WO2022149568A1 - ヒトを含めた生物の細胞にある転写産物および、遺伝子導入されたｒｎａとその複合体精製ツール - Google Patents

ヒトを含めた生物の細胞にある転写産物および、遺伝子導入されたｒｎａとその複合体精製ツール Download PDF

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    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a CRISPR-dCas / Cas protein derivative or set, a polynucleotide or its complementary strand, a vector, a transformant, a carrier, a method for purifying a target RNA, a method for analyzing an intracellular environment, a prophylactic or therapeutic agent for a novel coronavirus.
  • a CRISPR-dCas / Cas protein derivative or set a polynucleotide or its complementary strand, a vector, a transformant, a carrier, a method for purifying a target RNA, a method for analyzing an intracellular environment, a prophylactic or therapeutic agent for a novel coronavirus.
  • RNAs in the living body of which about 300 are the subject of research, and about 99% of human RNAs have not been elucidated in function.
  • the number of human proteins is about 21,000, of which about 70% is the subject of research.
  • RNA is a gene that is transiently expressed in each cell, and it is difficult to recognize antibodies or label with biotin, etc., so a specific base sequence can be obtained under arbitrary conditions. This is because it is difficult to purify the RNA contained in it.
  • One object of the present invention is to provide a targeting technique capable of evaluating RNA molecular function.
  • Another object of the present invention is to visualize the intracellular behavior of RNA having a specific base sequence.
  • an object of the present invention is to provide a prophylactic or therapeutic agent for a new type of coronavirus, or a therapeutic agent for a disease caused by an abnormality in splicing of mRNA.
  • the present invention relates to the following CRISPR-dCas / Cas protein derivatives or sets, polynucleotides or complementary strands thereof, vectors, transformants, carriers, methods for purifying target RNA, methods for analyzing intracellular environment, prevention of new coronavirus, or It provides a therapeutic agent and a therapeutic agent for diseases caused by abnormal splicing of mRNA.
  • Item 1 CRISPR-dCas / Cas protein derivatives or sets, polynucleotides or complementary strands thereof, vectors, transformants, carriers, methods for purifying target RNA, methods for analyzing intracellular environment, prevention of new coronavirus, or It provides a therapeutic agent and a therapeutic agent for diseases caused by abnormal splicing of mRNA.
  • a CRISPR-dCas (dead Cas) protein having a helix region forming a complex with a guide RNA and a target RNA, and having no nuclease activity, or a CRISPR-Cas protein having a nuclease activity
  • the helix region The N domain including the N-terminal side and the C domain containing the C-terminal, including the first and second factors that can bind in response to a stimulus, the N domain and the first factor, and the C domain and the second factor are linked, respectively.
  • Factors 1 and 2 are bound by a linker containing a protease recognition sequence, or Factors 1 and 2 are bound by a linker containing a self-cleaving peptide, or Factors 1 and 2 are bound.
  • Factors are non-covalently linked and become (N-domain)-(first factor)-(linker containing protease recognition sequence)-(second factor)-(C-domain) or (N-domain)-(first).
  • the CRISPR-dCas / Cas protein according to Item 1 wherein the N domain contains a part of the amino acid sequence on the N-terminal side of the helix region, and the C domain contains a part of the amino acid sequence on the C-terminal side of the helix region.
  • protein derivatives, or CRISPR-dCas / Cas proteins and protein derivative sets Item 3.
  • the N domain contains 164 amino acids of a part of the amino acid sequence on the N-terminal side of the helix region of Cas13a (Sequence ID: WP_021746774.1) derived from Leptotrichia wadei, and the C domain is a part of the C-terminal side of the helix region.
  • the N domain contains 164 amino acids of a part of the amino acid sequence on the N-terminal side of the helix region of Cas13a (Sequence ID: WP_021746774.1) derived from Leptotrichia wadei
  • Item 3. The CRISPR-dCas / Cas protein derivative or CRISPR-dCas / Cas protein according to any one of Items 1 to 3, wherein the first factor contains nMAG or pMAG and the second factor contains pMAG or nMAG. And protein derivative set.
  • Item 6. Item 1 or 2 vector containing the 1 or 2 polynucleotide according to Item 5 or a complementary strand thereof.
  • Item 7. Item 6. The vector according to Item 6, wherein the vector is an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, or a plasmid vector.
  • Item 8 A term in which the vector is two kinds of vectors, one vector has a (N domain)-(first factor) structure, and the other vector has a (second factor)-(C domain) structure.
  • Item 6. The vector according to any one of Items 6 to 8, wherein the vector further contains a polynucleotide encoding a guide RNA corresponding to a target RNA.
  • Item 10. A transformant transformed by the vector according to any one of Items 6 to 9.
  • Item 11. Item 6.
  • Item 12. Item 12. The transformant according to Item 11, wherein the transformant is a transformed mammalian cell or a transformed non-human mammal.
  • Item 13. Item 6. The CRISPR according to any one of Items 1 to 4, wherein the target RNA is RNA derived from RNA virus, RNA of new coronavirus, RNA derived from synthetic gene, lncRNA, ncRNA of 30 nt or more or preRNA that can be targeted by guide RNA.
  • a carrier for purifying target RNA which comprises supporting a CRISPR-dCas (dead Cas) protein that can form a complex with a guide RNA and a target RNA and has no nuclease activity on a solid phase carrier.
  • a method for purifying a target RNA comprising eluting a target RNA binding factor selected from the group consisting of, protein, and non-target RNA.
  • Item 2. A step of introducing or expressing a plurality of guide RNAs into the transformant according to Item 10, a step of dissolving the transformant to capture the target RNA in the RNA capture particles, and a step of capturing the target RNA bound to the RNA capture particles.
  • a method for analyzing an intracellular environment including a step of analysis.
  • Item 17. Item 16. The analysis method according to Item 16, wherein the transformant is an iPS cell.
  • Item 16. The analysis method according to Item 16 or 17, comprising the step of recovering the expression system of the cell generated by the complex formation of the target RNA, the guide RNA and the photoactivated dCas protein.
  • Item 19. A prophylactic or therapeutic agent for a new type of coronavirus containing a lipid metabolism regulator as an active ingredient.
  • Item 20. Item 19.
  • Item 21. The prophylactic or therapeutic agent for the new coronavirus according to Item 19 or 20, wherein the lipid metabolism regulator is atorvastatin or rosuvastatin.
  • Item 22. A therapeutic agent for a disease caused by abnormal splicing of mRNA, rRNA (ribosomal RNA) and lncRNA, which comprises the vector according to any one of Items 6 to 9 as an active ingredient.
  • lncRNA long non-coding RNA having a desired base sequence can be easily purified.
  • the division of the Cas13 protein into peptides based on the division position according to the present invention can also be applied to Cas13 (Cas13) having ribonuclease activity, and can be used as activated Cas13.
  • the divided Cas13 / dCas13 according to the present invention can be applied to known uses of Cas13 / dCas13 other than the above.
  • the intracellular target RNA can be purified or captured, and the intracellular environment can be analyzed.
  • the intracellular behavior of lncRNA having a desired base sequence can be visualized.
  • RNA virus especially new coronavirus infection.
  • RNA complex purification method TransRNA Immunoprecipitation (TRIP). Application to modification analysis of RNA function, Precision RNA Sequence Modification (PRSM). Construction of photoactivated Cas13 (PAdCas13) system. Construction of photoactivated Cas13 (PAdCas13) system. Construction of photoactivated Cas13 (PAdCas13) system. Target lncRNAs with high selectivity. RNA visualization example targeting human XIST RNA. Using dCas13 labeled with GFP, the localization of XIST RNA in the cell nucleus could be confirmed in living cells. TRIP method implementation model diagram. Overview of the TRIP method for the untranslated region of SARS-CoV-2.
  • TRIP analysis method targeting SARS-CoV-2 1. Performance evaluation of TRIP analysis method targeting SARS-CoV-2 2. Types of RNA to which SARS-CoV-2 derived RNA binds in human cells; Ontology enrichment analysis. Performance evaluation of TRIP analysis method targeting SARS-CoV-2 3. Performance evaluation of TRIP analysis method targeting SARS-CoV-2 4. Data showing that hydrogen bonds of S565 are involved in the binding of atorvastatin and rosuvastatin to HMG-CoA. Performance evaluation of TRIP analysis method targeting SARS-CoV-2 5.
  • Left figure A diagram that visualizes whether the binding region of XIST RNA on DNA has regularity around the transcription initiation region of a gene.
  • the second column from the left is the test result of the TRIP method for XIST.
  • the first column from the left is a negative test that did not use crRNA.
  • the third, fourth, and fifth columns from the left are integrated diagrams for histone modification.
  • the top is the test result of the TRIP method for XIST. It shows an accumulation pattern similar to that of H3K4me3 in the third stage, suggesting that XIST is a transcription factor.
  • TSS transcription start site
  • the target defined by the guide RNA was set to long noncoding RNA XIST, and chromatin immunoprecipitation was performed and compared with the existing technique.
  • the technique of the present invention was capable of high resolution detection with one or two guide RNAs. The fact that it can be turned ON / OFF immediately and that it can be compared within the RNA molecule is an innovative performance that is difficult to achieve not only with existing technology but also with the original dCas13 protein.
  • X-axis distance from the transcription start site (5,000 bp at the right end, -5,000 bp at the left end), Y-axis: average value accumulated in the transcription start region.
  • RNA structure analysis data referred to in designing XIRT crRNA, structure prediction diagram, and protein group prediction that binds to the XIST sequence XIST RNA function control verification test using dCas13.
  • H3 histone H3
  • H3 histone H3
  • pENTR1A.dCas13a.GFP pGL3-SARS-CoV-2.ORF1-Promoter. pGL3-SARS-CoV-2.ORF1-Promoter. pGL3-SARS-CoV-2.ORF1-Promoter.
  • a virus-derived 5'UTR-mediated translational repression confirmed esiRNA cDNA target sequence.
  • Guide RNA targeting introns 1 and 2 of PD-1 pre-mRNA Creation of PD-1 activity-removing lymphocytes using dCas13. Using comprehensive RNA target analysis, we succeeded in creating PD-1 expression-regulated T cells.
  • RNA targeted for separation and purification, functional elucidation, disease prevention or treatment in the present invention examples include lncRNA, RNA derived from RNA virus including new coronavirus RNA, and RNA having splicing abnormality.
  • Cas5 / dCas5 as a CRISPR-dCas protein having a helix region, capable of forming a complex with a guide RNA and a target RNA, and having no nuclease activity, or a CRISPR-Cas protein having a nuclease activity
  • Examples thereof include Cas6 / dCas6, Cas7 / dCas7, Cas9 / dCas9, Cas10 / dCas10, Cas11 / dCas11, and Cas13 / dCas13, with Cas13 / dCas13 being preferred.
  • the CRISPR-dCas protein and the CRISPR-Cas protein have a helix region and are cleaved at any of the above-mentioned helix regions, and the N domain on the N-terminal side from the cleavage point and the C domain on the C-terminal side from the cleavage point.
  • CRISPR-dCas / Cas protein represented by (C domain) or (N domain)-(first factor)-(linker containing self-cleaving peptide)-(second factor)-(C domain)
  • CRISPR-dCas / Cas protein derivative set May be good.
  • This set is the "two-part CRISPR-dCas / Cas protein derivative set".
  • N domain -(1st factor)-(linker containing protease recognition sequence)-(2nd factor)-(C domain) or
  • N domain -(1st factor)-(linker containing self-cleaving peptide)
  • One protein represented by-(factor 2)-(C domain) is cleaved with a protease recognition sequence or a self-cleaving peptide, and a polypeptide containing (N domain)-(factor 1) and (second factor). It is a set of polypeptides containing factor)-(C domain).
  • the complex becomes a set of a polypeptide containing (N domain)-(factor 1) and a polypeptide containing (factor 2)-(C domain) in which the non-covalent bond is broken in the absence of stimulus.
  • Stimuli that promote the binding of the first factor and the second factor include physical stimuli such as light (white light, blue light, etc.), heat (high temperature, low temperature), pH (acidic, neutral, alkaline), pressure, etc. Examples include combinations of ligands and receptors, chemical substances, and the like.
