WO2022075474A1 - 免疫・炎症性疾患の治療薬 - Google Patents

免疫・炎症性疾患の治療薬 Download PDF

Info

Publication number
WO2022075474A1
WO2022075474A1 PCT/JP2021/037471 JP2021037471W WO2022075474A1 WO 2022075474 A1 WO2022075474 A1 WO 2022075474A1 JP 2021037471 W JP2021037471 W JP 2021037471W WO 2022075474 A1 WO2022075474 A1 WO 2022075474A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
cells
tigit
seq
amino acid
Prior art date
Application number
PCT/JP2021/037471
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
勤 竹内
昭彦 吉村
勝也 鈴木
勝 竹下
希典 児島
義明 葛西
拓 紅露
敬子 関谷
智樹 吉原
竜太郎 安達
Original Assignee
学校法人慶應義塾
武田薬品工業株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 学校法人慶應義塾, 武田薬品工業株式会社 filed Critical 学校法人慶應義塾
Priority to CN202180069100.8A priority Critical patent/CN116406292A/zh
Priority to EP21877773.8A priority patent/EP4226943A1/en
Priority to JP2022555605A priority patent/JPWO2022075474A1/ja
Priority to US18/030,901 priority patent/US20230374128A1/en
Publication of WO2022075474A1 publication Critical patent/WO2022075474A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for immune / inflammatory diseases, including an antibody against human TIGIT.
  • the present invention also relates to an anti-human TIGIT antibody having a specific primary structure and the like, which may have therapeutic activity for immune / inflammatory diseases.
  • the immune checkpoint protein is a factor that prevents the onset of immune and inflammatory diseases due to abnormal activation of the immune system, and is PD-1 (Programmed cell death protein 1, also known as CD279) and PD-L1 (Programmed cell death ligand).
  • PD-1 Programmed cell death protein 1, also known as CD279
  • PD-L1 Programmed cell death ligand
  • Major molecules include PD-L2 (Programmed cell death ligand 2, also known as B7-DC / CD273) and CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4, also known as CD152). Is known to be.
  • TIGIT T-cell immunoreceptor with immunoglobulin and ITIM domains, also known as zB7R1
  • TIGIT is a natural killer (NK) cell, cytotoxic T cell (CTL), memory T cell, regulatory T cell (Treg cell), follicular helper cell (Tfh cell). It is an immune checkpoint receptor present in such cells.
  • CTL and NK cells the interaction of TIGIT with either of its two ligands, CD155 (PVR) or CD112 (Nectin2), suppresses immune activation, whereas TIGIT expression in Treg is , It is known that the interaction enhances the ability to suppress the immune response.
  • the immunosuppressive effect of binding TIGIT to CD155 or CD112 results from competitive inhibition of the immunosuppressive receptor CD226 expressed on cytotoxic T cells and NK cells and the same ligand (ie, CD155 and CD112 ligands). ..
  • Patent Document 1 Focusing on signal transduction via TIGIT, a method for treating immune / inflammatory diseases through suppression of TIGIT-positive T cell function by an agonist or anti-TIGIT agoistic antibody against TIGIT has been reported (Patent Document 1). 2). However, there is no approved drug containing an anti-TIGIT agonistic antibody so far, and it is desired to create an anti-TIGIT antibody having excellent therapeutic effect, safety and the like.
  • the present invention provides an anti-human TIGIT agonistic antibody that has the ability to bind to human TIGIT and can enhance the signal mediated by the TIGIT, and also comprises a novel immune / inflammatory antibody to human TIGIT.
  • the subject is to provide a therapeutic drug for sexual diseases.
  • TIGIT expression level is increased in patients with rheumatoid arthritis while conducting research on the search for drug discovery targets based on the elucidation of the onset mechanism of immune diseases.
  • Tfh cells, peripheral helper T cells (peripheral T; Tph cells), and Treg cells which have high TIGIT expression levels even in healthy subjects, have significantly high TIGIT expression levels in diseases.
  • Tph cells peripheral helper T cells
  • Treg cells which have high TIGIT expression levels even in healthy subjects
  • the present invention provides the following.
  • a therapeutic agent for immune and inflammatory diseases containing an anti-human TIGIT antibody that activates an inhibitory immune checkpoint molecule (TIGIT) as an active ingredient.
  • a method for treating an immune / inflammatory disease in a mammal which comprises administering an effective amount of an anti-human TIGIT antibody that activates an inhibitory immune checkpoint molecule (TIGIT) to the mammal.
