WO2022158583A1

WO2022158583A1 - 低フラン酸ダイズ

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Publication number: WO2022158583A1
Application number: PCT/JP2022/002307
Authority: WO
Inventors: 豊昭穴井; 啓史渡邊; 成人牧田; 遼岡部; 尚志荒井; 恵理奈肥山; 貴士佐野
Original assignee: Saga University NUC; J Oil Mills Inc
Current assignee: Saga University NUC; J Oil Mills Inc
Priority date: 2021-01-21
Filing date: 2022-01-14
Publication date: 2022-07-28
Anticipated expiration: 2023-07-21
Also published as: JP7820735B2; JPWO2022158583A1; CA3208445A1; US20240298599A1

Abstract

ダイズに含まれる油脂中のフラン酸含有量が低減された改変ダイズ、及びその用途等を提供する。本発明は、遺伝子変異によりダイズ含まれる油脂中のフラン酸の含有割合が低減された改変ダイズである。

Description

低フラン酸ダイズ

　本発明は、ダイズに含まれる油脂中のフラン酸含量が低減された改変ダイズ等に関する。

　ダイズは、世界的に主要な植物由来の食用油脂供給源である。油脂に含まれる脂肪酸の組成は、油脂の品質に直接的な影響を与えるため、ダイズにおいても脂肪酸組成の改変が品種改良の主要な課題となっている。
　一般に、食用油脂は、光や熱等によって劣化し、風味上問題になる臭いが発生する。特にダイズ油脂は、光の存在下で「明所臭（あるいは「曝光臭」）」と呼ばれる特有の臭いを発生したり、加熱調理等による「加熱臭」を発生したりする。そのため、ダイズ油脂を高い割合で含む食用油脂、あるいは、ダイズ油脂を含む食品等は、賞味に耐えうる品質を保証することができないとの指摘がある（特許文献１）。こういった明所臭や加熱臭の発生の要因としては、ダイズ油脂を構成する脂肪酸組成中の「フラン酸（フラン脂肪酸）」の分解物であると考えられている。

　先行技術文献
特許文献１：特許第４２９０２２２号公報

　このような状況下において、ダイズに含まれる油脂中のフラン酸含量（フラン酸の産生量）が低減された改変ダイズ等の開発が望まれていた。

　本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、改変ダイズ等を提供するものである。
（１）遺伝子変異によりダイズに含まれる油脂中のフラン酸の含有割合が低減された改変ダイズ。
（２）前記含有割合が０質量ｐｐｍ以上２０質量ｐｐｍ以下である、上記（１）に記載のダイズ。
（３）前記フラン酸が、３，４−ジメチル−５−ペンチル−２−フランノナン酸である、上記（１）又は（２）に記載のダイズ。

（４）Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子及び／又はＧｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子に変異が導入されたものである、上記（１）~（３）のいずれか１項に記載のダイズ。
（５）前記遺伝子に導入された変異が、ミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異及びヌル変異からなる群から選択されるいずれかの変異である、上記（４）に記載のダイズ。

（６）Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子に導入された変異が、
（ｉ）該遺伝子によりコードされるタンパク質の第４１０番目のアミノ酸残基をコードするコドンの塩基に生じた変異、
（ｉｉ）該遺伝子によりコードされるタンパク質の第６８８番目のアミノ酸残基をコードするコドンの塩基に生じた変異、又は
（ｉｉｉ）該遺伝子の第１７番目のエキソンとイントロンの境界に存在する塩基に生じた変異
である、上記（４）又は（５）に記載のダイズ。

（７）前記（ｉ）の変異が、グリシンのコドンからアスパラギン酸のコドンに置換される変異である、上記（６）に記載のダイズ。
（８）前記（ｉ）の変異が、Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子のｃＤＮＡにおける第１５１９番目の塩基であるＧ（グアニン）が、Ａ（アデニン）に置換された変異である、上記（７）に記載のダイズ。
（９）前記（ｉｉ）の変異が、アスパラギン酸のコドンからアスパラギンのコドンに置換される変異である、上記（６）に記載のダイズ。

（１０）前記（ｉｉ）の変異が、Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子のｃＤＮＡにおける第２３５２番目の塩基であるＧ（グアニン）が、Ａ（アデニン）に置換された変異である、上記（９）に記載のダイズ。
（１１）前記（ｉｉｉ）の変異が、Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子のｍＲＮＡ前駆体における第７１８０番目の塩基であるＧ（グアニン）が、Ａ（アデニン）に置換された変異である、上記（６）に記載のダイズ。
（１２）Ｇｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子に導入された変異が、該遺伝子によりコードされるタンパク質の第６４番目のアミノ酸残基をコードするコドンの塩基に生じた変異である、上記（４）又は（５）に記載のダイズ。

（１３）前記変異が、アルギニンのコドンからシステインのコドンに置換される変異である、上記（１２）に記載のダイズ。
（１４）前記変異が、Ｇｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子のｃＤＮＡにおける第４８３番目の塩基であるＣ（シトシン）が、Ｔ（チミン）に置換された変異である、上記（１３）に記載のダイズ。
（１５）フクユタカの改変ダイズである、上記（１）~（１４）のいずれか１項に記載のダイズ。

（１６）受託番号がＦＥＲＭ　ＢＰ−２２３９２であるＬＦ６５ダイズ。
（１７）受託番号がＦＥＲＭ　ＢＰ−２２４１３である１６ＳＮ２７９ダイズ。
（１８）上記（１）~（１７）のいずれか１項に記載のダイズ又はその処理物を含む、食品用、飼料用又は医薬組成物用の材料。

（１９）上記（１８）に記載の材料を含む、食品、飼料又は医薬組成物。
（２０）上記（１）~（１７）のいずれか１項に記載のダイズから抽出されたダイズ油脂。
（２１）上記（２０）に記載のダイズ油脂を含む、食品、飼料又は医薬組成物。
（２２）上記（１）~（１７）のいずれか１項に記載のダイズ同士、又は当該ダイズと他のダイズ種とを交雑させることを含む、改変ダイズの製造方法。
　発明の効果

　本発明により、ダイズに含まれる油脂中のフラン酸含量（フラン酸の産生量）低減された改変ダイズを提供することができる。当該改変ダイズ由来の食用油脂や当該食用油脂を含む食品等は、従来のダイズ油脂を含有するものとは異なり、ダイズ油脂特有の不快な明所臭が抑制され、加熱調理時等の加熱臭、特にダイズ油脂由来の刺激臭が抑制される。さらに、当該改変ダイズ由来の食用油脂は、従来のダイズ油脂よりも加熱時の粘度・色調・酸化上昇が抑制される。また、当該改変ダイズもしくは改変ダイズの処理物を含む食品等は、豆臭が抑制され良好な風味を有している。そのため、当該改変ダイズは有用性、実用性に優れたものである。

フクユタカ（原品種）及び変異４系統（変異体１~４）のフラン酸含量（Ｆ３／内部標準（ＩＳ）×１０００）を示す図（実施例１中の表１に示す結果に対応する図）である。トヨシロメと変異体１の交雑によって得られた分離集団を用いた変異遺伝子の座乗領域の同定の概要を示す図である。低フラン酸含量の表現型を持つ変異体１~３に関する、Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子に見いだされたＤＮＡ多型・塩基多型を示す図である。低フラン酸含量の表現型を持つ変異体４に関する、Ｇｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子（Ｇｌｙｍａ０４Ｇ０５４１００遺伝子）に見いだされたＤＮＡ多型を示す図である。高融解度曲線を利用したＰＣＲによる、変異体１（＃６５）が持つダイズ２０番染色体の４２，７２０，１１９番目のＤＮＡ多型を対象にした遺伝子型判別の結果を示す図である。変異体１（＃６５）が持つダイズ２０番染色体の４２，７２０，１１９番目のＤＮＡ多型とフラン酸含量との関連を示す図である。高融解度曲線を利用したＰＣＲによる、変異体２（１６ＳＮ２５３）が持つダイズ２０番染色体の４２，７１７，５８１番目のＤＮＡ多型を対象にした遺伝子型判別の結果を示す図である。変異体２（１６ＳＮ２５３）が持つダイズ２０番染色体の４２，７１７，５８１番目のＤＮＡ多型とフラン酸含量との関連を示す図である。高融解度曲線を利用したＰＣＲによる、変異体３（１６ＳＮ６９３）が持つダイズ２０番染色体の４２，７１７，９９８番目のＤＮＡ多型を対象にした遺伝子型判別の結果を示す図である。変異体３（１６ＳＮ６９３）が持つダイズ２０番染色体の４２，７１７，９９８番目のＤＮＡ多型とフラン酸含量との関連を示す図である。高融解度曲線を利用したＰＣＲによる、変異体４（１６ＳＮ２７９）が持つダイズ４番染色体の４，３４０，３７９番目のＤＮＡ多型を対象にした遺伝子型判別の結果を示す図である。変異体４（１６ＳＮ２７９）が持つダイズ４番染色体の４，３４０，３７９番目のＤＮＡ多型とフラン酸含量との関連を示す図である。

