WO2022162722A1 - 無菌サンプリング装置および無菌サンプリング方法 - Google Patents

無菌サンプリング装置および無菌サンプリング方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2022162722A1
WO2022162722A1 PCT/JP2021/002564 JP2021002564W WO2022162722A1 WO 2022162722 A1 WO2022162722 A1 WO 2022162722A1 JP 2021002564 W JP2021002564 W JP 2021002564W WO 2022162722 A1 WO2022162722 A1 WO 2022162722A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sampling
sterile
culture
pressure
channel
Prior art date
Application number
PCT/JP2021/002564
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
勝 難波
啓介 渋谷
憲一郎 岡
Original Assignee
株式会社日立ハイテク
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社日立ハイテク filed Critical 株式会社日立ハイテク
Priority to PCT/JP2021/002564 priority Critical patent/WO2022162722A1/ja
Priority to US18/267,523 priority patent/US20240052283A1/en
Publication of WO2022162722A1 publication Critical patent/WO2022162722A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/04—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus by injection or suction, e.g. using pipettes, syringes, needles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/12—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus by pressure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/40—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of pressure

Definitions

  • the present invention relates to an aseptic sampling device and an aseptic sampling method.
  • cell culture equipment that maintains sterile conditions for long periods of culture has been developed.
  • target cells are often cultured under predetermined conditions to induce differentiation into target cells or to produce target macromolecular proteins.
  • culture is generally performed in a culture tank filled with a culture medium optimized for the target cells while aeration and agitation are performed.
  • a culture solution in a culture tank during culture is measured.
  • Various parameters such as temperature, pH, dissolved oxygen (DO) concentration, and dissolved carbon dioxide (DCO 2 ) concentration can be measured online using various electrodes and sensors according to the parameters. is widely practiced.
  • DO dissolved oxygen
  • DCO 2 dissolved carbon dioxide
  • part of the culture solution is aseptically sampled and measured with various measuring instruments as needed during culture. This measurement is often performed outside the culture vessel using a sampled culture medium for medium components involved in cell metabolism, such as amino acids such as glutamine, glucose, lactate, ammonia, and produced proteins (such as antibodies). .
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • SPR Surface Plasmon Resonance
  • the above-described measurement may also be performed on mutants of macromolecular proteins.
  • LC/MS liquid chromatograph-mass spectrometer
  • isoelectric focusing capillary electrophoresis, and the like are used for the measurement of macromolecular protein variants.
  • the above-mentioned measurement may be performed to analyze the state of cell differentiation using a staining agent, the number of cells determined to be alive or dead, the survival rate, the cell diameter, and the cell shape of the cultured cells.
  • These analyzes require a sampling operation in which the cells are directly extracted from the culture vessel.
  • the sampling device is required to have a structure that prevents microorganisms from entering from the outside and a structure that minimizes retention of the culture medium in the device.
  • the sampling operation of the culture solution from the culture tank was done manually by opening the valve from the sampling piping tube installed in the culture tank and collecting the required amount.
  • the sampling port of the piping tube must be placed in an aseptic space such as a glove box, and sterilization must be performed with steam, flame, disinfectant, etc. before and after sampling the culture solution, which requires manual work.
  • the sampling piping system is steam sterilized, the culture solution containing cells is sampled, and then steam sterilized again, washed with sterile water, and then blown with sterile air. Discard remaining liquid in the piping.
  • a sampling device described in Patent Document 1 includes a sampling nozzle, an automatic sample aspirating pinch valve leading to it, a sample aspirating tube pump, an automatic pinch valve connecting or separately connecting a sterile air feeding pipe and a steam feeding pipe, and a drug feeding. It consists of an automatic pinch valve that connects or separates the sterilized water supply pipe and the sterile water supply pipe, and a pipe that connects them.
  • the opening and closing of each automatic pinch valve and the operation of the sample suction tube pump are controlled by a control device, and each operation of sterilization, flushing, steam sterilization, chemical sterilization, washing and sampling stored in advance in the control device. are freely combined.
  • Patent Document 1 it is possible to uniformly sample the solid-liquid phase with this device, and it is described that sterilization and cleaning can be performed efficiently when the sample contains perishable organic matter.
  • the culture conditions change from moment to moment, and when the concentration of living cells is low at the beginning of the culture, it is well controlled, but as the concentration of living cells increases, the target culture environment is maintained. Situations may arise where it is not possible. In order to maintain a culture environment suitable for culturing living cells, it is necessary to perform appropriate culture control as the living cells are being cultivated.
  • the culture solution containing cells is extracted from the culture tank, the cells are separated using centrifugal separation or a tangential flow filtration device (TFF) equipped with a hollow fiber membrane filter, and the separated cells are separated. It is returned to the culture tank and only the culture solution is discharged out of the system.
  • TFF tangential flow filtration device
  • the same amount of fresh medium as the discharged culture medium is supplied to perform long-term continuous culture. Therefore, in the case of perfusion culture, since the separated cells are returned to the culture tank, it is possible to measure the medium components and the metabolic components of the cells using the discharged culture medium, but the cells themselves cannot be analyzed.
  • Patent Document 1 The sampling device described in Patent Document 1 mentioned above can make it possible to sample cells from a culture tank even in the case of perfusion culture.
  • this sampling device requires the operation of various devices for sampling, and the configuration is complicated and expensive.
  • the purpose of the present invention is to provide a simple and inexpensive aseptic sampling device and aseptic sampling method.
  • the aseptic sampling device which has solved the above problems, comprises a sampling channel for extracting a culture solution from a culture vessel for testing in an analyzer, and a pressure applying device for applying pressure to the sampling channel. wherein the pressure applying device applies a flow pressure or a liquid flow velocity to the fluid in the sampling channel so that the pressure gradient is 1 kPa / m or more toward the open end nozzle on the outlet side of the sampling channel. is to be controlled.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the overall configuration of a cell culture device 30 including an aseptic sampling device 1 according to a first embodiment
  • FIG. It is a graph which shows an internal diameter of the piping tube 2a for sampling, and an example of flow volume selection.
  • the horizontal axis is the inner diameter (mm) of the piping tube 2a
  • the left vertical axis is the sampling flow rate (mL/min)
  • the right vertical axis is the Reynolds number Re(-).
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing the overall configuration of a cell culture device 30 including an aseptic sampling device 1 according to a second embodiment
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing the overall configuration of a cell culture device 30 including an aseptic sampling device 1 according to a third embodiment;
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the overall configuration of a cell culture device 30 including a sterile sampling device 1 according to the first embodiment.
  • the aseptic sampling device 1 is connected to the culture tank 4 of the cell culture device 30 .
  • This aseptic sampling device 1 is preferably used for online monitoring of cell culture conditions in the cell culture device 30 .
  • the cell culture device 30 is applied when culturing animal- or human-derived cells that produce useful substances that are the main raw materials for biopharmaceuticals, health foods, and the like.
  • the cell culture device 30 is intended for stem cells that have pluripotency capable of differentiating into various cells/organs such as skin, nerves, bones, blood vessels, etc., and the ability to proliferate almost infinitely in regenerative medicine applications. It is applied when performing culture with
  • Cells cultured in the cell culture device 30 include, for example, Chinese hamster ovary cells (CHO cells), baby hamster kidney cells, and mouse myeloma cells, which are generally used as cells for producing useful substances. It is not limited to these.
  • agitation culture can be performed by attaching the cells to a carrier such as a microcarrier and suspending them.
  • stem cells include, but are not limited to, human mesenchymal stem cells (hMSCs), iPS cells (induced pluripotent stem cells), and human ES cells (embryonic stem cells). It should be noted that the stem cells can be induced to differentiate into target tissues or organs after proliferating in the culture tank 4 .
  • Examples of the useful substances described above include, but are not limited to, macromolecular proteins.
  • Examples of high-molecular proteins include physiologically active substances, particularly antibodies.
  • Antibodies include, for example, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, humanized antibodies, human antibodies, immunoglobulins, and the like.
  • Physiologically active substances are not limited to antibodies, but include tissue-type plasminogen activator used as a thrombolytic agent, biopharmaceuticals such as erythropoietin and interferon, and other industrially useful proteins such as ⁇ -carotene and Also of interest are proteins that bind carotenoids such as astaxanthin, and pigments such as chlorophyll and bacteriochlorophyll.
  • examples of physiologically active substances include phycobilin proteins such as phycocyanin, which are used for coloring foods and cosmetics.
  • the medium used for culture is not particularly limited, and any conventional medium can be used as long as it is effective for the growth of cells to be cultured and the production of useful substances.
  • the sampling flow path 2 is a piping tube 2a, that is, a hollow member, from which the culture solution 5 in the culture tank 4 is extracted to be tested in the analyzer .
  • the culture solution 5 is a solution containing cells cultured in a liquid medium.
  • the pressure application device 3 is a device that applies pressure to the inside of the sampling channel 2 .
  • the pressure application device 3 is provided at an arbitrary position between one end of the sampling channel 2 (the connection end with the culture tank 4) and the other end (the open end nozzle 2b on the outlet side).
  • the pressure application device 3 is, for example, a liquid transfer pump 3a.
  • the aseptic sampling device 1 controls the fluid in the sampling channel 2 by the pressure applying device 3 so that the pressure gradient is 1 kPa/m or more toward the open end nozzle 2b on the outlet side of the sampling channel 2. is doing.
  • the culture solution 5 is mentioned, for example.
  • the pressure gradient of the fluid in the sampling channel 2 is sufficiently high, so that bacteria cannot enter from the open end nozzle 2b on the outlet side. Even if germs invade from the open end nozzle 2b for a moment, pressure resistance is generated by the fluid having a sufficient pressure gradient, and the germs are swept out of the sampling channel 2 at a flow velocity faster than the swimming speed of the germs.
  • the aseptic sampling device 1 can prevent contamination from the open end nozzle 2b on the outlet side of the sampling channel 2.
  • FIG. Therefore, the aseptic sampling device 1 does not need to be equipped with various devices for sterilizing the open-end nozzle 2b with steam, flame, disinfectant, or the like.
  • the aseptic sampling device 1 with a simple structure and low cost can be realized. Therefore, when the cell culture apparatus 30 includes this aseptic sampling apparatus 1, contamination can be prevented during culture and analysis while having a simple configuration and low cost.
  • the control of the pressure gradient is preferably performed by controlling the flow pressure or the liquid flow rate by the pressure applying device 3 . Moreover, it is preferable that the control of the pressure gradient is always performed while the fluid is present in the sampling channel 2 .
  • the aseptic sampling device 1 uses the pressure applying device 3 to apply a pressure gradient of 1 kPa/m to the fluid in the sampling channel 2 toward the open end nozzle 2b on the outlet side of the sampling channel 2. Since the control is performed as described above, the cell culture apparatus 30 equipped with this is capable of continuous sampling. In addition, the sterile sampling device 1 can also appropriately sample and analyze the culture solution 5 containing cells. As a result, the cell culture apparatus 30 equipped with the aseptic sampling apparatus 1 can grasp the cell culture state and perform appropriate culture control. Furthermore, the aseptic sampling apparatus 1 samples the minimum amount of the culture solution 5 necessary for analysis, so that the target cells can be efficiently cultured without wasting the culture solution 5 .
  • the pressure gradient described above is preferably 10 kPa/m or more. From the viewpoint of reducing the amount of culture solution 5 to be used, the pressure gradient is preferably 100 kPa/m or less, more preferably 30 kPa/m or less.
  • the inner diameter of the plumbing tube 2a is preferably 1.5 mm or less, more preferably 0.1 to 0.5 mm. In this way, the fluid flowing through the piping tube 2a is less likely to become turbulent and shear force is less likely to occur, so damage to the cells in the culture medium 5 during sampling can be reduced. Also, less fluid flow is required to maintain the pressure gradient.
  • the internal diameter of piping tubes other than the piping tube 2a (for example, piping tubes 6a, 7a, 8a, etc., which will be described later) can be arbitrarily set.
  • the material of the piping tube 2a is, for example, fluororesin, polytetrafluoroethylene, tetrafluoroethylene/ethylene copolymer, tetrafluoroethylene/perfluoroalkyl vinyl ether copolymer, polyetheretherketone, or polyetheretherketoneketone. is preferred. By doing so, it is possible to easily obtain the piping tube 2a having the inner diameter described above.
  • the pressure applying device 3 is preferably at least one of, for example, a tube pump and a diaphragm pump. These pressure application devices 3 can be used to apply pressure in an aseptic manner.
  • an air pump for supplying sterile air and an air compressor for supplying sterile air are used as the pressure applying device 3. at least one of which can be used. In this way, pressure can be applied by sterile gas (sterile air) as described in the third embodiment.
