WO2022108203A1 - 항 약물 항체의 수준을 정확하게 정량화하는 방법 - Google Patents

항 약물 항체의 수준을 정확하게 정량화하는 방법 Download PDF

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infliximab
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최의열
이윤석
이미숙
전향아
다니쉬말리크 라피그사이어드
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바디텍메드(주)
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Definitions

  • the present invention relates to a method for accurately quantifying the level of an anti-drug antibody, and more particularly, to a method for more accurately quantifying the level of an anti-drug antibody by minimizing interference by a drug present in a patient's sample.
  • Therapeutic drug monitoring refers to a series of activities that provide feedback while continuously observing drug response for optimal drug therapy for individual patients. It is mainly used to maximize the treatment effect for each patient by monitoring the drug concentration trend to maintain the effective blood concentration and at the same time to minimize the expression of drug toxicity.
  • the main service targets include some antibiotics, anti-epileptic drugs, and cardiotropic drugs with well-known therapeutic concentration ranges, and about 10,000 cases are being administered annually.
  • Therapeutic drug concentration monitoring for optimal drug therapy is a method that bypasses individual pharmacokinetic differences by adjusting the drug regimen based on the measured drug concentration data when administering a drug with a well-known therapeutic plasma concentration range.
  • Anti-TNF agents are antibodies against Tumor necrosis factor ⁇ (TNF- ⁇ ), a major inflammatory mediator that causes chronic inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis and inflammatory bowel disease. It is widely used.
  • TNF- ⁇ Tumor necrosis factor ⁇
  • anti-TNF agents are very expensive compared to other existing drugs and have the disadvantage that they can cause opportunistic infections such as tuberculosis, and in about one-third of patients, anti-TNF agents do not show a therapeutic effect, and the remaining patients It is known that the effect decreases if the treatment is continued. According to a recently published meta-analysis, it is known that when an antibody to an anti-TNF agent is formed and when the concentration of an anti-TNF agent in blood is low, there is a high tendency for the treatment response to disappear.
  • biotherapeutic agents such as infliximab generally have long half-lives and are almost always present in test samples at most sampling points, the sensitivity analysis of the drug is of little significance without knowing the drug-tolerance limits of the ADA assay. If the level of resistance to a drug in the ADA assay is lower than the drug concentration in the test sample, the ADA assay cannot detect ADA present in the sample due to drug interference, and the incidence of ADA is underestimated. 1 explains the result error due to the interference effect by the excess free drug (infliximab) when the present invention is not applied. Therefore, it is necessary to develop a method capable of accurately detecting the amount of ADA present in the body with a high level of resistance to the target drug.
  • the drug may be an antibody drug.
  • the complex in which the drug is bound to the anti-drug antibody to which the magnetic beads are bound may be removed.
  • the level of the anti-drug antibody present in the sample can be more accurately quantified by minimizing the interference on the quantitative analysis of the anti-drug antibody by removing the excess drug present in the sample in advance.
  • Figure 3 (a) is a table showing the affinity of anti-infliximab monoclonal antibodies and anti-infliximab monoclonal antibodies to infliximab according to an embodiment of the present invention
  • Figure 3 (b) is a graph showing the contents of FIG. 3(a).
  • Figure 5 (a) is a table showing drug resistance in the quantitative measurement method of the anti-infliximab antibody of the present invention when the excess free drug (infliximab) is removed according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 5(b) is a graph showing the contents of FIG. 5(a).
  • the method for accurately quantifying the level of anti-drug antibody according to this example is (a) an anti-drug antibody (magnetic bead-antibody) in which magnetic beads are bound to a sample containing the anti-drug antibody and drug.
  • step (d) adding; (b) removing the magnetic beads from the sample that has undergone step (a); (c) dissociating the sample that has undergone step (b); (d) adding the sample subjected to step (c) to a solution containing a drug to which magnetic beads are bound and a drug to which a detector is bound; (e) adding a substrate after step (d).
  • the drug may be an antibody drug.
  • Biological products are largely divided into protein drugs, antibody drugs, vaccines, and cell therapy products.
  • antibody drugs refer to biopharmaceuticals using monoclonal antibodies that target and bind to protein antigens involved in the immune cell signaling system or markers expressed on the surface of cancer cells.
  • Antibody drugs can be classified into monoclonal antibody (mab), antibody-drug conjugate (ADC), and immunoconjugate.
  • monoclonal antibody is mouse monoclonal antibody, chimeric monoclonal antibody, humanized It is divided into monoclonal antibodies and human monoclonal antibodies.
  • the monoclonal antibody includes infliximab, trastuzumab, pertuzumab, cetuximab, bevacizumab, ramucirumab, rituximab, etc. depending on the target.
  • infliximab corresponds to a chimeric monoclonal antibody among monoclonal antibodies, and by inhibiting tumor necrosis factor, it exhibits anti-inflammatory and immunosuppressive effects.
  • the drug may correspond to any drug corresponding to an antibody drug.
  • the step (a) is a step of adding an anti-drug antibody (magnetic bead-antibody) to which a magnetic bead is bound to a sample containing an anti-drug antibody and a drug, and more specifically, the sample is a free anti-drug antibody and drug It may include an anti-drug antibody bound to, and a free drug.
  • the sample may be plasma or whole blood as well as serum.
  • a complex magnetic bead-antibody in which a magnetic bead is bound to an anti-drug antibody having high affinity with the drug is added to the sample. Due to this, most of the free drug present in the sample is bound to the anti-drug antibody (magnetic bead-antibody) to which the magnetic beads are bound.
