WO2022080882A1

WO2022080882A1 - 만성신장질환의 악화 예측 마커로서의 snp 및 이의 이용

Info

Publication number: WO2022080882A1
Application number: PCT/KR2021/014204
Authority: WO
Inventors: 오국환; 박수경
Original assignee: 서울대학교병원
Priority date: 2020-10-15
Filing date: 2021-10-14
Publication date: 2022-04-21

Abstract

본 발명은 유전자 다형성을 이용하여 만성신장질환의 악화를 예측하기 위한 조성물, 키트 및 방법에 관한 것이다.

Description

만성신장질환의 악화 예측 마커로서의 SNP 및 이의 이용

만성신장질환 (chronic kidney disease, CKD)은 다양한 원인에 의하여 신장의 기능이 점차적이고 진행성으로 상실되는 질환을 말한다. 일반적으로 사용되는 미국국립신장재단의 정의에 따르면, 만성신장질환은 신장 손상의 유무 및 신장 기능의 수준에 따라 정의되는데, 즉, 단백뇨 또는 혈뇨 등의 신장 손상의 증거가 있거나, 신기능을 나타내는 사구체 여과율(glomerular filtration rate, GFR)이 60ml/min/1.73m² 미만으로 감소된 상태가 3개월 이상 만성적으로 지속된 상태로 정의된다.

임상분야에서는 환자의 진단 및 치료를 위해 사구체 여과율에 따라 만성신장질환의 병기를 1기(stage 1)부터 5기(stage 5)까지 5단계로 나누고 있으며 추가로 투석 환자(Dialysis, D)와 신장이식 환자(Transplantation, T)에 대하여 별도로 표기하고 있다. 일반적으로 1기 내지 4기에서는 투석이 필요하지 않으나, 신장의 변성 과정이 시작되면 신장 기능이 말기(5기)를 향해 비가역적으로 악화되어, 5기의 환자들은 대부분 투석이나 신장 이식 등의 신대체요법 없이는 생존이 어려운 경우가 많다.

만성신장질환의 치료 목표는 일차적으로는 신질환을 예방하는 것이나, 만성적인 신기능 악화가 일단 시작된 이후에는 그 진행 속도를 정지시키거나 최대한 지연시켜 말기 신장질환과 합병증의 발생을 억제하고 보다 나은 삶의 질을 영위하게 하는 것이다. 따라서 만성신장질환의 악화가 진행될 가능성이 높은 위험군을 조기에 발견하고 적절히 대처하는 것이 중요하다. 그러나, 신기능의 저하 또는 합병증 발병이 수년 또는 10여년에 걸쳐 만성적으로 진행되는 만성신장질환의 특성상, 질병의 경과와 치료의 반응을 평가하는데 오랜 시간이 소요되는 문제가 있다.

따라서 신기능의 악화 또는 질환의 중증도를 반영하여 예후를 예측하거나 치료 반응을 알려줄 수 있는 바이오마커의 개발이 필요한 실정이다.

본 발명의 일예는 rs28629773, rs74798667 및 rs57966672 (NCBI refSNP ID) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 2 이상의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 만성신장질환의 악화 예측용 조성물을 제공한다.

구체예로, SNP를 검출할 수 있는 제제는, 해당 SNP를 포함하는 10 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 또는 해당 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 프로브 또는 프라이머를 포함할 수 있다.

다른 예는 rs28629773, rs74798667 및 rs57966672 (NCBI refSNP ID) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 2 이상의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 만성신장질환의 악화 예측용 키트를 제공한다.

구체예로, 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩, 또는 미세유체 칩 키트일 수 있다.

다른 예는 만성신장질환을 예측하는 방법으로서, (i) 만성신장질환 환자의 시료로부터 rs28629773, rs74798667 및 rs57966672 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 2 이상의 단일염기다형성(SNP)을 검출하는 단계, 및 (ii) 상기 (i) 단계에서 검출된 단일염기다형성(SNP)의 서열을 확인하는 단계를 포함하고, rs28629773 의 SNP 유전자형이 G 인 것으로 확인되거나, rs74798667 의 SNP 유전자형이 C인 것으로 확인되거나, 또는 rs57966672 의 SNP 유전자형이 A인 것으로 확인되는 경우, 만성신장질환이 악화될 위험성이 높은 것으로 예측되는 것인, 방법을 제공한다.

다른 예는 만성신장질환의 악화 예측을 위한 정보를 제공하는 방법으로서, (i) 만성신장질환 환자의 시료로부터 rs28629773, rs74798667 및 rs57966672 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 2 이상의 단일염기다형성(SNP)을 검출하는 단계, 및 (ii) 상기 (i) 단계에서 검출된 단일염기다형성(SNP)의 서열을 확인하는 단계를 포함하고, rs28629773 의 SNP 유전자형이 G 인 것으로 확인되거나, rs74798667 의 SNP 유전자형이 C인 것으로 확인되거나, 또는 rs57966672 의 SNP 유전자형이 A인 것으로 확인되는 경우, 만성신장질환이 악화될 위험성이 높은 것으로 예측되는 것인, 방법 을 제공한다.

다른 예는 만성신장질환의 악화 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여 단일염기다형성(SNP)을 검출하는 방법으로서, (i) 만성신장질환 환자의 시료로부터 rs28629773, rs74798667 및 rs57966672 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 2 이상의 단일염기다형성(SNP)을 검출하는 단계, 및 (ii) 상기 (i) 단계에서 검출된 단일염기다형성(SNP)의 서열을 확인하는 단계를 포함하고, rs28629773 의 SNP 유전자형이 G 인 것으로 확인되거나, rs74798667 의 SNP 유전자형이 C인 것으로 확인되거나, 또는 rs57966672 의 SNP 유전자형이 A인 것으로 확인되는 경우, 만성신장질환이 악화될 위험성이 높은 것으로 예측되는 것인, 방법을 제공한다.

구체예로, 상기 방법들에서, 단일염기다형성(SNP)의 검출은, 상기 SNP를 포함하는 10 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 프로브 또는 프라이머를 이용하는 것일 수 있다.

