KR20140019646A - 항암 활성을 갖는 ＧＫＮ１ ｂｒｉｃｈｏｓ 도메인의 용도 - Google Patents

항암 활성을 갖는 ＧＫＮ１ ｂｒｉｃｈｏｓ 도메인의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 GKN1의 brichos 도메인을 포함하는 항암용 조성물에 관한 것으로서, 특히 위암의 발생을 억제하고 암 세포의 전이를 억제하는 활성이 우수한 GKN1 유전자의 활성 영역에 관한 것이다. 본 발명에 따른 GKN1 brichos 도메인은 암세포의 생존 및 증식을 억제하는 활성이 우수할 뿐만 아니라, 세포주기의 진행을 정지시키는 효과가 있다. 따라서 항암 치료용 조성물 및 항암제의 스크리닝 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항암 활성을 갖는 ＧＫＮ１ ｂｒｉｃｈｏｓ 도메인의 용도{Use of GKN1 brichos domain having anticancer activity}
본 발명은 GKN1의 brichos 도메인을 포함하는 항암용 조성물에 관한 것으로서, 특히 위암의 발생을 억제하고 암 세포의 전이를 억제하는 활성이 우수한 GKN1 유전자의 활성 영역에 관한 것이다.
최근 들어 전 세계적으로 암의 생성 및 치료와 관련된 유전자의 기능 연구를 통해 치료용 표적을 발굴하고 이들을 진단 및 치료제 개발에 이용하기 위한 시도가 급격히 증가하고 있다. 게놈(genome) 연구의 활성화와 함께 인간 유전자 DNA 칩 또는 프로테옴 분석 연구가 활발하게 이루어지고 암과 관련된 유전자가 대량 발굴됨에 따라 많은 유전정보들의 데이터베이스는 구축되어 있으나 대부분 이들 유전자들에 대한 세포 내에서의 구체적 생물학적 기능 및 암 관련성은 아직 연구되어 있지 않거나 불확실하다. 따라서 이들 정보를 바탕으로 실제 암과 관련된 진단 및 표적 유전자를 발굴하기 위한 노력이 지속적으로 필요한 실정이다.
한편, 위장관은 소화된 음식물 파편, 다양한 유해물질, 및 산성 pH 스트레스 등에 항상 노출되어 있어 외상이 발생하기 쉽다. TFF1 (trefoil factor family 1)과 같은 내생적(endogenous) 분자들은 위와 같은 유해 환경으로부터 위 점막을 보호한다(Babyatsky, et al., 1996, Oral trefoil peptides protect against ethanol- and indomethacin-induced gastric injury in rats. Gastroenterology 110, 489-497). 최근에는 gastrokine 1 (GKN1)이 쥐를 포함한 다양한 포유동물들의 위 점막세포에서 분리되었고(Martin et al., 2003, A novel mitogenic protein that is highly expressed in cells of the gastric antrum mucosa. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 285, G332-G343), GKN1은 위 점막에서 특이적으로 발현되는 신규한 autocrine/paracrine 단백질이다(Martin et al., 2003; Xing et al., 2012, Gastrokine 1 induces senescence through p16/Rb pathway activation in gastric cancer cells. Gut 61, 43-52). Toback et al. 은 GKN1이 상악동 점막(antral mucosa)을 보호하며, 손상 후에 복위(restitution) 및 증식을 촉진시켜 상처 치유를 돕는다고 보고하였다(Toback et al., 2003, Peptide fragments of AMP-18, a novel secreted gastric antrum mucosal protein, are mitogenic and motogenic. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 285, G344-G353). 또한 GKN1은 상피중간엽세포이행(epithelial-mesenchymal transition; EMT)과, 활성산소종(ROS) 및 PI3K/Akt 경로 조절에 의한 위암세포 이동에 있어서 중요한 역할을 한다고 보고한 바 있다(Yoon et al., 2011).
나아가, 본 발명자들은 GKN1이 NF-kB 및 COX-2의 불활성화를 유도하고, 림프구 이동을 자극한다는 것을 발견하였고, 이것은 위 점막 감염 및 세포 증식을 억제할 수 있으며, 따라서 GKN1이 위암 발달에 있어서 세포주기를 조절함으로써 중요한 역할을 할 것이라 가정하였다. 이러한 가정은 SGC-7901 세포에서 GKN1이 G2/M 정지(arrest)를 통해 세포성장을 억제한다는 최근의 연구결과에서도 확인할 수 있었다(Yan et al., 2011, Proteomics characterization of gastrokine 1-induced growth inhibition of gastric cancer cells. Proteomics 11, 3657-3664). 위 결과들과 일치하게, Xing et al.은 최근에 GKN1이 위암세포에서 p16/Rb 경로 활성을 통해 노화를 촉진한다는 결과를 발표하였다(Xing et al., 2012). 하지만, 세포주기를 억제하는 GKN1의 분자적 기작은 아직 밝혀지지 않았다.