  • the stimulus is light
  • one of the first factor and the second factor may be nMAG and the other may be pMAG.
  • the "non-covalent bond" includes the binding of the first factor and the second factor. For example, when the first factor and the second factor are nMAG and pMAG, the binding of nMAG and pMAG is included in the "non-covalent bond”.
  • the protease recognition sequence may be cleaved by an intracellular protease, or a protease that can be cleaved by a protease recognition sequence may be introduced into the cell together with the CRISPR-dCas / Cas protein.
  • the length of the linker can be appropriately selected by those skilled in the art, but is preferably a peptide consisting of 3 to 100 amino acids, more preferably 5 to 60 amino acids.
  • various protease recognition sequences known in the art can be used (J. Biol. Chem., Vol. 283, No. 30, p20897, 2008).
  • the protease recognition sequence is the intracellular protease recognition sequence into which the CRISPR-dCas / Cas protein derivative or protein derivative set is introduced.
  • the intracellular protease recognition sequence include amino acid sequences recognized by the intracellular proteases Furin, PC7, and PACE4.
  • the linker may be a peptide consisting of a protease recognition sequence or may contain an additional amino acid sequence on the N-terminal side and / or C-terminal side of the protease recognition sequence.
  • self-cleaving peptides include literature (Szymczak-Workman, Andrea L et al. “Design and construction of 2A peptide-linked multicistronic vectors.” Cold Spring Harbor protocols vol.
  • self-cleaving peptide examples include, but are not limited to, T2A, P2A, E2A, F2A and the like.
  • the N domain and the C domain may or may not have a part of the amino acid in the helix region, the amino acid sequence in the helix region may be modified, and a new amino acid sequence is added or inserted. It may have a protease recognition sequence or an amino acid sequence derived from a self-cleaving peptide or linker.
  • the present invention includes a CRISPR-dCas / Cas protein derivative, or a polynucleotide encoding a CRISPR-dCas / Cas protein derivative set or a complementary strand thereof.
  • Such polynucleotides include: (i) (N domain)-(1st factor)-(linker containing protease recognition sequence)-(2nd factor)-(C domain) or (N domain)-(1st factor)-(self-cleaving peptide) Containing linker)-(second factor)-(C domain) encoding polynucleotide; (ii) A polynucleotide encoding a polypeptide containing (N domain)-(factor 1) and a polynucleotide encoding a polypeptide containing (factor 2)-(C domain) have appropriate spacer nucleotide sequences.
  • polynucleotide (iii) Two kinds of polynucleotides consisting of a polynucleotide encoding a polypeptide containing (N domain)-(factor 1) and a polynucleotide encoding a polypeptide containing (factor 2)-(C domain). Set of.
  • the vector of the present invention contains any of the above (i) to (iii), is one vector in the case of the above (i) and (ii), and is 2 in the case of the above (iii). It is a set of seed vectors.
  • a plasmid vector As the vector, either a plasmid vector or a virus vector may be used.
  • the virus vector include an adeno-associated virus vector, an adenovirus vector, a retrovirus vector, and a lentiviral vector.
  • the plasmid vector include an entry vector for a Gateway system (pENTR, etc.), a donor vector for gene recombination, a destination vector for parallel transfer, and the like.
  • the vector may encode at least one guide RNA in addition to the CRISPR-dCas / Cas protein derivative or the polynucleotide encoding the CRISPR-dCas / Cas protein derivative set or its complementary strand.
  • the transformant of the present invention is prepared by transforming a host cell with the vector of the present invention.
  • Hosts include mammals such as humans, mice, rats, rabbits, guinea pigs, hamsters, goats, dogs and monkeys.
  • the host cell is an ES cell or a fertilized egg of a non-human mammal
  • a non-human mammal can be prepared from the transformed cell, and the transformant of the present invention includes a non-human mammal.
  • the target RNA purification carrier of the present invention carries a plurality of CRISPR-dCas (dead Cas) proteins that can form a complex with a guide RNA and a target RNA and do not have nuclease activity on a solid phase carrier.
  • CRISPR-dCas (deadCas) protein having no nuclease activity include dCas5, dCas6, dCas7, dCas9, dCas10, dCas11, and dCas13, with dCas13 being preferred.
  • a solid-phase carrier for supporting the CRISPR-dCas protein known carriers such as silica soil, activated charcoal, alumina, titanium oxide, crosslinked starch particles, cellol-based polymers, chitin and chitosan derivatives can be used.
  • RNA purification carrier As a method for immobilizing a CRISPR-dCas protein on a solid phase carrier, known methods such as a physical adsorption method, an ionic bonding method, a comprehensive method, and a covalent bonding method can be used, and among them, the covalent bonding method is used. Excellent long-term stability and desirable.
  • a method for co-bonding the dCas protein various methods such as using a compound having an aldehyde group such as formaldehyde, glyoxal, and glutaraldehyde, using a polyfunctional acylating agent, and cross-linking a sulfhydryl group can be used. Available.
  • the target RNA purification carrier is preferably used by filling it in a column reactor.
  • FIG. 1 illustrates a method for functionally analyzing a target RNA in a cell or in a cytolytic solution using the CRISPR-dCas / Cas protein derivative of the present invention.
  • photoactivated dCas13 is used as the CRISPR-dCas protein
  • inactivated dCas13 is dCas13 before irradiation with blue light or white light (dark place)
  • activated dCas13 is after irradiation with light containing blue light or white light. It is dCas13 of (Mingsho).
  • crRNA, inactivated dCas13, and target RNA are present separately, but when activated dCas13 is produced by light irradiation, a complex of crRNA-activated dCas13-target RNA is formed.
  • the target RNA may be bound to DNA, non-target RNA, protein, and the like.
  • FIG. 1 shows an example in which DNA, RNA or protein is complexed with the target RNA.
  • the DNA or RNA is separated from the target RNA and analyzed by real-time PCR (qPCR) next-generation sequencing (NGS), so that the DNA or RNA to which the target RNA binds is bound. Can be identified.
  • qPCR real-time PCR
  • NGS next-generation sequencing
  • the protein to which the target RNA binds can be identified by separating the protein from the target RNA and performing proteome analysis.
  • the sequence of target RNA can be determined by analysis in combination with qPCR and NGS.
  • the intracellular environment can be analyzed by these analyses.
  • FIG. 2 shows the analysis results of the intracellular environment after inducing differentiation of iPS cells.
  • the crRNA sequence can be designed based on the crRNA algorithm based on RNA higher-order structure prediction.
  • Information on the target RNA can be obtained by binding a large number of crRNAs to the CRISPR-dCas protein on the target RNA purification carrier and sequencing a large number of target RNAs in the sample bound thereto. For example, when a group of lncRNA (long noncoding RNA) expressed at the time of disease can be determined from a sample derived from cells of the disease, or when a group of lncRNA expressed at the time of disease has already been sequenced. In the meantime, effective drug candidate compounds can be screened by monitoring how the expression pattern changes depending on the drug candidate compound. Since many relationships between a certain disease and lncRNA are known, crRNA can be designed with reference to such information.
  • a photoactivated dCas protein system (PAdCas system) can be used to observe the expression, distribution, migration, etc. of lncRNA in cells.
  • PAdCas system photoactivated dCas protein system
  • FIG. 2 shows an example in which the cells of the present invention are applied to PRSM (Precision RNA Sequence Modification).
  • FIGS. 3-5 show an example of the PAdCas system of the present invention.
  • the PAdCas system contains the N-terminal portion of the CRISPR-dCas protein containing the guide RNA recognition domain (corresponding to ILwaCas13a.N-N MAG in FIGS. 3-5) and the second portion containing the HEPN domain (FIGS. 3-5). It is divided into ILwaCas13a.C-P MAG), and when cells containing these are irradiated with blue light or white light, the current formation of nMAG and pMAG changes and they bind to become an active dCas protein.
  • the complex formed by binding the intracellular crRNA and the target RNA can be detected by the labeling of active dCas (for example, a fluorescent protein such as green fluorescent protein).
  • active dCas for example, a fluorescent protein such as green fluorescent protein.
  • the protein / CRISPR-Cas / dCas protein used in the present invention that can form a complex with a guide RNA and a target RNA and has or does not have RNA nuclease activity can control the RNA splicing mechanism.
  • Duchenne muscular dystrophy in the case of a patient in which a stop codon is introduced into the 44th exon, Duchenne muscular dystrophy is treated by introducing a guide RNA for skipping Cas13 and exon 44 of the present invention into cells. be able to.
  • RNA splicing abnormalities such as Duchenne muscular dystrophy are shown in Tables 1 to 4 below.
  • the present invention further provides a therapeutic agent for a new coronavirus capable of suppressing the growth of the new coronavirus in the body of mammals including humans.
  • the research of the present inventor revealed that the protein of the new coronavirus is biosynthesized using the lipid metabolism pathway of mammals, especially humans.
  • the present inventor suppresses the biosynthesis of the new coronavirus protein in the lipid metabolism pathway, thereby preventing the virus infection, and further suppresses the growth of the virus even if the virus infection is established, thereby causing the symptoms of the new coronavirus infection.
  • a lipid metabolism regulator was tested as a substance that can alleviate the virus and suppress its aggravation, the lipid metabolism regulator should be administered to mammals such as humans, especially humans to whom the lipid metabolism regulator has not been administered.
  • lipid metabolism regulators are particularly useful in the prevention of new coronavirus infections due to their low toxicity.
  • the dose of the lipid metabolism control substance is about 1 to 150 mg per day for a human adult, and this can be divided and administered once to 4 times a day.
  • lipid metabolism regulators include, but are not limited to, mevastatin, atorvastatin, pravastatin, rosuvastatin, fluvastatin and lovastatin.
  • the lipid metabolism regulator is preferably one having an HMG-CoA reductase inhibitory action.
  • Preferred lipid metabolism regulators include atorvastatin and rosuvastatin.
  • PD-1 can be suppressed by applying the present invention to NK cells.
  • pleural effusion or peritoneal dissemination can be treated by taking out the pleural effusion or ascites of a patient with pleural effusion or peritoneal dissemination, suppressing PD-1 of NK cells contained in the pleural effusion or ascites, and returning the pleural effusion or ascites to the pleural effusion or ascites.
  • an anti-PD-1 antibody and the dCas13 complex of the present invention can be combined.
  • PD-1 expression T cells are activated not only from the antibody but also from inside the T cells. Cancer can be treated more effectively by eliminating the disease.
  • dCas13 which targets PD-1 pre-mRNA, can be expressed in human lymphocytes to control splicing depending on external stimuli.
  • Example 1 RNA complex purification method using Trans RNA Immunoprecipitation (TRIP)
  • TRIP Trans RNA Immunoprecipitation
  • An RNA target sequence recognition and binding system known as the CRISPR-dCas protein eg, CRISPR-dCas 13, hereinafter abbreviated as "dCas 13"
  • dCas 13 a guide RNA
  • a complex of dCas proteins without nuclease activity designed to be bifurcated, such as a combination of pMAG and nMag that can be bound by light irradiation recognizes the targeted gene and forms a complex. .
  • dCas 13 RNA target sequence recognition and binding system known as the CRISPR-dCas protein
  • crRNA guide RNA
  • a complex of dCas proteins without nuclease activity designed to be bifurcated such as a combination of pMAG and nMag that can be bound by light irradiation, recognizes the
  • inactivated dCas13 corresponds to a state where pMAG and nMAG are separated before light irradiation, and activated dCas13 is a combination of pMAG and nMAG after light irradiation.
  • activated dCas13 is a combination of pMAG and nMAG after light irradiation.
  • a system using a heat shock protein in which the bound state and the unbound state are reversibly changed depending on the temperature may be used.
  • the dCas protein divided into two is in an inactive state, it can be bound and activated by an external stimulus such as light or heat.
  • activated means that the CRISPR-dCas protein forms a complex of target RNA and crRNA.
  • TRIP technology can be used to extract the complex of targeted RNA, crRNA and dCas13.
  • the complex may contain various factors such as other RNAs, DNAs, proteins, etc. that bind to the target RNA. In some cases, it is possible to eliminate specific RNA (ribosomal RNA, etc.) from the cell extract.