　以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２０２１−００７７９５号明細書（令和３年（２０２１年）１月２１日付け出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。

１．改変ダイズ
　本発明においては、前述のとおり、遺伝子変異によりダイズに含まれる油脂中のフラン酸の含有割合が低減された改変ダイズ（以下、「本発明のダイズ」又は「本発明の改変ダイズ」と称することがある）が提供される。
　本発明において、「ダイズ」とは、ダイズの植物個体の全体又は一部を意味し、植物個体のほか、該植物個体の器官（種子等）、該植物個体由来の細胞又は細胞小器官などの部分構造体を意味する場合もある。

　本発明において、「遺伝子変異」とは、遺伝子組換えによる変異（遺伝子組換え技術による遺伝的性質の改変）であってもよいし、非遺伝子組換え型の変異、例えば、ランダム変異やゲノム編集等による変異であってもよく、限定はされない。ランダム変異としては、薬剤（例えば、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、ニトロソメチル尿素、ニトロソメチルウレタン等）での処理、紫外線の照射による変異や、Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ^ＴＭ　ＰＣＲ法、エラープローン（Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ法、ローリングサークル型増幅（Ｒｏｌｌｉｎｇ　Ｃｉｒｃｌｅ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＲＣＡ）法、エラープローンＲＣＡ法、又は公知の各種ランダム変異導入キットなどを用いて導入する変異など、特に限定はされず、適宜採用することができる。

　また、上記の各手法により、遺伝子に導入される変異としては、例えば、ミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異及びヌル変異からなる群から選択されるいずれか１種の変異であってもよいし、２種以上を組み合わせた変異であってもよく、限定はされない。ここで、「ミスセンス変異」とは、核酸配列のコドン内の塩基の変化又は置換により、そのコドンにコードされるアミノ酸の種類が変化する変異を意味する。また、「ナンセンス変異」とは、核酸配列のコドン内の変化又は置換により、そのコドンが終止コドンに変化し、そのコドンよりも３’側のＯＲＦ領域が翻訳されなくなる変異を意味するものである。ナンセンス変異は、終止変異とも呼ばれる。また、「フレームシフト変異」とは、塩基の挿入又は欠失により、その挿入又は欠失部位よりも３’側の領域でコドンの読み枠がずれる変異を意味する。さらに、「ヌル変異」とは、そのタンパク質をコードするヌクレオチド配列が完全に欠失しているか、又はヌクレオチド配列が存在していても機能性タンパク質を発現できない変異を意味する。

　本発明において、遺伝子変異を生じさせる前のダイズ（本発明の改変ダイズの元となるダイズ）としては、遺伝子組換え等による遺伝的性質の改変を全く経ていないダイズ育種（すなわちダイズ原種）であってもよいし、そのようなダイズ原種に何らかの遺伝的性質の改変が導入されることにより品種改良等がなされたダイズ品種であってもよく、限定はされず、例えば、「フクユタカ」、「トヨシロメ」、「むらゆたか」、「Ｂａｙ」といったダイズ品種が挙げられる。
　本発明の改変ダイズは、ダイズに含まれる油脂中のフラン酸の含有割合が低減されたものであることを特徴とし、当該含有割合は、例えば、０質量ｐｐｍ以上２０質量ｐｐｍ以下であることが好ましく、０質量ｐｐｍ以上１５質量ｐｐｍ以下、０質量ｐｐｍ以上１０質量ｐｐｍ以下、０質量ｐｐｍ以上５質量ｐｐｍ以下、０質量ｐｐｍ以上３質量ｐｐｍ以下、０質量ｐｐｍ以上１質量ｐｐｍ以下であってもよく、さらには０質量ｐｐｍであってもよい。

　本発明の改変ダイズにおいて低減されたフラン酸としては、限定はされないが、下記構造式で示される、３，４−ジメチル−５−ペンチル−２−フランノナン酸（「Ｆ３」とも称する）であることが好ましい。

　本発明の改変ダイズは、好ましくは、Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子及び／又はＧｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子に変異が導入されたもの（又は、当該変異を含むもの）である。ここで、「変異が導入されたもの」や「変異を含むもの」とは、ダイズ細胞内に変異遺伝子が保持されることを意味し、好ましくは、該変異遺伝子が該ダイズのゲノム中に保持されることを意味する。また、当該変異は、上記遺伝子の機能欠失型変異であってもよい。
　上記Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子、及びＧｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子の詳細については、例えば、公知の各種データベースの１つである、「Ｊｏｉｎｔ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＪＧＩ）」（ｈｔｔｐｓ：／／ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ／）のウェブサイト中の「Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ」（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ／ｐｚ／ｐｏｒｔａｌ．ｈｔｍｌ）において、当該遺伝子のゲノム配列情報やｃＤＮＡの塩基配列情報、及び当該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列情報や当該アミノ酸配列をコードする塩基配列領域（ＣＤＳ）の情報などが登録されている。

　本発明においては、上記Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示し、Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。また、Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子のｍＲＮＡ前駆体の塩基配列（ゲノムＤＮＡ配列の表記をＲＮＡに変換（チミン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）に変換）した配列）を配列番号５に示す。
　なお、Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子は、上記データベース（Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ）の版がＷｍ８２．ａ２．ｖ１では、遺伝子名が「Ｇｌｙｍａ．２０Ｇ２０１４００．１」又は「Ｇｌｙｍａ．２０Ｇ２０１４００」と表記されている。
　他方、上記Ｇｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号３に示し、Ｇｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。
　なお、Ｇｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子は、上記データベース（Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ）の版がＷｍ８２．ａ２．ｖ１では、遺伝子名が「Ｇｌｙｍａ．０４Ｇ０５４１００．１」又は「Ｇｌｙｍａ．０４Ｇ０５４１００」と表記されている。

　上記Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子に導入される変異としては、限定はされないが、例えば、下記（ｉ）~（ｉｉｉ）の遺伝子変異が挙げられる。

　（ｉ）該遺伝子によりコードされるタンパク質の第４１０番目のアミノ酸残基をコードするコドンの塩基に生じた変異。
　ここで、当該（ｉ）の変異は、例えば、グリシンのコドンからアスパラギン酸のコドンに置換される変異が好ましく挙げられる。詳しくは、Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号１）における第１５１９番目の塩基であるＧ（グアニン）がＡ（アデニン）に置換された変異が挙げられる。

　（ｉｉ）該遺伝子によりコードされるタンパク質の第６８８番目のアミノ酸残基をコードするコドンの塩基に生じた変異。
　ここで、当該（ｉｉ）の変異は、例えば、アスパラギン酸のコドンからアスパラギンのコドンに置換される変異が好ましく挙げられる。詳しくは、Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号１）における第２３５２番目の塩基であるＧ（グアニン）が、Ａ（アデニン）に置換された変異が挙げられる。

