WO2022124665A1 - Gkn1(gastrokine 1) 특이적 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Gkn1(gastrokine 1) 특이적 항체 및 이의 용도 Download PDF

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윤정환
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    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)

Definitions

  • the present invention relates to a novel antibody that specifically binds to a specific epitope of the GKN1 protein and its use for diagnosing gastric cancer.
  • Cancer is a state in which cell proliferation and death are not normally regulated due to various changes in gene expression and abnormal growth of cells is caused. Cancer is a state in which cells infiltrate and destroy adjacent tissues and metastasize to other parts, eventually leading to death. do.
  • the cause of cancer i.e., the mechanism by which normal cells are transformed into cancer cells, has not been precisely elucidated. It is known that internal factors such as , immunological factors, etc. are complicatedly intertwined to cause cancer as a result. Cancer is largely classified into a blood cancer in which the number of blood cells is abnormal and a solid cancer in the form of a mass of cells having a certain hardness and shape in the body.
  • Cancer can occur almost anywhere in the body, including blood and tissues, and examples include lung cancer, stomach cancer, breast cancer, oral cancer, liver cancer, uterine cancer, esophageal cancer, and skin cancer.
  • lung cancer stomach cancer
  • breast cancer oral cancer
  • liver cancer uterine cancer
  • esophageal cancer esophageal cancer
  • skin cancer esophageal cancer
  • chemotherapeutic agents that inhibit cell proliferation are the main methods.
  • gastric cancer GC
  • gastric cancer is one of the most common malignant tumors worldwide and is known as the third leading cause of cancer-related deaths.
  • stomach cancer shows a variety of patterns, ranging from no symptoms at all to severe pain.
  • the symptoms of gastric cancer do not have any characteristics, but represent general digestive symptoms.
  • most of the cases in the early stages of gastric cancer are asymptomatic, and even if there is, it is mild and causes slight indigestion or discomfort in the upper abdomen.
  • gastric X-ray imaging which includes double imaging, compression imaging, and mucosal imaging.
  • a gastroscopy allows direct observation of the stomach, even very small lesions that do not appear on X-ray examination. Not only can it be done, but it is also possible to directly conduct a biopsy at a suspicious location for gastric cancer, increasing the diagnosis rate.
  • this method has disadvantages in that the expertise of the gastroscopic operator is required, and the patient has to suffer pain during the examination and hygiene problems. Therefore, recently, studies have been made to diagnose gastric cancer by measuring the expression level of a genetic marker specifically expressed in gastric cancer, and relatively little research has been done on genetic markers for predicting the prognosis of gastric cancer patients.
  • an antibody is an immune protein that binds to a specific antigen.
  • antibodies are formed by pairing a heavy chain polypeptide and a light chain polypeptide.
  • Each chain consists of two regions called a variable region (Fv) and a constant region (Fc).
  • the light and heavy chain variable regions contain the antigen binding determinants of the molecule and are involved in binding to the target antigen.
  • a constant region defines a class (or isotype) of an antibody (eg, IgG) and is involved in binding to a number of Fc receptors and Fc ligands, conferring a set of important functional properties called effector functions. do.
  • IgG an antibody
  • Fc receptors e.g, Fc receptors and Fc ligands
  • An object of the present invention is to provide a novel antibody against GKN1, and to use the antibody for screening and diagnosis of gastric cancer.
  • the present invention provides an isolated antibody or fragment having immunological activity thereof that specifically binds to GKN1 protein.
  • the present invention provides an isolated nucleic acid molecule encoding the isolated antibody or immunologically active fragment thereof of the present invention, a vector comprising the same, and a host cell transformed with the vector.
  • the present invention provides a method for preparing an antibody specific for GKN1 or a fragment having immunological activity thereof.
  • the present invention provides a composition for screening and diagnosing gastric cancer comprising the isolated antibody of the present invention or a fragment having immunological activity thereof.
  • the present invention provides a gastric cancer screening and gastric cancer diagnostic kit comprising the composition of the present invention.
  • the present invention provides a method for providing information necessary for diagnosing gastric cancer.
  • the present invention provides the use of an isolated antibody or fragment having immunological activity thereof that specifically binds to a single epitope located in the BRICHOS domain of GKN1 protein for gastric cancer screening and diagnosis.
  • the antibody specific to GKN1 developed in the present invention specifically binds to a new epitope, and by using it to check the GKN1 protein level in serum, gastric cancer can be detected (diagnosed) with 100% sensitivity and specificity, so it can be It can be usefully used for screening and diagnostic purposes.
  • FIG. 1 is a diagram showing the production process of anti-GKN1 antibody and its epitope mapping results:
  • Figure 2 is a diagram of determining the anti-GKN1 antibody and serum dilution factor for measuring the GKN1 concentration in the serum using a sandwich ELISA assay:
  • FIG. 3 is a diagram confirming the diagnostic performance of GKN1 protein in serum in ELISA analysis:
  • FIG. 4 is a diagram confirming the diagnostic performance of GKN1 protein in serum in patients with early gastric cancer and advanced gastric cancer:
  • A Comparison of serum GKN1 protein concentrations in healthy individuals, patients with early gastric cancer (EGC) and patients with advanced gastric cancer (AGC);
  • D and E GKN1 protein concentration (cutoff value) in serum for diagnosis of EGC (D) and AGC (E) derived from ROC curve analysis.
  • the present invention relates to an isolated antibody or an immunologically active fragment thereof that specifically binds to a single epitope located in the BRICHOS domain of gastrokine 1 (GKN1) protein.
  • the epitope may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the isolated antibody or fragment having immunological activity thereof comprises a Complementarity determining regions light chain (CDRL1) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, CDRL2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 4 It may include a VL domain comprising a CDRL3 comprising the amino acid sequence of
  • the isolated antibody or fragment having immunological activity thereof is FR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, FR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, FR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or a VL domain comprising FR4 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
  • the isolated antibody or fragment having immunological activity thereof comprises a complementarity determining regions heavy chain (CDRH)1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, CDRH2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: and a VH domain comprising CDRH3 comprising the amino acid sequence of 7.
  • CDRH complementarity determining regions heavy chain
  • the isolated antibody or fragment having immunological activity thereof is FR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, FR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, FR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 or a VH domain comprising FR4 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15.
  • the isolated antibody or immunologically active fragment thereof may comprise a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
  • the isolated antibody or immunologically active fragment thereof may comprise a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17.
  • the isolated antibody or immunologically active fragment thereof may comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.
  • the isolated antibody is a chimeric antibody, a humanized antibody, a bivalent, bispecific molecule, a minibody, a domain antibody, a bispecific antibody, an antibody mimic , may be a diabody, a triabody, a tetrabody, and fragments having immunological activity thereof are Fab, Fd, Fd', Fab', dAb, F(ab'), F( ab') 2 , scFv (single chain fragment variable), Fv, single chain antibody, Fv dimer (dsFv) or complementarity determining region (CDR) fragment may be any one selected from the group consisting of fragments, more preferably scFv do.
  • the antibody is not only in the form of a whole antibody, but also includes functional fragments of antibody molecules.
  • the whole antibody has a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, and each light chain is connected to the heavy chain by a disulfide bond.
  • a functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having antigen-binding function
  • antibody fragments include (i) a light chain variable region (VL) and a heavy chain variable region (VH) and a light chain constant region (CL) and a Fab fragment consisting of the first constant region of the heavy chain (CH1); (ii) an Fd fragment consisting of the VH and CH1 domains; (iii) an Fv fragment consisting of the VL and VH domains of a single antibody; (iv) a dAb fragment consisting of a VH domain (Ward ES et al., Nature 341:544-546 (1989)); (v) an isolated CDR region; (vi) a bivalent fragment comprising two linked Fab fragments F(ab')2 fragments: (vii) single chain Fv molecules (scFv) joined by a peptide linker joining the VH and VL domains to form an antigen binding site (viii) bispecific single chain Fv dim
  • the antibody or fragment having immunological activity thereof of the present invention may be selected from the group consisting of an animal-derived antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody, a human antibody, and a fragment having immunological activity thereof.
  • the antibody may be recombinantly or synthetically produced.
  • An animal-derived antibody produced by immunizing an animal to be immunized with a desired antigen may cause immune rejection when administered to humans for therapeutic purposes, and a chimeric antibody has been developed to suppress such immune rejection.
  • a chimeric antibody is one obtained by substituting a constant region of an animal-derived antibody that causes an anti-isotype reaction with that of a human antibody using a genetic engineering method. Chimeric antibodies have significantly improved anti-isotype response compared to animal-derived antibodies, but still have animal-derived amino acids in the variable region, potentially resulting in anti-idiotypic side effects. are doing A humanized antibody was developed to improve these side effects. This is produced by grafting complementarity determining regions (CDRs), which play an important role in antigen binding, into a human antibody framework among the variable regions of a chimeric antibody.