  • "Turn ON & immunoprecipitation &wash” converts inactivated dCas13 to activated dCas13 by light irradiation (Turn ON), immunoprecipitates the obtained complex (immunoprecipitation), and then cleans and combines.
  • RNA target RNA
  • proteomics analysis can be performed.
  • TRIP technology is applied to the cell extract, but in TRIP technology, the RNA labeling method using Cas13 or dCas13 is applied to both intracellular and cell extracts.
  • Example 2 (1) Application to modification analysis of RNA function (Precision RNA Sequence Modification (PRSM))
  • PRSM Precision RNA Sequence Modification
  • the functional modification of the target RNA can be regulated by switching from Inactive-Cas13 / dCas13 to Active-Cas13 / dCas13 by an external stimulus, and the phenomenon occurs in the cells into which crRNA and Cas13 or dCas13 are introduced at the timing desired by the examiner. Can be observed.
  • PRSM Precision RNA Sequence Modification
  • FIG. 2 explains the use in Droplet-Sequencing (Drop-Seq).
  • Droplet-Sequencing at the timing desired by the tester for a cell group in which arbitrary crRNA (crRNA library in FIG. 2) and Cas13 / dCas13 were introduced and switched to Active-Cas13 / dCas13.
  • the function of RNA targeted by crRNA is modified by Active-Cas13 / dCas13.
  • the expression level of the transcript can be analyzed as the phenotype for each cell by the next-generation sequence.
  • RNA-seq single-cell RNA-seq
  • crRNA-seq single-cell RNA-seq
  • the expression system of the target RNA and the sequence responsible for the RNA function can be identified.
  • Beads in FIG. 2 have a large number of sequences complementary to various RNAs (for example, antisense polynucleotides of a target RNA or a guide RNA) bound to the beads, and the target RNA binds to these beads.
  • PA-dCas13 iPS cells
  • PA-dCas13 and crRNA may be introduced into iPS cells by a known method capable of introducing proteins and RNA into cells such as liposomes and lipofectamine, and plasmid vectors and viral vectors encoding PA-dCas13 and crRNA may be introduced. It may be introduced into iPS cells to express crRNA and photoactivated dCas13 (PA-dCas13) in the cells.
  • light (blue light) stimulation is performed by adding peptides (pMAG and nMAG) having the property of binding to photosensitivity to the C-terminal side of dCas13a.N and the N-terminal side of dCas13a.C, respectively.
  • peptides pMAG and nMAG
  • Techniques that can be used to reacquire the function of the split Cas13 / dCas13 peptide can be replaced by physical stimuli such as light stimuli, temperature and pressure, as well as chemical stimuli such as ion gradients and drug stimuli.
  • Example 3 RNA purification test with crRNA targeting human XIST RNA Binds XIST RNA and XIST from cell extract by immunoprecipitation (TRIP method) via dCas13 using the RNA ChIP method. RNA was purified. It was confirmed that XIST RNA could be extracted with a high degree of purification by the next-generation sequencing method (Fig. 6).
  • Gateway® pENTR1A.dCas13a.GFP (Fig. 28A) was prepared as an entry vector corresponding to specific recombination and recombined into a mammalian cell expression vector.
  • a lentiviral vector that constitutively expresses crRNA targeting XIST was prepared by inserting the XIST gene sequence into pLKO5.U6.crRNA (gene name) .tRFP.v1 (Fig. 27A).
  • FIG. 7 shows an example of RNA visualization targeting human XIST RNA, and the intranuclear localization of XIST RNA could be confirmed in living cells using GFP-labeled photoactivated dCas13 (PAdCas13).
  • PAdCas13 GFP-labeled photoactivated dCas13
  • FIG. 8 is a TRIP method implementation model diagram.
  • FIG. 9 shows an outline of an interaction verification test between RNA derived from SARS-CoV-2 and a human intracellular factor.
  • pGL3-SARS-CoV-2.ORF1-Promoter (Fig. 29A) is prepared as a synthetic RNA expression vector fused with virus-derived RNA and a Tag sequence (luciferase sequence) that can be targeted by crRNA.
  • a lentiviral vector that constitutively expresses crRNA targeting the luciferase gene was created by inserting the XIST gene sequence into pLKO5.U6.crRNA (gene name) .tRFP.v1.
  • crRNA targeting the virus RNA or crRNA targeting the Tag sequence and dCas13 are expressed, converted to Activate-Cas13 / dCas13 at an arbitrary timing, and then the TRIP method is applied. It is used to purify RNA derived from the virus and its complex.
  • DNA / RNA we will carry out next-generation sequencing. For proteins, perform proteome analysis.
  • Figure 10 shows the outline of the TRIP method for the untranslated region of SARS-CoV-2 that was actually performed. We attempted to elucidate the mechanism by which untranslated sequences derived from SARS-CoV-2 synthesize their own proteins in human cells.
  • FIG. 11 shows the structural analysis of the fusion RNA of the Tag sequence (in this figure, the RNA of the Luciferase protein) and the untranslated region of SARS-CoV-2, and the design method of the crRNA sequence for the TRIP method. It can be seen that the untranslated region of SARS-CoV-2 shows a unique structure.
  • FIG. 12 shows an outline of RNA immunoprecipitation used in the TRIP method.
  • FIG. 12 is a qPCR analysis for confirming the degree of purification recovered by the TRIP method. After introducing only the untranslated region sequence or Tag sequence of the Tag fusion SARS-CoV-2 shown in FIGS. 9 and 10 into HEK293T cells and A549 cells, the TRIP method targeting the Tag sequence was performed, and the recovered RNA was performed. In contrast, the recovery efficiency of the untranslated region sequence of SARS-CoV-2 was compared and examined. The RNA sequence could be recovered only in cells into which Tag-fused SARS-CoV-2 was introduced and immunoprecipitated via Cas13.
  • FIG. 13 shows an example of performance evaluation of the TRIP analysis method targeting SARS-CoV-2.
  • arrows indicate genes involved in lipid metabolism obtained by immunoprecipitation.
  • the RNA of the untranslated region sequence of SARS-CoV-2 has specificity in the RNA sequence that binds in the human cell and significantly binds to the intracellular metabolic mechanism.
  • FIG. 14 is another example of performance evaluation of the TRIP analysis method targeting SARS-CoV-2.
  • Ontology enrichment analysis revealed that the function of the RNA group recovered in FIG. 13 is the lipid metabolism mechanism.
  • FIG. 15 is another example of performance evaluation of the TRIP analysis method targeting SARS-CoV-2.
  • ACAA2, HMGcs, FADS1 / 2, and SCD are all factors involved in lipid metabolism and cholesterol metabolism.
  • pGL3-5'UTR was expressed in HEK293T and A549 cells, a significant change in gene expression was confirmed as compared with the case where pGL3 was expressed.
  • FIG. 16 (b) is an interpretation diagram of the result of FIG. 15 (a).
  • the metabolism to the PUFA system was enhanced in A549, and the cholesterol metabolism system was enhanced in HEK293T cells.
  • FIG. 16 (c) An attempt was made to suppress HMGcs using an over-the-counter drug, statin.
  • the expression of the Luciferase protein enhanced by 5'UTR derived from SARS-CoV-2 was suppressed by statins. At this time, suppression of cell proliferation and transcription of Luciferase RNA could not be confirmed.
  • Fig. 16 Suppression of HMGcs and ACAA2 expression by esiRNA was performed, and suppression of Luciferase protein expression enhanced by 5'UTR derived from SARS-CoV-2 was confirmed.
  • the range of sequences targeted by esiRNA (MISSION® esiRNA: composed of an inhomogeneous pool of hundreds of siRNAs at 21 bp) is shown in FIG.
  • atorvastatin and rosuvastatin have many binding points (S565) when binding to HMG-CoA, which is considered to be one of the reasons why SARS-CoV-2 has a growth inhibitory effect. ..
  • FIG. 18 is another example of performance evaluation of a TRIP analysis method targeting SARS-CoV-2, in which the untranslated region sequence of SARS-CoV-2 forms a complex in a host cell containing humans. Show the law. In order for the untranslated region sequence of SARS-CoV-2 (CoV19 in the figure) to bind to human-derived RNA, a certain sequence is required for the factor on the human side, which is the untranslated region of SARS-CoV-2. Predict the presence of proteins that mediate the binding of region sequences to human RNA.
  • FIG. 19 is an outline of DNA immunoprecipitation used in the TRIP method, and shows the procedure for extracting and analyzing DNA that binds to XIST RNA.
  • FIG. 20 shows a verification test of a light-sensitive switching system. Purification of the XIST-DNA complex via dCas13-crRNA was possible only in light-stimulated cells. The generated genomic DNA was detected by the qPCR method for the known XIST RNA binding region.
  • FIG. 21 shows an outline of an example in which it was verified whether the binding region of XIST RNA is related to the histone code in addition to FIG.
  • FIG. 22A A diagram visualizing whether the binding region of XIST RNA on DNA has regularity around the transcription initiation region of a gene.
  • the second column from the left is the test result of the TRIP method for XIST.
  • the first column from the left is a negative test that did not use crRNA.
  • the third, fourth, and fifth columns from the left are integrated diagrams for histone modification. Graphs of the accumulation area from the transcription start area in the right and left figures.
  • the top is the test result of the TRIP method for XIST. It shows an accumulation pattern similar to that of H3K4me3 in the third stage, suggesting that XIST is a transcription factor.
  • FIG. 22B confirms the accumulation in the transcription initiation region from the result of DNA sequencing to the genomic DNA group targeted by XIST extracted from the result of gRNA-dCas13 mediated pulldown (TRIP) targeting XIST which is lncRNA.
  • TRIP gRNA-dCas13 mediated pulldown
  • the isolated DNA is DNA that interacts with XIST RNA and has been known to be involved in gene transcriptional regulation in contact with histone modifications.
  • the results of this test show that the accumulation amount (peak height) exceeds the existing technology (eg, ChIRP, reference: Mol Cell. 2011 Nov 18; 44 (4): 667-78), and the degree of decomposition (peak narrow).
  • the result of demonstrating that the XIST target sequence could be extracted in (1) is shown.
  • FIG. 23 is RNA structure analysis data referred to in designing XIST crRNA, a structure prediction diagram, and a protein group prediction diagram that binds to the XIST sequence.
  • FIG. 24 shows the results of a functional control verification test of XIST RNA by dCas13.
  • FIG. 25 shows an application using the photoactivated Cas13 (PAdCas13) system.
  • PAdCas13 photoactivated Cas13
  • FIG. 24 uses the application shown in FIG. 24, comprehensive RNA function analysis becomes possible.
  • PRSM Precision RNA Sequence Modification
  • FIG. 26 shows the repair of the (Duchenne) type muscular dystrophy causative factor dystrophin gene mutation at the pre-RNA level.
  • Example 4 PD-1 pre-mRNA of PD-1 positive T cells / NK cells (Fig. 31) T cells that have the ability to recognize and eliminate cancer cells misidentify cancer cells as autologous cells by expressing PD-1, but by using dCas13, T cells around the cancer cells It is possible to generate gene-unmodified chimeric antigen receptor T cells that intentionally suppress the expression of PD-1 and specifically attack cancer cells, which will lead to the development of new immunotherapy (Fig. 31).
  • the target was the expression of exon 2 of PD-1 pre-mRNA, and by changing the structure of the functional sequence of the splicing control protein that binds to intron 1 and intron 2 of PD-1, the pre of PD-1 was targeted. -The purpose was to control the process from mRNA to mature mRNA. The sequence of the guide RNA targeting each sequence is shown (FIG. 32).
  • FIG. 33 Left figure: PA-dCas13 constitutive expression system for human CD8 + T cell line EBT-8, which is a PD-1 expressing cell. After the introduction, a guide RNA targeting the pre-mRNA of PD-1 was introduced. The guide RNA was introduced using a lentiviral vector, and the PD-1 target guide RNAs described above were all introduced simultaneously up to 1-18.
  • Chimeric antigen receptor T cells that have been successfully suppressed in expression will be prepared from lymphocytes derived from patient ascites, and their efficacy and safety will be evaluated in an animal model of peritoneal dissemination.
