WO2022098143A1 - 분리된 미토콘드리아를 포함하는 섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

분리된 미토콘드리아를 포함하는 섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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fibrosis
mitochondria
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stem cells
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김천형
한규범
유신혜
김유진
이서은
박종혁
조가영
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating fibrosis comprising mitochondria as an active ingredient.
  • fibrosis which accounts for about 45% of the causes of death in Western society, can be diagnosed after the disease has progressed clinically, there is a limit to prophylactic treatment. In addition, it is a serious disease field that has no effective treatment means to directly address advanced and pre-generated fibrosis to date.
  • Direct causes of fibrosis include tissue damage, infection, autoimmune diseases, organ transplantation and foreign body reactions, and tumors.
  • aging, obesity, diabetes, cardiovascular disease, high blood pressure, blood cholesterol, etc. are also pointed out as important causes.
  • the causes of fibrosis and the types of diseases that are expressed are very diverse, but the mechanism of progression of fibrosis in each tissue is not only very complicated, but also known to be caused by the complex action of various pathways.
  • myofibroblasts As the causative cell that dominates the progression of fibrosis, abnormally activated fibroblasts, myofibroblasts, have been pointed out. Myofibroblasts are characterized by the accumulation of extracellular matrix (ECM) composed of fibrous type 1 and 3 collagen and fibronectin in the tissue and inactivation of enzyme genes that degrade the extracellular matrix (Dufferield JS, et al. ., Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis, 8:241-276 (2013)).
  • ECM extracellular matrix
  • TGF- ⁇ 1 Transforming Growth Factor-beta 1
  • TNF- ⁇ Tumor Necrosis Factor-alpha
  • IL-1 interleukin-1
  • IL-6 IL-6
  • IL-13 growth factors
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • TGF- ⁇ 1, IL-13, CTGF (Connective- Tissue Growth Factor), PDGF, ⁇ v ⁇ 6 integrin, galectin-3, LOXL2 (Lysyl oxidase homolog 2), transglutaminase-2, NOX4 (NADPH oxidase 4) or Jun N-terminal kinases (JNK) inhibitors Drugs are being developed.
  • a steroid and an immunosuppressant are used alone, or a steroid and an immunosuppressant are used in combination.
  • treatment efficacy is shown only in about 10 to 30% of all patients, and the median survival rate is less than 3 years, which is not effective.
  • the frequency of use is gradually decreasing.
  • Pirfenidone is a drug that inhibits the promoter response of TGF- ⁇ . It was a drug recommended for conditional use in the 2011 guidelines, but it was recently changed to a conditionally usable drug. The drug has been shown to reduce the proliferation of myofibroblasts in animal studies. However, in subsequent clinical trials, it was reported that there was no clear effect, and side effects such as nausea, vomiting, and indigestion appeared.
  • tyrosine kinase inhibitor nintedanib is a drug that inhibits the growth factor receptors of various cells. It is known that nintedanib inhibits the action of cytokines promoting fibrosis at the cellular level, reduces collagen synthesis by TGF- ⁇ , and alleviates pulmonary fibrosis in fibrosis-induced animal experiments. Although clinical trials have shown the effect of delaying the decrease in lung function in a wide range of patients, it is known that it cannot cure pulmonary fibrosis. As such, pirfenidone and nintedanib have limitations in that they do not function as drugs to stop the progression of fibrosis itself.
  • mitochondria are eukaryotic organelles involved in the synthesis and regulation of adenosine triphosphate (ATP), an intracellular energy source.
  • ATP adenosine triphosphate
  • Mitochondria are implicated in the control of various metabolic pathways in vivo, such as cell signaling, cell differentiation, apoptosis, as well as the cell cycle and cell growth.
  • mitochondria have their own genomes and are organelles that play a pivotal role in energy metabolism in cells. Mitochondria play important roles, including producing cellular energy through electron transport and oxidative phosphorylation, and participating in apoptosis signaling pathways.
  • the present inventors isolated mitochondria from cells of different species in order to isolate mitochondria exhibiting antifibrotic activity, and comparatively analyzed mitochondrial function and antifibrotic activity. By inhibiting the activity of TGF- ⁇ , it was confirmed that the treatment of advanced or pre-generated fibrosis is possible, and the present invention was completed.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating fibrosis and a method for treating fibrosis using the same.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating fibrosis comprising mitochondria exhibiting anti-fibrotic activity.
  • one aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating fibrosis comprising mitochondria as an active ingredient.
  • Another aspect of the present invention provides a method for preventing or treating fibrosis comprising administering the pharmaceutical composition to a subject.
  • the pharmaceutical composition comprising mitochondria according to the present invention as an active ingredient inhibits the activity of TGF- ⁇ to inhibit the differentiation and proliferation of myofibroblasts, the cause of fibrosis, thereby inhibiting tissue fibrosis, and even after fibrosis has already progressed considerably. It can be usefully used for the prevention or treatment of fibrosis, an incurable disease, by promoting the death of myofibroblasts to promote the breakdown of fibers and return to normal tissues.
  • FIG. 1 is a human lung fibroblast CCD8-Lu cells according to TGF- ⁇ and nintedanib, mesenchymal stem cell-derived mitochondria and HEK293 cell-derived mitochondria treated with ⁇ -SMA gene (Fig. 1a), CTGF gene (Fig. 1b), The difference in expression levels of the fibronectin gene (Fig. 1c) and the NOX4 gene (Fig. 1d) is compared using quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR).
  • Figure 2 shows human lung fibroblast Wi-38 cells treated with TGF- ⁇ and nintedanib, mesenchymal stem cell-derived mitochondria and HEK293 cell-derived mitochondria (A) ⁇ -SMA gene, (B) CTGF gene and (C ) This is the result of comparing the difference in the expression level of the fibronectin gene using a quantitative polymerase chain reaction.
  • Figure 3 is human lung fibroblast CCD8-Lu cells TGF- ⁇ and / or nintedanib, mesenchymal stem cell-derived mitochondria, L6 cell-derived mitochondria, HEK293 cell-derived mitochondria, C2C12 cell-derived mitochondria, dedifferentiated stem cell-derived mitochondria Alternatively, after treating mitochondria derived from human lung fibroblasts, CCD8-Lu cells, the expression level of collagen 1A was compared using Western blotting.
  • Figure 4 is human human lung fibroblasts, CCD8-Lu cells, TGF- ⁇ and/or umbilical cord blood mesenchymal stem cell-derived mitochondria, bone marrow mesenchymal stem cell-derived mitochondria, dedifferentiated stem cell-derived mitochondria, HEK293 cell-derived mitochondria, nintedanib
  • the expression levels of collagen 1A and alpha smooth muscle actin protein were compared using western blotting.
  • fibroblast CCD8-Lu cell derived from TGF- ⁇ and/or umbilical cord blood mesenchymal stem cell, bone marrow mesenchymal stem cell-derived mitochondria, dedifferentiated stem cell-derived mitochondria, HEK293 cell-derived mitochondria, nintedanib or After pirfenidone treatment, the expression levels of collagen 1A and fibronectin protein were compared using an immunocytochemical analysis method.
  • Figure 6a is human lung fibroblast CCD8-Lu cells TGF- ⁇ and / or nintedanib, mesenchymal stem cell-derived mitochondria, or HEK293 cell-derived mitochondria treated with CTGF expression level difference using Western blotting compared. It is the result.
  • Figure 6b compares the difference in CTGF expression level by treating Wi-38 cells, which are human lung fibroblasts, with TGF- ⁇ and/or nintedanib, mesenchymal stem cell-derived mitochondria, or HEK293 cell-derived mitochondria using western blotting. It is the result.
  • Figure 7 is human lung fibroblast CCD8-Lu cells after treatment with TGF- ⁇ and/or nintedanib, HEK293-derived mitochondria, mesenchymal stem cell-derived mitochondria by concentration, and dedifferentiated stem cell-derived mitochondria for each concentration, fibronectin, collagen
  • the expression levels of 1A and alpha smooth muscle actin were compared using western blotting.
  • 8A, 8B and 8C are results of comparing the differences in the expression levels of alpha smooth muscle actin, NOX4 and CTGF genes according to the concentration treatment of mesenchymal stem cell-derived mitochondria, respectively, using quantitative polymerase chain reaction.
  • One aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating fibrosis comprising mitochondria as an active ingredient.
  • fibrosis is a disease in which abnormal production, accumulation and deposition of extracellular matrix by fibroblasts occurs, and is caused by fibrosis of an organ or tissue. Fibrosis is a very fatal disease that causes organ damage. Also, used interchangeably with “fibrotic condition”, “fibroproliferative condition”, “fibrotic disease”, “fibroproliferative disease”, “fibrotic disorder” and “fibroproliferative disorder”, dysregulated proliferation or activity of fibroblasts , a condition, disease or disorder characterized by an abnormal accumulation of fibronectin and/or a pathological or excessive accumulation of collagenous tissue.
  • the fibrosis may occur in any one or more selected from the group consisting of kidney, liver, lung, skin, heart, pancreas, urinary system, reproductive system, sweat gland, nerve, brain, bone marrow, muscle and joint.
  • the fibrosis is lung fibrosis (Pulmonary Fibrosis), idiopathic pulmonary fibrosis (Idiopathic Pulmonary Fibrosis), radiation-induced lung injury (Radiation-induced lung injury) or lung fibrosis, pulmonary edema, cystic fibrosis (Cystic Fibrosis) , Liver Fibrosis, Endocardial Fibrosis, Myocardial Infarction, Atrial Fibrosis, Glial scar, Renal Fibrosis, Myelofibrosis, Joint fibrosis ( Arthrofibrosis), fatty fibrosis, skin fibrosis, may be any one selected from the group consisting of nerve fibrosis and muscle fibrosis.
  • pulmonary fibrosis refers to the development of scarred (fibrous) tissue due to the formation or development of excessive fibrous connective tissue in the lung (fibrosis).
  • pulmonary fibrosis is a chronic disease that causes swelling and scarring of the alveoli and interstitial tissues of the lungs.
  • Such scar tissue replaces healthy tissue and causes inflammation, and chronic inflammation can be identified as a precursor to fibrosis. Due to such damage to the lung tissue, the lungs may become stiff, and it may become difficult for the individual to breathe on their own.
  • Pulmonary fibrosis in the present specification is idiopathic pulmonary fibrosis (Idiopathic Pulmonary Fibrosis), lung injury caused by radiation (Radiation-induced lung injury), nonspecific interstitial pneumonia (Nonspecific Interstitial Pneumonia), acute interstitial pneumonia (Acute Interstitial Pneumonia), Idiopathic Organizing Pneumonia, Respiratory Bronchiolitis associated Interstitial Lung, Desquamative Interstitial Pneumonia, Lymphoid Interstitial Pneumonia, Interstitial Pneumonia fibrosis and diffuse pulmonary fibrosis, pulmonary edema, cystic fibrosis or pulmonary fibrosis due to a metabolic disease.
  • renal fibrosis includes all diseases in which fibrosis occurs in the kidney due to various causes, and fibrosis includes catheter installation, glomerulosclerosis, glomerulonephritis, nephritis, acute renal failure, chronic renal failure, end-stage renal disease. renal fibrosis due to disease or metabolic disease.
  • liver fibrosis refers to a symptom in which fibrous tissue proliferates due to chronic liver damage.
  • the liver fibrosis is chronic liver disease, hepatitis B virus infection, hepatitis C virus infection, hepatitis D virus infection, schistosomiasis, alcoholic liver disease or non-alcoholic steatohepatitis, metabolic disease, protein deficiency, coronary artery. disease, autoimmune hepatitis, cystic fibrosis, alpha-1 antitrypsin deficiency, primary biliary cirrhosis, drug reaction and toxins.