  • CDRs complementarity determining regions
  • the most important thing in the CDR grafting technology for producing a humanized antibody is to select an optimized human antibody that can best accept the CDR region of an animal-derived antibody. structure analysis, molecular modeling technology, etc. are used. However, even when the CDR regions of an animal-derived antibody are transplanted into the optimized human antibody framework, there are cases in which amino acids that affect antigen binding are present while being located in the framework of the animal-derived antibody, so that antigen-binding ability is not preserved in many cases. Therefore, it can be said that the application of additional antibody engineering technology to restore antigen binding force is essential.
  • the antibody or fragment having immunological activity thereof may be isolated from a living body (not present in the living body) or non-naturally occurring, for example, synthetically or recombinantly produced.
  • the term "antibody” refers to a substance produced by stimulation of an antigen in the immune system, the type is not particularly limited, and can be obtained naturally or non-naturally (eg, synthetically or recombinantly).
  • Antibodies are advantageous for mass expression and production because they are very stable and have a long half-life not only in vitro but also in vivo.
  • the adhesion is very high.
  • a complete antibody has a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, and each light chain is linked to a heavy chain by a disulfide bond.
  • the constant region of an antibody is divided into a heavy chain constant region and a light chain constant region, and the heavy chain constant region has gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ) and epsilon ( ⁇ ) types, subclasses gamma 1 ( ⁇ 1), gamma 2 ( ⁇ 2), gamma 3 ( ⁇ 3), gamma 4 ( ⁇ 4), alpha 1 ( ⁇ 1) and alpha 2 ( ⁇ 2).
  • the constant region of the light chain has kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ) types.
  • the term “heavy chain” refers to a variable region domain V H and three constant region domains C H1 , C H2 and C H3 comprising an amino acid sequence having a variable region sequence sufficient to confer specificity to an antigen. and a full-length heavy chain including a hinge and a fragment thereof.
  • the term “light chain” refers to both full-length light chains and fragments thereof comprising a variable region domain VL and a constant region domain CL comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen. interpreted as including
  • variable region or variable domain refers to a portion of an antibody molecule that exhibits many variations in sequence while performing a function of specifically binding to an antigen, and complementarity in the variable region There are determining regions CDR1, CDR2 and CDR3. Between the CDRs, a framework region (FR) portion exists to support the CDR ring.
  • FR framework region
  • the "complementarity determining region” is a ring-shaped region involved in antigen recognition, and the specificity of the antibody for the antigen is determined as the sequence of this region changes.
  • scFv single chain fragment variable
  • scFv single chain fragment variable
  • CDR complementarity determining region
  • the terms “specifically binding” or “specifically recognized” have the same meaning as commonly known to those skilled in the art, and mean that an antigen and an antibody specifically interact to conduct an immunological reaction. .
  • the term “antigen-binding fragment” refers to a fragment of the entire immunoglobulin structure, and refers to a portion of a polypeptide including an antigen-binding portion. For example, it may be scFv, (scFv) 2 , scFv-Fc, Fab, Fab' or F(ab') 2 , but is not limited thereto.
  • Fab has a structure having a light chain and heavy chain variable regions, a light chain constant region and a heavy chain first constant region (C H1 ), and has one antigen-binding site.
  • Fab' differs from Fab in that it has a hinge region comprising one or more cysteine residues at the C-terminus of the heavy chain C H1 domain.
  • the F(ab') 2 antibody is produced by forming a disulfide bond with a cysteine residue in the hinge region of Fab'.
  • Fv is a minimal antibody fragment having only a heavy chain variable region and a light chain variable region, and a recombinant technique for generating an Fv fragment is well known in the art.
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region are linked by a non-covalent bond
  • single-chain Fv single-chain Fv
  • the linker may be a peptide linker consisting of any amino acids from 1 to 100 or 2 to 50 amino acids, and an appropriate sequence is known in the art.
  • the antigen-binding fragment can be obtained using a proteolytic enzyme (for example, Fab can be obtained by restriction digestion of the entire antibody with papain, and F(ab') 2 fragment can be obtained by digestion with pepsin), It can be produced through genetic recombination technology.
  • a proteolytic enzyme for example, Fab can be obtained by restriction digestion of the entire antibody with papain, and F(ab') 2 fragment can be obtained by digestion with pepsin
  • the term "hinge region” refers to a region included in the heavy chain of an antibody, which exists between the C H1 and C H2 regions, and functions to provide flexibility of the antigen-binding site in the antibody. means area.
  • the hinge may be derived from a human antibody, and specifically, may be derived from IgA, IgE, or IgG, such as IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4.
  • the present invention relates to an isolated nucleic acid molecule encoding an antibody or immunologically active fragment thereof of the present invention, a vector comprising the same, and a host cell transformed therewith.
  • the isolated nucleic acid molecule may include any one selected from the group consisting of nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 19 to 35.
  • the nucleic acid molecules of the present invention may be isolated or recombinant, and include single-stranded and double-stranded forms of DNA and RNA as well as corresponding complementary sequences.
  • An isolated nucleic acid is a nucleic acid that has been separated from surrounding genetic sequences present in the genome of the individual from which the nucleic acid was isolated, in the case of a nucleic acid isolated from a naturally occurring source.
  • a nucleic acid synthesized enzymatically or chemically from a template such as a PCR product, a cDNA molecule, or an oligonucleotide
  • a nucleic acid resulting from such a procedure can be understood as an isolated nucleic acid molecule.
  • nucleic acid molecule refers to a nucleic acid molecule in the form of separate fragments or as a component of a larger nucleic acid construct.
  • Nucleic acids are operably linked when placed into a functional relationship with another nucleic acid sequence.
  • the DNA of the presequence or secretion leader is operably linked to the DNA of the polypeptide when expressed as a preprotein in the form before the polypeptide is secreted
  • the promoter or enhancer is the polypeptide sequence is operably linked to a coding sequence when it affects the transcription of, or a ribosome binding site is operably linked to a coding sequence when positioned to facilitate translation.
  • operably linked DNA sequences are located contiguously, and in the case of a secretory leader, it means that they are contiguous and in the same reading frame.
  • enhancers need not be located adjacent to each other. Linkage is achieved by ligation at convenient restriction enzyme sites. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used according to conventional methods.
  • An isolated nucleic acid molecule encoding an antibody or immunologically active fragment of the present invention is expressed from a coding region due to codon degeneracy or in consideration of codons preferred in the organism in which the antibody is to be expressed.
  • Various modifications may be made to the coding region within the range that does not change the amino acid sequence of the antibody, and various modifications or modifications may be made within the range that does not affect the expression of the gene even in parts other than the coding region, such modifications It will be well understood by those skilled in the art that genes are also included within the scope of the present invention.
  • nucleic acid molecule of the present invention encodes a protein having an equivalent activity
  • one or more nucleic acid bases may be mutated by substitution, deletion, insertion, or a combination thereof, and these are also included in the scope of the present invention.
  • the sequence of such a nucleic acid molecule may be single-stranded or double-stranded, and may be a DNA molecule or an RNA (mRNA) molecule.
  • An isolated nucleic acid molecule encoding an antibody of the present invention or an immunologically active fragment thereof according to the present invention can be inserted into an expression vector for protein expression.
  • Expression vectors usually comprise a protein operably linked, ie, placed in a functional relationship, with regulatory or regulatory sequences, selectable markers, optional fusion partners, and/or additional elements.
  • the present invention by a method for inducing protein expression by culturing a host cell transformed with a nucleic acid, preferably an expression vector containing an isolated nucleic acid molecule encoding an antibody of the present invention or an immunologically active fragment thereof Antibodies of the invention or fragments having immunological activity thereof can be produced.
  • host cells can be used, including, but not limited to, mammalian cells, bacteria, insect cells, and yeast. Methods for introducing an exogenous nucleic acid into a host cell are known in the art and will vary depending on the host cell used.
  • E. coli which has a high industrial use value due to low production cost, can be produced as a host cell.
  • the vector of the present invention includes, but is not limited to, a plasmid vector, a cosmid vector, a bacteriophage vector, and a viral vector.
  • Suitable vectors include a signal sequence or leader sequence for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as promoter, operator, start codon, stop codon, polyadenylation signal and enhancer, and may be prepared in various ways depending on the purpose.
  • the promoter of the vector may be constitutive or inducible.
  • the signal sequence includes a PhoA signal sequence and an OmpA signal sequence when the host is Escherichia sp., and an ⁇ -amylase signal sequence and a subtilisin signal when the host is a Bacillus sp.
  • the vector may also contain a selection marker for selecting a host cell containing the vector, and in the case of a replicable expression vector, an origin of replication.
  • vector refers to a carrier capable of inserting a nucleic acid sequence for introduction into a cell capable of replicating the nucleic acid sequence.
  • Nucleic acid sequences may be exogenous or heterologous.
  • Vectors include, but are not limited to, plasmids, cosmids, and viruses (eg, bacteriophages).
  • viruses eg, bacteriophages.
  • One skilled in the art can construct vectors by standard recombinant techniques (Maniatis, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988; and Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Inc, NY, 1994 et al.).
  • expression control sequences such as promoter, terminator, enhancer, etc., membrane targeting or secretion according to the type of host cell in which the antibody is to be produced. Sequences and the like can be appropriately selected and combined in various ways depending on the purpose.
