replication inhibitors against EBOV are needed to establish new preventive and therapeutic methods for Ebola hemorrhagic fever.
  • the purpose of the present invention is to provide a new viral replication inhibitor against EBOV.
  • EBOV is a virus whose genome is a minus-strand RNA with a total length of about 18 to 19 kb.
  • NP ribonucleoprotein
  • VP30 is a multifunctional protein that is essential for replication and forms hexamers. Each multimer interacts with genomic RNA, VP35 and L to form RNP.
  • RNPs are important for both viral protein expression and genome replication, thus the multimerization and interaction of NP and VP30 represent a critical early step in viral replication.
  • the present inventors focused on the potential of EBOV as a drug discovery target for NP and VP30, and conducted intensive research. As a result, they discovered deletion mutant NP and deletion mutant VP30 capable of inhibiting replication of EBOV, thereby completing the present invention.
  • the present invention is based on the above findings and provides the following.
  • a Filoviridae virus replication inhibitor comprising a polypeptide selected from the group consisting of (a) to (e) below.
  • a polypeptide containing a position corresponding to position 337 A polypeptide in which an arbitrary amino acid sequence is added to the N-terminus and/or
  • the polypeptide described in (b) above comprises positions 20 to 500 in the Zaire Ebola virus NP protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or the polypeptide described in (d)
  • the Filoviridae according to (1) or (2) comprising positions corresponding to positions 20 to 500 of SEQ ID NO: 1 in the Filoviridae orthologue of the Zaire Ebola virus NP protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • Viral replication inhibitor is e.
  • a Filoviridae virus replication inhibitor comprising a polypeptide selected from the group consisting of (f) to (j) below.
  • the polypeptide described in (g) above comprises positions 91 to 288 in the Zaire Ebola virus VP30 protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, or the polypeptide described in (i) above
  • the Filoviridae according to (4) or (5) which comprises positions corresponding to positions 91 to 288 of SEQ ID NO: 3 in the Filoviridae orthologue of the Zaire Ebola virus VP30 protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • Viral replication inhibitor is included in the polypeptide described in (g) above.
  • An inhibitor of Filoviridae virus replication comprising an expression vector containing a condition.
  • a pharmaceutical composition for treating Filoviridae virus infection comprising the Filoviridae virus replication inhibitor according to any one of (1) to (8) as an active ingredient.
  • a method of inhibiting replication of a Filoviridae virus comprising the step of introducing into a Filoviridae virus.
  • a method for evaluating the replication activity of a Filoviridae virus comprising introducing a reporter gene expression vector, an NP gene expression vector, a VP30 gene expression vector, a VP35 gene expression vector, and an L gene expression vector into a host cell.
  • the reporter gene expression vector comprises an RNA polymerase I promoter sequence, a Filoviridae viral trailer sequence, a reporter gene sequence, a Filoviridae viral leader sequence, and RNA polymerase I terminator sequence in the above order, wherein the reporter gene sequence is included in the reverse orientation with respect to the promoter sequence, and the NP gene expression vector is capable of inducing gene expression in a host cell
  • the NP gene of the Filoviridae virus is arranged downstream of the promoter in an expressible state
  • the VP30 gene expression vector contains the NP gene of the Filoviridae virus downstream of the promoter capable of inducing gene expression in host cells.
  • the VP30 gene is placed in an expressible state, and the VP35 gene expression vector is placed downstream of a promoter capable of inducing gene expression in host cells in a state where the VP35 gene of the Filoviridae virus can be expressed.
  • the L gene expression vector is arranged downstream of a promoter capable of inducing gene expression in host cells in a state in which the L gene of a Filoviridae virus can be expressed, and the NP gene expression vector, the VP30 gene.
  • a new viral replication inhibitor against EBOV can be provided.
  • FIG. 1 shows the genome structure of EBOV.
  • EBOV is a virus whose genome is a negative-strand RNA with a total length of about 18-19 kb. (Viral protein 30), VP24 (Viral protein 24), and L (Large protein; RNA Polymerase). The 5' and 3' terminal regions of the EBOV genome have untranslated regions, the trailer and the leader.
  • FIG. 1 shows the structure of ribonucleoprotein (RNP) complexes within EBOV virus particles. EBOV genomic RNA binds to NP, VP35, VP30, and L and exists as an RNP complex.
  • FIG. 1 shows the principle of the EBOV minigenome assay.
  • FIG. 1 shows the principle of the EBOV minigenome assay.
  • FIG. 3 shows the results of examining the optimal ratio of EBOV proteins (NP, VP35, VP30, and L) in the EBOV minigenome assay.
  • FIG. 2 shows the structures of the EBOV wild-type NP protein and deletion mutant NP ( ⁇ NP).
  • A shows the structure of the wild-type NP protein.
  • B shows the structure of the wild-type NP protein.
  • C shows the structures of wild-type NP protein and ⁇ NP.
  • FIG. 4 shows the EBOV replication inhibitory effect of ⁇ NP.
  • A shows the structure of ⁇ NP. In constructs 4-9, Met is added to the N-terminus of ⁇ NP.
  • (B) shows the results of measuring the inhibitory effect of ⁇ NP on EBOV replication.
  • FIG. 1 shows the structure of the wild-type NP protein and deletion mutant NP.
  • A shows the structure of the wild-type NP protein.
  • B shows the structure of the wild-type NP protein and ⁇ NP.
  • FIG. 4 shows
  • FIG. 3 shows the EBOV replication inhibitory effect of ⁇ NP(20-405) further modified.
  • A shows the structure of ⁇ NP(20-405) further modified. All have Met added to the N-terminus.
  • B shows the results of measuring the EBOV replication inhibitory effect.
  • FIG. 3 shows the EBOV replication inhibitory effect when a ⁇ NP(20-337) expression plasmid was introduced in an amount 1/16 to 4 times that of the wild-type NP expression plasmid.
  • FIG. 2 shows the inhibitory effect of ⁇ NP(20-337) introduced with amino acid substitution mutations on EBOV replication.
  • FIG. 2 shows the structure of the EBOV wild-type VP30 protein.
  • VP30 has two domain structures, an N-terminal domain (NTD) and a C-terminal domain (CTD).
  • NTDs have an RNA binding domain, a Zn finger motif, and a hexamerization motif.
  • the CTD contains dimerization and NP binding domains.
  • FIG. 4 shows the EBOV replication inhibitory effect of deletion mutant VP30 ( ⁇ VP30).
  • A shows the structure of ⁇ VP30. In constructs 6-9, Met is added to the N-terminus of ⁇ VP30.
  • (B) shows the results of measuring the inhibitory effect of ⁇ VP30 on EBOV replication.
  • FIG. 10 shows the EBOV replication inhibitory effect of ⁇ VP30, which is a further modified version of ⁇ VP30(91-288).
  • FIG. 10 shows the EBOV replication inhibitory effect of ⁇ VP30, which is a further modified version of ⁇ VP30(91-288).
  • A shows the structure of ⁇ VP30, which is a further modification of ⁇ VP30(91-288). All have Met added to the N-terminus.
  • B shows the results of examining the EBOV replication inhibitory effect.
  • FIG. 3 shows the EBOV replication inhibitory activity of ⁇ VP30(91-272) and ⁇ VP30(91-254).
  • FIG. 2 shows the function of NP-PA, which is NP with a PA tag added to the C-terminus.
  • A EBOV replication activity by wild-type NP and NP-PA.
  • B Shows the inhibitory effect of ⁇ NP(20-405) and ⁇ VP30(91-254) on NP-PA-dependent EBOV replication.
  • FIG. 4 shows the results of examination of NP-PA complex formation by particle blotting.
  • FIG. 10 shows the results of examining the effects of ⁇ NP(20-405) and ⁇ VP30(91-254) on NP-PA complex formation by particle blotting.
  • FIG. 2 shows the structure and alignment of NP.
  • A shows the structure of the ZEBOV NP protein.
  • B Alignment of NP proteins in TAFV, BUBV, ZEBOV, RESTV, SEBOV (SUDV), LLOV and MARV. The location of each region shown in panel A is indicated above the sequence. This is a continuation of Figure 18-1. This is a continuation of Figure 18-2.
  • FIG. 3 shows the structure and alignment of VP30.
  • A) shows the structure of the ZEBOV VP30 protein.
  • Filoviridae virus replication inhibitor 1-1 is a Filoviridae virus replication inhibitor.
  • the Filoviridae virus replication inhibitor of the present invention is a peptide fragment derived from the NP protein or VP30 protein of a Filoviridae virus, a polypeptide having an arbitrary amino acid sequence added to its N-terminus and/or C-terminus, or a cell It consists of an expression vector capable of expressing either of them within.
  • the Filoviridae virus replication inhibitor of the present invention can be an active ingredient of a pharmaceutical composition for treating Filoviridae virus infection, which has a high effect of inhibiting the proliferation of Filoviridae virus in cells.
  • Filoviridae are viruses belonging to the order Mononegavirales and having a negative-strand RNA genome.
  • Filoviridae viruses include the genus Ebolavirus, the genus Marburgvirus, and the genus Cuevavirus.
  • Hosts for Filoviridae viruses include mammals such as humans, gorillas, chimpanzees, monkeys, deer, and bats.
  • Ebolavirus is a virus whose genome is about 18-19kb negative-strand RNA, and is known as the pathogen of Ebola hemorrhagic fever. Although the mechanism of EBOV infection remains largely unknown, it is believed that EBOV infects phagocytic immune cells such as macrophages and dendritic cells in the animal body.
  • NP Nucleoprotein
  • VP35 Virtual protein 35
  • VP40 Viral protein 40
  • GP Glycoprotein
  • VP30 Virtual protein 30
  • VP24 Virtual protein 24
  • L Large protein
  • ORFs of RNA Polymerase There are 7 kinds of ORFs of RNA Polymerase.
  • Viruses belonging to the Ebolavirus genus include Zaire ebolavirus (ZEBOV), Sudan ebolavirus (SUDV; SEBOV), Reston ebolavirus (RESTV), Tai Forest ebolavirus (TAFV). ), Bundibugyo ebolavirus (BUBV), etc. are known.
  • Zaire ebolavirus ZEBOV
  • Sudan ebolavirus SUDV
  • SEBOV Sudan ebolavirus
  • RESTV Reston ebolavirus
  • TAFV Tai Forest ebolavirus
  • BUBV Bundibugyo ebolavirus
  • Marburg virus is a virus whose genome is about 19 kb of negative RNA, and is known as the causative agent of Marburg hemorrhagic fever.
  • ORFs There are seven types of ORFs, NP, VP35, VP40, GP, VP30, VP24, and L, on the genome of viruses of the genus Marburg, as in the genus Ebolavirus.
  • Marburg marburg virus (MARV) is known as a virus belonging to the Marburg virus genus.
  • a virus belonging to the "Cuevavirus genus” is known to be Lloviu cuevavirus (LLOV) found in bats.
  • LLOV Lloviu cuevavirus
  • NP Nucleoprotein
  • NP Nucleoprotein
  • NP is the main component of the nucleocapsid of Filoviridae viruses and forms multimers (Fig. 2).
  • NP contains an N-terminal core domain, a C-terminal C-tail, and a non-conserved region in between (Figs. 5A and 5B).
  • the core domain of NP contains N and C lobes (Fig. 5A), between which an RNA binding glove is formed (Fig. 5B).
  • the core domain of NP contains 13 ⁇ -helices.
  • the Filoviridae virus NP is the ZEBOV NP protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and its Filoviridae orthologue.
  • NP examples include ZEBOV NP consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, SUDV NP consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, RESTV NP consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, and the amino acid shown in SEQ ID NO: 8.
  • examples include TAFV NP consisting of the sequence, BUBV NP consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:9, MARV NP consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:10, and LLOV NP consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:11. Alignments of the amino acid sequences of the NP proteins are shown in Figures 18-1 to 18-3.
  • base sequences encoding NP examples include the ZEBOV NP gene (SEQ ID NO: 2) and its codon-optimized sequence (SEQ ID NO: 18).
  • VP30 (Viral protein 30) is a multifunctional protein that plays an essential role in the replication of Filoviridae viruses and forms a hexamer (Fig. 2).
  • VP30 has two domain structures, an N-terminal domain (NTD) and a C-terminal domain (CTD) (Fig. 10).
  • NTDs have an RNA binding domain, a Zn finger motif, and a hexamerization motif.
  • the CTD contains seven ⁇ -helices and contains dimerization and NP-binding regions.
  • the VP30 of the Filoviridae virus is the ZEBOV VP30 protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and its Filoviridae ortholog.
  • VP30 examples include ZEBOV VP30 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, SUDV VP30 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, RESTV VP30 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, and the amino acid shown in SEQ ID NO: 14.
  • VP30 of TAFV consisting of the sequence
  • VP30 of BUBV consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15
  • VP30 of MARV consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16
  • VP30 of LLOV consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17.
  • Amino acid sequence alignments of VP30 proteins are shown in Figures 19-1 to 19-2.
  • nucleotide sequences encoding VP30 include the nucleotide sequence of the ZEBOV VP30 gene (SEQ ID NO: 4) and its codon-optimized nucleotide sequence (SEQ ID NO: 19).
  • the term "expression vector” refers to a vector that contains a gene or gene fragment (hereinafter referred to as "gene, etc.”) in an expressible state and contains an expression unit capable of controlling the expression of the gene, etc.
  • state capable of expression means that a gene or the like to be expressed is arranged in the downstream region of the promoter under the control of the promoter.
  • Vectors include plasmid vectors, virus vectors, and the like, and any vector can be used. Ordinarily, a plasmid vector, which is easily manipulated for gene recombination, may be used.
  • As the expression vector a commercially available expression vector for mammalian cells may be used. Examples include Promega's pCI vector and pSI vector. Expression vectors may also be shuttle vectors that are replicable between mammalian cells and bacteria such as E. coli.
  • promoter refers to a gene expression regulatory region that can control the expression of genes placed downstream (3' end side) in cells into which an expression vector has been introduced. Promoters can be classified into ubiquitous promoters (systemic promoters) and site-specific promoters, based on where genes under expression control are expressed.
  • a ubiquitous promoter is a promoter that controls the expression of a target gene or the like (target gene or the like) in all cells, that is, in the entire host individual.
  • a site-specific promoter is a promoter that controls the expression of a target gene or the like only in specific cells or tissues.
  • promoters are classified into constitutively active promoters, expression-inducible promoters, and time-specific active promoters based on the timing of expression.
  • a constitutively active promoter can constantly express a target gene or the like in a cell.
  • An expression-inducible promoter can induce the expression of a target gene or the like in cells at any time.
  • the time-specific active promoter can induce the expression of a target gene or the like in cells only at a specific time during the developmental stage. Both promoters can be understood as overexpression type promoters because they can bring about overexpression of target genes in host cells.
  • treatment refers to alleviation or elimination of symptoms associated with disease, prevention or suppression of disease progression, and cure of disease.
  • disease means a Filoviridae virus infection unless otherwise specified.
  • Filoviridae virus infection refers to an infection caused by a Filoviridae virus. Examples include Ebola hemorrhagic fever and Marburg hemorrhagic fever.
  • the Filoviridae virus replication inhibitor of the present invention consists of a peptide fragment (polypeptide) or an expression vector. Each configuration will be specifically described below.
  • the peptide fragment (polypeptide) constituting the Filoviridae virus replication inhibitor of the present invention is a peptide fragment derived from the NP protein of a Filoviridae virus, or an arbitrary amino acid sequence added to its N-terminus and/or C-terminus. or a peptide fragment derived from the VP30 protein of a Filoviridae virus, or a polypeptide having an arbitrary amino acid sequence added to its N-terminus and/or C-terminus.
  • the Filoviridae virus replication inhibitor of the present invention is It consists of a peptide fragment derived from the viral NP protein, or a polypeptide having an arbitrary amino acid sequence added to its N-terminus and/or C-terminus.
  • the peptide fragment derived from the NP protein of the Filoviridae virus is a peptide fragment derived from either the NP protein of the Zaire Ebola virus or the Filoviridae ortholog of the NP protein of the Zaire Ebola virus, It is a peptide fragment that can inhibit the replication of family viruses.
  • peptide fragment derived from the NP protein of the Filoviridae virus constituting the Filoviridae virus replication inhibitor of the present invention include (a) the NP protein of the Zaire Ebola virus, which consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • a polypeptide comprising positions corresponding to positions 20 to 337 of SEQ ID NO: 1 at positions corresponding to positions 1 to 500 of SEQ ID NO: 1 in the Filoviridae orthologue of the NP protein of Zaire Ebola virus. (a) to (d) will be described in more detail below.
  • (a) a polypeptide consisting of positions 20 to 337 in the Zaire Ebola virus NP protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the N-terminal of the 13 ⁇ -helices contained in the core domain of the NP protein. It is a polypeptide containing 12 flanking ⁇ -helices and corresponds to ⁇ NP(20-337) found in the Examples herein to have activity in inhibiting EBOV replication.
  • (b) a polypeptide comprising positions 20 to 337 in positions 1 to 500 of the NP protein of Zaire Ebola virus consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a Zaire Ebola virus consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. It is a peptide fragment contained in positions 1 to 500 of the NP protein of the virus and containing positions 20 to 337 of the NP protein of Zaire Ebola virus consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1.