  • Aseptic air can be supplied by an air pump or an air compressor by equipping them with an aseptic filter F (see FIG. 4).
  • the cell culture apparatus 30 includes, in addition to the culture tank 4 and the aseptic sampling apparatus 1, submerged aeration means 6, liquid surface aeration means 7, medium supply means 8, and the like.
  • the submerged aeration means 6 plays a role of sending sterile air into the culture solution 5 in the culture tank 4 .
  • the submerged aeration means 6 includes, for example, an air pump or an air compressor equipped with a sterile filter (not shown in FIG. 1), which is connected to the culture tank 4 via a piping tube 6a. It can be embodied by distributing.
  • microbubble forming means such as a sparger 11, at the tip of the piping tube 6a placed in the culture solution 5 to make the bubbles smaller.
  • the sterilized air becomes microbubbles, so that the efficiency of dissolving oxygen in the culture solution 5 is increased.
  • the rising speed of the bubbles is slowed down and the impact caused by the bursting of the bubbles on the liquid surface can be suppressed, the damage to the cells can be reduced.
  • the liquid surface aeration means 7 plays a role of sending sterile air to the liquid surface of the culture solution 5 in the culture tank 4 .
  • the liquid surface aeration means 7 can be implemented by connecting an air pump or air compressor equipped with the above-described aseptic filter (not shown in FIG. 1) to the gas phase portion of the culture tank 4 with a piping tube 7a.
  • the medium supply means 8 supplies fresh medium in the same amount as the culture medium 5 extracted from the sampling channel 2 into the culture tank 4 to maintain the amount of the culture medium 5 in the culture tank 4 constant. be.
  • a fresh medium is a new medium containing no cells but containing nutrients necessary for cell culture.
  • the medium supply means 8 includes a medium supply tank (not shown) that stores fresh medium, a piping tube 8a that connects the medium supply tank and the culture tank 4, and a pressure applying device installed on the piping tube 8a. 3 and a liquid feed pump 3b.
  • the piping tubes 6a, 7a, and 8a can be made of the same material as the piping tube 2a.
  • the submerged aeration means 6, the liquid surface aeration means 7, and the medium supply means 8 can all be arbitrarily provided according to the culture method.
  • the medium supply means 8 since a predetermined amount of the culture solution 5 is withdrawn, it is preferable to provide the medium supply means 8. However, if the volume of the culture solution 5 is large and the amount of the culture solution 5 to be extracted is sufficiently small, this should be provided. It doesn't have to be.
  • the medium supply means 8 is not provided, the cell culture apparatus 30 provided with the aseptic sampling apparatus 1 can be provided with a simpler structure and at a lower cost.
  • the sterile sampling device 1 preferably includes a measuring device 9 for measuring the flow pressure or liquid flow velocity in the sampling channel 2. It is preferable that the aseptic sampling device 1 controls the pressure application device 3 based on the measured value measured by the measuring device 9, and controls the flow pressure or the liquid flow rate so as to achieve the pressure gradient described above. In this way, the sterile sampling device 1 can reliably control the pressure gradient described above.
  • a pressure gauge 9a is an example of the measuring device 9 that measures the flow pressure.
  • a liquid flow meter 9b can be used as the measuring device 9 for measuring the liquid flow velocity.
  • These measuring devices 9 are preferably provided downstream of the pressure applying device 3 in the sampling flow path 2, for example.
  • a pressure gauge 9a and a liquid flow meter 9b may be provided as the measuring device 9, and the pressure gradient may be controlled by both the flow pressure and the liquid flow velocity. In this way, the aseptic sampling device 1 can control the pressure gradient more precisely.
  • Cells are cultured under predetermined conditions for a long period of time under sterile conditions.
  • the cells are cultured by uniformly mixing and stirring the cell-suspended culture solution 5 with the stirrer 10 in the culture tank 4 filled with the culture medium optimized for the cells.
  • FIG. 1 shows an example in which microbubbles are generated using a sparger 11 having micropores. When microbubbles have an effect such as inhibiting cell culture, membrane surface aeration through a porous membrane is applied.
  • the proper pH control of the culture solution 5 can be achieved by performing a gas aeration of aseptic air mixed with carbon dioxide by the liquid surface aeration means 7, or by adding an acid or an alkali by means of a liquid supply means (not shown). conduct.
  • the amount of liquid supplied by the liquid supply means is controlled by a liquid feed pump (not shown).
  • the liquid supply means may be used as a means for supplying an added medium containing nutrients necessary for cell culture during the culture.
  • the culture solution containing the cells from the culture tank 4 is appropriately obtained.
  • 5 is fractionated into a plurality of sampling containers 12 through the sampling flow path 2 at regular intervals or at regular intervals by the pressure application device 3 and sampled.
  • a predetermined amount of culture solution 5 required for analysis is collected in a sampling container 12 arranged in a fraction collector 13 .
  • the collected culture solution 5 is manually or automatically introduced into the analyzer 14 and subjected to various analyses.
  • the open end nozzle 2b is sterilized with steam, flame, disinfectant, etc. before and after sampling. I had to. Further, conventionally, a required amount was manually collected from the sampled culture solution 5 and analyzed.
  • the pressure gradient in the sampling channel 2 of the sterile sampling device 1 is 1 kPa/m or more, preferably 100 kPa/m or less, more preferably, for example, It was decided to control from 10 kPa/m to 30 kPa/m.
  • the aseptic sampling device 1 can prevent contamination from the open end nozzle 2b on the outlet side of the sampling flow path 2 while having a simple structure and low cost, and also enables continuous sampling. It is.
  • the pressure loss ⁇ p (Pa) of the fluid flowing through the piping tube 2a can be calculated using the Darcy-Weisbach equation shown in the following equation (1).
  • L length of piping tube 2a (m)
  • D inner diameter (m) of piping tube 2a
  • V average flow velocity (m/s)
  • ⁇ fluid density (kg/m 3 )
  • f friction loss coefficient (-) is.
  • Re is the Reynolds number.
  • a Reynolds number of 2000 or higher eg, in the range of 2300-4000, is an index of turbulent transition. If the flow becomes a turbulent region in the sampling channel 2, cell damage can occur.
  • the subject to be analyzed is a human- or animal-derived cell or stem cell, the cell may be damaged by shear stress because it does not have a cell wall unlike a microbial cell.
  • the pressure gradient ⁇ p/L (Pa/m) indicating the pressure loss ⁇ p (Pa) according to the length L (m) of the piping tube 2a is It depends on the inner diameter D (m) and the average flow velocity V (m/s).
  • FIG. 2 is a graph showing an example of selection of the inner diameter of the piping tube 2a for sampling and the flow rate.
  • the thick solid line shows the relationship between the inner diameter of the piping tube 2a and the sampling flow rate for controlling the pressure gradient of the sampling flow path 2 in the present embodiment from 10 kPa/m to 30 kPa/m, which is a preferable range. (left vertical axis).
  • the calculated value of the Reynolds number Re at each sampling flow rate is indicated by a dashed line (right vertical axis).
  • the Reynolds number Re becomes 2000 or more.
  • the flow becomes a turbulent region. Therefore, in the aseptic sampling device 1 according to this embodiment, it is preferable that the inner diameter of the piping tube 2a of the sampling channel 2 is 1.5 mm or less. In this way, the flow velocity when extracting the culture solution 5 becomes a laminar flow region with a Reynolds number of less than 2000, so even when animal-derived cells are used, the cells can be prevented from being damaged. can.
  • the inner diameter of the piping tube 2a and the sampling flow rate are appropriately set according to the amount of each culture sample liquid required for analysis by the analyzer 14. Since the required amount of liquid in the analyzer 14 is usually small, it is preferable to set the inner diameter of the piping tube 2a in the sampling flow path 2 to about 0.1 mm to 0.5 mm.
  • the sampling flow rate is preferably 0.9 to 3.0 mL/min, as shown in FIG.
  • the flow rate control in this case is performed, for example, by measuring the flow rate (liquid flow velocity) with the liquid flow meter 9b, which is the measuring device 9 installed in the sampling channel 2, and feeding the pressure applying device 3 based on the measured liquid flow velocity. This can be done by appropriately controlling the output of the liquid pump 3a. Thereby, the pressure gradient can be controlled as described above.
  • the flow rate control measures the flow pressure with a pressure gauge 9a, which is the measuring device 9 installed in the sampling flow path 2, and appropriately adjusts the output of the liquid feed pump 3a, which is the pressure applying device 3, based on the measured flow pressure. It can be done by controlling. Thereby, the pressure gradient can be controlled as described above.
  • the target value of the control pressure of the pressure gauge 9a is set according to the length L of the piping tube 2a in the sampling flow path 2. FIG. For example, when the length L of the piping tube 2a in the sampling channel 2 is 1 m, the differential pressure ⁇ p in the liquid feeding pump 3a is 1 kPa or more with respect to the atmospheric pressure in the open end nozzle 2b on the outlet side of the sampling channel 2.
  • the length L of the piping tube 2a corresponds to the length from the installation position of the pressure gauge 9a to the open end nozzle 2b on the outlet side.
  • FIG. 1 shows an example of sampling using the liquid feed pump 3a.
  • the sampling flow rate of the culture solution 5 in the sampling channel 2 may be controlled by increasing or decreasing the ventilation pressure or the flow rate of the gas that is passed through the liquid surface.
  • an air pump, air compressor, or the like (not shown) used in the liquid surface ventilation means 7 corresponds to the pressure applying device 3 .
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the overall configuration of a cell culture device 30 including the sterile sampling device 1 according to the second embodiment.
  • the sampling flow path 2 is branched into two on the way, and the open end nozzle 2c on one outlet side is connected to the analyzer via the valve Va. 14, and the other open end nozzle 2d on the outlet side is connected to a waste liquid container 15 via a valve Vb, which is different from the aseptic sampling apparatus 1 according to the first embodiment.
  • 2nd Embodiment demonstrates centering on the structure different from 1st Embodiment. Note that, in the second embodiment, elements that have already been described are denoted by the same reference numerals, and detailed description thereof may be omitted.
  • the analyzer 14 it may take a certain amount of time to perform the predetermined analysis process, and it may not be possible to continuously receive and analyze the sampled culture fluid 5. Moreover, depending on the purpose of culture, it may be desirable to perform analysis at regular time intervals. Furthermore, when culturing in the cell culture apparatus 30, there is a case where the culture solution 5 in the culture tank 4 is directly subjected to the analyzer 14 to analyze the culture solution 5 at an appropriate timing.
  • the aseptic sampling device 1 shown in FIG. 3 and the cell culture device 30 provided with the same were invented to meet these demands.
  • one open end nozzle 2c of the sampling channel 2 branched into two is connected to the analyzer 14. As shown in FIG. Therefore, by opening the valve Va while applying pressure to the culture solution 5 in the sampling channel 2 with the pressure applying device 3 , the sampled culture solution 5 can be tested in the analyzer 14 .
  • the other open end nozzle 2 d of the sampling channel 2 is connected to the waste liquid container 15 . Therefore, by opening the valve Vb while applying pressure to the culture solution 5 in the sampling channel 2 with the pressure applying device 3 , the sampled culture solution 5 that is not required for analysis can be stored in the waste liquid container 15 .
  • valve Va is closed and the valve Vb is opened to store the sampled culture solution 5 in the waste liquid container 15, and the valve Va is opened and the valve Vb is closed during analysis to store the sampled culture solution 5.
  • the analyzer 14 can be applied to the analyzer 14 .
  • the outlet side of the sampling channel 2 is opened to the fluid in the sampling channel 2 by the pressure application device 3, as described above.
  • the pressure gradient toward the end nozzle 2c is controlled to be 1 kPa/m or more, preferably 100 kPa/m or less, more preferably 10 kPa/m to 30 kPa/m. Therefore, the aseptic sampling apparatus 1 according to the present embodiment can prevent contamination due to contamination from germs from the open end nozzle 2d on the outlet side arranged in the waste liquid container 15, and can maintain sterility in the culture tank 4. In addition, the aseptic sampling device 1 according to the present embodiment can reliably transfer the culture solution 5 to the analyzer 14 while preventing contamination.
  • the aseptic sampling apparatus 1 performs culture in the cell culture device 30 such as the stirrer 10, the submerged aeration means 6, the liquid surface aeration means 7, and the medium supply means 8 according to the analysis result by the analyzer 14. It enables setting changes of various control means. Therefore, the aseptic sampling device 1 according to the present embodiment contributes to maintaining good culture conditions in the cell culture device 30.
  • a portion of the piping tube 2 a of the sampling channel 2 having an inner diameter of 1.5 mm or less be arranged immediately before the analyzer 14 .
  • the piping tube 2 a having an inner diameter of 1.5 mm or less is connected to the analyzer 14 .
  • Many analyzers 14 can be connected to such a small-diameter piping tube 2a, and the sampled culture solution 5 can be directly tested in the analyzer 14.
  • FIG. Also, if the inner diameter is 1.5 mm or less, the flow rate of the culture medium 5 is small, so the amount of the culture medium 5 used can be reduced.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing the overall configuration of a cell culture device 30 including the sterile sampling device 1 according to the third embodiment.
  • the aseptic sampling apparatus 1 discards the culture solution 5 remaining in the sampling channel 2 with a fluid other than the culture solution 5 so that the culture solution 5 does not remain in the sampling channel 2 .
  • the aseptic sampling device 1 continuously feeds fluid, preferably liquid, toward the open end nozzle 2b on the outlet side of the sampling channel 2, thereby preventing contamination with germs.