구체예로, 단일염기다형성(SNP)의 검출 방법으로는, 시퀀싱, 미니-시퀀싱, 자동시퀀싱, TaqMan 분석, 파이로시퀀싱, 대립 유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allelespecifichybridization, DASH), PCR-RELP (restriction fragment length polymorphism), PCR-SSCP (single strand conformation polymorphism), PCR-SSO (specific sequence oligonucleotide), 마이크로어레이에 의한 혼성화, 프라이머 신장, 서던 블롯 혼성화, 도트 혼성화, PCR-SSO과 도트 하이브리드화를 조합한 ASO (allele specific oligonucleotide) 혼성화, RCA (rolling circle amplification), HRM (high resolution melting), 또는 MALDI-TOF/MS (matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry)을 포함할 수 있다.

본 발명은 환자의 시료에서 채취한 게놈 DNA의 특정 SNP를 검출하여 만성신장질환의 악화를 예측하는 분자생물학적 진단법을 제공하며, 이는 간편하고 비침습적이며 경제적인 장점이 있다. 또한, SNP는 검출이 용이하고, 종래 단백질이나 RNA 마커들에 비해 안정적이며 분석이 쉬운 장점이 있다.

도 1은 발견 연구에서 전체(도 1a), 당뇨병 그룹(도 1b) 및 비-당뇨병 그룹(도 1c)에서의 eGFR 감소에 관한 전장유전체연관분석 결과를 맨하탄 plot 으로 나타낸 것이다.

도 2a 및 2b는 재현 또는 검증 연구에서 eGFR 감소와 높은 유의적인 관련성이 확인된 rs28629773 의 유전자 자리의 Regional plot을 나타낸다. Y 축은 상기 SNP의 log₁₀ (P 값)을 나타내고 X 축은 그 염색체 위치를 나타낸다.

도 3a 및 3b는 재현 또는 검증 연구에서 eGFR 감소와 높은 유의적인 관련성이 확인된 rs74798667 의 유전자 자리의 Regional plot을 나타낸다. Y 축은 상기 SNP의 log₁₀ (P 값)을 나타내고 X 축은 그 염색체 위치를 나타낸다.

도 4a 및 4b는 재현 또는 검증 연구에서 eGFR 감소와 높은 유의적인 관련성이 확인된 rs57966672 의 유전자 자리의 Regional plot을 나타낸다. Y 축은 상기 SNP의 log₁₀ (P 값)을 나타내고 X 축은 그 염색체 위치를 나타낸다.

본 발명은 전장유전체연관분석을 통해 만성신장질환 환자의 악화를 결정하는 지표인 추정 사구체 여과율 기울기(eGFR slope)와 유의적인 상관관계를 갖는 특정 단일염기다형성(SNP)의 염기를 확인하였으며, 이들 특정 SNP를 바이오마커로 이용하여 만성신장질환 환자의 예후를 예측하는 분자생물학적 진단 기술을 제공한다. SNP 마커는 DNA에 존재하기 때문에 검출이 용이하고, 단백질 마커에 비해 안정적이고, 염색체 내 특정 위치에서 일어나므로 분석이 손쉬우며, 소량의 시료에서도 쉽게 확인이 가능한 장점을 가진다.

따라서, 하나의 양태로서, 본 발명은 rs28629773, rs74798667 및 rs57966672 (NCBI refSNP ID) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 2 이상의 단일염기다형성(SNP)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 만성신장질환의 악화 예측용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.

일 구현예로, 본 발명은 rs28629773의 단일염기다형성(SNP)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 만성신장질환의 악화 예측용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.

다른 구현예로, 본 발명은 rs74798667 의 단일염기다형성(SNP)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 만성신장질환, 특히 당뇨병성 신증에 의한 만성신장질환의 악화 예측용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.

다른 구현예로, 본 발명은 rs57966672 의 단일염기다형성(SNP)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 만성신장질환, 특히 비당뇨병성 만성신장질환의 악화 예측용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 만성신장질환을 예측하는 방법으로서, (i) 만성신장질환 환자의 시료로부터 rs28629773, rs74798667 및 rs57966672 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 2 이상의 단일염기다형성(SNP)을 검출하는 단계, 및 (ii) 상기 (i) 단계에서 검출된 단일염기다형성(SNP)의 서열을 확인하는 단계를 포함하고, rs28629773 의 SNP 유전자형이 G 인 것으로 확인되거나, rs74798667 의 SNP 유전자형이 C인 것으로 확인되거나, 또는 rs57966672 의 SNP 유전자형이 A인 것으로 확인되는 경우, 만성신장질환이 악화될 위험성이 높은 것으로 예측되는 것인, 방법을 제공한다.

일 구현예로, 본 발명은 만성신장질환을 예측하는 방법으로서, (i) 만성신장질환 환자의 시료로부터 rs28629773의 단일염기다형성(SNP)을 검출하는 단계, 및 (ii) 상기 (i) 단계에서 검출된 단일염기다형성(SNP)의 서열을 확인하는 단계를 포함하고, rs28629773 의 SNP 유전자형이 G 인 것으로 확인되는 경우, 만성신장질환이 악화될 위험성이 높은 것으로 예측되는 것인, 방법을 제공한다.

다른 구현예로, 본 발명은 만성신장질환, 특히 당뇨병성 신증에 의한 만성신장질환을 예측하는 방법으로서, (i) 만성신장질환, 특히 당뇨병성 신증에 의한 만성신장질환 환자의 시료로부터 rs74798667 의 단일염기다형성(SNP)을 검출하는 단계, 및 (ii) 상기 (i) 단계에서 검출된 단일염기다형성(SNP)의 서열을 확인하는 단계를 포함하고, rs74798667 의 SNP 유전자형이 C인 것으로 확인되는 경우 만성신장질환, 특히 당뇨병성 신증에 의한 만성신장질환이 악화될 위험성이 높은 것으로 예측되는 것인, 방법을 제공한다.