  • expression vector refers to a vector comprising a nucleic acid sequence encoding at least a portion of a transcribed gene product. In some cases, the RNA molecule is then translated into a protein, polypeptide, or peptide.
  • the expression vector may include various regulatory sequences. In addition to regulatory sequences that control transcription and translation, vectors and expression vectors may contain nucleic acid sequences that also serve other functions.
  • the term "host cell” includes eukaryotes and prokaryotes, and refers to any transformable organism capable of replicating the vector or expressing a gene encoded by the vector.
  • a host cell may be transfected or transformed by the vector, which refers to a process in which an exogenous nucleic acid molecule is delivered or introduced into a host cell.
  • the host cell may be a bacterium or an animal cell
  • the animal cell line may be a CHO cell, a HEK cell or an NSO cell
  • the bacterium may be E. coli.
  • the present invention provides a method comprising: culturing a host cell transformed with a vector comprising an isolated nucleic acid molecule encoding an isolated antibody of the present invention or a fragment having immunological activity; And it relates to a method for producing an antibody or fragment having immunological activity specific to GKN1, comprising the step of recovering the antibody or fragment having immunological activity thereof from host cell culture.
  • the present invention relates to a composition for screening and diagnosing gastric cancer comprising the isolated antibody or immunologically active fragment thereof of the present invention.
  • the composition may be a composition for measuring the level of GKN1 protein in blood, plasma or serum, most preferably for measuring the level of GKN1 protein in serum.
  • the measurement is Western blot, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay (Immunoprecipitation assay) , complement fixation assay (Complement Fixation Assay), FACS, mass spectrometry, or a method selected from the group consisting of protein microarray, most preferably measured by ELISA.
  • ELISA enzyme linked immunosorbent assay
  • RIA radioimmunoassay
  • immunoelectrophoresis immunoelectrophoresis
  • tissue immunostaining immunoprecipitation assay
  • immunoprecipitation assay immunoprecipitation assay
  • complement fixation assay complement fixation assay
  • FACS mass spectrometry
  • mass spectrometry or a method selected from the group consisting of protein microarray, most preferably measured by ELISA.
  • the composition may be for ELISA analysis.
  • the gastric cancer may be early gastric cancer or advanced gastric cancer.
  • the present invention relates to a gastric cancer screening and diagnostic kit comprising the composition.
  • the kit may further include tools and/or reagents for collecting a biological sample from a subject or patient, as well as tools and/or reagents for preparing genomic DNA, cDNA, RNA or protein from the sample. have.
  • it may include PCR primers for amplifying a relevant region of genomic DNA.
  • the kit may include probes of genetic factors useful for pharmacogenomic profiling.
  • the labeled oligonucleotide can be easily identified during analysis.
  • the kit may further contain a labeling material such as a DNA polymerase and dNTPs (dGTP, dCTP, dATP and dTTP), a fluorescent material, and the like.
  • a labeling material such as a DNA polymerase and dNTPs (dGTP, dCTP, dATP and dTTP), a fluorescent material, and the like.
  • the present invention relates to a method of providing information necessary for diagnosing gastric cancer, comprising measuring the GKN1 protein level in a biological sample isolated from a test subject.
  • the method may further include determining that the test subject has gastric cancer when the GKN1 protein level is 6.608 ng/ml or less.
  • the biological sample may be blood, plasma or serum, more preferably serum.
  • the gastric cancer may be early gastric cancer or advanced gastric cancer.
  • the GKN1 protein level may be measured by an ELISA assay method, and the optimal concentration of the anti-GKN1 antibody of the present invention for measuring the serum GKN1 protein level by the ELISA assay method may be 0.5 ug/ml, The optimal dilution of the serum may be 100-fold.
  • the present invention relates to the use of an isolated antibody or fragment having immunological activity thereof, which specifically binds to a single epitope located in the BRICHOS domain of the GKN1 protein, for gastric cancer screening and diagnosis.
  • a phage display test method with selectivity and specificity for a specific antigen was used. Specifically, after immobilizing the human recombinant GKN1 protein on a solid phase, it was incubated with scFv phage libraries expressing the heavy and light chain variable domains of various antibodies on the surface of M13 bacteriophage. Unbound phage was washed away and high-affinity phage was eluted from the immobilized antigen. The eluted phages were infected by incubation with E. coli host cells, and a subpopulation of phages expressing antibodies having affinity for GKN1 was amplified.
  • the panning process was repeated 3 times. After culturing colonies of infected bacteria on a plate, monoclonal scFv (single-chain variable fragment) is generated from each colony, and monoclonal scFv that specifically binds to recombinant GKN1 protein is selected as an independent clone unit using ELISA. (total 95). Among them, five antibodies without Fc and BSA background were obtained, and the monoclonal conjugate with the lowest BSA background was amplified by PCR and inserted into a mini-body (scFv-Fc) expression vector. Then, the recombinant plasmid was transfected into 293F cells and the monoclonal mini-body was purified using affinity chromatography (FIG. 1A).
  • monoclonal scFv single-chain variable fragment
  • the amino acid sequences of the heavy and light chain variable regions (regions) of the anti-GKN1 antibody prepared in Example 1 were determined. Specifically, after extracting the phagemid DNA of the anti-GKN1 antibody, PCR-sequencing (ABI3730XL, Sanger-method sequencing, Phred Score>20) (primer sequence: Forward: 5'-AAGACAGCTATCGCGATTGCAG-3' and reverse: 5'-GCCCCCTTATTAGCGTTTGCCATC -3') was used to determine the DNA sequences of the heavy and light chain variable regions of the anti-GKN1 antibody, and the sequences of the VL, linker, VH and CDRs (complementarity determining regions) of the antibody were indicated (FIG. 1B) .
  • the linear epitope of the antibody was mapped using PEPperMAP® technology (PEPperPRINT GmbH, Heidelberg, Germany), a microarray technology containing 199 peptides. .
  • PEPperMAP® technology PEPperPRINT GmbH, Heidelberg, Germany
  • the C-terminus and N-terminus of the sequence of GKN1 were extended with a neutral GSGSGSG linker.
  • the extended antigen sequence was translated into a linear 15 amino acid peptide with a 14 amino acid peptide-peptide overlap.
  • a conformational GKN1 peptide microarray was constructed to contain overprinted 199 different peptides (398 peptide spots) and additionally include human influenza hemagglutinin (HA, YPYDVPDYAG, 76 spots) as a control peptide.
  • Hybridoma supernatants containing anti-GKN1 antibody were diluted with incubation PBS buffer (pH 7.4, with 0.005% Tween 20) and 10% MB-070 blocking buffer (Rockland Immunochemicals, Limerick, Pennsylvania, USA), and the peptide micro
  • the array was incubated at 4° C. at 140 rpm for 16 hours.
  • the array was washed with wash buffer (PBS, pH 7.4, with 0.005% Tween 20) to remove unbound antibodies.
  • the peptide arrays were then stained with goat anti-human IgG (H+L) conjugated with DyLight680 (Thermo Fisher Scientific) at 0.2 ⁇ g/mL.
  • the anti-GKN1 monoclonal antibody of the present invention was labeled using the FluoReporter FITC Protein Labeling Kit (Molecular Probes). Different amounts of (component A) FITC-labeled dye were constructed (reaction volumes 1, 3 and 10 ⁇ L), and the fluorescence:antibody (F:A) ratio of the dye at 280 nm based on A280 and A494 absorbance readings. Calculated according to the kit's instructions, including the recommended correction factor for the absorbance of
  • the anti-GKN1 monoclonal antibody was serially diluted to 0.25, 0.5, 1 and 2 ug/ml, and the coefficient of variation (CV) was calculated in the logistic regression model using softMaxPro. estimated.
  • CV coefficient of variation
  • ELISA condition optimization conditions that achieved a large amount of antecedent association (R 2 >0.8), and the limit of detection (LOD), lower limit of quantification (LOQ) and recombinant GKN1 protein, human serum and anti-GKN1 antibody Analytical parameters such as dilution linearity were evaluated.
  • microtiter plate was coated with another anti-GKN1 monoclonal antibody (H7) prepared in Example 1 and sealed with an adhesive sealing film for microplates (ImmunoChemistry Technologies, MN, USA). After blocking the wells with 300 ul/well of a blocking solution, the plate was incubated overnight at room temperature under dark conditions. After that, it was washed twice with PBS buffer and corrected with recombinant human GKN1 protein. Thereafter, the serum sample and recombinant GKN1 protein prepared above were put into each well and incubated at 37° C. for 1 hour.
  • H7 anti-GKN1 monoclonal antibody
  • FITC-conjugated anti-GKN1 monoclonal antibody was added, followed by incubation at room temperature for 2 hours.
  • GKN1 levels in serum were determined at an excitation wavelength of 485 nm and an emission wavelength of 528 nm using a Synergy H1 plate reader ELISA reader (Bio-Tek).
  • the H7 anti-GKN1 antibody was diluted 6,800-fold (0.25 ug/ml) and coated on a microplate, and the recombinant GKN1 protein as a calibrator, and a FITC-conjugated anti-GKN1 antibody of the present invention was used in a sandwich ELISA assay using CV (variation coefficient) ) was 0.39 to 1.69 for the recombinant GKN1 protein and 0.98 for the PBS sample.