  • the aseptic sampling device 1 includes a switching mechanism 16 in the sampling flow path 2. is different from 3rd Embodiment demonstrates centering around the structure different from 1st Embodiment. Note that, in the third embodiment, elements that have already been described are denoted by the same reference numerals, and detailed description thereof may be omitted.
  • the switching mechanism 16 switches between at least one of the sterile liquid 17, sterile water 18, buffer solution, and sterile air, and the culture medium 5. By doing so, contamination can be prevented more reliably.
  • the buffer solution is not illustrated, it can be used in the same manner as the sterile water 18, for example. Two or more of the sterile liquid 17, sterile water 18, buffer solution and sterile air can be used as shown in FIG. 4 (two cases are illustrated in FIG. 4).
  • the sterilizing liquid 17 refers to a solution containing components for sterilizing bacteria.
  • the sterilizing liquid 17 include 60 to 70% alcohol, sodium hypochlorite aqueous solution, hypochlorous acid water, and the like.
  • Sterilized water 18 refers to sterilized water.
  • the sterilized water 18 can be sterilized by, for example, an autoclave at 121° C. for 30 to 60 minutes or a filter.
  • a buffer solution is an aqueous solution in which even if a small amount of acid or base is added or the concentration is slightly changed, the pH does not change significantly.
  • buffers include phosphate buffered saline, Tris buffer, citrate phosphate buffer, citrate buffer, phosphate buffer, acetate buffer and the like.
  • the buffer solution can also be used after being sterilized as described above.
  • Sterile air refers to air or oxygen filtered by a sterile air ventilation means 19 having a sterile filter F to remove germs and the like. That is, sterile air is supplied by the sterile air venting means 19 .
  • Oxygen can be supplied from an oxygen cylinder or the like through a sterile filter, and can be mixed with air (sterile air) as described above, if necessary.
  • the sterile filter F is also provided in the storage tank for the sterilized liquid 17 and the storage tank for the sterile water 18. This allows sterility to be maintained even when these tanks are exposed to outside air.
  • the aseptic sampling device 1 switches by the switching mechanism 16 to feed the culture solution 5 toward the open end nozzle 2b on the outlet side of the sampling channel 2.
  • the switching mechanism 16 switches to send at least one of the sterile liquid 17, sterile water 18, buffer solution, and sterile air toward the open end nozzle 2b on the outlet side of the sampling channel 2. do.
  • the aseptic sampling device 1 includes the switching mechanism 16, so that the culture solution 5 can be fed only during sampling. Therefore, the aseptic sampling device 1 can reduce the amount of the culture solution 5 withdrawn from the culture tank 4 .
  • the switching mechanism 16 is not limited to a specific configuration as long as it can switch between the sterilizing solution 17 and the like and the culture solution 5. For example, it is possible to suitably switch between them as follows.
  • the culture tank 4 is filled with a culture solution 5 containing cells, and as in the first embodiment, while aeration and stirring are performed by the submerged aeration means 6 and the liquid surface aeration means 7, , Control the culture temperature, DO and pH as usual to culture the target cells.
  • the culture tank 4 may be provided with a medium supply means 8 and a liquid feed pump 3b. Whether or not the culture tank 4 is equipped with the submerged aeration means 6, the liquid surface aeration means 7, the medium supply means 8, and the liquid feed pump 3b varies depending on the culture method and the cells, so these can be arbitrarily set as necessary.
  • the culture method includes batch culture, fed-batch culture, perfusion culture, etc. in terms of the timing of addition of the liquid medium, and static culture, aeration culture, stirring culture, shaking culture, etc. in terms of the agitation method. .
  • Valves V1 to V7 in FIG. 4 are electromagnetic valves or pinch valves whose opening and closing drive can be controlled by a control device (not shown). If the piping tube is flexible, a pinch valve that opens and closes the flow path by pinching the piping tube does not allow liquid to pool inside the valve body, so it is easy to replace the piping tube. Yes, it is preferable. For this reason, in the present embodiment, it is preferable that all the piping tubes including the sampling channel 2 are made of flexible resin. Further, in this embodiment, a tube operating mechanism 20 is provided that can arbitrarily move the position of the open end nozzle 2b on the outlet side of the sampling channel 2 .
  • the open end nozzle 2b on the outlet side of the sampling channel 2 is placed in the waste liquid container 15 by the tube operating mechanism 20, and sterile water 18 is continuously fed to the sampling channel 2. Therefore, at the beginning of cell culture, the valves V1, V4 and V6 are closed and the valves V2, V3, V5 and V7 are open.
  • the liquid flow rate of the sterile water 18 is measured by the liquid flow meter 9b, and the output of the liquid feeding pump 3d is controlled based on the measured value.
  • the flow rate of the sterile water 18 at this time is preferably set and controlled according to the inner diameter of the piping tube 2a in the sampling flow path 2, as shown in FIG.
  • aseptic sampling is performed according to the following operation flow.
  • (1) Close the valves V5 and V7 from the initial state of starting the cell culture described above. That is, the valves V1, V4, V5, V6 and V7 are closed, and the valves V2 and V3 are open.
  • the liquid transfer pump 3d is stopped.
  • valve V4 Next, open the valve V4. That is, the valves V1, V5, V6 and V7 are closed, and the valves V2, V3 and V4 are open.
  • the sterile air venting means 19 ventilates the sampling channel 2 with sterile air, and the liquid remaining in the sampling channel 2 can be discarded in the waste liquid container 15 .
  • the flow rate of sterile air at this time is also preferably set and controlled according to the inner diameter of the piping tube 2a in the sampling flow path 2, as shown in FIG. Also, as with other fluids, it is preferable to control the pressure gradient of sterile air toward the open end nozzle 2b on the outlet side of the sampling channel 2 to be 1 kPa/m or more.
  • valve V4 is closed. That is, the valves V1, V4, V5, V6 and V7 are closed, and the valves V2 and V3 are open. Further, the tube operating mechanism 20 moves the open end nozzle 2b on the outlet side of the sampling flow path 2 to the sampling container 12 .
  • the liquid flow rate can also be measured by the liquid flow meter 9b and controlled based on the result.
  • the culture solution 5 is controlled so that the pressure gradient toward the open end nozzle 2b on the outlet side of the sampling channel 2 is 1 kPa/m or more.
  • valve V2 when the required amount of sampling is completed. That is, the valves V2, V4, V5, V6 and V7 are closed, and the valves V1 and V3 are open. Further, the tube operating mechanism 20 moves the open end nozzle 2b on the outlet side of the sampling channel 2 to the waste liquid container 15 .
  • valves V1 and V4 are closed and valves V2, V5 and V6 are opened. That is, the valves V1, V4 and V7 are closed, and the valves V2, V3, V5 and V6 are open.
  • the liquid-sending pump 3c can send the sterilizing liquid 17 into the piping tube 2a.
  • the sterilizing liquid 17 that has been sent is discarded in the waste liquid container 15 .
  • the flow rate of the sterilizing liquid 17 at this time is also preferably set and controlled according to the inner diameter of the piping tube 2a in the sampling flow path 2, as shown in FIG. Also, the sterilizing liquid 17 is controlled so that the pressure gradient toward the open end nozzle 2b on the outlet side of the sampling channel 2 is 1 kPa/m or more.
  • the liquid-sending pump 3d can continuously send the sterile water 18 into the piping tube 2a.
  • the sterile water 18 that has been fed is discarded in the waste liquid container 15 .
  • the flow rate of the sterile water 18 at this time is set and controlled according to the inner diameter of the piping tube 2a in the sampling flow path 2, as shown in FIG. Also, the sterile water 18 is controlled so that the pressure gradient toward the open end nozzle 2b on the outlet side of the sampling channel 2 is 1 kPa/m or more.
  • valves V5 and V7 are closed and valve V4 is opened. That is, the valves V1, V5, V6 and V7 are closed, and the valves V2, V3 and V4 are open.
  • the sterile air ventilation means 19 ventilates the sterile air into the piping tube 2a, and the residual liquid in the piping tube 2a can be discarded in the waste liquid container 15.
  • valve V4 closes the valve V4, open the valve V5, and open the valve V6 or V7. That is, the valves V1 and V4 are closed, and one of the valves V2, V3, V5 and the valves V6 and V7 is open (in this case, the other of the valves V6 and V7 is closed). and As a result, the sterile liquid 17 or the sterile water 18 is continuously fed into the sampling channel 2, and the sterile state of the sampling channel 2 after the valve V3 is maintained.
  • the flow rate of the sterile liquid 17 or the sterile water 18 at this time is also set and controlled according to the inner diameter of the piping tube 2a in the sampling flow path 2, as shown in FIG.
  • the sterile liquid 17 or the sterile water 18 is controlled so that the pressure gradient toward the open end nozzle 2b on the outlet side of the sampling channel 2 is 1 kPa/m or more.
  • the sterile liquid 17 is delivered, the sterile state of the sampling flow path 2 after the valve V3 can be more reliably maintained.
  • the step (8) is performed when the next sampling step is performed, and the sterile water 18 is continuously fed into the piping tube 2a, and then the steps after (1) are performed. It is desirable to
  • the culture solution 5 can be aseptically sampled by the above operation.
  • a pressure gradient of 1 kPa/m or more, preferably 100 kPa/m or less, is applied to the fluid such as the sterile liquid 17 and the sterile water 18 toward the outlet-side open end nozzle 2b by the pressure applying device 3.
  • the fluid such as the sterile liquid 17 and the sterile water 18 toward the outlet-side open end nozzle 2b by the pressure applying device 3.
  • the pressure applying device 3 is applied to the sampling channel 2 so that the pressure gradient of 1 kPa/m or more, preferably 100 kPa/m, is applied to the culture solution 5, which is a fluid, toward the open end nozzle 2b on the outlet side. Thereafter, more preferably, for example, control (maintaining and controlling the flow pressure or flow rate) is carried out so that the pressure is from 10 kPa/m to 30 kPa/m, so that sterility can be maintained.
  • the sterile sampling device 1 preferably has a check valve 21 in the sampling flow path 2 .
  • the check valve 21 By providing the check valve 21 in this way, the aseptic sampling device 1 can prevent backflow of the culture solution 5 or the like in the sampling channel 2 . Therefore, even if any of the equipment provided in the cell culture apparatus 30 malfunctions or an operation error occurs, the culture solution 5 contaminated with various germs flows back through the sampling flow path 2 and flows into the culture tank. 4 can be prevented from being contaminated.
  • the installation position of the check valve 21 is arbitrary, but it is preferably downstream of the measuring device 9 . By doing so, it is possible to prevent the culture solution 5 contaminated with germs from contaminating the measuring device 9 . Needless to say, the check valve 21 can be provided in the sampling flow path 2 in the first and second embodiments as well.
  • the sterile water 18 is continuously fed to the sampling channel 2 at the beginning of cell culture.
  • the present embodiment can be modified as follows.
  • the sterile liquid 17 may be sent to the sampling channel 2.
  • the valves V1, V4 and V7 are closed, and the valves V2, V3, V5 and V6 are open.
  • the liquid flow rate of the sterilizing liquid 17 is measured by the liquid flow meter 9b, and based on the measured value, the output of the liquid feeding pump 3c is controlled so that the pressure gradient of the sterilizing liquid 17 is 1 kPa/m or more. do.
  • the inside of the sampling channel 2 may be rinsed with sterile water 18 immediately before sampling, if necessary. Rinsing with sterile water 18 can be performed by closing valves V1, V4 and V6 and opening valves V2, V3, V5 and V7.
  • sterile air may be passed through the sampling flow path 2.
  • the valves V1, V5, V6 and V7 are closed, and the valves V2, V3 and V4 are open.
  • the sterile air flow rate is measured by the pressure gauge 9a, and based on the measured value, the output of the sterile air ventilation means 19 is controlled so that the pressure gradient of the sterile air is 1 kPa/m or more. can be done.
  • the pressure gradient of the fluid is controlled to be 1 kPa/m or more, so sterility can be maintained at the initial stage of cell culture (contamination of various bacteria can be prevented).
  • this method a sterile sampling method (hereinafter sometimes abbreviated as "this method") according to this embodiment will be described.
  • this method a sterile sampling method (hereinafter sometimes abbreviated as "this method") according to this embodiment will be described.
  • elements that have already been described are denoted by the same reference numerals, and detailed description may be omitted.
  • This method is an aseptic sampling method using the aseptic sampling device 1 having the sampling channel 2 and the pressure application device 3 described above.
  • the pressure applying device 3 described above controls the fluid in the sampling channel 2 so that the pressure gradient is 1 kPa/m or more toward the open end nozzle 2b on the outlet side of the sampling channel 2. . Therefore, in this method, as described above, the pressure gradient of the fluid in the sampling channel 2 is sufficiently high, so that germs cannot enter from the open end nozzle 2b on the outlet side of the sampling channel 2. Therefore, this method can prevent contamination from the open end nozzle 2b.
  • the present method does not require the aseptic sampling device 1 to be provided with various devices for sterilizing the open-ended nozzle 2b with steam, flame, disinfectant, or the like. In this manner, the present method can perform aseptic sampling with a simple configuration and at low cost.
  • the culture solution 5 after sampling by feeding the culture solution 5 to the sampling channel 2, at least one of the sterile solution 17, the sterile water 18, and the buffer solution is switched to the culture solution 5 and sent. is preferred.
  • This switching can be performed by the switching mechanism 16 described above.
  • the culture solution 5 can be fed only at the time of sampling, so the amount of the culture solution 5 withdrawn from the culture tank 4 can be reduced.
  • the gist of the present invention is not limited to this, and includes various modifications.
  • the above-described embodiments have been described in detail in order to explain the present invention in an easy-to-understand manner, and are not necessarily limited to those having all the described configurations.
  • part of the configuration of one embodiment can be replaced with the configuration of another embodiment, and the configuration of another embodiment can be added to the configuration of one embodiment.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