  • step (b) the anti-drug antibody to which magnetic beads are bound and the complex (magnetic bead-antibody-drug) to which the drug is bound may be removed. More specifically, a magnetic bead-bound anti-drug antibody and drug-bound complex (magnetic bead-antibody-drug) can be removed using a magnetic rod.
  • a commonly used analysis method for anti-drug antibodies is a bridge assay that forms a multivalent bridge between a capture drug (unlabeled or biotin-labeled form) and a labeled detection drug. These assays are characterized as susceptible to endogenous drug interference (false negative ADA) and/or drug-targeted interference (false positive ADA).
  • step (c) the sample from which the magnetic beads are removed in step (b) may be dissociated.
  • the drug-bound anti-drug antibody (drug-antibody) must be dissociated into a free form of the anti-drug antibody.
  • a dissociation buffer containing an acid sufficient to dissociate the drug-bound anti-drug antibody
  • the acid may include an organic acid or an inorganic acid.
  • the dissociation step may take 10 minutes or less, preferably 5 minutes or less, and more preferably 2 minutes or less.
  • the sample that has undergone the dissociation process may be added to a solution containing the drug to which the magnetic bead is bound and the drug to which the detector is bound. More specifically, the sample subjected to the dissociation process is brought into contact with a neutralization buffer containing a drug to which magnetic beads are bound and a drug to which a detector is bound.
  • the detector is a means capable of generating a signal by binding to an antigen, antibody, or protein, and may include enzymes or enzyme proteins such as horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (ALP), and glucose oxidase (GO); organic derivative fluorescent dyes such as xanthene derivatives, cyanine derivatives, squaraine derivatives, naphthalene derivatives, coumarin derivatives, oxidazole derivatives, anthracene derivatives, arylmethine derivatives, and dipyrromethene derivatives; Inorganic substances such as CdS/ZnS Quantum dot, CdSe Quantum dot, CdSe/ZnS Quantum dot, CdSSe/ZnS Quantum dot, CdTe/CdSe/ZnS Quantum dot, CdS Quantum dot, ZnCdSe/ZnS Quantum dot, CdTe Quantum dot, etc. derivative fluorescent
  • the addition of the capture drug (magnetic bead-drug) and the detection drug (detector-drug) may enable the formation of a complex with the anti-drug antibody faster than the structural recovery of the existing drug existing in the sample.
  • a complex in which a large amount of drug is bound to magnetic beads with a large surface area can be prepared by using magnetic beads with large particles having a diameter of about 200 nm to 5 ⁇ m. Therefore, it is possible to increase the specific reaction rate with the anti-drug antibody as the molecular size expands and the motility increases, thereby reducing the interference regression phenomenon of the dissociated free (unlabeled) drug.
  • the drug to which magnetic beads are bound can bind to both arms (variable regions) of the free anti-drug antibody present in the sample, respectively.
  • the magnetic bead-drug and detector-drug complexes may be collected using a magnetic rod, respectively, on both arms of the anti-drug antibody. And due to the magnetic beads, the collection and washing of the complex can be easily controlled, and the assay sensitivity and specificity can be promoted.
  • infliximab drug is mixed with 0.1M NaHCO 3 containing biotin-NHS (N-hydroxysuccinimide) ester and stirred at room temperature for 2 hours.
  • biotin-labeled drug is separated from the reaction solution using a size exclusion dialysis membrane. 50 ⁇ L (100%) magnetic beads having a functional group of streptavidin (Thermofisher) and 5 ⁇ g/mL biotin-conjugated infliximab were mixed and reacted at 37°C for 2 hours.
  • the prepared magnetic bead-bound infliximab (0.02%), ALP-labeled infliximab (1 ⁇ g/mL), and each clone (50 ⁇ L) were mixed and reacted for 7 minutes. Thereafter, the magnetic beads are recovered, washed, and 600 uM 4-MUP (4-Methylumbelliferyl-phosphate) is reacted with the magnetic beads, and then the fluorescence intensity is measured after 7 minutes.
  • Each clone was used at two concentrations, 10ng/mL and 250ng/mL, and the fluorescence intensities and ratios of low and high concentrations are shown in FIGS. 3(a) and 3(b). 2F5 of clone sr No. 11 having a relatively high reactivity compared to the commercial antibody (sr No. 1) was selected.
  • Dissociation buffer is prepared with 0.1M Glycine-HCl at pH 1.92.
  • Neutralization buffer was prepared by adding 0.05% preservative to 1M Tris-HCl, pH8.5 solution. Each buffer was dispensed into each position of the cartridge wells prior to use.
  • a conjugate of infliximab and magnetic beads and a conjugate of infliximab and an enzyme (ALP) were prepared in the same manner as in Example 1, and were used by dispensing into each well of the cartridge. Sr No. selected in Example 1 to remove excess free drug present in the sample. A conjugate in which magnetic beads were bound to the 2F5 clone antibody of 11 was used. The bonding method is the same as the magnetic bead bonding method of Example 1. 2F5 clone antibody is mixed with 0.1M NaHCO 3 containing biotin-NHS (N-hydroxysuccinimide) ester and stirred at room temperature for 2 hours. Biotin-labeled clones are separated from the reaction solution using a size exclusion dialysis membrane.
  • Magnetic beads having a functional group of streptavidin and 5 ⁇ g/mL biotin-conjugated infliximab are mixed and reacted at 37°C for 2 hours to prepare a 2F5 clone antibody to which magnetic beads are bound.