또한, GKN1 단백질은 BRICHOS 슈퍼패밀리의 멤버이며, 이들은 치매 또는 호흡곤란증후군(respiratory distress)과 관계있는 단백질들이다(Sanchez-Pulido et al., 2002, BRICHOS: a conserved domain in proteins associated with dementia, respiratory distress and cancer. Trends Biochem. Sci. 27, 329-332). BRICHOS 슈퍼패밀리의 단백질들은 네 개의 뚜렷한 영역인, 소수성(hydrophobic) 영역, 링커(linker), BRICHOS 도메인 및 C-말단을 갖고 있다. BRICHOS 도메인의 역할은 이 단백질의 번역 후 프로세싱(post-translational processing)과 관련되어 있으며, N-말단 소수성 영역은 신호 펩티드의 일부분이라는 보고가 있다(Sanchez-Pulido et al., 2002). 그러나 아직까지 GKN1을 이루는 각 도메인에 대한 구체적이고 명확한 작용 및 역할에 대한 연구는 많이 진행되지 않고 있다.
이에 본 발명자들은 GKN1이 세포 생존 및 증식, 세포주기, 및 세포주기 관련 단백질들의 후생학적 변형에 미치는 영향을 연구한 끝에 GKN1의 항암 활성을 확인하였고, 특히 이러한 활성을 나타내는 영역이 GKN1의 brichos 도메인이라는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
한국등록특허 제1134675호 한국공개특허 제2012-0078269호
본 발명의 목적은 GKN1(Gastrokine 1) 단백질의 brichos 도메인을 포함하는 항암용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GKN1의 brichos 도메인을 이용하여 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 또는 이를 암호화하는 핵산을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 위암일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 핵산은 발현 벡터 내에 포함되어 있는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은, 서열번호 1의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 발현하는 재조합 세포와 후보물질을 배양하는 단계 및 서열번호 1의 폴리펩티드의 활성 또는 세포 내 수준 증가에 미치는 효과를 측정하는 단계를 포함하는, 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 후보물질이 서열번호 1의 폴리펩티드에 대한 활성을 증가시키거나 세포 내에서 상기 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 발현수준을 증가시킬 경우, 상기 후보물질을 항암활성을 갖는 항암제로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리펩티드에 대한 활성 또는 세포 내 유전자의 발현수준 측정은 면역침전법(coimmunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 위암일 수 있다.
본 발명에 따른 GKN1 brichos 도메인은 암세포의 생존 및 증식을 억제하는 활성이 우수할 뿐만 아니라, 세포주기의 진행을 정지시키는 효과가 있다. 따라서 항암 치료용 조성물 및 항암제의 스크리닝 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 세포 생존 및 증식 억제를 통한 GKN1의 항암 활성을 보여준다. (A) MTT 어세이에서, GKN1-트랜스펙션된 AGS 위암 세포들은 시간-의존적으로 세포 생존을 억제한 반면에, shGKN1-트랜스펙션 HFE-145 정상 위 점막 세포들은 시간-의존적으로 세포 생존을 증가시켰다. (B) BrdU 삽입 어세이에서, GKN1 -트랜스펙션 AGS 세포들은 시간-의존적으로 세포 증식을 억제하였고, shGKN1-트랜스펙션 HFE-145 세포들은 시간-의존적으로 세포 증식을 증가시켰다.
도 2는 야생형 GKN1과 본 발명의 실시예에서 사용한 돌연변이들의 구조를 나타낸 그림이다.
도 3은 각각의 GKN1 플라스미드 및 GAPDH의 발현 수준을 나타내는 웨스턴 블랏 분석 결과이다. GAPDH는 로딩 컨트롤로 사용되었다.
도 4는 AGS 세포에서 pGKN1D13N, pGKN1△68-199, pGKN1△1-67,165-199 및 pGKN1△1-67의 일시적 트랜스펙션이 세포 생존을 시간 의존적으로 억제한 결과를 보여준다.
도 5는 AGS 세포에서 pGKN1D13N, pGKN1△68-199, pGKN1△1-67,165-199 및 pGKN1△1-67의 일시적 트랜스펙션이 세포 증식을 시간 의존적으로 억제한 결과를 보여준다. 반면에, AGS 세포에서 pGKN1D13A 및 pGKN1△1-164는 세포 생존 및 증식에 큰 영향을 미치지 않았다.
도 6 및 도 7은 AGS 세포에서 콜로니 형성 어세이로 항암 효과를 측정한 결과이다. 야생형 GKN1, pGKN1D13N, pGKN1△68-199, pGKN1△1-67,168-199 및 pGKN1△1-67은 콜로니 형성을 유의하게 억제하였다.
도 8은 (A) AGS 세포 및 (B) HFE-145 세포에 5-FU 처리는 시간- 및 투여량-의존적으로 세포 생존을 억제함을 보여준다.
도 9는 야생형 GKN1, pGKN1D13N, pGKN1△68-199, pGKN1△1-67,165-199, pGKN1△1-67, 및 재조합 GKN1 단백질 처리가 5-FU에 의한 세포 생존 억제에 시너지 효과를 나타냄을 보여준다.
도 10은 야생형 GKN1 및 재조합 GKN1 단백질 처리가 5-FU에 의한 G0/G1 및 G2/M 세포주기 정지에 시너지 효과를 나타냄을 보여준다.
도 11은 AGS 세포에 GKN1 트랜스펙션, 5-FU 및 재조합 GKN1 단백질 처리 후의 웨스턴 블랏 분석 결과이다. p53 및 p21의 발현 증가에는 시너지 효과가 나타났으나, 사이클린 B 및 사이클린 D의 발현은 감소하였다.