  • the LOD was 0.628 ng/ml
  • the LOQ was 4.718 ng/ml (FIG. 2B).
  • the optimal concentration of the anti-GKN1 antibody of the present invention to measure the level of GKN1 in serum was 0.5 ug/ml.
  • Serum dilution concentrations of 1:5, 1:10, 1:50 and 1:100 of 20 different healthy sera were evaluated to determine the optimal dilution of sera.
  • the mean ⁇ SD of the GKN1 concentration in the serum in the serum diluted at 1:1 and 1:100 was 9.799 ⁇ 1.33 ng/ml and 9.42 ⁇ 1.41 ng/ml, respectively, and 13.52 to 14.96 in the serum dilution analysis result.
  • Example 3 the level of GKN1 in serum samples of healthy subjects and gastric cancer patients was confirmed by ELISA analysis.
  • a receiver-operator characteristic (ROC) curve analysis was performed, and the optimal cutoff level of the serum GKN1 concentration for gastric cancer detection was determined using this.
  • Sensitivity true positive fraction; TPF
  • specificity true negative fraction; TPF
  • FNF false negative fraction
  • FPF false positive fraction
  • PPV positive based on the cut-off value of the GKN1 protein level in the serum predictive value
  • negative predictive value NPV
  • accuracy positive likelihood ratio (LR+), negative likelihood ratio (LR-) and diagnostic odds ratio (DOR) were determined.
  • the sensitivity and specificity for gastric cancer diagnosis were 100% and 100%, respectively (Fig. 3B and Table 2), and PPV and NPV were also 100% and 100%, respectively (Table 2) .
  • diagnostic accuracy and DOR in serum GKN1 cut-off values were 1 and 0, respectively (Table 2). Therefore, it can be seen that the ELISA analysis of GKN1 protein in serum using the anti-GKN1 antibody of the present invention can be used as a gastric cancer screening or diagnostic tool with very high sensitivity and specificity.
  • the level of GKN1 protein in serum is 4.085 ⁇ 1.27 ng/ml for EGC and 1.587 ⁇ 0.895 ng for AGC. /ml was significantly lower than that of healthy individuals, and in particular, the AGC patient group was lower than the EGC patient group (FIG. 4A and Table 3).

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Abstract

본 발명은 GKN1 단백질의 특정 에피토프에 특이적으로 결합하는 신규한 항체 및 이의 위암 진단 용도에 관한 것으로, 본 발명에서 개발한 GKN1에 특이적인 항체는 새로운 에피토프에 특이적으로 결합하며, 이를 이용하여 혈청 내 GKN1 단백질 수준을 확인함으로써 위암을 민감도 및 특이도 100%로 검출 (진단)할 수 있으므로, 이를 위암 스크리닝 및 진단 용도로 유용하게 활용할 수 있다.

Description

GKN1(GASTROKINE 1) 특이적 항체 및 이의 용도
본 발명은 GKN1 단백질의 특정 에피토프에 특이적으로 결합하는 신규한 항체 및 이의 위암 진단 용도에 관한 것이다.
암(cancer)은 유전자 발현의 다양한 변화에 의하여 세포의 증식과 사멸이 정상적으로 조절되지 않고 세포의 비정상적인 성장이 야기된 상태로, 인접한 조직에 침투하여 파괴하고 다른 부위로 전이하여 결국 사람이 사망에 이르게 한다. 암을 유발하는 원인, 즉 정상세포가 어떠한 기전을 거쳐 암 세포로 형질전환 되는지에 대해서는 정확히 규명되지는 않았으나, 현재까지 알려진 바에 따르면 암은 환경요인, 화학물질, 방사선, 바이러스 등 외적 요인 및 유전 인자, 면역학적 요인 등의 내적 요인 등이 복잡하게 얽혀 결과적으로 암을 유발하는 것으로 알려져 있다. 암은 혈액 세포 수에 이상을 보이는 혈액암과 신체 내에서 일정한 경도와 형태를 갖는 세포 덩어리 형태의 고형암으로 크게 분류된다. 암은 혈액, 조직 신체의 거의 전 부위에서 발생할 수 있으며, 폐암, 위암, 유방암, 구강암, 간암, 자궁암, 식도암, 피부암 등을 예로 들 수 있다. 암의 치료에는 대부분 수술이나 방사선 요법 및 세포 증식을 억제하는 화학 요법제를 이용한 항암제 치료가 주된 방법이다. 이 중, 위암(gastric cancer; GC)은 전 세계적으로 가장 많이 발생하는 악성 종양 중 하나이며 암으로 인한 사망의 세 번째 주요 원인으로 알려져 있다. 또한, 대부분의 위암 환자가 진행성 단계에 있고 대부분 예후가 매우 좋지 않은 것으로 보고되어 있다. 전이성 위암에서는 백금을 기반으로 한 병용 화학 요법이 표준 치료법으로 간주되지만 많은 환자들이 상기 치료법에 불응성을 가지며, 반응성을 나타내는 환자들의 경우에도 반응 기간이 수 개월 정도로 짧은 것으로 알려져 있다. 또한, 인간 표피성장인자수용체 2(epidermal growth factor receptor 2; EGFR2) 양성 종양 환자에서 트라스투주맙(trastuzumab) 및 2차 치료제로써 라무시루맙(ramucirumab)을 제외하고는 신규 표적약물에 대한 임상 시험을 통해 위암을 성공적으로 치료한 성과를 얻지 못하였다. 위암에서 생존율이 낮은 이유로는 위암이 치료법에 대한 공격성 및 반응성이 상당히 상이한 이질적인 질환이며, 환자 각각에서 임상적 결과 및 예후가 보고된 데이터들과 항상 일치하지 않는다는 것이다. 위암의 증상은 전혀 증상이 없는 경우에서부터 격심한 통증에 이르기까지 다양한 양상을 나타내고 있다. 또한, 위암의 증상은 어떤 특성을 가지는 것이 아니라 일반적인 소화기 증상을 나타낸다. 일반적으로 위암의 초기에는 증상이 없는 경우가 대부분이며, 있다고 하더라도 경미하여 약간의 소화불량이나 상복부 불편감을 느끼는 정도이므로 대부분의 사람들이 이를 간과하기 쉬워 위암의 사망률을 높이는 원인이 되기도 한다.
현재까지의 위암의 검사수단은 물리적인 것이 대부분이었다. 그 첫번째로는 위장 X-선 촬영으로 이중조영법, 압박촬영법, 점막촬영법 등이 있으며, 두번째로는 위내시경으로 위속을 직접 눈으로 들여다 볼 수 있게 하여, X선 검사에서 나타나지 않는 아주 작은 병변도 발견할 수 있을 뿐 아니라 위암이 의심스러운 장소에서 직접조직검사를 시행할 수도 있어, 그 진단율을 높이고 있다. 하지만, 이 방법은 위 내시경 시술자의 전문성이 필요하고, 위생상의 문제와 검사가 진행되는 동안 환자로 하여금 고통을 감수해야 하는 단점이 있었다. 따라서, 최근에는 위암에서 특이적으로 발현되는 유전자 마커의 발현수준을 측정함으로써 위암을 진단하려는 연구가 이루어지고 있으며, 위암 환자의 예후를 예측하기 위한 유전자 마커에 대한 연구는 상대적으로 덜 이루어지고 있다.
종래에는 위암 환자의 예후를 예측하기 위하여 해부학적인 관찰방법(암세포의 침윤 정도 및 전이된 림프절의 개수)을 사용하였으나, 의사의 주관적인 판단이 개입될 수 있고, 예후를 정확하게 예측하는데 한계가 있었다. 또한, 위암 수술 후 회복 속도를 향상시키기 위하여, 백금을 이용한 보조화학요법으로 위암 환자의 생존율을 향상시키고자 하는 시도가 있어 왔으나 (Paoletti X. et al.,JAMA 303(17):1729~1737; Lim L. et al., J. Clin. Oncol. 23(25):6220~6232), 30~50%의 환자들이 치료적 절제술 후 종양 재발을 겪으며, 화학요법의 효과는 종양생물학적 관점에서 차이가 있는 것으로 나타났다 (Sasako M. et al., J. Clin. Oncol. 29(33):4387~4393). 따라서, 절제술을 받은 위암 환자들에 화학요법을 적용하기 위한 임상적 또는 생물학적 예측인자(predictor)의 개발이 요구되는 실정이다.
한편, 항체는 특정 항원과 결합하는 면역 단백질이다. 인간과 마우스를 비롯한 대부분의 포유동물에 있어서, 항체는 중쇄 폴리펩티드와 경쇄 폴리펩티드가 쌍을 이루어 형성된다. 각각의 사슬은 가변 영역 (Fv) 및 불변 영역 (Fc)이라 불리는 2개의 영역으로 이루어져 있다. 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 분자의 항원 결합 결정기를 포함하며, 표적 항원과의 결합에 관여한다. 불변 영역은 항체의 군(또는 동 기준 표본형)을 한정하며 (예를 들어, IgG), 효과기 작용이라 불리는 일련의 중요한 기능상의 특성들을 부여하는, 다수의 Fc 수용체 및 Fc 리간드와의 결합에 관여한다. 예를 들어, 표적에 대한 특이성, 면역 작용기 기작을 매개하는 능력 및 긴 혈청 반감기와 같은 몇몇 중요한 항체의 특성으로 말미암아 항체는 강력한 치료제로서 사용되고 있다.