  • Example 5 Increased translational activity in Luciferase RNA fused with 5'UTR RNA gene information derived from SARS-CoV-2 was observed (Fig. 34).
  • Figure 34 a In the RNA genome of SARS-CoV-2, the region of the 5'UTR gene corresponds to 261 nt located on the 3'side of the ORF1A sequence. The sequence of this 5'UTR region was inserted into the 3'side of the Kozak sequence of the Luciferase RNA sequence of the pGL3-promoter vector.
  • Figure 34b Comparative measurement was performed to see if the expression of Luciferase protein increased in HEK293T and A549 cells depending on the amount of pGL3-promoter or pGL3-5'UTR vector introduced. In HEK293T and A549 cells, enhanced expression of Luciferase protein fused with 5'UTR RNA gene information derived from SARS-CoV-2 was observed. This suggests that the 5'UTR derived from SARS-CoV-2 contains a sequence that enhances the translational activity of mRNA fused in human cells.
  • FIG. 34c In the test conducted in FIG. 34b, it was confirmed by the qPCR method whether or not the expression level of Luciferase mRNA was changed. No transcriptional enhancement of Luciferase mRNA was confirmed. From the above results, we obtained the results showing that 5'UTR derived from SARS-CoV-2 contains a sequence that enhances the translational activity of mRNA fused in human cells. 5'UTR derived from SARS-CoV-2 is expected to be used for molecular genetics research as a novel IRES-like sequence that enhances the translation efficiency of arbitrary mRNA.

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Abstract

本発明は、へリックス領域を有し、ガイドＲＮＡ及び標的ＲＮＡと複合体を形成でき、かつ、ヌクレアーゼ活性を持たないCRISPR-dCas(dead Cas)タンパク質又はヌクレアーゼ活性を持つCRISPR-Casタンパク質において、前記へリックス領域のＮ末端側を含むＮドメインとＣ末端を含むＣドメイン、刺激に応答して結合可能な第１因子と第２因子を含み、Ｎドメインと第１因子、Ｃドメインと第２因子が各々連結され、第１因子と第２因子はプロテアーゼ認識配列を含むリンカーで結合されるか、或いは、第１因子と第２因子は自己切断ペプチド含むリンカーで結合されるか、或いは、第１因子と第２因子が非共有結合されてなり、（Ｎドメイン）－(第１因子)－(プロテアーゼ認識配列を含むリンカー)－(第２因子)－（Ｃドメイン）、或いは、（Ｎドメイン）－(第１因子)－(自己切断ペプチド含むリンカー)－(第２因子)－（Ｃドメイン）、或いは、（Ｎドメイン）－(第１因子)－(非共有結合)－(第２因子)－（Ｃドメイン）の構造を有するCRISPR-dCas/Casタンパク質誘導体、或いは、（Ｎドメイン）－(第１因子)と(第２因子)－（Ｃドメイン）の２つの部分を有するCRISPR-dCas/Casタンパク質およびタンパク質誘導体セットを提供する。

Description

ヒトを含めた生物の細胞にある転写産物および、遺伝子導入されたＲＮＡとその複合体精製ツール
　本発明は、CRISPR-dCas/Casタンパク質誘導体又はセット、ポリヌクレオチド又はその相補鎖、ベクター、形質転換体、担体、標的ＲＮＡの精製方法、細胞内環境の解析方法、新型コロナウイルスの予防又は治療剤、mRNAのスプライシング異常に基づく疾患の治療剤に関する。
　ヒトRNAは生体内で約34万個存在すると言われており、そのうち研究対象となっているRNAは約300個であり、ヒトRNAの約99％は機能が解明されていない。一方、ヒトタンパク質の数は約21000個であり、そのうち約70％が研究対象となっている。
　ヒトRNAの機能解明が遅れているのは、RNAが細胞ごとに一過性に発現する遺伝子であり、かつ抗体認識やビオチンなどによる標識が困難であるので、任意の条件で特定の塩基配列を有するRNAを精製するのが困難であるためである。
　本発明は、RNA分子機能評価できる標的化技術を提供することを１つの目的とする。
　また、本発明は、特定の塩基配列を有するRNAの細胞内での挙動を可視化することを他の目的とする。
　さらに本発明は、新型コロナウイルスの予防又は治療剤、或いは、mRNAのスプライシング異常に基づく疾患の治療剤を提供することを目的とする。
　本発明は、以下のCRISPR-dCas/Casタンパク質誘導体又はセット、ポリヌクレオチド又はその相補鎖、ベクター、形質転換体、担体、標的ＲＮＡの精製方法、細胞内環境の解析方法、新型コロナウイルスの予防又は治療剤、mRNAのスプライシング異常に基づく疾患の治療剤を提供するものである。
項１．　へリックス領域を有し、ガイドＲＮＡ及び標的ＲＮＡと複合体を形成でき、かつ、ヌクレアーゼ活性を持たないCRISPR-dCas(dead Cas)タンパク質又はヌクレアーゼ活性を持つCRISPR-Casタンパク質において、前記へリックス領域のＮ末端側を含むＮドメインとＣ末端を含むＣドメイン、刺激に応答して結合可能な第１因子と第２因子を含み、Ｎドメインと第１因子、Ｃドメインと第２因子が各々連結され、第１因子と第２因子はプロテアーゼ認識配列を含むリンカーで結合されるか、或いは、第１因子と第２因子は自己切断ペプチド含むリンカーで結合されるか、或いは、第１因子と第２因子が非共有結合されてなり、（Ｎドメイン）－(第１因子)－(プロテアーゼ認識配列を含むリンカー)－(第２因子)－（Ｃドメイン）、或いは、（Ｎドメイン）－(第１因子)－(自己切断ペプチド含むリンカー)－(第２因子)－（Ｃドメイン）、或いは、（Ｎドメイン）－(第１因子)－(非共有結合)－(第２因子)－（Ｃドメイン）の構造を有するCRISPR-dCas/Casタンパク質誘導体、或いは、（Ｎドメイン）－(第１因子)と(第２因子)－（Ｃドメイン）の２つの部分を有するCRISPR-dCas/Casタンパク質およびタンパク質誘導体セット。
項２．　前記Ｎドメインはへリックス領域のＮ末端側の一部のアミノ酸配列を含み、前記Ｃドメインはヘリックス領域のＣ末端側の一部のアミノ酸配列を含む、項１に記載のCRISPR-dCas/Casタンパク質およびタンパク質誘導体、或いは、CRISPR-dCas/Casタンパク質およびタンパク質誘導体セット。
項３．　前記ＮドメインはLeptotrichia wadei由来のCas13a（Sequence ID:WP_021746774.1）のへリックス領域のＮ末端側の一部のアミノ酸配列を164アミノ酸含み、前記Ｃドメインはへリックス領域のＣ末端側の一部のアミノ酸配列1,003アミノ酸を含む、項１に記載のCRISPR-dCas/Casタンパク質およびタンパク質誘導体、或いは、CRISPR-dCas/Casタンパク質およびタンパク質誘導体セット。
項４．　前記第１因子がnMAG又はpMAGを含み、前記第２因子がpMAG又はnMAGを含む、項１～３のいずれか１項に記載のCRISPR-dCas/Casタンパク質誘導体、或いは、CRISPR-dCas/Casタンパク質およびタンパク質誘導体セット。
項５．　項１～４のいずれかに記載のCRISPR-dCas/Casタンパク質誘導体、或いは、CRISPR-dCas/Casタンパク質誘導体セットをコードするポリヌクレオチド又はその相補鎖。
項６．　項５に記載の１種又は２種のポリヌクレオチド又はその相補鎖を含む１種又は２種のベクター。
項７．　前記ベクターがアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター又はプラスミドベクターである項６に記載のベクター。
項８．　前記ベクターが２種のベクターであり、一方のベクターが（Ｎドメイン）－(第１因子)の構造を有し、他方のベクターが(第２因子)－（Ｃドメイン）の構造を有する、項７に記載のベクター
項９．　前記ベクターが標的ＲＮＡに対応するガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、項６～８のいずれか１項に記載のベクター。
項１０．　項６～９のいずれか１項に記載のベクターによって形質転換された形質転換体。
項１１．　前記標的ＲＮＡが生体機能および疾患に関連する一群のｌｎｃＲＮＡ(long noncoding RNA)および、ncRNA(noncoding RNA)である、項１～４のいずれかに記載のCRISPR-dCas/Casタンパク質およびタンパク質誘導体セット、或いは、CRISPR-dCas/Casタンパク質およびタンパク質誘導体セット、項５に記載のポリヌクレオチド又はその相補鎖、項６～９のいずれか１項に記載のベクター又は項１０に記載の形質転換体。
項１２．　前記形質転換体が形質転換哺乳動物細胞または形質転換非ヒト哺乳動物である、項１１に記載の形質転換体。
項１３．　前記標的ＲＮＡがＲＮＡウイルス由来のＲＮＡ、新型コロナウイルスのＲＮＡ、合成遺伝子由来のＲＮＡ、lncRNA、ガイドＲＮＡが標的できる30nt以上のncRNA又はプレRNAである、項１～４のいずれかに記載のCRISPR-dCas/Casタンパク質およびタンパク質誘導体、或いは、CRISPR-dCas/Casタンパク質およびタンパク質誘導体セット、項５に記載のポリヌクレオチド又はその相補鎖、項６～９のいずれか１項に記載のベクター又は項１０～１２のいずれか１項に記載の形質転換体。
項１４．　ガイドＲＮＡ及び標的ＲＮＡと複合体を形成でき、かつ、ヌクレアーゼ活性を持たないCRISPR-dCas(dead Cas)タンパク質を固相担体に担持してなる、標的ＲＮＡ精製用担体。
項１５．　項１４記載の担体にガイドＲＮＡと標的ＲＮＡを作用させて前記担体上に前記標的ＲＮＡと前記ガイドＲＮＡと前記CRISPR-dCasタンパク質を含む複合体を形成させる工程、前記複合体から標的ＲＮＡおよびゲノムDNA、タンパク質、標的以外のRNAからなる群から選ばれる標的ＲＮＡ結合因子を溶出させる工程を含む、標的ＲＮＡの精製方法。
項１６．　項１０に記載の形質転換体に複数のガイドRNAを導入もしくは発現させる工程、前記形質転換体を溶解させて標的RNAをRNA捕捉粒子に捕捉させる工程、前記RNA捕捉粒子に結合された標的RNAを解析する工程を含む、細胞内環境の解析方法。
項１７．　前記形質転換体がiPS細胞である、項１６に記載の解析方法。
項１８．　標的ＲＮＡとガイドＲＮＡと光活性化されたｄＣａｓタンパク質の複合体形成により生じた細胞の表現系を回収する工程を含む、項１６又は１７に記載の解析方法。
項１９．　脂質代謝制御物質を有効成分とする、新型コロナウイルスの予防又は治療剤。
項２０．　脂質代謝制御物質がHMG-CoA還元酵素阻害作用またはアセチルCoA還元酵素阻害作用を有する、項１９に記載の新型コロナウイルスの予防又は治療剤。
項２１．　脂質代謝制御物質がアトルバスタチン又はロスバスタチンである、項１９又は２０に記載の新型コロナウイルスの予防又は治療剤。
項２２．　項６～９のいずれか１項に記載のベクターを有効成分とする、mRNA、rRNA（リボソーマルRNA）およびlncRNAのスプライシング異常に基づく疾患の治療剤。