다른 구현예로, 본 발명은 만성신장질환, 특히 비당뇨병성 만성신장질환을 예측하는 방법으로서, (i) 만성신장질환, 특히 비당뇨병성 만성신장질환 환자의 시료로부터 rs57966672 의 단일염기다형성(SNP)을 검출하는 단계, 및 (ii) 상기 (i) 단계에서 검출된 단일염기다형성(SNP)의 서열을 확인하는 단계를 포함하고, rs57966672 의 SNP 유전자형이 A인 것으로 확인되는 경우, 만성신장질환, 특히 비당뇨병성 만성신장질환이 악화될 위험성이 높은 것으로 예측되는 것인, 방법을 제공한다.

본원에서 "rs 넘버(rs number)" 또는 "NCBI refSNP ID"란, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)의 SNP 레퍼런스 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)에 등록된 SNP 들의 고유 번호로서, 이 고유 번호를 통해 상기 데이터베이스에 접근하여 해당 SNP에 대한 정보를 확인할 수 있다. 따라서, 본원에서 rs 넘버가 특정된 이상, 당업자는 해당 SNP에 대한 정보들, 예를 들어 해당 SNP 가 존재하는 염색체 위치, 유전자 자리(genetic loci), 및 SNP를 포함하는 다형성 서열(polymorphic sequence) 등의 정보를 용이하게 확인할 수 있다. 그 예로, 하기 표 1은 상기 데이터베이스를 통해 확인되는 rs28629773, rs74798667 및 rs57966672의 정보를 나타낸다. 하기 표의 다형성 서열에서, SNP 는 101번째 염기에 G 또는 C로 존재하거나(rs28629773), T 또는 C로 존재하거나(rs74798667), G, A 또는 C로 존재하며(rs57966672), 괄호 안의 굵은 글씨로 표시하였다.

NCBI refSNP ID	염색체상의 위치	유전자 자리	다형성 서열
rs28629773	chr4:187119273 (GRCh38.p12)	FAT1와 LINC02374 사이	ACGAGGTGAGGTTCCTGCTCCTGTATCTACTACTTTCCTTGTTTTTCTCTGAGTGAATGGAATACTAACCTAATTGGCTCAGAAGAAGAAGACTGCAGTA[G/C]AAGACTGGCTACATTTACTTACTAAATAAGTAAGTCTCATTGGCTTCCTACTTCATGGGACAGGCTCGGAAAGAAAGCCAGCAGGTATCTGTCCTTGCTC (서열번호 1)
rs74798667	chr5:90738686 (GRCh38.p12)	ADGRV1	TGGTAGAAGTTTTTTTCCCCTTCTTCATTACTTTGAGTTTATTATTCTACTCTCTCATGGTCTGCAGGGTTTCTGCTGAGAAATCTGCTAATTAGCCATA[T/C]TGAGACGCCTTTGAATGCGACTATATTCTCTATCTCTTGCTGCTTTCAGTATTCTTTCTTTGTGTTTGATTTTTGTCTGGGTAAACTCTTCATTGAGTTG (서열번호 2)
rs57966672	chr 5:683368 (GRCh38.p12)	TPPP	GGAGAACCTGTCTCTGCGGAGAAAGACACTCTGATGGCAGCCGACTGGATTCCACCAGAACCCGAGGGCAAGCATTCCTTGGGAAGTGACCAGGCTGGGA[G/A/C]CATCAGGCACGCACGCCACACACTCAACCCAAACCTTCTGTTAACTCAGGTTCCCAGGAGCCCCGCGTGCTTCTGCCTGGCAGGAGCCGATGCTCGTGCC (서열번호 3)

상기 표에서 인간 게놈 염색체 부위의 염기서열은 GRCh38.p12 (Genome Reference Consortium Human Build 38 patch release 12) 에 따라 표현하였지만 상기 인간 게놈 염색체 부위의 구체적 서열은 게놈 서열 연구 결과가 업데이트됨에 따라서 그 표현이 다소 변경될 수 있으며, 이러한 변경에 따라 본 발명의 상기 인간 게놈 염색체 부위의 표현이 상이해질 수 있다. 따라서, 본 발명의 GRCh38.p12 에 따라 표현된 인간 게놈 염색체 부위는 본 발명의 출원일 이후 인간 표준 염기서열(human reference sequence)이 업데이트되어 상기 인간 게놈 염색체 부위의 표현이 지금과 다르게 변경된다고 하여도, 본 발명의 범위가 상기 변경된 인간 게놈 염색체 부위에 미치게 됨은 자명하다고 할 것이다. 이러한 변경 내용은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 누구라도 용이하게 알 수 있는 사항이다.본 발명에서 용어, "악화 예측"이란 앞으로의 신기능에 대한 손상, 감소된 신기능의 진행, 말기 신장질환으로 발전될 위험, 만성신부전 또는 말기신부전으로의 진행될 위험, 투석이나 신장 이식 등의 신대체요법이 요구될 위험 등 앞으로의 신장 상태의 손상과 위험성을 미리 평가하고 예측하는 것을 포함한다.

또한 본 발명의 조성물, 키트 및 방법은 만성신장질환 환자 중에서 신기능 악화의 위험성이 높은 환자를 선별하여 특별하고 적절한 관리를 통하여 그 진행 속도를 정지시키거나 최대한 지연시켜, 종국적으로는 말기 신장질환과 합병증의 발생을 억제하고 보다 나은 삶의 질을 영위하도록 하기 위하여 임상적으로 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 조성물, 키트 및 방법은 만성신장질환 환자에서 신기능을 평가하거나, 환자의 앞으로의 신장상태의 변화 가능성을 평가하거나, 신장기능 악화를 모니터링하거나, 앞으로의 신장 기능 손상의 위험성을 결정하거나, 적절한 치료 요법을 결정하는 등 다양한 임상적 목적으로 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어, "사구체 여과율(glomerular filtration rate, GFR)"은 신장의 사구체에서 혈액을 여과해 여과액을 만드는 속도를 말하며, 신장 기능을 반영하는 지표로 활용되고 있다. 사구체 여과율을 측정하기 위하여 방사성 동위원소를 이용한 방법 또는 체외에서 이눌린을 연속 주입하여 소변의 청소율을 구하는 방법 등이 있으나 시간이 많이 소요되고 검사방법이 복잡하다.