　（ｉｉｉ）該遺伝子の第１７番目のエキソンとイントロンの境界に存在する塩基に生じた変異。
　ここで、当該（ｉｉｉ）の変異は、例えば、該遺伝子の第１７番目のエキソンの直後に位置するイントロンとの境界を定める塩基に生じた変異が挙げられ、好ましくは、Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子のｍＲＮＡ前駆体（配列番号５）における第７１８０番目~第７２６８番目の塩基により特定さるイントロンの境界を指定する「ＧＵ」（第７１８０~７１８１番目）及び「ＡＧ」（第７２６７~７２６８番目）の少なくとも１つ以上の塩基に導入される変異が挙げられ、より好ましくは、該ｍＲＮＡ前駆体（配列番号５）における第７１８０番目の塩基であるＧ（グアニン）が、Ａ（アデニン）に置換された変異が挙げられる。

　Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子に上記（ｉ）の変異が導入された本発明の改変ダイズの例としては、「＃６５」系統（以下、「ＬＦ６５」とも称する）のダイズ品種が挙げられ、当該ダイズ品種は、受託番号「ＦＥＲＭ　ＢＰ−２２３９２」として、独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター（〒２９２−０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８　１２０号室）に、２０２０年７月１６日付けで、国際寄託されている。また、上記（ｉｉ）の変異が導入された本発明の改変ダイズの例としては、「１６ＳＮ２５３」系統のダイズ品種が挙げられ、上記（ｉｉｉ）の変異が導入された本発明の改変ダイズの例としては、「１６ＳＮ６９３」系統のダイズ品種が挙げられる。

　他方、上記Ｇｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子に導入される変異としては、限定はされないが、例えば、該遺伝子によりコードされるタンパク質の第６４番目のアミノ酸残基をコードするコドンの塩基に生じた変異が挙げられる。
　ここで、当該変異は、例えば、アルギニンのコドンからシステインのコドンに置換される変異が好ましく挙げられる。詳しくは、Ｇｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号３）における第４８３番目の塩基であるＣ（シトシン）が、Ｔ（チミン）に置換された変異が挙げられる。
　Ｇｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子に上記変異が導入された本発明の改変ダイズの例としては、「１６ＳＮ２７９」系統（以下、「１６ＳＮ２７９」とも称する）のダイズ品種が挙げられ、当該ダイズ品種は、受託番号「ＦＥＲＭ　ＢＰ−２２４１３」として、独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター（〒２９２−０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８　１２０号室）に、２０２１年１月１４日付けで、国際寄託されている。

２．用途
　本発明においては、前述の本発明の改変ダイズ又はその処理物を含む、食品用、飼料用又は医薬組成物（若しくは医薬品）用の材料が提供される。また、本発明においては、前述の本発明のダイズから抽出されるダイズ油脂も提供される。さらに本発明においては、上記材料や上記ダイズ油脂を含む、食品、飼料又は医薬組成物（若しくは医薬品）も提供される。
　「ダイズの処理物」とは、ダイズに、例えば酵素処理、粉末化、乾燥、加熱、凍結、精製などの処理を施して得られるものを意味する。ダイズの処理物の具体例としては、全脂ダイズ粉、脱脂ダイズ粉、ダイズタンパク質等が挙げられる。

　「食品」とは、栄養素の摂取や嗜好を目的として飲食される物を意味する。ダイズは、古くから食品として摂取されている。本発明のダイズは、枝豆のように生鮮食品として食べてもよく、納豆のように発酵食品として食べてもよく、乾燥豆、味噌、醤油、豆腐、ゆば、豆乳、きな粉のように加工食品として飲食してもよい。前記ダイズの処理物を材料とする食品に制限はないが、例えば、ハンバーグ、パティ、餃子、唐揚げ、ソーセージ、コロッケ、ナゲット、シュウマイ、トンカツ、チキンフィレ肉、ミンチ肉、チャーハン等の米飯類の肉具材、即席麺の肉具材等の食肉加工食品に含まれる食肉の一部もしくは全部をダイズ処理物に置き換えた食品、クッキー、ケーキ、ドーナツ、パン等のベーカリー食品等が挙げられる。ダイズ油脂の用途に制限はないが、例えば、揚げ油、炒め油、炊飯油、かけ油等に使用できる。ダイズ油脂を含む食品としては、揚げ物、炒め物、米飯、米菓、麺、マヨネーズやドレッシングなどの調味料、粉末油脂、マーガリンやショートニングなどの加工油脂食品等が挙げられる。本発明のダイズは、ダイズ油脂中のフラン酸が低減され、明所臭や加熱臭が抑制されたものであるため、飲食への利用に消費者の抵抗が少ないものと期待される。また、サプリメント、健康機能食品、特定保健用食品の材料として、本発明のダイズを使用することもできる。

　「飼料」とは、飼育動物に餌として与えられる物を意味し、「飼育動物」には、家畜、家禽、養魚、ペットなどが含まれる。ダイズは、ウシ、ブタ、ニワトリなどの家畜、家禽用の飼料やペットフードに広く用いられている。
　「医薬組成物」（又は「医薬品」）とは、人や動物などの対象に投与することにより、対象の疾病の診断、治療又は予防を行うための物を意味し、このような効能が得られる限りにおいて医薬部外品を含み得る。ダイズに含まれるイソフラボンは、エストロゲン受容体に対してアゴニスト作用を示すことが知られており、骨粗鬆症の治療薬としても用いられている。

３．品種交雑
　本発明のダイズの特徴を有する新種の改変ダイズは、本発明のダイズ（ダイズ種）同士、あるいは本発明のダイズ（ダイズ種）と他のダイズ種と交雑させることにより製造（作出）することができる。このようにして得られる新たな改変ダイズも、前記２．項等で述べたように、ダイズに含まれる油脂中のフラン酸の含有割合が低減されたという特徴を有するものである。
　好ましくは、本発明のダイズ種を他のダイズ種と交雑させることにより、Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子及び／又はＧｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子に変異（機能欠失型変異など）が導入された、新種の改変ダイズを作製することができる。例えば、本発明のダイズ種を、特定の害虫及び／又は栽培条件に耐性を有する他のダイズ種と交雑させることにより、ダイズに含まれる油脂中のフラン酸含有量が低減され、かつ特定の害虫及び／又は栽培条件に耐性を有する新種のダイズを作製することができる。

　本発明において、「交雑」とは、遺伝的組成の異なる２個体間の交雑であって、その結果として雑種が形成されることを意味する。交雑方法としては、戻し交雑が好ましい。交雑によって得られる新種ダイズにおいて低フラン酸含有量を実現するためには、該新種ダイズを本発明のダイズ種と戻し交雑することにより、Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子変異やＧｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子変異のホモ接合体を得る必要がある。「戻し交雑」とは、変異をもった親Ａと持たない親Ｂ（フクユタカなどの既存のダイズ品種）との間に生まれた子を親Ｂ（フクユタカなどの既存のダイズ種）と交雑させて、変異型遺伝子を保持し、かつ親Ｂの特性を有する子孫を得る方法である。

４．スクリーニング方法
　本発明のダイズは、好ましくは、Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子及び／又はＧｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子に変異を有するので、これらのいずれかの遺伝子（又は両方の遺伝子）の変異を検出することにより、ダイズに含まれる油脂中のフラン酸含有割合が低減された特徴を有するダイズをスクリーニングすることができる。

　変異遺伝子の検出方法としては、
　（ａ）本発明の改変ダイズが有するＧｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子及び／又はＧｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子の変異部位の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ、及び／又は前記遺伝子の塩基配列及びその相補配列の少なくとも一方を増幅したときの増幅断片中に前記変異部位が含まれるように作製されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて被検ダイズのＧｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子及び／又はＧｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子について増幅処理及び／又はハイブリダイゼーション処理を行う工程、並びに、
　（ｂ）前記処理物を分析することにより変異部位を検出する工程
を含む方法が挙げられる。