  • active ingredient refers to a component that exhibits activity alone or together with an adjuvant (carrier) that has no activity by itself.
  • mitochondria is a cell organelle of eukaryotic cells involved in the synthesis and regulation of adenosine triphosphate (ATP), an intracellular energy source, and is involved in various metabolic pathways in vivo.
  • ATP adenosine triphosphate
  • the mitochondria may be obtained from eukaryotes, and may be obtained from mammals or humans. Specifically, the mitochondria may be isolated from cells or tissues. For example, the mitochondria may be isolated from cells cultured in vitro. In addition, the mitochondria may be obtained from somatic cells, germ cells, blood cells or stem cells. In addition, the mitochondria may be obtained from platelets. The mitochondria may be normal mitochondria obtained from cells having normal mitochondrial biological activity. In addition, the mitochondria may be cultured in vitro. In addition, the mitochondria may be isolated after disruption from a tissue or cell sample thawed after concentrating and disrupting the tissue or cells for use or frozen storage.
  • the mitochondria may be obtained from autologous, allogeneic or xenogenic.
  • autologous mitochondria refer to mitochondria obtained from tissues or cells of the same individual.
  • homologous mitochondria refer to mitochondria obtained from individuals belonging to the same species as the individual and having different genotypes for alleles.
  • heterologous mitochondria refer to mitochondria obtained from individuals belonging to a species different from the individual.
  • the somatic cells may be muscle cells, hepatocytes, nerve cells, fibroblasts, epithelial cells, adipocytes, osteocytes, leukocytes, lymphocytes, platelets, or mucosal cells.
  • the germ cells are cells that undergo meiosis and mitosis, and may be sperm or egg cells.
  • the stem cells may be any one selected from the group consisting of mesenchymal stem cells, adult stem cells, dedifferentiated stem cells, embryonic stem cells, bone marrow stem cells, neural stem cells, limbal stem cells, and tissue-derived stem cells. .
  • the mesenchymal stem cells may be any one selected from the group consisting of umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerve, skin, amniotic membrane and placenta.
  • the mitochondria may be obtained from umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells.
  • the mitochondrial separation may be obtained by disrupting cells and centrifuging in terms of maintaining mitochondrial activity.
  • the isolated mitochondria can quantify the mitochondria by quantifying the protein.
  • the isolated mitochondria can be quantified through BCA (Bicinchoninic acid Assay) analysis.
  • the mitochondria in the pharmaceutical composition may be included at a concentration of 0.1 ⁇ g/ml to 1,000 ⁇ g/ml, 1 ⁇ g/ml to 750 ⁇ g/ml, or 25 ⁇ g/ml to 500 ⁇ g/ml. In an embodiment of the present invention, concentrations of 25 ⁇ g/ml, 50 ⁇ g/ml and 100 ⁇ g/ml were used.
  • the number of the isolated mitochondria can be measured through a particle counter (Multisizer 4e, Beckman Coulter). Referring to the paper written by James D. McCully (J Vis Exp. 2014; (91): 51682.) The number of mitochondria may be as shown in Table 1 below.
  • Amount of isolated mitochondria ( ⁇ g) number of mitochondria Concentration ( ⁇ g/ml) 0.01 2.16 ⁇ 10 5 ⁇ 0.01 ⁇ 10 5 0.1
  • the active ingredient may be included in any amount (effective amount) depending on the use, formulation, purpose of mixing, etc. as long as it can exhibit a preventive or therapeutic effect on fibrosis.
  • the term "effective amount” refers to an amount of an active ingredient capable of inducing a fibrosis preventive or therapeutic effect. Such an effective amount can be determined empirically within the ordinary ability of one of ordinary skill in the art.
  • the mitochondria in the pharmaceutical composition may be included in an amount of 1 ⁇ 10 5 number of mitochondria/ml to 5 ⁇ 10 9 number of mitochondria/ml.
  • the mitochondria in the pharmaceutical composition are 1 ⁇ 10 5 mitochondrial number/ml to 5 ⁇ 10 9 mitochondrial number/ml, 2 ⁇ 10 5 mitochondrial number/ml to 2 ⁇ 10 9 mitochondrial number/ml, 5 ⁇ 10 5 mitochondrial number/ml to 1 ⁇ 10 9 mitochondrial number/ml , 1 ⁇ 10 6 number of mitochondria / ml to 5 ⁇ 10 8 number of mitochondria / ml, 2 ⁇ 10 6 number of mitochondria / ml to 2 ⁇ 10 8 number of mitochondria / ml, 5 ⁇ 10 6 number of mitochondria / ml to 1 ⁇ 10 8 number of mitochondria / ml or 1 ⁇ 10 7 number of mitochondria / ml 5 ⁇ 10 7 It may be included in a content of the number of mitochondria/ml. Since the pharmaceutical composition contains mitochondria at a concentration and content within the above range, it is easy to adjust the mitochondrial dose during administration, and the degree
  • prevention refers to any action that suppresses or delays the onset of fibrosis by administration of the pharmaceutical composition.
  • treatment refers to any action in which fibrosis is ameliorated or beneficially altered by administration of the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered to a subject in a pharmaceutically effective amount.
  • the term "therapeutically effective amount” or “pharmaceutically effective amount” refers to an amount of a compound or composition effective for preventing or treating a target disease, which is sufficient to treat the disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment. and in an amount that does not cause side effects.
  • the level of the effective amount may be determined by the patient's health condition, the type of disease, the severity, drug activity, sensitivity to the drug, administration method, administration time, administration route and excretion rate, treatment period, combination or factors including drugs used concurrently and It may be determined according to factors well known in the medical field.
  • a therapeutically effective amount refers to an amount of a drug effective to treat fibrosis.
  • the preferred dosage of the pharmaceutical composition varies depending on the condition and weight of the patient, the degree of disease, the drug form, the route and duration of administration, but may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the term "administration" means introducing a predetermined substance to an individual by an appropriate method, and the administration route of the composition may be administered through any general route as long as it can reach a target tissue.
  • Intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, topical administration, intranasal administration may be administered intrarectally. It can also be injected intranasally through breathing.
  • a preferred dosage of mitochondria included in the pharmaceutical composition may be 3 ⁇ 10 5 mitochondria/kg to 1.5 ⁇ 10 10 mitochondria numbers/kg at a time based on the body weight of the subject to be administered.
  • the therapeutically effective dose of mitochondria in the pharmaceutical composition is 3 ⁇ 10 5 mitochondria number/kg to 1.5 ⁇ 10 10 mitochondria number/kg, 6 ⁇ 10 5 mitochondrion number/kg to 6 ⁇ 10 9 mitochondria number at one time based on the body weight of the subject to be administered /kg, 1.5 ⁇ 10 6 number of mitochondria/kg to 3 ⁇ 10 9 number of mitochondria/kg, 3 ⁇ 10 6 number of mitochondria/kg to 1.5 ⁇ 10 9 number of mitochondria/kg, 6 ⁇ 10 6 number of mitochondria/kg to 6 ⁇ 10 8 number of mitochondria/kg, 1.5 ⁇ 10 7
  • the pharmaceutical composition may be administered 1 to 10 times, 3 to 8 times, or 5 to 6 times, preferably 5 times.
  • the administration interval may be 1 to 7 days or 2 to 5 days intervals, and preferably may be administered at intervals of 3 days.
  • the term "individual” refers to a subject to which the pharmaceutical composition of the present invention can be applied (prescribed), and may be an individual who may develop fibrosis or suffer from fibrosis.
  • the subject may be a mammal, such as a mouse, a mouse, or a livestock, including a human, but preferably a human.
  • the composition of the present invention may further include any compound or natural extract known to have a fibrosis improvement effect and safety has already been verified to enhance and reinforce the fibrosis improvement effect.
  • the pharmaceutical composition and the compound or natural extract having an effect of improving fibrosis may be administered simultaneously or sequentially.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may be any non-toxic material suitable for delivery to a patient. Distilled water, alcohol, fats, waxes and inert solids may be included as carriers. Pharmaceutically acceptable adjuvants (buffers, dispersants) may also be included in the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition may be prepared as a parenteral formulation according to the route of administration by a conventional method known in the art, including a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient.
  • pharmaceutically acceptable means that it does not inhibit the activity of the active ingredient and does not have toxicity beyond what the application (prescription) target can adapt.
  • the pharmaceutical composition of the present invention When the pharmaceutical composition of the present invention is prepared for parenteral use, it may be formulated in the form of injections, transdermal administrations and nasal inhalants together with suitable carriers according to methods known in the art.
  • suitable carriers preferably Ringer's solution, PBS (Phosphate Buffered Saline) containing triethanolamine, or sterile for injection Water, an isotonic solution such as 5% dextrose, etc. may be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be an injectable formulation that can be administered intravenously, intramuscularly, subcutaneously or mucosally. Therefore, the pharmaceutical composition according to the present invention is a physically and chemically very stable injection by adjusting the pH using a buffer solution such as an aqueous acid solution or phosphate that can be used for injection in order to secure product stability according to the distribution of the injection prescription. can be manufactured.
  • a buffer solution such as an aqueous acid solution or phosphate that can be used for injection in order to secure product stability according to the distribution of the injection prescription. can be manufactured.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include water for injection.
  • the water for injection means distilled water made to dissolve the solid injection or to dilute the water-soluble injection.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a stabilizer or a solubilizing agent.
  • the stabilizing agent may be pyrosulfite, citric acid or ethylenediaminetetra acetic acid
  • the solubilizing agent may be hydrochloric acid, acetic acid, sodium hydroxide, sodium hydrogen carbonate, sodium carbonate or hydroxide. It may be potassium.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be a liquid composition for injection comprising glycine, saccharides, a buffer and mitochondria.
  • the saccharides included in the liquid composition for injection of the present invention are not limited thereto, but include sucrose, trehalose, mannitol, sorbitol, glucose, fructose, mannose, maltose, lactose, isomaltose, dextran and dextrin. It may be one or more selected from the group consisting of.
  • the saccharide may be trehalose, mannitol or sucrose oil.
  • the saccharide may be trehalose.
  • the buffer included in the liquid composition for injection of the present invention is not limited thereto, but Tris buffer, HEPES (Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonic acid) buffer, MOPS (3- (N-morpholino) propane sulfonic acid) buffer And it may be one selected from the group consisting of acetate or phosphate-containing buffer.
  • the buffer may be a Tris buffer.
  • the present invention provides a method for preventing or treating fibrosis comprising administering to a subject the above-described pharmaceutical composition.
  • the subject may be afflicted with fibrosis, or may be a mammal suffering from fibrosis, preferably a human. Matters for mitochondria, fibrosis, prevention and treatment are as described above.
  • the administration may be intravenous (intra-venous), intramuscular (intra-muscular) or intra-dermal (intra-dermal) administration.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can supply exogenous mitochondria with normal activity to the veins of individuals suffering from fibrosis, so it is useful for increasing the activity of cells with reduced mitochondrial function or for regenerating cells with mitochondrial dysfunction, It can be used for the prevention or treatment of fibrosis.
  • HEK293, L6 and C2C12 cells were cultured in DMEM medium containing 10% FBS.
  • UC-MSC a mesenchymal stem cell derived from umbilical cord blood
  • BM-MSC a bone marrow-derived mesenchymal stem cell
  • IPSC cells which are dedifferentiated stem cells, were cultured in TeSR-E8 medium using a plate coated with 10 ⁇ g/ml of vitronectin.
  • composition containing the pellets was subjected to a second centrifugation at a temperature of 4° C. at a speed of 1,100 ⁇ g for 3 minutes to obtain a supernatant.
  • the supernatant was subjected to a third centrifugation at a speed of 12,000xg at a temperature of 4°C for 15 minutes to separate mitochondria from the cell line.
  • the isolated mitochondria were suspended in a buffer and used for the experiment after protein quantification by the BCA method.