본 발명에서 용어, "추정 사구체 여과율(estimated GFR, eGFR)"은 소정의 공식에 따라 계산한 값을 말한다. 사구체 여과율은 사구체에서 직접 측정할 수 없고, 앞서 언급한 바와 같이 방사성 동위원소를 이용한 방법과 청소율을 이용한 방법으로 간접 측정이 가능하기는 하나 임상에서 거의 사용되지 않는다. 이에, 임상에서는 크레아티닌의 혈장 농도를 기반으로 하여 나이, 성별, 체중 등의 인자를 고려한 소정의 공식을 통해 사구체 여과율을 추정(estimation)하는 방법을 주로 사용하는데, 이를 추정(estimated) 사구체 여과율이라고 표현한다. 따라서, 본원에서 "사구체 여과율"은 실질적으로 임상에서 적용할 경우 추정 사구체 여과율로 측정되는 경우가 대부분일 것이므로, 용어 GFR 과 eGFR 을 상호호환적으로 사용한다.

추정 사구체 여과율을 계산하는 공식은 당업계에 알려져 있고 통상적으로 사용되는 공식들을 사용할 수 있다. 예를 들어, C-G 공식 (Cockcroft-Gault Equation), MDRD 공식(Modification of Diet in Renal Disease Equation), CKD-EPI 공식 (Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration Equation) 등을 예시할 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.

"사구체 여과율 감소(GFR decline)"[또는 "추정 사구체 여과율 감소(eGFR decline)"]는 만성신장질환의 악화를 예측할 수 있는 지표가 되므로 GFR에 따라 신 질환의 병기를 결정하고 신독성 약물의 투여용량결정 및 신대체 요법 후 경과판정 등 적절한 예방 및 치료 조치를 취하게 된다. 예를 들어, 미국 국립신장재단(NKF, National Kidney Foundation)의 2002년 K/DOQI (Kidney disease/Dialysis outcome quality improvement) 지침은 사구체 여과율을 기준으로 만성신장질환의 병기(stage)를 구분하고 있는데, 1기(stage 1)는 정상 GFR (90 ml/min/1.73m² 이상), 2기는 경도(mild)의 GFR 감소(60-89 ml/min/1.73m²), 3기는 중증도(moderate)의 GFR 감소(30-59 ml/min/1.73m²), 4기는 중증(severe) GFR 감소 (15-29 ml/min/1.73m²), 및 5기는 말기 신부전(failure)(15 ml/min/1.73m² 미만)으로 구분한다.

"사구체 여과율 기울기(GFR slope)" [또는 "추정 사구체 여과율 기울기(eGFR slope)"]는 eGFR 의 연간 변화를 말하며, 예를 들어 만성신장질환 환자들에서 시간에 따른 GFR 값을 측정하여 종축을 GFR (또는 eGFR) 값, 횡축을 시간(시기)로 한 그래프로 플로팅하였을 때 직선의 기울기로 확인할 수 있다. 일반적으로 만성신장질환이 진행될수록 GFR 값이 좌측 위로부터 우측 아래를 향해 직선적으로 저하되는데 이 직선의 기울기가 클수록 사구체 여과율 감소 속도가 빠른 것, 즉, 신기능의 감소 속도가 빠른 것으로 이해할 수 있다. 이와 같이 GFR slope (또는 eGFR slope) 가 가파를수록 만성신장질환의 감소 속도가 빠르다는 것을 의미하며, 이는 만성신장질환의 악화와 연관된다.

일반적인 또는 만성신장질환 코호트에서, 말기 신장 질환, 심혈관 질환 및 사망의 위험 예측과 관련있는 것으로 알려져 있다. eGFR slope 는 무작위 대조군 연구에서 신장 예후(renal outcome)에 대한 임상적 대리지표(surrogate endpoint)로서 그 유효성이 확인된 바 있다 [Greene, T, et al.: Performance of GFR Slope as a Surrogate End Point for Kidney Disease Progression in Clinical Trials: A Statistical Simulation. J Am Soc Nephrol, 30: 1756-1769, 2019]. 본 발명에서는 eGFR slope 의 감소와 유의적으로 관련된 유전자 자리와 SNP 들이 처음으로 확인되었으므로, 이들 특정 SNP를 바이오마커로 이용하여 만성신장질환 환자의 예후를 예측하는데 활용할 수 있다.

본원의 구체예에서, 본 발명자들은 한국인 만성신장질환 환자 코호트와 2개의 병원 기반의 당뇨병성 만성신장질환 코호트를 이용하여 총 1738명의 샘플을 전장유전체연관분석을 실시하였다. 연구 집단은 당뇨병 상태에 따라 나누어, 당뇨병 군, 비당뇨병 군, 및 전체로 분석하였으며, 결과지표(outcome)로는 무작위 기울기 및 무작위 절편 방법을 사용하여 계산된 사구체 여과율 감소 속도(eGFR slope)를 이용하였다. 발견 연구에서 P값 1 × 10^-6 미만의 유의 한계점에서 eGFR slope 와 관련된 SNP들을 검출했고, 이후 미국의 만성신질환 코호트 연구(CRIC)에서의 재현/검증 연구를 통해 연구의 신뢰도를 높였다. 결과적으로 발견연구 및 재현/검증 연구를 통해 전체 연구대상에서(즉, 당뇨 여부와 관계없이) rs28629773 이 eGFR 감소와 높은 유의적인 관련성이 확인되었고, 당뇨병성 신증에 의한 만성신장질환 환자군에서 rs74798667 이 eGFR 감소와 높은 유의적인 관련성이 확인되었으며, 비당뇨병성 만성신장질환 환자군에서 rs57966672 이 eGFR 감소와 높은 유의적인 관련성이 확인되었다.

본 발명의 조성물은 환자로부터 단리된 유전자 시료에 대하여, rs28629773, rs74798667 및 rs57966672 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 2 이상의 SNP 를 검출 또는 확인하기 위한 제제를 함유하는 것을 특징으로 한다.