  • the amino acid residue located at the N-terminus of the peptide fragment is located at any one of positions 1 to 20 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid residue located at the C-terminus of the peptide fragment is located at the sequence Located anywhere from 337 to 500 in the amino acid sequence indicated by number 1.
  • Specific examples of the polypeptide of (b) above include positions 20 to 337, positions 15 to 337, positions 10 to 337, and positions 5 and up in the NP protein of Zaire Ebola virus consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the polypeptide of (b) above comprises positions 1 to 337 in the Zaire Ebola virus NP protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1.
  • Examples of such polypeptides include positions 1 to 337, 1 to 350, 1 to 360, 1 to 370, and 1 to 370 in the Zaire Ebola virus NP protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the polypeptide of (b) above comprises positions 20 to 500 in the Zaire Ebola virus NP protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1.
  • examples of such polypeptides include positions 20 to 500, 18 to 500, 16 to 500, 14 to 500, and 14 to 500 in the Zaire Ebola virus NP protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • Examples include polypeptides consisting of positions 12-500, 10-500, 8-500, 6-500, 4-500, 2-500, or 1-500.
  • (c) A polypeptide consisting of positions corresponding to positions 20 to 337 of SEQ ID NO: 1 in the Filoviridae orthologue of the Zaire Ebola virus NP protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence of the NP ortholog in any virus to which it belongs is aligned with the amino acid sequence of the NP protein of Zaire Ebola virus consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and gaps are introduced as necessary to It is a polypeptide consisting of positions corresponding to positions 20 to 337 of SEQ ID NO: 1 when the degree of amino acid identity is maximized.
  • Examples of polypeptides containing this include positions 20 to 337 in positions 1 to 500 of the SUDV NP protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, as shown in Figures 18-1 to 18-3.
  • Polypeptide A polypeptide containing positions 20 to 337 in positions 1 to 500 of the RESTV NP protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7; A polypeptide containing positions 20 to 337 at position 500; a polypeptide containing positions 20 to 337 at positions 1 to 500 of the BUBV NP protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9; an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 and a polypeptide comprising positions 20 to 337 at positions 1 to 502 of the LLOV NP protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 is mentioned.
  • a polypeptide having an arbitrary amino acid sequence added to its N-terminus and/or C-terminus means any is a polypeptide to which the amino acid sequence of is added. Any amino acid sequence that differs from the polypeptide described in any one of (a) to (d) above can be used as the arbitrary amino acid sequence. Examples include, but are not limited to, ubiquitination sequences, nuclear localization signals, tag sequences, labeled proteins described below, and the like. Although the number of amino acids to be added is not limited, for example, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, There may be 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, or 1. In one embodiment, a Met residue can be added to the N-terminus of the polypeptide according to any of (a) to (d) above.
  • the polypeptide of (d) above comprises positions corresponding to positions 1 to 337 of SEQ ID NO: 1 in the Filoviridae orthologue of the Zaire Ebola virus NP protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. .
  • the polypeptide of (d) above comprises positions corresponding to positions 20 to 500 of SEQ ID NO: 1 in the Filoviridae orthologue of the Zaire Ebola virus NP protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. .
  • the Filoviridae ortholog may be an Ebolavirus ortholog.
  • the Filoviridae virus replication inhibitor of the present invention is It consists of a peptide fragment derived from the VP30 protein of a virus, or a polypeptide having an arbitrary amino acid sequence added to its N-terminus and/or C-terminus.
  • the peptide fragment derived from the VP30 protein of the Filoviridae virus is a peptide fragment derived from either the VP30 protein of the Zaire Ebola virus or the Filoviridae ortholog of the VP30 protein of the Zaire Ebola virus, It is a peptide fragment that can inhibit the replication of family viruses.
  • a specific example of the peptide fragment derived from the VP30 protein of the Filoviridae virus constituting the Filoviridae virus replication inhibitor of the present invention is (f) the VP30 protein of the Zaire Ebola virus, which consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • (f) a polypeptide consisting of positions 91 to 254 in the VP30 protein of Zaire Ebola virus, which consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3" is contained in the hexamerization motif and the C-terminal domain (CTD) of the VP30 protein.
  • ⁇ VP30 which is a polypeptide containing 6 ⁇ -helices located on the N-terminal side of the 7 ⁇ -helices that are found in the examples of the present specification and has the activity of inhibiting EBOV replication Corresponds to (91-254).
  • (g) a polypeptide comprising positions 91 to 254 at positions 47 to 288 of the VP30 protein of Zaire Ebola virus consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is a Zaire Ebola virus consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. It is a peptide fragment contained in positions 47 to 288 of the VP30 protein of the virus, and is a peptide fragment containing positions 91 to 254 of the VP30 protein of Zaire Ebola virus consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:3.
  • the amino acid residue located at the N-terminus of the peptide fragment is located at any one of positions 47 to 91 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid residue located at the C-terminus of the peptide fragment is located at the sequence Located anywhere from 254 to 288 in the amino acid sequence indicated by number 3.
  • Specific examples of the polypeptide of (g) above include positions 91 to 254, positions 80 to 254, positions 70 to 254, and positions 60 and above in the VP30 protein of Zaire Ebola virus consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the polypeptide of (g) above comprises positions 47 to 254 in the Zaire Ebola virus VP30 protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:3.
  • polypeptides include positions 47 to 254, positions 47 to 260, positions 47 to 265, positions 47 to 270, and 47 in the VP30 protein of Zaire Ebola virus consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the polypeptide of (g) above comprises positions 91 to 288 in the Zaire Ebola virus VP30 protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:3.
  • a polypeptide consisting of positions 47 to 288 and a polypeptide consisting of positions 91 to 288 in the Zaire Ebola virus VP30 protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, which was found to have an inhibitory activity is mentioned.
  • (h) a polypeptide consisting of positions corresponding to positions 91 to 254 of SEQ ID NO: 3 in the Filoviridae orthologue of the Zaire Ebola virus VP30 protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3
  • the amino acid sequence of the VP30 ortholog in any virus to which it belongs is aligned with the amino acid sequence of the VP30 protein of Zaire Ebola virus consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and gaps are introduced as necessary to It is a polypeptide consisting of positions corresponding to positions 91 to 254 of SEQ ID NO:3 when the degree of amino acid identity is maximized.
  • 19-1 and 19-2 including positions 91 to 254 in positions 47 to 288 of the SUDV VP30 protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • Polypeptide having an arbitrary amino acid sequence added to its N-terminus and/or C-terminus means any is a polypeptide to which the amino acid sequence of is added.
  • any amino acid sequence that differs from the polypeptide described in any of (f) to (i) above can be used as the arbitrary amino acid sequence. Examples include, but are not limited to, ubiquitination sequences, nuclear localization signals, tag sequences, labeled proteins described below, and the like.
  • the number of amino acids to be added is not limited, for example, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, There may be 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, or 1.
  • a Met residue can be added to the N-terminus of the polypeptide according to any of (f) to (i) above.
  • polypeptide described in (i) above corresponds to positions 47 to 254 of SEQ ID NO: 3 in the Filoviridae orthologue of the Zaire Ebola virus VP30 protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. including.
  • polypeptide described in (i) above corresponds to positions 91 to 288 of SEQ ID NO: 3 in the Filoviridae orthologue of the Zaire Ebola virus VP30 protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. including.
  • the Filoviridae ortholog may be an Ebolavirus ortholog.
  • the "expression vector” that constitutes the Filoviridae virus replication inhibitor of the present invention is a peptide fragment derived from the NP protein or VP30 protein of a Filoviridae virus, or any N-terminal and/or C-terminal thereof. and a promoter, and capable of expressing the peptide fragment or the polypeptide in cells.
  • the expression vector may contain constituent elements such as a marker gene (selection marker), an enhancer, a terminator, a replication origin, and a poly(A) signal, in addition to the nucleic acid and promoter which are the constituent elements.
  • Expression vectors may be plasmid vectors or viral vectors. Each component will be described below.
  • nucleic acid "Nucleic acid encoding a peptide fragment derived from the NP protein or VP30 protein of a Filoviridae virus or a polypeptide having an arbitrary amino acid sequence added to the N-terminus and/or C-terminus of either of them" is defined as "1-3 -1.
  • the base sequences of such nucleic acids are not limiting.
  • An example of a nucleic acid encoding a peptide fragment derived from the NP protein of a Filoviridae virus or a polypeptide having an arbitrary amino acid sequence added to its N-terminus and/or C-terminus consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • a nucleic acid encoding a polypeptide consisting of positions 20 to 337 in the NP protein of Zaire Ebola virus for example, a nucleic acid consisting of positions 58 to 1011 in the NP gene of Zaire Ebola virus consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • Zaire consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a nucleic acid encoding a polypeptide consisting of positions 1 to 405 in the NP protein of Ebola virus (for example, Zaire consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2)
  • Nucleic acid consisting of positions 1 to 1215 in the NP gene of Ebola virus and a nucleotide sequence with an initiation codon (ATG) added to any 5' end thereof is also exemplified.
  • nucleic acid encoding a peptide fragment derived from the VP30 protein of a Filoviridae virus or a polypeptide having an arbitrary amino acid sequence added to its N-terminus and/or C-terminus consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • a nucleic acid encoding a polypeptide consisting of positions 91 to 254 in the VP30 protein of Zaire Ebola virus for example, a nucleic acid consisting of positions 271 to 762 in the VP30 gene of Zaire Ebola virus consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4
  • a nucleic acid encoding a polypeptide consisting of positions 91 to 272 in the VP30 protein of Zaire Ebola virus consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 for example, Zaire Ebola consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 A nucleic acid consisting of positions 271 to 816 in the VP30 gene of the virus
  • a nucleic acid encoding a polypeptide consisting of positions 91 to 288 in the VP30 protein of Zaire Ebola virus which consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (for example, SEQ ID NO: 4 A nucleic acid consisting of positions 271 to 864 in the VP30 gene of Zaire Ebola virus consisting
  • a promoter is a promoter capable of inducing the intracellular expression of a nucleic acid encoding a peptide fragment.
  • the target cells to which the Filoviridae virus replication inhibitor of the present invention is applied, i.e., the expression vector is introduced, are in principle mammalian cells, particularly cells derived from humans or chimpanzees. Any promoter can be used as long as it can express the Examples thereof include CMV promoter (CMV-IE promoter), SV40 early promoter, RSV promoter, EF1 ⁇ promoter, Ub promoter and the like.
  • a "marker gene” is a gene that encodes a marker protein, also called a selectable marker or reporter protein.
  • the term "marker protein” refers to a peptide that can determine the presence or absence of expression of a marker gene based on its activity. Detection of the activity may be carried out by directly detecting the activity of the labeled protein itself, or indirectly through metabolites such as dyes generated by the activity of the labeled protein. good.
  • Detection includes biological detection (including detection by binding of peptides such as antibodies and aptamers and nucleic acids), chemical detection (including enzymatic detection), physical detection (including behavioral analysis detection), or detection Any sensory detection of a person (including detection by sight, touch, smell, hearing, and taste) may be used.
  • labeling protein encoded by the labeling gene is not particularly limited as long as its activity can be detected by a method known in the art.
  • Label proteins that are less invasive to transformants for detection are preferred. Examples thereof include tag peptides, drug-resistant proteins, chromoproteins, fluorescent proteins, and luminescent proteins.
  • a "tag peptide” is a short peptide consisting of ten to several dozen amino acids that can be used for protein labeling, and is used for protein detection and purification. Usually, labeling is carried out by ligating a base sequence encoding a tag peptide to the 5'-end or 3'-end of a gene encoding a protein to be labeled and expressing it as a fusion protein with the tag peptide.
  • tag peptides have been developed in the field, and any tag peptide may be used. Specific examples of tag peptides include FLAG, HA, His, PA, and myc.
  • a "drug-resistant protein” is a protein that imparts resistance to drugs such as antibiotics added to the medium, etc., and is often an enzyme.
  • ⁇ -lactamase confers resistance to ampicillin
  • aminoglycoside 3′ phosphotransferase confers resistance to kanamycin
  • tetracycline efflux transporter confers resistance to tetracycline
  • chloramphenicol examples include CAT (chloramphenicol acetyltransferase) that imparts resistance.
  • a "chromoprotein” is a protein involved in the biosynthesis of a pigment, or a protein that enables chemical detection of a transformant with a pigment by applying a substrate, usually an enzyme.
  • pigment refers to a low-molecular-weight compound or peptide capable of imparting a pigment to a transformant, regardless of the type thereof. Examples include ⁇ -galactosidase (LacZ), ⁇ -glucuronidase (GUS), melanin-based pigment synthetic protein, ommochrome-based pigment, or pteridine-based pigment.
  • Fluorescent protein refers to a protein that emits fluorescence of a specific wavelength when irradiated with excitation light of a specific wavelength. It may be either natural or non-natural. Also, the excitation wavelength and fluorescence wavelength are not particularly limited. Specific examples include CFP, RFP, DsRed (including derivatives such as 3xP3-DsRed), YFP, PE, PerCP, APC, GFP (including derivatives such as EGFP and 3xP3-EGFP), and the like. be done.
  • Photoprotein refers to a substrate protein capable of emitting light without the need for excitation light or an enzyme that catalyzes the luminescence of that substrate protein. Examples include luciferin or aequorin as a substrate protein and luciferase as an enzyme.
  • the term “enhancer” is not particularly limited as long as it can enhance the expression efficiency of a gene or fragment thereof in a vector.
  • Terminator is a sequence capable of terminating transcription of a gene or the like expressed by the activity of the promoter.
  • the type of terminator is not particularly limited. A terminator derived from the same species as the promoter is preferred. A terminator paired with the promoter on the genome in a single gene expression control system is particularly preferred.
  • the expression vector of the present invention may be capable of transiently expressing a peptide fragment or the like derived from the NP protein or VP30 protein of a Filoviridae virus in mammalian cells. Therefore, no origin of replication for mammalian cells is required. However, when expressed as a shuttle vector in bacteria such as Escherichia coli, the origin of replication is essential. A known sequence can be used for the replication origin. For example, if it is a replication origin for Escherichia coli, the f1 origin or the like may be used.
  • the Filoviridae virus replication inhibitor of the present invention can inhibit the replication of Filoviridae viruses.
  • a second aspect of the present invention is a pharmaceutical composition for treating Filoviridae viral infections.
  • the pharmaceutical composition for treating Filoviridae virus infections of the present invention contains the Filoviridae virus replication inhibitor of the first aspect as an active ingredient, and inhibits the replication of Filoviridae viruses to inhibit the growth of Filoviridae viruses. It can inhibit and treat Filoviridae viral infections.
  • the pharmaceutical composition for treating Filoviridae virus infections of the present invention comprises one or more active ingredients as essential constituents, a solvent and/or carrier, and drug delivery system (DDS) particles. Each component will be specifically described below.
  • DDS drug delivery system
  • the pharmaceutical composition for treating Filoviridae virus infections of the present invention includes the Filoviridae virus replication inhibitor according to the first aspect as an essential active ingredient.
  • the pharmaceutical composition for treating Filoviridae virus infections of the present invention can contain one or more Filoviridae virus replication inhibitors.
  • the pharmaceutical composition for treating Filoviridae virus infections of the present invention is a peptide fragment derived from the NP protein according to the first aspect, or an arbitrary amino acid sequence at its N-terminus and/or C-terminus. Additional polypeptides and/or peptide fragments derived from the VP30 protein, or polypeptides having arbitrary amino acid sequences added to their N-terminus and/or C-terminus may also be included.
  • the content of the active ingredient contained in the pharmaceutical composition for treating Filoviridae virus infection of the present invention is not particularly limited. Generally, the content varies depending on the type of active ingredient, the dosage form, and the type of solvent and carrier that are other constituents described later. Therefore, it is sufficient to determine them as appropriate in consideration of each condition.
  • a single dose of a pharmaceutical composition for treating a Filoviridae virus infection may contain an effective amount of the active ingredient. However, if it is necessary to administer a large amount of the pharmaceutical composition for the treatment of filoviridae virus infection to the subject in order to obtain the pharmacological effect of the active ingredient, divide the dose into several doses to reduce the burden on the subject. can also be administered. In this case, the total amount of the active ingredients should be an effective amount.
  • the term "effective amount” refers to an amount necessary for the function of the active ingredient to be exhibited, and an amount that imparts little or no adverse side effects to subjects to whom it is applied. This effective amount may vary depending on various conditions such as subject information, route of application, and number of applications. Therefore, when the pharmaceutical composition for treating Filoviridae virus infection is used as a medicine, the content of the active ingredient is ultimately determined by the judgment of a doctor, pharmacist, or the like.
  • the term "subject” refers to an object to which the Filoviridae virus replication inhibitor according to the first aspect or the pharmaceutical composition for treating Filoviridae virus infection of this aspect is applied.
  • cells including cultured cells
  • tissues including organs, or individuals.
  • individuals they are preferably human individuals, in which case they are specifically referred to as "subjects”.
  • Subjects infected with a Filoviridae virus such as those infected with Ebola virus, are particularly preferred.
  • subject information refers to various information related to subject characteristics and conditions. For example, when the subject is a human individual, age, body weight, sex, general health, presence or absence of disease, disease progression and severity, drug sensitivity, presence or absence of concomitant drugs, tolerance to treatment, etc. .