  • An anti-human TIGIT antibody that activates inhibitory immune checkpoint molecules (TIGIT) for use in the treatment of immune and inflammatory diseases.
  • the therapeutic agent according to [1] which has a Tfh cell inhibitory effect.
  • Tfh cells which comprises an anti-human TIGIT antibody that activates an inhibitory immune checkpoint molecule (TIGIT).
  • TIGIT inhibitory immune checkpoint molecule
  • An activator of Treg cells comprising an anti-human TIGIT antibody that activates an inhibitory immune checkpoint molecule (TIGIT).
  • Immune and inflammatory diseases are rheumatoid arthritis, systemic erythematosus, Sjogren's syndrome, systemic scleroderma, polymyositis, dermatomyositis, IgG4-related diseases, hyperan arteritis, giant cell arteritis, nodular polyarteritis, ANCA Related vasculitis, mixed connective tissue disease, spondyloarthritis, Bechet's disease, adult Still's disease, polysclerosis, optic neuromyositis, severe myasthenia, primary biliary cirrhosis, non-alcoholic fatty liver disease, primary Sclerosing cholangitis, autoimmune hepatitis, ulcerative colitis, Crohn's disease, psoriasis (psoriasis arthritis), leukoplakia vulgaris, vesicular vesicular alopecia, idiopathic dilated cardiomyopathy, type 1 diabetes
  • the therapeutic agent according to any one of [1] to [4], wherein the anti-human TIGIT antibody is an antibody that binds to human TIGIT (SEQ ID NO: 1).
  • the antibody a) contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 in the third CDR of the heavy chain variable region and b) The third CDR of the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • Antibodies a) Heavy chain variable region containing: i) A first CDR comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; ii) A second CDR comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and b) a light chain variable region comprising: i) A first CDR comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5; ii) A second CDR containing the amino acid sequence of tyrosine-alanine-serin;
  • the therapeutic agent according to [5] or [6] which comprises.
  • the therapeutic agent according to [8], wherein the Fc domain is of human origin.
  • a) The third CDR of the heavy chain variable region contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and b) The third CDR of the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • antibody [12] The antibody according to [11], which binds to human TIGIT (SEQ ID NO: 1).
  • a) Heavy chain variable region including: i) A first CDR comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; ii) A second CDR comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and b) a light chain variable region comprising: i) A first CDR comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5; ii) A second CDR containing the amino acid sequence of tyrosine-alanine-serin; The antibody according to [11] or [12]. [14] The antibody according to any one of [11] to [13], further comprising an Fc domain. [15] The antibody according to [14], wherein the Fc domain is of human origin.
  • [16] The antibody according to [14] or [15], wherein the Fc domain is a mutant Fc domain.
  • a host cell comprising the isolated nucleic acid according to [17].
  • an antibody that binds to human TIGIT is provided. Since the antibody can be a therapeutic agent for immune / inflammatory diseases, the present invention is useful for the treatment of immune / inflammatory diseases using the therapeutic agent.
  • the measurement result of the antibody titer in the antiserum of the mouse immunized with the recombinant human TIGIT-His-mFc protein is shown.
  • the vertical axis of each graph shows the median fluorescence intensity.
  • the horizontal axis of each graph indicates log [plasma dilution].
  • the horizontal axis of each graph shows CD3 / PVR0, CD3 / PVR0.075, CD3 / PVR0.025, CD3 / PVR0.75, and CD3 / PVR2.5 in order from the left.
  • a It is a figure which showed how the TIGIT expression changes by a stimulus in the cell which originally has a low expression of TIGIT (CD4 + naive T cell) and the cell which has a high expression of TIGIT (Tfh cell).
  • b It is a figure showing that stimulation with an anti-TIGIT agoistic antibody suppresses the proliferation of Tfh cells.
  • a It is a figure which shows the time-dependent change of TIGIT expression by activation stimulation in Tfh cell, non-Tfh cell and CD4 + naive T cell.
  • Non-Tfh cells showed intermediate levels of TIGIT expression between Tfh cells and naive T cells.
  • Tfh cells It is a figure showing that stimulation with an anti-TIGIT aggressive antibody suppresses the proliferation of Tfh cells and non-Tfh cells, but the inhibitory effect is more remarkable on Tfh cells. It is a figure showing that stimulation of Tfh cells by an anti-TIGIT antagonist antibody suppresses B cell activation mediated by Tfh cells.
  • the stimulation of B cells from Tfh cells is evaluated by the ratio of plasma cells and the IgG concentration in the culture supernatant. It is shown as a relative value when the absolute value and the isotype result are set to 100. It is a figure which shows that the stimulation to Treg cells by an anti-TIGIT antagonist antibody suppressed the cell proliferation of Effector T cells.