　このような検出方法の具体例としては、ＰＣＲ法、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法、シーケンス法、マイクロアレイ法などの公知の方法が挙げられ、特に、機能欠失型変異が一塩基多型（ＳＮＰ）である場合には、インベーダー法やＴＩＬＬＩＮＧ法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　ＰＣＲ法の場合、３’末端部分が変異部位の塩基配列に相補的な配列を有するようなプライマーを作製することが好ましい。このように設計されたプライマーを用いると、鋳型となるサンプルが変異を有する場合には、プライマーが完全に鋳型にハイブリダイズするため、ポリメラーゼ伸長反応が進むが、鋳型が変異を有しない場合には、プライマーの３’末端のヌクレオチドが鋳型とミスマッチを生じるので、伸長反応は起こらない。したがって、このようなプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅産物をアガロースゲル電気泳動などによって分析し、所定のサイズの増幅産物が確認できれば、サンプルである鋳型が変異を有していることになり、増幅産物が存在しない場合には、鋳型が変異を有していないものと判断できる。ＰＣＲ及びアガロースゲル電気泳動については、以下を参照：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ　ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ。

　ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法とは、蛍光標識したアレル特異的オリゴとＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ反応とを利用した方法である（Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．１４，１４３（１９９９）；Ｍｏｒｒｉｓ　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３４，２９３３（１９９６））。
　シークエンス法とは、変異を含む領域をＰＣＲにて増幅させ、Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒなどを用いてＤＮＡ配列をシークエンスすることで、変異の有無を解析する方法である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ　ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）。
　ＤＮＡマイクロアレイは、ヌクレオチドプローブの一端が支持体上にアレイ状に固定されたものであり、ＤＮＡチップ、Ｇｅｎｅチップ、マイクロチップ、ビーズアレイ等を含むものである。ＤＮＡチップなどのＤＮＡマイクロアレイアッセイとしてはＧｅｎｅＣｈｉｐアッセイが挙げられる（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社；米国特許第６，０４５，９９６号、同第５，９２５，５２５号、及び同第５，８５８，６５９号参照）。ＧｅｎｅＣｈｉｐ技術は、チップに貼り付けたオリゴヌクレオチドプローブの小型化高密度マイクロアレイを利用するものである。

　インベーダー法とは、ＳＮＰ等の遺伝子多型のそれぞれのアレルに特異的な２種類のレポータープローブ及び１種類のインベーダープローブの鋳型ＤＮＡへのハイブリダイゼーションと、ＤＮＡの構造を認識して切断するという特殊なエンドヌクレアーゼ活性を有するＣｌｅａｖａｓｅ酵素によるＤＮＡの切断を組み合わせた方法である（Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１４，１４３−１４９（１９９９）；Ｍｏｒｒｉｓ　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３４，２９３３（１９９６）；Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ，Ｖ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０，７７８−７８３（１９９３）等）。
　ＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｌｏｃａｌ　Ｌｅｓｉｏｎｓ　ＩＮ　Ｇｅｎｏｍｅｓ）法とは、変異導入した突然変異体集団のゲノム中の変異ミスマッチをＰＣＲ増幅とＣＥＬ　Ｉヌクレアーゼ処理によってスクリーニングする方法である。ＣＥＬ　Ｉヌクレアーゼとは、二本鎖ＤＮＡのミスマッチ部分を特異的に切断するエンドヌクレアーゼである。サンプルが、Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子及び／又はＧｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子に変異を含む場合、上記ＰＣＲ産物にはミスマッチ部分が生じるが、変異を含まない場合には、ミスマッチは生じない。従って、変異が存在する場合には、ＰＣＲ産物のミスマッチペア部位が切断されることになり、変異が存在しない場合には、ＰＣＲ産物は切断されない。従って、ＣＥＬ　Ｉヌクレアーゼ処理したＰＣＲ産物をアガロース電気泳動などで分析し、核酸配列の長さを比較することにより、変異の有無を容易に確認することができる。ＣＥＬ　Ｉヌクレアーゼの詳細については、以下の文献を参照できる：Ｏｌｅｙｋｏｗｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．２０，４５９７−４６０２（１９９８）。

　上記に例示される変異検出方法においては、Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子及び／又はＧｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子の変異部位を含むように作製されたオリゴヌクレオチドが、プローブ又はプライマーとして使用される。従って、本発明は、Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子及び／又はＧｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子の変異部位を含むように作製されたオリゴヌクレオチドも提供される。
　インベーダー法によってＧｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子及び／又はＧｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子の変異を検出する場合、用いるプライマー若しくはプローブは、ＳＮＰ部位が当該プライマー若しくはプローブの塩基配列の３’若しくは５’端に存在するように設計し、又は相補配列の３’若しくは５’端に存在するように設計し、又は前２者（プライマー若しくはプローブ、又は相補配列）の３’若しくは５’端から４塩基内、好ましくは２塩基内に存在するように設計する。あるいは、オリゴヌクレオチドの塩基配列全長の中央にＳＮＰが存在するように設計する。「中央」とは、ＳＮＰの塩基よりも５’端に向かう塩基の数と、３’端に向かう塩基の数とがほぼ同数となる中心部の領域をいい、オリゴヌクレオチドの塩基数が奇数の場合は、「中央」は、中心部の５塩基が好ましく、より好ましくは中心部の３塩基、さらに好ましくは最も中心部の１塩基である。また、オリゴヌクレオチドの塩基数が偶数の場合は、「中央」は、中心部の４塩基が好ましく、より好ましくは中心部の２塩基である。

　また、本発明のオリゴヌクレオチドをインベーダー法にアレルプローブとして使用する場合、該オリゴヌクレオチドは、変異部位を含むＧｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子及び／又はＧｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子、あるいはその相補配列とハイブリダイズする断片と、ハイブリダイズしない断片（フラップ部分）とが前記変異部位の遺伝子配列又はその相補配列を介して結合したものであることが好ましい。
　本発明のオリゴヌクレオチドをサンプル中の核酸分子にハイブリダイズさせる場合、そのハイブリダイゼーション反応は、ストリンジェントな条件下で行われる。
　本発明のオリゴヌクレオチドの塩基配列の長さは、少なくとも１０塩基となるように設計することが好ましく、より好ましくは１０~２００塩基、さらに好ましくは１５~１５０塩基、最も好ましくは１８~８０塩基である。当該オリゴヌクレオチド配列は、被検遺伝子を検出するためのプローブとして使用することができ、またフォワード（センス）プライマー及びリバース（アンチセンス）プライマーのどちらに使用してもよい。

　以上のように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー又はオリゴヌクレオチドプローブは、公知の手段・方法により化学合成することができるが、一般には、市販の化学合成装置を使用して合成される。
　なお、プローブには、予め蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＶＩＣ、Ｒｅｄｍｏｎｄ　Ｄｙｅ等）及び蛍光標識に対するクエンチャーを付加して作業の自動化を図ることも可能である。

５．マイクロアレイ
　前述した本発明のオリゴヌクレオチドの一端をガラス、シリコン、ゲルなどの支持体に固定することでマイクロアレイを作製することができる。オリゴヌクレオチドのアレイは、例えば固相化学合成法と半導体産業において用いられているフォトリソグラフィー製造技術とを組み合わせた光照射化学合成法（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）により製造される。チップの化学反応部位の境界を明確するためにフォトリソグラフィーマスクを利用し、特定の化学合成工程を行うことによって、アレイの所定の位置にオリゴヌクレオチドプローブが貼り付けられた高密度アレイを構築することができる。

６．キット
　本発明の別の態様においては、本発明のオリゴヌクレオチド及び／又は該オリゴヌクレオチドを用いて作製したマイクロアレイを含む、Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子及び／又はＧｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子の変異検出用キットが提供される。このようなキットには、本発明のオリゴヌクレオチド又は該オリゴヌクレオチドを用いて作製したマイクロアレイ以外にも、検出反応用の溶液、コントロール用のオリゴヌクレオチド、検出反応に利用する容器、使用説明書などが含まれていてもよい。

　以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は、本発明の例示を目的とするものであり、本発明を限定するものではない。