도 12 및 도 13은 각각 본 발명의 GKN 야생형(도 12) 및 돌연변이(pGKN1D13N, pGKN1△68-199, pGKN1△1-67,165-199, 및 pGKN1△1-67)(도 13)로 트랜스펙션시킨 AGS 세포에서 G0/G1 및 G2/M기의 세포주기 정지 효과를 나타낸다.
도 14는 GKN 야생형을 트랜스펙션시킨 AGS 세포의 웨스턴 블랏 분석 결과이다. p53과 p21의 발현이 증가하였으며, p16의 재발현과 CDK4, 사이클린 D, E2F1, 및 사이클린 A 발현의 하향조절을 관찰할 수 있었다. HFE-145 세포에서 GKN1의 넉다운은 p53, p16 및 p21의 발현을 하향조절시켰으나, CDK4 및 사이클린 A를 포함하는 세포주기 양성적 조절인자들의 발현은 상향조절시켰다.
도 15는 G2/M 기 단백질 발현에 대한 GKN1의 하향조절 작용을 보여준다. AGS 세포에서 GNK1은 p-cdc2, PLK1, CDK2, cdc25a, cdc25c 및 사이클린 B를 하향조절시킨 반면에, HFE-145 세포에서 shGKN1 으로 GKN1 발현억제(silencing)는 p-cdc2, PLK1 및 CDK2 발현을 상향조절하였다.
도 16은 pGKN1D13N,pGKN1△68-199,pGKN1△1-67,165-199, 및 pGKN1△1-67을 일시적 트랜스펙션(transient transfection)으로 발현시켰을 때, CDK4, 사이클린 D, 사이클린 A, 사이클린 E, 및 사이클린 B의 하향조절(down-regulation)을 나타낸다.
본 발명은 GKN1(Gastrokine 1)의 brichos 도메인을 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물 및 이를 이용한 항암제 스크리닝 방법을 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명자들은 암 발생을 억제할 수 있는 새로운 암 치료제의 개발을 위해 연구하던 중, 최근 포유동물의 위 점막 세포로부터 분리된 신규한 단백질인 GKN1의 항암 효과를 확인하였다(대한민국 공개특허공보 10-2012-0051258 참조). GKN1(Gastrokine 1)은 AMP-18(antrum mucosal protein-18) 또는 CA11로도 알려져 있으며, 위 전정부에서 발현되는 것으로 알려져 있다. GKN1은 전정부 점막을 보호하고, 상처 후 회복과 증식을 용이하게 함으로써 상처 치유를 촉진시키는 활성을 나타낸다는 연구결과가 보고된바 있으나(Toback. F. G. et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 285: G344-353, 2003), GKN1의 항암 효과에 대해서는 알려진 바가 없었다. 본 발명자들은 정상세포와는 달리 암세포에서 GKN1 유전자의 발현이 감소되어 있다는 사실을 확인함으로써 GKN1 유전자가 암의 발병기작에 관여하고 있다고 추측하였으며, 실제적으로 GKN1이 항암 활성을 갖는다는 사실을 최초로 규명하였다.
본 발명자들은 GKN1의 항암 효과를 확인한 위 공개특허공보의 발명을 바탕으로 연구를 추가적으로 진행한 결과 GKN1의 brichos 도메인만으로도 GKN1과 유사한 수준의 항암 효과를 나타낼 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
GKN1은 199개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 3개의 보존적 영역인, 아미노-말단 조절 모티프(amino-terminal regulatory motif) (1-67), 가운데의 brichos 도메인 (68-164) 및 카르복시-말단 보존 영역(carboxy-terminal conserved domain) (165-199)으로 이루어져 있다(도 2). 본 발명자들은 GKN1의 항암 활성 기작을 조사하기 위하여, 야생형(wild-type) GKN1, 4 종류의 내부결손형(internal-deletion) 돌연변이(pGKN1△68-199, pGKN1△1-67,165-199, pGKN1△1-164 및 pGKN1△1-67), 및 2개의 돌연변이(pGKN1D13N 및 pGKN1D13A)를 각각 제작하였다(도 2). 이 중 pGKN1△1-67,165-199가 brichos 도메인 만을 포함하는 클론이다.
본 발명의 실시예에 따르면, AGS 세포에서 GKN1의 엑토픽(ectopic) 발현은 세포 생존, 증식 및 콜로니 형성을 상당히 감소시켰다(도 1, 도 4 내지 7). 반면에 HFE-145 정상 위 점막세포에서 GKN1의 발현억제(silencing)는 세포 생존 및 증식 능력을 증가시킴을 확인할 수 있었다(도 1). 또한, GKN1이 5-FU의 항암제 감수성(chemosensitivity)에 미치는 효과를 조사하기 위하여, AGS 및 HFE-145 세포에서 MTT 어세이를 수행하였다. 예상대로, GKN1 및 5-FU 처리는 p53 및 p21 발현을 통한 세포 생존 및 증식 억제의 시너지 효과를 나타냈다(도 8 내지 11). 5-FU 항암제에 의한 p53 및 p21 활성은 이미 마우스 L-TK 세포 및 AGS 세포에서 보고된바 있다(Sun et al., 1995, Identification of a novel p53 promoter element involved in genotoxic stress-inducible p53 gene expression. Mol. Cell. Biol. 15, 4489-4496; Seo et al., 2011, Contribution of Epstein-Barr virus infection to chemoresistance of gastric carcinoma cells to 5-fluorouracil. Arch. Pharm. Res. 34, 635-643). 또한, 위와 같은 GKN1의 항암 활성에는 GKN1의 brichos 도메인이 필요하였다. 상기 결과들은 GKN1이 항암작용을 하며, 항암 활성을 나타내려면 brichos 도메인이 필요하다는 것을 보여준다.