  • the boxplot of each data shows the non-coated group, the anti-TIGIT coated group, and the isotype coated group in order from the left. *: p ⁇ 0.05 It is a figure which showed the effect which the administration of the anti-TIGIT agonistic antibody had on the immune response of the imiquimod-induced lupus model mouse. From the top left, the proportion of CD69 + (activated) T cells in the CD4 + T cells in the spleen, the proportion of CD4 + Effector memory T (Tem) cells and Tfh cells in the CD4 + T cells, and the germinal center (GC) in the B220 + cells.
  • the procedure was performed on 6 animals per group, and clinical scores were shown in chronological order for the isotype-administered group and the anti-TIGIT-agonistic antibody-administered group. It is a figure showing that Treg cells in the brain, spinal cord, and spleen of EAE mice proliferate by administration of an anti-TIGIT antagonist antibody.
  • the procedure was performed on 3 animals in 1 group, and the cells in the brain, spinal cord, and spleen were stained in each of the isotype-administered group and the anti-TIGIT-agonistic antibody-administered group, and the proportions of Treg cells were compared.
  • the boxplot of each data shows the anti-TIGIT application group and the isotype application group in order from the left.
  • an antibody or fragment thereof that binds to human TIGIT The present invention provides an antibody or fragment thereof that has a complementarity determining region (CDR) containing a specific sequence and binds to human TIGIT.
  • CDR complementarity determining region
  • the term “antibody of the present invention” will be used as an inclusion of the above antibody and a fragment thereof.
  • the antibody of the present invention may be isolated.
  • isolated means that a specific component (eg, the antibody of the invention, a nucleic acid encoding the antibody, etc.) is identified and separated from a component in its natural environment (eg, cells, etc.). It means that it has been or has been recovered.
  • the antibody of the present invention has a third CDR (also referred to as CDR3) of a heavy chain variable region containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and a third CDR of the light chain variable region containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6. Includes CDR. Further, in one embodiment, the antibody of the present invention has i) the first CDR (also referred to as CDR1) of the heavy chain variable region containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and ii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • Heavy chain variable region second CDR (also referred to as CDR2) containing, and iii) light chain variable region first CDR containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 and iv) tyrosine-alanine-serine (YAS).
  • CDR2 Heavy chain variable region 2 CDR
  • YAS tyrosine-alanine-serine
  • the light chain variable region containing CDRs 1 to 3 shown in SEQ ID NO: 5, YAS and SEQ ID NO: 6, one containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 can be mentioned, and the light chain variable region includes this light chain variable region. It is not limited to those including sequences.
  • Anti-human TIGIT Agonystic antibody-containing therapeutic agent for immune / inflammatory diseases containing an anti-human TIGIT antibody that activates human TIGIT, which is an inhibitory immune checkpoint molecule, as an active ingredient.
  • therapeutic agent of the present invention One aspect of an antibody that is the active ingredient of the therapeutic agent of the present invention is an antibody or fragment thereof having a complementarity determining region (CDR) containing a specific sequence and binding to human TIGIT.
  • CDR complementarity determining region
  • the term “anti-human TIGIT agonistic antibody” will be used to include the above-mentioned antibody, which is the active ingredient of the present invention, and a fragment thereof.
  • the anti-human TIGIT aggressive antibody has an inhibitory effect on follicular helper T (Tfh) cells (hereinafter, may be referred to as “Tfh cell inhibitory effect”), and therefore Tfh. It has a therapeutic effect on immune and inflammatory diseases caused by cell activation. Furthermore, the anti-human TIGIT agonistic antibody has an activating effect on Treg cells (hereinafter, may be referred to as "Treg cell activating effect"). Therefore, in another aspect of the present invention, a method for suppressing Tfh cells, which comprises a step of contacting a Tfh cell inhibitor containing an anti-human TIGIT agonistic antibody or an anti-human TIGIT agonistic antibody with Tfh cells.
  • a method for activating Treg cells which comprises a step of contacting a Treg cell activator, which comprises an anti-human TIGIT agonistic antibody, or an anti-human TIGIT agonistic antibody, with the Treg cells. Will be done.
  • immune / inflammatory disease means a disease associated with inflammation due to the breakdown of immune tolerance.
  • immune / inflammatory diseases include rheumatoid arthritis, systemic elitematodes, Schegren's syndrome, systemic scleroderma, polymyositis, dermatomyositis, IgG4-related diseases, and hyperan arteritis.