  • Anti-infliximab (Biorad) at a concentration of 1 mg/ml was serially diluted into human plasma (healthy person) to obtain anti-infliximab concentrations of 0 ng/mL, 10 ng/mL, 50 ng/mL and 250 ng/mL, respectively.
  • a map solution was prepared.
  • Anti-infliximab (Biorad) at a concentration of 1 mg/ml was serially diluted with human plasma (from healthy people) to double concentrations of 0 ng/mL, 10 ng/mL, 50 ng/mL and 250 ng/mL of anti-infliximab. After preparing the simap solution, it was mixed with 100 ⁇ g/ml infliximab in a 1:1 ratio (v/v), and finally 0ng/mL, 10ng/mL containing 50 ⁇ g/mL infliximab drug, Prepare 50 ng/mL and 250 ng/mL anti-infliximab solutions.
  • the reference sample (composite) prepared in Example 2 was dispensed in an amount of 50 ⁇ l into the sample wells contained in the cartridge. After the reference sample was added to the sample well, 50 ⁇ l of the conjugate of the magnetic beads prepared in Example 2 and the anti-infliximab antibody was added to the sample and reacted for 5 minutes, then the magnetic beads were removed and discarded. . Then, 50 ⁇ l of the sample from the sample wells was transferred to the reaction wells containing the dissociation buffer mix of Example 2 and waited for 2 minutes.
  • the immune complex (the form in which the drug and the anti-drug antibody are combined) goes through the dissociation and neutralization steps, and then the excess drug in the sample binds to the anti-drug antibody again. This is because interference reactions occur.
  • the concentration of the infliximab drug present in the sample is 0, 10, 50, or 100 ⁇ g/ml, the magnetic beads prepared in Example 2 and the anti-infliximab ( In the case of removing the excess infliximab drug using the conjugation of the 2F5 antibody clone of Sr No. 11 selected in Example 1, see Figs. 5(a) and 5(b).
  • the concentration of the drug present in the sample the less the decrease in the recovery rate compared to the case where the excess infliximab drug removal step was not performed, and the presence of the antibody present in the sample It can be seen that the signal value indicating .
  • the immune complex (the form in which the drug and the anti-drug antibody are combined) goes through the dissociation and neutralization steps, and then the drug binds to the anti-drug antibody again. It can be seen that almost no reaction occurred.

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Abstract

본 발명은 항 약물 항체의 수준을 정확하게 정량화하는 방법에 관한 것으로서, (a) 항 약물 항체와 약물을 포함하는 샘플에 자기 비드가 결합된 항 약물 항체를 첨가하는 단계; (b) 상기 (a)단계를 거친 샘플에서 자기 비드를 제거하는 단계; (c) 상기 (b) 단계를 거친 샘플을 해리시키는 단계; (d) 상기 (c) 단계를 거친 샘플을 자기 비드가 결합된 약물 및 탐지체가 결합된 약물이 포함된 용액에 첨가하는 단계; (e) 상기 (d) 단계를 거친 후 기질을 첨가하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따르면, 샘플 내에 존재하는 과잉의 약물을 사전에 제거하여 항 약물 항체의 정량적 분석에 미치는 간섭을 최소화함으로써 샘플 내에 존재하는 항 약물 항체의 수준을 보다 정확하게 정량화할 수 있는 효과가 있다.

Description

항 약물 항체의 수준을 정확하게 정량화하는 방법
본 발명은 항 약물 항체의 수준을 정확하게 정량화하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 환자의 시료에 존재하는 약물에 의한 간섭을 최소화하여 보다 정확하게 항 약물 항체의 수준을 정량화하는 방법에 관한 것이다.
개발 중인 바이오 치료제의 수는 지난 10 년 동안 증가해 왔다. 바이오 치료제의 경우 환자에게 상당한 이점을 제공함에도 불구하고, 거의 모든 단백질 기반 바이오 치료제가 원치 않는 면역원성(immunogenicity)을 유발하여 효능 손실을 일으키고, 주입(infusion) 반응, 아나필락시스, 심지어 내인성 단백질에 대한 생명을 위협하는 반응 등과 같이 부작용의 위험이 존재한다. 최근 면역원성 분석의 발전으로 인해 완전한 의약 제품에서도 예기치 않게 높은 면역원성이 발생하고 있음이 밝혀지고 있는 바, 면역원성과 임상 관련성을 평가하는 데 새로운 도전이 발생하고 있다.
치료 약물 모니터링(Therapeutic Drug Monitoring, TDM)은 개별 환자의 적정 약물 치료법을 위해 지속적으로 약물 반응을 관찰하면서 피드백을 제공하는 일련의 활동을 의미한다. 주로 약물 농도 추이를 모니터링 하여 유효 혈중 농도를 유지하면서 동시에 약물 독작용의 발현을 최소화함으로써 환자 개인별 치료 효과를 극대화하는데 이용된다. 주요한 서비스 대상이 되는 약물은 치료 농도 범위가 잘 알려진 몇몇 항생제와 항간질제, 강심제 등이 있으며, 연간 약 1만 건을 실시하고 있다. 적정 약물 요법을 위한 치료적 약물 농도의 모니터링은 치료 혈장 농도 범위(therapeutic range of plasma concentration)가 잘 알려져 있는 약물의 투여 시 측정된 약물 농도 데이터를 근거로 약물 용법을 조정함으로써 약동학적 개인차를 우회하는 것이 가능하다. 최근 체액 내 약물 및 이의 대사체를 측정하는 분석 화학의 발전과, 임상 약물 동태학 (Clinical pharmacokinetics)의 도입 등으로 임상적으로 개개의 환자에서 치료적 약물의 모니터링이 이미 보편화되었고, 이러한 새로운 의료 분야의 연구 및 임상 응용의 필요성이 점차 증가하고 있다.