  • Human lung fibroblasts CCD8-Lu cells and Wi-38 cells, were each cultured in DMEM medium containing 10% FBS. About 2X10 5 cells/well of cells were inoculated in a 6-well plate and cultured for 24 hours, followed by a deficiency condition in DMEM medium from which FBS was removed for about 24 hours. After 24 hours, TGF- ⁇ was treated at a concentration of 2.5 ng/ml and then fibrosis of the cells was induced for 6 hours. After 6 hours, the remaining TGF- ⁇ was completely removed by washing twice with PBS.
  • the mitochondria isolated from HEK293, UC-MSC and BM-MSC cells in Preparation Example 1 were mixed with DMEM medium and treated, and then further cultured for 18 hours ( FIG. 1 ).
  • the negative control was not treated with anything
  • the positive control was treated with TGF- ⁇ at a concentration of 5 ng/ml alone
  • the experimental group was treated with 10 ⁇ g of mitochondria isolated from each cell, respectively.
  • the anti-fibrosis efficacy by mitochondria was compared by treating nintedanib, which is used as a conventional anti-fibrosis treatment, at a concentration of 1 ⁇ M.
  • RNA extract Trizol reagent, Thermo Fisher Scientific
  • 0.1 ml of chloroform was added and stirred for 15 seconds, followed by centrifugation at about 12,000xg for 10 minutes.
  • the separated supernatant was obtained, and the same volume of isopropyl alcohol was added, followed by centrifugation at 12,000xg for 10 minutes.
  • the liquid was removed, washed once with 75% ethanol, and then dried at room temperature. After drying, about 50 ⁇ l of RNAase-free purified distilled water was added, and the quantification and purity of the obtained RNA were measured using a spectrophotometer.
  • RNAse inhibitor and M- MLV reverse transcriptase (Enzynomics, Korea) was added, and cDNA synthesis was performed at 42° C. for 60 minutes. After the cDNA synthesis reaction was completed, reverse transcriptase was inactivated by heating at 72° C. for 5 minutes, and then single-stranded RNA was removed by adding RNase H to obtain final cDNA.
  • Quantitative real-time polymerization chain analysis of changes in the expression of the alpha-actin smooth muscle ( ⁇ -SMA) gene, a characteristic gene of myofibroblasts, the CCN2 (or CTGF) gene, a fibrosis characteristic gene, fibronectin, a fibrosis characteristic gene, and NOX-4 gene, a fibrosis characteristic gene The reaction was observed. The difference in expression was corrected by quantifying the GAPDH gene together.
  • the nucleotide sequences of the genes used in the quantitative real-time polymerization chain reaction are as described in the table below.
  • alpha-actin smooth muscle cells were treated with TGF- ⁇ in CCD8-Lu cells ( FIGS. 1A to 1D ) and Wi-38 cells ( FIG. 2 ), which are human lung-derived fibroblasts.
  • ⁇ -SMA TGF- ⁇ -induced ⁇ -actin smooth muscle
  • ⁇ -SMA TGF- ⁇ -induced ⁇ -actin smooth muscle
  • HEK293 cell-derived mitochondria did not suppress the TGF- ⁇ -induced expression of alpha-actin smooth muscle ( ⁇ -SMA), CTGF, fibronectin and NOX-4 genes.
  • ⁇ -SMA alpha-actin smooth muscle
  • CTGF fibronectin
  • NOX-4 fibronectin
  • the nintedanib compound used as an antifibrotic agent it was confirmed that the TGF- ⁇ -induced expression of ⁇ -actin smooth muscle ( ⁇ -SMA), CTGF and NOX-4 genes was weakly or hardly inhibited.
  • mesenchymal stem cell-derived mitochondria exhibit remarkably excellent anti-fibrotic activity under the same conditions compared to nintedanib compound, which is known as a conventional treatment for lung fibrosis, and also has superior anti-fibrosis compared to HEK293 cell-derived mitochondria. It was confirmed that the activity was shown.
  • a cell-based assay was performed using a Western assay.
  • Human lung fibroblasts CCD8-Lu cells, were cultured in DMEM medium containing 10% FBS. About 2X10 5 cells/well of cells were inoculated into a 6-well plate and cultured for 24 hours, followed by depletion conditions in DMEM medium from which FBS was removed for about 24 hours. After 24 hours, TGF- ⁇ was treated at a concentration of 2.5 ng/ml and then fibrosis of the cells was induced for 6 hours. After 6 hours, it was washed twice with PBS to completely remove TGF- ⁇ .
  • the mitochondria isolated from the UC-MSC, L6, HEK293, C2C12, iPSC and CCD8-Lu cells obtained in Preparation Example 1 were mixed in DMEM medium and treated and then further cultured for 18 hours (FIG. 3).
  • the negative control group was not treated with anything
  • the positive control group was treated with TGF- ⁇ at a concentration of 2.5 ng/ml alone
  • the experimental group was treated with 5 ⁇ g of mitochondria isolated from each cell.
  • the culture medium was removed and the cells were washed twice by adding PBS buffer solution, and 100 ⁇ l of RIPA (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5 % Deoxycholic acid, 0.1% SDS, 50 mM Tris pH 7.5) buffer solution was added directly. After 10 minutes, cells were recovered using a scraper, transferred to a microtube, and centrifuged at about 12,000xg for 10 minutes.
  • RIPA 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5 % Deoxycholic acid, 0.1% SDS, 50 mM Tris pH 7.5
  • the separated supernatant was obtained and transferred to a new microtube, and then the protein was quantified using the BCA assay. Each sample was electrophoresed with the same amount of protein, and then Western blotting was performed.
  • Primary antibodies include anti-collagen 1A antibody (Invitrogen, PA5-29569), anti-fibronectin antibody (Santa Cruz Biotechnology, sc-8422), anti-smooth muscle actin antibody (Sigma, A5228), anti-CTGF antibody (Santa Cruz) Biotechnology, sc-365970) was used, and as a secondary antibody, an anti-mouse IgG HRP antibody or an anti-rabbit IgG HRP antibody was used. For correction, the difference in protein expression was corrected using an anti- ⁇ actin antibody (Sigma, A2228) antibody.
  • a cell-based assay was performed using a Western assay.
  • CCD8-Lu cells which are human lung-derived fibroblasts, were cultured in DMEM medium containing 10% FBS. About 2X10 5 cells/well of cells were inoculated in a 6-well plate and cultured for 24 hours, followed by a deficiency condition in DMEM medium from which FBS was removed for about 24 hours. After 24 hours, TGF- ⁇ was treated at a concentration of 2.5 ng/ml to induce fibrosis of the cells for 6 hours. After 6 hours, it was washed twice with PBS to completely remove TGF- ⁇ .
  • the mitochondria isolated from the umbilical cord blood mesenchymal stem cells obtained in Preparation Example 1 were mixed in DMEM medium and treated. Further incubation for 18 hours (Fig. 4). At this time, the negative control was not treated with anything, the positive control was treated with TGF- ⁇ at a concentration of 2.5 ng/ml alone, and the experimental group was treated with 5 ⁇ g of mitochondria isolated from each cell, respectively.
  • the culture medium was removed and the cells were washed twice by adding PBS buffer solution, and 100 ⁇ l of RIPA (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5 % Deoxycholic acid, 0.1% SDS, 50 mM Tris pH 7.5) buffer solution was added directly. After 10 minutes, cells were recovered using a scraper, transferred to a microtube, and centrifuged at about 12,000xg for 10 minutes. The separated supernatant was obtained and transferred to a new microtube, and then the protein was quantified using the BCA assay. Each sample was electrophoresed with the same amount of protein, and then Western blotting was performed.
  • RIPA 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5 % Deoxycholic acid, 0.1% SDS, 50 mM Tris pH 7.5
  • An anti-collagen 1A antibody or an anti-alpha smooth muscle actin antibody was used as the primary antibody, and an anti-mouse IgG HRP antibody or anti-rabbit IgG HRP antibody was used as the secondary antibody.
  • an anti- ⁇ actin antibody was used to correct for differences in protein expression.
  • stem cell-derived mitochondria including mesenchymal stem cells and dedifferentiated stem cells exhibited superior or similar anti-fibrotic activity compared to nintedanib and pirfenidone, which are known as conventional lung fibrosis treatment agents.
  • a cell-based assay was performed using a Western assay.
  • Human lung fibroblasts CCD8-Lu cells, were cultured in DMEM medium containing 10% FBS. Then, about 2X10 4 cells/well of cells were inoculated in a 24-well plate and cultured for 24 hours, followed by reaction in DMEM medium from which FBS was removed for about 24 hours. After 24 hours, TGF- ⁇ was treated at a concentration of 2.5 ng/ml to induce fibrosis of the cells for 6 hours. After 6 hours, it was washed twice with PBS to completely remove TGF- ⁇ .
  • the mitochondria isolated from the umbilical cord blood mesenchymal stem cells obtained in Preparation Example 1 were mixed in DMEM medium and treated. Further incubation for 18 hours (Fig. 4). At this time, the negative control group was not treated with anything, the positive control group was treated with TGF- ⁇ at a concentration of 2.5 ng/ml alone, and the experimental group was treated with 5 ⁇ g of mitochondria isolated from each cell.
  • Immunohistoanalysis for each sample was performed as follows. First, after washing twice with PBS buffer, 4% formaldehyde was added and fixed for 1 hour. The primary antibody was anti-collagen 1A antibody and anti-fibronectin antibody, and the secondary antibody was Alexa Fluor 488 or Alexa Fluor. Anti-mouse antibody or anti-rabbit antibody labeled 568 was used. Nuclei were stained using DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole), and analysis was performed by the difference in fluorescence intensity using a fluorescence microscope.
  • DAPI 4,6-diamidino-2-phenylindole
  • stem cell-derived mitochondria including mesenchymal stem cells and dedifferentiated stem cells, exhibit similar or significantly superior anti-fibrotic activity compared to nintedanib and pirfenidone, which are known as conventional lung fibrosis treatment agents.
  • CTGF vascular endothelial growth factor
  • TGF- ⁇ was treated at a concentration of 2.5 ng/ml and then fibrosis of the cells was induced for 6 hours. After 6 hours, it was washed twice with PBS to completely remove TGF- ⁇ .
  • the mitochondria isolated from UC-MSC and HEK293 cells in the same manner as in Preparation Example 1 were mixed in DMEM medium and treated, and then further cultured for 18 hours ( FIG. 3 ).
  • the negative control group was not treated with anything
  • the positive control group was treated with TGF- ⁇ at a concentration of 2.5 ng/ml alone
  • the experimental group was treated with 5 ⁇ g of mitochondria isolated from each cell.
  • the culture medium was removed and the cells were washed twice by adding PBS buffer solution, and 100 ⁇ l of RIPA (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5 % Deoxycholic acid, 0.1% SDS, 50 mM Tris pH 7.5) buffer solution was added directly. After 10 minutes, cells were recovered using a scraper, transferred to a microtube, and centrifuged at about 12,000xg for 10 minutes.
  • RIPA 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5 % Deoxycholic acid, 0.1% SDS, 50 mM Tris pH 7.5
  • the separated supernatant was obtained and transferred to a new microtube, and then the protein was quantified using the BCA assay. Each sample was electrophoresed with the same amount of protein, and then Western blotting was performed. An anti-CTGF antibody was used as the primary antibody, and an anti-rabbit IgG HRP antibody was used as the secondary antibody. For correction, an anti- ⁇ actin antibody was used to correct for differences in protein expression.
  • a cell-based assay was conducted using a Western assay.
  • CCD8-Lu cells which are human lung-derived fibroblasts, were cultured in DMEM medium containing 10% FBS. About 2X10 5 cells/well of cells were inoculated in a 6-well plate and cultured for 24 hours, followed by a deficiency condition in DMEM medium from which FBS was removed for about 24 hours. After 24 hours, TGF- ⁇ was treated at a concentration of 2.5 ng/ml and then fibrosis of the cells was induced for 6 hours. After 6 hours, it was washed twice with PBS to completely remove TGF- ⁇ .