簡易な構成かつ安価な無菌サンプリング装置および無菌サンプリング方法を提供する。本発明に係る無菌サンプリング装置（１）は、培養槽（４）内の培養液（５）を分析装置（１４）に供試するために抜出すサンプリング流路（２）と、前記サンプリング流路（２）内に圧力を付与する圧力付与装置（３）と、を備え、前記圧力付与装置（３）により、前記サンプリング流路（２）内の流体に対し、前記サンプリング流路（２）の出口側の開放端ノズル（２ｂ）に向けて圧力勾配が１ｋＰａ／ｍ以上となるように流動圧力または液流速を制御することとしている。

Description

無菌サンプリング装置および無菌サンプリング方法
　本発明は、無菌サンプリング装置および無菌サンプリング方法に関する。
　再生医療やバイオ医薬品製造など、細胞を培養する必要がある技術分野においては、無菌状態を維持したまま、長期間の培養を行う細胞培養装置が開発されている。細胞培養装置による細胞培養では、対象の細胞を所定の条件下で培養して、目的とする細胞への分化誘導または目的とする高分子タンパク質の生産を行うことが多く行われている。また、細胞培養装置による細胞培養では、対象の細胞に最適化された培地を張り込んだ培養槽の中で通気攪拌を行いながら培養することが一般的である。
　細胞培養装置による細胞培養では、培養時の培養槽内における培養液の状態を測定している。培養液の状態は、例えば、温度、ｐＨ、溶存酸素（ＤＯ）濃度、溶存二酸化炭素（ＤＣＯ２）濃度などの各種パラメータをパラメータに応じた各種電極やセンサ類を使用してオンラインで計測することが広く行われている。
　また、細胞培養装置による細胞培養では、培養時に、必要に応じて培養液の一部を無菌的にサンプリングして各種の計測機器で測定することが行われている。この測定は、サンプリングした培養液を用いて培養槽の外部でグルタミンなどのアミノ酸、グルコース、乳酸、アンモニア、生成タンパク（抗体など）といった細胞の代謝に関与する培地成分に対して行われることが多い。
　前記した測定は、特定のタンパク質に対して行われることも多い。特定のタンパク質の測定には、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）のほか、目的産物に対する抗体または親和性のある物質を保持するセンシング部を備えたＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定）、ＥＣＬ（電気化学発光）、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）など各種の分析手法が用いられる。
　また、前記した測定は、高分子タンパク質の変異体に対して行われることもある。高分子タンパク質の変異体の測定には、ＬＣ／ＭＳ（液体クロマトグラフ質量分析計）のほか、等電点電気泳動法、キャピラリー電気泳動法などが用いられる。
　さらに、前記した測定は、培養細胞について、染色剤を用いた細胞分化の状態、生死を判別した細胞数の計測、生存率、細胞径および細胞形状などを分析するために行われることもある。これらの分析を行うには、直接、細胞を培養槽から抜き出すサンプリング操作が必要である。
　特に、再生医療の用途では、培養細胞の分化状態などを把握する必要があり、細胞培養装置の無菌性を維持したまま、細胞を含む培養液を非無菌空間に抜き出す必要がある。サンプリングに際しては、雑菌汚染（コンタミネーション）を避けるために無菌操作が要求される。また、サンプリング装置においては、外部から微生物が入り込まない構造および培養液が装置内に滞留することを極力避ける構造が要求される。
　従来、培養槽内からの培養液のサンプリング操作は、人手により培養槽に設けたサンプリング用の配管チューブからバルブを開けて必要量を採取していた。配管チューブの採取口を、グローブボックスなど無菌空間に配置し、培養液サンプル採取の前後に蒸気や火炎、消毒剤等で殺菌を行う必要があり人手作業となる。なお、培養槽と配管がステンレス製の培養プラントでは、サンプリング用の配管系を蒸気滅菌した後、細胞を含む培養液をサンプリングし、再度、蒸気滅菌して無菌水で洗浄した後、無菌エアで配管内の残留液を廃棄する。工程の自動化は可能であるが、複数の工程を実施するためにサンプリングの前後に多くの時間を要し、サンプリング間隔を短くすることが困難である。
　このような状況下、例えば、特許文献１に記載のサンプリング装置が提案されている。このサンプリング装置は、サンプリングノズルとそれに通じる試料吸引用自動ピンチバルブ、試料吸引用チューブポンプ、無菌エア送入用配管とスチーム送入用配管とを連結または別々に接続する自動ピンチバルブ、薬剤送入用配管と無菌水送入用配管とを連結または別々に接続する自動ピンチバルブ、およびそれらを連通させる配管とから構成されている。この装置は、夫々の自動ピンチバルブの開閉および該試料吸引用チューブポンプの運転が制御装置により制御され、あらかじめ制御装置に記憶させた殺菌、フラッシング、スチーム殺菌、薬剤殺菌、洗浄およびサンプリングの各操作を自由に組み合わせて行う。特許文献１によれば、この装置により、固液相を均一にサンプリングすることが可能であり、サンプルが腐りやすい有機物を含む場合に殺菌や洗浄を効率良く行うことができる旨記載されている。
特許第３１３７３９６号公報
　生体細胞の培養においては、培養状況が刻々と変化し、培養初期の生体細胞の濃度が低い状況では良好に制御されていたものが、生体細胞の濃度が高まることによって目標とする培養環境を維持できない状況が生じ得る。生体細胞の培養に適切な培養環境を維持するために、生体細胞の培養が進行するのに伴って適切な培養制御を行う必要がある。
　培養方式が灌流培養の場合、培養槽から細胞を含んだ培養液を抜き出し、遠心分離または中空糸膜フィルタを備えたタンジェンシャルフローろ過装置（ＴＦＦ）を用いて細胞を分離し、分離した細胞を培養槽に戻して培養液のみを系外に排出する。灌流培養ではこれと同時に、排出した培養液と同量の新鮮な培地を供給することで、長期間の連続培養を行う。従って、灌流培養の場合、分離した細胞を培養槽に戻すため、排出した培養液を用いて培地成分および細胞の代謝成分を測定することは可能であるが、細胞自体を分析することはできない。
　前記した特許文献１に記載のサンプリング装置は、灌流培養の場合であっても培養槽から細胞をサンプリングすることを可能とし得るものである。しかし、このサンプリング装置は、サンプリングにあたりさまざまな装置を動かす必要があり、構成が複雑で高価なものであった。
　本発明の目的は、簡易な構成かつ安価な無菌サンプリング装置および無菌サンプリング方法を提供することにある。
　前記課題を解決した本発明に係る無菌サンプリング装置は、培養槽内の培養液を分析装置に供試するために抜出すサンプリング流路と、前記サンプリング流路内に圧力を付与する圧力付与装置と、を備え、前記圧力付与装置により、前記サンプリング流路内の流体に対し、前記サンプリング流路の出口側の開放端ノズルに向けて圧力勾配が１ｋＰａ／ｍ以上となるように流動圧力または液流速を制御することとしている。
　本発明によれば、簡易な構成かつ安価な無菌サンプリング装置および無菌サンプリング方法を提供できる。
　前述した以外の課題、構成および効果は以下の実施形態の説明により明らかにされる。
第１実施形態に係る無菌サンプリング装置１を備える細胞培養装置３０の全体構成を示す概略図である。 サンプリング用の配管チューブ２ａの内径と流量選定の一例を示すグラフである。同図中、横軸は配管チューブ２ａの内径（ｍｍ）、左縦軸はサンプリング流量（ｍＬ／ｍｉｎ）、右縦軸はレイノルズ数Ｒｅ（－）である。 第２実施形態に係る無菌サンプリング装置１を備える細胞培養装置３０の全体構成を示す概略図である。 第３実施形態に係る無菌サンプリング装置１を備える細胞培養装置３０の全体構成を示す概略図である。
　以下、適宜図面を参照して本発明に係る無菌サンプリング装置および無菌サンプリング方法の一実施形態について詳細に説明する。
［無菌サンプリング装置１］
（第１実施形態）
　図１は、第１実施形態に係る無菌サンプリング装置１を備える細胞培養装置３０の全体構成を示す概略図である。
　図１に示すように、本実施形態に係る無菌サンプリング装置１は、細胞培養装置３０の培養槽４に接続されている。この無菌サンプリング装置１は、細胞培養装置３０における細胞の培養状態をオンラインで監視するために好適に用いられる。
　細胞培養装置３０は、バイオ医薬品や健康食品などの主原料となる有用物質を生産する動物やヒト由来の細胞の培養を行う際に適用される。また、細胞培養装置３０は、再生医療の用途において、皮膚、神経、骨、血管など、さまざまな細胞・器官へと分化できる多能性と、ほぼ無限に増殖する能力とを有する幹細胞を対象とした培養を行う際に適用される。
　細胞培養装置３０で培養される細胞としては、例えば、有用物質の生産用細胞として一般的に用いられるチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）やベイビーハムスター腎臓細胞、マウス骨髄腫細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
　細胞培養装置３０で培養される細胞が付着性細胞である場合は、マイクロキャリア等の担体に付着させて浮遊化させることにより、攪拌培養を行うことができる。
　幹細胞としては、例えば、ヒト間葉系幹細胞（ｈｕｍａｎ　Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ；ｈＭＳＣ）、ｉＰＳ細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ）やヒトＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ）などが挙げられるが、これらに限定されない。なお、幹細胞は、培養槽４内で増殖させた後、目的とする組織や臓器へと分化誘導することができる。
　前記した有用物質としては、例えば、高分子タンパク質が挙げられるが、これに限定されない。また、高分子タンパク質としては、例えば、生理活性物質が挙げられ、特に抗体が挙げられる。抗体としては、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、免疫グロブリンなどが挙げられる。また、生理活性物質は抗体に限らず、血栓溶解剤として利用される組織型プラスミノーゲン活性化因子やエリスロポエチン、インターフェロンなどのバイオ医薬品、その他工業的に有用なタンパク質も対象となり、β－カロテンやアスタキサンチンなどのカロチノイド、クロロフィルやバクテリオクロロフィルなどの色素を結合したタンパク質も対象となる。さらに、生理活性物質としては、食品や化粧品などの着色等に使用されるフィコシアニンなどのフィコビリンタンパク質なども挙げられる。
　培養に用いる培地については特に限定されるものではなく、培養対象とする細胞の増殖、有用物質の生産に有効なものであれば、従来のあらゆる培地が使用可能である。
　そして、本実施形態では、図１に示すように、無菌サンプリング装置１が、サンプリング流路２と圧力付与装置３とを備えている。
　サンプリング流路２は、培養槽４内の培養液５を分析装置１４に供試するために抜出す配管チューブ２ａ、つまり、中空材である。なお、培養液５とは、液体培地で培養した細胞を含む溶液をいう。
　圧力付与装置３は、サンプリング流路２内に圧力を付与する装置である。圧力付与装置３は、サンプリング流路２の一端（培養槽４との接続端部）から他端（出口側の開放端ノズル２ｂ）の間の任意の位置に設けられている。圧力付与装置３は、例えば、送液ポンプ３ａである。
　無菌サンプリング装置１は、この圧力付与装置３により、サンプリング流路２内の流体に対し、サンプリング流路２の出口側の開放端ノズル２ｂに向けて圧力勾配が１ｋＰａ／ｍ以上となるように制御している。なお、前記した流体としては、第１実施形態においては、例えば、培養液５が挙げられる。