항TNF 제제는 류마티스 관절염, 염증성 장질환 등의 만성 염증질환을 유발하는 주요 염증매개물질인 Tumor necrosis factor α (TNF- α)에 대한 항체로서, 크론병에서 처음 사용된 이후 현재는 궤양성 대장염에서도 널리 사용되고 있다. 하지만, 항TNF 제제는 기존의 다른 약제에 비해 약가가 매우 비싸고, 결핵 등의 기회감염을 유발할 수 있다는 단점이 있으며, 약 1/3의 환자에서는 항TNF 제제에 치료 효과를 보이지 못하고 있으며, 나머지 환자들에게 치료를 지속하는 경우 그 효과가 떨어진다고 알려져 있다. 최근에 발표된 메타 분석에 따르면, 항TNF 제제에 대한 항체가 형성된 경우와 혈중 항TNF 제제의 농도가 낮은 경우, 치료 반응이 소실될 가능성이 높은 경향을 보이는 것으로 알려져 있다.
2015년 발표된 TAXIT (The Trough Concentration Adapted Infliximab Treatment) 연구에서는 인플릭시맙 유지 요법으로 치료받는 염증성 장질환 환자에서 약물의 최저 수준 목표(Trough level target, 3~7 μg/mL)를 설정하여 대상자의 투약스케줄을 조정하거나 약물 용량을 조절하였다. TAXIT 연구결과를 살펴보면 유지 단계(maintenance phase)에서 임상에 기초하여 투여한(clinically based dosing) 군과 농도에 기초하여 투여한(Concentration based dosing) 군의 임상적 관해율의 차이는 없었으나, 최적 단계(Optimization phase)에서 크론병 환자의 경우에는 임상적 관해율이 65.1%에서 88.4%로 증가하였다. 또한 다른 연구에서는 염증성 장질환 환자에서 인플릭시맙 약물의 최저 수준을 6~10μg/mL 유지했을 때, 내시경을 이용해 평가한 mucosal healing rate가 80-90%로 나타났다. 이와 같이 해외에서는 이미 염증성 장질환 환자들에게 인플릭시맙을 투약하는 경우, TDM을 적극적으로 이용하여 그 검사 결과를 치료에 반영하고 있는 실정이다.
한편, 체내에 존재하는 약물의 경우 체내에 약물에 대한 항체가 낮은 농도로 존재할수록 약물의 면역원성이 문제되지 않게 되고 이 경우 약물로서 제대로 효과를 나타낼 수 있게 된다. 따라서 체내에 존재하는 약물에 대한 항체인 항 약물 항체(anti drug antibody, ADA)의 농도를 정확하게 측정하는 것이 필요하며 매우 중요하다.
인플릭시맙과 같은 바이오 치료제는 일반적으로 반감기가 길고 대부분의 샘플링 시점에서 거의 항상 테스트 샘플에 존재하기 때문에 ADA 분석의 약물에 대한 내성 한계를 알지 못하면 약물의 민감도 분석은 거의 의미가 없게 된다. ADA 분석의 약물에 대한 내성 수준이 테스트 샘플의 약물 농도보다 낮으면 ADA 분석은 약물의 간섭으로 인해 샘플에 존재하는 ADA를 감지할 수 없으며 ADA 발생률은 과소 평가된다. 도 1은 본 발명이 적용되지 않았을 때의 과잉 유리약물 (인플릭시맙)에 의한 간섭 효과로 인한 결과 오류를 설명한다. 따라서 목적 약물에 대해 높은 내성 수준을 가지고 이로 인해 체내에 존재하는 ADA의 양을 정확하게 검출할 수 있는 방법의 개발이 필요한 실정이다.
따라서 본 발명은 샘플 내에 존재하는 과잉의 약물을 사전에 제거하여 항 약물 항체의 정량적 분석에 미치는 간섭을 최소화함으로써, 샘플 내에 존재하는 항 약물 항체의 수준을 보다 정확하게 정량화하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성을 위하여 본 발명은 항 약물 항체의 수준을 정확하게 정량화하는 방법으로서 (a) 항 약물 항체와 약물을 포함하는 샘플에 자기 비드가 결합된 항 약물 항체를 첨가하는 단계; (b) 상기 (a) 단계를 거친 샘플에서 자기 비드를 제거하는 단계; (c) 상기 (b) 단계를 거친 샘플을 해리시키는 단계; (d) 상기 (c) 단계를 거친 샘플을 자기 비드가 결합된 약물 및 탐지체가 결합된 약물이 포함된 용액에 첨가하는 단계; (e) 상기 (d) 단계를 거친 후 기질을 첨가하는 단계를 포함하는 것을 일 측면으로 한다.
바람직하게는, 상기 약물은 항체의약품일 수 있다.
바람직하게는, 상기 (b) 단에서는 자기 비드가 결합된 항 약물 항체에 약물이 결합된 형태의 복합체가 제거될 수 있다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 샘플 내에 존재하는 과잉의 약물을 사전에 제거하여 항 약물 항체의 정량적 분석에 미치는 간섭을 최소화함으로써, 샘플 내에 존재하는 항 약물 항체의 수준을 보다 정확하게 정량화할 수 있다.