項２３．　CRISPR-dCas/Casタンパク質がヌクレアーゼ活性を持つCas13タンパクである、項１に記載のCRISPR-dCas/Casタンパク質およびタンパク質誘導体、或いは、CRISPR-dCas/Casタンパク質およびタンパク質誘導体セット。
　本発明によれば、所望の塩基配列を有するlncRNA（long non-coding RNA）を容易に精製することができる。
　本発明による当該分割位置に基づくCas13タンパクのペプチドへの分割はリボヌクレアーゼ活性を有するCas13(Cas13)にも適用することができ、活性化Cas13として用いることができる。
　本発明による分割Cas13/dCas13は、前記以外の公知のCas13/dCas13の用途に適用することができる。
　また、本発明によれば、細胞内の標的RNAを精製又は捕捉し、細胞内環境を解析することができる。
　標識された刺激活性化dCas13を使用することで、所望の塩基配列を有するlncRNAの細胞内挙動を可視化することができる。
　さらに、スプライシング異常を主原因とする疾患に対する治療剤を提供できる。
　さらに、RNAウイルス、特に新型コロナウイルス感染症の予防又は治療薬を提供することができる。
RNA複合体精製手法、Trans RNA Immunoprecipitation (TRIP)。 RNA機能の修飾解析への応用、Precision RNA Sequence Modification (PRSM)。 光活性化Cas13(PAdCas13)システムの構築。 光活性化Cas13(PAdCas13)システムの構築。 光活性化Cas13(PAdCas13)システムの構築。 Target lncRNAs with high selectivity。 ヒトのXIST RNAを標的としたRNA可視化実施例。GFPで標識したdCas13を用いて、XIST RNAの細胞核内局在を生細胞にて確認できた。 TRIP法実施モデル図。 SARS-CoV-2の非翻訳領域を対象としたTRIP法の概要。 Transcript from pGL3-SARS-CoV-2.ORF1-Promoter。 ChIP(Chromatin immunoprecipitation)のプロトコール。 SARS-CoV-2を標的としたTRIP解析手法の性能評価１。 SARS-CoV-2を標的としたTRIP解析手法の性能評価２。 SARS-CoV-2由来のRNAがヒトの細胞内で結合するRNAの種類；オントロジーエンリッチメント解析。 SARS-CoV-2を標的としたTRIP解析手法の性能評価３。 SARS-CoV-2を標的としたTRIP解析手法の性能評価４。 アトルバスタチン、ロスバスタチンとHMG-CoAとの結合にS565の水素結合が関与することを示すデータ。 SARS-CoV-2を標的としたTRIP解析手法の性能評価５。 TRIP法で用いたDNA免疫沈降の概要。 光感受性スイッチングシステムの実証試験。 PA-dCas13タンパク質の性能評価試験。(A) lncRNA XISTを標的するガイドRNAを持つdCas13タンパク質が核分画にて発現、（B）ガイドRNAで標的するRNAが局在する部位(核)へdCas13が移行することを細胞画分ごとにwestern blotを実施し確認した。 XIST RNAの結合領域がヒストンコードとの関連があるかを検証した実施例の概要。 Application to ChIP-seq analysis。左図：XIST RNAのDNA上での結合領域が遺伝子の転写開始領域周囲にて規則性を持っているかを可視化した図。左から２列目がXISTを対象としてTRIP法を行った試験結果。左から１列目がcrRNAを用いなかった陰性試験。左から３、４、５列目はヒストン修飾を対象とした集積図。右図、左図の転写開始領域からの集積領域をグラフ化したもの。一番上がXISTを対象としてTRIP法を行った試験結果。三段目のH3K4me3と似た集積パターンを示しており、XISTが転写制御因子である事が窺える。 転写開始部位 (TSS)に集積する標的RNA (XIST)の性質。ガイドRNAにより規定する標的をlong noncoding RNA XISTに設定し、クロマチン免疫沈降法を実施し、既存技術と比較した。本発明の技術は1つないし2つのガイドRNAで高い分解能での検出が可能であった。ON/OFFが即座に可能である点、RNA分子内での比較が可能である点は、既存技術だけでなく、オリジナルとなるdCas13タンパク質でも実現が困難な革新的な性能である。X軸：転写開始部位からの距離（右端が5,000bp、左端が-5,000bp）、Y軸：転写開始領域への集積平均値。 XIRT crRNAをデザインする上で参考にしたRNA構造解析データと、構造予測図、及びXIST配列に結合するタンパク質群予想。 dCas13によるXIST RNAの機能制御検証試験。図２３上図のcrRNAの番号に相当したcrRNAを導入した細胞内にてXIST RNAの特定の配列にdCas13を導入する事で、XIST RNAを介したH3(ヒストンH3)のゲノム上への誘導が阻害されないかと確認した。crRNA1,2,3,5が導入された細胞においてH3のゲノム領域への結合が阻害されており、crRNA1,2,3,5を標的した場合にXISTの機能が阻害される事がわかる。 光活性化Cas13(PAdCas13)システムを用いた用途。SC-sequenceを利用したRNA表現形解析。 （Duchenne）型筋ジストロフィー原因因子ジストロフィン遺伝子変異のプレRNAレベルでの修復。デュシェンヌ型筋ジストロフィーを対象としたエキソン・スキップ治療薬の開発。 pLKO5.U6.crRNA(gene name).tRFP.v1。 pLKO5.U6.crRNA(gene name).tRFP.v1。 pENTR1A.dCas13a.GFP。 pENTR1A.dCas13a.GFP。 pENTR1A.dCas13a.GFP。 pENTR1A.dCas13a.GFP。 pGL3-SARS-CoV-2.ORF1-Promoter。 pGL3-SARS-CoV-2.ORF1-Promoter。 pGL3-SARS-CoV-2.ORF1-Promoter。 ウイルス由来の5’UTRを介した翻訳抑制を確認したesiRNA cDNA標的配列。 PD-1陽性T細胞／NK細胞のPD-1 pre-mRNA。 PD-1 pre-mRNAのイントロン１、２を標的したガイドRNA。 dCas13を利用したPD-1活性除去リンパ球の作成。網羅的RNA標的解析を用いて、PD-1発現制御T細胞の作成に成功した。右図（a） の領域にある細胞が内包するガイドRNA配列およびdCas13タンパク質でのex-vivo製薬の開発が可能となる：CAR-T細胞療法（キムリア）よりも安全な細胞治療薬が提供できる。 SARS-CoV-2に由来する5’UTR RNA遺伝子情報を融合したLuciferase RNAでの翻訳活性の亢進を観測。
　本発明で分離精製、機能解明、疾患の予防又は治療の標的となるRNAとしては、lncRNA、新型コロナウイルスRNAを含むRNAウイルス由来のRNA、スプライシング異常を有するRNAなどが挙げられる。
　本発明において、へリックス領域を有し、ガイドＲＮＡ及び標的ＲＮＡと複合体を形成でき、かつ、ヌクレアーゼ活性を持たないCRISPR-dCasタンパク質又はヌクレアーゼ活性を持つCRISPR-Casタンパク質としては、Cas5/dCas5、Cas6/dCas6、Cas7/dCas7、Cas9/dCas9、Cas10/dCas10、Cas11/dCas11、Cas13/dCas13が挙げられ、Cas13/dCas13が好ましい。
　CRISPR-dCasタンパク質とCRISPR-Casタンパク質は、へリックス領域を有し、前記へリックス領域のいずれかの場所で切断し、切断点からN末端側のＮドメインと切断点からC末端側のＣドメインに分け、Ｎドメインと第１因子を結合させた（Ｎドメイン）－(第１因子)と、Ｃドメインと第２因子を結合させた(第２因子)－（Ｃドメイン）の２つのポリペプチドを形成する。これらのポリペプチドをプロテアーゼ認識配列を含むリンカーもしくは自己切断ペプチドを含むリンカーで結合することで、（Ｎドメイン）－(第１因子)－(プロテアーゼ認識配列を含むリンカー)－(第２因子)－（Ｃドメイン）もしくは（Ｎドメイン）－(第１因子)－(自己切断ペプチドを含むリンカー)－(第２因子)－（Ｃドメイン）で表される１つのタンパク質（CRISPR-dCas/Casタンパク質）を形成してもよく、（Ｎドメイン）－(第１因子)を含むポリペプチドと、(第２因子)－（Ｃドメイン）を含むポリペプチドのセット（CRISPR-dCas/Casタンパク質誘導体セット）としてもよい。このセットが、「２つの部分を有するCRISPR-dCas/Casタンパク質誘導体セット」である。（Ｎドメイン）－(第１因子)－(プロテアーゼ認識配列を含むリンカー)－(第２因子)－（Ｃドメイン）もしくは（Ｎドメイン）－(第１因子)－(自己切断ペプチドを含むリンカー)－(第２因子)－（Ｃドメイン）で表される１つのタンパク質は、プロテアーゼ認識配列または自己切断ペプチドで切断され、（Ｎドメイン）－(第１因子)を含むポリペプチドと、(第２因子)－（Ｃドメイン）を含むポリペプチドのセットとなる。第１因子と第２因子が刺激により結合すると、（Ｎドメイン）－(第１因子)－(非共有結合)－(第２因子)－（Ｃドメイン）で表される１つの複合体を形成し、この複合体と（Ｎドメイン）－(第１因子)－(プロテアーゼ認識配列を含むリンカー)－(第２因子)－（Ｃドメイン）もしくは（Ｎドメイン）－(第１因子)－(自己切断ペプチドを含むリンカー)－(第２因子)－（Ｃドメイン）で表されるタンパク質を合わせて本明細書では「CRISPR-dCas/Casタンパク質誘導体」と称することがある。前記複合体は刺激の非存在下で非共有結合が切れて（Ｎドメイン）－(第１因子)を含むポリペプチドと、(第２因子)－（Ｃドメイン）を含むポリペプチドのセットとなり、第１因子と第２因子の間の非共有結合の形成と切断は刺激の有無により可逆的に生じる。第１因子と第２因子の結合を促進する刺激としては、光（白色光、青色光など）、熱（高温、低温）、ｐＨ（酸性、中性、アルカリ性）、圧力などの物理的刺激、リガンドと受容体の組合せ、化学物質などが挙げられる。刺激が光の場合、第１因子と第２因子の一方がnMAG、他方がpMAGであってもよい。「非共有結合」は、第１因子と第２因子の結合が含まれ、例えば第１因子と第２因子がｎＭＡＧとｐＭＡＧの場合、ｎＭＡＧとｐＭＡＧの結合が「非共有結合」に含まれる。
　プロテアーゼ認識配列は、細胞内のプロテアーゼにより切断されてもよく、CRISPR-dCas/Casタンパク質とともにプロテアーゼ認識配列で切断可能なプロテアーゼを細胞内に導入してもよい。前記リンカーの長さは、当業者に適宜選択され得るが、好ましくは、３個～１００個、より好ましくは５～６０個のアミノ酸からなるペプチドである。プロテアーゼ認識配列としては、当該分野で公知の種々のプロテアーゼ認識配列が使用され得る（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２８３，Ｎｏ．３０，ｐ２０８９７，２００８）。好ましくは、プロテアーゼ認識配列は、CRISPR-dCas/Casタンパク質誘導体もしくはタンパク質誘導体セットが導入される細胞内の細胞内プロテアーゼ認識配列である。細胞内プロテアーゼ認識配列としては、例えば、細胞内プロテアーゼＦｕｒｉｎ、ＰＣ７、及びＰＡＣＥ４が認識するアミノ酸配列が挙げられる。前記リンカーは、プロテアーゼ認識配列からなるペプチドであるか、或いはプロテアーゼ認識配列のＮ末端側及び／又はＣ末端側にさらなるアミノ酸配列を含んでもよい。自己切断ペプチドとしては、例えば文献（Szymczak-Workman, Andrea L et al. “Design and construction of 2A peptide-linked multicistronic vectors.” Cold Spring Harbor protocols vol. 2012,2 199-204. 1 Feb. 2012, doi:10.1101/pdb.ip067876）に記載されるものが挙げられ、この文献はその全体が本明細書に参考として援用される。自己切断ペプチドとしては、例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａなどが挙げられるが、これらに制限されない。
　ＮドメインとＣドメインは、へリックス領域の一部のアミノ酸を有していても有していなくてもよく、へリックス領域のアミノ酸配列を改変してもよく、新たなアミノ酸配列を付加又は挿入してもよく、プロテアーゼ認識配列もしくは自己切断ペプチド或いはリンカーに由来するアミノ酸配列を有していてもよい。
　本発明は、CRISPR-dCas/Casタンパク質誘導体、或いは、CRISPR-dCas/Casタンパク質誘導体セットをコードするポリヌクレオチド又はその相補鎖を包含する。このようなポリヌクレオチドとしては、以下のものが挙げられる：