  • UC-MSC which are umbilical cord blood mesenchymal stem cells
  • iPSC which are dedifferentiated stem cells, obtained in Preparation Example 1, respectively
  • DMEM medium After treatment, it was further cultured for 18 hours (FIG. 7).
  • the negative control was not treated with anything, and the positive control was treated with TGF- ⁇ at a concentration of 2.5 ng/ml alone.
  • TGF- ⁇ As a control group, 1 ⁇ M of nintedanib and mitochondria derived from HEK293 cells were treated.
  • the culture medium was removed and the cells were washed twice by adding PBS buffer solution, and 100 ⁇ l of RIPA (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5 % deoxycholic acid, 0.1% SDS, 50 mM Tris pH 7.5) buffer solution was added directly. After 10 minutes, cells were collected using a scraper, transferred to a microtube, and centrifuged at about 12,000xg for 10 minutes.
  • RIPA 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5 % deoxycholic acid, 0.1% SDS, 50 mM Tris pH 7.5
  • the separated supernatant was obtained and transferred to a new microtube, and then the protein was quantified using the BCA assay. Each sample was electrophoresed with the same amount of protein, and then Western blotting was performed.
  • an anti-fibronectin antibody, an anti-collagen 1A antibody, or an anti-alpha smooth muscle actin antibody was used, and an anti-mouse IgG HRP antibody or an anti-rabbit IgG HRP antibody was used as the secondary antibody.
  • an anti- ⁇ actin antibody was used to correct for differences in protein expression.

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Abstract

본 발명은 섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이며, 보다 상세하게는 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 외래 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 폐섬유증, 간섬유증 및 신장섬유증과 같은 섬유증을 앓고 있는 개체에 투여할 경우, 조직의 섬유화를 억제할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 TGF-β 처리시 피브로넥틴, CTGF2, α-SMA, 콜라겐 1A 등의 발현을 효과적으로 억제시킨다. 따라서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 섬유증의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

분리된 미토콘드리아를 포함하는 섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물
본 발명은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
서구 사회의 사망 원인의 약 45%에 해당하는 섬유증은 임상적으로 질병이 상당히 진행된 후에 진단이 가능하기 때문에, 예방적 치료의 한계가 있다. 뿐만 아니라, 현재까지 진행성 및 기 생성된 섬유증을 직접 해결하는 효과적인 치료 수단도 없는 심각한 질환 분야이다. 섬유증을 일으키는 직접적인 원인에는 조직 손상, 감염, 자가 면역 질환, 장기 이식 및 이물질 반응, 종양 등이 있다. 또한, 노화, 비만, 당뇨, 심혈관계 질환, 고혈압, 혈중 콜레스테롤 등도 중요한 원인으로 지목되고 있다. 이처럼 섬유증을 일으키는 원인과 발현되는 질환의 형태들도 매우 다양하지만, 각각의 조직 들에서 진행되는 섬유증의 진행 기전은 매우 복잡할 뿐 아니라, 다양한 경로가 복합적으로 작용되어 일어나는 것으로 알려지고 있다.
섬유증의 진행을 지배하는 원인 세포로는 비정상적으로 활성화된 섬유아세포인 근섬유아세포(myofibroblast)가 지목되고 있다. 근섬유아세포는 섬유성 1,3형 콜라겐 및 피브로넥틴으로 이루어진 세포외 기질(Extracellular Matrix, ECM)의 조직 내 축적 및 세포외 기질을 분해하는 효소 유전자들이 비활성화를 유발하는 특징이 있다(Dufferield JS, et al., Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis, 8:241-276 (2013)).
이러한 근섬유아세포의 분화와 활성화에는 손상된 상피, 내피, 골수 유래 섬유소 세포, 면역 세포 등에서 분비되는 TGF-β1(Transforming Growth Factor-beta 1), TNF-α(Tumor Necrosis Factor-alpha), IL-1(interleukin-1), IL-6, IL-13, PDGF(Platelet-Derived Growth Factor) 등의 성장 인자와 사이토카인 등이 관여하는 것으로 알려진다. 따라서, 섬유증을 악화시키는 상기 성장 인자와 사이토카인의 활성화 및 신호 전달을 차단하는 것이 섬유증을 치료하는 출발점이 될 수 있으며, 당업계에서는 섬유증 치료를 위해 TGF-β1, IL-13, CTGF(Connective-Tissue Growth Factor), PDGF, αvβ6 인테그린, 갈렉틴-3, LOXL2(Lysyl oxidase homolog 2), 트랜스글루타미네이즈-2, NOX4(NADPH oxidase 4) 또는 JNK(Jun N-terminal kinases) 억제제를 표적으로 하는 약물들이 개발 중이다.
현재, 섬유증의 일종인 특발성 폐섬유화 환자에게 투여되는 약물은 스테로이드 및 면역 억제제를 각각 단독 사용하거나, 스테로이드 및 면역 억제제를 병용으로 사용하고 있다. 그러나, 전체 환자 중에 약 10 내지 30%의 환자에서만 치료 효능을 나타내며, 중간 생존율이 3년 미만으로 효과적이지는 못하다. 뿐만 아니라, 부작용이 많아 사용 빈도가 점차 줄어들고 있는 추세이다.
한편, 피르페니돈(Pirfenidone)은 TGF-β의 프로모터 반응을 억제하는 약물로 2011년 가이드라인에서 조건부 사용 금지가 권고된 약물이었으나, 최근 조건부 사용가능 약물로 변경되었다. 상기 약물은 동물연구에서 근섬유아세포의 확산을 감소시킨 것으로 나타났다. 그러나, 후속으로 진행된 임상시험에서는 뚜렷한 효과는 없었고 오심, 구토, 소화불량 등의 부작용이 나타나고 있음이 보고되었다.
또한, 티로신 키나아제 억제제인 닌테다닙(Nintedanib)은 다양한 세포의 성장인자 수용체들을 억제하는 약물이다. 닌테다닙은 세포 수준에서 섬유화를 촉진하는 사이토카인의 작용을 억제하고, TGF-β에 의한 콜라겐 합성을 감소시키며, 섬유화 유도 동물 실험에서 폐섬유증을 완화시키는 것으로 알려져 있다. 임상 실험을 통해 광범위한 환자군에서 폐 기능의 감소를 지연시키는 효과를 보이고 있으나, 폐섬유화를 치료할 수는 없다고 알려져 있다. 이와 같이, 피르페니돈과 닌테다닙은 섬유증의 진행 자체를 멈추게 하는 약물로서 기능을 하지 못한다는 한계를 가지고 있는 실정이다.
이와 같이 섬유화를 치료하기 위한 연구가 진행된 바 있으나, 현재까지 진행 중인 섬유화 치료 약물은 병의 진행을 더디게 할 뿐 그 효과가 매우 제한적이고 부작용이 많이 발생하는 문제가 있는 등 아직은 획기적인 치료법이 개발되지 않은 실정이다. 안전하고 효과적인 섬유화 치료제에 대한 지속적인 연구개발이 필요한 상황이다.
한편, 미토콘드리아는 세포내 에너지 공급원인 아데노신 트라이포스페이트(ATP)의 합성 및 조절에 관여하는 진핵세포의 세포 소기관이다. 미토콘드리아는 생체내 다양한 대사 경로, 예를 들어, 세포 신호처리, 세포 분화, 세포 사멸뿐만 아니라 세포 주기 및 세포 성장의 제어와 연관이 있다. 특히, 미토콘드리아는 자신의 유전체를 보유하고 있으며, 세포내에서 에너지 대사에 중추적 역할을 하는 소기관이다. 미토콘드리아는 전자 전달 및 산화적 인산화 과정을 통해 세포 에너지를 생산하며 세포 사멸 신호 전달 경로에 관여하는 등 중요한 역할을 한다.
미토콘드리아의 기능 저하에 의한 에너지 생산 감소는 다양한 인간 질병을 유발하는 것으로 보고된 바 있다. 미토콘드리아 유전체 및 단백체의 변이에 따라 전자전달연쇄반응의 기능이 저하될 경우, ATP 생산의 감소, 과다한 활성산소의 생성, 세포내의 칼슘 조절 기능의 저하 등이 일어나게 된다. 이러한 경우 미토콘드리아의 막 투과성의 변화가 일어나 세포 사멸의 기능이 비이상적으로 일어나게 되고 이에 따른 암 및 난치성 질환의 원인을 제공하게 될 수 있다. 이와 같이 미토콘드리아 기능 이상에 의해 발생하는 인간 질병으로는 미토콘드리아 관련 유전병, 심장질환, 파킨슨병이나 알츠하이머병 등과 같은 노인성 치매, 및 각종 암의 발생과 암전이에도 미토콘드리아의 비이상적인 에너지 대사와 많은 관련이 있음이 보고된 바 있다.
본 발명자들은 항섬유화 활성을 나타내는 미토콘드리아를 분리하기 위하여 종이 다른 세포로부터 미토콘드리아를 분리하고, 미토콘드리아의 기능 및 항섬유화 활성을 비교 분석하였으며, 다양한 세포로부터 분리된 미토콘드리아는 근섬유아세포의 분화 및 증식을 유도하는 TGF-β의 활성을 억제함으로써, 진행형 또는 기 생성된 섬유증의 치료가 가능함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 섬유화를 치료하기 위한 약학 조성물 및 이를 이용한 섬유화를 치료하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 항섬유화 활성을 나타내는 미토콘드리아를 포함하는 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 섬유화의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 섬유화 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 TGF-β의 활성을 억제하여 섬유증의 원인인 근섬유아세포의 분화 및 증식을 억제하여 조직의 섬유화를 억제하고, 섬유증이 이미 발병하여 상당히 진행된 후에도 근섬유아세포의 사멸을 촉진하여 섬유질의 분해와 정상적인 조직으로의 회귀를 촉진함으로써 난치병인 섬유증의 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 인간 폐섬유아세포인 CCD8-Lu 세포에 TGF-β와 닌테다닙, 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아 및 HEK293 세포 유래 미토콘드리아 처리에 따른 α-SMA 유전자(도 1a), CTGF 유전자(도 1b), 피브로넥틴 유전자(도 1c) 및 NOX4 유전자(도 1d)의 발현량 차이를 정량적 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)을 이용하여 비교한 결과이다.
도 2는 인간 폐섬유아세포인 Wi-38 세포에 TGF-β와 닌테다닙, 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아 및 HEK293 세포 유래 미토콘드리아 처리에 따른 (A) α-SMA 유전자, (B) CTGF 유전자 및 (C) 피브로넥틴 유전자의 발현량 차이를 정량적 중합효소연쇄반응을 이용하여 비교한 결과이다.
도 3은 인간 폐섬유아세포인 CCD8-Lu 세포에 TGF-β 및/또는 닌테다닙, 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아, L6 세포 유래 미토콘드리아, HEK293 세포 유래 미토콘드리아, C2C12 세포 유래 미토콘드리아, 역분화줄기세포 유래 미토콘드리아 또는 인간 폐섬유아세포인 CCD8-Lu 세포 유래 미토콘드리아를 처리한 후, 콜라겐 1A 발현량을 웨스턴 블롯팅을 이용하여 비교한 결과이다.
도 4는 인간 인간 폐섬유아세포인 CCD8-Lu 세포에 TGF-β 및/또는 제대혈중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아, 골수중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아, 역분화줄기세포 유래 미토콘드리아, HEK293 세포 유래 미토콘드리아, 닌테다닙 또는 피르페니돈을 처리한 후, 콜라겐 1A와 알파평활근액틴 단백질의 발현량을 웨스턴 블롯팅을 이용하여 비교한 결과이다.