본 발명에서는 GKN1에 대한 신규한 항체를 제공하고, 상기 항체를 위암의 스크리닝 및 진단 용도로 사용하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 GKN1 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자, 이를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 GKN1에 특이적인 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 포함하는 위암 스크리닝 및 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 위암 스크리닝 및 위암 진단 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 위암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 GKN1 단백질의 BRICHOS 도메인에 위치한 단일 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편의 위암 스크리닝 및 진단 용도를 제공한다.
본 발명에서 개발한 GKN1에 특이적인 항체는 새로운 에피토프에 특이적으로 결합하며, 이를 이용하여 혈청 내 GKN1 단백질 수준을 확인함으로써 위암을 민감도 및 특이도 100%로 검출 (진단)할 수 있으므로, 이를 위암 스크리닝 및 진단 용도로 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 항-GKN1 항체의 생산 과정 및 이의 에피토프 맵핑 결과를 나타낸 도이다:
A: 항-GKN1 항체 제작 과정;
B: 항-GKN1 항체의 핵산 및 아미노산 서열;
C: GKN1 항체가 결합하는 컨센서스 모티프 KGPGGPPPK 주변의 인접 펩타이드들로 형성된 에피토프-유사 스팟 패턴에 대한 형광 강도; 및
D: 항-GKN1 항체의 에피토프 개략도
도 2는 sandwich ELISA 분석을 이용한 혈청 내 GKN1 농도 측정을 위한 항-GKN1 항체 및 혈청 희석 인자를 결정한 도이다:
A: 항-GKN1 단일클론 항체의 캡쳐로서의 재조합 GKN1 단백질의 ELISA 표준 곡선;
B: 분석의 추정된 교정 곡선;
C: 혈청 희석도에 따른 혈청 내 GKN1 단백질 농도; 및
D: 혈청 희석도에 따른 혈청 내 GKN1 단백질 농도의 선형 회귀.
도 3은 ELISA 분석에서 혈청 내 GKN1 단백질의 진단 성능을 확인한 도이다:
A: 위암 환자 vs 건강한 개체의 혈청 내 GKN1 단백질 농도 비교;
B: 항원 GKN1 테스트로 얻은 ROC 곡선; 및
C: ROC 곡선 분석으로 도출한 위암(GC) 진단을 위한 혈청 내 GKN1 단백질의 최적 컷오프 값.
도 4는 조기 위암 및 진행성 위암 환자에서의 혈청 내 GKN1 단백질의 진단 성능을 확인한 도이다:
A: 건강한 개체, 조기 위암 환자 (EGC) 및 진행성 위암 환자 (AGC)에서의 혈청 내 GKN1 단백질 농도 비교;
B 및 C: EGC (B) 및 AGC (C)의 혈청 시료를 이용한 항원 GKN1 테스트로 얻은 ROC 곡선; 및
D 및 E: ROC 곡선 분석을 통해 도출한 EGC (D) 및 AGC (E)의 진단을 위한 혈청 내 GKN1 단백질 농도 (컷오프 값).
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서 전반을 통하여, 천연적으로 존재하는 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용될 뿐만 아니라 Aib(α-아미노이소부티르산), Sar(N-methylglycine) 등과 같은 다른 아미노산에 대해 일반적으로 허용되는 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 발명에서 약어로 언급된 아미노산은 하기와 같이 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다:
알라닌: A, 아르기닌: R, 아스파라긴: N, 아스파르트산: D, 시스테인: C, 글루탐산: E, 글루타민: Q, 글리신: G, 히스티딘: H, 이소류신: I, 류신: L, 리신: K, 메티오닌: M, 페닐알라닌: F, 프롤린: P, 세린: S, 트레오닌: T, 트립토판: W, 티로신: Y 및 발린: V.
일 측면에서, 본 발명은 GKN1(gastrokine 1) 단백질의 BRICHOS 도메인에 위치한 단일 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1(Complementarity determining regions light chain), 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3를 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 FR1, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 FR2, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 FR3 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 FR4를 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH(Complementarity determining regions Heavy chain)1, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3를 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 FR1, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 FR2, 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 FR3 또는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 FR4를 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단리된 항체는 키메라 항체, 인간화 항체(humanized antibody), 이가(bivalent), 양특이성 분자, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체(bispecific antibody), 항체 모방체, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody)일 수 있으며, 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 Fab, Fd, Fd', Fab', dAb, F(ab'), F(ab')2, scFv(single chain fragment variable), Fv, 단일쇄 항체, Fv 이량체(dsFv) 또는 상보성 결정 영역(CDR) 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, scFv인 것이 더욱 바람직하다.
상기 항체는 전체(whole) 항체 형태일 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(heavy chain)를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합(disulfide bond)으로 연결되어 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, 항체 단편의 예는 (i) 경쇄의 가변영역(VL) 및 중쇄의 가변영역(VH)과 경쇄의 불변영역(CL) 및 중쇄의 첫번째 불변 영역(CH1)으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward ES et al., Nature 341:544-546 (1989)]; (v) 분리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 결합된 단일쇄 Fv 분자(scFv); (viii) 이특이적인 단일쇄 Fv 이량체(PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다특이적인 단편인 디아바디(diabody) WO94/13804) 등을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 동물 유래 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 및 이들의 면역학적 활성을 가진 단편으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 항체는 재조합적 또는 합성적으로 생산된 것일 수 있다.
원하는 항원을 피면역 동물에게 면역시켜 생산하는 동물 유래 항체는 일반적으로 치료 목적으로 인간에 투여시 면역거부반응이 일어날 수 있으며, 이러한 면역거부반응을 억제하고자 키메릭 항체(chimeric antibody)가 개발되었다. 키메릭 항체는 유전공학적 방법을 이용하여 항-아이소타입(anti-isotype) 반응의 원인이 되는 동물 유래 항체의 불변 영역을 인간 항체의 불변 영역으로 치환한 것이다. 키메릭 항체는 동물 유래 항체에 비하여 항-아이소타입 반응에 있어서 상당 부분 개선되었으나, 여전히 동물 유래 아미노산들이 가변 영역에 존재하고 있어 잠재적인 항-이디오타입(anti-idiotypic) 반응에 대한 부작용을 내포하고 있다. 이러한 부작용을 개선하고자 개발된 것이 인간화 항체(humanized antibody)이다. 이는 키메릭 항체의 가변 영역 중 항원의 결합에 중요한 역할을 하는 CDR(complementaritiy determining regions) 부위를 인간 항체 골격(framework)에 이식하여 제작된다.
인간화 항체를 제작하기 위한 CDR 이식(grafting) 기술에 있어서 가장 중요한 것은 동물 유래 항체의 CDR 부위를 가장 잘 받아들일 수 있는 최적화된 인간 항체를 선정하는 것이며, 이를 위하여 항체 데이터베이스의 활용, 결정구조(crystal structure)의 분석, 분자모델링 기술 등이 활용된다. 그러나, 최적화된 인간 항체 골격에 동물 유래 항체의 CDR 부위를 이식할지라도 동물 유래 항체의 골격에 위치하면서 항원 결합에 영향을 미치는 아미노산이 존재하는 경우가 있기 때문에, 항원 결합력이 보존되지 못하는 경우가 상당수 존재하므로, 항원 결합력을 복원하기 위한 추가적인 항체 공학 기술의 적용은 필수적이라고 할 수 있다.
상기 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 생체에서 분리된 (생체에 존재하지 않는) 것 또는 비자연적으로 생산(non-naturally occurring)된 것일 수 있으며, 예컨대, 합성적 또는 재조합적으로 생산된 것일 수 있다.
본 발명에서 "항체"라 함은, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질을 의미하는 것으로서, 그 종류는 특별히 제한되지 않으며, 자연적 또는 비자연적(예컨대, 합성적 또는 재조합적)으로 얻어질 수 있다. 항체는 생체 외뿐 아니라 생체 내에서도 매우 안정하고 반감기가 길기 때문에 대량 발현 및 생산에 유리하다. 또한, 항체는 본질적으로 다이머(dimer) 구조를 가지므로 접착능(avidity)이 매우 높다. 완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
본 발명에서 용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1 , CH2 및 CH3 과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
본 발명에서 용어, "가변 영역(variable region) 또는 가변 부위 (variable domain)"는 항원과 특이적으로 결합하는 기능을 수행하면서 서열상의 많은 변이를 보이는 항체 분자의 부분을 의미하고, 가변 영역에는 상보성 결정 영역인 CDR1, CDR2 및 CDR3가 존재한다. 상기 CDR 사이에는 프레임 워크 영역(framework region, FR) 부분이 존재하여 CDR 고리를 지지해주는 역할을 한다. 상기 "상보성 결정 영역"은 항원의 인식에 관여하는 고리모양의 부위로서 이 부위의 서열이 변함에 따라 항체의 항원에 대한 특이성이 결정된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "scFv(single chain fragment variable)"는 유전자 재조합을 통해 항체의 가변영역만을 발현시켜 만든 단쇄항체를 말하며, 항체의 VH 영역과 VL 영역을 짧은 펩티드 사슬로 연결한 단일쇄 형태의 항체를 말한다. 상기 용어 "scFv"는 달리 명시되지 않거나, 문맥상 달리 이해되는 것이 아니라면, 항원 결합 단편을 비롯한 scFv 단편을 포함하고자 한다. 이는 통상의 기술자에게 자명한 것이다.