  • the pharmaceutical composition for treating Filoviridae virus infection of the present invention can contain a pharmaceutically acceptable solvent, if necessary.
  • “Pharmaceutically acceptable solvent” refers to a solvent commonly used in the field of formulation technology. Examples include water or an aqueous solution, or an organic solvent. Aqueous solutions include, for example, physiological saline, isotonic solutions containing glucose or other adjuvants, phosphate buffers, sodium acetate buffers. Adjuvants include, for example, D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, low-concentration nonionic surfactants, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, and the like.
  • Organic solvents include ethanol.
  • composition for treatment of Filoviridae virus infection of the present invention can contain a pharmaceutically acceptable carrier, if necessary.
  • pharmaceutically acceptable carrier refers to additives commonly used in the field of formulation technology. Examples include excipients, binders, disintegrants, fillers, emulsifiers, flow additives, lubricants, human serum albumin and the like.
  • Excipients include, for example, sugars such as monosaccharides, disaccharides, cyclodextrins and polysaccharides, metal salts, citric acid, tartaric acid, glycine, polyethylene glycol, pluronics, kaolin, silicic acid, or combinations thereof. be done.
  • Binders include, for example, starch pastes using vegetable starch, pectin, xanthan gum, simple syrup, glucose solution, gelatin, tragacanth, methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, shellac, paraffin, polyvinylpyrrolidone, or combinations thereof. mentioned.
  • disintegrants examples include starch, lactose, carboxymethyl starch, crosslinked polyvinylpyrrolidone, agar, laminaran powder, sodium hydrogen carbonate, calcium carbonate, alginic acid or sodium alginate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, sodium lauryl sulfate, and stearin. acid monoglycerides or salts thereof.
  • fillers examples include petroleum jelly, the above sugar and/or calcium phosphate.
  • emulsifiers examples include sorbitan fatty acid esters, glycerin fatty acid esters, sucrose fatty acid esters, and propylene glycol fatty acid esters.
  • flow additives and lubricants examples include silicates, talc, stearates or polyethylene glycol.
  • solubilizers suspending agents, diluents, dispersing agents, surfactants, soothing agents, stabilizers, absorption enhancers, bulking agents commonly used in pharmaceutical compositions, etc.
  • Moisturizing agent, humectant, humectant, adsorbent, flavoring agent, disintegration inhibitor, coating agent, coloring agent, preservative, preservative, antioxidant, flavoring agent, flavoring agent, sweetening agent, buffering agent, isotonicity Agents and the like can also be included as appropriate.
  • the carrier avoids or suppresses the decomposition of the active ingredient by enzymes or the like in the subject, facilitates the formulation and administration method, and is used to maintain the dosage form and efficacy. should be used.
  • DDS particles Drug delivery system particles
  • the pharmaceutical composition for treatment of Filoviridae virus infection of the present invention can contain DDS particles if necessary.
  • DDS particles contain active ingredients, other carriers, etc. inside them and deliver the contents, especially the active ingredients, to the target site without degrading them. Particles that can be quantitatively controlled.
  • the active ingredient of the pharmaceutical composition for treating Filoviridae virus infection of the present invention is a peptide or nucleic acid
  • the use of DDS particles is suitable also for protecting it from degradation by proteases and nucleases in vivo after administration. be.
  • the type of DDS particles does not matter. Examples thereof include liposomes, polymeric micelles, virus particles and the like.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition for treating Filoviridae virus infection of the present invention is not particularly limited. Any form may be used as long as it can be delivered to the target site without deactivating the active ingredient in the subject's body.
  • the specific dosage form differs depending on the application method described later. Since application methods can be broadly classified into parenteral administration and oral administration, dosage forms suitable for each administration method may be used.
  • the preferred dosage form is a liquid formulation that allows direct administration to the target site or systemic administration via the circulatory system.
  • liquid formulations include injections. Injectable formulations are appropriately combined with the aforementioned excipients, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, pH adjusters, etc., in addition to solvents, and mixed in unit dosage forms generally accepted for pharmaceutical practice. It can be formulated by
  • preferred dosage forms include solid formulations (including tablets, capsules, drops, and lozenges), granules, powders, powders, and liquid formulations (internal water, emulsion, and syrup). ). If it is a solid formulation, it is optionally made into a dosage form with a coating known in the art, such as a sugar-coated tablet, a gelatin-coated tablet, an enteric-coated tablet, a film-coated tablet, a double tablet, and a multilayer tablet. be able to.
  • each dosage form described above are not particularly limited as long as they are within the range of dosage forms known in the art for each dosage form.
  • the pharmaceutical composition for treating hepatitis B of the present invention may be formulated according to a conventional method in the technical field.
  • the application method of the pharmaceutical composition for treating Filoviridae virus infection of the present invention may be oral administration or parenteral administration.
  • Oral administration generally involves systemic administration, while parenteral administration can be further subdivided into systemic administration and local administration.
  • Local administration includes, for example, intramuscular, subcutaneous, tissue, and organ administration, and parenteral methods of systemic administration include intracirculatory administration, such as intravenous (iv), arterial Intralymphatic administration and intralymphatic administration are included.
  • intravenous (iv) intravenous
  • iv intravenous
  • intralymphatic administration intralymphatic administration
  • intralymphatic administration intralymphatic administration are included.
  • the dose may be any amount effective for the active ingredient to be effective. An effective amount is appropriately selected according to subject information as described above.
  • Filviridae viruses such as EBOV are thought to infect phagocytic immune cells such as macrophages and dendritic cells. It is thought that it will shift to Therefore, it is also possible to administer to local infected sites or muscles in the early stage of infection before systemic infection, and to administer into the circulatory system by intravenous injection or the like in the stage of systemic infection.
  • a third aspect of the present invention is a method for inhibiting replication of a Filoviridae virus.
  • the method for inhibiting Filoviridae virus replication of the present invention involves the introduction of a peptide fragment derived from the NP protein or VP30 protein of a Filoviridae virus into a host such as a Filoviridae virus-infected cell or a cell suspected thereof.
  • An expression vector comprising a polypeptide having an arbitrary amino acid sequence added to its N-terminus and/or C-terminus, or a nucleic acid encoding said peptide fragment or said polypeptide, and capable of expressing said peptide fragment or said polypeptide in cells can inhibit the replication of Filoviridae viruses in the host, thereby suppressing the multiplication of Filoviridae viruses.
  • this method is administered to a person infected with a Filoviridae virus or a person who is likely to be infected with the virus, it can be used as a therapeutic method for a Filoviridae virus infection.
  • the method for inhibiting replication of Filoviridae viruses in this embodiment includes an introduction step as an essential step.
  • the "introduction step” includes a peptide fragment derived from the NP protein or VP30 protein of a Filoviridae virus, a polypeptide having an arbitrary amino acid sequence added to the N-terminus and/or C-terminus thereof, or the peptide fragment or The step of introducing into a host an expression vector that contains a nucleic acid encoding the polypeptide and is capable of expressing the peptide fragment in cells, that is, the filoviridae virus replication inhibitor according to the first aspect.
  • host refers to a cell, tissue, or individual into which a Filoviridae virus replication inhibitor can be introduced.
  • the cell may be one or more mammalian cells. Cells derived from humans, gorillas, chimpanzees, monkeys, bats, and deer, which are hosts of Filoviridae viruses, are preferred. Any type of derived cell can be used. Cells derived from various organs and tissues (for example, phagocytic immune cells such as macrophages and dendritic cells), which are target cells to be infected with Filoviridae viruses, can be targets.
  • the host may be either a cell line system or a primary cell line. The host is preferably, but not limited to, cells infected or suspected of being infected with a Filoviridae virus. When the host is an individual, it may be any of the subjects described above.
  • the method of introducing each expression vector into the host is not particularly limited.
  • the host is a cell or tissue
  • gene introduction methods transformation methods known in the art may be used. Examples thereof include the lipofectin method (PNAS, 1989, 86: 6077; PNAS, 1987, 84: 7413), the electroporation method, the calcium phosphate method (Virology, 1973, 52: 456-467), the DEAE-Dextran method and the like.
  • the host is an individual, for example, a subject, a Filoviridae virus replication inhibitor, or a Filoviridae containing the same as an active ingredient, is applied to the subject by the method described in "2-3.
  • Application method" of the second aspect A pharmaceutical composition for treating viral infections may be administered.
  • the method for inhibiting Filoviridae virus replication of this embodiment can serve as a method for treating Filoviridae virus infections.
  • the method for inhibiting Filoviridae virus replication of this aspect includes (a) a polypeptide consisting of positions 20 to 337 in the NP protein of Zaire Ebola virus, which consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and (b) SEQ ID NO: (c) a polypeptide comprising positions 20 to 337 in positions 1 to 500 of the Zaire Ebola virus NP protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; A polypeptide consisting of positions corresponding to positions 20 to 337 of SEQ ID NO: 1 in the viridae orthologue, (d) SEQ ID NO: 1 in the Filoviridae orthologue of the Zaire Ebola virus NP protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 A polypeptide comprising positions corresponding to positions 20 to 337 of SEQ ID NO: 1 at positions corresponding to positions 1 to 500, (e) the polypeptide according to any one of (a) to (d) above A polypeptide having an amino acid sequence
  • a fourth aspect of the present invention is a method for evaluating the replication activity of a Filoviridae virus.
  • an NP gene expression vector, a VP30 gene expression vector, a VP35 gene expression vector, and an L gene expression vector are introduced into host cells together with a reporter gene expression vector, and expression of the reporter gene is detected. , the replication activity of Filoviridae viruses can be assessed.
  • the evaluation method of this embodiment includes an introduction step and a detection step as essential steps.
  • the "introduction step” is a step of introducing a reporter gene expression vector, an NP gene expression vector, a VP30 gene expression vector, a VP35 gene expression vector, and an L gene expression vector into host cells.
  • a "reporter gene expression vector” includes an RNA polymerase I promoter sequence, a Filoviridae virus trailer sequence, a reporter gene sequence, a Filoviridae virus leader sequence, and an RNA polymerase I terminator sequence in the above order.
  • the reporter gene sequence is contained in reverse orientation with respect to the promoter sequence.
  • the reporter gene is not limited as long as it is a gene whose expression can be detected, and may be, for example, a gene encoding a chromoprotein, a fluorescent protein, or a luminescent protein.
  • the NP gene expression vector is placed downstream of a promoter capable of inducing gene expression in host cells in a state in which the NP gene of the Filoviridae virus can be expressed.
  • the VP30 gene expression vector is arranged downstream of a promoter capable of inducing gene expression in host cells in a state in which the VP30 gene of the Filoviridae virus can be expressed.
  • the VP35 gene expression vector is placed downstream of a promoter capable of inducing gene expression in host cells in a state in which the VP35 gene of the Filoviridae virus can be expressed.
  • the L gene expression vector is placed downstream of a promoter capable of inducing gene expression in host cells in a state in which the L gene of the Filoviridae virus can be expressed.
  • the above expression vector may contain components such as a marker gene (selection marker), enhancer, terminator, origin of replication, and poly A signal, if necessary.
  • selection marker selection marker
  • enhancer terminator
  • origin of replication origin of replication
  • poly A signal poly A signal
  • the introduction ratio of the NP gene expression vector, VP30 gene expression vector, VP35 gene expression vector, and L gene expression vector is 4:1:1:2.
  • the “detection step” is the step of detecting the expression of the reporter gene.
  • a method for detecting the expression of the reporter gene may be appropriately selected depending on the type of reporter gene. If the reporter gene is a fluorescent protein gene, the fluorescence intensity of the fluorescent protein can be measured by irradiating it with excitation light of a specific wavelength. If the reporter gene is a photoprotein gene, a luminescent substrate can be added to the medium and the luminescence intensity can be measured.
  • the method of this aspect may include test substance treatment in which host cells are treated with a test substance as a selection step. When this step is included, the replication activity inhibitory effect of the test substance on Filoviridae viruses can be evaluated.
  • ⁇ Example 1 Development of EBOV minigenome assay> (Purpose) Develop an EBOV minigenome assay to measure EBOV replication efficiency. (Method and result)
  • (1) Construction of Plasmids Expression plasmids for EBOV proteins (L, NP, VP35, and VP30) were obtained by subcloning codon-optimized genes for human cells into mammalian cell expression vector pCI (Promega).
  • ⁇ NP and ⁇ VP30 expression plasmids were prepared from pCI-NP or pCI-VP30 mainly using site-directed mutagenesis (PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit, TaKaRa).
  • a PA tag consisting of the amino acid sequence (GVAMPGAEDDVV) shown in SEQ ID NO: 5 was introduced into some constructs.
  • the secretory luciferase gene (Gluc) of the antisense strand which has the untranslated regions of the EBOV genome, Trailer (740bp) and Leader (469bp) (Fig. 1), is fused to the RNA polymerase I (RNA PolI) promoter (PRO) and terminator.
  • RNA PolI RNA polymerase I promoter
  • a reporter gene (Fig. 3, miniG) inserted between (TER) was prepared.
  • Expression vectors for miniG and EBOV proteins NP, VP35, VP30, and L
  • luciferase activity in the culture supernatant was measured after 24 hours of culture.
  • a reporter RNA that mimics the EBOV genome (Fig. 3, vRNA) is transcribed by host RNA polymerase I (PolI).
  • NP, VP35, VP30, and L produce Gluc mRNA with added Cap and PolyA (Fig. 3, Gluc mRNA).
  • EBOV replication activity can be assessed by measuring luciferase activity secreted into the culture supernatant.
  • the results are shown in Figure 4.
  • the EBOV protein was introduced into HeLa cells at this ratio, and then various deletion mutant proteins were introduced to evaluate the EBOV replication inhibitory effect.
  • EBOV replication inhibitory effect by deletion mutant NP> Various deletion mutants of NP will be generated and the inhibitory effect on EBOV replication will be examined.
  • Method EBOV wild-type NP is a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and consisting of a total length of 721 amino acids.
  • EBOV wild-type NP has a non-conserved region between the N-terminal core domain (20-405 amino acid residues) and the C-terminal C-tail (641-721 amino acid residues). (FIGS. 5A and 5B).
  • the core domain of NP contains an N lobe (20–240 amino acid residues) and a C lobe (241–405 amino acid residues), between which an RNA binding groove is formed. . Crystallography of NP shows that the core domain contains 13 ⁇ -helices (Dong S, et al., Protein Cell, 2015, 6(5):351-62).
  • ⁇ NP expression plasmids were transfected into HeLa cells together with miniG and EBOV protein (NP, VP35, VP30, and L) expression plasmids.
  • the ratio of wild-type NP to ⁇ NP is approximately 1:4. After culturing for 24 hours, luciferase activity in the culture supernatant was measured.
  • ⁇ NP(1-240) containing only the N lobe and ⁇ NP(241-405) containing only the C lobe weakened the inhibitory effect.
  • ⁇ NP(20-337) was shown to inhibit EBOV replication depending on the amount of plasmid introduced into cells (Fig. 8).
  • ⁇ NP (20-337) introduced with R240A/K248A/D252A (RKD) mutations that impair binding ability to VP35 almost no replication inhibitory activity was observed (Fig. 9, KKR and RKD).
  • EBOV replication inhibitory effect by deletion mutant VP30> (Purpose) We will generate various deletion mutants of VP30 and examine their inhibitory effects on EBOV replication.
  • Method EBOV wild-type VP30 is a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and having a total length of 288 amino acids. VP30 has two domain structures, an N-terminal domain (NTD, 1-141 amino acid residues) and a C-terminal domain (CTD, 142-288 amino acid residues) (Fig. 10).
  • NTDs have an RNA binding domain (26-46 amino acid residues), a Zn finger motif (72-90 amino acid residues), and a hexamerization motif (100-104 amino acid residues).
  • the CTD contains dimerization and NP binding domains (180-197 amino acid residues).
  • ⁇ VP30 ⁇ VP30 expression plasmids expressing ⁇ VP30 shown in FIGS. did.
  • EBOV minigenome assay was performed for each ⁇ VP30 by the following method.
  • a ⁇ VP30 expression plasmid was transfected into HeLa cells along with miniG and EBOV protein (NP, VP35, VP30, and L) expression plasmids.
  • the ratio of wild-type VP30 and ⁇ VP30 is 1:16. After culturing for 24 hours, luciferase activity in the culture supernatant was measured.
  • ⁇ VP30 91-288
  • ⁇ VP30 lacking the C-terminus FIGS. 11B, 1-5
  • ⁇ VP30 lacking the hexamerization motif in addition to the N-terminal RNA-binding domain and Zn finger motif FIGS. 11B, 8 and 9
  • VP30's CTD is known to consist of seven ⁇ -helices. Therefore, the C-terminal ⁇ -helix was deleted from ⁇ VP30(91-288), which showed an EBOV replication inhibitory effect, and the effect on the EBOV inhibitory effect was examined (Fig. 13). As a result, ⁇ VP30(91-254) lacking the seventh ⁇ -helix (Fig. 13A, ⁇ 7) exhibited the same EBOV replication inhibitory activity as ⁇ VP30(91-272) containing all seven ⁇ -helices. (Fig. 13B). On the other hand, it was revealed that ⁇ VP30(91-231), which lacks the sixth and subsequent ⁇ -helices, has an attenuated inhibitory effect (Fig. 13B).