SNP를 검출할 수 있는 제제는, 상기 SNP를 포함하는 10 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 프로브 또는 프라이머를 포함한다.

일예로, SNP를 검출할 수 있는 제제는, SNP를 포함하는 10 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 이들은 예를 들어, 10 내지 100개, 10 내지 90개, 10 내지 80개, 10 내지 70개, 10 내지 60개, 10 내지 50개, 10 내지 40개, 10 내지 30개, 10 내지 20개, 20 내지 100개, 20 내지 90개, 20 내지 80개, 20 내지 70개, 20 내지 60개, 20 내지 50개, 20 내지 40개, 20 내지 30개, 30 내지 100개, 30 내지 90개, 30 내지 80개, 30 내지 70개, 30 내지 60개, 30 내지 50개, 30 내지 40개, 40 내지 100개, 40 내지 90개, 40 내지 80개, 40 내지 70개, 40 내지 60개, 또는 40 내지 50개의 연속 염기로 구성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자가 적절히 결정할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열(polymorphic sequence)과 관련된다. 다형성 서열이란 뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 다형성 부위란 다형성 서열 중 SNP가 존재하는 부위를 말한다. 본 발명에 있어서 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다.

다른예로, 본원에서 SNP를 검출할 수 있는 제제는, SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 프로브 또는 프라이머일 수 있으며, 바람직하게, 이들은 대립유전자 특이적(allele-specific)이다.

대립유전자 특이적 프로브 또는 프라이머는 각 대립유전자에 특이적으로 혼성화할 수는 프로브 또는 프라이머를 말한다. 즉, 다형성 서열 중에 존재하는 다형성 부위의 염기를 특이적으로 구별할 수 있도록 혼성화하는 것을 말한다. 여기에서, 혼성화 조건은 대립형질 간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여 특정 대립유전자에만 혼성화되도록 충분히 엄격해야 한다. 혼성화에 적합한 조건은 당업계에 통상적으로 알려진 내용을 참조하여 결정할 수 있으며, 온도, 이온 세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

본 발명에 용어, "프로브"란 특정 핵산에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 단편을 의미한다. 프로브는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편일 수 있으며, 표지(Labelling)되어 있어서 특정 핵산의 존재 유무를 확인 할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본원의 프로브는 SNP를 포함하는 서열에 완전하게 또는 부분적으로 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 (substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 본 발명에서는 본 발명의 SNP 를 포함하는 부위와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 SNP를 확인할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명에 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 프라이머는 통상 7개 내지 50개 또는 15 내지 30개의 염기로 구성될 수 있으나, 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 SNP를 포함하는 서열에 혼성화하여 다형성 부위를 포함하는 DNA 단편을 증폭시켜 이를 검출하는데 사용할 수 있다.

프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 또는 2 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명에서는 rs28629773 의 SNP 유전자형이 G 인 것으로 확인 내지 검출되는 경우 만성신장질환이 악화될 위험성이 높은 것으로 예측할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 rs74798667 의 SNP 유전자형이 C인 것으로 확인 내지 검출되는 경우 만성신장질환, 특히 당뇨병성 신증에 의한 만성신장질환이 악화될 위험성이 높은 것으로 예측할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 rs57966672 의 SNP 유전자형이 A인 것으로 확인 내지 검출되는 경우 만성신장질환, 특히 비당뇨병성 만성신장질환이 악화될 위험성이 높은 것으로 예측할 수 있다.

본 발명에서 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이(microarray) 칩, 또는 미세유체 칩 (microfluidic chip) 키트일 수 있다. 본 발명의 키트는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

일예로, 본 발명의 키트는 PCR 키트일 수 있다. 바람직하게는 실시간 PCR (RT-PCR) 키트일 수 있다. 이러한 키트는 PCR, 예컨대 실시간 PCR (RT-PCR)을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 SNP 부위를 포함하는 핵산을 증폭할 수 있는 각각의 프라이머 쌍, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 추가로 포함할 수 있다.

다른예로, 본 발명의 키트는 DNA 칩 키트일 수 있다. 바람직하게는 마이크로어레이 칩 또는 미세유체 칩 키트일 수 있다. 이러한 키트는 상기 SNP 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 프로브 또는 프라이머가 고정화되어 있는 기판을 포함할 수 있다.

마이크로어레이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어질 수 있다. 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

마이크로어레이는 기판 상에 미세-포인팅(fine-pointed) 핀을 이용하는 인쇄, 사전 제작한 마스크를 이용하는 포토리소그래피, 동적 마이크로미러 장치를 이용하는 포토리소그래피, 잉크젯 인쇄 또는 마이크로전극 어레이 상에서의 전기 화학을 포함하는 다양한 기법을 이용하여 제작될 수 있다. 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-Llysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로스막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

미세유체 칩은 미세유체 제어 기술을 이용하여 유체샘플에 포함되어 있는 분석 대상 물질을 칩 위에 있는 생체물질, 세포, 조직 또는 검출 장치와의 상호작용을 측정 및 분석하는 미소유체 장치로서, 프로브/표적 혼성화, 핵산 증폭, 및 모세관 전기영동 반응과 같은 과정을 소형화 및 구획화하여 포함할 수 있다.