도 5는 인간 폐섬유아세포인 CCD8-Lu 세포에 TGF-β 및/또는 제대혈중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아, 골수중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아, 역분화줄기세포 유래 미토콘드리아, HEK293 세포 유래 미토콘드리아, 닌테다닙 또는 피르페니돈을 처리 후, 콜라겐 1A와 피브로넥틴 단백질의 발현량을 면역세포화학 분석 방법을 이용하여 비교한 결과이다.
도 6a는 인간 폐섬유아세포인 CCD8-Lu 세포에 TGF-β 및/또는 닌테다닙, 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아 또는 HEK293 세포 유래 미토콘드리아를 처리함에 따른 CTGF 발현량 차이를 웨스턴 블롯팅을 이용하여 비교한 결과이다.
도 6b는 인간 폐섬유아세포인 Wi-38 세포에 TGF-β 및/또는 닌테다닙, 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아 또는 HEK293 세포 유래 미토콘드리아를 처리함에 따른 CTGF 발현량 차이를 웨스턴 블롯팅을 이용하여 비교한 결과이다.
도 7은 인간 폐섬유아세포인 CCD8-Lu 세포에 TGF-β 및/또는 닌테다닙, HEK293 유래 미토콘드리아와 농도 별 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아, 농도 별 역분화줄기세포 유래 미토콘드리아를 처리 후, 피브로넥틴, 콜라겐 1A 및 알파평활근액틴의 발현량을 웨스턴 블롯팅을 이용하여 비교한 결과이다.
도 8a, 도 8b 및 도 8c는 각각 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아를 농도 처리함에 따른 알파평활근액틴, NOX4 및 CTGF 유전자의 발현량 차이를 정량적 중합효소연쇄반응을 이용하여 비교한 결과이다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명하도록 한다.
본 발명의 일 측면은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "섬유증"은 섬유아세포에 의한 세포 외 기질의 비정상적 생성, 축적 및 침착이 일어나는 질환으로, 기관 또는 조직의 섬유화에 의해 발병한다. 섬유증은 장기 손상을 유발하는 매우 치명적인 질환을 의미한다. 또한, "섬유증 병태", "섬유증식성 병태", "섬유증 질환", "섬유증식성질환", "섬유증 장애" 및 "섬유증식성 장애"와 호환적으로 사용되며, 섬유모세포의 조절장애적 증식 또는 활성, 피브로넥틴의 이상 축적 및/또는 콜라겐성 조직의 병적 혹은 과도한 축적을 특징으로 하는 병태, 질환 또는 장애를 지칭할 수 있다.
상기 섬유증은 신장, 간, 폐, 피부, 심장, 췌장, 비뇨기계, 생식기계, 땀샘, 신경, 뇌, 골수, 근육 및 관절로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에서 발생할 수 있다. 구체적으로, 상기 섬유증은 폐 섬유화증(Pulmonary Fibrosis), 특발성 폐 섬유화증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis), 방사선 조사에 의한 폐 손상(Radiation-induced lung injury) 또는 폐 섬유화, 폐부종, 낭포성 섬유증(Cystic Fibrosis), 간 섬유화, 심내막 심근섬유증(Endomyocardial Fibrosis), 심근경색(Myocardial Infarction), 심방 섬유화(Artrial Fibrosis), 신경교 반흔(Glial scar), 신장 섬유증(Renal Fibrosis), 골수 섬유증(Myelofibrosis), 관절 섬유증(Arthrofibrosis), 지방 섬유증, 피부 섬유증, 신경 섬유증 및 근 섬유증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어, "폐섬유증"은, 폐에서의 과도한 섬유성 연결 조직의 형성 또는 발달(섬유증)로 인해, 흉터가 생긴(섬유성) 조직의 발달을 의미한다. 구체적으로, 폐 섬유증은 폐포 및 폐의 간질성 조직의 팽윤 및 흉터를 유발하는 만성 질환이다. 이와 같은 흉터 조직이 건강한 조직을 대체하여 염증을 유발하며, 만성 염증은 섬유증의 전조로 파악될 수 있다. 이와 같은 폐 조직의 손상으로 인하여 폐가 뻣뻣하게 될 수 있고, 개체가 자가호흡이 어려워지게 될 수 있다.
본 명세서에서 폐섬유증은 특발성 폐섬유증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis), 방사선 조사에 의한 폐 손상(Radiation-induced lung injury), 비특이성 간질성 폐렴(Nonspecific Interstitial Pneumonia), 급성간질성 폐렴(Acute Interstitial Pneumonia), 특발성 기질화 폐렴(Cryptogenic Organizing Pneumonia), 호흡계기관지염 관련성 간질성 폐질환(Respiratory Bronchiolitis associated Interstitial Lung), 박리성 간질성 폐렴(Desquamative Interstitial Pneumonia), 임파구성 간질성 폐렴(Lymphoid Interstitial Pneumonia), 간질성 폐섬유증 및 미만성 폐섬유증, 폐부종, 낭포성 섬유증 또는 대사성 질환으로 인한 폐섬유증일 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어, "신장 섬유증"은 다양한 원인으로 신장에서 섬유화가 발생된 모든 질환을 포함하며, 섬유증은 카테터(catheter) 설치, 사구체 경화증, 사구체 신염, 신장염, 급성 신부전, 만성 신부전, 말기 신장 질환 또는 대사성 질환으로 인한 신장 섬유증일 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어, "간섬유증(liver fibrosis)"은 간의 만성 손상으로 섬유 조직이 증식하는 증상을 말한다. 구체적으로, 상기 간섬유증은 만성 간 질환, B형 간염 바이러스 감염, C형 간염 바이러스 감염, D형 간염 바이러스 감염, 주혈흡충증, 알코올성 간 질환 또는 비-알코올성 지방간염, 대사성 질환, 단백질 결핍증, 관상 동맥 질환, 자가 면역 간염, 낭포성 섬유증, 알파-1 항트립신 결핍증, 일차성 담즙성 간경화증, 약물 반응 및 독소로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로부터 유발될 수 있다.
본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한,　"유효성분"은　단독으로 활성을 나타내거나 또는 그 자체로는 활성이 없는 보조제(담체)와 함께 활성을 나타내는 성분을 지칭한다.
본 명세서에 사용한 용어, "미토콘드리아(mitochondria)"는 세포 내 에너지 공급원인 아데노신 트라이포스페이트(ATP)의 합성 및 조절에 관여하는 진핵세포의 세포 소기관으로, 생체 내 다양한 대사 경로에 관여하고 있다.
상기 미토콘드리아는 진핵생물(eukaryote)부터 수득된 것일 수 있으며, 포유동물 또는 인간으로부터 수득된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 미토콘드리아는 세포 또는 조직으로부터 분리된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 미토콘드리아는 체외 배양된 세포부터 분리된 것일 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아는 체세포, 생식세포, 혈액세포 또는 줄기세포로부터 수득된 것일 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아는 혈소판(platelet)에서 수득된 것일 수 있다. 상기 미토콘드리아는 미토콘드리아의 생물학적 활성이 정상인 세포로부터 수득된 정상적인 미토콘드리아일 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아는 체외에서 배양된 것일 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아는 조직 또는 세포를 농축하여 파쇄 후 분리하여 사용하거나 동결 보관한 후 해동한 조직 또는 세포 시료로부터 파쇄 후 분리된 것일 수 있다.
또한, 상기 미토콘드리아는 자가(autologous), 동종(allogenic) 또는 이종(xenogenic)으로부터 수득된 것일 수 있다. 구체적으로, 자가 미토콘드리아는 동일 개체의 조직 또는 세포로부터 수득된 미토콘드리아를 의미한다. 또한, 동종 미토콘드리아는 개체와 같은 종에 속하면서 대립유전자에 대해서는 다른 유전자형을 가지는 개체로부터 수득된 미토콘드리아를 의미한다. 또한, 이종 미토콘드리아는 개체와 다른 종에 속하는 개체로부터 수득된 미토콘드리아를 의미한다.
구체적으로, 상기 체세포는 근육세포, 간세포, 신경세포, 섬유아세포, 상피세포, 지방세포, 골세포, 백혈구, 림프구, 혈소판 또는 점막세포일 수 있다. 또한, 상기 생식세포는 감수분열과 체세포 분열을 하는 세포로서 정자 또는 난자일 수 있다. 또한, 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 골수줄기세포, 신경줄기세포, 윤부줄기세포 및 조직 유래 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 이때, 상기 중간엽줄기세포는 탯줄, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 바람직하게, 상기 미토콘드리아는 제대혈 유래 중간엽줄기세포에서 수득한 것일 수 있다.
한편, 상기 미토콘드리아를 특정 세포로부터 분리하는 경우에는, 예를 들어, 특정 버퍼 용액을 사용하거나 전위차 및 자기장을 이용하는 등 공지된 다양한 방법을 비롯하여 이를 변형한 다양한 방법을 통해 미토콘드리아를 분리할 수 있다.
상기 미토콘드리아 분리는 미토콘드리아 활성 유지 측면에서, 세포를 파쇄하고 원심분리하여 수득할 수 있다.
상기 분리된 미토콘드리아는 단백질을 정량함으로써, 미토콘드리아를 정량할 수 있다. 구체적으로, 상기 분리된 미토콘드리아를 BCA(Bicinchoninic acid Assay) 분석법을 통해 정량 할 수 있다. 이때, 상기 약학 조성물 내 미토콘드리아는 0.1 ㎍/㎖ 내지 1,000 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖ 내지 750 ㎍/㎖ 또는 25 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖ 농도로 사용하였다.
또한, 상기 분리된 미토콘드리아를 파티클 카운터(Multisizer 4e, Beckman Coulter)를 통해 개수를 측정할 수 있으며, James D. McCully가 저술한 논문(J Vis Exp. 2014; (91): 51682.)을 참고하면 미토콘드리아의 개수는 하기 표 1과 같을 수 있다.
분리한 미토콘드리아의 양 (㎍) 미토콘드리아 개수 농도 (㎍/㎖)
0.01 2.16Х105 ± 0.01Х105 0.1
1 2.16Х107 ± 0.08Х107 10
25 0.54Х109 ± 0.02Х109 250
50 1.08Х109 ± 0.04Х109 500
100 2.16Х109 ± 0.08Х109 1,000
본 발명의 섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물에서 그 유효성분은 섬유증에 대한 예방 또는 치료효과를 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있다. 여기서 "유효량"이란 섬유증 예방 또는 치료 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
상기 약학 조성물 내 미토콘드리아는 1Х105 미토콘드리아 개수/㎖ 내지 5Х109 미토콘드리아 개수/㎖의 함량으로 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물 내 미토콘드리아는 1Х105 미토콘드리아 개수/㎖ 내지 5Х109 미토콘드리아 개수/㎖, 2Х105 미토콘드리아 개수/㎖ 내지 2Х109 미토콘드리아 개수/㎖, 5Х105 미토콘드리아 개수/㎖ 내지 1Х109 미토콘드리아 개수/㎖, 1Х106 미토콘드리아 개수/㎖ 내지 5Х108 미토콘드리아 개수/㎖, 2Х106 미토콘드리아 개수/㎖ 내지 2Х108 미토콘드리아 개수/㎖, 5Х106 미토콘드리아 개수/㎖ 내지 1Х108 미토콘드리아 개수/㎖ 또는 1Х107 미토콘드리아 개수/㎖ 내지 5Х107 미토콘드리아 개수/㎖의 함량으로 포함될 수 있다. 상기 약학 조성물은 상기 범위의 농도 및 함량으로 미토콘드리아를 포함함으로써, 투여 시 미토콘드리아 용량 조절이 용이하고, 환자의 섬유증 병증 개선 정도가 보다 향상될 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어, "예방"은 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 섬유증의 발생을 억제하거나 그의 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다. 또한, "치료"는 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 섬유증이 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 개체에 투여한다. 상기 용어 "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약학적으로 유효한 양"이란 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 화합물 또는 조성물의 양으로서, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 유효량의 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일 구체예에서 치료학적으로 유효한 양은 섬유증을 치료하는데 효과적인 약물의 양을 의미한다. 상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어, "투여"는 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 비내 투여, 직장내 투여될 수 있다. 또한, 호흡을 통해 비강내에 주입될 수 있다.