  • Giant cell arteritis nodular polyarteritis, ANCA-related vasculitis, mixed connective tissue disease, spondyloarthritis, Bechet's disease, adult Still disease, polysclerosis, optic neuromyositis, severe myasthenia, primary Bile liver cirrhosis, non-alcoholic fatty liver disease, primary sclerosing cholangitis, autoimmune hepatitis, ulcerative colitis, Crohn's disease, psoriasis (dermatomyositis), leukoplakia vulgaris, bullous dermatomyositis, round Alopecia, idiopathic dilated myocardial disease, type 1 diabetes, Basedou disease, Hashimoto disease, IgA nephropathy, membranous nephropathy, hemolytic anemia, idiopathic thrombocytopenic purpura.
  • the administration target of the therapeutic agent of the present invention examples include primate animals, and examples of such primate animals include fox monkeys, loris, tsubai, monkeys (eg, cynomolgus monkeys, etc.), and humans. It is preferably human. Therefore, the present invention also includes a therapeutic method for administering an effective amount of an anti-human TIGIT agonistic antibody or a therapeutic agent of the present invention to the primate animal.
  • the "Tfh cell inhibitory action” includes both the Tfh cell proliferation inhibitory action and the Tfh cell function inhibitory action.
  • Tfh cell functions include B cell maturation and activation, and antibody production promoting effect.
  • the "Treg cell activating action” includes both the Treg cell proliferation promoting action and the Treg cell function activating action.
  • the functions of such Treg cells include, for example, suppression of autoimmune response through suppression of effector T cells, and suppression of excessive inflammation through secretion of anti-inflammatory cytokines such as IL-10 and TGF ⁇ . Can be mentioned.
  • the anti-human TIGIT aggressive antibody comprises a third CDR (also referred to as CDR3) of a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 and a light chain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6. Includes a third CDR of the chain variable region.
  • the anti-human TIGIT agonistic antibody further comprises i) the first CDR (also referred to as CDR1) of the heavy chain variable region containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and ii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • the heavy chain variable region containing the second CDR (also referred to as CDR2), and iii) the first CDR of the light chain variable region containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 and iv) tyrosine-alanine-serine (YAS). It may contain a second CDR of the light chain variable region containing the indicated amino acid sequence.
  • CDR2 also referred to as CDR2
  • YAS tyrosine-alanine-serine
  • the light chain variable region containing CDRs 1 to 3 shown in SEQ ID NO: 5, YAS and SEQ ID NO: 6, one containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 can be mentioned, and the light chain variable region includes this light chain variable region. It is not limited to those including sequences.
  • the anti-human TIGIT agonistic antibody can activate TIGIT (in other words, exert agonist activity against TIGIT) by binding to TIGIT.
  • activating TIGIT is compared to or said to a control to which the antibody is not bound (including a group to which an antibody having no TIGIT activating effect is contacted). It means that the signal mediated by TIGIT is activated by binding the antibody as compared with before binding the antibody.
  • the "anti-human TIGIT agonistic antibody” is used by binding the antibody in comparison with a control to which the antibody is not bound, or in comparison with a control before binding the antibody. It means an antibody in which a signal mediated by TIGIT is activated.
  • TIGIT-mediated signal activation can be assessed by any of the methods known per se, such as the luciferase assay. Further, by such an evaluation method, anti-human TIGIT agoistic antibodies other than the antibodies containing the specific CDRs 1 to 3 described above can be screened.
  • the term "binding” means "having an ability to bind” and forms a non-covalent complex with one or more other molecules. Refers to ability.
  • Examples of the complex of the present invention include a complex of an anti-human TIGIT agonistic antibody and TIGIT.
  • the anti-human TIGIT agonistic antibody binds to a human TIGIT protein consisting of the amino acid sequence (NCBI Reference Sequence: NP_776160.2) shown in SEQ ID NO: 1.
  • the anti-human TIGIT aggressive antibody binds not only to the human TIGIT protein but also to the TIGIT of non-human primates (eg, cynomolgus monkeys), but to the rodents (eg, mice). Does not combine.
  • human TIGIT can be read as “primate TIGIT”.
  • the binding ability of such an antibody can be evaluated by any of the methods known per se, for example, by contacting TIGIT with the antibody and detecting or measuring the antibody bound to TIGIT.
  • the anti-human TIGIT agonistic antibody may be any antibody or fragment thereof as long as it contains CDR3 of the heavy chain variable region and CDR3 of the light chain variable region.
  • the class of the antibody is not particularly limited and may be any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgD, IgE and the like. IgG or IgM is preferable, and IgG is more preferable in consideration of easiness of purification and the like.