  • ⁇ VP30(91-254) showed concentration-dependent EBOV replication inhibitory activity, similar to ⁇ VP30(91-272) (Fig. 14).
  • NP-PA which is NP with a PA tag added to the C-terminus
  • NP-PA which is an NP with a PA tag consisting of the amino acid sequence (GVAMPGAEDDVV) shown in SEQ ID NO: 5 added to the C-terminus
  • GVAMPGAEDDVV amino acid sequence
  • Particle blotting was performed by the following method. After the transfected cells were cultured for 24 hours, they were lysed with PB lysis buffer (1% NP40, 25 mM Tris pH7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 50 mM NaF), migrated to 1.2% agarose (TAE), and transferred to a PVDF membrane. did.
  • PB lysis buffer 1% NP40, 25 mM Tris pH7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 50 mM NaF
  • TAE 1.2% agarose
  • ⁇ NP or ⁇ VP30 expression plasmid was co-introduced into a minigenome assay using NP-PA, and the inhibitory effect on NP-PA complex formation was examined. did.

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Abstract

EBOVに対する新たなウイルス複製阻害剤を提供することである。　（a）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質において20位～337位からなるポリペプチド、（b）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質の1位～500位において20位～337位を含むポリペプチド、（c）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質のフィロウイルス科オルソログにおいて配列番号１の20位～337位に相当する位置からなるポリペプチド、（d）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質のフィロウイルス科オルソログにおける、配列番号１の1位～500位に相当する位置において、配列番号１の20位～337位に相当する位置を含むポリペプチドからなる群から選択されるいずれかのポリペプチド、又は（e）前記（a）～（d）のいずれかに記載のポリペプチドのN末端及び／又はC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチドからなるフィロウイルス科（Filoviridae）ウイルス複製阻害剤を提供する。

Description

フィロウイルス科ウイルス複製阻害剤
　本発明は、フィロウイルス科ウイルス複製阻害剤、フィロウイルス科ウイルス感染症治療用医薬組成物、フィロウイルス科ウイルスの複製阻害方法、及びフィロウイルス科ウイルスの複製活性の評価方法に関する。
　エボラウイルス病（エボラ出血熱）は、エボラウイルス（Ebolavirus: EBOV）の感染による致死率の極めて高い急性熱性感染症である。1976年にスーダンにおいて最初の感染例（感染者数284、死亡者数151、致死率51％）が報告されて以来、主に中央アフリカを中心として、20回以上に及ぶアウトブレークを繰り返している。特に、過去最悪の感染事例となった2014年の西アフリカにおけるアウトブレークでは、感染者数27,550人、死亡者数11,235人（致死率41％）に達しただけでなく、アメリカ、スペイン、イギリス、イタリア等の欧米諸国にも感染が飛び火し、その猛威を目の当たりにしたことは記憶に新しい。
　近年、アウトブレークの頻度が高くなる傾向が見られることから、世界規模での流行が危惧されている。また、その著しく高い致死率から、これがバイオテロ等に悪用される可能性を懸念する声も聞かれる。各方面での努力にもかかわらず、エボラ出血熱の決定的な予防及び治療法は、現段階では確立されておらず、対症療法に頼らざるを得ないのが現状である（非特許文献１）。
　エボラ出血熱の新たな予防及び治療法を確立するために、EBOVに対する新たなウイルス複製阻害剤が必要とされている。
横山裕一、「エボラウイルスおよびエボラウイルス病に関する文献的考察」、慶應保健研究、33(1), 015-021, 2015
　本発明の目的は、EBOVに対する新たなウイルス複製阻害剤を提供することである。
　上記課題を解決するために、本発明者らは、EBOVの複製を阻害する新たな阻害剤の開発を試みた。
　EBOVは、全長約18～19kbのマイナス鎖RNAをゲノムとするウイルスであり、ゲノム上には、NP（Nucleoprotein）、VP35（Viral protein 35）、VP40（Viral protein 40）、GP（Glycoprotein）、VP30（Viral protein 30）、VP24（Viral protein 24）、及びL（Large protein；RNA Polymerase）の7種類のORFが存在する（図１）。
　EBOVウイルス粒子内のゲノムRNAはNP、VP35、VP30、及びLと結合してリボヌクレオプロテイン(RNP)複合体として存在する（図２）。このうちNPはヌクレオカプシドの主成分であり、多量体を形成する。VP30は複製に必須の働きをする多機能タンパク質であり、六量体を形成する。各々の多量体がゲノムRNAやVP35及びLと相互作用することによりRNPが形成される。RNPは、ウイルスタンパク質の発現とゲノムの複製の双方に重要であり、したがってNP及びVP30の多量体形成及び相互作用は、ウイルス複製の重要な初期のステップと言える。
　本発明者らは、EBOVのNP及びVP30の創薬標的としての可能性に着目し、鋭意研究を行った。その結果、EBOVの複製を阻害し得る欠失変異型NP及び欠失変異型VP30を見出し、本発明を完成させるに至った。本発明は、上記知見に基づくものであって以下を提供する。
（１）以下の（a）～（e）からなる群から選択されるいずれかのポリペプチドからなるフィロウイルス科（Filoviridae）ウイルス複製阻害剤。
　（a）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質において20位～337位からなるポリペプチド
　（b）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質の1位～500位において20位～337位を含むポリペプチド
　（c）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質のフィロウイルス科オルソログにおいて配列番号１の20位～337位に相当する位置からなるポリペプチド
　（d）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質のフィロウイルス科オルソログにおける、配列番号１の1位～500位に相当する位置において、配列番号１の20位～337位に相当する位置を含むポリペプチド
　（e）前記（a）～（d）のいずれかに記載のポリペプチドのN末端及び／又はC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチド
（２）前記（b）に記載のポリペプチドが、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質において1位～337位を含む、又は前記（d）に記載のポリペプチドが、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質のフィロウイルス科オルソログにおいて配列番号１の1位～337位に相当する位置を含む、（１）に記載のフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤。
（３）前記（b）に記載のポリペプチドが、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質において20位～500位を含む、又は前記（d）に記載のポリペプチドが、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質のフィロウイルス科オルソログにおいて配列番号１の20位～500位に相当する位置を含む、（１）又は（２）に記載のフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤。
（４）以下の（f）～（j）からなる群から選択されるいずれかのポリペプチドからなるフィロウイルス科（Filoviridae）ウイルス複製阻害剤。
　（f）配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質において91位～254位からなるポリペプチド
　（g）配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質の47位～288位において91位～254位を含むポリペプチド
　（h）配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質のフィロウイルス科オルソログにおいて配列番号３の91位～254位に相当する位置からなるポリペプチド
　（i）配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質のフィロウイルス科オルソログにおける、配列番号３の47位～288位に相当する位置において、配列番号３の91位～254位に相当する位置を含むポリペプチド
　（j）前記（f）～（i）のいずれかに記載のポリペプチドのN末端及び／又はC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチド
（５）前記（g）に記載のポリペプチドが、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質において47位～254位を含む、又は前記（i）に記載のポリペプチドが、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質のフィロウイルス科オルソログにおいて配列番号３の47位～254位に相当する位置を含む、（４）に記載のフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤。
（６）前記（g）に記載のポリペプチドが、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質において91位～288位を含む、又は前記（i）に記載のポリペプチドが、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質のフィロウイルス科オルソログにおいて配列番号３の91位～288位に相当する位置を含む、（４）又は（５）に記載のフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤。
（７）前記フィロウイルス科オルソログがエボラウイルス属オルソログである、（１）～（６）のいずれかに記載のフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤。
（８）（１）に記載の（a）～（e）及び（４）に記載の（f）～（j）からなる群から選択されるいずれかのポリペプチドをコードする核酸を発現可能な状態で含む発現ベクターからなるフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤。
（９）有効成分として（１）～（８）のいずれかに記載のフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤を含む、フィロウイルス科ウイルス感染症治療用医薬組成物。
（１０）以下の（a）～（j）からなる群から選択されるいずれかのポリペプチド、又は前記ポリペプチドをコードする核酸を含み、細胞内で前記ポリペプチドを発現可能な発現ベクターを宿主内に導入する工程を含む、フィロウイルス科ウイルスの複製阻害方法。
　（a）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質において20位～337位からなるポリペプチド
　（b）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質の1位～500位において20位～337位を含むポリペプチド
　（c）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質のフィロウイルス科オルソログにおいて配列番号１の20位～337位に相当する位置からなるポリペプチド
　（d）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質のフィロウイルス科オルソログにおける、配列番号１の1位～500位に相当する位置において、配列番号１の20位～337位に相当する位置を含むポリペプチド
　（e）前記（a）～（d）のいずれかに記載のポリペプチドのN末端及び／又はC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチド
　（f）配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質において91位～254位からなるポリペプチド
　（g）配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質の47位～288位において91位～254位を含むポリペプチド
　（h）配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質のフィロウイルス科オルソログにおいて配列番号３の91位～254位に相当する位置からなるポリペプチド
　（i）配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質のフィロウイルス科オルソログにおける、配列番号３の47位～288位に相当する位置において、配列番号３の91位～254位に相当する位置を含むポリペプチド
　（j）前記（f）～（i）のいずれかに記載のポリペプチドのN末端及び／又はC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチド
（１１）フィロウイルス科ウイルスの複製活性の評価方法であって、レポーター遺伝子発現ベクター、NP遺伝子発現ベクター、VP30遺伝子発現ベクター、VP35遺伝子発現ベクター、及びL遺伝子発現ベクターを宿主細胞内に導入する導入工程、並びに前記レポーター遺伝子の発現を検出する検出工程を含み、前記レポーター遺伝子発現ベクターは、RNAポリメラーゼIプロモーター配列、フィロウイルス科ウイルスのトレーラー配列、レポーター遺伝子配列、フィロウイルス科ウイルスのリーダー配列、及びRNAポリメラーゼIターミネーター配列を上記順序で含み、ここで前記レポーター遺伝子配列は、前記プロモーター配列に対して逆向きに含まれており、前記NP遺伝子発現ベクターは、宿主細胞内で遺伝子発現誘導が可能なプロモーターの下流に、フィロウイルス科ウイルスのNP遺伝子が発現可能な状態で配置されており、前記VP30遺伝子発現ベクターは、宿主細胞内で遺伝子発現誘導が可能なプロモーターの下流に、フィロウイルス科ウイルスのVP30遺伝子が発現可能な状態で配置されており、前記VP35遺伝子発現ベクターは、宿主細胞内で遺伝子発現誘導が可能なプロモーターの下流に、フィロウイルス科ウイルスのVP35遺伝子が発現可能な状態で配置されており、前記L遺伝子発現ベクターは、宿主細胞内で遺伝子発現誘導が可能なプロモーターの下流に、フィロウイルス科ウイルスのL遺伝子が発現可能な状態で配置されており、NP遺伝子発現ベクター、VP30遺伝子発現ベクター、VP35遺伝子発現ベクター、及びL遺伝子発現ベクターの導入比率が4：1：1：2である、前記方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2021-010636号の開示内容を包含する。
　本発明によれば、EBOVに対する新たなウイルス複製阻害剤を提供することができる。
EBOVのゲノム構造を示す図である。EBOVは、全長約18～19kbのマイナス鎖RNAをゲノムとするウイルスであり、ゲノム上には、NP（Nucleoprotein）、VP35（Viral protein 35）、VP40（Viral protein 40）、GP（Glycoprotein）、VP30（Viral protein 30）、VP24（Viral protein 24）、及びL（Large protein；RNA Polymerase）の7種類のORFが存在する。EBOVゲノムの5'及び3'末端領域には、非翻訳領域であるTrailer及びLeaderが存在する。 EBOVウイルス粒子内のリボヌクレオプロテイン(RNP)複合体の構造を示す図である。EBOVゲノムRNAはNP、VP35、VP30、及びLと結合してRNP複合体として存在する。 EBOVミニゲノムアッセイの原理を示す図である。 EBOVミニゲノムアッセイにおけるEBOVタンパク質（NP、VP35、VP30、及びL）の最適な比率を検討した結果を示す図である。 EBOVの野生型NPタンパク質及び欠失変異型NP（ΔNP）の構造を示す図である。（Ａ）野生型NPタンパク質の構造を示す。（Ｂ）野生型NPタンパク質の構造を示す。（Ｃ）野生型NPタンパク質及びΔNPの構造を示す。 ΔNPによるEBOV複製阻害効果を示す図である。（Ａ）ΔNPの構造を示す。コンストラクト4～9では、ΔNPのN末端にMetが付加されている。（Ｂ）ΔNPによるEBOV複製阻害効果を測定した結果を示す。 ΔNP(20-405)をさらに改変したΔNPのEBOV複製阻害効果を示す図である。（Ａ）ΔNP(20-405)をさらに改変したΔNPの構造を示す。いずれもN末端にMetが付加されている。（Ｂ）EBOV複製阻害効果を測定した結果を示す。 ΔNP(20-337)発現プラスミドを野生型NP発現プラスミドに対して1/16倍～4倍の量で導入した際のEBOV複製阻害効果を示す図である。 アミノ酸置換変異を導入したΔNP(20-337)によるEBOV複製阻害効果を示す図である。 EBOVの野生型VP30タンパク質の構造を示す図である。VP30は、N末端ドメイン（NTD）及びC末端ドメイン（CTD）の2つのドメイン構造を有する。NTDには、RNA結合領域、Znフィンガーモチーフ、及び六量体化モチーフが存在する。CTDには二量体化及びNP結合領域が含まれる。 欠失変異型VP30（ΔVP30）のEBOV複製阻害効果を示す図である。（Ａ）ΔVP30の構造を示す。コンストラクト6～9では、ΔVP30のN末端にMetが付加されている。（Ｂ）ΔVP30によるEBOV複製阻害効果を測定した結果を示す。 ΔVP30(91-288)をさらに改変したΔVP30のEBOV複製阻害効果を示す図である。（Ａ）ΔVP30(91-288)をさらに改変したΔVP30の構造を示す。いずれもN末端にMetが付加されている。（Ｂ）EBOV複製阻害効果を測定した結果を示す。 ΔVP30(91-288)をさらに改変したΔVP30のEBOV複製阻害効果を示す図である。（Ａ）ΔVP30(91-288)をさらに改変したΔVP30の構造を示す。いずれもN末端にMetが付加されている。（Ｂ）EBOV複製阻害効果を検討した結果を示す。 ΔVP30(91-272)及びΔVP30(91-254)のEBOV複製阻害活性を示す図である。（Ａ）ΔVP30(91-272)及びΔVP30(91-254)の構造を示す。いずれもN末端にMetが付加されている。（Ｂ）ΔVP30(91-272)及びΔVP30(91-254)を野生型VP30に対して1/4倍～16倍の量で導入した際のEBOV複製阻害効果を示す。 PAタグをC末端に付加したNPであるNP-PAの機能を示す図である。（Ａ）野生型NP及びNP-PAによるEBOV複製活性を示す。（Ｂ）NP-PA依存的EBOV複製に対する、ΔNP(20-405)及びΔVP30(91-254)による阻害効果を示す。 NP-PAの複合体形成をパーティクルブロッティングにより検討した結果を示す図である。 NP-PAの複合体形成に対するΔNP(20-405)及びΔVP30(91-254)の効果をパーティクルブロッティングにより検討した結果を示す図である。 NPの構造とアラインメントを示す図である。（Ａ）ZEBOV NPタンパク質の構造を示す。（Ｂ）TAFV、BUBV、ZEBOV、RESTV、SEBOV（SUDV）、LLOV、及びMARVにおけるNPタンパク質のアラインメントを示す。パネルＡに示す各領域の位置を配列の上に示す。 図１８－１の続きである。 図１８－２の続きである。 VP30の構造とアラインメントを示す図である。（Ａ）ZEBOV VP30タンパク質の構造を示す。（Ｂ）TAFV、BUBV、ZEBOV、RESTV、SEBOV（SUDV）、LLOV、及びMARVにおけるVP30タンパク質のアラインメントを示す図である。パネルＡに示す各領域の位置をアラインメントの上に示す。 図１９－１の続きである。
１．フィロウイルス科ウイルス複製阻害剤
１－１．概要