본 발명에서 용어, "상보성결정영역(complementarity determining region, CDR)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역 (hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다 (CDRH1, CDRH2,CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 항원결정부위에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다.
본 발명에서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어, "항원결합단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어, scFv, (scFv) 2 , scFv-Fc, Fab, Fab' 또는 F(ab') 2 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 항원결합단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab') 2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변 부위와 경쇄 가변 부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 링커는 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있으며, 당업계에 적절한 서열이 알려져 있다. 상기 항원결합단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab') 2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명에서 용어 "힌지 영역(hinge region)"은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서, CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며, 항체 내 항원 결합 부위의 유연성(flexibility)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다. 예컨대, 상기 힌지는 인간 항체로부터 유래한 것일 수 있으며, 구체적으로, IgA, IgE, 또는 IgG, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터 유래한 것일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자, 이를 포함하는 벡터, 및 이로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 단리된 핵산 분자는 서열번호 19 내지 35의 염기서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 단리된 것이거나 재조합된 것일 수 있으며, 단일쇄 및 이중쇄 형태의 DNA 및 RNA뿐만 아니라 대응하는 상보성 서열이 포함된다. 단리된 핵산은 천연 생성 원천에서 단리된 핵산의 경우, 핵산이 단리된 개체의 게놈에 존재하는 주변 유전 서열로부터 분리된 핵산이다. 주형으로부터 효소적으로 또는 화학적으로 합성된 핵산, 예컨대 PCR 산물, cDNA 분자, 또는 올리고뉴클레오타이드의 경우, 이러한 절차로부터 생성된 핵산이 단리된 핵산분자로 이해될 수 있다. 단리된 핵산분자는 별도 단편의 형태 또는 더 큰 핵산 구축물의 성분으로서의 핵산 분자를 나타낸다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 작동가능하게 연결된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더(leader)의 DNA는 폴리펩타이드가 분비되기 전의 형태인 전단백질(preprotein)로서 발현되는 경우 폴리펩타이드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 폴리펩타이드 서열의 전사에 영향을 주는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치될 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 작동가능하게 연결된 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하여 위치할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 통상적인 방법에 따라 사용한다.
본 발명의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 항체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 항체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 핵산 분자는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 핵산 분자의 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA(mRNA)분자일 수 있다.
본 발명에 따른 본 발명의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자는 단백질 발현을 위해 발현벡터에 삽입될 수 있다. 발현벡터는, 통상 조절 또는 제어 (regulatory) 서열, 선별마커, 임의의 융합 파트너, 및/또는 추가적 요소와 작동가능하게 연결된, 즉, 기능적 관계에 놓인 단백질을 포함한다. 적절한 상태에서, 핵산으로 형질전환된 숙주세포, 바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자 함유 발현벡터를 배양하여 단백질 발현을 유도하는 방법에 의해 본 발명의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편이 생산될 수 있다. 포유류 세포, 박테리아, 곤충 세포, 및 효모를 포함하는 다양한 적절한 숙주세포가 사용될 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다. 외인성 핵산을 숙주세포에 도입하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 사용되는 숙주세포에 따라 달라질 것이다. 바람직하게는, 생산비가 저렴하여 산업적 이용가치가 높은 대장균을 숙주세포로 생산할 수 있다.
본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 상기 시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속(Escherichia sp.)균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속(Bacillus sp.)균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모(yeast)인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널 서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.
본 발명에서 용어, "벡터"는 핵산 서열을 복제할 수 있는 세포로의 도입을 위해서 핵산 서열을 삽입할 수 있는 전달체를 의미한다. 핵산 서열은 외생 (exogenous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다. 벡터로서는 플라스미드, 코스미드 및 바이러스(예를 들면 박테리오파지)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 표준적인 재조합 기술에 의해 벡터를 구축할 수 있다(Maniatis, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988; 및 Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology , John, Wiley & Sons, Inc, NY, 1994 등).
일 구현예에서, 상기 벡터의 제작 시, 상기 항체를 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "발현 벡터"는 전사되는 유전자 산물 중 적어도 일부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한 벡터를 의미한다. 일부의 경우에는 그 후 RNA 분자가 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드로 번역된다. 발현 벡터에는 다양한 조절서열을 포함할 수 있다. 전사 및 번역을 조절하는 조절서열과 함께 벡터 및 발현 벡터에는 또 다른 기능도 제공하는 핵산 서열도 포함될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "숙주세포"는 진핵생물 및 원핵생물을 포함하며, 상기 벡터를 복제할 수 있거나 벡터에 의해 코딩되는 유전자를 발현할 수 있는 임의의 형질 전환 가능한 생물을 의미한다. 숙주세포는 상기 벡터에 의해 형질감염(transfected) 또는 형질전환(transformed) 될 수 있으며, 이는 외생의 핵산분자가 숙주세포 내에 전달되거나 도입되는 과정을 의미한다.
일 구현예에서, 상기 숙주 세포는 박테리아 또는 동물세포일 수 있으며, 동물 세포주는 CHO 세포, HEK 세포 또는 NSO 세포일 수 있고, 박테리아는 대장균일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 숙주 세포 배양물로부터 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 회수하는 단계를 포함하는 GKN1에 특이적인 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 제조하는 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 포함하는 위암 선별검사 및 진단용 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 혈액, 혈장 또는 혈청 내에서 GKN1 단백질의 수준을 측정하기 위한 조성물일 수 있으며, 혈청 내 GKN1 단백질의 수준 측정용인 것이 가장 바람직하다.
일 구현예에서, 상기 측정은 웨스턴블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 면역 전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석 또는 단백질 마이크로어레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 수행될 수 있으며, ELISA로 측정되는 것이 가장 바람직하다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 ELISA 분석용일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 위암은 조기 위암 또는 진행성 위암일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 조성물을 포함하는 위암 스크리닝 및 진단 키트에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 키트는 대상체 또는 환자로부터 생체 시료를 수집하기 위한 도구 및/또는 시약 뿐 아니라 그 시료로부터 게놈 DNA, cDNA, RNA 또는 단백질을 준비하기 위한 도구 및/또는 시약을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 게놈 DNA의 관련 영역을 증폭하기 위한 PCR 프라이머를 포함할 수 있다. 상기 키트는 약리게놈학적 프로파일링에 유용한 유전 인자의 프로브를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 키트의 사용에 있어서, 표지화된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 분석 중 용이하게 동정할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 키트는 DNA 중합효소 및 dNTP(dGTP, dCTP, dATP 및 dTTP), 형광물질 등의 표지 물질을 추가로 더 함유할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 검사 대상체로부터 분리한 생물학적 시료에서 GKN1 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 위암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, GKN1 단백질 수준이 6.608 ng/ml 이하인 경우 검사 대상체가 위암일 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장 또는 혈청일 수 있으며, 혈청인 것이 더욱 바람직하다.
일 구현예에서, 위암은 조기 위암 또는 진행성 위암일 수 있다.
일 구현예에서, ELISA 분석 방법으로 GKN1 단백질 수준을 측정할 수 있으며, ELISA 분석 방법으로 혈청 내 GKN1 단백질 수준을 측정하기 위한 본 발명의 항-GKN1 항체의 최적 농도는 0.5 ug/ml일 수 있고, 상기 혈청의 최적 희석도는 100배일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 GKN1 단백질의 BRICHOS 도메인에 위치한 단일 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편의 위암 스크리닝 및 진단 용도에 관한 것이다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 항-GKN1 단일클론 항체 제작
항-GKN1 단일클론 항체를 개발하기 위해, 특정 항원에 대한 선택성 및 특이성을 가진 파지 디스플레이 테스트 방법을 이용하였다. 구체적으로, 인간 재조합 GKN1 단백질을 고체상에 고정한 후, M13 박테리오파지 표면에 다양한 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 발현하는 scFv 파지 라이브러리와 함께 배양하였다. 결합되지 않은 파지를 씻어내고, 고-친화성 파지를 고정된 항원으로부터 용리하였다. 용리된 파지를 E. coli 숙주 세포와 인큐베이션하여 감염시키고 GKN1에 친화성을 가지는 항체를 나타내는 파지의 아집단이 증폭되었다. 상기 패닝 과정을 3회 반복하였다. 감염된 박테리아의 콜로니를 플레이트에서 배양한 후, 각 콜로니로부터 단일클론 scFv(single-chain variable fragment)를 생성하고 ELISA를 이용하여 재조합 GKN1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 scFv를 독립적인 클론 단위로 선별하였다 (총 95개). 그 중 Fc 및 BSA 백그라운드가 없는 5가지 항체를 확보하고, 이 중 BSA 백그라운드가 가장 낮은 단일클론 컨쥬게이트를 PCR로 증폭하고 미니-바디 (scFv-Fc) 발현 벡터에 삽입하였다. 그 후, 상기 재조합 플라스미드를 293F 세포에 트랜스펙션하고 친화성 크로마토그래피를 이용하여 단일클론 미니-바디를 정제하였다 (도 1A).