  • the antibody fragment contains CDR3 of the heavy chain variable region and CDR3 of the light chain variable region, and is not particularly limited as long as it binds to human TIGIT. For example, Fab, Fab'having the above CDR. , F (ab') 2 and other antibody fragments.
  • the anti-human TIGIT agonistic antibody has an Fc domain, such as a full-bodied antibody or an antibody in which a Fab region and an Fc domain are bound.
  • Fc domains may be wild-type or mutant.
  • the Fc domain of an antibody interacts with a number of Fc receptors and ligands to provide an important function called effector function.
  • Fc receptors include, but are not limited to: Fc ⁇ RI (CD64) containing isoforms Fc ⁇ RIa, Fc ⁇ RIb and Fc ⁇ RIc (in humans); isoforms Fc ⁇ RIIa (including allotypes H131 and R131), Fc ⁇ RIIb (Fc ⁇ RIIb).
  • Fc ⁇ RIIIa including allotypes V158 and F158, associated with antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC)
  • Fc ⁇ RIIIb allotype Fc ⁇ RIIIb-NA1
  • Suitable amino acid mutations can be made at one or more positions, as outlined below: for example, US Patent Application 11 / 841,654 and references cited therein, US2004 / 013210, US2005 / 0054832, US2006 / 0024298. , US2006 / 0121032, US2006 / 0235208, US2007 / 0148170.
  • non-CDR portion of the anti-human TIGIT agonistic antibody may consist of any amino acid sequence as long as it has agonist activity against TIGIT.
  • the non-CDR portion of the anti-human TIGIT agonistic antibody may consist of any amino acid sequence as long as it has agonist activity against TIGIT.
  • examples of such animals include mammals such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, dogs, monkeys, orangutans, chimpanzees, and humans, but are preferably derived from humans.
  • the anti-human TIGIT agonistic antibody can be genetically engineered using a nucleic acid or vector encoding the antibody or fragment thereof.
  • a nucleic acid encoding an anti-human TIGIT agonistic antibody can be introduced into a host cell to express the antibody or fragment thereof, and the antibody or fragment thereof can be isolated by a method known per se. Examples of such an isolation method include an affinity column using protein A or the like, other chromatography columns, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, and the like, and these methods may be appropriately combined.
  • the antibody fragment can also be prepared by treating the full-bodied antibody prepared above with an enzyme such as papain or pepsin.
  • nucleic acid encoding anti-human TIGIT agonistic antibody The present invention provides an isolated nucleic acid encoding the antibody of the present invention (hereinafter, may be referred to as "nucleic acid of the present invention").
  • the nucleic acid of the present invention includes a nucleic acid encoding a heavy chain and a light chain of the antibody of the present invention, a nucleic acid encoding a fragment of an antibody, and the like.
  • the nucleic acid encoding the antibody of the present invention, the anti-human TIGIT agonistic antibody or a fragment thereof may be DNA, RNA, or a DNA / RNA chimera, but is preferably DNA.
  • the nucleic acid may be double-stranded or single-stranded. In the case of double strand, it may be double-stranded DNA, double-stranded RNA or a hybrid of DNA: RNA.
  • the nucleic acid encoding the antibody or fragment thereof may contain a natural nucleotide, a modified nucleotide, a nucleotide analog, or a mixture thereof as long as the polypeptide can be expressed in vitro or in a cell.
  • the nucleic acid encoding the antibody or a fragment thereof can be constructed by a method known per se. For example, based on the amino acid sequence of the anti-human TIGIT agonistic antibody described in the sequence listing, a base sequence encoding the amino acid is designed, and a DNA chain is chemically synthesized or a partially overlapping oligo DNA synthesized. By connecting short chains using the PCR method or Gibson Assembly method, it is possible to construct DNA encoding the full length or part of the anti-human TIGIT agonistic antibody.
  • nucleic acid encoding the antibody or fragment thereof can be incorporated into an expression vector. Therefore, an expression vector containing any of the above-mentioned antibodies or nucleic acids encoding fragments thereof is provided.
  • the nucleic acid encoding the heavy chain of the antibody and the nucleic acid encoding the light chain of the antibody may be incorporated into separate expression vectors or may be incorporated into one expression vector.
  • these two nucleic acids may be integrated via sequences that allow polycistronic expression. By using a sequence that enables polycistronic expression, it becomes possible to more efficiently express multiple genes integrated into one type of expression vector.