도 1은 본 발명이 적용되지 않았을 때의 과잉 유리약물 (인플릭시맙)에 의한 간섭 효과로 인한 결과 오류를 설명한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 자기비드가 결합된 항-약물 항체를 사용하여 과잉 유리 약물(인플릭시맙)을 제거하여 약물(인플릭시맙) 항체를 검출하는 방법을 도시한 것이다.
도 3(a)는 본 발명의 일 실시예에 따른 항 인플릭시맙 단일클론 항체들 및 항 인플릭시맙 단일클론 항체들의 인플릭시맙에 대한 친화도를 나타내는 표이고, 도 3(b)는 도 3(a)의 내용을 표시한 그래프이다.
도 4(a)는 과잉 유리 약물(인플릭시맙)의 제거 단계를 거치지 않은 경우에 본 발명 항 인플릭시맙 항체의 정량적 측정 방법의 약물에 대한 내성을 나타내는 표이고, 도 4(b)는 도 4(a)의 내용을 표시한 그래프이다.
도 5(a)는 본 발명의 일 실시예에 따른 과잉 유리 약물(인플릭시맙)의 제거 단계를 거친 경우에 본 발명 항 인플릭시맙 항체의 정량적 측정 방법의 약물에 대한 내성을 나타내는 표이고, 도 5(b)는 도 5(a)의 내용을 표시한 그래프이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 자기비드가 결합된 항-약물 항체를 사용하여 과잉 유리 약물(인플릭시맙)을 제거하여 약물(인플릭시맙) 항체를 검출하는 방법을 도시한다. 도 2에 도시된 바와 같이, 본 실시예에 의해 항 약물 항체의 수준을 정확하게 정량화 하는 방법은 (a) 항 약물 항체와 약물을 포함하는 샘플에 자기 비드가 결합된 항 약물 항체(자기비드-항체)를 첨가하는 단계; (b) 상기 (a)단계를 거친 샘플에서 자기 비드를 제거하는 단계; (c) 상기 (b) 단계를 거친 샘플을 해리시키는 단계; (d) 상기 (c) 단계를 거친 샘플을 자기 비드가 결합된 약물 및 탐지체가 결합된 약물이 포함된 용액에 첨가하는 단계; (e) 상기 (d) 단계를 거친 후 기질을 첨가하는 단계를 포함한다.
상기 약물은 항체의약품일 수 있다. 생물학적 제제(바이오의약품)는 크게 단백질의약품, 항체의약품, 백신, 세포치료제 등으로 나뉜다. 이 중 항체의약품이란 면역세포 신호전달체계에 관여하는 단백질 항원이나 암세포 표면에서 발현되는 표지인자를 표적으로 하여 결합하는 단세포군 항체(Monoclonal antibody)를 이용하는 바이오의약품을 말한다. 항체의약품은 단클론 항체(monoclonal antibody, mab), 항체-약물 복합체(antibody-drug conjugate, ADC), 면역접합체(immunoconjugate)로 분류할 수 있고, 이 중에서도 단클론 항체는 마우스 단클론 항체, 키메라 단클론 항체, 인간화 단클론 항체, 인간 단클론 항체로 나뉘게 된다.
또한 상기 단클론 항체에는 표적에 따라 인플릭시맙, 트라스투주맙, 퍼투주맙, 세툭시맙, 베바시주맙, 라무시루맙, 리툭시맙 등이 있다. 그 중에서도 인플릭시맙은 단클론 항체 중에서도 키메라 단클론 항체에 해당하는 것으로서, 종양괴사인자를 저해함으로써 항염증 및 면역억제 효과를 나타내어 면역체계에 이상으로 인해 발생된 과도하고 지속적인 염증성 질환의 치료에 사용되는 약물이다. 주로 주사제의 형태로, 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 궤양성 대장염, 성인 크론병, 소아 크론병, 건선, 건선성 관절염에 사용되고 있다.
상기 약물은 상기 예시로 든 인플릭시맙, 트라스투주맙, 퍼투주맙, 세툭시맙, 베바시주맙, 라무시루맙, 리툭시맙 등 이외에도 항체의약품에 해당하는 약물이라면 이에 해당될 수 있다.
상기 (a) 단계는 항 약물 항체와 약물을 포함하는 샘플에 자기 비드가 결합된 항 약물 항체(자기비드-항체)를 첨가하는 단계로서, 보다 상세하게는 상기 샘플은 유리된 항 약물 항체 및 약물과 결합된 항 약물 항체, 유리된 약물을 포함할 수 있다. 상기 샘플은 혈청 뿐만 아니라 혈장, 전혈을 그 대상으로 할 수 있다. 그리고 이러한 샘플에 약물과 친화도가 높은 항 약물 항체에 자기비드가 결합된 형태의 복합체(자기비드-항체)를 첨가한다. 이로 인해 샘플 내에 존재하는 유리 약물의 대부분이 자기 비드가 결합된 항 약물 항체(자기비드-항체)와 결합하게 된다.