　このようにすると、サンプリング流路２内の流体の圧力勾配が十分に高いので、雑菌が出口側の開放端ノズル２ｂから侵入することができない。仮に一瞬、雑菌が開放端ノズル２ｂから侵入したとしても、十分な圧力勾配を有する流体によって圧力抵抗を生じ、雑菌の遊泳速度より早い流速でサンプリング流路２外に押し流される。従って、無菌サンプリング装置１は、サンプリング流路２の出口側の開放端ノズル２ｂからの雑菌汚染（コンタミネーション）を防止できる。そのため、無菌サンプリング装置１は、開放端ノズル２ｂを蒸気や火炎、消毒剤などで滅菌するための各種装置を備える必要がない。このように、本実施形態によれば、簡易な構成かつ安価な無菌サンプリング装置１が具現できる。従って、細胞培養装置３０がこの無菌サンプリング装置１を備える場合、簡易な構成かつ安価でありながら、培養および分析にあたってコンタミネーションを防止できる。
　なお、圧力勾配の制御は、圧力付与装置３によって流動圧力または液流速を制御することによって行われることが好ましい。また、圧力勾配の制御は、サンプリング流路２内に流体が存在している間は常に行われていることが好ましい。
　さらに、前記したように、無菌サンプリング装置１は、圧力付与装置３により、サンプリング流路２内の流体に対し、サンプリング流路２の出口側の開放端ノズル２ｂに向けて圧力勾配が１ｋＰａ／ｍ以上となるように制御しているので、これを備える細胞培養装置３０は連続サンプリングが可能である。また、無菌サンプリング装置１は、細胞を含む培養液５を適宜サンプリングして分析することもできる。これらにより、無菌サンプリング装置１を備える細胞培養装置３０は、細胞の培養状態を把握し、適切な培養制御を行うことができる。さらに、無菌サンプリング装置１は、分析に必要な最少量の培養液５をサンプリングすることで無駄に培養液５を消費することが無く、効率的に目的の細胞を培養することができる。
　前記した圧力勾配は、コンタミネーションのより確実な防止の観点から、１０ｋＰａ／ｍ以上とすることが好ましい。また、前記した圧力勾配は、使用する培養液５の量を少なくする観点から、１００ｋＰａ／ｍ以下とすることが好ましく、３０ｋＰａ／ｍ以下とすることがより好ましい。
　前記した配管チューブ２ａの内径は１．５ｍｍ以下であることが好ましく、０．１～０．５ｍｍであることがより好ましい。このようにすると、配管チューブ２ａを流れる流体が乱流となり難く、せん断力が生じ難いため、サンプリング時に培養液５中の細胞に与えるダメージを減らすことができる。また、圧力勾配を維持するのに必要な流体の流量を小さくすることができる。なお、配管チューブ２ａ以外の配管チューブ（例えば、後述する配管チューブ６ａ、７ａ、８ａなど）の内径は任意に設定できる。
　配管チューブ２ａの材質は、例えば、フッ素樹脂、ポリテトラフルオロエチレン、テトラフルオロエチレン・エチレン共重合体、テトラフルオロエチレン・パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体、ポリエーテルエーテルケトンまたはポリエーテルエーテルケトンケトンであることが好ましい。このようにすると、前記した内径の配管チューブ２ａを容易に入手することができる。
　圧力付与装置３は、例えば、チューブポンプおよびダイアフラムポンプのうちの少なくとも１つであることが好ましい。これらの圧力付与装置３を用いると、無菌的に圧力を付与することができる。
　なお、サンプリング流路２（配管チューブ２ａ）内に残存する培養液５などの液体を廃棄する際には、圧力付与装置３として無菌エアを送気するエアポンプおよび無菌エアを送気するエアコンプレッサのうちの少なくとも１つを用いることができる。このようにすると、第３実施形態で述べるように、無菌的な気体（無菌エア）によって圧力を付与することができる。なお、エアポンプやエアコンプレッサによる無菌エアの送気は、これらに無菌フィルタＦ（図４参照）を備えることで行うことができる。
　また、図１に示すように、細胞培養装置３０は、培養槽４および無菌サンプリング装置１の他にも、液中通気手段６、液面通気手段７、培地供給手段８などを備えている。
　液中通気手段６は、培養槽４内の培養液５中に無菌エアを送り込む役割を果たす。液中通気手段６は、例えば、無菌フィルタ（図１で図示せず）を備えたエアポンプやエアコンプレッサなどを配管チューブ６ａで培養槽４に接続し、さらにこの配管チューブ６ａを培養液５中に配することで具現できる。この場合、培養液５中に配される配管チューブ６ａの先端にスパージャ１１などの気泡を小さくする微小気泡化手段を設けておくことが好ましい。このようにすると、無菌エアが微小気泡となるため培養液５中に酸素を溶存させる効率が高くなる。また、気泡の上昇速度が遅くなるとともに液面にあがった気泡の破裂による衝撃を抑えることができるため細胞に与えるダメージを減らすことができる。
　液面通気手段７は、培養槽４内の培養液５の液面に無菌エアを送り込む役割を果たす。液面通気手段７は、例えば、前記した無菌フィルタ（図１で図示せず）を備えたエアポンプやエアコンプレッサなどを配管チューブ７ａで培養槽４の気相部に接続することで具現できる。
　培地供給手段８は、サンプリング流路２から抜き出される培養液５と同等量の新鮮な培地を培養槽４内に供給し、培養槽４内の培養液５の量を一定に維持するものである。なお、新鮮な培地とは、細胞培養に必要な栄養成分は含むが、細胞を含んでいない新規な培地をいう。培地供給手段８は、新鮮な培地を貯留する培地供給タンク（図示せず）と、この培地供給タンクと培養槽４とを繋ぐ配管チューブ８ａと、この配管チューブ８ａ上に設置された圧力付与装置３である送液ポンプ３ｂとで構成される。
　なお、配管チューブ６ａ、７ａ、８ａは、前記した配管チューブ２ａと同様の材質とすることができる。
　液中通気手段６、液面通気手段７および培地供給手段８はいずれも、培養方式に応じて任意に設けることができる。なお、本実施形態においては培養液５を所定量抜き出すことになるので、培地供給手段８を備えておくことが好ましいが、培養液５の容量が大きくかつ抜き出し量が十分小さい場合はこれを備えなくてもよい。培地供給手段８を備えない場合は、無菌サンプリング装置１を備えた細胞培養装置３０がより簡易な構成かつ安価に提供できる。
　また、図１に示すように、無菌サンプリング装置１は、サンプリング流路２に流動圧力または液流速を計測する計測装置９を備えていることが好ましい。そして、無菌サンプリング装置１は、計測装置９で計測した計測値に基づいて圧力付与装置３を制御し、前記した圧力勾配となるように流動圧力または液流速を制御することが好ましい。このようにすると、無菌サンプリング装置１は前記した圧力勾配の制御を確実に行うことができる。
　流動圧力を計測する計測装置９としては、例えば、圧力計９ａが挙げられる。液流速を計測する計測装置９としては、例えば、液流量計９ｂが挙げられる。これらの計測装置９は、例えば、サンプリング流路２において圧力付与装置３の下流に設けるとよい。本実施形態においては、計測装置９として圧力計９ａおよび液流量計９ｂを併設し、圧力勾配を流動圧力および液流速の両方で制御してもよい。このようにすると、無菌サンプリング装置１は圧力勾配の制御をより精緻に行うことができる。
　以下、図１を参照して、本実施形態についてより具体的に説明する。
　細胞は、所定の条件下で長期間に渡り無菌状態を維持して培養される。細胞の培養は、細胞に最適化された培地を張り込んだ培養槽４の中で、細胞を懸濁した培養液５を攪拌機１０で均一に混合攪拌して行う。
　図１中には図示しないが、培養槽４には既存の滅菌可能な各種センサが設置されており、温度、ｐＨ、溶存酸素（ＤＯ）濃度などを分析し、適宜の手段で制御している。例えば、ＤＯ濃度の制御は、液中通気手段６により無菌エア（または酸素と無菌エアとの混合空気）を液中に通気して行う。図１では一例として、微細孔を有するスパージャ１１を用いて微小気泡を発生させる例を示している。微小気泡が細胞の培養を阻害するなどの影響を及ぼす場合は、多孔性膜を介した膜面通気が適用される。
　また、培養液５の適正なｐＨの制御は、液面通気手段７により、無菌エアに二酸化炭素を混合したガス通気を行うか、または図示しない液供給手段により、酸またはアルカリを添加することによって行う。液供給手段における液供給量は、図示しない送液ポンプによって制御する。なお、液供給手段では、細胞の培養に必要な栄養成分を含む添加培地を培養途中において供給する手段として使用することもある。
　細胞の培養状態および品質管理において、培地成分または細胞自体を培養系外で分析して細胞の代謝反応や細胞状態をモニタリングする必要がある場合には、適宜、培養槽４から細胞を含む培養液５を圧力付与装置３により一定量または一定時間ごとにサンプリング流路２を介して複数のサンプリング容器１２に分画してサンプリングする。図１では一例として、フラクションコレクタ１３に配置されたサンプリング容器１２に、分析に必要な所定量の培養液５を回収している。回収した培養液５は、人手を介して、または自動的に分析装置１４に導入されて各種の分析に供される。
　従来は、室内の常在菌などがサンプリング流路２の出口側の開放端ノズル２ｂから侵入するコンタミネーションを防止するため、サンプリングの前後に開放端ノズル２ｂを蒸気や火炎、消毒剤などで滅菌する必要があった。また、従来は、サンプリングした培養液５から人手により必要量を採取し、分析していた。
　本実施形態では、サンプリング流路２の長さと流速を種々検討した結果、無菌サンプリング装置１のサンプリング流路２における圧力勾配を１ｋＰａ／ｍ以上、好ましくは１００ｋＰａ／ｍ以下、より好ましくは、例えば、１０ｋＰａ／ｍから３０ｋＰａ／ｍとなるように制御することとした。このようにすることによって、無菌サンプリング装置１は、簡易な構成かつ安価でありながら、サンプリング流路２の出口側の開放端ノズル２ｂからのコンタミネーションを防止でき、また、連続サンプリングも可能としたものである。
　なお、配管チューブ２ａを流れる流体の圧力損失Δｐ（Ｐａ）は、次式（１）に示すダルシー・ワイスバッハの式（Ｄａｒｃｙ－Ｗｅｉｓｂａｃｈ　Ｅｑｕａｔｉｏｎ）を用いて算出できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　ここで、式（１）において、
Ｌ：配管チューブ２ａの長さ（ｍ）
Ｄ：配管チューブ２ａの内径（ｍ）
Ｖ：平均流速（ｍ／ｓ）
ρ：流体密度（ｋｇ／ｍ３）
ｆ：摩擦損失係数（－）
　である。
　なお、摩擦損失係数ｆは、層流状態ではハーゲン・ポアズイユの法則により次式（２）となる。
　ｆ＝６４／Ｒｅ　　　　‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥（２）
　ここで、式（２）において、Ｒｅはレイノルズ数である。円管内の流れでは、レイノルズ数が２０００以上、例えば２３００～４０００の範囲において乱流遷移の指標とされる。サンプリング流路２において流れが乱流領域となると、細胞の損傷を生じる可能性がある。例えば、分析対象がヒトまたは動物由来の細胞や幹細胞である場合、微生物細胞と異なり細胞壁を持たないため、せん断応力によって細胞がダメージを受けるおそれがある。
　上述のダルシー・ワイスバッハの式（１）において、配管チューブ２ａの長さＬ（ｍ）に応じた圧力損失Δｐ（Ｐａ）を示す圧力勾配Δｐ／Ｌ（Ｐａ／ｍ）は、配管チューブ２ａの内径Ｄ（ｍ）と平均流速Ｖ（ｍ／ｓ）に依存する。図２は、サンプリング用の配管チューブ２ａの内径と流量選定の一例を示すグラフである。図２には、本実施形態におけるサンプリング流路２の圧力勾配を好ましい範囲である１０ｋＰａ／ｍから３０ｋＰａ／ｍに制御するための、配管チューブ２ａの内径とサンプリング流量の関係が太い実線で示されている（左縦軸）。また、図２には、各サンプリング流量におけるレイノルズ数Ｒｅの算出値が破線で示されている（右縦軸）。
　図２に示すように、配管チューブ２ａの内径が１．５ｍｍを超えるとレイノルズ数Ｒｅが２０００以上となる。前述したように、レイノルズ数Ｒｅが２０００以上になると乱流領域となる。従って、本実施形態に係る無菌サンプリング装置１では、サンプリング流路２の配管チューブ２ａの内径を１．５ｍｍ以下とすることが好ましい。このようにすると、培養液５の抜き出し時における流速はレイノルズ数２０００未満の層流領域となるため、動物由来の細胞を用いた場合であっても、細胞がダメージを受けるのを防止することができる。