엑토픽 GKN1 발현이 세포 증식을 억제한다는 사실은 GKN1이 세포주기-조절 성분들을 조절할 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명자들은 GKN1이 세포주기 및 G1/S 및 G2/M기의 조절 성분들에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 야생형 GKN1을 트랜스펙션시킨 AGS 세포에서 유세포분석(flowcytometry)을 수행하였다. 그 결과, G0/G1기 및 G2/M기가 동시에 증가하는 것을 확인하였다(도 12). 이와 유사한 패턴을 pGKN1D13N, pGKN1△68-199, pGKN1△1-67,165-199, 및 pGKN1△1-67로 트랜스펙션시킨 AGS 세포들에서 확인하였다(도 13). G1/S기에서, p15, p16, p18, p19, p27 및 p21과 같은 음성적(negative) 세포주기 조절인자들은 사이클린 D1/CDK4, 6 또는 사이클린 E/CDK2 복합체를 억제하는 핵심적인 조절인자이다(Grana and Reddy, 1995, Cell cycle control in mammalian cells: role of cyclins, cyclin dependent kinases (CDKs), growth suppressor genes and cyclin-dependent kinase inhibitors (CKIs). Oncogene 11, 211-219). 위 세포주기 조절인자들을 조사한 결과, G1/S기에서 엑토픽 GKN1 발현은 p53과 p21의 발현을 증가시키며, 선택적으로 p16 재발현(re-expression)을 야기시키고, CDK4, 사이클린 D1, E2F, 및 사이클린 A 발현을 동시에 억제시켰다(도 14). 반면에, CDK4 및 사이클린 A를 포함한 양성적(positive) 세포 조절인자들은 GKN1이 넉다운 된 HFE-145 세포에서 상향조절(up-regulation)되었다(도 14). 또한 GKN1은 AGS 세포에서 cdc25, PLK1 및 사이클린 B 발현의 조절을 통해 G2/M-기 진행을 불활성화시켰다(도 15). 또한, pGKN1D13N,pGKN1△68-199,pGKN1△1-67,165-199, 및 pGKN1△1-67을 일시적 트랜스펙션(transient transfection)으로 발현시켰을 때, CDK4, 사이클린 D, 사이클린 A, 사이클린 E, 및 사이클린 B의 하향조절(down-regulation)을 관찰하였다(도 16). 또한, HFE-145 세포에서 GKN1의 발현 억제는 p-cdc2, PLK1 및 CDK2 발현이 상향조절하였다(도 15). 상기 결과들은 GKN1의 과발현이 G1 또는 G/M기에서 세포주기정지(cell cycle arrest)를 야기시킨다는 이전의 연구결과와 일치한다(Xing et al., 2012; Yan et al., 2011). 상기 결과들을 종합하면, GKN1은 세포주기 조절과 관련된 일련의 단백질들의 조절에 직접적으로 관여하며, 이를 위해서는 GKN1의 brichos 도메인이 필수적이라는 것을 알 수 있다.
따라서 본 발명은 GKN1 brichos 도메인 또는 이를 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는 항암용 조성물을 제공할 수 있다. 바람직하게, 상기 GKN1 brichos 도메인은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 상기 GKN1 brichos 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
또한 본 발명에 따른 상기 GKN1 brichos 도메인은 바람직하게 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 기능적 동등물일 수 있다. 상기 '기능적 동등물'이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 GKN1과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, '실질적으로 동질의 활성'이란 상기에서 기재한 GKN1의 활성을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 본 발명에 따른 GKN1의 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함될 수 있다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환일 수 있으며, 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 GKN1의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치할 수 있다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 GKN1의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 다른 단백질과 융합으로 만들어진 융합단백질 등이 이에 포함될 수 있다.
또한 상기 GKN1(Gastrokine 1) brichos 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 발현 벡터 내로 공지의 방법에 의해 도입시킨 후 상기 발현 벡터를 당업계에 공지된 다양한 방법으로 형질도입(transduction) 또는 형질주입(transfection)에 의해 발현형으로 표적 세포 내에 도입시킬 수 있다.
플라스미드 발현 벡터는 사람에게 사용할 수 있는 FDA의 승인된 유전자 전달방법이며 사람 세포에 직접적으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법으로(Nabel, E. G. et al., Science, 249:1285-1288, 1990), 플라스미드 DNA는 바이러스 벡터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 플라스미드 발현 벡터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있으며, 본 발명의 일실시예에서는 pcDNA3.1(Invitrogen) 플라스미드를 사용하여 재조합 발현벡터를 제조하였다.