  • Sequences that enable polycistronic expression include, for example, 2A sequences (eg, 2A sequences (F2A) derived from foot-and-mouth disease virus (FMDV), 2A sequences (E2A) derived from horse rhinitis A virus (ERAV), Porcine teschovirus (eg. 2A sequence derived from PTV-1) (P2A), 2A sequence derived from Thosea signa virus (TaV) (T2A sequence) (PLoS ONE 3, e2532, 2008, Stem Cells 25, 1707, 2007)), internal ribosome entry site ( IRES) (U.S. Patent No. 4,937,190) and the like.
  • 2A sequences eg, 2A sequences (F2A) derived from foot-and-mouth disease virus (FMDV), 2A sequences (E2A) derived from horse rhinitis A virus (ERAV), Porcine teschovirus (eg. 2A sequence derived from PTV-1) (P2A
  • Examples of the promoter used in the above vector include EF1 ⁇ promoter, CAG promoter, SR ⁇ promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, RSV (Rous sarcoma virus) promoter, and MoMuLV (Molony mouse leukemia virus).
  • LTR, HSV-TK (simple herpesvirus thymidin kinase) promoter, TCRV ⁇ gene promoter, TCRV ⁇ gene promoter, etc. are used.
  • the vector may contain, if desired, a transcriptional and translational regulatory sequence, a ribosome binding site, an enhancer, an origin of replication, a poly A addition signal, a selectable marker gene, and the like, in addition to the promoter.
  • a selectable marker gene include a dihydrofolate reductase gene, a neomycin resistance gene, a puromycin resistance gene, and the like.
  • an expression vector containing the nucleic acid encoding the heavy chain of the nucleic acid of the present invention described above and the nucleic acid encoding the light chain is introduced into a host cell to form an antibody in the cell.
  • a host cell hereinafter, may be referred to as “host cell of the present invention”
  • a method for producing an antibody of the present invention using the host cell hereinafter, may be referred to as "the production method of the present invention”.
  • the production method of the present invention comprises the step of culturing the host cell of the present invention under the conditions under which the antibody of the present invention is produced.
  • Examples of cells that can be used as cells expressing the antibody of the present invention and the anti-human TIGIT agonistic antibody include mammalian cells.
  • mammalian cells include, for example, many immortalized cell lines available from American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, including Chinese hamster ovary (CHO) cells, HEK293 cells, Examples include, but are not limited to, NSO cells, HeLa cells, baby hamster kidney (BHK) cells, monkey kidney cells (COS), human hepatocytes cancer cells (eg, Hep G2), and numerous other cell lines.
  • Recombinant antibodies can also be expressed using non-mammalian cells including, but not limited to, bacteria (eg, E. coli, etc.), yeasts, insects and plants.
  • Anti-human TIGIT agonistic antibodies can also be produced in transgenic animals such as cattle and chickens.
  • the method for introducing a nucleic acid encoding an antibody or a fragment thereof (for example, the nucleic acid of the present invention) or a vector into a host cell is not particularly limited, and a known method can be used.
  • introducing a nucleic acid or a plasmid vector for example, it can be carried out by a calcium phosphate coprecipitation method, a PEG method, an electroporation method, a microinjection method, a lipofection method or the like.
  • Nucleic acid encoding an antibody or fragment thereof may also be introduced directly into a cell in the form of RNA and used to express the antibody intracellularly.
  • a known method can be used, and for example, a lipofection method, an electroporation method, or the like can be preferably used.
  • the obtained recombinant host cells are prepared under conditions suitable for expression (for example, in the presence of an inducer, in a suitable non-human animal, a medium supplemented with suitable salts, growth factors, antibiotics, nutritional supplements, etc.). ), which produces one or more encoded polypeptides.
  • the heavy chain is made in one cell and the light chain is made in another cell.
  • the medium for culturing the cells is, for example, the minimum essential containing about 5 to about 20% fetal bovine serum.
  • MEM Medium
  • DMEM Dalbeco Modified Eagle's Medium
  • RPMI 1640 Medium RPMI 1640 Medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967) )] 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)], etc.
  • the pH of the medium is preferably about 6 to about 8.
  • Culturing is usually carried out at about 30 ° C to about 40 ° C. Ventilation and agitation may be performed as needed.
  • the antibody of the present invention has the ability to bind to human TIGIT. Therefore, in another embodiment, a reagent for detecting or measuring human TIGIT (or non-human TIGIT) containing the antibody of the present invention (hereinafter, may be referred to as “reagent of the present invention”) is provided.
  • the antibody itself can be used as a reagent for detecting or measuring human TIGIT by binding a labeling substance or the like to the antibody of the present invention, or can be combined with other reagents or the like to detect or measure human TIGIT. ..