(i)　（Ｎドメイン）－(第１因子)－(プロテアーゼ認識配列を含むリンカー)－(第２因子)－（Ｃドメイン）もしくは（Ｎドメイン）－(第１因子)－(自己切断ペプチドを含むリンカー)－(第２因子)－（Ｃドメイン）をコードするポリヌクレオチド；
(ii)　（Ｎドメイン）－(第１因子)を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、(第２因子)－（Ｃドメイン）を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが適当なスペーサーヌクレオチド配列を介して連結された；１つのポリヌクレオチド
(iii)　（Ｎドメイン）－(第１因子)を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、(第２因子)－（Ｃドメイン）を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる２種のポリヌクレオチドのセット。
　本発明のベクターは、上記(i)～(iii)のいずれかを含むものであり、上記(i)と(ii)の場合は１つのベクターであり、上記(iii)の場合には、２種のベクターのセットとなる。
　ベクターとしてはプラスミドベクターとウイルスベクターのいずれを使用してもよい。ウイルスベクターとしては、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターが挙げられる。プラスミドベクターとしては、Gatewayシステム用エントリーベクター(pENTRなど)、遺伝子組換え用ドナーベクター、並列移動用のデスティネーションベクターなどが挙げられる。
　ベクターは、CRISPR-dCas/Casタンパク質誘導体、或いは、CRISPR-dCas/Casタンパク質誘導体セットをコードするポリヌクレオチド又はその相補鎖の他に少なくとも１種のガイドRNAをコードしていてもよい。
　本発明の形質転換体は、本発明のベクターで宿主細胞を形質転換することにより作製される。宿主としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、ヤギ、イヌ、サルなどの哺乳動物が挙げられる。宿主細胞がヒト以外の哺乳動物のＥＳ細胞又は受精卵の場合、形質転換細胞から非ヒト哺乳動物を作製でき、本発明の形質転換体は、非ヒト哺乳動物を含む。
　本発明の標的ＲＮＡ精製用担体は、ガイドＲＮＡ及び標的ＲＮＡと複合体を形成でき、かつ、ヌクレアーゼ活性を持たない複数のCRISPR-dCas(dead Cas)タンパク質を固相担体に担持したものである。ヌクレアーゼ活性を持たないCRISPR-dCas(dead Cas)タンパク質としては、dCas5、dCas6、dCas7、dCas9、dCas10、dCas11、dCas13が挙げられ、dCas13が好ましい。
　CRISPR-dCasタンパク質を担持するための固相担体としては、ケイソウ土、活性炭、アルミナ、酸化チタン、架橋処理デンプン粒子、セルロール系高分子、キチンおよびキトサン誘導体などの公知の担体を利用できる。
　CRISPR-dCasタンパク質の固相担体への固定化方法としては、物理吸着法、イオン結合法、包括法、共有結合法などタンパク質の固定化方法として公知の方法を利用できるが、中でも共有結合法が長期安定性に優れ望ましい。ｄＣａｓタンパク質を共有結合させる方法としては、ホルムアルデヒド、グリオキザール、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド基を有する化合物を用いるか、多官能基性アシル化剤を利用する方法、スルフヒドリル基を架橋させる方法など各種の方法を利用できる。標的ＲＮＡ精製用担体は、カラムリアクターに充填して用いることが好ましい。
　図１は、本発明のCRISPR-dCas/Casタンパク質誘導体を用いて細胞内又は細胞溶解液中の標的ＲＮＡの機能解析を行う手法が例示されている。図１では、CRISPR-dCasタンパク質として光活性化dCas13が使用され、inactivated dCas13は青色光又は白色光の照射前(暗所)のdCas13であり、activated dCas13は青色光又は白色光を含む光照射後(明所)のdCas13である。光照射前はcrRNA、inactivated dCas13、標的RNAはバラバラに存在するが、光照射によりactivated dCas13が生成すると、crRNA－activated dCas13－標的RNAの複合体が形成される。標的RNAはDNA、標的以外のRNA、タンパク質などと結合している場合がある。
　図１では、標的RNAにDNA、RNAまたはタンパク質が複合体化されている例が示されている。標的RNAにDNA又はRNAが結合している場合、そのDNA又はRNAを標的RNAから分離して、リアルタイムPCR（qPCR）次世代シーケンシング(NGS)解析することで、標的RNAが結合するDNA又はRNAを特定することができる。また、標的RNAにタンパク質が結合している場合、そのタンパク質を標的RNAから分離してプロテオーム解析することで、標的RNAが結合するタンパク質を特定することができる。このように、標的RNAに結合するDNA、RNA、タンパク質を解析することで、標的RNAの機能を解明することができる。さらに、標的RNAの配列は、qPCRとNGSを組み合わせて解析により決定することができる。これらの解析により細胞内環境を解析することができる。例えば図２は、iPS細胞について分化誘導を行った後の細胞内環境の解析結果が示されている。
　crRNAの配列は、RNA高次構造予測に基づくcrRNAのアルゴリズムに基づきデザインすることができる。標的ＲＮＡ精製用担体には、多数のcrRNAをCRISPR-dCasタンパク質に結合させておき、そこに結合したサンプル中の多数の標的ＲＮＡを配列決定することで、標的ＲＮＡの情報を得ることができる。例えば、疾患の細胞に由来するサンプル中から疾患時に発現される一群のｌｎｃＲＮＡ(long noncoding RNA)を決定することができ、或いは、既に疾患時に発現される一群のｌｎｃＲＮＡの配列が決定されている場合には、その発現パターンが薬物候補化合物によりどのように変化するのかをモニタリングすることで、有効な薬物候補化合物をスクリーニングすることができる。ある疾患とｌｎｃＲＮＡの関係は数多く知られているので、そのような情報を参考にしてcrRNAをデザインすることができる。
　本発明の好ましい１つの実施形態において、細胞内でのｌｎｃＲＮＡの発現、分布、移動などを観察するために光活性化ｄＣａｓタンパク質システム（ＰＡｄＣａｓシステム）を利用することができる。
　図２には、本発明の細胞をPRSM(Precision RNA Sequence Modification)に適用した一例を示す。
　図３～５に本発明のＰＡｄＣａｓシステムの一例が示されている。ＰＡｄＣａｓシステムは、暗所ではCRISPR-dCasタンパク質がガイドＲＮＡ認識ドメインを含むN末端側部分（図３～５のILwaCas13a.N－N MAGに相当）とHEPNドメインを含む第２部分（図３～５のILwaCas13a.C－P MAGに相当）に分かれており、これらを含む細胞に青色光又は白色光を照射するとｎＭＡＧとｐＭＡＧの今フォーメーションが変化してこれらが結合することで活性型のｄＣａｓタンパク質となり、細胞内のcrRNAと標的RNAと結合して形成される複合体を活性型ｄＣａｓの標識(例えば緑色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質)により検出することができる。
ｎＭＡＧとｐＭＡＧの塩基配列及びアミノ酸配列は文献既知である（Nature Communications volume 6, Article number: 6256 (2015)）。
　本発明で使用する、ガイドＲＮＡ及び標的ＲＮＡと複合体を形成でき、かつ、RNAヌクレアーゼ活性を持つ又は持たないタンパク質／CRISPR-Cas/dCasタンパク質はRNAスプライシング機構を制御することができる。例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィーにおいて、４４番目のエキソンにストップコドンが導入された患者の場合、本発明のCas13とエキソン44をスキップするためのガイドRNAを細胞内に導入することで、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療することができる。
　デュシェンヌ型筋ジストロフィーのようなRNAのスプライシング異常を主原因とする疾患を以下の表１～４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　本発明は、さらにヒトを含む哺乳動物の体内での新型コロナウイルスの増殖を抑制することができる新型コロナウイルスの治療薬を提供するものである。
　本発明者の研究により、新型コロナウイルスのタンパク質は哺乳動物、特にヒトの脂質代謝経路を利用して生合成されることが明らかになった。本発明者は脂質代謝経路における新型コロナウイルスタンパク質の生合成を抑制し、それによりウイルス感染を予防し、さらにウイルス感染が成立した場合でもウイルスの増殖を抑制することで新型コロナウイルス感染症の症状を緩和し、重症化を抑制することができるものとして脂質代謝制御物質について試験をしたところ、脂質代謝制御物質がヒト等の哺乳動物、特に脂質代謝制御物質を投与されていないヒトに投与することで、新型コロナウイルスの感染症を予防することができ、新型コロナウイルス感染症に罹患した場合でも軽症から中等症、或いは中等症から重症への移行を抑制するか、少なくとも遅らせることができることを見出した。脂質代謝制御物質は、新型コロナウイルスに感染する前から服用することで、新型コロナウイルスの体内での増殖を抑制できるので、感染症の発症を抑制することができる。脂質代謝制御物質は毒性が低いので、新型コロナウイルス感染の予防に特に有用である。脂質代謝制御物質の投与量は、ヒト成人１日当たり１～１５０ｍｇ程度であり、これを１日１回～４回で分割して投与することができる。
　脂質代謝制御物質としては、メバスタチン、アトルバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチンおよびロバスタチンが挙げられるが、これらに限定されることはない。脂質代謝制御物質は、HMG-CoA還元酵素阻害作用を有するものが好ましい。好ましい脂質代謝制御物質としては、アトルバスタチンとロスバスタチンが挙げられる。
　本発明をＮＫ細胞に適用することでＰＤ－１を抑制することができる。例えば胸膜播種又は腹膜播種患者の胸水または腹水を取り出し、胸水または腹水に含まれるＮＫ細胞のＰＤ－１を抑制し、胸水または腹水に戻すことで、胸膜播種又は腹膜播種を治療することができる。
　例えば抗PD-1抗体と本発明のdCas13複合体を組み合わせることができる。
　抗PD1抗体と本発明のdCas13複合体を用いた正常のPD-1 mRNAの成熟を抑制により、PD-1発現T細胞の活性化を抗体だけでなく、T細胞の内部からもPD-1発現を消失せしめることで、がんをより有効に治療することができる。具体的には、PD-1のpre-mRNAを標的するdCas13をヒトリンパ球細胞で発現させて、外部からの刺激に依存したスプライシング制御を行うことができる。
　以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。
実施例１：Trans RNA Immunoprecipitation (TRIP)を用いたRNA複合体精製手法(図１)
　CRISPR-dCasタンパク質（例えば、CRISPR-dCas 13、以下「dCas13」と略すことがある）として知られているRNA標的配列の認識および結合システムは、 標的配列の28個のヌクレオチドを含むガイドRNA(crRNA)と、光照射により結合可能なpMAGとnMagの組合せのような二分割されるようにデザインされたヌクレアーゼ活性を持たないdCasタンパク質の複合体が標的とする遺伝子を認識して複合体を形成する。例えば、図１において、pMAGとnMagでニ分割されたdCas13の場合、inactivated dCas13は、光照射前でpMAGとnMAGが離れた状態に対応し、activated dCas13は、光照射後でpMAGとnMAGが結合した状態に対応する。inactivated dCas13とactivated dCas13は、例えば熱ショックタンパク質を用いた温度により結合状態と非結合状態が可逆的に変化するシステムを用いてもよい。二分割されたdCasタンパク質は不活性（Inactive）状態であるが、光、熱などの外部刺激により結合し再活性化（Activated）させる事ができる。ここで、再活性化（Activated）はCRISPR-dCasタンパク質が標的RNAとcrRNAとの複合体を形成することを意味する。TRIPテクノロジーを使用して、標的とするRNAとcrRNAとdCas13との複合体の抽出が可能となる。前記複合体には標的RNAと結合する、その他のRNA、DNA、タンパク質などの様々な因子が含まれ得る。場合によっては、細胞抽出液からの特定RNA（リボソームRNAなど）の排除なども可能である。図１において、「Turn ON & immunoprecipitation & wash」は、光照射(Turn ON)によりinactivated dCas13をactivated dCas13に変換し、得られた前記複合体を免疫沈降させ(immunoprecipitation)、その後に洗浄して複合体以外の成分を除去することを意味する。その後の抽出(extraction)により、標的RNA(RNA)とそれに結合しているDNA、タンパク質(protein)又は標的以外のRNAを分離し、DNA/RNAは次世代シークエンスにより配列決定し、タンパク質の場合はプロテオーム解析を実施することができる。