　なお、本実施形態においては、分析装置１４での分析に必要とする各培養サンプル液量に応じて、配管チューブ２ａの内径とサンプリング流量を適正に設定することになる。通常、分析装置１４での必要液量は少量であるため、サンプリング流路２における配管チューブ２ａの内径は０．１ｍｍから０．５ｍｍあたりに設定することが好ましい。例えば、配管チューブ２ａの内径が０．５ｍｍの場合、図２に示すように、サンプリング流量を０．９～３．０ｍＬ／ｍｉｎとすることが好ましい。
　この場合の流量制御は、例えば、サンプリング流路２に設置した計測装置９である液流量計９ｂで流量（液流速）を計測しつつ、計測した液流速に基づいて圧力付与装置３である送液ポンプ３ａの出力を適宜制御することにより行うことができる。これにより、前記した圧力勾配に制御することができる。
　また、流量制御は、サンプリング流路２に設置した計測装置９である圧力計９ａで流動圧力を計測しつつ、計測した流動圧力に基づいて圧力付与装置３である送液ポンプ３ａの出力を適宜制御することにより行うことができる。これにより、前記した圧力勾配に制御することができる。なお、この場合、サンプリング流路２における配管チューブ２ａの長さＬに応じて圧力計９ａの制御圧力の目標値を設定する。例えば、サンプリング流路２における配管チューブ２ａの長さＬを１ｍとした場合、サンプリング流路２の出口側の開放端ノズル２ｂにおける大気圧に対して、送液ポンプ３ａにおける差圧Δｐが１ｋＰａ以上、好ましくは１００ｋＰａ以下、より好ましくは、例えば、１０ｋＰａから３０ｋＰａとなるように流量を制御する。なお、図１に示す例で説明すると、配管チューブ２ａの長さＬは、圧力計９ａの設置位置から出口側の開放端ノズル２ｂまでの長さに相当する。
　また、図１では、送液ポンプ３ａを用いたサンプリング例を示したが、培養槽４がガラス製または樹脂製などの剛性を有するものである場合は、液面通気手段７で培養槽４の液面に通気するガスの通気圧または流量を増減させてサンプリング流路２における培養液５のサンプリング流量を制御してもよい。この場合、液面通気手段７で使用する図示しないエアポンプやエアコンプレッサなどが圧力付与装置３に該当する。
　無菌サンプリング装置１は、上述したこれらの手段を適用することによって、出口側の開放端ノズル２ｂからの雑菌のコンタミネーションを生じることなく、連続サンプリングが可能となる。
（第２実施形態）
　図３は、第２実施形態に係る無菌サンプリング装置１を備える細胞培養装置３０の全体構成を示す概略図である。
　図３に示すように、本実施形態に係る無菌サンプリング装置１は、サンプリング流路２が途中で二つに分岐しており、一方の出口側の開放端ノズル２ｃがバルブＶａを介して分析装置１４に接続され、他の一方の出口側の開放端ノズル２ｄがバルブＶｂを介して廃液容器１５に接続されている点で、第１実施形態に係る無菌サンプリング装置１と異なっている。第２実施形態は、第１実施形態と相違する構成を中心に説明を行う。なお、第２実施形態において、既に説明した要素については同一の符号を付し、詳細な説明を省略する場合がある。
　分析装置１４によっては、所定の分析工程を実施するのに一定の時間を要し、サンプリングした培養液５を連続的に受け取って分析することができない場合がある。また、培養目的によっては、分析頻度を一定の時間間隔で実施することが望ましい場合がある。さらに、細胞培養装置３０で培養を行うにあたり、適宜のタイミングで培養槽４の培養液５を直接、分析装置１４に供試して培養液５の分析を行いたい場合がある。図３に示す無菌サンプリング装置１およびこれを備える細胞培養装置３０は、これらの要望に応えるために創案されたものである。
　図３に示すように、二つに分岐するサンプリング流路２の一方の開放端ノズル２ｃが分析装置１４に接続されている。そのため、圧力付与装置３でサンプリング流路２内の培養液５に圧力を付与しつつバルブＶａを開くことにより、サンプリングした培養液５を分析装置１４に供試できる。また、サンプリング流路２のもう一方の開放端ノズル２ｄが廃液容器１５に接続されている。そのため、圧力付与装置３でサンプリング流路２内の培養液５に圧力を付与しつつバルブＶｂを開くことにより、分析に必要としないサンプリングした培養液５を廃液容器１５に貯留できる。
　従って、例えば、通常はバルブＶａを閉じてバルブＶｂを開いておくことでサンプリングした培養液５を廃液容器１５に貯留させ、分析時にバルブＶａを開いてバルブＶｂを閉じることでサンプリングした培養液５を分析装置１４に供試するという態様をとることができる。
　廃液容器１５への貯留時および分析装置１４への送液時は、前述しているように、圧力付与装置３により、サンプリング流路２内の流体に対し、サンプリング流路２の出口側の開放端ノズル２ｃに向けて圧力勾配が１ｋＰａ／ｍ以上、好ましくは１００ｋＰａ／ｍ以下、より好ましくは、例えば、１０ｋＰａ／ｍから３０ｋＰａ／ｍの圧力勾配となるように制御する。従って、本実施形態に係る無菌サンプリング装置１は、廃液容器１５に配置した出口側の開放端ノズル２ｄからの雑菌汚染によるコンタミネーションを防止し、培養槽４における無菌性を維持することができる。また、本実施形態に係る無菌サンプリング装置１は、分析装置１４への培養液５の送液時もコンタミネーションを防止しつつ、確実な送液が可能となる。さらに、本実施形態に係る無菌サンプリング装置１は、分析装置１４による分析結果に応じて攪拌機１０、液中通気手段６、液面通気手段７、培地供給手段８などの細胞培養装置３０における培養を制御する各種手段の設定変更を可能とするものである。従って、本実施形態に係る無菌サンプリング装置１は、細胞培養装置３０における良好な培養状態を維持することに資するものである。
　なお、本実施形態においては、サンプリング流路２の配管チューブ２ａのうち、内径が１．５ｍｍ以下の部分が分析装置１４の直前に配置されていることが好ましい。つまり、内径が１．５ｍｍ以下の配管チューブ２ａが分析装置１４に接続されていることが好ましい。分析装置１４にはこのような細径の配管チューブ２ａを接続できるものが多く、サンプリングした培養液５を分析装置１４に直接供試することができる。また、内径が１．５ｍｍ以下であれば培養液５の流量が少ないので培養液５の使用量を少なくできる。
（第３実施形態）
　図４は、第３実施形態に係る無菌サンプリング装置１を備える細胞培養装置３０の全体構成を示す概略図である。
　第１実施形態では、培養槽４の培養液５を連続的にサンプリングする例を示したが、図４に示す第３実施形態では、培養液５の分析が必要なタイミングで適宜、無菌サンプリングを行う。そのため、第３実施形態に係る無菌サンプリング装置１は、サンプリング流路２に培養液５が残留しないように、培養液５以外の流体でサンプリング流路２内に残存する培養液５を廃棄する。その後、この無菌サンプリング装置１は、サンプリング流路２の出口側の開放端ノズル２ｂに向けて流体、好ましくは液体を連続的に送出（送液）することで雑菌のコンタミネーションを防止する。
　これを具現するため、図４に示すように、第３実施形態に係る無菌サンプリング装置１は、サンプリング流路２に切り替え機構１６を備えている点で、第１実施形態に係る無菌サンプリング装置１と異なっている。第３実施形態は、第１実施形態と相違する構成を中心に説明を行う。なお、第３実施形態において、既に説明した要素については同一の符号を付し、詳細な説明を省略する場合がある。
　ここで、切り替え機構１６は、滅菌液１７、無菌水１８、緩衝液および無菌エアのうちの少なくとも１つの流体と、培養液５との切り替えを行う。このようにすると、より確実にコンタミネーションが防止される。なお、緩衝液について図示はしないが、例えば、無菌水１８と同様に行うことができる。滅菌液１７、無菌水１８、緩衝液および無菌エアは、図４に示すように２つ以上用いることができる（図４では２つの場合を例示している）。
　ここで、滅菌液１７とは、細菌を殺菌するための成分を含む溶液をいう。滅菌液１７としては、例えば、６０～７０％アルコール、次亜塩素酸ナトリウム水溶液、次亜塩素酸水などが挙げられる。
　無菌水１８とは、殺菌した水をいう。無菌水１８は、例えば、１２１℃×３０～６０分程度のオートクレーブまたはフィルタなどで滅菌処理したものを用いることができる。
　緩衝液とは、少量の酸や塩基を加えたり、多少濃度が変化したりしてもｐＨが大きく変化しないようにした水溶液をいう。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝液、クエン酸リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液などが挙げられる。緩衝液も前記した滅菌処理を行ったものを用いることができる。
　無菌エアとは、無菌フィルタＦを備えた無菌エア通気手段１９によって空気や酸素をろ過して雑菌などを除去したものをいう。つまり、無菌エアは、無菌エア通気手段１９によって供給される。なお、酸素は無菌フィルタを介して酸素ボンベなどから供給でき、必要に応じて前記したように空気（無菌エア）と混合することができる。
　無菌フィルタＦは、滅菌液１７の貯蔵タンクや無菌水１８の貯蔵タンクにも設けられている。これにより、これらのタンクが外気を取り込む場合であっても無菌性を維持できる。
　無菌サンプリング装置１は、サンプリング時は、切り替え機構１６で切り替えて、サンプリング流路２の出口側の開放端ノズル２ｂに向けて培養液５を送液する。そして、サンプリング時以外は、切り替え機構１６で切り替えて、滅菌液１７、無菌水１８、緩衝液および無菌エアのうちの少なくとも１つをサンプリング流路２の出口側の開放端ノズル２ｂに向けて送出する。このように、無菌サンプリング装置１は、切り替え機構１６を備えているので、サンプリング時のみ培養液５を送液することができる。そのため、無菌サンプリング装置１は、培養槽４からの培養液５の抜き取り量を少量化できる。
　切り替え機構１６は、前記した滅菌液１７などと培養液５とを切り替えることができればよく、特定の構成に限定されないが、例えば、以下のようにすると好適にこれらを切り替えることができる。
　図４に示すように、培養槽４には、細胞を含む培養液５が充填されており、第１実施形態と同様に、液中通気手段６および液面通気手段７により通気攪拌を行いながら、通常通りに培養温度、ＤＯおよびｐＨなどの制御を行って目的の細胞を培養する。なお、図４には図示していないが、培養槽４は、培地供給手段８や送液ポンプ３ｂを備えていてもよい。培養槽４が、液中通気手段６、液面通気手段７、培地供給手段８および送液ポンプ３ｂを備えるか否かは培養方式や細胞によってさまざまなので、必要に応じてこれらを任意に設定できる。培養方式としては、液体培地の添加タイミングで言えば、バッチ培養、流加培養、灌流培養などが挙げられ、攪拌方法で言えば、静置培養、通気培養、攪拌培養、振盪培養などが挙げられる。
　図４中のバルブＶ１～Ｖ７は、図中に図示しない制御装置によって開閉駆動を制御できる電磁弁またはピンチバルブである。配管チューブなどが可撓性を有する場合、配管チューブを押し挟んで流路を開閉するピンチバルブは、バルブ本体の中を液が流れないので液溜まりができず、配管チューブの交換に際しても簡便であり、好適である。このため、本実施形態では、サンプリング流路２を含め全ての配管チューブが可撓性を有する樹脂製であることが好ましい。また、本実施形態では、サンプリング流路２の出口側の開放端ノズル２ｂの位置を任意に移動させることができるチューブ稼働機構２０を備えている。
　細胞培養開始初期は、チューブ稼働機構２０によってサンプリング流路２の出口側の開放端ノズル２ｂが廃液容器１５に配置され、無菌水１８をサンプリング流路２に連続して送液する。このため、細胞培養開始初期は、バルブＶ１、Ｖ４、Ｖ６を閉状態、バルブＶ２、Ｖ３、Ｖ５、Ｖ７を開状態とする。無菌水１８の送液流量は液流量計９ｂで計測され、その計測値に基づいて送液ポンプ３ｄの出力を制御する。このときの無菌水１８の流量は、図２に示したように、サンプリング流路２における配管チューブ２ａの内径に応じて設定し、制御するとよい。
　そして、培養液５をサンプリングして分析する必要が生じた場合には、以下の操作フローで無菌サンプリングを行う。