＜低フラン酸ダイズ変異系統の作製＞

１．植物材料
　材料として使用したダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒ．）品種は以下の通りである。
　（ｉ）　フクユタカ
　（ｉｉ）　トヨシロメ
　変異集団の作製にはダイズ品種フクユタカを用いた。変異原として０．３％のエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）水溶液中にダイズ種子（Ｍ０種子）を１晩浸漬した後、流水中で８時間すすぐことにより得られたＭ１種子を圃場に播種し、常法に従ってＭ１個体を栽培した。稔性を保持していた植物体については個体当たり１粒ずつのＭ２種子を回収し保存した。翌年、保存しておいたＭ２種子を、再度圃場に播種しＭ２個体を栽培した。各Ｍ２個体から得られたＭ３種子を個体別に回収した２８３１系統を、低フラン酸含量の変異系統の選抜に用いた。トヨシロメ、フクユタカは別途、下記に記載された手順に従って変異系統との交配を行い、分離集団の育成に用いた。なお、上記の「Ｍ０」は変異を起こす前の元の品種を表し、「Ｍ１」は変異を起こした当初の世代であり、その後の世代が順に「Ｍ２」、「Ｍ３」となる。

２．フラン酸の分析方法
　ダイズ種子の種子粉末１００~５００ｍｇを秤量し、５ｍｌのヘキサンを加えて激しく攪拌した後、６０℃のアルミブロック（ＴＡＩＴＥＣ：ＤＴＣ−１ＣＮ）上で３０分間、保温した。次に、超音波洗浄機（ＳＨＡＲＰ：ＵＴ−２０４）中で３０分間超音波処理をした後、定性ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ：Ｎｏ．１　φ８２ｍｍ）を用いてろ過し、ろ液を回収した。残渣に再び５ｍｌのヘキサンを加えて攪拌、６０℃の保温、超音波洗浄機を用いた抽出を繰り返し、ろ液を再度回収した。ガス吹きつけユニット（ＴＡＩＴＥＣ：ＥＮ１−２５）を用いて約３０分間空気を吹きつけ、ろ液中に含まれるヘキサンを完全に揮発させた。遠心管中の油脂を回収しダイズ油脂のメチルエステル化に供試した。

　４ｍｇのダイズ油脂を秤量し、６００μｌの０．２Ｍ　ＫＯＨ−ＭｅＯＨを加えて混合した。８０μｌの２Ｍ　ＨＣｌを加え１分間混合した後、内部標準（ベヘン酸メチル−ｄ３、濃度１０μｇ／ｍｌ）を加えたヘキサン溶液を６００μｌ加え２分間混合した。１３０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、５００μｌの上層を新しい１．５ｍｌチューブに移した。そのチューブに５００μｌの滅菌水を加えて１分間混合し、１３０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、１００μｌの上層をガラスバイアルに移し、ガスクロマトグラフ質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　５９７７Ａ）の分析試料とした。

　調製した試料の１μＬを、ガスクロマトグラフ質量分析計へスプリットレスで分析した。機器の分析条件は、ヘリウムガスをキャリアガスとして約１ｍｌ／ｍｉｎの流量、ＨＰ−８８（Ａｇｉｌｅｎｔ：φ０．２５ｍｍ×６０ｍ）カラムを使用し、分析時間２０分間、注入口温度が２５０℃、質量分析計接続部温度が２３０℃、イオン源温度が２３０℃、四重極の質量フィルタ温度を１５０℃に設定した。分析時間中のカラムオーブンの温度条件は、１００℃で１分間保持した後に２０℃／ｍｉｎで２００℃まで５分間かけて昇温させ、その後、１０℃／ｍｉｎで２４０℃まで４分間かけて昇温させ、２４０℃で４分間保持した。その後、１０℃／ｍｉｎで２５０℃まで１分間かけて昇温させ、５分間保持した。
　得られたクロマトグラム、マススペクトルデータから内部標準（ＩＳ：分子量３５７）とフラン酸（Ｆ３（３，４−ジメチル−５−ペンチル−２−フランノナン酸）：分子量３３６）のピーク面積を求め、その比を表現型データとして用いた。

３．変異体のスクリーニング：
　ダイズ品種フクユタカで作製した突然変異集団２８３１系統から、上記の手法を用いて各系統のフラン酸を分析し、４系統（変異体１~４）をフラン酸の産生量に関する変異系統として同定した。異なる個体に由来する種子を用いた反復実験から、同定した４系統が持つ変異が遺伝的に固定していることを確認した（表Ａ、図１）。

４．変異遺伝子が座乗する染色体領域の同定
　ダイズ突然変異集団から選抜した変異系統の持つ変異遺伝子を同定するために遺伝分析を行った。変異体１とトヨシロメを人工交配によって交配し、雑種種子を得た。交配は晴天時の午前中に行った。開花前日のトヨシロメの花を母親に、開花当日の変異体１の花から得た花粉を父親に用いた。具体的には、開花前日のトヨシロメの花について、がく、花びら（旗弁、翼弁、竜骨弁）をピンセットで取り除き、葯が裂開していないことを目視で確認後、葯を取り除き、柱頭のめしべを露出させた。当日開花した変異体１の花からおしべと柱頭をピンセットで取り出し、葯が裂開していることを目視で確認した後に、おしべの先端（花粉）を用意した母親（トヨシロメ）のめしべの先端へ軽く触れ、受粉を行った。得られた雑種個体（Ｆ１個体）を栽培し、自殖種子を得てこれを分離集団（Ｆ２集団）として、８２個体を栽培した。

　トヨシロメと変異体１の交配によって得られた分離集団の８２個体の葉から、Ｙａｍａｇａｔａ，Ｙ．ｅｔ　ａｌ，Ｂｒｅｅｄ．Ｓｃｉ．，２０１８（以下、文献Ａ）に記載されている方法でＤＮＡの抽出を行った。文献Ａに記載されているトヨシロメとフクユタカの間で多型を示すＤＮＡマーカーならびに遺伝子型の検出技術を利用して、各個体の持つ遺伝子型を決定した。また各Ｆ２個体の自殖種子を用いて、上記の方法によって、フラン酸含量を分析した。各個体の持つ遺伝子型情報とフラン酸含量の表現型データから、Ｍｄ．Ａｂｄｕｒ　Ｒａｕｆ　Ｓａｒｋａｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｒｅｅｄ．Ｓｃｉ．，２０２０（以下、文献Ｂ））に記載されている統計解析手法を用いて、各個体の遺伝子型と表現型に最も関連性が高い染色体領域を同定した。遺伝分析の結果、ダイズ２０番染色体の４１．０００．０００塩基（４１Ｍ）から４５．０００．０００（４５Ｍ）塩基の領域で、変異体１の持つ低フラン酸含量の特性に関して高い統計値（ＬＯＤスコア）を示し、４３．３Ｍｂｐ付近で最も高い統計値を示した。このことから、この領域内に低フラン酸含量に関与する変異遺伝子を位置づけた（図２）。なお、上記文献Ａ及びＢの詳細は、以下の通りである。

　文献Ａ：Ｙａｍａｇａｔａ，Ｙ．，Ａ．Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｔ．Ａｎａｉ，ａｎｄ　Ｓ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｃｒｉｔｅｒｉａ　ｆｏｒ　ＳＮＰ　ｌｏｃｉ　ｔｏ　ｍａｘｉｍｉｚｅ　ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ　ｏｆ　ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｍｅｌｔｉｎｇ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　ｐｌａｎｔ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ．Ｂｒｅｅｄ．Ｓｃｉ．６８：４８８−４９８，２０１８．
　文献Ｂ：Ｍｄ．Ａｂｄｕｒ　Ｒａｕｆ　Ｓａｒｋａｒ，Ｗａｋａｎａ　Ｏｔｓｕ，Ａｋｉｈｉｒｏ　Ｓｕｚｕｋｉ，Ｆｕｍｉｏ　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔｏｙｏａｋｉ　Ａｎａｉ，Ｓａｔｏｓｈｉ　Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｓｉｎｇｌｅ−ｂａｓｅ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｉｎ　ＧｍＣＨＲ５　ｉｎｃｒｅａｓｅｓ　ｔｈｅ　ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ−ｔｏ−ｄａｉｄｚｅｉｎ　ｒａｔｉｏ　ｉｎ　ｓｏｙｂｅａｎ　ｓｅｅｄ．Ｂｒｅｅｄ．Ｓｃｉ．７０：２６５−２７６，２０２０．