　本発明の第１の態様は、フィロウイルス科ウイルス複製阻害剤である。本発明のフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤は、フィロウイルス科ウイルスのNPタンパク質若しくはVP30タンパク質に由来するペプチド断片、そのN末端及び／又はC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチド、又は細胞内でそのいずれかを発現可能な発現ベクターからなる。本発明のフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤は、細胞内においてフィロウイルス科ウイルスに対する増殖抑制効果の高いフィロウイルス科ウイルス感染症治療用医薬組成物の有効成分となり得る。
１－２．用語の定義
　本明細書で使用する用語について、以下で定義する。
　「フィロウイルス科（Filoviridae）」は、モノネガウイルス目（Mononegavirales）に属し、マイナス鎖RNAゲノムを有するウイルスである。フィロウイルス科ウイルスには、エボラウイルス属（Ebolavirus）、マールブルグウイルス属（Marburgvirus）、クウェバウイルス属（Cuevavirus）が知られている。フィロウイルス科ウイルスの宿主には、ヒト、ゴリラ、チンパンジー、サル、シカ、及びコウモリ等の哺乳動物が含まれる。
　「エボラウイルス属（Ebolavirus; EBOV）」は、全長約18～19kbのマイナス鎖RNAをゲノムとするウイルスであり、エボラ出血熱の病原体として知られる。EBOVの感染機序には不明な点が多いが、動物体内ではマクロファージや樹状細胞等の貪食性免疫細胞に感染すると考えられている。EBOVゲノム上には、NP（Nucleoprotein）、VP35（Viral protein 35）、VP40（Viral protein 40）、GP（Glycoprotein）、VP30（Viral protein 30）、VP24（Viral protein 24）、及びL（Large protein；RNA Polymerase）の7種類のORFが存在する。EBOVゲノムの5'及び3'末端領域には、非翻訳領域であるTrailer及びLeaderが存在する。エボラウイルス属に属するウイルスには、ザイールエボラウイルス（Zaire ebolavirus；ZEBOV）、スーダンエボラウイルス（Sudan ebolavirus；SUDV；SEBOV）、レストンエボラウイルス（Reston ebolavirus；RESTV）、タイフォレストウイルス（Tai Forest ebolavirus；TAFV）、ブンディブギョエボラウイルス（Bundibugyo ebolavirus；BUBV）等が知られている。
　「マールブルグウイルス属（Marburgvirus）」は、全長約19kbのマイナスRNAをゲノムとするウイルスであり、マールブルグ出血熱の病原体として知られる。マールブルグウイルス属ウイルスのゲノム上には、エボラウイルス属と同様にNP、VP35、VP40、GP、VP30、VP24、及びLの7種類のORFが存在する。マールブルグウイルス属に属するウイルスには、マールブルグウイルス（Marburg marburgvirus；MARV）が知られている。
　「クウェバウイルス属（Cuevavirus）」に属するウイルスには、コウモリから見つかったLloviu cuevavirus（LLOV）が知られている。クウェバウイルス属ウイルスのゲノム上には、エボラウイルス属と同様にNP、VP35、VP40、GP、VP30、VP24、及びLの7種類のORFが存在する。
　「NP（Nucleoprotein）」は、フィロウイルス科ウイルスのヌクレオカプシドの主成分であり、多量体を形成する（図２）。NPは、N末端のコアドメイン、C末端のCテール、及びその間の非保存領域を含む（図５Ａ及び図５Ｂ）。NPのコアドメインはNローブとCローブを含み（図５Ａ）、NローブとCローブの間にはRNA結合グローブが形成される（図５Ｂ）。NPのコアドメインには13個のαヘリックスが含まれる。本明細書において、フィロウイルス科ウイルスのNPは、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるZEBOVのNPタンパク質、及びそのフィロウイルス科オルソログである。NPの例として、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるZEBOVのNP、配列番号６で示すアミノ酸配列からなるSUDVのNP、配列番号７で示すアミノ酸配列からなるRESTVのNP、配列番号８で示すアミノ酸配列からなるTAFVのNP、配列番号９で示すアミノ酸配列からなるBUBVのNP、配列番号１０で示すアミノ酸配列からなるMARVのNP、配列番号１１で示すアミノ酸配列からなるLLOVのNPが挙げられる。NPタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを図１８－１～図１８－３に示す。またNPをコードする塩基配列の例として、ZEBOVのNP遺伝子（配列番号２）及びそのコドン最適化配列（配列番号１８）が挙げられる。
　「VP30（Viral protein 30）」は、フィロウイルス科ウイルスの複製に必須の働きをする多機能タンパク質であり、六量体を形成する（図２）。VP30は、N末端ドメイン（NTD）及びC末端ドメイン（CTD）の2つのドメイン構造を有する（図１０）。NTDには、RNA結合領域、Znフィンガーモチーフ、及び六量体化モチーフが存在する。CTDには7個のαヘリックスが含まれており、二量体化及びNP結合領域が含まれる。本明細書において、フィロウイルス科ウイルスのVP30は、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるZEBOVのVP30タンパク質、及びそのフィロウイルス科オルソログである。VP30の例として、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるZEBOVのVP30、配列番号１２で示すアミノ酸配列からなるSUDVのVP30、配列番号１３で示すアミノ酸配列からなるRESTVのVP30、配列番号１４で示すアミノ酸配列からなるTAFVのVP30、配列番号１５で示すアミノ酸配列からなるBUBVのVP30、配列番号１６で示すアミノ酸配列からなるMARVのVP30、配列番号１７で示すアミノ酸配列からなるLLOVのVP30が挙げられる。VP30タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを図１９－１～図１９－２に示す。またVP30をコードする塩基配列の例として、ZEBOVのVP30遺伝子の塩基配列（配列番号４）及びそのコドン最適化塩基配列（配列番号１９）が挙げられる。
　本明細書において「発現ベクター」とは、遺伝子や遺伝子断片（以下「遺伝子等」と表記する）を発現可能な状態で含み、その遺伝子等の発現を制御できる発現単位を包含するベクターをいう。本明細書において「発現可能な状態」とは、プロモーターの制御下にあるプロモーター下流域に、発現すべき遺伝子等を配置していることをいう。ベクターには、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が知られるが、いずれのベクターも利用することができる。通常は、遺伝子組換え操作の容易なプラスミドベクターでよい。発現ベクターは、市販の哺乳動物細胞用発現ベクターを利用してもよい。例えば、Promega社のpCIベクターやpSIベクター等が挙げられる。また、発現ベクターは、哺乳動物細胞と大腸菌等の細菌間とで複製可能なシャトルベクターであってもよい。
　本明細書において「プロモーター」とは、発現ベクターを導入した細胞において、下流（3’末端側）に配置された遺伝子等の発現を制御することのできる遺伝子発現調節領域である。プロモーターは、発現制御下にある遺伝子等を発現させる場所に基づいて、ユビキタスプロモーター（全身性プロモーター）と部位特異的プロモーターに分類することができる。ユビキタスプロモーターは、全細胞、すなわち宿主個体全体で対象とする遺伝子等（対象遺伝子等）の発現を制御するプロモーターである。また、部位特異的プロモーターは、特定の細胞又は組織でのみ対象遺伝子等の発現を制御するプロモーターである。
　また、プロモーターは、発現の時期に基づいて構成的活性型プロモーター、発現誘導型プロモーター又は時期特異的活性型プロモーターに分類される。構成的活性型プロモーターは、細胞内で対象遺伝子等を恒常的に発現させることができる。発現誘導型プロモーターは、細胞内で対象遺伝子等の発現を任意の時期に誘導することができる。また、時期特異的活性型プロモーターは、細胞内で対象遺伝子等を発生段階の特定の時期にのみに発現誘導することができる。いずれのプロモーターも、宿主細胞内で対象遺伝子の過剰な発現をもたらし得ることから過剰発現型プロモーターと解することができる。
　本明細書において「治療」とは、疾患の罹患に伴う症状の緩和又は除去、及び／又は疾患の進行の阻止又は抑制、並びに疾患の治癒をいう。本明細書において「疾患」とは、断りのない限り、フィロウイルス科ウイルス感染症を意味する。
　本明細書において「フィロウイルス科ウイルス感染症」とは、フィルウイルス科ウイルスによる感染症をいう。例えば、エボラ出血熱やマールブルグ出血熱が挙げられる。
１－３．構成
　本発明のフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤は、ペプチド断片（ポリペプチド）又は発現ベクターからなる。それぞれの構成を以下で具体的に説明する。
１－３－１．ペプチド断片（ポリペプチド）
　本発明のフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤を構成するペプチド断片（ポリペプチド）は、フィロウイルス科ウイルスのNPタンパク質に由来するペプチド断片、若しくはそのN末端及び／若しくはC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチド、又はフィロウイルス科ウイルスのVP30タンパク質に由来するペプチド断片、若しくはそのN末端及び／若しくはC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチドである。
（１）NPタンパク質に由来するペプチド断片、又はそのN末端及び／又はC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチド
　一態様において、本発明のフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤は、フィロウイルス科ウイルスのNPタンパク質に由来するペプチド断片、又はそのN末端及び／又はC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチドからなる。フィロウイルス科ウイルスのNPタンパク質に由来するペプチド断片は、ザイールエボラウイルスのNPタンパク質、又はザイールエボラウイルスのNPタンパク質のフィロウイルス科オルソログのいずれかに由来するペプチド断片であって、細胞内においてフィロウイルス科ウイルスの複製を阻害することができるペプチド断片である。
　本発明のフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤を構成するフィロウイルス科ウイルスのNPタンパク質に由来するペプチド断片の具体例としては、（a）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質において20位～337位からなるポリペプチド、（b）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質の1位～500位において20位～337位を含むポリペプチド、（c）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質のフィロウイルス科オルソログにおいて配列番号１の20位～337位に相当する位置からなるポリペプチド、又は（d）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質のフィロウイルス科オルソログにおける、配列番号１の1位～500位に相当する位置において、配列番号１の20位～337位に相当する位置を含むポリペプチドが挙げられる。（a）～（d）について以下でより具体的に説明する。
　「（a）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質において20位～337位からなるポリペプチド」は、NPタンパク質のコアドメインに含まれる13個のαヘリックスのうち、N末端側に位置する12個のαへリックスを含むポリペプチドであり、本明細書の実施例においてEBOV複製を阻害する活性を有することが見出されたΔNP(20-337)に対応する。
　「（b）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質の1位～500位において20位～337位を含むポリペプチド」とは、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質の1位～500位に含まれるペプチド断片であって、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質の20位～337位を含むペプチド断片である。すなわち、当該ペプチド断片のN末端に位置するアミノ酸残基は、配列番号１で示すアミノ酸配列における1～20位のいずれかに位置し、当該ペプチド断片のC末端に位置するアミノ酸残基は、配列番号１で示すアミノ酸配列における337～500位のいずれかに位置する。上記（b）のポリペプチドの具体例としては、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質において20位～337位、15位～337位、10位～337位、5位～337位、1位～337位、20位～350位、20位～375位、20位～400位、20位～425位、20位～450位、20位～475位、又は20位～500位からなるポリペプチド、例えば、本明細書の実施例においてEBOV複製を阻害する活性を有することが見出された、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質において20位～405位からなるポリペプチドが挙げられる。
　一実施形態において、上記（b）のポリペプチドは、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質において1位～337位を含む。そのようなポリペプチドの例としては、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質において1位～337位、1位～350位、1位～360位、1位～370位、1位～380位、1位～390位、1位～400位、1位～410位、1位～420位、1位～430位、1位～440位、1位～450位、1位～460位、1位～470位、1位～480位、1位～490位、又は1位～500位からなるポリペプチド、例えば、本明細書の実施例においてEBOV複製を阻害する活性を有することが見出された、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質において1位～405位からなるポリペプチドが挙げられる。
　一実施形態において、上記（b）のポリペプチドは、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質において20位～500位を含む。そのようなポリペプチドの例としては、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質において20位～500位、18位～500位、16位～500位、14位～500位、12位～500位、10位～500位、8位～500位、6位～500位、4位～500位、2位～500位、又は1位～500位からなるポリペプチドが挙げられる。
　「（c）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質のフィロウイルス科オルソログにおいて配列番号１の20位～337位に相当する位置からなるポリペプチド」とは、フィロウイルス科に属する任意のウイルスにおけるNPオルソログのアミノ酸配列を配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質のアミノ酸配列に対して整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときに、配列番号１の20位～337位に相当する位置からなるポリペプチドである。当業者であればそのようなアラインメントは容易に実施することが可能であり、フィロウイルス科に属する任意のウイルスにおけるNPオルソログのアミノ酸配列において、配列番号１の20位～337位に相当する位置を容易に決定することができる。配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質のフィロウイルス科オルソログにおいて配列番号１の20位～337位に相当する位置からなるポリペプチドの例としては、図１８－１～図１８－３に示すように、配列番号６で示すアミノ酸配列からなるSUDVのNPタンパク質の20位～337位からなるポリペプチド；配列番号７で示すアミノ酸配列からなるRESTVのNPタンパク質の20位～337位からなるポリペプチド；配列番号８で示すアミノ酸配列からなるTAFVのNPタンパク質の20位～337位からなるポリペプチド；配列番号９で示すアミノ酸配列からなるBUBVのNPタンパク質の20位～337位からなるポリペプチド；配列番号１０で示すアミノ酸配列からなるMARVのNPタンパク質の2位～319位からなるポリペプチド；及び配列番号１１で示すアミノ酸配列からなるLLOVのNPタンパク質の20位～337位からなるポリペプチドが挙げられる。
　「（d）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質のフィロウイルス科オルソログにおける、配列番号１の1位～500位に相当する位置において、配列番号１の20位～337位に相当する位置を含むポリペプチド」とは、フィロウイルス科に属する任意のウイルスにおけるNPオルソログのアミノ酸配列を配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質のアミノ酸配列に対して整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときに、配列番号１の1位～500位に相当する位置において、配列番号１の20位～337位に相当する位置を含むポリペプチドである。当業者であれば、上述のように、フィロウイルス科に属する任意のウイルスにおけるNPオルソログのアミノ酸配列において、配列番号１の1位～500位に相当する位置、及び配列番号１の20位～337位に相当する位置を容易に決定することができる。配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質のフィロウイルス科オルソログにおける、配列番号１の1位～500位に相当する位置において、配列番号１の20位～337位に相当する位置を含むポリペプチドの例としては、図１８－１～図１８－３に示すように、配列番号６で示すアミノ酸配列からなるSUDVのNPタンパク質の1位～500位において20位～337位を含むポリペプチド；配列番号７で示すアミノ酸配列からなるRESTVのNPタンパク質の1位～500位において20位～337位を含むポリペプチド；配列番号８で示すアミノ酸配列からなるTAFVのNPタンパク質の1位～500位において20位～337位を含むポリペプチド；配列番号９で示すアミノ酸配列からなるBUBVのNPタンパク質の1位～500位において20位～337位を含むポリペプチド；配列番号１０で示すアミノ酸配列からなるMARVの1位～480位において2位～319位を含むポリペプチド；及び配列番号１１で示すアミノ酸配列からなるLLOVのNPタンパク質の1位～502位において20位～337位を含むポリペプチドが挙げられる。
　「そのN末端及び／又はC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチド」とは、前記（a）～（d）のいずれかに記載のポリペプチドのN末端及び／又はC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチドである。任意のアミノ酸配列として、前記（a）～（d）のいずれかに記載のポリペプチドとは異なる任意のアミノ酸配列を用いることができる。特に限定しないが、例えば、ユビキチン化配列、核移行シグナル、タグ配列や、後述の標識タンパク質等が挙げられる。付加されるアミノ酸数は限定しないが、例えば、それぞれ、20個、19個、18個、17個、16個、15個、14個、13個、12個、11個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個、又は1個であってもよい。一実施形態では、前記（a）～（d）のいずれかに記載のポリペプチドのN末端にMet残基を付加することができる。
　一実施形態において、上記（d）のポリペプチドは、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質のフィロウイルス科オルソログにおいて配列番号１の1位～337位に相当する位置を含む。
　一実施形態において、上記（d）のポリペプチドは、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質のフィロウイルス科オルソログにおいて配列番号１の20位～500位に相当する位置を含む。
　一実施形態において、フィロウイルス科オルソログは、エボラウイルス属オルソログであってもよい。
（２）VP30タンパク質に由来するペプチド断片、又はそのN末端及び／又はC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチド
　一態様において、本発明のフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤は、フィロウイルス科ウイルスのVP30タンパク質に由来するペプチド断片、又はそのN末端及び／又はC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチドからなる。フィロウイルス科ウイルスのVP30タンパク質に由来するペプチド断片は、ザイールエボラウイルスのVP30タンパク質、又はザイールエボラウイルスのVP30タンパク質のフィロウイルス科オルソログのいずれかに由来するペプチド断片であって、細胞内においてフィロウイルス科ウイルスの複製を阻害することができるペプチド断片である。