실시예 2. 항-GKN1 단일클론 항체 분석
2-1. 중쇄 및 경쇄 가변 부위 서열 확인
상기 실시예 1에서 제작한 항-GKN1 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 부위(영역)의 아미노산 서열을 결정하였다. 구체적으로, 항-GKN1 항체의 파지미드 DNA를 추출한 후 PCR-시퀀싱 (ABI3730XL, Sanger-method sequencing, Phred Score>20) (프라이머 서열: Forward: 5'-AAGACAGCTATCGCGATTGCAG-3' 및 reverse: 5'-GCCCCCTTATTAGCGTTTGCCATC-3')을 이용하여 항-GKN1 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 부위의 DNA 서열을 결정하고 항체의 VL, 링커, VH 및 CDRs(complementarity determining regions, 상보성결정영역)의 서열을 표기하였다 (도 1B).
2-2. 에피토프 맵핑
상기 실시예 1에서 제작한 항-GKN1 항체의 잠재력 및 항원 특이성을 조사하기 위해, 199 펩타이드를 포함하는 마이크로어레이 기술인 PEPperMAP®기술 (PEPperPRINT GmbH, Heidelberg, Germany)을 이용하여 항체의 선형 에피토프를 맵핑하였다. 구체적으로, 절단된 펩타이드를 피하기 위해, GKN1 (UniProtKB Q9NS71)의 서열의 C-말단 및 N-말단을 중성 GSGSGSG 링커로 연장하였다. 연장된 항원 서열을 14개 아미노산의 펩타이드-펩타이드 오버랩을 가지는 선형의 15개 아미노산 펩타이드로 번역하였다. 펩타이드 합성 후, C-말단의 시스테인 및 적절하게 변형된 N-말단 간의 티오에테르(thioether) 연결을 통해 모든 펩타이드를 고리화하였다. 중복 프린트된 199개의 서로 다른 펩타이드 (398개의 펩타이드 스팟)를 포함하며, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA, YPYDVPDYAG, 76 스팟) 대조군 펩타이드로서 추가로 포함하도록 형태적(conformational) GKN1 펩타이드 마이크로어레이를 제작하였다. 항-GKN1 항체를 함유하는 하이브리도마 상청액을 인큐베이션 PBS 버퍼 (pH 7.4, with 0.005% Tween 20) 및 10% MB-070 블로킹 버퍼 (Rockland Immunochemicals, Limerick, Pennsylvania, USA)로 희석하고, 상기 펩타이드 마이크로어레이와 4℃에서 140 rpm으로 16시간 동안 인큐베이션하였다. 어레이를 세척 버퍼 (PBS, pH 7.4, with 0.005% Tween 20)로 세척하여 결합하지 않은 항체들을 제거하였다. 그 후, 펩타이드 어레이를 0.2 μg/mL의 DyLight680 (Thermo Fisher Scientific)가 컨쥬게이트된 고트 항-인간 IgG (H+L)로 염색하였다. 펩타이드 어레이를 프레이밍하는 HA 대조 펩타이드를 0.5 μg/mL의 단일클론 항-HA (12CA5)-DyLight800 (Thermo Fisher Scientific)로 상온에서 45분간 염색하였다. LI-COR Odyssey Imaging System (scanning offset 0.65 mm, resolution 21 μm, 및 scanning intensities of 7/7 (red=700 nm/green=800 nm) 및 PepSlide Analyzer를 이용하여 스팟 강도 및 펩타이드 주석(peptide annotation)을 정량하였다. 또한, 또 다른 인간 GKN1 펩타이드 마이크로어레이 카피를 인간 항체 항-GKN1 항체와 인큐베이션한 결과, 신호-노이즈　비율에서　컨센서스　모티프(consensus　motif)인　KGPGGPPPK를　중심으로　인접한　펩타이드들에서　스팟　패턴을　보였다　(도　1C).　이러한 신호 패턴들을 바탕으로 에피토프를 맵핑한 결과, 본 발명에서 제작한 항체가 GKN1 단백질의 BRICHOS 도메인에 위치한 단일 에피토프 (EKKLQGKGPGGPPPKGLMYSVNPNKV, 서열번호 1)를 인식하는 명확한 단일클론 항체 반응을 나타냈다 (도 1D).
실시예 3. 혈청 GKN1 ELISA 분석 최적화
3-1. 항-GKN1-FITC 컨쥬게이트 제작
FluoReporter FITC Protein Labeling Kit (Molecular Probes)를 이용하여 본 발명의 항-GKN1 단일클론 항체를 표지하였다. FITC 표지된 염료의 (성분 A) 양을 다양하게 구성하였으며 (반응 부피 1, 3 및 10 μL), A280 및 A494 흡광도 판독값을 기준으로 형광:항체 (F:A) 비율을 280 nm에서의 염료의 흡광도에 대한 권장 보정 계수를 포함하는 상기 키트의 설명서에 따라 계산하였다.
3-2. 항-GKN1 항체의 농도 최적화
혈청 내 GKN1 농도를 측정하기 위한 GKN1 sandwich ELISA 분석 방법의 적용 가능성을 재조합 GKN1 단백질, 건강한 개체 및 위암 환자 유래 혈청을 이용하여 확인하였다. 구체적으로, 혈청 시료는 침윤 정도에 따라 분류된 진행성 위암 (advanced gastric cancer, AGC) 350명 및 조기 위암(early gastric cancer, EGC) 150명을 포함하는 500명의 위암 환자와, 대조군 건강한 지원자 (n=200)로부터 수집되었으며, 상기 어떤 환자에게서도 가족성 암의 증거가 발견되지 않았다. 상기 혈청 시료들 간 변이를 정규화하기 위해, 혈청 내 총 단백질 농도를 PBS를 사용해 15 μg/ml로 조정하였다. 그 후, GKN1 단백질이 인간 혈청에서 엑소좀 단백질로 존재하기 때문에, 혈청 시료를 70℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 또한, 본 발명의 항체 농도를 최적화하기 위해 항-GKN1 단일클론 항체는 0.25, 0.5, 1 및 2 ug/ml로 연속희석하여 softMaxPro를 이용하여 로지스틱 회귀 모델에서 변동 계수 (coefficient of variation, CV)를 추정하였다. ELISA 조건 최적화를 위해, 큰 양의 선행 연관성 (R2>0.8)을 달성한 조건, 및 LOD(limit of detection), LOQ(lower limit of quantification) 및 재조합 GKN1 단백질, 인간 혈청 및 항-GKN1 항체의 희석 선형성과 같은 분석 매개 변수가 평가되었다. 아울러, 마이크로타이터 플레이트를 실시예 1에서 제작된 다른 항-GKN1 단일클론 항체(H7)로 코팅하고 마이크로플레이트용 접착 실링 필름 (ImmunoChemistry Technologies, MN, USA)으로 밀봉하였다. 300 ul/웰의 블로킹 용액으로 웰들을 블로킹한 후, 플레이트를 상온에서 암조건으로 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 그 후 PBS 버퍼로 2회 세척하고 재조합 인간 GKN1 단백질로 보정하였다. 그 후, 상기에서 준비한 혈청 시료와 재조합 GKN1 단백질을 각 웰에 넣고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후 PBS로 3회 세척하고 FITC가 컨쥬게이션된 항-GKN1 단일클론 항체를 첨가한 뒤, 상온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 혈청 내 GKN1 수준은 Synergy H1 plate reader ELISA reader (Bio-Tek)를 이용하여 485 nm의 여기 파장 및 528 nm의 방출 파장에서 결정되었다.
Sandwich ELISA 분석을 위해 실시예 1에서 선정한 다른 항-GKN1 항체(H7)를 6,800 배로 희석 (0.25 ug/ml)한 후 마이크로프레이트에 코팅하고 재조합 GKN1 단백질을 이용하여, FITC 컨쥬게이션된 본 발명의 항-GKN1 항체로 얻은 ELISA 값은 항-GKN1 항체(H7)를 1:1,700배 희석된 항체 (1 ug/ml)의 값과 매우 일관된 값을 가지는 것으로 나타났다 (도 2A). 또한, 재조합 GKN1 단백질의 연속 희석 계산 곡선에서, 결과 대 예측 재조합 GKN1 농도의 선형 회귀 분석은 0.993의 상관 계수(correlation coefficient)를 도출했다 (도 2A). H7 항-GKN1 항체를 6,800배로 희석(0.25 ug/ml)하여 마이크로프레이트에 코팅하고 캘리브레이터로서 재조합 GKN1 단백질을, 그리고 FITC 컨쥬게이션된 본 발명의 항-GKN1 항체를 사용한 sandwich ELISA 분석에서 CV(variation coefficient)는 재조합 GKN1 단백질에 대해 0.39 내지 1.69로 나타났고 PBS 시료에 대해 0.98로 나타났다. 아울러, LOD는 0.628 ng/ml로, LOQ는 4.718 ng/ml로 나타났다 (도 2B). 또한, 혈청 내 GKN1 수준을 측정하기 위해 본 발명의 최적 항-GKN1 항체의 농도는 0.5 ug/ml인 것을 확인할 수 있었다.