본 발명에 따른 핵산을 포함하는 플라스미드 발현 벡터(plasmid expression vector)는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 트랜스펙션(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 트랜스펙션(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개 트랜스펙션(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개 트랜스펙션(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 DNA를 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 종양세포 내로 도입할 수 있다(Wu. et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu. et al., Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988). 바람직하게는, 일시적 트랜스펙션 방법을 사용할 수 있다.
또한, 상기 GKN1 brichos 도메인을 발현시킬 수 있는 벡터는 공지의 방법에 의해 세포, 조직 또는 체내로 투여될 수 있는데, 예를 들면, 국소적으로, 비경구, 경구, 비강, 정맥, 근육 내, 피하 내 또는 다른 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 특히, 상기 벡터는 표적 조직의 종양세포를 치료하기 위한 유효량으로 표적 암 또는 종양세포 내로 직접 주사할 수 있다. 특히, 눈, 위장관, 비뇨생식기관, 폐 및 기관지 시스템과 같은 체강(body cavity)에 있는 암 또는 종양의 경우에는 본 발명의 약학적 조성물을 암 또는 종양에 의해 영향을 받는 유강 기관(hollow organ) 내에 바늘, 도관(catheter) 또는 다른 종류의 수송튜브를 이용하여 직접 주입할 수 있다.
한편, 본 발명의 GKN1 brichos 도메인은 암세포의 증식을 억제하고, 세포사멸을 촉진시킴과 동시에 암세포의 전이 및 침윤을 억제하는 활성이 있으므로 본 발명은 상기 유전자를 이용한 항암제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 항암제 스크리닝 방법은, 서열번호 1의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 발현하는 재조합 세포와 후보물질을 배양하는 단계; 및 서열번호 1의 폴리펩티드의 활성 또는 세포 내 수준 증가에 미치는 효과를 측정할 수 있다.
상기에서 GKN1 brichos 도메인의 세포 내 수준 증가의 의미는 GKN1 brichos 도메인을 암호화하는 유전자의 발현이 증가되거나 또는 GKN1 brichos 도메인의 분해가 억제되어 GKN1 brichos 도메인의 농도가 증가되는 것을 말한다. 상기 GKN1 brichos 도메인 유전자 발현은 GKN1 brichos 도메인을 암호화하는 유전자의 전사 및 번역 과정을 포함한다. 따라서 상기 후보물질이 세포 내에서 GKN1 brichos 도메인 유전자의 발현 및 단백질 수준을 증가시킬 경우, 상기 후보물질을 항암활성을 가지는 물질로 판단할 수 있다.
또한, GKN1 brichos 도메인의 활성 및 세포 내 수준을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 여러 가지 방법을 사용할 수 있는데, 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 면역침전법(coimmunoprecipitation), 효소면역분석법(enzymelinked immunosorbentassay), 방사능면역분석법(RIA), 면역조직화학, 웨스턴 블로팅(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 GKN1을 표적으로 한 스크리닝 방법은 고효율 스크리닝(high throughput screening; HTS)을 적용할 수 있다. HTS는 다수의 후보물질을 병행 시험하여, 다수의 후보물질의 생물학적 활성에 대해 동시에 또는 거의 동시에 스크리닝하는 방법이다. 특정 양태로서, 96-웰 미세역가 플레이트 또는 192-웰 미세역가 플레이트에서 세포주를 배양하고, 여기에 다수개의 후보물질을 처리한 다음 면역화학적 방법에 의해 GKN1의 발현정도를 측정할 수 있다. 상기 웰은 전형적으로 50 내지 500에 이르는 검정 용적을 필요로 하며, 플레이트 이외에, 96-웰 포맷을 광범위한 균일계 및 불균일계 검정에 적합하게 하기 위해 다수의 계기, 기구, 피펫터, 로봇, 플레이트 세척기 및 플레이트 판독기가 상업적으로 이용 가능하다.
또한, 본 발명에 따른 항암 조성물은 암을 예방 및 치료할 수 있는 약학적 조성물로 사용될 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.
상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 바람직하게는 1~10000/체중kg/day, 더욱 바람직하게는 10~1000/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 항암용 조성물은 암을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수도 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1>
세포배양 및 트랜스펙션( transfection )
AGS 위암 세포주 및 HFE-145 정상 위 점막 세포를 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) 및 Hassan 박사(Washington, DC, USA)로부터 입수하였다. 양 세포주 모두 10% 열-불활성화 소 태아 혈청을 첨가한 RPMI-1640 배지(Lonza,Basel,Switzerland)에서 37℃로 배양하였다(5% CO2). GKN1 cDNA 및 shGKN1을 pcDNA3.1 발현벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 클로닝하였다. AGS 및 HFE-145 세포들을 60 mm-직경 접시에서 발현 플라스미드(2㎍ 총 DNA)로 트랜스펙션시켰다. 리포펙타민 플러스 트랜스펙션 시약(Lipofectamine Plus transfection reagent) (Invitrogen)을 제조사의 프로토콜에 따라 사용하였다.