　本発明のフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤を構成するフィロウイルス科ウイルスのVP30タンパク質に由来するペプチド断片の具体例としては、（f）配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質において91位～254位からなるポリペプチド、（g）配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質の47位～288位において91位～254位を含むポリペプチド、（h）配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質のフィロウイルス科オルソログにおいて配列番号３の91位～254位に相当する位置からなるポリペプチド、又は（i）配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質のフィロウイルス科オルソログにおける、配列番号３の47位～288位に相当する位置において、配列番号３の91位～254位に相当する位置を含むポリペプチドが挙げられる。
　「（f）配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質において91位～254位からなるポリペプチド」は、VP30タンパク質の六量体化モチーフ、並びにC末端ドメイン（CTD）に含まれる7個のαヘリックスのうち、N末端側に位置する6個のαへリックスを含むポリペプチドであり、本明細書の実施例においてEBOV複製を阻害する活性を有することが見出されたΔVP30(91-254)に対応する。
　「（g）配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質の47位～288位において91位～254位を含むポリペプチド」とは、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質の47位～288位に含まれるペプチド断片であって、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質の91位～254位を含むペプチド断片である。すなわち、当該ペプチド断片のN末端に位置するアミノ酸残基は、配列番号３で示すアミノ酸配列における47～91位のいずれかに位置し、当該ペプチド断片のC末端に位置するアミノ酸残基は、配列番号３で示すアミノ酸配列における254～288位のいずれかに位置する。上記（g）のポリペプチドの具体例としては、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質において91位～254位、80位～254位、70位～254位、60位～254位、50位～254位、47位～254位、91位～260位、91位～265位、91位～270位、91位～275位、91位～280位、91位～285位、又は91位～288位からなるポリペプチド、例えば、本明細書の実施例においてEBOV複製を阻害する活性を有することが見出された、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質において91位～254位からなるポリペプチドが挙げられる。
　一実施形態において、上記（g）のポリペプチドは、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質において47位～254位を含む。そのようなポリペプチドの例として、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質において47位～254位、47位～260位、47位～265位、47位～270位、47位～275位、47位～280位、47位～285位、又は47位～288位からなるポリペプチド、例えば、本明細書の実施例においてEBOV複製を阻害する活性を有することが見出された、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質において、91位～263位からなるポリペプチド、91位～272位からなるポリペプチド、及び91位～288位からなるポリペプチドが挙げられる。
　一実施形態において、上記（g）のポリペプチドは、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質において91位～288位を含む。例えば、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質において91位～288位、90位～288位、85位～288位、80位～288位、75位～288位、70位～288位、65位～288位、60位～288位、55位～288位、50位～288位、又は47位～288位からなるポリペプチド、例えば、本明細書の実施例においてEBOV複製を阻害する活性を有することが見出された、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質において、47位～288位からなるポリペプチド、及び91位～288位からなるポリペプチドが挙げられる。
　「（h）配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質のフィロウイルス科オルソログにおいて配列番号３の91位～254位に相当する位置からなるポリペプチド」とは、フィロウイルス科に属する任意のウイルスにおけるVP30オルソログのアミノ酸配列を配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質のアミノ酸配列に対して整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときに、配列番号３の91位～254位に相当する位置からなるポリペプチドである。当業者であればそのようなアラインメントは容易に実施することが可能であり、フィロウイルス科に属する任意のウイルスにおけるVP30オルソログのアミノ酸配列において、配列番号３の91位～254位に相当する位置を容易に決定することができる。配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質のフィロウイルス科オルソログにおいて配列番号３の91位～254位に相当する位置からなるポリペプチドの例としては、図１９－１～図１９－２に示すように、配列番号１２で示すアミノ酸配列からなるSUDVのVP30タンパク質の91位～254位からなるポリペプチド；配列番号１３で示すアミノ酸配列からなるRESTVのVP30タンパク質の91位～254位からなるポリペプチド；配列番号１４で示すアミノ酸配列からなるTAFVのVP30タンパク質の91位～254位からなるポリペプチド；配列番号１５で示すアミノ酸配列からなるBUBVのVP30タンパク質の91位～254位からなるポリペプチド；配列番号１６で示すアミノ酸配列からなるMARVのVP30タンパク質の97位～261位からなるポリペプチド；及び配列番号１７で示すアミノ酸配列からなるLLOVのVP30タンパク質の133位～296位からなるポリペプチドが挙げられる。
　「（i）配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質のフィロウイルス科オルソログにおける、配列番号３の47位～288位に相当する位置において、配列番号３の91位～254位に相当する位置を含むポリペプチド」とは、フィロウイルス科に属する任意のウイルスにおけるVP30オルソログのアミノ酸配列を配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質のアミノ酸配列に対して整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときに、配列番号３の47位～288位に相当する位置において、配列番号３の91位～254位に相当する位置を含むポリペプチドである。当業者であれば、上述のように、フィロウイルス科に属する任意のウイルスにおけるVP30オルソログのアミノ酸配列において、配列番号３の47位～288位に相当する位置、及び配列番号３の91位～254位に相当する位置を容易に決定することができる。配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質のフィロウイルス科オルソログにおける、配列番号３の47位～288位に相当する位置において、配列番号３の91位～254位に相当する位置を含むポリペプチドの例としては、図１９－１～図１９－２に示すように、配列番号１２で示すアミノ酸配列からなるSUDVのVP30タンパク質の47位～288位において91位～254位を含むポリペプチド；配列番号１３で示すアミノ酸配列からなるRESTVのVP30タンパク質の47位～287位において91位～254位を含むポリペプチド；配列番号１４で示すアミノ酸配列からなるTAFVのVP30タンパク質の47位～289位において91位～254位を含むポリペプチド；配列番号１５で示すアミノ酸配列からなるBUBVのVP30タンパク質の47位～289位において91位～254位を含むポリペプチド；配列番号１６で示すアミノ酸配列からなるMARVのVP30タンパク質の47位～281位において97位～261位を含むポリペプチド；及び配列番号１７で示すアミノ酸配列からなるLLOVのVP30タンパク質の65位～328位において133位～296位を含むポリペプチドが挙げられる。
　「そのN末端及び／又はC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチド」とは、前記（f）～（i）のいずれかに記載のポリペプチドのN末端及び／又はC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチドである。ここで任意のアミノ酸配列には、前記（f）～（i）のいずれかに記載のポリペプチドとは異なる任意のアミノ酸配列を用いることができる。特に限定しないが、例えば、ユビキチン化配列、核移行シグナル、タグ配列や、後述の標識タンパク質等が挙げられる。付加されるアミノ酸数は限定しないが、例えば、それぞれ、20個、19個、18個、17個、16個、15個、14個、13個、12個、11個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個、又は1個であってもよい。一実施形態では、前記（f）～（i）のいずれかに記載のポリペプチドのN末端にMet残基を付加することができる。
　一実施形態において、上記（i）に記載のポリペプチドは、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質のフィロウイルス科オルソログにおいて配列番号３の47位～254位に相当する位置を含む。
　一実施形態において、上記（i）に記載のポリペプチドは、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質のフィロウイルス科オルソログにおいて配列番号３の91位～288位に相当する位置を含む。
　一実施形態において、フィロウイルス科オルソログは、エボラウイルス属オルソログであってもよい。
１－３－２．発現ベクター
　本発明のフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤を構成する「発現ベクター」は、フィロウイルス科ウイルスのNPタンパク質又はVP30タンパク質に由来するペプチド断片又はそのいずれかのN末端及び／又はC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチドをコードする核酸、及びプロモーターを含み、細胞内で前記ペプチド断片又は前記ポリペプチドを発現可能な発現ベクターである。発現ベクターは、前記構成要素である核酸及びプロモーターに加えて、必要に応じて、標識遺伝子（選抜マーカー）、エンハンサー、ターミネーター、複製起点、及びポリAシグナル等の構成要素を含んでいてもよい。発現ベクターは、プラスミドベクターやウイルスベクターであってもよい。以下、各構成要素について説明をする。
（核酸）
　「フィロウイルス科ウイルスのNPタンパク質又はVP30タンパク質に由来するペプチド断片又はそのいずれかのN末端及び／又はC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチドをコードする核酸」は、「１－３－１．ペプチド断片（ポリペプチド）」に記載のいずれかのペプチド断片又はポリペプチドをコードする核酸であればよい。そのような核酸の塩基配列は、限定はしない。フィロウイルス科ウイルスのNPタンパク質に由来するペプチド断片又はそのN末端及び／又はC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチドをコードする核酸の例としては、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質において20位～337位からなるポリペプチドをコードする核酸（例えば、配列番号２で示す塩基配列からなるザイールエボラウイルスのNP遺伝子において58位～1011位からなる核酸）、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質において20位～405位からなるポリペプチドをコードする核酸（例えば、配列番号２で示す塩基配列からなるザイールエボラウイルスのNP遺伝子において58位～1215位からなる核酸）、及び配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質において1位～405位からなるポリペプチドをコードする核酸（例えば、配列番号２で示す塩基配列からなるザイールエボラウイルスのNP遺伝子において1位～1215位からなる核酸）が挙げられ、そのいずれかの5’末端側に開始コドン（ATG）が付加された塩基配列もまた例示される。フィロウイルス科ウイルスのVP30タンパク質に由来するペプチド断片又はそのN末端及び／又はC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチドをコードする核酸の例としては、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質において91位～254位からなるポリペプチドをコードする核酸（例えば、配列番号４で示す塩基配列からなるザイールエボラウイルスのVP30遺伝子において271位～762位からなる核酸）、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質において91位～263位からなるポリペプチドをコードする核酸（例えば、配列番号４で示す塩基配列からなるザイールエボラウイルスのVP30遺伝子において271位～789位からなる核酸）、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質において91位～272位からなるポリペプチドをコードする核酸（例えば、配列番号４で示す塩基配列からなるザイールエボラウイルスのVP30遺伝子において271位～816位からなる核酸）、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質において91位～288位からなるポリペプチドをコードする核酸（例えば、配列番号４で示す塩基配列からなるザイールエボラウイルスのVP30遺伝子において271位～864位からなる核酸）、及び配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質において47位～288位からなるポリペプチドをコードする核酸（例えば、配列番号４で示す塩基配列からなるザイールエボラウイルスのVP30遺伝子において139位～864位からなる核酸）が挙げられ、そのいずれかの5’末端側に開始コドン（ATG）が付加された塩基配列もまた例示される。
（プロモーター）
　本明細書においてプロモーターは、ペプチド断片をコードする核酸を細胞内で発現誘導できるプロモーターである。本発明のフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤を適用する、すなわち発現ベクターを導入する標的細胞は、原則として哺乳動物細胞、特にヒト又はチンパンジー由来の細胞であることから、それらの細胞内で下流の遺伝子を発現できるプロモーターであればよい。例えば、CMVプロモーター（CMV-IEプロモーター）、SV40初期プロモーター、RSVプロモーター、EF1αプロモーター、Ubプロモーター等が挙げられる。
（標識遺伝子）
　本明細書において「標識遺伝子」は、選抜マーカー又はレポータータンパク質とも呼ばれる標識タンパク質をコードする遺伝子である。「標識タンパク質」とは、その活性に基づいて標識遺伝子の発現の有無を判別することのできるペプチドをいう。活性の検出は、標識タンパク質の活性そのものを直接的に検出するものであってもよいし、色素のような標識タンパク質の活性によって発生する代謝物を介して間接的に検出するものであってもよい。検出は、生物学的検出（抗体、アプタマー等のペプチドや核酸の結合による検出を含む）、化学的検出（酵素反応的検出を含む）、物理的検出（行動分析的検出を含む）、又は検出者の感覚的検出（視覚、触覚、嗅覚、聴覚、味覚による検出を含む）のいずれであってもよい。
　標識遺伝子がコードする標識タンパク質の種類は、当該分野で公知の方法によりその活性を検出可能な限り、特に限定はしない。検出に際して形質転換体に対する侵襲性の低い標識タンパク質は好ましい。例えば、タグペプチド、薬剤耐性タンパク質、色素タンパク質、蛍光タンパク質、発光タンパク質等が挙げられる。
　「タグペプチド」は、タンパク質を標識化することのできる十数アミノ酸～数十アミノ酸からなる短ペプチドであって、タンパク質の検出用、精製用として用いられる。通常は、標識すべきタンパク質をコードする遺伝子の5’末端側又は3’末端側にタグペプチドをコードする塩基配列を連結し、タグペプチドとの融合タンパク質として発現させることで標識化する。タグペプチドは、当該分野で様々な種類が開発されているが、いずれのタグペプチドを使用してもよい。タグペプチドの具体例として、FLAG、HA、His、PA、及びmyc等が挙げられる。
　「薬剤耐性タンパク質」は、培地等に添加された抗生物質等の薬剤に対する抵抗性を細胞に付与するタンパク質であり、多くは酵素である。例えば、アンピシリンに対して抵抗性を付与するβラクタマーゼ、カナマイシンに対して抵抗性を付与するアミノグリコシド3’ホスホトランスフェラーゼ、テトラサイクリンに対して抵抗性を付与するテトラサイクリン排出トランスポーター、クロラムフェニコールに対して抵抗性を付与するCAT（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）等が挙げられる。
　「色素タンパク質」は、色素の生合成に関与するタンパク質、又は基質の付与により色素による形質転換体の化学的検出を可能にするタンパク質であり、通常は酵素である。ここでいう「色素」とは、形質転換体に色素を付与することができる低分子化合物又はペプチドで、その種類は問わない。例えば、β-ガラクトシダーゼ（LacZ）、β-グルクロニターゼ（GUS）、メラニン系色素合成タンパク質、オモクローム系色素、又はプテリジン系色素が挙げられる。
　「蛍光タンパク質」は、特定波長の励起光を照射したときに特定波長の蛍光を発するタンパク質をいう。天然型及び非天然型のいずれであってもよい。また、励起波長、蛍光波長も特に限定はしない。具体的には、例えば、CFP、RFP、DsRed（3xP3-DsRedのような派生物を含む）、YFP、PE、PerCP、APC、GFP（EGFP、3xP3-EGFP等の派生物を含む）等が挙げられる。
　「発光タンパク質」とは、励起光を必要とすることなく発光することのできる基質タンパク質又はその基質タンパク質の発光を触媒する酵素をいう。例えば、基質タンパク質としてのルシフェリン又はイクオリン、酵素としてのルシフェラーゼが挙げられる。
（エンハンサー）
　本明細書において「エンハンサー」は、ベクター内の遺伝子又はその断片の発現効率を増強できるものであれば特に限定はされない。
（ターミネーター）
　本明細書において「ターミネーター」は、前記プロモーターの活性により発現した遺伝子等の転写を終結できる配列である。ターミネーターの種類は、特に限定はしない。好ましくはプロモーターと同一生物種由来のターミネーターである。一遺伝子発現制御系においてゲノム上で前記プロモーターと対になっているターミネーターは特に好ましい。
（複製起点）
　本発明における発現ベクターは、フィロウイルス科ウイルスのNPタンパク質又はVP30タンパク質に由来するペプチド断片等を哺乳動物細胞内で一過的に発現することができればよい。したがって、哺乳動物細胞用の複製起点は不要である。しかし、シャトルベクターとして、例えば、大腸菌等の細菌内で発現させる場合には、その複製起点が必須となる。複製起点は、公知の配列を利用することができる。例えば、大腸菌用の複製起点であればf1 origin等を利用すればよい。
１－４．効果
　本発明のフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤によれば、フィロウイルス科ウイルスの複製を阻害することができる。
２．フィロウイルス科ウイルス感染症治療用医薬組成物
２－１．概要
　本発明の第２の態様は、フィロウイルス科ウイルス感染症治療用医薬組成物である。本発明のフィロウイルス科ウイルス感染症治療用医薬組成物は、第１態様のフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤を有効成分とし、フィロウイルス科ウイルスの複製を阻害することでフィロウイルス科ウイルスの増殖を抑制し、フィロウイルス科ウイルス感染症を治療することができる。
２－２．構成
２－２－１．構成成分