상기 (b) 단계에서는 자기비드가 결합된 항 약물 항체와 약물이 결합된 복합체(자기비드-항체-약물)가 제거될 수 있다. 보다 상세하게는, 마그네틱 로드를 사용하여 자기비드가 결합된 항 약물 항체와 약물이 결합된 복합체(자기비드-항체-약물)를 제거할 수 있다. 일반적으로 사용되는 항 약물 항체의 분석 방법은 포획 약물 (비 표지 또는 비오틴이 표지된 형태)과 표지된 검출 약물 사이의 다중 valent 브릿지를 형성하는 브릿지 분석이다. 이러한 분석은 내인성 약물 간섭 (위음성 ADA) 및/또는 약물 표적 간섭 (위양성 ADA)에 취약한 특징이 있다. 따라서 분석 방법 개발 분야에서는 산 또는 염기 해리, 타사 결합 파트너 경쟁 억제 및/또는 간섭 요인 제거, 고체상 추출과 같이 상기 취약점을 완화하기 위해 많은 접근 방식이 사용되어 왔다. 본 발명의 경우 항 약물 항체의 측정에 간섭반응을 일으킬 수 있는 유리 약물들이 사전에 제거되므로, 항체와 자기 비드가 결합된 약물로 이루어진 특정 면역복합체가 쉽게 형성될 수 있으며, 이로 인해 유리 약물의 간섭 없이 더 큰 특이성과 민감도로 정확하게 샘플 내에 존재하는 항 약물 항체(유리된 항 약물 항체 및 약물이 결합된 항 약물 항체 모두)의 수준을 정량화할 수 있게 된다.
상기 (c) 단계에서는 상기 (b) 단계에서 자기 비드가 제거된 샘플을 해리시킬 수 있다. 샘플 내 항 약물 항체의 정확한 수준을 측정하기 위해서는, 약물이 결합된 항 약물 항체(약물-항체)를 유리 형태의 항 약물 항체로 해리시켜야 한다. 샘플에서 자기 비드가 결합된 항 약물 항체와 약물이 결합된 형태의 복합체(자기비드-항체-약물)를 제거한 후, 약물이 결합된 항 약물 항체를 해리시키기에 충분한 양의 산을 포함하는 해리 완충용액과 샘플을 접촉시킨다. 여기서 산은 유기산 또는 무기산을 포함할 수 있다. 해리 단계는 10분 이하의 시간이 소요되며, 바람직하게는 5분 이하, 더욱 바람직하게는 2분 이하의 시간이 소요될 수 있다.
상기 (d) 단계에서는 상기 해리과정을 거친 샘플을 자기 비드가 결합된 약물 및 탐지체가 결합된 약물이 포함된 용액에 첨가할 수 있다. 보다 상세하게는, 자기 비드가 결합된 약물 및 탐지체가 결합된 약물을 포함하는 중화 완충액과 해리과정을 거친 샘플을 접촉시킨다.
상기 탐지체는 항원, 항체, 또는 단백질 등에 결합하여 신호를 발생시킬 수 있는 수단으로서, HRP(Horseradish peroxidase), ALP(Alkaline phosphatase), GO(Glucose oxidase) 등의 효소 또는 효소 단백질; xanthene 유도체, cyanine 유도체, squaraine 유도체, naphthalene 유도체, coumarin 유도체, oxidazole 유도체, anthracene 유도체, arylmethine 유도체, dipyrromethene 유도체 등의 유기물 유도체 형광 염료; CdS/ZnS Quantum dot, CdSe Quantum dot, CdSe/ZnS Quantum dot, CdSSe/ZnS Quantum dot, CdTe/CdSe/ZnS Quantum dot, CdS Quantum dot, ZnCdSe/ZnS Quantum dot, CdTe Quantum dot, Eu, Tb 등의 무기물 유도체 형광 염료; 형광 염료 등이 착색된 라텍스, 폴리스타이렌 등의 미소입자; 및 Au, Ag, Fe, Pt, Co 또는 이들의 조합으로 구성된 나노입자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
약물 및 항 약물 항체의 경우 산을 사용하는 해리과정을 통해 그 입체 구조에 약간의 변형이 일어난 상태이므로 상기 중화 과정을 통해 본래의 약물 및 항체의 구조를 회복할 수 있게 된다.
한편, 중화반응을 하는 동안 본래의 약물 및 항체의 구조가 회복되어 다시 약물과 항 약물 항체가 결합하는데는 상당한 시간이 소요될 수 있다. 이때 포획 약물(자기비드-약물) 및 탐지 약물(탐지체-약물)의 첨가는 샘플 내에 존재하였던 기존 약물의 구조 회복 보다 빠르게 항 약물 항체와의 복합체 형성을 가능하게 할 수 있다. 또한 기존의 방식인 ELISA 제품과 달리, 약 200 nm ~5 μm의 직경을 가지는 입자가 큰 자기비드를 사용함으로써 표면적이 넓은 자기비드에 다량의 약물이 결합된 복합체를 제조할 수 있다. 따라서 이로 인해 분자크기가 확장되고 운동성이 높아짐에 따라 항 약물 항체와의 특이적 반응속도를 높일 수 있으므로, 해리된 유리 (비표지) 약물의 간섭 회귀 현상을 줄일 수 있게 된다.
자기 비드가 결합된 약물(자기비드-약물) 및 탐지체 가 결합된 약물(탐지체-약물)은 각각 샘플 내에 존재하는 유리된 항 약물 항체의 양 팔(variable region)에 결합을 할 수 있고, 이 경우 상기 항 약물 항체의 양 팔에 각각 자기비드-약물 및 탐지체-약물이 결합된 형태의 복합체를 마그네틱 로드를 사용하여 수집할 수 있다. 그리고 상기 자기 비드로 인해 복합체의 수집 및 세척이 쉽게 제어되며 분석 감도 및 특이성을 촉진시킬 수 있다.