< 실시예 2>
플라스미드 제작 및 GKN1 의 트랜스펙션
GKN1은 199개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 3개의 보존적 영역인, 아미노-말단 조절 모티프(amino-terminal regulatory motif) (1-67), 중앙의 brichos 도메인 (68-164) 및 카르복시-말단 보존 도메인(carboxy-terminal conserved domain) (165-199)을 갖고 있다(도 2). 본 발명자들은 다음 4종류의 소거형(deletion-formed) 플라스미드를 제작하였다. pGKN1△68-199는 아미노-말단 조절 모티프를, pGKN1△1-67,165-199는 brichos 도메인을, pGKN1△1-164는 카르복시-말단을, pGKN1△1-67은 brichos 및 카르복시 말단을 각각 포함한다. 또한, GKN1의 13번 코돈에서 아스파르트산(D)으로부터 아스파라긴(N)으로의 번역 후 변형(post-translational modification)이 H. pylori 감염 위 점막에서 보고되었으므로(Nardone et al., 2007), 13번 코돈에서 돌연변이가 일어난 두 종류의 돌연변이도 Quick Change Site-Directed Mutagenesis 키트(Stratagene, La Jolla, CA, USA)를 사용하여 제작하였다. 모든 플라스미드들은 시퀀싱으로 확인하였다.
GKN1의 클로닝 및 특정 영역의 PCR에 사용한 프라이머 서열은 다음 표 1과 같다.
Figure pat00001
모든 cDNAs는 pcDNA 3.1 (Invitrogen)에 서브클로닝하였고, 야생형 GKN1과 6개의 돌연변이를 포함하는 7개의 제작물(constructs)로 AGS 세포에서 일시적 트랜스펙션(transient transfection)을 수행하였다. 리포펙타민(Lipofectamine, Invitrogen)을 제조사의 지시에 따라 사용하였다. 그 후, 위 돌연변이들이 세포 생존, 증식 및 콜로니 형성에 미치는 영향을 shGKN1으로 트랜스펙션된 AGS 및 HFE-145 세포에서 관찰하였다.
추가로, GKN1이 5-FU (5-fluorouracil)의 항암제 감수성(chemosensitivity)에 기여하는지 알아보기 위하여, 야생형 및 6개의 돌연변이 GKN1을 포함하는 각각의 제작물(construct), 재조합 GKN1 단백질, 및 5-FU를 동시에 처리한 후 24시간 및 48시간째 AGS 및 HFE-145 세포에서 MTT 어세이를 수행하였다.
< 실시예 3>
GKN1 이 세포 생존, 증식 및 콜로니 형성에 미치는 영향
<3-1> 세포 생존, 증식 및 콜로니 형성 측정
세포 생존 및 성장 분석을 위하여, 각각의 제작물(construct)을 일시적 트랜스펙션(transient transfection)시킨 후 24, 48, 및 72시간 째 MTT 어세이를 수행하였다. 분광광도계를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였고, 세포 생존능력은 대조군(mock) (빈 벡터 + 리포펙타민)에 대한 상대값으로 표현하였다.
세포 증식(cell proliferation) 측정을 위하여, 각각의 제작물(construct)을 일시적 트랜스펙션(transient transfection)시킨 후 24, 48, 및 72시간 째 BrdU 삽입 어세이를 수행하였다. BrdU 세포 증식 어세이 키트(Millipore, Billerica, MA, USA)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하였다. 분광광도계를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 세포 증식능력은 대조군(mock)에 대한 상대값으로 표현하였다.
시험관 내(in vitro)에서 단일 세포의 증식 능력을 측정하기 위하여, 집락형성분석법(plate clonogenic assay)을 수행하였다. 각각의 제작물로 트랜스펙션시킨 1 X 103의 AGS 세포들을 6-웰 플레이트에 접종하고 RPMI-1640에서 2주간 배양하여 콜로니가 형성되도록 하였다. 콜로니들을 1% 포름알데히드에 고정시키고, 0.5% crystal violet 용액에서 염색한 뒤, 콜로니 계수(count) 프로그램을 이용하여 수를 세었다.
GKN1이 세포 생존 및 증식에 미치는 영향을 조사하기 위해 스튜던트 t-테스트(Studentt-test)를 하였다. 데이터는 적어도 3 회 반복 실험의 평균±표준편차로 표시하였다. P 값이 0.05 미만인 수준에서 통계적 유의성으로 간주하였다.