　本発明のフィロウイルス科ウイルス感染症治療用医薬組成物の構成成分について説明をする。本発明のフィロウイルス科ウイルス感染症治療用医薬組成物は、必須の構成成分として一以上の有効成分、及び溶媒及び／又は担体、さらに薬剤送達系（DDS；Drug Delivery System）粒子を含む。以下、各構成成分について具体的に説明をする。
（１）有効成分
　本発明のフィロウイルス科ウイルス感染症治療用医薬組成物は、必須の有効成分として第１態様に記載のフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤を包含する。本発明のフィロウイルス科ウイルス感染症治療用医薬組成物は、１種又は複数種のフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤を含むことができる。
　一実施形態において、本発明のフィロウイルス科ウイルス感染症治療用医薬組成物は、第１態様に記載のNPタンパク質に由来するペプチド断片、若しくはそのN末端及び／若しくはC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチド、並びに／又はVP30タンパク質に由来するペプチド断片、若しくはそのN末端及び／若しくはC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチドを含んでもよい。
　本発明のフィロウイルス科ウイルス感染症治療用医薬組成物に含まれる有効成分の含有量は、特に限定はしない。一般に含有量は、有効成分の種類、剤形、並びに後述する他の構成成分である溶媒や担体の種類によって異なる。したがって、それぞれの条件を勘案して適宜定めればよい。単回適用量のフィロウイルス科ウイルス感染症治療用医薬組成物に有効量の有効成分が含有されていればよい。ただし、有効成分の薬理効果を得る上で被験体にフィロウイルス科ウイルス感染症治療用医薬組成物を大量に投与する必要がある場合には、被験体の負担軽減のために数回に分割して投与することもできる。この場合、有効成分の量は、総合量で有効量を含んでいればよい。「有効量」とは、有効成分としての機能を発揮する上で必要な量であって、かつそれを適用する被験体に対して有害な副作用をほとんど又は全く付与しない量をいう。この有効量は、被験体の情報、適用経路、及び適用回数等の様々な条件によって変わり得る。したがって、フィロウイルス科ウイルス感染症治療用医薬組成物を医薬として使用する場合、有効成分の含有量は、最終的には、医師又は薬剤師等の判断によって決定される。
　本明細書において「被験体」とは、第１態様に記載のフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤、又は本態様のフィロウイルス科ウイルス感染症治療用医薬組成物の適用対象物をいう。例えば、細胞（培養細胞を含む）、組織、器官、又は個体である。個体の場合、好ましくはヒト個体であり、この場合、特に「被験者」と表記する。フィロウイルス科ウイルスに感染した被験者、例えばエボラウイルス感染者は特に好ましい。
　本明細書において、「被験体の情報」とは、被験体の特徴や状態に関する様々な情報である。例えば、被験体がヒト個体の場合には、年齢、体重、性別、全身の健康状態、疾患の有無、疾患の進行度や重症度、薬剤感受性、併用薬物の有無及び治療に対する耐性等が挙げられる。
（２）溶媒
　本発明のフィロウイルス科ウイルス感染症治療用医薬組成物は、必要に応じて薬学的に許容可能な溶媒を含むことができる。「薬学的に許容可能な溶媒」とは、製剤技術分野において通常使用する溶媒をいう。例えば、水若しくは水溶液、又は有機溶剤が挙げられる。水溶液には、例えば、生理食塩水、ブドウ糖又はその他の補助剤を含む等張液、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液が挙げられる。補助剤には、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム、その他にも低濃度の非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。有機溶剤には、エタノールが挙げられる。
（３）担体
　本発明のフィロウイルス科ウイルス感染症治療用医薬組成物は、必要に応じて薬学的に許容可能な担体を含むことができる。「薬学的に許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する添加剤をいう。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤、ヒト血清アルブミン等が挙げられる。
　賦形剤には、例えば、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖、金属塩、クエン酸、酒石酸、グリシン、ポリエチレングリコール、プルロニック、カオリン、ケイ酸、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
　結合剤には、例えば、植物デンプンを用いたデンプン糊、ペクチン、キサンタンガム、単シロップ、グルコース液、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セラック、パラフィン、ポリビニルピロリドン又はそれらの組み合わせが挙げられる。
　崩壊剤としては、例えば、前記デンプンや、乳糖、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド又はそれらの塩が挙げられる。
　充填剤としては、ワセリン、前記糖及び／又はリン酸カルシウムが例として挙げられる。
　乳化剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが例として挙げられる。
　流動添加調節剤及び滑沢剤としては、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが例として挙げられる。
　上記の他にも、必要であれば医薬組成物等において通常用いられる可溶化剤、懸濁剤、希釈剤、分散剤、界面活性剤、無痛化剤、安定剤、吸収促進剤、増量剤、付湿剤、保湿剤、湿潤剤、吸着剤、矯味矯臭剤、崩壊抑制剤、コーティング剤、着色剤、保存剤、防腐剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤、等張化剤等を適宜含むこともできる。
　担体は、被験体内で酵素等による前記有効成分の分解を回避又は抑制する他、製剤化や投与方法を容易にし、剤形及び薬効を維持するために用いられるものであり、必要に応じて適宜使用すればよい。
（４）薬剤送達系粒子（DDS粒子）
　本発明のフィロウイルス科ウイルス感染症治療用医薬組成物は、必要に応じてDDS粒子を含むことができる。DDS粒子は、その内部等に有効成分や他の担体等を包含して、標的部位にまで内容物、特に有効成分を分解させることなく送達し、また生体内での薬物分布を時間的に、量的に制御し得る粒子をいう。本発明のフィロウイルス科ウイルス感染症治療用医薬組成物の有効成分はペプチド又は核酸であることから、投与後に生体内でプロテアーゼやヌクレアーゼによる分解から保護するためにも、DDS粒子の使用は好適である。DDS粒子の種類は問わない。例えば、リポソーム、高分子ミセル、ウイルス粒子等が挙げられる。
２－２－２．剤形
　本発明のフィロウイルス科ウイルス感染症治療用医薬組成物の剤形は、特に限定しない。被験体の体内で有効成分を失活させることなく目的の部位にまで送達される形態であればよい。
　具体的な剤形は、後述する適用方法によって異なる。適用方法は、非経口投与と経口投与に大別することができるので、それぞれの投与法に適した剤形にすればよい。
　例えば、投与方法が非経口投与であれば、好ましい剤形は、対象部位への直接投与又は循環系を介した全身投与が可能な液剤である。液剤の好例としては、注射剤が挙げられる。注射剤は、溶媒の他、前記賦形剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、pH調節剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
　投与方法が経口投与であれば、好ましい剤形は、固形剤（錠剤、カプセル剤、ドロップ剤、トローチ剤を含む）、顆粒剤、粉剤、散剤、液剤（内用水剤、乳剤、シロップ剤を含む）が挙げられる。固形剤であれば、必要に応じて、当該技術分野で公知の剤皮を施した剤形、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠にすることができる。
　なお、上記各剤形の具体的な形状、大きさについては、いずれもそれぞれの剤形において当該分野で公知の剤形の範囲内にあればよく、特に限定はしない。本発明のB型肝炎治療用医薬組成物の製造方法については、当該技術分野の常法に従って製剤化すればよい。
２－３．適用方法
　本発明のフィロウイルス科ウイルス感染症治療用医薬組成物の適用方法は、経口投与でも、非経口投与でもよい。一般に経口投与法は全身投与となるが、非経口投与法は、さらに全身投与と局所投与に細分できる。局所投与には、例えば、筋肉内投与、皮下投与、組織投与、及び器官投与が該当し、非経口投与法の全身投与には、循環器内投与、例えば、静脈内投与（静注）、動脈内投与及びリンパ管内投与が挙げられる。本発明のフィロウイルス科ウイルス感染症治療用医薬組成物を局所投与する場合には、注射等で局所感染部位に直接投与すればよい。また、全身投与する場合には、静注等により循環器内に投与すればよい。投与量は、有効成分が奏効する上で有効な量であればよい。有効量は、前述のように被験体情報に応じて適宜選択される。
　EBOV等のフィルウイルス科ウイルスは、マクロファージや樹状細胞等の貪食性免疫細胞に感染すると考えられ、感染後の時間経過とともに、創傷部位、呼吸器、又は消化器粘膜等の局所感染から全身感染へと移行するものと考えられる。それ故、全身感染に至っていない感染初期のステージでは局所感染部位や筋肉に投与し、全身感染のステージでは静注等により循環器内に投与することも可能である。
３．フィロウイルス科ウイルスの複製阻害方法
３－１．概要
　本発明の第３の態様は、フィロウイルス科ウイルスの複製阻害方法である。本発明のフィロウイルス科ウイルス複製阻害方法は、フィロウイルス科ウイルス感染細胞若しくはその恐れのある細胞等の宿主内に、フィロウイルス科ウイルスのNPタンパク質又はVP30タンパク質に由来するペプチド断片、そのいずれかのN末端及び／又はC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチド、又は前記ペプチド断片若しくは前記ポリペプチドをコードする核酸を含み、細胞内で前記ペプチド断片又は前記ポリペプチドを発現可能な発現ベクターを導入することで宿主内におけるフィロウイルス科ウイルスの複製を阻害し、それによってフィロウイルス科ウイルスの複増殖を抑制することができる。また、この方法をフィロウイルス科ウイルス感染者若しくはその感染の恐れがある者に投与すれば、フィロウイルス科ウイルス感染症の治療方法となり得る。
３－２．方法
　本態様におけるフィロウイルス科ウイルスの複製阻害方法は、必須の工程として導入工程を含む。
　「導入工程」は、フィロウイルス科ウイルスのNPタンパク質又はVP30タンパク質に由来するペプチド断片、そのいずれかのN末端及び／又はC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチド、又は前記ペプチド断片又は前記ポリペプチドをコードする核酸を含み、細胞内で前記ペプチド断片を発現可能な発現ベクター、すなわち、第１態様に記載のフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤を宿主内に導入する工程である。
　本態様において「宿主」とは、フィロウイルス科ウイルス複製阻害剤を導入可能な、細胞、組織、又は個体をいう。宿主が細胞の場合、細胞は、１又は複数の哺乳動物細胞であればよい。好ましくはフィロウイルス科ウイルスの宿主であるヒト、ゴリラ、チンパンジー、サル、コウモリ、及びシカ由来の細胞である。由来細胞の種類は問わない。フィロウイルス科ウイルスの感染対象細胞である各種器官や組織由来の細胞（例えば、マクロファージや樹状細胞等の貪食性免疫細胞）が対象となり得る。また宿主は、細胞株系又は初代培養細胞系のいずれであってもよい。限定はしないが、宿主はフィロウイルス科ウイルスに感染した細胞やその恐れがある細胞が好ましい。宿主が個体の場合、前述の被験者であればよい。
　各発現ベクターの宿主への導入方法は、特に限定はしない。例えば、宿主が細胞や組織であれば、Green ＆ Sambrook、2012、Molecular Cloning： A Laboratory Manual Fourth Ed．、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York等に記載された当該分野で公知の遺伝子導入方法（形質転換方法）を用いればよい。例えば、リポフェクチン法（PNAS、1989、86: 6077；PNAS、1987、84: 7413）、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法（Virology、1973、52: 456－467）、DEAE-Dextran法等が挙げられる。一方、宿主が個体、例えば被験者であれば、第２態様の「２－３．適用方法」に記載の方法で、被験者にフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤、又はそれを有効成分として含むフィロウイルス科ウイルス感染症治療用医薬組成物を投与すればよい。それらを被験者に投与することで、本態様のフィロウイルス科ウイルス複製阻害方法は、フィロウイルス科ウイルス感染症治療方法となり得る。
　一態様において、本態様のフィロウイルス科ウイルス複製阻害方法は、（a）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質において20位～337位からなるポリペプチド、（b）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質の1位～500位において20位～337位を含むポリペプチド、（c）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質のフィロウイルス科オルソログにおいて配列番号１の20位～337位に相当する位置からなるポリペプチド、（d）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質のフィロウイルス科オルソログにおける、配列番号１の1位～500位に相当する位置において、配列番号１の20位～337位に相当する位置を含むポリペプチド、（e）前記（a）～（d）のいずれかに記載のポリペプチドのN末端及び／又はC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチド、（f）配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質において91位～254位からなるポリペプチド、（g）配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質の47位～288位において91位～254位を含むポリペプチド、（h）配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質のフィロウイルス科オルソログにおいて配列番号３の91位～254位に相当する位置からなるポリペプチド、（i）配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質のフィロウイルス科オルソログにおける、配列番号３の47位～288位に相当する位置において、配列番号３の91位～254位に相当する位置を含むポリペプチドからなる群から選択されるいずれかのポリペプチド、又は（j）前記（f）～（i）のいずれかに記載のポリペプチドのN末端及び／又はC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチド、又は前記ポリペプチドをコードする核酸を含み、細胞内で前記ポリペプチドを発現可能な発現ベクターを宿主内に導入する工程を含む。上記(a)～(j)の構成は第1態様の記載に準じる。
４．フィロウイルス科ウイルスの複製活性の評価方法
４－１．概要
　本発明の第４の態様は、フィロウイルス科ウイルスの複製活性の評価方法である。本発明の評価方法は、レポーター遺伝子発現ベクターと共に、NP遺伝子発現ベクター、VP30遺伝子発現ベクター、VP35遺伝子発現ベクター、及びL遺伝子発現ベクターを宿主細胞内に導入し、レポーター遺伝子の発現を検出することで、フィロウイルス科ウイルスの複製活性を評価することができる。
４－２．方法
　本態様の評価方法は、必須の工程として導入工程及び検出工程を含む。
　「導入工程」は、レポーター遺伝子発現ベクター、NP遺伝子発現ベクター、VP30遺伝子発現ベクター、VP35遺伝子発現ベクター、及びL遺伝子発現ベクターを宿主細胞内に導入する工程である。
　本明細書において「レポーター遺伝子発現ベクター」は、RNAポリメラーゼIプロモーター配列、フィロウイルス科ウイルスのトレーラー配列、レポーター遺伝子配列、フィロウイルス科ウイルスのリーダー配列、及びRNAポリメラーゼIターミネーター配列を上記順序で含む。レポーター遺伝子発現ベクターにおいて、レポーター遺伝子配列は、前記プロモーター配列に対して逆向きに含まれている。レポーター遺伝子は、その発現を検出可能な遺伝子であれば限定せず、例えば色素タンパク質、蛍光タンパク質、又は発光タンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
　NP遺伝子発現ベクターは、宿主細胞内で遺伝子発現誘導が可能なプロモーターの下流に、フィロウイルス科ウイルスのNP遺伝子が発現可能な状態で配置されている。
　VP30遺伝子発現ベクターは、宿主細胞内で遺伝子発現誘導が可能なプロモーターの下流に、フィロウイルス科ウイルスのVP30遺伝子が発現可能な状態で配置されている。
　VP35遺伝子発現ベクターは、宿主細胞内で遺伝子発現誘導が可能なプロモーターの下流に、フィロウイルス科ウイルスのVP35遺伝子が発現可能な状態で配置されている。
　L遺伝子発現ベクターは、宿主細胞内で遺伝子発現誘導が可能なプロモーターの下流に、フィロウイルス科ウイルスのL遺伝子が発現可能な状態で配置されている。
　上記の発現ベクターは、遺伝子配列及びプロモーターに加えて、必要に応じて、標識遺伝子（選抜マーカー）、エンハンサー、ターミネーター、複製起点、及びポリAシグナル等の構成要素を含んでいてもよい。各構成要素の構成は第１態様の発現ベクターの記載に準じる。
　一実施形態において、NP遺伝子発現ベクター、VP30遺伝子発現ベクター、VP35遺伝子発現ベクター、及びL遺伝子発現ベクターの導入比率は4：1：1：2である。
　「検出工程」は、レポーター遺伝子の発現を検出する工程である。レポーター遺伝子の発現を検出する方法は、レポーター遺伝子の種類に応じて適宜選択すればよい。レポーター遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子であれば、特定波長の励起光を照射して蛍光タンパク質の蛍光強度を測定することができる。レポーター遺伝子が発光タンパク質遺伝子であれば、発光基質を培地に添加して発光強度を測定することができる。
　一実施形態において、本態様の方法は、選択工程として宿主細胞を被験物質で処置する被験物質処置を含んでもよい。本工程を含む場合、被験物質のフィロウイルス科ウイルスに対する複製活性阻害効果を評価することができる。
＜実施例１：EBOVミニゲノムアッセイの開発＞
（目的）
　EBOV複製効率を測定するためのEBOVミニゲノムアッセイを開発する。
（方法と結果）
（１）プラスミドの構築
　EBOVタンパク質（L、NP、VP35、及びVP30）の発現プラスミドは、コドンをヒト細胞に最適化した遺伝子を哺乳動物細胞発現ベクターpCI (Promega)にサブクローニングしたものを使用した。ΔNP及びΔVP30発現プラスミドは、pCI-NP又はpCI-VP30から主に部位特異的変異導入(PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit, TaKaRa)を用いて作製した。一部のコンストラクトには、配列番号５で示すアミノ酸配列（GVAMPGAEDDVV）からなるPAタグを導入した。
（２）EBOVミニゲノムアッセイ
　本明細書の実施例においてウイルス複製効率の測定に用いたEBOVミニゲノムアッセイの原理を図３に示す。
　EBOVゲノムの非翻訳領域であるTrailer (740bp)及びLeader (469bp)（図１）を両端に有するアンチセンス鎖の分泌型ルシフェラーゼ遺伝子（Gluc）をRNA ポリメラーゼI（RNA PolI）プロモーター（PRO）とターミネーター（TER）との間に挿入したレポーター遺伝子（図３、miniG）を作製した。miniG及びEBOVタンパク質（NP、VP35、VP30、及びL）の発現ベクターを電気的穿孔法によりHeLa細胞に導入し、24時間培養後に培養上清中のルシフェラーゼ活性を測定した。
　miniGが細胞に導入されると、宿主のRNAポリメラーゼI（PolI）によってEBOVゲノムを模したレポーターRNA（図３、vRNA）が転写される。このレポーターRNAを鋳型として、NP、VP35、VP30、及びLによって、CapとPolyAを付加したGluc mRNA（図３、Gluc mRNA）が産生される。培養上清中に分泌されたルシフェラーゼ活性を測定することにより、EBOV複製活性を評価することができる。
（３）EBOVミニゲノムアッセイにおけるL、NP、VP35、及びVP30の最適比率の検討
　EBOVミニゲノムアッセイにおけるL、NP、VP35、及びVP30の最適な導入比率を検討した。miniG及びEBOVタンパク質（L、NP、VP35、及びVP30）の発現プラスミドをHeLa細胞に導入し、24時間培養後に培養上清中のルシフェラーゼ活性を測定した。L、NP、VP35、及びVP30は図４に示す様々な比率で導入し、miniGとEBOVタンパク質との比率は1：1とした。
　結果を図４に示す。EBOVタンパク質の比率は、L：NP：VP35：VP30＝4：1：1：2が最適であった。以降の実施例ではこの比率でEBOVタンパク質をHeLa細胞に導入し、その上で様々な欠失変異型タンパク質を導入することで、EBOV複製阻害効果を評価した。