　図１では、細胞抽出液に対しTRIPテクノロジーを適用しているが、TRIPテクノロジーでは、Cas13もしくはdCas13によるRNA標識方法は細胞内、細胞抽出液のいずれにでも適用される。
実施例２
（１）RNA機能の修飾解析への応用（Precision RNA Sequence Modification (PRSM)）
　Cas13もしくはdCas13による標的RNA標識自体が標的としたRNAの機能を修飾する事を利用し、crRNAライブラリーが導入された細胞単位での網羅的なRNAの機能の解析が可能となる。標的RNAの機能修飾は、外部刺激によるInactive-Cas13/dCas13からActive -Cas13/dCas13へとスイッチングで調節可能であり、試験者の望むタイミングでcrRNA及び、Cas13もしくはdCas13が導入された細胞内で現象の観察が可能となる。
　図２ではDroplet-Sequencing (Drop-Seq)での用途を説明する。任意のcrRNA（図２ではcrRNAライブラリー）及び、Cas13/dCas13を導入して、Active -Cas13/dCas13へとスイッチ変換が行われた細胞群に対して、試験者の希望するタイミングでDroplet-Sequencingを施行した場合に、crRNAに標的されたRNA の機能がActive -Cas13/dCas13によって修飾される。その結果、導入されたcrRNAの配列によって細胞ごとに異なった表現系を示すため、次世代シークエンスにより、細胞ごとの表現系として転写産物の発現量解析が可能となる。シングルセルRNA-seq（scRNA-seq）テクノロジーを使用した場合はさまざまな細胞系統の軌跡を追跡することができるため、分子および細胞生物学レベルで事前に設計されたcrRNAライブラリーを使用することによって標的となるRNAが持つ表現系と、RNAの機能を担う配列を同定できる。 図２中のBeadsは、多様なRNAに相補的な多数の配列(例えば標的RNAやガイドRNAのアンチセンスポリヌクレオチド)が結合されており、このビーズに標的RNAが結合する。
　Droplet-Sequencingは公知の手法である(文献名：Shapiro E, et.al. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 2013 Sep;14(9):618-30. doi: 10.1038/nrg3542. Epub 2013 Jul 30. PMID: 23897237. Alizadeh AA, et.al. Toward understanding and exploiting tumor heterogeneity. Nat Med. 2015 Aug;21(8):846-53. doi: 10.1038/nm.3915. PMID: 26248267; PMCID: PMC4785013.)。図２では、Droplet-SequencingをcrRNAと光活性化dCas13（PA-dCas13）をiPS細胞(iPSC)に導入した本発明と組み合わせた実施形態が示されている。PA-dCas13とcrRNAは、リポソーム、リポフェクタミンなどの細胞内にタンパク質、RNAを導入できる公知の手法によりiPS細胞内に導入されてもよく、PA-dCas13とcrRNAをコードするプラスミドベクター、ウイルスベクターなどをiPS細胞に導入し、細胞内でcrRNAと光活性化dCas13（PA-dCas13）を発現させてもよい。
（２）光活性化Cas13(PAdCas13)システムの構築
　Cas13タンパク質の構造解析を行い、HEPN-1及びHEPN-2などの標的RNAの認識及び、crRNAとの結合への影響が少ないと予想されるHelical1領域にて２つのペプチドへの二分割を行った(図３)。分割されたそれぞれのペプチドは、dCas13のN末端ペプチド（Cas13a.N:REC LOBE）、C末端ペプチド（Cas13a.C:NUC LOBE）として二つのペプチドに分けた。
　本実施例では、dCas13a.NのC末端側と、dCas13a.CのN末端側にそれぞれ光感受性に結合する性質を持ったペプチド（pMAGとnMAG）を付加する事で、光（blue light）刺激によって二つに分割したペプチドが再結合し、Cas13が持つcrRNAの誘導下にて標的RNAと複合体を形成する本来の機能を再獲得できる機構を創造した(図４、図５)。分割されたCas13/dCas13ペプチド機能の再獲得に使用できる手法は、光刺激、温度、圧力などの物理刺激のみならず、イオン勾配、薬剤刺激などの化学的な刺激での代替も可能である。
実施例３：ヒトのXIST RNAを標的としたcrRNAでのRNAの精製試験
　RNA ChIP法を用いて、dCas13を介しての免疫沈降（TRIP法）にて細胞抽出液からXIST RNAとXISTと結合するRNAの精製を行った。次世代シークエンス法にて、XIST RNAが高い精製度で抽出できている事が確認できた（図６）。Gateway(登録商標) 特異的組換えに対応したエントリーベクターとしてpENTR1A.dCas13a.GFP（図２８Ａ）を作成し、哺乳動物細胞発現ベクターへの組換えを行った。XISTを標的とするcrRNAを恒常発現するレンチウイルスベクターをpLKO5.U6.crRNA(gene name).tRFP.v1(図２７Ａ)にXIST遺伝子配列を挿入する事で作成した。
　図７は、ヒトのXIST RNAを標的としたRNA可視化実施例を示し、GFPで標識した光活性化dCas13(PAdCas13)を用いて、XIST RNAの細胞核内局在を生細胞にて確認できた。
　図８は、TRIP法実施モデル図である。また、図９は、SARS-CoV-2由来のRNAとヒト細胞内因子の相互作用検証試験の概要を示す。
　ウイルス由来のRNA配列の二次構造を予測し、標的可能となるcrRNAをデザインする。もしくは、ウイルス由来のRNAとcrRNAで標的可能となるTag配列（ルシフェラーゼ配列）と融合させた合成RNA発現ベクターとしてpGL3-SARS-CoV-2.ORF1-Promoter（図２９Ａ）を準備する。本試験ではルシフェラーゼ遺伝子を標的とするcrRNAを恒常発現するレンチウイルスベクターをpLKO5.U6.crRNA(gene name).tRFP.v1にXIST遺伝子配列を挿入する事で作成した。ウイルス感染細胞内（もしくは感染モデル細胞）にてウイルスRNAを標的したcrRNAもしくはTag配列を標的したcrRNAとdCas13を発現させて、任意のタイミングでActivate-Cas13/dCas13に変換させたのちにTRIP法を用いて、ウイルス由来のRNAとその複合体を精製する。DNA/RNAの場合は次世代シークエンスを実施。タンパク質の場合はプロテオーム解析を実施する。実際に行った、SARS-CoV-2の非翻訳領域を対象としたTRIP法の概要を図10に示す。ヒトの細胞内にてSARS-CoV-2由来の非翻訳配列が自身のタンパク質を合成するメカニズムの解明を試みた。
　図１１は、Tag配列（この図ではLuciferaseタンパク質のRNA）とSARS-CoV-2の非翻訳領域の融合RNAの構造解析及び、TRIP法のためのcrRNA配列のデザイン方法を示す。SARS-CoV-2の非翻訳領域が独特の構造を示す事がわかる。
　TRIP法で用いたRNA免疫沈降の概要を図１２に示す。
　図１２は、TRIP法で回収された精製度を確認するためのqPCR解析である。HEK293T細胞及び、A549細胞に図９、図１０のTag融合SARS-CoV-2の非翻訳領域配列もしくはTag配列のみを導入した上で、Tag配列を標的としたTRIP法を行い、回収されたRNAに対して、SARS-CoV-2の非翻訳領域配列の回収効率を比較検討した。Tag融合SARS-CoV-2を導入し且つ、Cas13を介した免疫沈降を行った細胞でおいてのみ、同RNA配列の回収を行う事ができた。
　図１３は、SARS-CoV-2を標的としたTRIP解析手法の性能評価の１例を示す。図１３において、矢印は免疫沈降で得られた脂質代謝に関与する遺伝子群を示す。図１３に示すように、SARS-CoV-2の非翻訳領域配列のRNAがヒトの細胞内で結合するRNA配列に特異性があり、細胞内の代謝機構に有意に結合する事がわかった。
　図１４は、SARS-CoV-2を標的としたTRIP解析手法の性能評価の他の例である。オントロジーエンリッチメント解析によって、図１３にて回収されたRNA群の機能が脂質代謝機構である事がわかった。
　図１５は、SARS-CoV-2を標的としたTRIP解析手法の性能評価の他の例である。Tag融合SARS-CoV-2の非翻訳領域配列もしくはTag配列のみを導入した細胞において、脂質代謝機構の遺伝子発現変化を起こすのかを検証した試験。
　GO解析にて抽出された脂質代謝に関連する遺伝子の転写活性が、SARS-CoV-2 の5’UTR遺伝子発現の更新によって変化するかを検討した。
　ACAA2, HMGcs, FADS1/2,SCDのいずれもが脂質代謝からコレステロール代謝に関わる因子である。HEK293T、A549細胞にてpGL3-5’UTRを発現させた場合、pGL3を発現させた場合と比べて有意に遺伝子発現の変化を確認できた。
　図１６(b)は、図１５(a)の結果の解釈図。SARS-CoV-2由来の5’UTR の発現を高めた系において、A549ではPUFA系への代謝が亢進しており、HEK293T細胞ではコレステロール代謝の系が亢進した。
　図１６(c）市販薬であるスタチンを用いてHMGcsの抑制を試みた。スタチンにてSARS-CoV-2由来の5’UTRによって高まったLuciferaseタンパク質の発現が抑制された。この際に細胞の増殖抑制及びLuciferase RNAの転写抑制は確認できなかった。
　図１６(d) esiRNAによるHMGcs及びACAA2の発現抑制を行い、SARS-CoV-2由来の5’UTRによって高まったLuciferaseタンパク質の発現抑制を確認した。esiRNA（MISSION（登録商標） esiRNA：21bpの数百のsiRNAの不均質なプールで構成されている）で標的する配列の範囲を図１７に示す。
　以上より、脂質代謝の制御がSARS-CoV-2由来の5’UTRによって高まったLuciferaseタンパク質の発現を抑制することがわかった。いずれの抑制系でも細胞株への毒性は確認されておらず、またLuciferase mRNA発現抑制も確認されなかった。したがって、SARS-CoV-2由来の5’UTRによって高まったLuciferaseタンパク質の発現抑制はLuciferase タンパク質の翻訳抑制によるものであることが示されている。
　図１７に示されるように、アトルバスタチンとロスバスタチンはHMG-CoAと結合する際に、多くの結合点（S565）を持つ事がSARS-CoV-2の増殖抑制作用を有する理由の一つとして考えられる。
　図１８は、SARS-CoV-2を標的としたTRIP解析手法の性能評価の他の例であり、SARS-CoV-2の非翻訳領域配列がヒトを含むホスト細胞内にて複合体を形成する法則を示す。SARS-CoV-2（図ではCoV19）の非翻訳領域配列とヒト由来のRNAが結合するためにはヒト側の因子に一定の配列が求められており、これはSARS-CoV-2の非翻訳領域配列とヒトRNAの結合を介在するタンパク質の存在を予想させる。
　図１９は、TRIP法で用いたDNA免疫沈降の概要であり、XIST RNAと結合する、DNAの抽出と解析手順を示す。
　図２０は、光感受性スイッチングシステムの実証試験を示す。光刺激を与えた細胞においてのみ、dCas13-crRNAを介したXIST-DNA複合体の精製が可能であった。生成されたゲノムDNAは既知のXIST RNA結合領域に対したqPCR法にて検出を行った。
　図２１は、図１９に加えて、XIST RNAの結合領域がヒストンコードとの関連があるかを検証した実施例の概要を示す。