（１）前記した細胞培養開始初期の状態からバルブＶ５、Ｖ７を閉じる。すなわち、バルブＶ１、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７は閉状態、バルブＶ２、Ｖ３は開状態とする。また、このバルブ操作とともに送液ポンプ３ｄを停止する。
（２）次に、バルブＶ４を開く。すなわち、バルブＶ１、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７は閉状態、バルブＶ２、Ｖ３、Ｖ４は開状態とする。これにより、無菌エア通気手段１９はサンプリング流路２に無菌エアを通気し、サンプリング流路２内に残留する液を廃液容器１５に廃棄できる。このときの無菌エアの流量も図２に示したように、サンプリング流路２における配管チューブ２ａの内径に応じて設定制御することが好ましい。また、無菌エアも他の流体と同様にサンプリング流路２の出口側の開放端ノズル２ｂに向けて圧力勾配が１ｋＰａ／ｍ以上となるように制御することが好ましい。
（３）次に、バルブＶ４を閉じる。すなわち、バルブＶ１、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７は閉状態、バルブＶ２、Ｖ３は開状態とする。また、チューブ稼働機構２０はサンプリング流路２の出口側の開放端ノズル２ｂをサンプリング容器１２に移動させる。
（４）そして、バルブＶ１を開く。すなわち、バルブＶ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７は閉状態、バルブＶ１、Ｖ２、Ｖ３は開状態とする。この状態で培養液５は必要量が培養槽４からサンプリングされる。このとき、液面通気手段７は培養槽４の気相部に通気する無菌エアの圧力を調整して、培養槽４から開放端ノズル２ｂまでのサンプリング流路２の長さに応じた差圧を設定する。このときの培養液５の流量も図２に示したように、サンプリング流路２における配管チューブ２ａの内径に応じて設定制御する。液流量は、液流量計９ｂで計測し、その結果に基づいて制御することもできる。また、培養液５は、サンプリング流路２の出口側の開放端ノズル２ｂに向けて圧力勾配が１ｋＰａ／ｍ以上となるように制御する。
（５）必要量のサンプリングが終わったらバルブＶ２を閉じる。すなわち、バルブＶ２、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７は閉状態、バルブＶ１、Ｖ３は開状態とする。また、チューブ稼働機構２０はサンプリング流路２の出口側の開放端ノズル２ｂを廃液容器１５に移動させる。
（６）そして、バルブＶ４を開ける。すなわち、バルブＶ２、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７は閉状態、バルブＶ１、Ｖ３、Ｖ４は開状態とする。これにより、無菌エア通気手段１９は配管チューブ２ａ内に無菌エアを通気し、培養槽４とバルブＶ１の配管内に残留する培養液５を培養槽４に返送できる。
（７）次に、バルブＶ１、Ｖ４を閉じ、バルブＶ２、Ｖ５、Ｖ６を開ける。すなわち、バルブＶ１、Ｖ４、Ｖ７は閉状態、バルブＶ２、Ｖ３、Ｖ５、Ｖ６は開状態とする。これにより、送液ポンプ３ｃは配管チューブ２ａ内に滅菌液１７を送液できる。なお、送液した滅菌液１７は廃液容器１５に廃棄される。このときの滅菌液１７の流量も図２に示したように、サンプリング流路２における配管チューブ２ａの内径に応じて設定制御することが好ましい。また、滅菌液１７は、サンプリング流路２の出口側の開放端ノズル２ｂに向けて圧力勾配が１ｋＰａ／ｍ以上となるように制御する。
（８）その後、バルブＶ６を閉じ、バルブＶ７を開ける。すなわち、バルブＶ１、Ｖ４、Ｖ６は閉状態、バルブＶ２、Ｖ３、Ｖ５、Ｖ７は開状態とする。これにより、送液ポンプ３ｄは配管チューブ２ａ内に無菌水１８を連続的に送液できる。なお、送液した無菌水１８は廃液容器１５に廃棄される。このときの無菌水１８の流量は図２に示したように、サンプリング流路２における配管チューブ２ａの内径に応じて設定制御する。また、無菌水１８は、サンプリング流路２の出口側の開放端ノズル２ｂに向けて圧力勾配が１ｋＰａ／ｍ以上となるように制御する。
（９）次いで、バルブＶ５、Ｖ７を閉じ、バルブＶ４を開ける。すなわち、バルブＶ１、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７は閉状態、バルブＶ２、Ｖ３、Ｖ４は開状態とする。これにより、無菌エア通気手段１９は配管チューブ２ａ内に無菌エアを通気し、配管チューブ２ａ内の残留液を廃液容器１５に廃棄できる。
（１０）その後、バルブＶ４を閉じ、バルブＶ５を開けるとともに、バルブＶ６またはバルブＶ７を開ける。すなわち、バルブＶ１、Ｖ４は閉状態、バルブＶ２、Ｖ３、Ｖ５ならびにバルブＶ６およびバルブＶ７のうちのいずれか一方は開状態（この場合、バルブＶ６およびバルブＶ７のうちのいずれか他方が閉状態）とする。これにより、滅菌液１７または無菌水１８をサンプリング流路２内に連続的に送液し、バルブＶ３以降のサンプリング流路２の無菌状態を維持する。このときの滅菌液１７または無菌水１８の流量も図２に示したように、サンプリング流路２における配管チューブ２ａの内径に応じて設定制御する。また、滅菌液１７または無菌水１８は、サンプリング流路２の出口側の開放端ノズル２ｂに向けて圧力勾配が１ｋＰａ／ｍ以上となるように制御する。滅菌液１７を送出する場合は、バルブＶ３以降のサンプリング流路２の無菌状態をより確実に維持できる。なお、この場合は、次のサンプリング工程を実施する際に上記（８）の工程を行い、配管チューブ２ａ内に無菌水１８を連続的に送液した後に、上記（１）以降の工程を実施することが望ましい。
　本実施形態は、以上の操作によって培養液５を無菌的にサンプリングできる。サンプリング流路２には、圧力付与装置３により、滅菌液１７、無菌水１８などの流体に対し、出口側の開放端ノズル２ｂに向けて圧力勾配が１ｋＰａ／ｍ以上、好ましくは１００ｋＰａ／ｍ以下、より好ましくは、例えば、１０ｋＰａ／ｍから３０ｋＰａ／ｍとなるように制御（流動圧力または流速を維持・制御）するので、簡易な構成かつ安価な構成でありながら、次回のサンプリングまでの間、無菌性を維持できる（サンプリング流路２の出口側の開放端ノズル２ｂからの雑菌のコンタミネーションを防止できる）。また、サンプリング中もサンプリング流路２には、圧力付与装置３により、流体である培養液５に対し、出口側の開放端ノズル２ｂに向けて圧力勾配が１ｋＰａ／ｍ以上、好ましくは１００ｋＰａ／ｍ以下、より好ましくは、例えば、１０ｋＰａ／ｍから３０ｋＰａ／ｍとなるように制御（流動圧力または流速を維持・制御）するので無菌性を維持できる。
　また、図４に示すように、第３実施形態に係る無菌サンプリング装置１は、サンプリング流路２に逆止弁２１を備えていることが好ましい。このように逆止弁２１を備えていると、無菌サンプリング装置１はサンプリング流路２における培養液５などの逆流を防止できる。従って、細胞培養装置３０が備えるいずれかの機器に不具合が生じたり、操作ミスなどが生じたりした場合であっても、雑菌に汚染された培養液５がサンプリング流路２を逆流して培養槽４を汚染することを防止できる。逆止弁２１の設置位置は任意であるが、計測装置９よりも下流とすることが好ましい。このようにすると、雑菌に汚染された培養液５が計測装置９を汚染するのを防止できる。言うまでもなく、逆止弁２１は、第１実施形態および第２実施形態でも同様にサンプリング流路２に備えることができる。
　なお、前記では、本実施形態において、細胞培養開始初期に、無菌水１８をサンプリング流路２に連続して送液することとしていた。これに対し、本実施形態においては次のような変形例とすることができる。
　一つの変形例として、無菌水１８に替えて、滅菌液１７をサンプリング流路２に送液することが挙げられる。この変形例では、バルブＶ１、Ｖ４、Ｖ７を閉状態、バルブＶ２、Ｖ３、Ｖ５、Ｖ６を開状態とする。また、滅菌液１７の送液流量は液流量計９ｂで計測し、その計測値に基づいて送液ポンプ３ｃの出力を制御して滅菌液１７の圧力勾配が１ｋＰａ／ｍ以上となるように制御する。培養液５をサンプリングする場合は、必要に応じてサンプリングの直前に無菌水１８でサンプリング流路２内をリンスするとよい。無菌水１８でのリンスは、バルブＶ１、Ｖ４、Ｖ６を閉状態、バルブＶ２、Ｖ３、Ｖ５、Ｖ７を開状態とすることで行える。
　また、他の変形例として、無菌水１８に替えて、無菌エアをサンプリング流路２に通気することが挙げられる。この変形例では、バルブＶ１、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７を閉状態、バルブＶ２、Ｖ３、Ｖ４を開状態とする。また、無菌エアの送気流量は圧力計９ａで計測し、その計測値に基づいて無菌エア通気手段１９の出力を制御して無菌エアの圧力勾配が１ｋＰａ／ｍ以上となるように制御することができる。
　これらのいずれの変形例によっても、流体の圧力勾配が１ｋＰａ／ｍ以上となるように制御しているので、細胞培養開始初期における無菌性を維持できる（雑菌のコンタミネーションを防止できる）。
［無菌サンプリング方法］
　次に、本実施形態に係る無菌サンプリング方法（以下、「本方法」と略すことがある）について説明する。なお、本方法の説明にあたり、既に説明した要素については同一の符号を付し、詳細な説明を省略する場合がある。
　本方法は、前記したサンプリング流路２と圧力付与装置３とを備える無菌サンプリング装置１による無菌サンプリング方法である。本方法は、前記した圧力付与装置３により、サンプリング流路２内の流体に対し、サンプリング流路２の出口側の開放端ノズル２ｂに向けて圧力勾配が１ｋＰａ／ｍ以上となるように制御する。従って、本方法は前述しているように、サンプリング流路２内の流体の圧力勾配が十分に高いので、雑菌がサンプリング流路２の出口側の開放端ノズル２ｂから侵入することができない。従って、本方法は、当該開放端ノズル２ｂからのコンタミネーションを防止できる。つまり、本方法は、無菌サンプリング装置１について、開放端ノズル２ｂを蒸気や火炎、消毒剤等で滅菌するための各種装置を設ける必要がない。このように、本方法は、簡易な構成かつ安価に無菌サンプリングを行うことができる。
　また、本方法は、サンプリング流路２に培養液５を送液したサンプリングの後、滅菌液１７、無菌水１８および緩衝液のうちの少なくとも１つを、培養液５と切り替えて送液することが好ましい。この切り替えは、前記した切り替え機構１６で行うことができる。このようにすると、本方法は、サンプリング時のみ培養液５を送液することができるので、培養槽４からの培養液５の抜き取り量を減らすことができる。
　以上、本発明に係る無菌サンプリング装置１および無菌サンプリング方法について実施形態により詳細に説明したが、本発明の主旨はこれに限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、前記した実施形態は本発明を分かり易く説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施形態の構成の一部を他の実施形態の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることも可能である。また、各実施形態の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
　１　　　無菌サンプリング装置
　２　　　サンプリング流路
　２ａ　　配管チューブ
　２ｂ、２ｃ、２ｄ　開放端ノズル
　３　　　圧力付与装置
　４　　　培養槽
　５　　　培養液
　６　　　液中通気手段
　６ａ　　配管チューブ
　７　　　液面通気手段
　７ａ　　配管チューブ
　８　　　培地供給手段
　８ａ　　配管チューブ
　９　　　計測装置
　９ａ　　圧力計
　９ｂ　　液流量計
　１０　　攪拌機
　１１　　スパージャ
　１２　　サンプリング容器
　１３　　フラクションコレクタ
　１４　　分析装置
　１５　　廃液容器
　１６　　切り替え機構
　１７　　滅菌液
　１８　　無菌水
　１９　　無菌エア通気手段
　２０　　チューブ稼働機構
　２１　　逆止弁
　３０　　細胞培養装置
　Ｖ１～Ｖ７、Ｖａ、Ｖｂ　バルブ