상기 (e) 단계에서는 상기 (d) 단계를 거친 샘플에 상기 탐지체와 반응하는 기질을 첨가할 수 있다. 이 경우 상기 탐지체와 기질간의 반응을 통해 상기 항 약물 항체의 수준을 정량화할 수 있게 된다. 상기 항 약물 항체의 수준을 정량화하는 기술로는 항원/항체 간의 특이적 결합에 기반한 EIA (Enzyme ImmunoAssay)로도 불리는 면역분석기술이 사용될 수 있다. 상기 EIA 면역분석기술에는 분석물의 검출을 위해 사용되는 기질의 종류에 따라서, 발색반응을 흡광도로 측정하는 색변화측정 방법(chromogenic, 또는 colorimetric), 화학발광법 및 형광을 이용한 방법 등이 있다.
이와 같이 상기 (a), (b), (c), (d), (e)단계를 거침으로써 샘플 내에 존재하는 항 약물 항체의 수준을 정확하게 정량화할 수 있게 된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 항 인플릭시맙 항체의 선정
인플릭시맙을 쥐에 면역하여 확보한 16클론에 대해 약물과의 반응성을 확인하고 가장 반응성이 높은 1 클론을 선별한다. 약물과의 반응성 확인을 위해 먼저, 인플릭시맙 약물을 비오틴-NHS (N-hydroxysuccinimide) ester 이 포함된 0.1M NaHCO3에 혼합하여 2시간 동안 상온에서 교반한다. 반응이 완료된 용액은 크기 배제 투석막을 이용하여 비오틴이 표지된 약물을 분리한다. 스트렙트아비딘 (streptavidin)의 작용기를 가진 50μL (100%) 자기비드 (Thermofisher)와 5μg/mL 비오틴결합 인플릭시맙을 혼합하여 37도에서 2시간 반응시켜 자기비드가 결합된 인플릭시맙(자기비드-인플릭시맙)을 제조한다. 한편 alkalinephosphatase (ALP)가 표지된 약물 제조를 위해서 ALP 표지키트 (Abcam Alkaline phosphatase conjugation kit)를 이용하여 ALP 표지 약물(ALP-약물)을 제조한다.
상기 제조된 자기비드가 결합된 인플릭시맙(0.02%)과 ALP가 표지된 인플릭시맙 (1μg/mL)과 각 클론 (50μL)을 혼합하여 7분간 반응시킨다. 이후 자기비드를 회수하여 세척 후 600uM 4-MUP(4-Methylumbelliferyl - phosphate)를 자기비드와 반응시킨 후 7분 경과 후에 형광세기를 측정한다.
각 클론은 두가지 농도, 10ng/mL 과 250ng/mL 로 사용하였으며, 저농도와 고농도의 형광세기 및 그 ratio를 도 3(a)와 도 3(b)에 나타냈다. 상용항체(sr No.1)과 비교하여 반응성이 상대적으로 높은 클론 sr No.11의 2F5가 선택되었다.
실시예 2
1. 완충액
해리완충액은 pH 1.92의 0.1M Glycine-HCl로 제조한다. 중화완충액은 1M Tris-HCl, pH8.5 용액에 0.05% 보존제를 첨가하여 제조되었다. 각 완충액은 사용 전에 카트리지 웰 각 위치에 분주되었다.
2. 컨쥬게이트의 준비(제조)
인플릭시맙과 자기 비드의 컨쥬게이트와 인플릭시맙과 효소(ALP)의 컨쥬게이트는 실시예1 과 동일하게 제조되었으며, 카트리지의 각 웰에 분주하여 사용하였다. 시료내에 존재하는 과잉 유리 약물을 제거하기 위해 실시예 1에서 선정된 Sr No. 11의 2F5 클론 항체에 자기비드를 결합한 컨쥬게이트를 사용하였다. 그 결합 방법은 상기 실시예 1의 자기비드 결합 방식과 동일하다. 2F5 클론 항체를 비오틴-NHS (N-hydroxysuccinimide) ester 이 포함된 0.1M NaHCO3에 혼합하여 2시간동안 상온에서 교반한다. 반응이 완료된 용액은 크기 배제 투석막을 이용하여 비오틴이 표지된 클론을 분리한다. 스트렙트아비딘 (streptavidin)의 작용기를 가진 자기비드 (Thermofisher)와 5μg/mL 비오틴 결합 인플릭시맙을 혼합하여 37도에서 2시간 반응시켜 자기비드가 결합된 2F5 클론 항체를 제조한다.
3. 샘플의 준비
(1) 기준 샘플(free)
1mg/ml의 농도인 항-인플릭시맙 (Biorad)을 인간 혈장 (건강한 사람)으로 연속 희석하여 농도가 각각 0ng/mL, 10ng/mL, 50ng/mL 및 250ng/mL 인 항- 인플릭시 맵 용액을 제조하였다.
(2) 기준 샘플(복합체)
농도 1mg/ml의 항 인플릭시맙(Biorad)을 인간 혈장(건강한 사람의 것)으로 연속 희석하여 농도 0ng/mL, 10ng/mL, 50ng/mL 및 250ng/mL의 2배 농도로 항 인플릭시맙 용액을 제조 한 후 100μg/ml의 인플릭시맙과 함께 1:1 비율(v/v)으로 혼합하여 최종 50μg/mL 의 인플릭시맙약물이 포함된 0ng/mL, 10ng/mL, 50ng/mL 및 250ng/mL의 항 인플릭시맙 용액을 제조한다.