５．フラン酸含量の減少の原因となるＤＮＡ多型の同定
　変異体１~４、フクユタカ、トヨシロメを対象に、次世代シークエンス解析によって全ゲノム塩基配列解析を行った。各個体の葉から抽出したＤＮＡをＮｏｖｏｇｅｎｅ社ＮＧＳ受託解析サービスに送付し、各系統あたり１７０億塩基のゲノム情報を取得した。公共のデータベースである、「Ｊｏｉｎｔ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＪＧＩ）」（ｈｔｔｐｓ：／／ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ／）のウェブサイト中の「Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ」（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ／ｐｚ／ｐｏｒｔａｌ．ｈｔｍｌ）から、ダイズのゲノム情報（Ｇｍａｘ＿１８９＿ｈａｒｄｍａｓｋｅｄ．ｆａ）を取得し、変異体１~４、フクユタカ、トヨシロメの次世代シークエンス解析から得られた塩基配列情報を、前掲の文献Ｂに記載されている方法で、ダイズのゲノム配列と比較し、ＥＭＳ処理によって生じた変異系統（変異体１~４）に特有の塩基多型（変異）を同定した。

　その結果、変異体１~３においては、ダイズ２０番染色体の４１Ｍから４５Ｍ塩基対の間に存在する、Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子（データベース（Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ）の版がＷｍ８２．ａ２．ｖ１では、遺伝子名がＧｌｙｍａ．２０Ｇ２０１４００．１又はＧｌｙｍａ．２０Ｇ２０１４００となっている）（Ｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ　ｆａｔｔｙ　ａｃｙｌ　ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　ｓｙｎｔｈａｓｅ）に共通して変異原処理によって生じた塩基多型（変異）を有していた。

　具体的には、変異体１（「＃６５」とも表記する）は、ダイズ２０番染色体配列中の第４２，７２０，１１９番目の塩基がＣからＴに置換した変異（すなわち、Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号１）における第１５１９番目の塩基であるＧ（グアニン）がＡ（アデニン）に置換された変異；但し、当該染色体配列に対し当該ｃＤＮＡ配列の方向が反対向き（逆向き）であるため、当該染色体配列中の置換塩基と、当該ｃＤＮＡ配列中の置換塩基とは、相補関係にある。）を持ち、Ｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ　ｆａｔｔｙ　ａｃｙｌ　ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　ｓｙｎｔｈａｓｅ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列（配列番号２）の中の、第４１０番目のアミノ酸がグリシンからアスパラギン酸へ変化していた。

　変異体２（「１６ＳＮ２５３」とも表記する）は、ダイズ２０番染色体配列中の第４２，７１７，５８１番目の塩基がＣからＴに置換した変異（すなわち、Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号１）における第２３５２番目の塩基であるＧ（グアニン）が、Ａ（アデニン）に置換された変異；但し、当該染色体配列に対し当該ｃＤＮＡ配列の方向が反対向き（逆向き）であるため、当該染色体配列中の置換塩基と、当該ｃＤＮＡ配列中の置換塩基とは、相補関係にある。）を持ち、Ｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ　ｆａｔｔｙ　ａｃｙｌ　ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　ｓｙｎｔｈａｓｅ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列（配列番号２）の中の、第６８８番目のアミノ酸がアスパラギン酸からアスパラギンへ変化していた。

　変異体３（「１６ＳＮ６９３」とも表記する）は、ダイズ２０番染色体配列中の第４２，７１７，９９８番目の塩基がＣからＴに置換した変異（すなわち、Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子のｍＲＮＡ前駆体配列（配列番号５）における第７１８０番目の塩基であるＧ（グアニン）が、Ａ（アデニン）に置換された変異；但し、当該染色体配列に対し当該ｍＲＮＡ前駆体配列の方向が反対向き（逆向き）であるため、当該染色体配列中の置換塩基と、当該ｍＲＮＡ前駆体配列中の置換塩基とは、相補関係にある。）を持つ。それにより、Ｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ　ｆａｔｔｙ　ａｃｙｌ　ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　ｓｙｎｔｈａｓｅ遺伝子の第１７番目のエキソンの直後に位置するイントロンの境目にある（当該イントロンの両端に存在する）、遺伝子のスプライシングに必要なＧＵ−ＡＧという配列（詳しくは、イントロンのスプライシングに必要な（スプライシングの目印となる）、当該ｍＲＮＡ前駆体配列（配列番号５）における第７１８０~７１８１番目の「ＧＵ」と第７２６７~７２６８番目の「ＡＧ」という配列）が、ＡＵ−ＡＧという配列に変化することで、当該イントロン（配列番号５中の第７１８０番目~第７２６８番目の塩基で特定される配列）におけるスプライシング異常を引き起こしていると考えられた（図３）。

　変異体４については、Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子にＥＭＳ処理によって生じた変異を有していなかったため、データベース（Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ）上でＧｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子の相同遺伝子としてリストアップされているＧｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子（データベース（Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ）の版がＷｍ８２．ａ２．ｖ１では、遺伝子名がＧｌｙｍａ．０４Ｇ０５４１００となっている）の塩基配列を比較した。
　その結果、変異体４（「１６ＳＮ２７９」とも表記する）は、ダイズ４番染色体配列中の第４，３４０，３７９番目の塩基がＧ（グアニン）からＡ（アデニン）に置換した変異（すなわち、Ｇｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号３）における第４８３番目の塩基であるＣ（シトシン）が、Ｔ（チミン）に置換された変異；但し、当該染色体配列中の置換塩基と、当該ｃＤＮＡ配列中の置換塩基とは、相補関係にある。）を持ち、Ｇｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子によりコードされるアミノ酸配列（配列番号４）の中の、第６４番目のアミノ酸がアルギニンからシステインへ変化していた（図４）。Ｇｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子の１０２番目から３７７番目のアミノ酸はＣｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ　ｆａｔｔｙ−ａｃｙｌ−ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓの機能に関与すると予測され、Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子の５５９番目から８４８番目のアミノ酸において同様の機能を持つと予測された。

６．フラン酸含量の減少の原因となるＤＮＡ多型のＤＮＡマーカー化と低フラン酸含量の表現型との関連
　それぞれの変異系統（変異体１~４）で同定したＤＮＡ多型を対象に各個体の持つ遺伝子型を判別できるＤＮＡマーカーを開発し、低フラン酸含量の表現型との関連を確認した。ＤＮＡ多型を対象にＰＣＲ法で遺伝子型を識別できるＤＮＡマーカーを開発するために、文献Ａに記載されている方法を用いた。具体的には、変異体１が持つ４２，７２０，１１９番目の塩基を挟み込むように、ＰＣＲに用いるプライマー（フォワードプライマー：ＡＣＴＡＴＡＣＧＡＴＴＧＡＡＣＴＴＴＣＡＧＧＣＴＴ（配列番号６）、リバースプライマー：ＧＣＴＴＣＣＴＡＧＡＡＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＴ（配列番号７））を設計し、各個体のＤＮＡを鋳型にＰＣＲ法によって、多型ＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ断片に含まれる塩基の違いをＤＮＡが２本鎖から１本鎖へ融解する際の温度の違いを検出することで、各個体の持つ遺伝子型を判別した（図５Ａ）。正常型はＣの塩基を持ち、変異型はＴの塩基を持つために、融解温度の変化量のピーク（以後、融解温度とする）は、正常型（図５Ａ中の青色のプロット）が変異型（図５Ａ中の赤色のプロット）に比べて高い融解温度を示す。一方、ヘテロ接合型の個体では正常型と変異型のＤＮＡのいずれも持つことから、ＰＣＲ断片の融解温度は異なるパターン（図５Ａ中の橙色のプロット）を示す。上記に記載したトヨシロメと変異体１の交配によって得られた分離集団の各個体が示すフラン酸含量は、作製したＤＮＡマーカーの遺伝子型によって明確に区別することができた。従って、変異体１が持つ４２，７２０，１１９番目の塩基多型によって低フラン酸含量の表現型を説明できる（図５Ｂ）。