본 발명의 SNP 의 유전자형의 검출에는 서열분석(sequencing), 마이크로어레이 등에 의한 혼성화 분석, PCR 을 이용한 증폭 등이 사용될 수 있다. 예를 들어, 시퀀싱, 미니-시퀀싱, 자동시퀀싱, TaqMan 분석, 파이로시퀀싱, 대립 유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allelespecifichybridization, DASH), PCR-RELP (restriction fragment length polymorphism), PCR-SSCP (single strand conformation polymorphism), PCR-SSO (specific sequence oligonucleotide), 마이크로어레이에 의한 혼성화, 프라이머 신장, 서던 블롯 혼성화, 도트 혼성화, PCR-SSO과 도트 하이브리드화를 조합한 ASO (allele specific oligonucleotide) 혼성화, RCA (rolling circle amplification), HRM (high resolution melting), 또는 MALDI-TOF/MS (matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry) 등의 공지의 방법이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 양태로, 본 발명은 만성신장질환을 예측하는 방법으로서, (i) 만성신장질환 환자의 시료로부터 rs28629773, rs74798667 및 rs57966672 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 2 이상의 단일염기다형성(SNP)을 검출하는 단계, 및 (ii) 상기 (i) 단계에서 검출된 단일염기다형성(SNP)의 서열을 확인하는 단계를 포함하고, rs28629773 의 SNP 유전자형이 G 인 것으로 확인되거나, rs74798667 의 SNP 유전자형이 C인 것으로 확인되거나, 또는 rs57966672 의 SNP 유전자형이 A인 것으로 확인되는 경우, 만성신장질환이 악화될 위험성이 높은 것으로 예측되는 것인, 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "시료"란 피검자로부터 분리된 생물학적 물질을 말한다. 시료는 원하는 SNP를 검출할 수 있는 모든 생물학적 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 시료는 유전적 물질, 예를 들면, DNA, 게놈 DNA (genomic DNA), 상보적 DNA (cDNA), RNA, 이형핵 RNA(heterogeneous nuclear RNA: hnRNA), mRNA 등을 포함할 수 있다. 이러한 시료는 세포, 조직, 혈액(전혈, 혈청, 또는 혈장), 타액, 체모, 구강점막, 눈물, 객담 또는 뇨 등으로부터 분리될 수 있으며, 시료의 분리 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.

먼저, 만성신장질환 환자의 시료로부터 게놈 DNA의 수득은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.

SNP 의 유전자형의 검출은 서열분석(sequencing), 마이크로어레이 등에 의한 혼성화 분석, PCR 을 이용한 증폭 등이 사용될 수 있다. 예를 들어, 시퀀싱, 미니-시퀀싱, 자동시퀀싱, TaqMan 분석, 파이로시퀀싱, 대립 유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allelespecifichybridization, DASH), PCR-RELP (restriction fragment length polymorphism), PCR-SSCP (single strand conformation polymorphism), PCR-SSO (specific sequence oligonucleotide), 마이크로어레이에 의한 혼성화, 프라이머 신장, 서던 블롯 혼성화, 도트 혼성화, PCR-SSO과 도트 하이브리드화를 조합한 ASO (allele specific oligonucleotide) 혼성화, RCA (rolling circle amplification), HRM (high resolution melting), 또는 MALDI-TOF/MS (matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry) 등의 공지의 방법에 의해 수행될 수 있다.

상기 방법은 환자의 시료에서 검출된 SNP 를 만성신장질환이 신속하게 진행된 환자의 SNP 대조군, 또는 만성신장질환이 느리게 진행되거나 또는 악화되지 않은 환자의 SNP 대조군과 비교하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 예를 들어, 환자의 시료에서 검출된 SNP가 만성신장질환이 신속하게 진행된 환자의 SNP 대조군과 동일한 유전형을 나타내는 경우, 해당 환자는 만성신장질환이 악화될 위험이 높은 환자로 판단될 수 있고, 상기 대조군과 동일한 유전형을 나타내지 않는 경우 만성신장질환이 악화될 위험이 낮은 것으로 판단될 수 있다. 또는, 환자의 시료에서 검출된 SNP가 만성신장질환이 느리게 진행된 또는 악화되지 않은 환자의 SNP 대조군과 비교하여 동일한 유전형을 나타내는 경우 해당 환자는 만성신장질환이 악화될 위험이 낮은 것으로 판단될 수 있고, 상기 대조군과 동일한 유전형을 나타내지 않는 경우 해당 환자는 만성신장질환이 악화될 위험이 높은 환자로 판단될 수 있다.

바람직하게, 상기 방법은 rs28629773 의 SNP 유전자형이 G 인 것으로 확인되거나, rs74798667 의 SNP 유전자형이 C인 것으로 확인되거나, 또는 rs57966672 의 SNP 유전자형이 A인 것으로 확인되는 경우, 만성신장질환이 악화될 위험성이 높은 것으로 예측하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.

따라서, 상기 본 발명에 따를 경우, 전술한 특정 SNP 의 존재를 검출함으로써 만성신장질환의 악화 예측에 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 연구대상

본 연구는 2011년 3월 질병관리본부의 학술용역과제에서 출범된 만성신장질환 코호트(KoreaN cohort study for Outcome in patients With Chronic Kidney Disease, KNOW-CKD)에서의 2118명의 샘플과, 조직검사상 당뇨병성 신증으로 확인된 만성신장질환 환자 188명의 샘플 (서울대학교병원 인체자원은행에서 91개 샘플, 경희의료원에서 97개 샘플)을 포함하여, 총 2,306개의 만성신장질환자 샘플을 수집하였다. KNOW-CKD는 만성신장질환으로 진단된 1기부터 투석을 아직 시행하지 않은 (Predialysis) 5기의 환자까지, 만성신장질환의 1기~5기 전체를 아우르는 20~75세의 성인 환자 총 2,388명에 대한 다기관 전향적 관찰 연구를 위한 코호트이며, 본 연구에서는 이로부터 2118명 환자의 혈액 샘플을 수집하였다.

총 2,045개의 샘플이 품질관리(QC) 검사를 통과하였는데, 그 중 상염색체 우성 다낭신을 가진 273명의 환자와, 추정 사구체 여과율 기울기(eGFR slope)를 계산할 수 없는 34명의 환자를 제외하고, 총 1,738명의 환자를 발견 코호트(discovery cohort)를 하였다. 모든 환자로부터 동의서와 혈액 샘플을 받았고 서울대학교병원 의학연구윤리심의위원회로부터 연구를 승인받았다.

실시예 2. 유전형분석(Genotyping) 및 품질 관리(Quality control, QC)

연구대상 환자의 전혈 샘플을 에틸렌디아민테트라아세트산 튜브에 수집하고 이로부터 분리한 말초혈액 백혈구로부터 게놈 DNA 를 추출하였다. 국립보건연구원 유전체 센터에서 개발한 한국인칩 (K-CHIP; Affymetrix Axiom KORV1.1, Santa Clara, CA, USA)을 K-CHIP 컨소시엄으로부터 제공받아 이를 이용하여 유전자형 데이터를 생산하였다.