3-3. 혈청의 희석도 최적화
20개의 서로 다른 건강한 혈청의 1:5, 1:10, 1:50 및 1:100의 혈청 희석 농도를 평가하여 혈청의 최적 희석도를 결정하였다. 그 결과, 1:1 및 1:100으로 희석한 혈청에서 혈청 내 GKN1 농도의 Mean ±SD는 각각 9.799 ±1.33 ng/ml 및 9.42 ±1.41 ng/ml로 나타났고, 혈청 희석 분석 결과에서도 13.52 내지 14.96의 CV, r2 =0.8069 및 s/n ratios= 7.3 내지 6.7로 유사한 값을 나타냈다 (도 2C 및 D). 이를 통해, ELISA 분석에서 혈청내 IgG 등으로 인한 비특이적 반응을 최소화하기 위한 혈청의 최적 희석도는 100배 희석인 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 혈청 내 GKN1 ELISA 분석값을 이용한 위암 진단
4-1. 혈청 내 GKN1의 ELISA 분석을 통한 위암 진단 확인
상기 실시예 3에서와 같이, 건강한 대상 및 위암 환자의 혈청 시료 내 GKN1 수준을 ELISA 분석으로 확인하였다. 항-GKN1 sandwich ELISA키트의 진단 유용성을 최적화하기 위해, ROC(receiver-operator characteristic) 곡선 분석을 수행하였으며, 이를 이용하여 위암 검출을 위한 혈청 GKN1 농도의 최적 컷오프 수준을 결정하였다. 상기 혈청 내 GKN1 단백질 수준의 컷-오프 값을 기반으로 민감도 (true positive fraction; TPF), 특이도 (true negative fraction; TPF), FNF (false negative fraction), FPF(false positive fraction), PPV(positive predictive value), NPV(negative predictive value), 정확도(accuracy), LR+(positive likelihood ratio), LR-(negative likelihood ratio) 및 DOR(diagnostic odds ratio)를 결정하였다.
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본 발명의 항-GKN1 항체를 이용한 ELISA 분석으로 혈청에서 GKN1 수준을 확인한 결과, 혈액 내 GKN1 수준이 위암 환자 (2.33 ±1.53 ng/ml)에서 건강한 대상 (9.25 ±1.38 ng/ml)에 비해 현저히 낮은 것으로 나타났다 (도 3A 및 표 1). 또한, 혈청 내 GKN1 단백질이 위암의 스크리닝 및 조기 진단 마커로서 적용될 수 있는지 확인하기 위해, ROC 곡선 분석을 수행한 결과, 혈청 내 GKN1 단백질 수준은 AUC 값이 1.0000 로 건강한 개인과 위암 환자를 완전히 구분하는 것으로 나타났으며 (도 3B), 6.608 ng/ml의 혈청 내 GKN1 수준이 위암 진단을 위한 최적 컷-오프 값으로 확인되었다 (도 3A). 200명의 대조군 모두에서 혈청 내 GKN1 단백질 수준은 상기 컷-오프 값을 초과한 반면, 500명의 위암 환자에서 혈청 내 GKN1 단백질 수준은 상기 컷-오프 값 이하로 나타났다 (도 3A 및 표 1). 이 컷-오프 값에서, 위암 진단에 대한 민감도 및 특이도는 각각 100% 및 100%로 나타났으며 (도 3B 및 표 2), PPV 및 NPV도 각각 100% 및 100%로 나타났다 (표 2). 또한, 혈청 내 GKN1 컷-오프 값에서 진단 정확도 및 DOR는 각각 1 및 0으로 나타났다 (표 2). 따라서, 본 발명의 항-GKN1 항체를 이용한 혈청 내 GKN1 단백질의 ELISA 분석이 민감도 및 특이도가 매우 높은 위암 스크리닝 또는 진단 툴로서 이용될 수 있음을 알 수 있다.
4-2. 진행성 위암 및 조기 위함 구별능 확인
본 발명의 항-GKN1 항체를 이용한 혈청 내 GKN1 단백질의 ELISA 분석이 위암의 진행 정도도 구별할 수 있는지 확인한 결과, 혈청 내 GKN1 단백질 수준이 EGC 는 4.085 ±1.27 ng/ml 및 AGC는 1.587 ±0.895 ng/ml 로 나타나 건강한 개체에 비해 현저히 낮게 나타났으며, 특히, AGC 환자군이 EGC 환자군에 비해 더 낮게 나타났다 (도 4A 및 표 3). 또한, ROC 곡선 분석은 혈청 내 GKN1 수준이 건강한 개체로부터 EGC 및 AGC을 모두 명확하게 구별하는 것으로 나타났으며, AUC는 각각 1.00 (AUC 95% CI= 0.990 ~ 1.000) 및 1.00 (AUC 95% CI= 0.993 ~ 1.000)로 나타났다 (도 4B 및 C). 또한, ROC 분석 결과, 건강한 개체로부터 EGC 및 AGC를 진단하기 위한 혈청 내 GKN1 수준의 최적 진단 컷-오프 값이 각각 6.5691 ng/ml (민감도 99% 및 특이도 100%) 및 4.0028 ng/ml (민감도 99% 및 특이도 100%)인 것으로 나타났다 (도 4A 및 B, 표 4). 그러나 상기 두 가지 위암에 대한 혈청 내 GKN1 단백질의 컷-오프 값을 6.608 ng/ml 으로 선택했을 때, EGC에 대한 민감도 및 특이도는 모두 100%로 나타났으며, AGC에 대한 민감도 및 특이도도 모두 100%로 나타났다 (도 4A 및 B, 표 5). 아울러, 혈청 내 GKN1 컷-오프 값에서 진단 정확도는 EGC 및 AGC 모두 1인 것으로 나타났다 (표 5).
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Claims (27)

  1. GKN1(gastrokine 1) 단백질의 BRICHOS 도메인에 위치한 단일 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편.
  3. 제 1항에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1(Complementarity determining regions light chain), 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3를 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편.
  4. 제 1항에 있어서, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 FR1, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 FR2, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 FR3 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 FR4를 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편.
  5. 제 1항에 있어서, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH(Complementarity determining regions Heavy chain)1, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3를 포함하는 VH 도메인을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편.
  6. 제 1항에 있어서, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 FR1, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 FR2, 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 FR3 또는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 FR4를 포함하는 VH 도메인을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편.
  7. 제 1항에 있어서, 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편.
  8. 제 1항에 있어서, 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편.
  9. 제 1항에 있어서, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편.
  10. 제 1항에 있어서, 항체는 키메라 항체, 인간화 항체(humanized antibody), 이가(bivalent), 양특이성 분자, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체(bispecific antibody), 항체 모방체, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody)인, 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편.
  11. 제 10항에 있어서, 면역학적 활성을 가진 단편은 Fab, Fd, Fd', Fab', dAb, F(ab'), F(ab')2, scFv(single chain fragment variable), Fv, 단일쇄 항체, Fv 이량체(dsFv) 또는 상보성 결정 영역(CDR) 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편.
  12. 제 1항의 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  13. 제 12항에 있어서, 서열번호 19 내지 35의 염기서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  14. 제 12항의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  15. 제 14항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  16. a) 제 1항의 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    b) 숙주 세포 배양물로부터 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 회수하는 단계를 포함하는 GKN1에 특이적인 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 제조하는 방법.
  17. 제 1항의 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 포함하는 위암 스크리닝 및 진단용 조성물.
  18. 제 17항에 있어서, 혈액, 혈장 또는 혈청 내 GKN1 단백질의 수준을 측정하는, 위암 스크리닝 및 진단용 조성물.
  19. 제 18항에 있어서, 측정은 웨스턴블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 면역 전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석 또는 단백질 마이크로어레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 수행되는, 위암 스크리닝 및 진단용 조성물.
  20. 제 17항에 있어서, 위암은 조기 위암 또는 진행성 위암인, 위암 스크리닝 및 진단용 조성물.
  21. 제 17항의 조성물을 포함하는 위암 스크리닝 및 진단 키트.
  22. 제 21항에 있어서, 위암은 조기 위암 또는 진행성 위암인, 위암 스크리닝 및 진단 키트.
  23. 검사 대상체로부터 분리한 생물학적 시료에서 GKN1 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 위암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 생물학적 시료는 혈액, 혈장 또는 혈청인, 위암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  25. 제 23항에 있어서, 위암은 조기 위암 또는 진행성 위암인, 위암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  26. 제 23항에 있어서, GKN1 단백질 수준이 6.608 ng/ml 이하인 경우 검사 대상체가 위암일 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 위암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  27. GKN1 단백질의 BRICHOS 도메인에 위치한 단일 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편의 위암 스크리닝 및 진단 용도.
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