실시예 3. 면역분석(Immunoassay)
실시예 2에서 준비된 완충액, 컨쥬게이트, 기준샘플을 사용하여 이하의 면역 분석을 수행하였다.
실시예 2에서 준비된 기준 샘플(복합체)은 카트리지에 담겨있는 샘플 웰에 50μl의 양으로 분주되었다. 기준 샘플을 샘플 웰에 첨가 한 후, 상기 실시예 2에 의해 제조된 자기 비드와 항 인플릭시맙 항체의 컨쥬게이트 50μl를 샘플에 추가하고 5 분 동안 반응시킨 후, 자기 비드를 제거하고 폐기하였다. 그리고 나서, 샘플 웰에 있는 샘플 50μl를 실시예 2의 해리 완충액 믹스를 포함하는 반응 웰로 옮기고 2 분 동안 기다렸다. 해리반응 후 해리된 시료 150μl를 자기비드가 결합된 인플릭스맵 약물 25μl 및 효소(ALP) 결합된 인플릭시맙 약물을 포함하는 실시예 2의 중성화 완충액 웰로 옮겼다. 그 다음 혼합하고 5 분 동안 기다렸다. 그 후 마그네틱 로드를 사용하여 면역 복합체를 수집한 후 두 번 세척하였고 최종 검출을 위해 7 분 동안 대기한 후 기질인 4-MUP(4-Methylumbelliferyl phosphate)를 포함하는 최종 웰로 세척된 면역 복합체를 옮겼다.
측정예 1. 약물에 대한 내성(Drug Tolerance)
샘플 내에 존재하는 인플릭시맙 약물의 농도가 0, 10, 50, 100 μg/ml 존재하는 경우에, 실시예 2에 의해 제조된 자기비드와 항-인플릭시맙(실시예 1에서 선정된 Sr No. 11의 2F5 항체 클론)의 컨쥬게이션을 사용하여 과잉의 인플릭시맙 약물을 제거하는 단계를 거치지 않은 것을 제외하고는, 실시예 3과 동일한 방법으로 기준 샘플(복합체)에 존재하는 항 인플릭스맵 항체의 농도를 측정하였다. 그 결과 도 4(a)와 도 4(b)에 나타난 바와 같이, 샘플에 존재하는 각각의 항체 농도에 대하여 샘플 내에 존재하는 약물의 농도가 높아질수록 회수되는 항체의 비율이 점점 낮아지고 샘플 내 존재하는 항체의 존재를 나타내는 시그널 값도 점점 작아지고 있음을 알 수 있다. 이는 과잉의 인플릭시맙 약물 제거 단계를 거치지 않은 경우 면역 복합체(약물과 항 약물 항체가 결합된 형태)가 해리 및 중성화 단계를 거친 이후에 다시 샘플 내에 존재하는 과잉 약물이 항 약물 항체에 결합하는 간섭 반응이 일어나기 때문이다.
그러나 샘플 내에 존재하는 인플릭시맙 약물의 농도가 0, 10, 50, 100 μg/ml 존재하는 경우에, 실시예 3과 같이 실시예 2에 의해 제조된 자기비드와 항-인플릭시맙(실시예 1에서 선정된 Sr No. 11의 2F5 항체 클론)의 컨쥬게이션을 사용하여 과잉의 인플릭시맙 약물을 제거하는 단계를 거친 경우, 도 5(a)와 도 5(b)를 보면 샘플에 존재하는 각각의 측정된 항체 농도에 대하여 샘플 내에 존재하는 약물의 농도가 높아질수록 상기 과잉의 인플릭시맙 약물 제거 단계를 거치지 않은 경우에 비해 회수율의 감소가 훨씬 적고 샘플 내 존재하는 항체의 존재를 나타내는 시그널 값도 큰 변화를 나타내지 않음을 알 수 있다.
따라서 상기와 같이 과잉의 인플릭시맙 약물을 제거하는 단계를 거침으로써 면역 복합체(약물과 항 약물 항체가 결합된 형태)가 해리 및 중성화 단계를 거친 이후에 다시 약물이 항 약물 항체에 결합하는 간섭 반응이 거의 일어나지 않았음을 알 수 있다.
본 발명은 그 바람직한 실시예를 참조하여 구체적으로 도시되고 설명되었지만, 첨부된 청구 범위에 포함되는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부 사항에서의 다양한 변화가 이루어질 수 있음이 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 또한, 여기에 설명된 실시예들은 상호 배타적인 것이 아니며, 다양한 실시예들의 특징이 본 발명에 따라 전체적으로 또는 부분적으로 조합될 수 있다는 것을 이해해야 한다.

Claims (3)

  1. (a) 항 약물 항체와 약물을 포함하는 샘플에 자기 비드가 결합된 항 약물 항체를 첨가하는 단계;
    (b) 상기 (a)단계를 거친 샘플에서 자기 비드를 제거하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계를 거친 샘플을 해리시키는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계를 거친 샘플을 자기 비드가 결합된 약물 및 탐지체가 결합된 약물이 포함된 용액에 첨가하는 단계;
    (e) 상기 (d) 단계를 거친 후 기질을 첨가하는 단계; 를 포함하는 항 약물 항체의 수준을 정확하게 정량화하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 약물은 항체의약품인 것을 특징으로 하는 항 약물 항체의 수준을 정확하게 정량화하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 자기 비드가 결합된 항 약물 항체에 약물이 결합된 형태의 복합체가 제거되는 것을 특징으로 하는 항 약물 항체의 수준을 정확하게 정량화하는 방법.
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