＜実施例２：欠失変異型NPによるEBOV複製阻害効果＞
（目的）
　様々な欠失変異型NPを作製し、EBOV複製に対する阻害効果を検討する。
（方法）
　EBOVの野生型NPは、配列番号１で示すアミノ酸配列からなり、全長721アミノ酸からなるタンパク質である。EBOVの野生型NPには、N末端のコアドメイン（20～405アミノ酸残基）とC末端のCテール（641～721アミノ酸残基）との間に非保存領域（Non-conserved region）が存在する（図５Ａ及び図５Ｂ）。NPのコアドメインはNローブ（20～240アミノ酸残基）とCローブ（241～405アミノ酸残基）を含み、NローブとCローブの間にはRNA結合グローブ（RNA binding groove）が形成される。NPの結晶構造解析の結果によれば、コアドメインには13個のαヘリックスが含まれる（Dong S, et al., Protein Cell, 2015, 6(5):351-62）。
　本発明者らは、様々な欠失変異型NP（ΔNP）のEBOV複製に対する阻害効果を検討する目的で、図５Ｃ、図６Ａ、及び図７Ａに示すΔNPを発現する発現プラスミドを作製した。各々のΔNPについて、以下の方法でEBOVミニゲノムアッセイを行った。miniG及びEBOVタンパク質（NP、VP35、VP30、及びL）発現プラスミドと共に、ΔNP発現プラスミドをHeLa細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入の比率は、miniG：NP：VP35：VP30：L：ΔNP＝8：4：1：1：2：16とした。野生型NPとΔNPの比率は、およそ1：4となる。24時間培養後に培養上清中のルシフェラーゼ活性を測定した。
（結果）
（１）欠失変異型NPによるEBOV複製阻害効果
　図５Ｃ及び図６Ａに示す9種類のΔNPによるEBOV複製阻害効果を検討した。各々のΔNPについてEBOVミニゲノムアッセイを行った結果を図６Ｂに示す。
　コアドメイン全長を含み非保存領域以降を欠くΔNP(1-405)又はΔNP(20-405)を導入した細胞では、ルシフェラーゼ活性が著しく阻害され、EBOV複製の抑制が認められた（図６Ｂ）。
　一方、Nローブのみを含むΔNP(1-240)、及びCローブのみを含むΔNP(241-405)では、阻害効果が減弱した。
　この結果から、コアドメイン全長を含み、非保存領域及びCテールを欠くことが複製阻害活性に重要であることが示された（図６Ｂ）。
（２）ΔNP(20-405)をさらに改変した欠失変異型NPによるEBOV複製阻害効果
　（１）で阻害効果を示したΔNP(20-405)について、N末端側又はC末端側の部分をさらに欠失させたΔNPを作製した（図７Ａ）。野生型NPとΔNPを1：4の比率で導入する条件、及び野生型NPとΔNPを1：1の比率で導入する条件下でEBOV複製阻害効果を測定した。
　ルシフェラーゼ活性を測定した結果、ΔNP(20-405)のN末端からαヘリックスを1つ欠損させた場合（ΔNP(63-405)）、及びC末端のαヘリックスを2つ欠損させた場合（ΔNP(20-313)）に、複製阻害活性が減弱する傾向が見られた（図７Ｂ）。一方、C末端のαヘリックスを1つ欠損させた場合（ΔNP(20-337)）には複製阻害活性が減弱しなかった（図７Ｂ）。この結果から、コアドメインに含まれる13個のαヘリックスのうちα1～α12が複製阻害活性に重要であることが明らかとなった。
　さらに、ΔNP(20-337)は、細胞に導入したプラスミドの量に依存してEBOV複製を阻害することが示された（図８）。
（３）アミノ酸置換変異を導入したΔNP(20-337)によるEBOV複製阻害効果
　EBOVの野生型NPが持つNP-NP相互作用（多量体形成）、RNA結合、及びVP35結合活性について、その各々の活性を損なうアミノ酸置換変異が知られている。これらの変異をΔNP(20-337)発現プラスミドに導入し、EBOV複製阻害効果に対するその影響を検討した（図９）。
　NP-NP相互作用の活性を損なうY21A/H22A(YHAA)変異を導入したΔNP(20-337)は、野生型ΔNP(20-337)と比較して複製阻害活性が減弱していた（図９、Wt及びYHAA）。RNA結合能を損なうK160A/K171A/R174A(KKR)変異を導入したΔNP(20-337）、及びVP35との結合能を損なうR240A/K248A/D252A(RKD)変異を導入したΔNP(20-337)では、複製阻害活性がほとんど認められなかった（図９、KKR及びRKD）。
　これらの結果から、ΔNPのEBOV複製阻害活性には、NP-NP相互作用、RNA結合能、及びVP35結合能のいずれも不可欠であることが示された。
＜実施例３：欠失変異型VP30によるEBOV複製阻害効果＞
（目的）
　VP30の様々な欠失変異体を作製し、EBOV複製に対する阻害効果を検討する。
（方法）
　EBOVの野生型VP30は、配列番号３で示すアミノ酸配列からなり、全長288アミノ酸からなるタンパク質である。VP30は、N末端ドメイン（NTD、1～141アミノ酸残基）及びC末端ドメイン（CTD、142～288アミノ酸残基）の2つのドメイン構造を有する（図１０）。NTDには、RNA結合領域（26～46アミノ酸残基）、Znフィンガーモチーフ（72～90アミノ酸残基）、及び六量体化モチーフ（100～104アミノ酸残基）が存在する。CTDには二量体化及びNP結合領域（180～197アミノ酸残基）が含まれる。
　本発明者らは、様々な欠失変異型VP30（ΔVP30）のEBOV複製に対する阻害効果を検討する目的で、図１１Ａ、図１２Ａ、図１３Ａ、及び図１４Ａに示すΔVP30を発現する発現プラスミドを作製した。各々のΔVP30について、以下の方法でEBOVミニゲノムアッセイを行った。miniG及びEBOVタンパク質（NP、VP35、VP30、及びL）発現プラスミドと共にΔVP30発現プラスミドをHeLa細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入の比率は、miniG：NP：VP35：VP30：L：ΔVP30＝8：4：1：1：2：16とした。野生型VP30とΔVP30の比率は、1：16となる。24時間培養後に培養上清中のルシフェラーゼ活性を測定した。
（結果）
（１）欠失変異型VP30によるEBOV複製阻害効果
　図１１Ａに示す9種類のΔVP30についてEBOV複製阻害効果を検討した。各々のΔVP30についてEBOVミニゲノムアッセイを行った結果を図１１Ｂに示す。
　9種類のΔVP30では、N末端のRNA結合領域とZnフィンガーモチーフを欠くΔVP30(91-288)がEBOV複製を強く抑制することが示された（図１１Ｂ、7）。一方、C末端を欠損したΔVP30（図１１Ｂ、1～5）や、N末端のRNA結合領域とZnフィンガーモチーフに加えて六量体化モチーフを欠損するΔVP30（図１１Ｂ、8及び9）では、複製阻害活性が減弱していることが示された。
　この結果から、ΔVP30の複製阻害活性には、N末端のRNA結合領域とZnフィンガーモチーフを欠くことと同時に、六量体化モチーフ及びNP結合領域を含むことが重要であることが示唆された。
（２）ΔVP30(91-288)をさらに改変した欠失変異型VP30によるEBOV複製阻害効果
　（１）で阻害効果を示したΔVP30(91-288)を、C末端側からさらに欠損させたΔVP30を作製し、そのEBOV複製阻害効果を検討した（図１２）。
　ルシフェラーゼ活性を測定した結果、NP結合領域を欠くΔVP30(91-179)及びΔVP30(91-141)では、EBOV複製阻害効果が著しく減弱することが明らかとなった。この結果から、NP結合領域を含むCTDがEBOV複製阻害活性には重要であることが示唆された。
　VP30のCTDは7個のαヘリックスによって構成されることが知られている。そこで、EBOV複製阻害効果を示したΔVP30(91-288)からC末端のαヘリックスを欠損させ、EBOV阻害効果に及ぼす影響を検討した（図１３）。その結果、7番目のαヘリックス（図１３Ａ、α7）を欠損させたΔVP30(91-254)は、7個のαヘリックスを全て含むΔVP30(91-272)と同等のEBOV複製阻害活性を示した（図１３Ｂ）。一方、6番目以降のαヘリックスを欠くΔVP30(91-231)では、阻害効果が減弱することが明らかとなった（図１３Ｂ）。
　また、ΔVP30(91-254)は、ΔVP30(91-272)と同様に濃度依存的なEBOV複製阻害活性を示した（図１４）。
　以上の結果から、ΔVP30(91-254)が、顕著なEBOV複製阻害活性を有する最小のΔVP30であることが示された。
＜実施例４：カプシド形成に対する阻害効果＞
（目的）
　ΔNP及びΔVP30によるEBOV複製阻害の作用機序を検討する。
（方法と結果）
（１）PAタグをC末端に付加したNPであるNP-PAの作製
　配列番号５で示すアミノ酸配列（GVAMPGAEDDVV）からなるPAタグをC末端に付加したNPであるNP-PAを作製し、上記と同様にEBOVミニゲノムアッセイを行った。その結果、NP-PAは野生型NPと同様にEBOV複製において機能することが示された（図１５Ａ）。
　次に、野生型NPの代わりにNP-PAを用いたEBOV複製が、ΔNP(20-405)又はΔVP30(91-254)の存在下で阻害されるか否かを検討した。その結果、NP-PAによるEBOV複製は、野生型NPによるEBOV複製と同様に、ΔNP(20-405)及びΔVP30(91-254)によって効率的に阻害することが示された（図１５Ｂ）。
（２）NP-PAによる複合体形成のパーティクルブロッティングによる検出
　NP-PAの細胞内における複合体形成をパーティクルブロッティングにより検討した。NP-PA発現プラスミドと共にminiG及びEBOVタンパク質（VP35、VP30、L）発現プラスミドをHeLa細胞に遺伝子導入した。miniG：NP-PA：VP35：VP30：Lの導入比率は8：4：1：1：2とした。24時間培養後に抗PA抗体を用いたパーティクルブロッティングを行った。
　パーティクルブロッティングは以下の方法で行った。遺伝子導入した細胞を24時間培養後にPB lysis buffer (1％NP40, 25mM Tris pH7.4, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 50mM NaF)で溶解し、1.2％アガロース(TAE)に泳動し、PVDF膜に転写した。抗PAタグモノクローナル抗体(NZ-1)は富士フィルム和光純薬から購入した。
　パーティクルブロッティングの結果、NP-PAが複合体（カプシド）を形成していると思われるバンドが確認された（図１６）。
（３）ΔNP及びΔVP30の複合体形成に対する阻害効果の検討
　次に、NP-PAを用いたミニゲノムアッセイにΔNP又はΔVP30発現プラスミドを共導入し、NP-PAの複合体形成に対する阻害効果を検討した。ΔNPの導入比率は、miniG：NP-PA：VP35：VP30：L：ΔNP＝8：4：1：1：2：16とした。ΔVP30の導入比率は、miniG：NP-PA：VP35：VP30：L：ΔVP30＝8：4：1：1：2：16とした。
　その結果、ΔNP(20-405)を導入した細胞においては、NP-PAが形成する複合体のバンドが消失していた（図１７）。したがって、ΔNP(20-405)発現はNPの複合体すなわちカプシド形成自体を阻害することにより、EBOV複製を阻害することが示唆された。
　一方、ΔVP30(91-254)の発現は、NPによるカプシド形成は阻害しないものの、VP30のカプシドへの結合を阻害することにより、EBOV複製を阻害することが示唆された。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (11)

  1. 　以下の（a）～（e）からなる群から選択されるいずれかのポリペプチドからなるフィロウイルス科（Filoviridae）ウイルス複製阻害剤。
    　（a）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質において20位～337位からなるポリペプチド
    　（b）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質の1位～500位において20位～337位を含むポリペプチド
    　（c）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質のフィロウイルス科オルソログにおいて配列番号１の20位～337位に相当する位置からなるポリペプチド
    　（d）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質のフィロウイルス科オルソログにおける、配列番号１の1位～500位に相当する位置において、配列番号１の20位～337位に相当する位置を含むポリペプチド
    　（e）前記（a）～（d）のいずれかに記載のポリペプチドのN末端及び／又はC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチド
  2. 　前記（b）に記載のポリペプチドが、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質において1位～337位を含む、又は
    　前記（d）に記載のポリペプチドが、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質のフィロウイルス科オルソログにおいて配列番号１の1位～337位に相当する位置を含む、
    請求項１に記載のフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤。
  3. 　前記（b）に記載のポリペプチドが、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質において20位～500位を含む、又は
    　前記（d）に記載のポリペプチドが、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質のフィロウイルス科オルソログにおいて配列番号１の20位～500位に相当する位置を含む、
    請求項１又は２に記載のフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤。
  4. 　以下の（f）～（j）からなる群から選択されるいずれかのポリペプチドからなるフィロウイルス科（Filoviridae）ウイルス複製阻害剤。
    　（f）配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質において91位～254位からなるポリペプチド
    　（g）配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質の47位～288位において91位～254位を含むポリペプチド
    　（h）配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質のフィロウイルス科オルソログにおいて配列番号３の91位～254位に相当する位置からなるポリペプチド
    　（i）配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質のフィロウイルス科オルソログにおける、配列番号３の47位～288位に相当する位置において、配列番号３の91位～254位に相当する位置を含むポリペプチド
    　（j）前記（f）～（i）のいずれかに記載のポリペプチドのN末端及び／又はC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチド
  5. 　前記（g）に記載のポリペプチドが、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質において47位～254位を含む、又は
    　前記（i）に記載のポリペプチドが、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質のフィロウイルス科オルソログにおいて配列番号３の47位～254位に相当する位置を含む、
    請求項４に記載のフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤。
  6. 　前記（g）に記載のポリペプチドが、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質において91位～288位を含む、又は
    　前記（i）に記載のポリペプチドが、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質のフィロウイルス科オルソログにおいて配列番号３の91位～288位に相当する位置を含む、
    請求項４又は５に記載のフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤。
  7. 　前記フィロウイルス科オルソログがエボラウイルス属オルソログである、請求項１～６のいずれか一項に記載のフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤。
  8. 　請求項１に記載の（a）～（e）及び請求項４に記載の（f）～（j）からなる群から選択されるいずれかのポリペプチドをコードする核酸を発現可能な状態で含む発現ベクターからなるフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤。
  9. 　有効成分として請求項１～８のいずれか一項に記載のフィロウイルス科ウイルス複製阻害剤を含む、フィロウイルス科ウイルス感染症治療用医薬組成物。
  10. 　以下の（a）～（j）からなる群から選択されるいずれかのポリペプチド、又は
    　前記ポリペプチドをコードする核酸を含み、細胞内で前記ポリペプチドを発現可能な発現ベクター
    を宿主内に導入する工程を含む、フィロウイルス科ウイルスの複製阻害方法。
    　（a）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質において20位～337位からなるポリペプチド
    　（b）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質の1位～500位において20位～337位を含むポリペプチド
    　（c）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質のフィロウイルス科オルソログにおいて配列番号１の20位～337位に相当する位置からなるポリペプチド
    　（d）配列番号１で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのNPタンパク質のフィロウイルス科オルソログにおける、配列番号１の1位～500位に相当する位置において、配列番号１の20位～337位に相当する位置を含むポリペプチド
    　（e）前記（a）～（d）のいずれかに記載のポリペプチドのN末端及び／又はC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチド
    　（f）配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質において91位～254位からなるポリペプチド
    　（g）配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質の47位～288位において91位～254位を含むポリペプチド
    　（h）配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質のフィロウイルス科オルソログにおいて配列番号３の91位～254位に相当する位置からなるポリペプチド
    　（i）配列番号３で示すアミノ酸配列からなるザイールエボラウイルスのVP30タンパク質のフィロウイルス科オルソログにおける、配列番号３の47位～288位に相当する位置において、配列番号３の91位～254位に相当する位置を含むポリペプチド
    　（j）前記（f）～（i）のいずれかに記載のポリペプチドのN末端及び／又はC末端に任意のアミノ酸配列が付加されたポリペプチド
  11. 　フィロウイルス科ウイルスの複製活性の評価方法であって、
    　レポーター遺伝子発現ベクター、NP遺伝子発現ベクター、VP30遺伝子発現ベクター、VP35遺伝子発現ベクター、及びL遺伝子発現ベクターを宿主細胞内に導入する導入工程、並びに
    　前記レポーター遺伝子の発現を検出する検出工程
    を含み、
    　前記レポーター遺伝子発現ベクターは、
    　　RNAポリメラーゼIプロモーター配列、
    　　フィロウイルス科ウイルスのトレーラー配列、
    　　レポーター遺伝子配列、
    　　フィロウイルス科ウイルスのリーダー配列、及び
    　　RNAポリメラーゼIターミネーター配列
    を上記順序で含み、
    　　ここで前記レポーター遺伝子配列は、前記プロモーター配列に対して逆向きに含まれており、
    　前記NP遺伝子発現ベクターは、宿主細胞内で遺伝子発現誘導が可能なプロモーターの下流に、フィロウイルス科ウイルスのNP遺伝子が発現可能な状態で配置されており、
    　前記VP30遺伝子発現ベクターは、宿主細胞内で遺伝子発現誘導が可能なプロモーターの下流に、フィロウイルス科ウイルスのVP30遺伝子が発現可能な状態で配置されており、
    　前記VP35遺伝子発現ベクターは、宿主細胞内で遺伝子発現誘導が可能なプロモーターの下流に、フィロウイルス科ウイルスのVP35遺伝子が発現可能な状態で配置されており、
    　前記L遺伝子発現ベクターは、宿主細胞内で遺伝子発現誘導が可能なプロモーターの下流に、フィロウイルス科ウイルスのL遺伝子が発現可能な状態で配置されており、
    　NP遺伝子発現ベクター、VP30遺伝子発現ベクター、VP35遺伝子発現ベクター、及びL遺伝子発現ベクターの導入比率が4：1：1：2である、
    前記方法。
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