상기 약학 조성물에 포함되는 미토콘드리아의 바람직한 투여량은, 투여할 개체의 체중을 기준으로 1회 3Х105 미토콘드리아 개수/㎏ 내지 1.5Х1010 미토콘드리아 개수/㎏일 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물 내 미토콘드리아의 치료 효과 용량은, 투여할 개체의 체중을 기준으로 1회 3Х105 미토콘드리아 개수/㎏ 내지 1.5Х1010 미토콘드리아 개수/㎏, 6Х105 미토콘드리아 개수/㎏ 내지 6Х109 미토콘드리아 개수/㎏, 1.5Х106 미토콘드리아 개수/㎏ 내지 3Х109 미토콘드리아 개수/㎏, 3Х106 미토콘드리아 개수/㎏ 내지 1.5Х109 미토콘드리아 개수/㎏, 6Х106 미토콘드리아 개수/㎏ 내지 6Х108 미토콘드리아 개수/㎏, 1.5Х107 미토콘드리아 개수/㎏ 내지 3Х108 미토콘드리아 개수/㎏ 또는 3Х107 미토콘드리아 개수/㎏ 내지 1.5Х108 미토콘드리아 개수/㎏일 수 있다. 즉, 상기 미토콘드리아를 포함하는 약학 조성물을 섬유증이 발병된 개체의 체중을 기준으로 상기 범위의 용량으로 미토콘드리아가 투여되는 것이 세포 활성 측면에서 가장 바람직하다.
또한, 상기 약학 조성물은 1회 내지 10회, 3회 내지 8회 또는 5회 내지 6회 투여할 수 있으며, 바람직하게는 5회 투여할 수 있다. 이때, 투여 간격은 1일 내지 7일 또는 2일 내지 5일 간격으로 할 수 있으며, 바람직하게는 3일 간격으로 투여할 수 있다.
상기 용어 "개체"란 본 발명의 약학 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상을 의미하며, 섬유증이 발생할 수 있거나, 섬유증을 앓고 있는 개체일 수 있다. 또한 상기 개체는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 포유동물일 수 있으나, 바람직하게는 인간일 수 있다. 본 발명의 조성물은 미토콘드리아 이외에, 섬유증 개선 효과를 상승 및 보강을 위하여 이미 안전성이 검증되고 섬유증 개선 효과를 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 약학 조성물 및 섬유증 개선 효과를 갖는 화합물 또는 천연 추출물은 동시 또는 순차적으로 투여할 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약물학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약학 조성물에 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.
본 발명의 약학 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(Phosphate Buffered Saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 정맥, 근육, 피하 또는 점막에 투여될 수 있는 주사용 제제일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 주사제 처방의 유통에 따른 제품 안정성을 확보하기 위하여, 주사제로 사용 가능한 산수용액 또는 인산염 등의 완충용액을 사용하여 pH를 조절함으로써, 물리적으로나 화학적으로 매우 안정한 주사제로 제조될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 약학 조성물은 주사용수를 포함할 수 있다. 상기 주사용수는 고형주사제의 용해나 수용성 주사제를 희석하기 위하여 만들어진 증류수를 의미한다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 안정화제 또는 용해보조제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 안정화제는 피로설파이트(pyrosulfite), 구연산(citric acid) 또는 에틸렌 디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetra acetic acid)일 수 있고, 용해보조제는 염산, 아세트산, 수산화나트륨, 탄산수소나트륨, 탄산나트륨 또는 수산화칼륨일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 일 실시예로, 글라이신, 당류, 버퍼(buffer) 및 미토콘드리아를 포함하는 주사용 액상 조성물일 수 있다. 이때, 본 발명의 주사용 액상 조성물 내 포함되는 상기 당류는 이에 제한되지는 않으나 수크로오스, 트레할로오스, 만니톨, 소르비톨, 글루코오스, 프락토오스, 만노오스, 말토오스, 락토오스, 이소말토오스, 덱스트란 및 덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다. 특히, 상기 당류는 트레할로오스, 만니톨 또는 수크로오일 수 있다. 바람직하게, 상기 당류는 트레할로오스일 수 있다. 이때, 본 발명의 주사용 액상 조성물 내 포함되는 상기 버퍼는 이에 제한되지는 않으나 트리스(Tris) 버퍼, HEPES(Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonic acid) 버퍼, MOPS(3-(N-morpholino)propane sulfonic acid) 버퍼 및 아세테이트 또는 포스페이트 함유 버퍼로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 바람직하게, 상기 버퍼는 트리스(Tris) 버퍼일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면으로, 본 발명은 전술한 약학 조성물을 개체의 투여하는 단계를 포함하는 섬유증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 여기서 개체는 섬유증을 앓을 수 있거나, 앓고 있는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다. 미토콘드리아, 섬유증, 예방 및 치료에 대한 사항은 상술한 바와 같다.
이때, 투여는 정맥 내(intra-venous), 근육 내(intra-muscular) 또는 피부 내(intra-dermal)에 투여되는 것일 수 있다. 이를 통해, 본 발명에 따른 약학 조성물은 섬유증을 앓고 있는 개체의 정맥에 정상적인 활성을 갖는 외래 미토콘드리아를 공급할 수 있어, 미토콘드리아 기능이 저하된 세포의 활성을 증가시키거나 미토콘드리아 기능 이상 세포 재생에 유용하며, 섬유증의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면으로, 섬유증 예방 또는 치료를 위한 분리된 미토콘드리아의 용도를 제공한다. 미토콘드리아, 섬유증, 예방 및 치료에 대한 사항은 상술한 바와 같다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 세포 배양 및 미토콘드리아 분리
HEK293, L6 및 C2C12 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에 배양하였다. 또한, 제대혈 유래 중간엽줄기세포인 UC-MSC와 골수 유래 중간엽줄기세포인 BM-MSC 세포를 10% FBS, 20 ng/㎖ bFGF를 포함하는 alpha MEM 배지에 배양하였다. 역분화줄기세포인 iPSC 세포를 10 ㎍/㎖의 비트로넥틴(vitronectin)이 코팅된 플레이트를 사용하고, TeSR-E8 배지에 배양하였다.
배양이 종료된 후, DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco)를 이용하여 2회 세척하였다. 세척된 세포는 0.25%(v/v) Trypsin-EDTA(TE, Gibco)를 처리하여 세포를 수득하였다. 수득한 세포는 미토콘드리아를 분리하기 위하여, 혈구계산기를 이용하여 1Ｘ107 cells/㎖ 농도의 세포를 회수하였다. 상기 세포주를 4℃온도에서 10분 동안 350xg의 속도로 제1차 원심분리를 수행하였다. 이때 얻어진 펠렛을 회수하여 버퍼 용액에 재현탁 시킨 후, 10분 내지 15분 동안 균질화시켰다. 그 후, 상기 펠렛을 포함하는 조성물을 4℃온도에서 3분 동안 1,100xg의 속도로 제2차 원심분리시켜 상청액을 수득하였다. 상기 상청액을 4℃온도에서 15분 동안 12,000xg의 속도로 제3차 원심분리시켜 세포주로부터 미토콘드리아를 분리하였다. 분리한 미토콘드리아는 버퍼에 부유하여 BCA법으로 단백질 정량 후 실험에 사용하였다.
실험예 1. 미토콘드리아의 항섬유화 활성 분석
실험예 1.1. 정량적 실시간 중합연쇄반응을 이용한 항섬유화 활성 비교
미토콘드리아의 항섬유화 활성을 분석하기 위하여 정량적 실시간 중합연쇄반응법을 이용한 세포 기반 분석 실험을 진행하였다.
인간 폐유래 섬유아세포인 CCD8-Lu 세포 및 Wi-38 세포를 각각 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 약 2Ｘ105 cells/well의 세포를 6 well 플레이트에 접종을 하고 24시간 동안 배양을 한 후에 FBS가 제거된 DMEM 배지에서 약 24시간 동안 결핍조건을 진행하였다. 24시간 후에, 2.5 ng/㎖의 농도로 TGF-β를 처리한 다음 6시간 동안 세포의 섬유화를 유도하였다. 6시간 후에 PBS를 이용하여 2회 세척하여 남아있는 TGF-β를 완전히 제거해 주었다. 다음으로 제조예 1에서 HEK293, UC-MSC 및 BM-MSC 세포로부터 분리한 미토콘드리아를 DMEM 배지에 혼합하여 처리한 뒤 18시간 동안 추가로 배양하였다(도 1). 이 때, 음성 대조군에는 아무것도 처리하지 않고, 양성 대조군에는 5 ng/㎖ 농도의 TGF-β를 단독으로 처리하였으며, 실험군에는 각 세포로부터 분리한 미토콘드리아를 각각 10 ㎍으로 처리하였다. 미토콘드리아에 의한 항섬유화 효능을 기존의 항섬유화 치료제로 사용되고 있는 닌테다닙을 1 μM 농도로 처리하여 비교하였다.
미토콘드리아 처리 18시간 후에, 배양액을 제거하고 세포에 PBS 완충 용액을 첨가하여 2회 세척하고, 0.5 ㎖의 RNA 추출액(Trizol reagent, Thermo Fisher Scientific)액을 직접 첨가한 후, 10분 동안 상온에서 방치하였다. 그리고 나서, 0.1 ㎖의 클로로포름을 첨가하여 15초 동안 교반한 다음, 약 12,000xg로 10분 동안 원심분리 하였다. 분리된 상층액을 수득하고, 동일 부피만큼의 아이소프로필알콜을 첨가한 후에 12,000xg로 10분 동안 원심분리 하였다. 그 후, 액체를 제거하고 75% 에탄올로 1회 세척을 한 후에 상온에서 건조하였다. 건조 후, RNAase-free 정제 증류수를 약 50 ㎕를 첨가하고, 분광 광도계를 이용하여 수득된 RNA의 정량 및 순도를 측정하였다.
수득된 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하기 위해, 정제된 총 RNA 2 ㎍에 oligo dT와 결합 반응을 70℃에서 5분 동안 진행한 후, 10X 역전사반응 완충 용액, 10 mM dNTP, RNAse 저해제 및 M-MLV 역전사효소(Enzynomics, Korea)를 첨가하여, cDNA 합성 반응을 42℃에서 60분 동안 수행하였다. cDNA 합성 반응이 끝난 후에 72℃에서 5분 동안 가열하여 역전사효소를 불활성화시킨 다음, RNase H를 첨가하여 단일 가닥의 RNA를 제거하여 최종 cDNA를 수득하였다.
근섬유아세포의 특징 유전자인 알파액틴평활근(α-SMA) 유전자와 섬유화 특징 유전자인 CCN2(또는 CTGF) 유전자, 섬유화 특징 유전자인 피브로넥틴 및 섬유화 특징 유전자인 NOX-4 유전자의 발현 변화 여부를 정량적 실시간 중합연쇄반응을 통해 관찰하였다. GAPDH 유전자를 함께 정량화 하여 발현의 차이를 보정하였다. 정량적 실시간 중합연쇄반응에 사용된 유전자들의 염기 서열은 하기의 표에 기재된 바와 같다.