　変異体２（「１６ＳＮ２５３」とも表記する）はダイズ２０番染色体の４２，７１７，５８１番目の塩基がＣからＴに置換した変異を持ち、この変異を対象にプライマー（フォワードプライマー：ＴＣＧＴＡＴＴＴＡＴＡＴＧＴＣＴＴＧＧＧＣＡ（配列番号８）、リバースプライマー：ＧＧＡＣＣＧＣＡＴＣＡＡＴＴＴＴＧＴ（配列番号９））を設計し、ＰＣＲによってこの変異系統が持つＤＮＡ多型を含むＰＣＲ断片を増幅し、上記と同様にＰＣＲ断片に含まれる塩基の違いをＰＣＲ断片の融解温度の違いとして検出した。正常型がＣを持ち、変異型のＴよりも高い融解温度のピークを示す（図６Ａ）。このＤＮＡマーカーを用いて、上述と同様の手順で作製したフクユタカと変異体２の交配によって得られた雑種個体を２度自殖させたＦ３集団６４個体について、遺伝子型とフラン酸含量の関係を調べた結果、変異型の遺伝子型を持つ場合に低フラン酸含量の表現型を示した。従って、このＤＮＡ多型によって低フラン酸含量の表現型を説明できる（図６Ｂ）。なお、図６Ａ中の、青、赤、及び橙色のプロットの説明は、図５Ａにおける説明が同様に適用される。

　変異体３（「１６ＳＮ６９３」とも表記する）はダイズ２０番染色体の４２，７１７，９９８番目の塩基がＣからＴに置換しており、この変異を対象にＰＣＲで増幅するためのプライマー（フォワードプライマー：ＡＧＡＡＡＡＡＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＡＴＴＧＡＡＡ（配列番号１０）、リバースプライマー：ＡＧＴＡＡＴＡＡＧＡＴＡＧＣＡＡＴＣＡＡＡＧＧＣＡ（配列番号１１））を設計し、ＰＣＲ断片に含まれる塩基多型をＰＣＲ断片の融解温度の違いとして検出した。正常型のＣの対立遺伝子を持つＰＣＲ断片は変異型のＴを含むＰＣＲ断片よりも高い融解温度を示す（図７Ａ）。上記と同様にフクユタカと変異体３の交配によって得られたＦ２集団３２個体を用いて、ＤＮＡマーカーの遺伝子型とフラン酸含量の関係を解析した結果、変異型の遺伝子型を持つ場合に低フラン酸含量の表現型を示した。従って、この塩基多型によって低フラン酸含量の表現型を説明できる（図７Ｂ）。なお、図７Ａ中の、青、赤、及び橙色のプロットの説明は、図５Ａにおける説明が同様に適用される。

　変異体４（「１６ＳＮ２７９」とも表記する）が持つダイズ４番染色体の４，３４０，３７９番目の塩基がＧからＡへのＤＮＡ多型をＰＣＲによって検出するためのプライマー（フォワードプライマー：ＴＣＡＴＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＣＴＣＡＣＧ（配列番号１２）、リバースプライマー：ＡＡＧＴＴＧＧＧＡＧＧＡＧＧＧＴＴＴＧ（配列番号１３））を設計し、ＰＣＲ断片に含まれる塩基多型をＰＣＲ断片の融解温度の違いによって検出した。正常型の塩基Ｇを持つ場合、変異型のＡの塩基を持つ場合に比べて、ＰＣＲ断片の融解温度が高くなる（図８Ａ）。この融解温度の違いを利用して、フクユタカと変異体４の交配によって得られたＦ３集団６３個体の遺伝子型とフラン酸含量の関係を解析した結果、変異型の遺伝子を持つ場合に、低フラン酸含量の表現型を示した。よって、このＤＮＡ多型によって低フラン酸含量の表現型を説明できる（図８Ｂ）。なお、図８Ａ中の、青、赤、及び橙色のプロットの説明は、図５Ａにおける説明が同様に適用される。

　以上の結果から、本実施例で示した変異系統１~４は、原品種であるフクユタカと比較してダイズに含まれる油脂中のフラン酸含量が減少した性質を備え、Ｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ　ｆａｔｔｙ−ａｃｙｌ−ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓをコードすると考えられる遺伝子、Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０とＧｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子に生じた変異が、各変異系統が示すフラン酸含量の減少の原因であることを明らかにした。

＜低フラン酸ダイズ由来の油脂、及び当該ダイズを用いた加工食品の評価＞

１．ダイズ油脂の抽出及び精製
（１）ダイズ種子
　佐賀大学の圃場にて栽培、収穫した下記種子を用いた。
　１．フクユタカ
　２．＃６５（低フラン酸系統）：実施例１で作製した変異体１

（２）抽出条件
　ブレンダーで粉砕した各ダイズ種子を５０℃に加熱したヘキサンに浸漬し、得られた浸漬液からヘキサンを蒸留回収して油分を抽出した。

（３）精製条件
　上記抽出油を一般的な精製方法である脱ガム、脱酸、脱色、脱臭処理にて精製した。
　まず、８０℃に加温させた抽出油に対して、８５％リン酸水溶液および温水をそれぞれ０．４質量％、２．５質量％添加し、３０分間撹拌後、水相を遠心除去して脱ガム油を得た。
　次に、８０℃に加温させた脱ガム油に対して、８５％リン酸水溶液を０．０５質量％、１５％ＮａＯＨ水溶液を０．６％それぞれ添加し、１５分間撹拌後、水相を遠心除去した。得られた油相に対して、８０℃でイオン交換水を１５質量％添加し、１５分間撹拌後、再度水相を遠心除去して脱酸油を得た。

　次に、上記で得られた脱酸油に対して、８０℃で活性白土を１．５質量％添加し、減圧下で３０分間撹拌後、白土をろ過で除去して脱色油を得た。
　次に、上記で得られた脱色油に対して、２５０℃及び減圧下で２．０質量％の水蒸気を４５分間吹き込んで脱臭処理を施し、前記処理油に対して、クエン酸を２５質量ｐｐｍ添加して脱臭油を得た。

２．ダイズ油脂の評価
　前記１．項で精製した各ダイズ種子由来の脱臭油を用いて、下記（１）~（３）の項目に関する評価を実施した。
（１）一般性状
　脂肪酸組成：基準油脂分析試験法２．４．２．３−２０１３に則って測定した。
　フラン酸（Ｆ３）：特許第６７１４００１号公報（又はＷＯ２０１７／０３３６７４）の段落［００５５］~［００５８］に記載の方法に則って測定した。

（２）耐光性
　１０ｍｌのバイアル瓶に脱臭油５ｇを入れ、１０００ｌｕｘで１週間照射させ、下記項目を評価した。なお、光照射前に各脱臭油のフラン酸含量を測定した。
　ＰＯＶ：基準油脂分析試験法２．５．２．２−２０１３に則って測定した。
　明所臭：光照射後サンプルについて、ブロックヒーターで１００℃に加熱した後に明所臭を評価した。（ｎ＝２）

（３）耐熱性
　３００ｍＬビーカーに油１００ｇを張り込み、１８０℃で加熱した（５ｈｒ毎にサンプリングを実施し、合計２０ｈｒまで加熱）。
　酸価：基準油脂分析試験法２．３．１−２０１３に則って測定した。
　色調：ＡＯＣＳ　Ｃｃ１３ｊ−９７に則って、ロビボンド自動比色計を用いて測定した。
　粘度：３０℃においてＥ型粘度計を用いて測定した。
　加熱臭：加熱１５ｈｒ後の油に対して、１４名のパネルが各評価項目を０~５点（下記参照）で評価し、その平均値を評価値とした。