<3-2> GKN1 의 세포 생존, 증식 및 콜로니 형성 감소 효과
GKN1이 세포성장 및 증식에 미치는 효과를 AGS 및 HFE-145 세포에서 MTT, BrdU 삽입 및 콜로니 형성 어세이를 수행하여 확인하였다. 그 결과 야생형 GKN1-트랜스펙션된 AGS 세포에서는 세포성장 및 증식에 있어서 의미있게 시간-의존적 억제 효과가 관찰되었으며(도 1A 및 B), 이는 이전의 연구 결과와 일치한다(Yoon et al., 2011). 반대로, GKN1 발현 HFE-145 세포에서, shGKN1에 의한 GKN1 발현억제(silencing)은 세포성장 및 증식의 시간-의존적 증가를 나타냈다(도 1A 및 B). 세포 증식을 조절하는 GKN1의 특정 영역을 찾기 위하여, 본 발명자들은 먼저 GKN1의 4종류의 내부-소거(internal-deletion) 돌연변이, pGKN1△68-199, pGKN1△1-67,165-199, pGKN1△1-164 및 pGKN1△1-67을 제작하였다(도 2). 또한, GKN1의 13 코돈에서 1개의 뉴클레오티드를 변경시켜 두 개의 돌연변이 GKN1 플라스미드, pGKN1D13N 및 pGKN1D13A를 만들었다(도 2). 야생형 GKN1, 상기 2개의 돌연변이, 및 4개의 소거(deletion) 플라스미드들의 발현은 AGS 세포 용해물로부터 웨스턴 블랏 분석을 통해 확인하였다(도 3). 또한 4종류의 소거형 플라스미드 및 2종류의 돌연변이 플라스미드로 트랜스펙션시킨 AGS 세포에서 세포 생존 및 증식능력을 분석하였다. 도 4 및 5에 나타낸 바와 같이, GKN1 야생형, pGKN1D13N,pGKN1△68-199,pGKN1△1-67,165-199, 및 pGKN1△1-67 플라스미드의 엑토픽 발현은 AGS 세포에서 세포 생존 및 증식을 상당히 감소시켰다. 하지만, 돌연변이 플라스미드 pGKN1D13A 및 카르복시 말단만 포함하는 pGKN1△1-164는 최소한의 영향만 미쳤다(도 4 및 5).
콜로니 형성 어세이에서, GKN1 야생형, pGKN1D13N, pGKN1△68-199, pGKN1△1-67,165-199, 및 pGKN1△1-67의 엑토픽 발현은 빈 벡터트랜스펙션시킨 대조군 세포(mock)와 비교하여 AGS 위암세포주로부터 살아남은 콜로니들의 수와 크기를 상당히 감소시켰다(도 6 및 7).
추가로, GKN1이 5-FU의 항암제 감수성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, AGS 및 HFE-145 세포에서 5-FU, 야생형 또는 돌연변이 GKN1, 및 재조합 GKN1의 동시처리 후 24시간 및 48시간째 MTT 어세이를 수행하였다. 5-FU 처리는 양쪽 세포주 모두에서 시간 및 투여량(dose)-의존적인 세포 생존능력을 감소시켰다(도 8). 예상대로, 야생형 및 pGKN1D13N, pGKN1△68-199, pGKN1△1-67,165-199, pGKN1△1-67을 포함한 돌연변이 GKN1 , 및 재조합 GKN1 단백질을 처리한 AGS 세포는 5-FU와 함께 시간 및 투여량 의존적 방식으로 세포 생존 억제에 시너지적인 효과를 나타냈다(도 9). 이는 GKN1이 5-FU의 세포독성을 증가시킨다는 것을 의미한다. 하지만, 2개의 돌연변이, pGKN1D13A 및 pGKN1△1-164는 세포 생존에 약한 수준의 영향만 주었다(도 9). 세포주기 진행에 있어서 GKN1이 5-FU의 항암제 감수성에 미치는 효과는 유세포 분석으로 확인하였다. 흥미롭게도, 5-FU만의 처리는 세포주기에 아무런 영향을 미치지 못했으나, 5-FU 및 야생형 GKN1 또는 재조합 GKN1 단백질을 처리한 AGS 세포들은 sub-G0 세포의 수를 증가시키고 세포주기의 G0/G1 및 G2/M기 진행에 억제 효과를 나타냈다(도 10). 또한, GKN1 과발현은 p53 및 p21의 시너지적인 발현 증가를 나타냈고, AGS 세포에서 사이클린(cyclin) B 및 D의 발현을 감소시켰다(도 11).
< 실시예 4>
GKN1 이 세포주기에 미치는 영향
<4-1> 세포주기의 유세포분석
세포주기 분석을 위하여, 각각의 실험 그룹의 AGS 세포들을 수집하고 트립신으로 분해한 뒤, 차가운 70% 에탄올로 고정하고, 분석에 앞서 어두운 곳에서 45분간 PI (propidium iodide)로 염색하였다. 세포주기의 다른 상태(phases)에서 세포의 백분율은 CellQuest 3.0 소프트웨어를 구비한 FACS Calibur Flow Cytometer (BD Biosciences, Heidelberg, Germany)를 사용하여 결정하였다. 실험은 3회 반복으로 수행하였다.
<4-2> 세포주기 조절인자의 발현
GKN1이 세포주기 조절에 관여하는지 알아보기 위하여, 야생형 및 돌연변이 GKN1 트랜스펙션 후 24 및 48시간 후의 AGS 세포 및 shGKN1 트랜스펙션 24시간 후의 HFE-145 세포에서, p53, p21, p16, p15, CDK4, cyclin D1, 및 E2F를 포함한 G0/G1기 단백질의 발현을, cdc2, cyclin B, cdc25A, cdc25C, aurora A, 및 Plk1을 포함한 G2/M기 단백질의 발현을 각각 조사하였다. 세포 용해물을 10% 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 젤에서 분리하고, Hybond PVDF막(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)에 옮겼다. 차단(blocking) 후에, 연속적으로 막을 G0/G1기 단백질들 (p53, p21, p16, p15, CDK4, cyclin D1, 및 E2F를 포함하는)에 대한 항체 및 G2/M기 단백질들(cdc2, cyclin B, cdc25A, cdc25C, aurora A, 및 Plk1을 포함하는)에 대한 항체로 탐지시켰다. 강화된 화학발광(chemiluminescence) 시약(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)을 사용하여 단백질 밴드를 검출하였다.