프라이머 서열 서열번호
CTGF-S 5'-GGC TTA CCG ACT GGA AGA C-3' 서열번호1
CTGF-AS 5'-AGG AGG CGT TGT CAT TGG-3' 서열번호2
Fibronectin-S 5'-GTG GCT GAA GAC ACA AGG AA-3' 서열번호3
Fibronectin-AS 5'-CCT GCC ATT GTA GGT GAA T-3' 서열번호4
NOX4-S 5'- CAC CTC TGC CTG TTC ATC TG-3' 서열번호5
NOX4-AS 5'- GGC TCT GCT TAG ACA CAA TCC-3' 서열번호6
Alpha-SMA-S 5'-GCC CAG CCA AGC ACT GTC AGG A-3' 서열번호7
Alpha-SMA-AS 5'-TCC CAC CAT CAC CCC CTG ATG TC-3' 서열번호8
GAPDH-S 5'-GTC TCC TCT GAC TTC AAC AGC G-3' 서열번호9
GAPDH-AS 5'-ACC ACC CTG TTG CTG TAG CCA A-3' 서열번호10
실험 결과, 도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 인간 폐 유래 섬유아세포인 CCD8-Lu 세포(도 1a 내지 도 1d) 및 Wi-38 세포(도 2)에 TGF-β를 처리하였을 때 알파액틴평활근(α-SMA), CTGF, 피브로넥틴 및 NOX-4 유전자의 발현이 증가함을 알 수 있었으며, TGF-β에 의해 유도되는 알파액틴평활근(α-SMA), CTGF, 피브로넥틴 및 NOX-4 유전자의 발현은 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아를 처리하였을 때 현저하게 억제됨을 확인하였다.
반면에 HEK293 세포 유래의 미토콘드리아는 TGF-β에 의해 유도되는 알파액틴평활근(α-SMA), CTGF, 피브로넥틴 및 NOX-4 유전자의 발현을 억제하지 못함을 알 수 있었다. 항섬유화 치료제로 사용되는 닌테다닙 화합물의 경우에는 TGF-β에 의해 유도되는 알파액틴평활근(α-SMA), CTGF 및 NOX-4 유전자의 발현을 약하게 억제하거나 거의 억제하지 못하는 것을 확인하였다. 이를 통하여, 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아는 기존의 폐섬유화 치료제로 알려져 있는 닌테다닙 화합물과 비교하여, 동일한 조건에서 현저하게 우수한 항섬유화 활성을 나타내는 것을 알 수 있었으며 또한 HEK293 세포 유래 미토콘드리아에 비해 우수한 항섬유화 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
실험예 1.2. 섬유화 관련 단백질 발현을 통한 항섬유화 활성 비교
실험예 1.2.1. 다양한 세포 유래 미토콘드리아에 의한 항섬유화 활성 비교
미토콘드리아의 항섬유화 활성을 분석하기 위하여 웨스턴 분석법을 이용하여 세포 기반 분석 실험을 진행하였다.
인간 폐유래 섬유아세포인 CCD8-Lu 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 약 2Ｘ105 cells/well의 세포를 6well 플레이트에 접종을 하고 24시간 동안 배양을 한 후에 FBS가 제거된 DMEM 배지에서 약 24시간 동안 결핍조건을 진행하였다. 24시간 후에, 2.5 ng/㎖의 농도로 TGF-β를 처리한 다음 6시간 동안 세포의 섬유화를 유도하였다. 6시간 후에 PBS를 이용해 2회 세척하여 TGF-β를 완전히 제거해 주었다. 다음으로 제조예 1에서 수득한 UC-MSC, L6, HEK293, C2C12, iPSC 및 CCD8-Lu 세포로부터 분리한 미토콘드리아를 DMEM 배지에 혼합하여 처리한 뒤 18시간 동안 추가로 배양하였다(도 3). 이 때, 음성 대조군에는 아무것도 처리하지 않고, 양성 대조군에는 2.5 ng/㎖ 농도의 TGF-β를 단독으로 처리하였으며, 실험군에는 각 세포로부터 분리한 미토콘드리아를 각각 5 ㎍ 처리하였다.
미토콘드리아 처리 18시간 후에, 배양액을 제거하고 세포에 PBS 완충 용액을 첨가하여 2회 세척하고, 단백질분해효소 억제제(protease inhibitor)가 포함된 100 ㎕의 RIPA(150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 데옥시콜산(Deoxycholic acid), 0.1% SDS, 50 mM Tris pH 7.5) 완충 용액을 직접 첨가하였다. 10분 후, 스크래퍼를 이용해 세포를 회수하여 마이크로 튜브에 옮긴 다음, 약 12,000xg로 10분 동안 원심분리 하였다.
분리된 상층액을 수득하여 새로운 마이크로튜브에 옮긴 다음 BCA 분석법을 이용하여 단백질을 정량하였다. 각 샘플들은 동일한 단백질 양으로 전기영동 한 후, 웨스톤 블롯팅을 수행하였다. 1차 항체로는 항-콜라겐 1A 항체(Invitrogen, PA5-29569), 항-피브로넥틴 항체(Santa Cruz Biotechnology, sc-8422), 항-평활근액틴 항체(Sigma, A5228), 항-CTGF 항체(Santa Cruz Biotechnology, sc-365970)를 사용하였고, 2차 항체로는 항-마우스 IgG HRP 항체 또는 항-래빗 IgG HRP 항체를 사용하였다. 보정을 위하여 항-β 액틴 항체(Sigma, A2228) 항체를 이용하여 단백질 발현의 차이를 보정하였다.
실험 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 인간 폐 유래 섬유아세포인 CCD8-Lu에 TGF-β를 처리하였을 때 콜라겐 1A의 발현이 증가함을 알 수 있었으며, TGF-β에 의해 발현이 유도되는 콜라겐 1A 발현은 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아를 포함한 다양한 세포 유래의 미토콘드리아를 처리하였을 때 콜라겐 1A의 발현이 억제됨을 확인하였다. 반면에, HEK293 세포 유래 미토콘드리아를 처리한 경우에는 TGF-β에 의해 유도되는 콜라겐 1A 단백질 발현을 거의 억제하지 못하는 것을 확인하였다. 이를 통하여, 중간엽줄기세포 및 역분화줄기세포를 포함한 다양한 세포 유래 미토콘드리아는 기존의 폐섬유증 치료제로 알려져 있는 닌테다닙과 비슷한 수준으로 항섬유화 활성을 나타내는 것을 알 수 있었다.
실험예 1.2.1. 줄기 세포 유래 미토콘드리아에 의한 항섬유화 활성 비교
줄기세포 유래 미토콘드리아의 항섬유화 활성을 분석하기 위하여 웨스턴 분석법을 이용하여 세포 기반 분석 실험을 진행하였다.
인간 폐 유래 섬유아세포인 CCD8-Lu 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 약 2Ｘ105 cells/well의 세포를 6 well 플레이트에 접종을 하고 24시간 동안 배양을 한 후에 FBS가 제거된 DMEM 배지에서 약 24시간 동안 결핍조건을 진행하였다. 24시간 후에, 2.5 ng/㎖ 농도로 TGF-β를 처리한 다음 6시간 동안 세포의 섬유화를 유도하였다. 6시간 후에 PBS를 이용해 2회 세척하여 TGF-β를 완전히 제거해 주었다. 다음으로 제조예 1에서 수득한 제대혈중간엽줄기세포인 UC-MSC, 골수중간엽줄기세포인 BM-MSC, 역분화줄기세포인 iPSC 및 HEK293 세포로부터 분리한 미토콘드리아를 DMEM 배지에 혼합하여 처리한 뒤 18시간 동안 추가로 배양하였다(도 4). 이때, 음성 대조군에는 아무것도 처리하지 않고, 양성 대조군에는 2.5 ng/㎖ 농도의 TGF-β를 단독으로 처리하였으며, 실험군에는 각 세포로부터 분리한 미토콘드리아를 각각 5 ㎍ 처리하였다.
미토콘드리아 처리 18시간 후에, 배양액을 제거하고 세포에 PBS 완충 용액을 첨가하여 2회 세척하고, 단백질분해효소 억제제(protease inhibitor)가 포함된 100 ㎕의 RIPA(150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 데옥시콜산(Deoxycholic acid), 0.1% SDS, 50mM Tris pH 7.5) 완충 용액을 직접 첨가하였다. 10분 후, 스크래퍼를 이용해 세포를 회수하여 마이크로 튜브에 옮긴 다음, 약 12,000xg로 10분 동안 원심분리 하였다. 분리된 상층액을 수득하여 새로운 마이크로튜브에 옮긴 다음 BCA 분석법을 이용하여 단백질을 정량하였다. 각 샘플들은 동일한 단백질 양으로 전기영동 한 후, 웨스톤 블롯팅을 수행하였다. 1차 항체로는 항-콜라겐 1A 항체 또는 항-알파평활근액틴 항체를 사용하였고, 2차 항체로는 항-마우스 IgG HRP 항체 또는 항-ㄹ래래빗 IgG HRP 항체를 사용하였다. 보정을 위하여 항-β 액틴 항체를 이하여 단백질 발현의 차이를 보정하였다.
실험 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 인간 폐 유래 섬유아세포인 CCD8-Lu에 TGF-β를 처리하였을 때 콜라겐 1A 및 알파액틴평활근(α-SMA)의 발현이 증가함을 알 수 있었으며, TGF-β에 의해 발현이 유도되는 콜라겐 1A 및 알파액틴평활근(α-SMA)의 발현은 제대혈중간엽줄기세포, 골수중간엽줄기세포 및 역분화줄기세포 유래 미토콘드리아에 의해 콜라겐 1A 및 알파액틴평활근(α-SMA)의 발현이 억제됨을 확인하였다. 반면, HEK293 세포 유래 미토콘드리아를 처리한 경우에는 TGF-β에 의해 유도되는 콜라겐 1A 및 알파액틴평활근(α-SMA)의 발현이 거의 억제하지 못하는 것을 확인하였다.
이를 통하여, 중간엽줄기세포 및 역분화줄기세포를 포함한 줄기세포 유래 미토콘드리아는 기존의 폐섬유화 치료제로 알려져 있는 닌테다닙과 피르페니돈에 비해 우수하거나 비슷한 수준으로 항섬유화 활성을 나타내는 것을 알 수 있었다.
실험예 1.3. 세포면역화학염색 분석법을 이용한 항섬유화 활성 분석
줄기세포 유래 미토콘드리아의 항섬유화 활성을 분석하기 위하여 웨스턴 분석법을 이용하여 세포 기반 분석 실험을 진행하였다.
인간 폐유래 섬유아세포인 CCD8-Lu 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 그리고 나서, 약 2Ｘ104 cells/well의 세포를 24 well 플레이트에 접종을 하고 24시간 동안 배양을 한 후에 FBS가 제거된 DMEM 배지에서 약 24시간 동안 반응시켰다. 24시간 후에, 2.5 ng/㎖ 농도로 TGF-β를 처리한 다음 6시간 동안 세포의 섬유화를 유도하였다. 6시간 후에 PBS를 이용해 2회 세척하여 TGF-β를 완전히 제거해 주었다. 다음으로 제조예 1에서 수득한 제대혈중간엽줄기세포인 UC-MSC, 골수중간엽줄기세포인 BM-MSC, 역분화줄기세포인 iPSC 및 HEK293 세포로부터 분리한 미토콘드리아를 DMEM 배지에 혼합하여 처리한 뒤 18시간 동안 추가로 배양하였다(도 4). 이 때, 음성 대조군에는 아무것도 처리하지 않고, 양성 대조군에는 2.5 ng/㎖ 농도의 TGF-β를 단독으로 처리하였으며, 실험군에는 각 세포로부터 분리한 미토콘드리아를 각각 5 ㎍ 처리하였다.