  • kit of the present invention a kit for detecting or measuring human TIGIT containing the antibody of the present invention (hereinafter, may be referred to as “kit of the present invention”) is also provided.
  • the reagent or kit of the present invention can be used for Western blotting, immunostaining, methods using EIA (Enzyme Immunoassay) or ELISA (Enzyme-Linked immunosorbent assay) (eg, direct method, indirect method, competitive method, sandwich method, etc.). Can be used.
  • the reagent or kit of the present invention may contain other antibodies (including fragments thereof, the same shall apply hereinafter) or reagents in addition to the antibodies of the present invention, and these antibodies or reagents may contain the above-mentioned antibodies in advance. It may be combined with or stored in separate containers.
  • an antibody different from the antibody of the present invention that binds to human TIGIT or a fragment thereof hereinafter, may be referred to as "anti-human TIGIT antibody”
  • a secondary antibody a labeling substance (for example, fluorescence).
  • Dyes eg, fluorescein, etc.
  • enzymes eg, Horseradish peroxidase: HRP, alkaline phosphatase (AP), etc.), radioactive substances, etc.
  • substrates AP substrate PNPP (p-nitrophenyl phosphate), HRP substrate
  • Certain ABTS (2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid] -diammonium salt
  • OPD o-phenylenediamine dihydrochloride
  • TMB 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine, etc.
  • enzymes eg, fluorescein, etc.
  • examples include buffers, standards of known concentration, positive controls (eg, recombinant human TIGIT, etc.), negative controls, instructions with protocols,
  • the antibody of the present invention contained in the above reagent or kit may be immobilized on a carrier in advance.
  • the carrier used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include polymers such as polystyrene, glass beads, magnetic particles, microplates, filter papers for immunochromatography, and insoluble carriers such as glass filters.
  • a microplate used for ELISA is preferable.
  • human TIGIT including human TIGIT to which other peptides such as labeled human TIGIT and BSA are bound
  • a reagent or kit for ELISA containing a microplate on which the antibody of the present invention is immobilized, or an ELISA comprising a microplate on which human TIGIT is immobilized and an antibody of the present invention. Reagents or kits for are provided.
  • the reagent or kit of the present invention containing a secondary antibody can be used, for example, for Western blotting, immunostaining, indirect method of EIA or ELISA, and the like.
  • the secondary antibody is not particularly limited as long as it can bind to the antibody of the present invention, and can be appropriately selected. Further, the secondary antibody is preferably bound to the above-mentioned labeling substance, and the above-mentioned reagent or kit may contain the above-mentioned substrate or the like for the above-mentioned labeling substance.
  • human TIGIT is immobilized on a microplate, and the antibody of the present invention is subsequently reacted with an enzyme-labeled secondary antibody against the antibody for washing. Later, by detecting or measuring the enzyme activity remaining on the microplate, human TIGIT or its amount can be detected or measured.
  • the reagent or kit of the present invention containing the labeled human TIGIT can be used, for example, in a competitive method of EIA or ELISA.
  • the labeled human TIGIT is not particularly limited as long as it can bind to the antibody of the present invention.
  • the labeling substance to be bound to human TIGIT is not particularly limited, and examples thereof include the above-mentioned fluorescent dyes and enzymes.
  • the labeling substance may be directly bound to human TIGIT or indirectly.
  • the direct binding is carried out by, for example, a cross-linking reaction via a linker (eg, NHS ester, maleimide, etc.) or the like, but the method is not limited to this method.
  • a linker eg, NHS ester, maleimide, etc.
  • Indirect binding is, for example, a labeling substance via a substance that binds one or more tags (eg, biotin, etc.) to biotin and binds to the tag (eg, (streptavidin) avidin, an antibody against the tag, etc.). It can be done by combining the tag with the tag. Therefore, the labeled human TIGIT may be provided in a form in which the human TIGIT to which the tag is attached and the labeling substance having a substance that binds to the tag are different substances. In addition to the labeled human TIGIT, the reagent or kit may contain the above-mentioned substrate or the like for the labeling substance.
  • tags eg, biotin, etc.
  • tag eg, (streptavidin) avidin, an antibody against the tag, etc.
  • the labeled human TIGIT may be provided in a form in which the human TIGIT to which the tag is attached and the labeling substance having a substance that binds to
  • the antibody of the present invention is immobilized on a microplate, and a sample containing human TIGIT and a labeled human TIGIT having a known concentration are used in the same microplate.