Claims (11)

  1. 　培養槽内の培養液を分析装置に供試するために抜出すサンプリング流路と、
    　前記サンプリング流路内に圧力を付与する圧力付与装置と、を備え、
    　前記圧力付与装置により、前記サンプリング流路内の流体に対し、前記サンプリング流路の出口側の開放端ノズルに向けて圧力勾配が１ｋＰａ／ｍ以上となるように制御することを特徴とする無菌サンプリング装置。
  2. 　請求項１に記載の無菌サンプリング装置において、
    　前記サンプリング流路に配置される配管チューブの内径が１．５ｍｍ以下であることを特徴とする無菌サンプリング装置。
  3. 　請求項１に記載の無菌サンプリング装置において、
    　前記サンプリング流路に、滅菌液、無菌水、緩衝液および無菌エアのうちの少なくとも１つと前記培養液との切り替えを行う切り替え機構を備えていることを特徴とする無菌サンプリング装置。
  4. 　請求項１に記載の無菌サンプリング装置において、
    　前記サンプリング流路に流動圧力または液流速を計測する計測装置を備え、
    　前記計測装置で計測した計測値に基づいて前記圧力付与装置を制御し、前記圧力勾配となるように前記流動圧力または前記液流速を制御することを特徴とする無菌サンプリング装置。
  5. 　請求項１に記載の無菌サンプリング装置において、
    　前記サンプリング流路が逆止弁を備えていることを特徴とする無菌サンプリング装置。
  6. 　請求項１に記載の無菌サンプリング装置において、
    　前記培養液の抜き出し時における流速がレイノルズ数２０００未満の層流領域であることを特徴とする無菌サンプリング装置。
  7. 　請求項１に記載の無菌サンプリング装置において、
    　前記圧力付与装置が、チューブポンプ、ダイアフラムポンプ、無菌エアを送気するエアポンプおよび無菌エアを送気するエアコンプレッサのうちの少なくとも１つであることを特徴とする無菌サンプリング装置。
  8. 　請求項２に記載の無菌サンプリング装置において、
    　前記配管チューブの材質が、フッ素樹脂、ポリテトラフルオロエチレン、テトラフルオロエチレン・エチレン共重合体、テトラフルオロエチレン・パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体、ポリエーテルエーテルケトンまたはポリエーテルエーテルケトンケトンであることを特徴とする無菌サンプリング装置。
  9. 　請求項２に記載の無菌サンプリング装置において、
    　前記配管チューブが、前記分析装置の直前に配置されていることを特徴とする無菌サンプリング装置。
  10. 　培養槽内の培養液を分析装置に供試するために抜き出すサンプリング流路と、前記サンプリング流路内に圧力を付与する圧力付与装置と、を備える無菌サンプリング装置による無菌サンプリング方法であり、
    　前記圧力付与装置により、前記サンプリング流路内の流体に対し、前記サンプリング流路の出口側の開放端ノズルに向けて圧力勾配が１ｋＰａ／ｍ以上となるように制御することを特徴とする無菌サンプリング方法。
  11. 　請求項１０に記載の無菌サンプリング方法において、
    　前記サンプリング流路に前記培養液を送液したサンプリングの後、滅菌液、無菌水および緩衝液のうちの少なくとも１つを、前記培養液と切り替えて送液することを特徴とする無菌サンプリング方法。
PCT/JP2021/002564 2021-01-26 2021-01-26 無菌サンプリング装置および無菌サンプリング方法 WO2022162722A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2021/002564 WO2022162722A1 (ja) 2021-01-26 2021-01-26 無菌サンプリング装置および無菌サンプリング方法
US18/267,523 US20240052283A1 (en) 2021-01-26 2021-01-26 Aseptic Sampling Apparatus and Aseptic Sampling Method

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2021/002564 WO2022162722A1 (ja) 2021-01-26 2021-01-26 無菌サンプリング装置および無菌サンプリング方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022162722A1 true WO2022162722A1 (ja) 2022-08-04

Family

ID=82654266

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2021/002564 WO2022162722A1 (ja) 2021-01-26 2021-01-26 無菌サンプリング装置および無菌サンプリング方法

Country Status (2)

Country Link
US (1) US20240052283A1 (ja)
WO (1) WO2022162722A1 (ja)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60227697A (ja) * 1984-04-25 1985-11-12 Hitachi Ltd 培養液のサンプリング方法および装置
JPS6480279A (en) * 1987-09-18 1989-03-27 Ube Industries Aseptic sampling apparatus for cell culture system
JPH05176752A (ja) * 1991-12-27 1993-07-20 Toyo Eng Corp サンプリング装置
JP2013526269A (ja) * 2010-05-11 2013-06-24 アルテリス ソシエテ アノニム 細胞培養装置および細胞培養方法
JP2016208864A (ja) * 2015-04-30 2016-12-15 株式会社日立製作所 細胞培養装置、及び弁機構部材
JP2019136005A (ja) * 2018-02-14 2019-08-22 日本光電工業株式会社 無菌サンプリング流路キット及びそれを用いた細胞培養装置

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60227697A (ja) * 1984-04-25 1985-11-12 Hitachi Ltd 培養液のサンプリング方法および装置
JPS6480279A (en) * 1987-09-18 1989-03-27 Ube Industries Aseptic sampling apparatus for cell culture system
JPH05176752A (ja) * 1991-12-27 1993-07-20 Toyo Eng Corp サンプリング装置
JP2013526269A (ja) * 2010-05-11 2013-06-24 アルテリス ソシエテ アノニム 細胞培養装置および細胞培養方法
JP2016208864A (ja) * 2015-04-30 2016-12-15 株式会社日立製作所 細胞培養装置、及び弁機構部材
JP2019136005A (ja) * 2018-02-14 2019-08-22 日本光電工業株式会社 無菌サンプリング流路キット及びそれを用いた細胞培養装置

Also Published As

Publication number Publication date
US20240052283A1 (en) 2024-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2022113884A (ja) 自己細胞治療製造用の細胞維持機
AU2012215514B2 (en) Pneumatic alternating pressure membrane cell separation system
US20070128087A1 (en) Device for automated bioreactor sampling
JP2019505240A (ja) 灌流バイオリアクタおよび連続細胞培養を実施するためのその使用方法
WO2011090781A1 (en) A single use cell culture bioreactor manifold system
CN209485753U (zh) 一种用于生物反应过程在线取样检测装置
US20240042426A1 (en) Device and method for producing individually processed fluid samples
WO2022162722A1 (ja) 無菌サンプリング装置および無菌サンプリング方法
TWI770040B (zh) 細胞培養容器的可消毒接合器、可消毒裝置的用途以及用於在搖動條件下細胞培養的方法
FI106561B (fi) Menetelmä ja laite mikrobiologisten näytteiden rikastamista ja tutkimista varten
JP2021019519A (ja) 無菌サンプリング装置
JPH05176752A (ja) サンプリング装置
Kadwell et al. Production of baculovirus-expressed recombinant proteins in wave bioreactors
KR20230062808A (ko) 샘플링 디바이스 및 시스템
CN110106084A (zh) 细胞培养装置及使培养基富氢的方法
Davis Hollow fiber cell culture
JP2023549325A (ja) 無菌サンプリングおよび液体付加のためのシステムおよび方法
Chen et al. Author Spotlight: Advancing Cell Therapy Manufacturing with Dissolvable Microcarriers
JP2023514354A (ja) 自動細胞培養用のシステム及び方法
US20210132099A1 (en) Device and method for continuous fluid sampling having a vent
SWAIN Microfluidics in assisted reproduction 31 technology
NZ614364B2 (en) Pneumatic alternating pressure membrane cell separation system
Gastrock et al. Protein‐Processing Platform (3P)–a New Concept for the Characterization of Cell Cultures in the mL‐Scale Using Microfluidic Components
Amer Identification of the critical cultivation parameters for scaling up the upstream process of recombinant human Follicle Stimulating Hormone production from Chinese Hamster Ovary cells
JPH02167065A (ja) 培養液採取装置，採取方法及び培養システム

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21922747

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 18267523

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21922747

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1