각 샘플들에 대한 면역조직 분석은 다음과 같이 수행하였다. 먼저 PBS 완충액으로 2회 세척을 한 후에 4% 포름알데하이드를 첨가하여 1시간 동안 고정시키고, 1차 항체로 항-콜라겐 1A 항체 및 항-피브로넥틴 항체를, 2차 항체로는 Alexa Fluor 488 또는 Alexa Fluor 568로 표지된 항-마우스 항체 또는 항-래빗 항체를 사용하였다. 핵은 DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)를 사용하여 염색을 하고, 형광 현미경을 사용하여 형광의 세기 차이에 의한 분석을 수행하였다.
실험 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 인간 폐 유래 섬유아세포인 CCD8-Lu에 TGF-β를 처리하였을 때 콜라겐 1A 및 알파액틴평활근(α-SMA)의 발현이 증가함을 알 수 있었으며, TGF-β에 의해 발현이 유도되는 콜라겐 1A 및 알파액틴평활근(α-SMA)의 발현은 제대혈중간엽줄기세포, 골수중간엽줄기세포 및 역분화줄기세포 유래 미토콘드리아 처리에 의해 그 발현이 억제됨을 확인하였다. 반면에, HEK293 세포 유래 미토콘드리아를 처리한 경우에는 TGF-β에 의해 유도되는 콜라겐 1A 및 알파액틴평활근(α-SMA)의 발현이 거의 억제되지 않았다. 이를 통하여, 중간엽줄기세포 및 역분화줄기세포를 포함한 줄기세포 유래 미토콘드리아는 기존의 폐섬유화 치료제로 알려져 있는 닌테다닙과 피르페니돈와 비교하여 유사하거나 현저히 우수한 항섬유화 활성을 나타내는 것을 알 수 있었다.
실험 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 음성 대조군인 CCD8-Lu 세포에서는 콜라겐 1A 및 피브로넥틴의 발현이 낮았으며, 2.5 ng/㎖ TGF-β를 처리하였을 때 콜라겐 1A 및 피브로넥틴의 발현이 상당히 증가함을 형광의 세기에 의해 확인하였다. 또한, 2.5 ng/㎖의 TGF-β를 처리하고 6시간 후에 제대혈중간엽줄기세포, 골수중간엽줄기세포, 및 역분화줄기세포 유래 미토콘드리아를 처리하였을 때는 TGF-β에 의해 유도되는 콜라겐 1A 및 피브로넥틴의 발현의 증가는 제대혈중간엽줄기세포, 골수중간엽줄기세포, 및 역분화줄기세포 유래 미토콘드리아를 처리하였을 때 현저하게 억제됨을 확인하였다.
반면, HEK293 세포 유래 미토콘드리아와 1 mM의 피르페니돈 화합물을 처리했을 경우에는 TGF-β에 의해 유도되는 콜라겐 1A 및 피브로넥틴의 단백질의 발현을 거의 억제하지 못하거나 약하게 억제하는 것을 확인하였다. 이를 통하여, 줄기세포 유래 미토콘드리아는 기존의 폐섬유증 치료제로 알려져 있는 닌테다닙 화합물 및 피르페니돈 화합물과 비교하여, 동일한 조건에서 비슷하거나 현저하게 우수한 항섬유화 활성을 나타내는 것을 알 수 있었다.
실험예 1.4. CTGF 발현 억제를 통한 항섬유화 활성 비교
섬유화의 핵심 유전자인 CTGF의 발현이 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아에 의해 조절되는지 여부를 관찰하기 위하여 웨스턴 분석법을 이용하여 세포 기반 분석 실험을 진행하였다.
인간 폐유래 섬유아세포인 CCD8-Lu 세포(도 6a) 및 Wi-38 세포(도 6b)를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 약 2Ｘ105 cells/well의 세포를 6 well 플레이트에 접종을 하고 24시간 동안 배양을 한 후에 FBS가 제거된 DMEM 배지에서 약 24시간 동안 결핍조건을 진행하였다.
24시간 후에, 2.5 ng/㎖의 농도로 TGF-β를 처리한 다음 6시간 동안 세포의 섬유화를 유도하였다. 6시간 후에 PBS를 이용해 2회 세척하여 TGF-β를 완전히 제거해 주었다. 다음으로 제조예 1와 동일한 방법으로 UC-MSC 및 HEK293 세포로부터 분리한 미토콘드리아를 DMEM 배지에 혼합하여 처리한 뒤 18시간 동안 추가로 배양하였다(도 3). 이 때, 음성 대조군에는 아무것도 처리하지 않고, 양성 대조군에는 2.5 ng/㎖ 농도의 TGF-β를 단독으로 처리하였으며, 실험군에는 각 세포로부터 분리한 미토콘드리아를 각각 5 ㎍ 처리하였다.
미토콘드리아 처리 18시간 후에, 배양액을 제거하고 세포에 PBS 완충 용액을 첨가하여 2회 세척하고, 단백질분해효소 억제제(protease inhibitor)가 포함된 100 ㎕의 RIPA(150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 데옥시콜산(Deoxycholic acid), 0.1% SDS, 50 mM Tris pH 7.5) 완충 용액을 직접 첨가하였다. 10분 후, 스크래퍼를 이용해 세포를 회수하여 마이크로 튜브에 옮긴 다음, 약 12,000xg로 10분 동안 원심분리 하였다.
분리된 상층액을 수득하여 새로운 마이크로튜브에 옮긴 다음 BCA 분석법을 이용하여 단백질을 정량하였다. 각 샘플들은 동일한 단백질 양으로 전기영동 한 후, 웨스톤 블롯팅을 수행하였다. 1차 항체로는 항-CTGF 항체를 사용하였고, 2차 항체로는 항-래빗 IgG HRP 항체를 사용하였다. 보정을 위하여 항-β 액틴 항체를 이용하여 단백질 발현의 차이를 보정하였다.
실험 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 인간 폐 유래 섬유아세포인 CCD8-Lu에 TGF-β를 처리하였을 때 CTGF의 발현이 증가함을 알 수 있었으며, TGF-β에 의해 발현이 유도되는 CTGF 발현은 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아를 처리하였을 때 CTGF의 발현이 억제됨을 확인하였다. 반면, HEK293 세포 유래 미토콘드리아와 항섬유화 치료제인 닌테다닙을 처리한 경우에는 TGF-β에 의해 유도되는 CTGF 단백질 발현을 거의 억제하지 못하는 것을 확인하였다. 이를 통하여, 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아는 기존의 폐섬유증 치료제로 알려져 있는 닌테다닙에 비해 우수한 수준으로 항섬유화 활성을 나타내는 것을 알 수 있었다.
실험예 1.5. 줄기 세포 유래 미토콘드리아의 농도 별에 따른 항섬유화 활성 비교
중간엽줄기세포와 역분화줄기세포 유래 미토콘드리아의 항섬유화 활성이 처리하는 미토콘드리아의 양에 따라 변화하는지 여부를 분석하기 위하여 웨스턴 분석법을 이용하여 세포 기반 분석 실험을 진행하였다.
인간 폐 유래 섬유아세포인 CCD8-Lu 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 약 2Ｘ105 cells/well의 세포를 6 well 플레이트에 접종을 하고 24시간 동안 배양을 한 후에 FBS가 제거된 DMEM 배지에서 약 24시간 동안 결핍조건을 진행하였다. 24시간 후에, 2.5 ng/㎖의 농도로 TGF-β를 처리한 다음 6시간 동안 세포의 섬유화를 유도하였다. 6시간 후에 PBS를 이용해 2회 세척하여 TGF-β를 완전히 제거해 주었다. 다음으로 제조예 1에서 수득한 제대혈중간엽줄기세포인 UC-MSC 및 역분화줄기세포인 iPSC로부터 분리한 미토콘드리아를 각각 1 ㎍, 5 ㎍, 10 ㎍, 20 ㎍ 또는 50 ㎍을 DMEM 배지에 혼합하여 처리한 뒤 18시간 동안 추가로 배양하였다(도 7). 이 때, 음성 대조군에는 아무것도 처리하지 않고, 양성 대조군에는 2.5 ng/㎖ 농도의 TGF-β를 단독으로 처리하였다. 비교군으로는 1 μM의 닌테다닙과 HEK293 세포로부터 유래된 미토콘드리아를 처리하였다.
미토콘드리아 처리 18시간 후에, 배양액을 제거하고 세포에 PBS 완충 용액을 첨가하여 2회 세척하고, 단백질분해효소 억제제(protease inhibitor)가 포함된 100 ㎕의 RIPA(150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 데옥시콜산(deoxycholic acid), 0.1% SDS, 50 mM Tris pH 7.5) 완충 용액을 직접 첨가하였다. 10분 후, 스크래퍼를 이용하여 세포를 회수하고 마이크로 튜브에 옮긴 다음, 약 12,000xg로 10분 동안 원심분리 하였다.
분리된 상층액을 수득하여 새로운 마이크로튜브에 옮긴 다음 BCA 분석법을 이용하여 단백질을 정량하였다. 각 샘플들은 동일한 단백질 양으로 전기영동 한 후, 웨스톤 블롯팅을 수행하였다. 1차 항체로는 항-피브로넥틴 항체, 항-콜라겐 1A 항체 또는 항-알파평활근액틴 항체를 사용하였고, 2차 항체로는 항-마우스 IgG HRP 항체 또는 항-래빗 IgG HRP 항체를 사용하였다. 보정을 위하여 항-β 액틴 항체를 이용하여 단백질 발현의 차이를 보정하였다.
실험 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 인간 폐 유래 섬유아세포인 CCD8-Lu에 TGF-β를 처리하였을 때 피브로넥틴, 콜라겐 1A 및 알파액틴평활근(α-SMA)의 발현이 증가함을 알 수 있었으며, TGF-β에 의해 발현이 유도되는 피브로넥틴, 콜라겐 1A 및 알파액틴평활근(α-SMA)의 발현은 제대혈중간엽줄기세포와 역분화줄기세포 유래 미토콘드리아에 의해 농도 의존적으로 발현이 억제됨을 확인하였다. 이를 통하여, 중간엽줄기세포 및 역분화줄기세포를 포함한 줄기세포 유래 미토콘드리아는 농도 의존적인 항섬유화 활성을 나타내는 것을 알 수 있었다.

Claims (9)

  1. 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 섬유증은 신장, 간, 폐, 피부, 심장, 췌장, 비뇨기계, 생식기계, 땀샘, 신경, 뇌, 골수, 근육 및 관절로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에서 발생하는 것인, 섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 섬유증은 폐 섬유화증(Pulmonary Fibrosis), 특발성 폐 섬유화증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis), 방사선 조사에 의한 폐 손상(Radiation-induced lung injury) 또는 폐 섬유화, 폐부종, 낭포성 섬유증(Cystic Fibrosis), 간 섬유화, 심내막 심근섬유증(Endomyocardial Fibrosis), 심근경색(Myocardial Infarction), 심방 섬유화(Artrial Fibrosis), 신경교 반흔(Glial scar), 신장 섬유증(Renal Fibrosis), 골수 섬유증(Myelofibrosis), 관절 섬유증(Arthrofibrosis), 지방 섬유증, 피부 섬유증, 신경 섬유증 및 근 섬유증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인, 섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 미토콘드리아는 세포 또는 조직으로부터 분리된 것인, 섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 미토콘드리아는 중간엽줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 골수줄기세포, 신경줄기세포, 윤부줄기세포, 조직 유래 줄기세포, 혈소판 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 분리된 것인, 섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 약학 조성물에 대하여, 상기 미토콘드리아는 0.1 ㎍/㎖ 내지 1,000 ㎍/㎖의 농도로 포함되는, 섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 약학 조성물에 대하여, 상기 미토콘드리아는 1Х105 내지 5Х108 미토콘드리아 개수/㎖의 함량으로 포함되는 것인, 섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 섬유증 예방 또는 치료 방법.
  9. 섬유증 예방 또는 치료를 위한 분리된 미토콘드리아의 용도.
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