품질 관리(QC)는 한국인칩 프로토콜에 의하여 1,2차 샘플 QC와 SNP QC를 수행하였다. 1차 샘플 QC에서 다음의 기준으로 샘플이 제외되었다: (i) DQC (dish quality control) 0.82 미만, (ii) call rate 97% 미만, (iii) 결측률(missing call rate) 2% 이상, (iv) 이형접합성(heterozygosity)이 Mean ± 3SD에서 벗어나는 경우, (v) 다차원 축적법(MDS) 그림에서 패턴에서 벗어난 경우, (vi) singletone 15개 이상. 이후 2차 샘플 QC를 진행하였으며 기준은 다음과 같다: (i) DQC (dish quality control) 0.82 미만, (ii) call rate 97% 미만, (iii) 결측률(missing call rate) 2% 이상, (iv) 이형접합성(heterozygosity)이 Mean ± 3SD에서 벗어나는 경우, (v) MDS plot에서 패턴에서 벗어난 경우, (vi) singletone 15개 이상, (vii) 연관된 개인 (직계동형(identical-by-descent) > 0.8), (viii) 성별 불일치(sex inconsistence).

이후 다음의 SNPs 은 제외하였다: (i) 결측률(missing call rate) 5% 이상, 및 (ii) P 값(하디-바인베르크 평형 테스트) 10^-6 미만.

그 결과 745,176개의 상염색체 SNP가 확인되었으며, Minimac3 를 이용하여 1000 게놈 프로젝트 phase 3 의 기준 패널로 대치하고 Shapeit_v2.12 를 이용하여 위상을 조절하였다. 최종적으로, 결측값 대체(imputation) QC 후, 0.7 미만의 결정계수(R²)와 0.01 미만의 복대립유전자빈도를 가진 SNP 를 제외한 7,734,192 SNPs를 분석에 사용하였다.

실시예 3. 통계 분석

환자군은 당뇨병 여부에 의하여 전체/당뇨/비당뇨군으로 나누어 연구집단의 기저 특성에 대한 기술통계를 계산하였다. 결과는 평균(표준편차) 또는 숫자와 백분율(%)로 표시하였다. eGFR 은 4 변수 CKD-EPI(Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration) 공식을 사용하여 계산하였다. 일차 결과지표(primary outcome)는 추정 사구체 여과율 기울기(eGFR slope)였다. 무작위 절편(random intercept)을 가진 선형혼합모형 (linear mixed model)을 이용하여 eGFR slope 를 계산하였다.

eGFR slope 와 관련된 유전자 자리(genetic loci)를 찾기 위하여, 부가 모델을 이용하여 연령과 성별을 보정한 후 다변량 선형 회귀 분석을 수행하였다. 통계 분석에는 PLINK (version 2.0)를 사용하였다. R 통계 소프트웨어 패키지 version 3.6.2 (R Development Core Team; R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria) 을 사용하여 Manhattan plot 과 Q-Q (quantile-quantile) plot을 그렸다. 각 SNP의 Annotation 은 ANNOVAR 를 이용하여 수행하였고, 미국 국립보건원의 LDassoc 을 이용하여 regional plot 을 그렸다. 중요한 SNP는 p 값 10^-6 미만으로 선택하였다. 0.05 미만의 p값을 이용하여 유효성을 분석하였다. 메타분석에서 고정효과모델을 사용하여 p 값을 결합하였다.

실시예 4. 재현 및 검증 연구

재현(replication)라는 용어는 유사한 상황의 독립적인 샘플에서 확인 연구를 수행할 때 사용된다. 재현 연구는 미국의 만성신장질환 코호트(Chronic Renal Insufficiency Cohort, CRIC)에서 시행하였다. 총 2,498명의 CRIC 코호트 환자를 인종(백인과 흑인)과 당뇨병 상태(당뇨 있음 또는 당뇨 없음)에 따라 분석하였다.

실험결과

1. 연구대상자들의 특성

발견 코호트의 임상적 및 인구통계학적 특성을 표 2에 정리하였다. 총 1,738명의 환자 시료가 이 연구에서 분석되었다. 평균 연령은 54.9세이며, 환자의 63.3%가 남성이었다. 또한 44.3%가 당뇨병 환자이며, 96.3%가 고혈압이 있었다. 평균 eGFR은 48.9 ± 28.5 mL/min/1.73 m²이었다. 환자들을 당뇨병 그룹과 비-당뇨병 그룹으로 나누었으며, 당뇨병 환자들은 비당뇨 환자에 비하여 나이가 더 많고 수축기 혈압, 체질량지수 및 단백뇨 수준이 더 높고, 헤모글로빈과 알부민 수준은 낮았다. 당뇨병 환자들은 당뇨병이 아닌 그룹의 환자에 비해 낮은 eGFR과 가파른 eGFR 감소를 보였다.

발견 코호트의 특성

	전체 N=1738	당뇨병 그룹 N=771	비-당뇨병 그룹 N=967	P
연령(at baseline)	54.9 (12.1)	58.1 (10.6)	52.4 (12.7)	<0.001
성별 (남성)	1101 (63.3%)	517 (67.1%)	584(60.4%)	0.004
고혈압 (%)	1674 (96.3%)	730 (94.7%)	944 (97.6%)	0.001
수축기 혈압 (mmHg)	127.7 (17.7)	131.9 (20.3)	124.8 (14.9)	<0.001
확장기 혈압 (mmHg)	76.3 (11.7)	76.1 (13.1)	76.6 (10.7)	0.416
체질량지수 (kg/m²)	24.7 (6.0)	25.4 (7.8)	24.1 (4.0)	<0.001
백혈구(/mm3)	6529.8 (2320.0)	6551.4 (2649.1)	6512.6 (2020.8)	0.737
헤모글로빈 (g/dL)	12.5 (3.5)	12.0 (4.3)	13.0 (2.5)	<0.001
알부민 (mg/dL)	4.0 (0.6)	3.9 (0.7)	4.2 (0.5)	<0.001
24-h 요단백(g)	1.8 (2.5)	2.6 (3.2)	1.1 (1.5)	<0.001
eGFR (ml/min/1.73m²)	48.9 (28.5)	42.0 (25.3)	54.4 (29.8)	<0.001
eGFR 기울기	-2.1 (2.1)	-2.5(2.1)	-1.7 (1.9)	<0.001
추적기간 (년)	3.3 (1.8)	2.8 (1.7)	3.7 (1.7)	<0.001