<4-3> GKN1 의 G0 / G1 및 G2 /M기 정지( arrest ) 효과
추가로 GKN1이 세포주기 진행에 미치는 영향을 유세포 분석으로 확인하였다. GKN1이 복제중지(replicative arrest)를 야기하는 능력을 야생형 GKN1, 4종류의 소거형 플라스미드, 및 2종류의 돌연변이 GKN1으로 트랜스펙션시킨 후 24시간 및 48시간째 AGS에서 유세포 분석으로 측정하였다. 예상대로, GKN1 야생형, pGKN1D13N, pGKN1△68-199, pGKN1△1-67,165-199, 및 pGKN11 -67은 sub-G0 세포의 수를 증가시키고, 세포주기 G0/G1 및 G2/M기 진행에 중간 정도의 영향을 나타냈다. 하지만, pGKN1D13A 및 pGKN1△1-164는 세포주기 진행에 아무런 영향을 나타내지 않았다(도 12 및 13).
GKN1에 의한 세포주기 정지에 관련된 잠재적인 분자 경로를 찾기 위하여, G0/G1 및 G2/M-관련 단백질들의 발현을 조사하였다. GKN1으로 트랜스펙션된 AGS 세포 용해물 및 shGKN1으로 트랜스펙션된 HFE-145 세포 용해물로부터 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. AGS 세포의 G0/G1 중지(arrest) 동안, GKN1의 엑토픽 발현은 p53과 p21의 발현을 상향조절시키며, p16의 재발현을 야기시키고 Cdk4, cyclin D, E2F1, 및 cyclin A의 발현을 하향조절하였다(도 14). shGKN1 트랜스펙션 된 HFE-145 세포에서, GKN1 발현억제(silencing)는 p16 및 p21의 발현을 하향조절시켰으나, CDK4 및 cyclin A를 포함한 양성적 세포주기 조절인자들의 발현을 상향조절하였다(도 14). G2/M 중지 동안, AGS 세포에서 GKN1은 p-cdc2, PLK1, CDK2, cdc25a, cdc25c 및 cyclin B 발현을 하향조절시킨 반면, HFE-145 세포에서 GKN1 발현억제는 p-cdc2, PLK1 및 cdk2의 발현을 상향조절하였다(도 15). 또한, AGS 세포에서 pGKN1D13N, pGKN1△68-199, pGKN1△1-67,165-199, 및 pGKN1△1-67 은 CDK4, cyclin D, 및 cyclin B의 발현을 하향조절하였으며(도 16), 이는 GKN1이 세포주기의 G1/S 및 G2/M기를 조절할 수 있다는 것을 의미한다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University <120> Use of GKN1 brichos domain having anticancer activity <130> PN1207-351 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gkn1 brichos domain peptide sequence <400> 1 Asn Asn Gly Trp Asp Ser Trp Asn Ser Ile Trp Asp Tyr Gly Asn Gly 1 5 10 15 Phe Ala Ala Thr Arg Leu Phe Gln Lys Lys Thr Cys Ile Val His Lys 20 25 30 Met Asn Lys Glu Val Met Pro Ser Ile Gln Ser Leu Asp Ala Leu Val 35 40 45 Lys Glu Lys Lys Leu Gln Gly Lys Gly Pro Gly Gly Pro Pro Pro Lys 50 55 60 Gly Leu Met Tyr Ser Val Asn Pro Asn Lys Val Asp Asp Leu Ser Lys 65 70 75 80 Phe Gly Lys Asn Ile Ala Asn Met Cys Arg Gly Ile Pro Thr Tyr Met 85 90 95 Ala <210> 2 <211> 291 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gkn1 brichos domain DNA sequence <400> 2 aacaacggat gggactcctg gaattccatc tgggattatg gaaatggctt tgctgcaacc 60 agactctttc aaaagaagac atgcattgtg cacaaaatga acaaggaagt catgccctcc 120 attcaatccc ttgatgcact ggtcaaggaa aagaagcttc agggtaaggg accaggagga 180 ccacctccca agggcctgat gtactcagtc aacccaaaca aagtcgatga cctgagcaag 240 ttcggaaaaa acattgcaaa catgtgtcgt gggattccaa catacatggc t 291

Claims (8)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 또는 이를 암호화하는 핵산을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 핵산은 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 항암용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 암은 위암인 것을 특징으로 하는 항암용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 핵산은 발현 벡터 내에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 항암용 약학적 조성물.
  5. 서열번호 1의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 발현하는 재조합 세포와 후보물질을 배양하는 단계; 및
    서열번호 1의 폴리펩티드의 활성 또는 세포 내 수준 증가에 미치는 효과를 측정하는 단계를 포함하는, 항암제 스크리닝 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 후보물질이 서열번호 1의 폴리펩티드에 대한 활성을 증가시키거나 세포 내에서 상기 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 발현수준을 증가시킬 경우, 상기 후보물질을 항암활성을 갖는 항암제로 판단하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 폴리펩티드에 대한 활성 또는 세포 내 유전자의 발현수준 측정은 면역침전법(coimmunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 암은 위암인 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.
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