　評価点数：
　５：非常に強く感じる
　４：強く感じる
　３：やや強く感じる
　２：やや感じる
　１：あまり感じない
　０：感じない

（４）結果
　上記（１）~（３）の各評価の結果を、表１~７に示す。

　＃６５から採取したダイズ油脂中のフラン酸（Ｆ３）は、検出限界以下であった。また、＃６５から採取したダイズ油脂は、フクユタカらから採取したダイズ油脂と比較して、耐光性に優れており、明所臭が抑制されていた。さらに、耐熱性にも優れており、加熱時の色調上昇、酸化上昇及び粘度上昇とも抑制されており、加熱臭も抑制されていた。

３．ダイズを用いた加工食品の評価
（１）前記１．項で用いた各ダイズ（フクユタカ、＃６５（低フラン酸系統））を用い、下記（ｉ）~（ｖ）の加工食品を試作した。
　（ｉ）ダイズハンバーグ
　（ｉｉ）豆乳
　（ｉｉｉ）豆腐
　（ｉｖ）おからクッキー
　（ｖ）ダイズ粉クッキー

（２）試作方法
（ｉ）ダイズハンバーグ
　各ダイズ１５０ｇを４倍以上の水に１晩漬け、鍋で３０分~１時間煮た。
　ダイズ水煮２００ｇをフードプロセッサーでペースト状にし、表８中の※の材料と合わせてよくこねた。
　成形して、油を引いたフライパンで焼いた。
　３分半でひっくり返し、さらに２分半焼き、ダイズハンバーグを得た。

（ｉｉ）豆乳
　各ダイズ１５０ｇを水に一晩浸けた。
　軽く水で洗い、水７５０ｇ（乾燥時のダイズに対して５倍量）添加し、ミキサーで粉砕した。
　鍋で沸騰するまで加熱し、さらに弱火で１０分加熱した。
　さらしで濾し、おからと豆乳を分別し、豆乳を得た。

（ｉｉｉ）豆腐
　上記（ｉｉ）の各ダイズ由来の豆乳を鍋に入れ、７５~８０℃に加熱後、火を消した。
　にがりを豆乳に対して１．５質量％添加し、少し撹拌した後、蓋をして１０分蒸らした。
　さらしを敷いたざるで水気を切り、豆腐を得た。

（ｉｖ）おからクッキー
　上記（ｉｉ）で豆乳と分別した各ダイズ由来のおからの水分をよく絞り、生おからを得た。
　表９に記載された材料をボウルに入れよく混ぜた。
　冷蔵庫で１時間ほど寝かせ、成形した。
　１７０℃に予熱したオーブンで２５分焼き、おからクッキーを得た。

（ｖ）ダイズ粉クッキー
　各ダイズをミキサーで粉砕し、ダイズ粉を得た。
　表１０に記載された材料をボウルに入れよく混ぜた。
　薄く広げて冷蔵庫で１時間ほど寝かせた。
　型抜き後、１７０度に予熱したオーブンで２０分焼いた。

（３）評価結果
　各加工食品について、４名のパネルが、「ダイズっぽさ（豆臭）」、「後味の渋み（渋み）」を１~３点（下記参照）で評価し、その平均値を評価値とした。その評価の結果を、表１１~１５に示す。
　評価点数：
　１：全く感じない
　２：やや感じる
　３：はっきり感じる

　＃６５もしくは＃６５のダイズの処理物を材料とした加工食品は、フクユタカもしくはフクユタカのダイズの処理物を材料とした加工食品と比較して、豆臭、渋みとも抑制されており、良好な風味を有していた。

　本発明によれば、ダイズに含まれる油脂中のフラン酸含量（フラン酸の産生量）低減された改変ダイズを提供することができる。当該改変ダイズ由来の食用油脂や当該食用油脂を含む食品等は、従来のダイズ油脂を含有するものとは異なり、ダイズ油脂特有の不快な明所臭が抑制され、加熱調理時等の加熱臭、特にダイズ油脂由来の刺激臭が抑制される。さらに、当該改変ダイズ由来の食用油脂は、従来のダイズ油脂よりも加熱時の粘度・色調・酸化上昇が抑制される。また、当該改変ダイズもしくは改変ダイズの処理物を含む食品等は、豆臭が抑制され良好な風味を有している。そのため、当該改変ダイズは有用性、実用性に優れたものである。

　配列番号６~１３：合成ＤＮＡ

Claims

　遺伝子変異によりダイズに含まれる油脂中のフラン酸の含有割合が低減された改変ダイズ。
　前記含有割合が０質量ｐｐｍ以上２０質量ｐｐｍ以下である、請求項１に記載のダイズ。
　前記フラン酸が、３，４−ジメチル−５−ペンチル−２−フランノナン酸である、請求項１又は２に記載のダイズ。
　Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子及び／又はＧｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子に変異が導入されたものである、請求項１~３のいずれか１項に記載のダイズ。
　前記遺伝子に導入された変異が、ミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異及びヌル変異からなる群から選択されるいずれかの変異である、請求項４に記載のダイズ。
　Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子に導入された変異が、
（ｉ）該遺伝子によりコードされるタンパク質の第４１０番目のアミノ酸残基をコードするコドンの塩基に生じた変異、
（ｉｉ）該遺伝子によりコードされるタンパク質の第６８８番目のアミノ酸残基をコードするコドンの塩基に生じた変異、又は
（ｉｉｉ）該遺伝子の第１７番目のエキソンとイントロンの境界に存在する塩基に生じた変異
である、請求項４又は５に記載のダイズ。
　前記（ｉ）の変異が、グリシンのコドンからアスパラギン酸のコドンに置換される変異である、請求項６に記載のダイズ。
　前記（ｉ）の変異が、Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子のｃＤＮＡにおける第１５１９番目の塩基であるＧ（グアニン）が、Ａ（アデニン）に置換された変異である、請求項７に記載のダイズ。
　前記（ｉｉ）の変異が、アスパラギン酸のコドンからアスパラギンのコドンに置換される変異である、請求項６に記載のダイズ。
　前記（ｉｉ）の変異が、Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子のｃＤＮＡにおける第２３５２番目の塩基であるＧ（グアニン）が、Ａ（アデニン）に置換された変異である、請求項９に記載のダイズ。
　前記（ｉｉｉ）の変異が、Ｇｌｙｍａ２０ｇ３４３４０遺伝子のｍＲＮＡ前駆体における第７１８０番目の塩基であるＧ（グアニン）が、Ａ（アデニン）に置換された変異である、請求項６に記載のダイズ。
　Ｇｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子に導入された変異が、該遺伝子によりコードされるタンパク質の第６４番目のアミノ酸残基をコードするコドンの塩基に生じた変異である、請求項４又は５に記載のダイズ。
　前記変異が、アルギニンのコドンからシステインのコドンに置換される変異である、請求項１２に記載のダイズ。
　前記変異が、Ｇｌｙｍａ０４ｇ０５６９０遺伝子のｃＤＮＡにおける第４８３番目の塩基であるＣ（シトシン）が、Ｔ（チミン）に置換された変異である、請求項１３に記載のダイズ。
　フクユタカの改変ダイズである、請求項１~１４のいずれか１項に記載のダイズ。
　受託番号がＦＥＲＭ　ＢＰ−２２３９２であるＬＦ６５ダイズ。
　受託番号がＦＥＲＭ　ＢＰ−２２４１３である１６ＳＮ２７９ダイズ。
　請求項１~１７のいずれか１項に記載のダイズ又はその処理物を含む、食品用、飼料用又は医薬組成物用の材料。
　請求項１８に記載の材料を含む、食品、飼料又は医薬組成物。
　請求項１~１７のいずれか１項に記載のダイズから抽出されたダイズ油脂。
　請求項２０に記載のダイズ油脂を含む、食品、飼料又は医薬組成物。
　請求項１~１７のいずれか１項に記載のダイズ同士、又は当該ダイズと他のダイズ種とを交雑させることを含む、改変ダイズの製造方法。