　図２２Ａの左図：XIST RNAのDNA上での結合領域が遺伝子の転写開始領域周囲にて規則性を持っているかを可視化した図。左から２列目がXISTを対象としてTRIP法を行った試験結果。左から１列目がcrRNAを用いなかった陰性試験。左から３、４、５列目はヒストン修飾を対象とした集積図。右図、左図の転写開始領域からの集積領域をグラフ化したもの。一番上がXISTを対象としてTRIP法を行った試験結果。三段目のH3K4me3と似た集積パターンを示しており、XISTが転写制御因子である事が窺える。
　図２２Ｂは、lncRNA であるXISTを標的した gRNA-dCas13 mediated pull down（TRIP）の結果より抽出されたXISTが標的するゲノムDNA群へのDNAシークエンスの結果より、転写開始領域への集積を確認した結果図である。分離されたDNAはXIST RNAと相互作用するDNAであり、ヒストン修飾と連絡して遺伝子の転写制御に関与すると知られていた。本試験による結果は、既存技術（例：ChIRP、参照文献：Mol Cell. 2011 Nov 18;44(4):667-78）を上回る集積量（ピークの高さ）と、高い分解度（ピーク狭さ）でのXIST標的配列の抽出を行えたことを実証した結果を示す。
　図２３は、XIST crRNAをデザインする上で参考にしたRNA構造解析データと、構造予測図、及びXIST配列に結合するタンパク質群予想図である。
　図２４は、dCas13によるXIST RNAの機能制御検証試験結果である。
図２３上図のcrRNAの番号に相当したcrRNAを導入した細胞内にてXIST RNAの特定の配列にdCas13を誘導する事で、XIST RNAを介したH3(ヒストンH3)のゲノム上への誘導が阻害されないかと確認した。crRNA1,2,3,5が導入された細胞においてH3のゲノム領域への結合が阻害されており、crRNA1,2,3,5を標的した場合にXISTの機能が阻害される事がわかる。
　図２５は、光活性化Cas13(PAdCas13)システムを用いた用途である。
図２４での用途を利用して、網羅的なRNA機能解析が可能となる。（図２のPrecision RNA Sequence Modification (PRSM)法）。用途例として、iPS細胞を用いての分化誘導試験の中で試験者の望むタイミングで標的RNAの配列特異的な機能を阻害する事が可能となる。
　図２６は、（Duchenne）型筋ジストロフィー原因因子ジストロフィン遺伝子変異のプレRNAレベルでの修復である。Cas13/dCas13によるRNAスプライシング機構の制御と治療応用の可能性検討として、Dystrophin遺伝子のスプライシング制御を試みた。RNAのスプライシング異常を主原因とする疾患は添付図の通りである。
実施例４：PD-1陽性T細胞／NK細胞のPD-1 pre-mRNA（図３１）
　がん細胞を認識して排除する能力を持つT細胞はPD-1を発現することで、がん細胞を自己細胞と誤認するが、dCas13を用いることで、がん細胞の周囲にあるT細胞からPD-1 の発現を意図的に抑制してがん細胞を特異的に攻撃する遺伝子非改変キメラ抗原受容体T細胞を作成し、新規免疫療法の開発につなげることができる（図３１）。
　標的としたのはPD-1 pre-mRNAのエクソン２の発現であり、PD-1のイントロン１及びイントロン２に結合するスプライシング制御タンパク質の機能配列の構造を変化させることで、PD-1のpre-mRNAから成熟mRNAへの行程を制御することを目的とした。それぞれの配列を標的したガイドRNAの配列を示す（図３２）。
　腫瘍細胞攻撃性能を高めた遺伝子非改変キメラ抗原受容体T細胞の作成
図３３左図：PD-1発現細胞であるヒトCD8+T細胞株EBT-8に対して、PA-dCas13恒常発現系を導入した上で、PD-1のpre-mRNAを標的するガイドRNAの導入を行なった。ガイドRNAの導入はレンチウイルスベクターにて行い、先述のPD-1標的ガイドRNAを１－１８まで全て同時に導入した。
図３３右図：aの領域にてEBT-8において、PD-1の選択的な発現抑制を確認した。
　発現抑制に成功したキメラ抗原受容体T細胞を患者腹水由来のリンパ球にて作成し、腹膜播種の動物モデルでの有効性及び、安全性の評価を行う。
実施例５
SARS-CoV-2に由来する5’UTR RNA遺伝子情報を融合したLuciferase RNAでの翻訳活性の亢進を観測（図３４）
図３４ a : SARS-CoV-2 のRNAゲノムで5’UTR遺伝子の領域はORF1A配列の3’側に存在する261ntに相当する。この5’UTR領域の配列をpGL3-promoter ベクターのLuciferase RNA配列のKozak配列の3’側に融合する形で挿入した。
 図３４b: HEK293T及び、A549細胞にてpGL3-promoterもしくはpGL3-5’UTRベクターの導入量に依存的にLuciferaseタンパク質の発現が増すか比較計測した。HEK293T及び、A549細胞にて、SARS-CoV-2に由来する5’UTR RNA遺伝子情報を融合したLuciferase タンパク質の発現亢進を観測した。これは、SARS-CoV-2に由来する5’UTR にヒトの細胞内で融合するmRNAの翻訳活性を亢進させる配列を含まれることを示唆する。
 図３４c: 図３４bで実施した試験において、Luciferase mRNAの発現量が変化していないかをqPCR法で確認した。Luciferase mRNAの転写亢進は確認されなかった。
以上の結果より、SARS-CoV-2に由来する5’UTR にヒトの細胞内で融合するmRNAの翻訳活性を亢進させる配列を含まれることを示す結果を得た。
SARS-CoV-2に由来する5’UTRは、任意のmRNAの翻訳効率を高める新規のIRES様配列として、分子遺伝学研究への活用が期待できる。

Claims (23)

  1. へリックス領域を有し、ガイドＲＮＡ及び標的ＲＮＡと複合体を形成でき、かつ、ヌクレアーゼ活性を持たないCRISPR-dCas(dead Cas)タンパク質又はヌクレアーゼ活性を持つCRISPR-Casタンパク質において、前記へリックス領域のＮ末端側を含むＮドメインとＣ末端を含むＣドメイン、刺激に応答して結合可能な第１因子と第２因子を含み、Ｎドメインと第１因子、Ｃドメインと第２因子が各々連結され、第１因子と第２因子はプロテアーゼ認識配列を含むリンカーで結合されるか、或いは、第１因子と第２因子は自己切断ペプチド含むリンカーで結合されるか、或いは、第１因子と第２因子が非共有結合されてなり、（Ｎドメイン）－(第１因子)－(プロテアーゼ認識配列を含むリンカー)－(第２因子)－（Ｃドメイン）、或いは、（Ｎドメイン）－(第１因子)－(自己切断ペプチド含むリンカー)－(第２因子)－（Ｃドメイン）、或いは、（Ｎドメイン）－(第１因子)－(非共有結合)－(第２因子)－（Ｃドメイン）の構造を有するCRISPR-dCas/Casタンパク質誘導体、或いは、（Ｎドメイン）－(第１因子)と(第２因子)－（Ｃドメイン）の２つの部分を有するCRISPR-dCas/Casタンパク質およびタンパク質誘導体セット。
  2. 前記Ｎドメインはへリックス領域のＮ末端側の一部のアミノ酸配列を含み、前記Ｃドメインはへリックス領域のＣ末端側の一部のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のCRISPR-dCas/Casタンパク質およびタンパク質誘導体、或いは、CRISPR-dCas/Casタンパク質およびタンパク質誘導体セット。
  3. 前記ＮドメインはLeptotrichia wadei由来のCas13a（Sequence ID:WP_021746774.1）のへリックス領域のＮ末端側の一部のアミノ酸配列を164アミノ酸含み、前記Ｃドメインはへリックス領域のＣ末端側の一部のアミノ酸配列1,003アミノ酸を含む、請求項１に記載のCRISPR-dCas/Casタンパク質およびタンパク質誘導体、或いは、CRISPR-dCas/Casタンパク質およびタンパク質誘導体セット。
  4. 前記第１因子がnMAG又はpMAGを含み、前記第２因子がpMAG又はnMAGを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のCRISPR-dCas/Casタンパク質誘導体、或いは、CRISPR-dCas/Casタンパク質およびタンパク質誘導体セット。
  5. 請求項１～４のいずれかに記載のCRISPR-dCas/Casタンパク質誘導体、或いは、CRISPR-dCas/Casタンパク質誘導体セットをコードするポリヌクレオチド又はその相補鎖。
  6. 請求項５に記載の１種又は２種のポリヌクレオチド又はその相補鎖を含む１種又は２種のベクター。
  7. 前記ベクターがアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター又はプラスミドベクターである請求項６に記載のベクター。
  8. 前記ベクターが２種のベクターであり、一方のベクターが（Ｎドメイン）－(第１因子)の構造を有し、他方のベクターが(第２因子)－（Ｃドメイン）の構造を有する、請求項７に記載のベクター
  9. 前記ベクターが標的ＲＮＡに対応するガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項６～８のいずれか１項に記載のベクター。
  10. 請求項６～９のいずれか１項に記載のベクターによって形質転換された形質転換体。
  11. 前記標的ＲＮＡが生体機能および疾患に関連する一群のｌｎｃＲＮＡ(long noncoding RNA)および／または、ncRNA(noncoding RNA)である、請求項１～４のいずれかに記載のCRISPR-dCas/Casタンパク質およびタンパク質誘導体セット、或いは、CRISPR-dCas/Casタンパク質およびタンパク質誘導体セット、請求項５に記載のポリヌクレオチド又はその相補鎖、請求項６～９のいずれか１項に記載のベクター又は請求項１０に記載の形質転換体。
  12. 前記形質転換体が形質転換哺乳動物細胞または形質転換非ヒト哺乳動物である、請求項１０又は１１に記載の形質転換体。
  13. 前記標的ＲＮＡがＲＮＡウイルス由来のＲＮＡ、新型コロナウイルスのＲＮＡ、合成遺伝子由来のＲＮＡ、lncRNA、ガイドＲＮＡが標的できる30nt以上のncRNA又はプレRNAである、請求項１～４のいずれかに記載のCRISPR-dCas/Casタンパク質およびタンパク質誘導体、或いは、CRISPR-dCas/Casタンパク質およびタンパク質誘導体セット、請求項５に記載のポリヌクレオチド又はその相補鎖、請求項６～９のいずれか１項に記載のベクター又は請求項１０～１２のいずれか１項に記載の形質転換体。
  14. ガイドＲＮＡ及び標的ＲＮＡと複合体を形成でき、かつ、ヌクレアーゼ活性を持たないCRISPR-dCas(dead Cas)タンパク質を固相担体に担持してなる、標的ＲＮＡ精製用担体。
  15. 請求項１４記載の担体にガイドＲＮＡと標的ＲＮＡを作用させて前記担体上に前記標的ＲＮＡと前記ガイドＲＮＡと前記CRISPR-dCasタンパク質を含む複合体を形成させる工程、前記複合体から標的ＲＮＡおよびゲノムDNA、タンパク質、標的以外のRNAからなる群から選ばれる標的ＲＮＡ結合因子を溶出させる工程を含む、標的ＲＮＡの精製方法。
  16. 請求項１０に記載の形質転換体に複数のガイドRNAを導入もしくは発現させる工程、前記形質転換体を溶解させて標的RNAをRNA捕捉粒子に捕捉させる工程、前記RNA捕捉粒子に結合された標的RNAを解析する工程を含む、細胞内環境の解析方法。
  17. 前記形質転換体がiPS細胞である、請求項１６に記載の解析方法。
  18. 標的ＲＮＡとガイドＲＮＡと光活性化されたｄＣａｓタンパク質の複合体形成により生じた細胞の表現系を回収する工程を含む、請求項１６又は１７に記載の解析方法。
  19. 脂質代謝制御物質を有効成分とする、新型コロナウイルスの予防又は治療剤。
  20. 脂質代謝制御物質がHMG-CoA還元酵素阻害作用またはアセチルCoA還元酵素阻害作用を有する、請求項１９に記載の新型コロナウイルスの予防又は治療剤。
  21. 脂質代謝制御物質がアトルバスタチン又はロスバスタチンである、請求項１９又は２０に記載の新型コロナウイルスの予防又は治療剤。
  22. 請求項６～９のいずれか１項に記載のベクターを有効成分とする、mRNA、rRNA（リボソーマルRNA）およびlncRNAのスプライシング異常に基づく疾患の治療剤。
  23. CRISPR-dCas/Casタンパク質がヌクレアーゼ活性を持つCas13タンパクである、請求項１に記載のCRISPR-dCas/Casタンパク質およびタンパク質誘導体、或いは、CRISPR-dCas/Casタンパク質およびタンパク質誘導体セット。
     
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