eGFR 감소와 연관된 유의한 SNP들

발견 연구에서 전체, 당뇨병 그룹 및 비-당뇨병 그룹에서의 eGFR 감소에 관한 전장유전체연관분석 결과를 맨하탄 plot 으로 나타내었다 (도 1). 그 결과 전체, 당뇨병 그룹 및 비-당뇨병 그룹에서 각각 p값 10^-6 미만의 유의성으로 eGFR 기울기와 관련된 총 85개의 SNP 들이 확인되었다(SNP 전체그룹에서 18개, 당뇨 그룹에서 40개, 비당뇨 그룹에서 27개).

재현 연구 결과

총 2,498명의 CRIC 코호트 환자 (당뇨 환자 1339명 및 비당뇨 환자 1159명)를 대상으로 한 재현 연구 결과, 21개 SNP 가 재현되었다(SNP 전체그룹에서 4개, 당뇨 그룹에서 1개, 비당뇨 그룹에서 16개). 그 중에서 SNP 전체그룹에서 rs28629773 (FAT1 유전자와 LINC02374 유전자 사이에 위치함)가 eGFR 감소와 유의성이 매우 높은 것으로 확인되었고, 당뇨병 그룹에서 rs74798667 (ADGRV1 유전자에 위치함)가 eGFR 감소와 유의성이 매우 높은 것으로 확인되었고, 비당뇨병 그룹에서 rs57966672 (TPPP 유전자에 위치함)가 eGFR 감소와 유의성이 매우 높은 것으로 확인되었다 (표 3).

rsID	염색체 위치	근접한 유전자	대립 유전자 (allele)	발견연구			재현연구				결합 (combined)
rsID	염색체 위치	근접한 유전자	대립 유전자 (allele)	EAF	beta (SE)	p	그룹	EAF	beta (SE)	p	p
rs28629773	4q35.2	FAT1, LINC02374	G/C	0.46	0.37 (0.07)	6.20 x 10^-7	AA	0.38	0.20 (0.10)	0.04	1.89 x 10^-7
rs74798667	5q14.3	ADGRV1	T/C	0.03	-1.90 (0.32)	7.01 x 10^-9	AA	0.002	-13.16 (5.28)	0.01	1.99 x 10^-9
rs57966672	5p15.33	TPPP	G/A	0.07	-0.90 (0.18)	7.09 x 10^-7	EA	0.11	-0.31 (0.10)	2.23x 10^-3	2.97 x 10^-7

약어설명: SE, 표준오차; AA, 아프리카계 미국인; EA, 유럽계 미국인; EAF, effect allele frequency또한, 도 2a 및 2b는 재현 또는 검증 연구에서 eGFR 감소와 높은 유의적인 관련성이 확인된 rs28629773 의 유전자 자리의 Regional plot을 나타내고, 도 3a 및 3b는 재현 또는 검증 연구에서 eGFR 감소와 높은 유의적인 관련성이 확인된 rs74798667 의 유전자 자리의 Regional plot을 나타내고, 도 4a 및 4b는 재현 또는 검증 연구에서 eGFR 감소와 높은 유의적인 관련성이 확인된 rs57966672 의 유전자 자리의 Regional plot을 나타낸다.

이와 같이 rs28629773 는 당뇨병 여부와 관계없이 전체 연구대상에서 eGFR 감소와 유의성이 매우 높은 것으로 확인되었으므로 당뇨병 여부와 관계없이 만성신장질환의 악화 예측용 마커로 유용하게 활용될 수 있다. rs74798667 는 당뇨병 그룹에서 eGFR 감소와 유의성이 매우 높은 것으로 확인되었으므로 만성신장질환, 특히 당뇨병성 신증에 의한 만성신장질환의 악화 예측용 마커로 유용하게 활용될 수 있다. rs57966672 는 비당뇨병 그룹에서 eGFR 감소와 유의성이 매우 높은 것으로 확인되었으므로 만성신장질환, 특히 비당뇨병성 만성신장질환의 악화 예측용 마커로 유용하게 활용될 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

rs28629773, rs74798667 및 rs57966672 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 2 이상의 단일염기다형성(SNP)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 만성신장질환의 악화 예측용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 SNP를 검출할 수 있는 제제는,

상기 SNP를 포함하는 10 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 또는

상기 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 프로브 또는 프라이머인, 조성물.
rs28629773, rs74798667 및 rs57966672 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 2 이상의 단일염기다형성(SNP)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 만성신장질환의 악화 예측용 키트.
제3항에 있어서, 상기 SNP를 검출할 수 있는 제제는,

상기 SNP를 포함하는 10 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 또는

상기 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 프로브 또는 프라이머인, 키트.
제3항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 또는 미세유체 칩인, 키트.
만성신장질환을 예측하는 방법으로서,

(i) 만성신장질환 환자의 시료로부터 rs28629773, rs74798667 및 rs57966672 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 2 이상의 단일염기다형성(SNP)을 검출하는 단계, 및

(ii) 상기 (i) 단계에서 검출된 단일염기다형성(SNP)의 서열을 확인하는 단계를 포함하고,

rs28629773 의 SNP 유전자형이 G 인 것으로 확인되거나, rs74798667 의 SNP 유전자형이 C인 것으로 확인되거나, 또는 rs57966672 의 SNP 유전자형이 A인 것으로 확인되는 경우, 만성신장질환이 악화될 위험성이 높은 것으로 예측되는 것인, 방법.
제6항에 있어서,

단일염기다형성(SNP)의 검출은,

상기 SNP를 포함하는 10 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 또는

상기 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 프로브 또는 프라이머를 이용하는 것인, 방법.