  • Human TIGIT or its amount can be detected or measured by simultaneously reacting in the plate and detecting or measuring the enzyme activity remaining in the microplate after the reaction.
  • the reagent or kit of the present invention containing anti-human TIGIT can be used, for example, in the ELISA sandwich method.
  • the antibody that binds to human TIGIT is not particularly limited as long as it can bind to human TIGIT, but it is preferable that a labeling substance is bound.
  • the labeling substance is not particularly limited, and examples thereof include the above-mentioned fluorescent dyes and enzymes.
  • the reagent or kit may contain the substrate or the like for the labeling substance.
  • the antibody of the present invention is immobilized on a microplate, reacted with human TIGIT, and subsequently reacted with a labeled anti-human TIGIT antibody, and after washing.
  • Human TIGIT can be detected or measured by detecting or measuring the enzyme activity remaining in the microplate.
  • the anti-human TIGIT antibody can be produced by an existing general production method using human TIGIT, a partial peptide thereof, or modified human TIGIT to which amino acids and the like are added as an immunogen.
  • Such antibodies include, but are not limited to, polyclonal antibodies, monoclonal antibodies (mAbs), fragments thereof, and the like.
  • Preferred antibodies are monoclonal antibodies or fragments thereof.
  • the antibody or a fragment thereof include a genetically engineered conjugated molecule such as a fragment of Fab, Fab', F (ab') 2, etc. having the ability to bind to human TIGIT, or polyethylene glycol.
  • examples thereof include, but are not limited to, derivatives thereof modified with molecules having a protein stabilizing action such as (PEG).
  • the present invention may be referred to as a method for detecting or measuring human TIGIT using the antibody, reagent or kit of the present invention (hereinafter, referred to as "method of the present invention”. )I will provide a.
  • the method of the invention is: It includes (1) contacting the human TIGIT in the sample with the antibody of the present invention, and (2) detecting or measuring the antibody of the present invention bound to the human TIGIT.
  • the method can be applied to, for example, Western blotting, immunostaining, EIA or ELISA (eg, direct method, indirect method, sandwich method, etc.).
  • the method of contacting the human TIGIT in the sample with the antibody of the present invention is not particularly limited, but for example, the sample and the solution containing the antibody of the present invention may be mixed. Can be done.
  • the sample is a tissue section
  • human TIGIT and the antibody of the present invention can be brought into contact with the tissue section by adding a solution containing the antibody of the present invention.
  • the conditions for contacting the human TIGIT with the antibody of the present invention are not particularly limited, but are usually contacted at a temperature of 0 to 45 ° C, preferably at a temperature of 0 to 40 ° C, and more preferably.
  • Contact is carried out at a temperature of 4 to 37 ° C, more preferably 25 ° C to 37 ° C.
  • the contact time is not particularly limited, but is usually 5 minutes to 6 hours, preferably 10 minutes to 2 hours, and more preferably 20 minutes to 1 hour.
  • a sample is added to a carrier on which the antibody of the present invention is immobilized, or human TIGIT in the sample is immobilized on the carrier, and the antibody of the present invention is applied to the carrier. It can be done by adding or the like. Examples of such a carrier include the above 1. The same as those described in 1 can be used.
  • the method for immobilizing the human TIGIT in the antibody or sample of the present invention on the carrier is not particularly limited, and for example, a method using physical adsorption, electrostatic interaction, hydrophobic interaction, cross-linking agent, etc. Can be mentioned.
  • the concentration of the antibody of the present invention in the solution at the time of solid phase may be appropriately adjusted according to the material, shape, immobilization method, etc.
  • the concentration of human TIGIT in the solution can be appropriately adjusted.
  • the blocking agent may be appropriately selected from agents usually used in the field of measurement using an antigen-antibody reaction such as EIA and ELISA, and a preferable blocking agent is collagen peptide.
  • a washing step may be provided in order to remove the antibody that could not bind to the human TIGIT and the human TIGIT that could not bind to the antibody.
  • the cleaning solution used in the cleaning step include a buffer solution (pH 6 to 8)), and more specifically, a Tris buffer solution, a phosphate buffer solution, a HEPES buffer solution, and the like. Further, these buffer solutions may appropriately contain salts, surfactants, proteins, sugars, zwitterionic compounds and the like. Further, the cleaning solution included in a commercially available immune reaction kit is also preferably used.
  • the method for detecting or measuring the antibody of the present invention bound to human TIGIT in the above step (2) is not particularly limited, and can be carried out by a method known per se. Such methods include "Methods in ENZYMOLOGY" Vol.70 (Immunochemical Techniques (Part A)), the same book Vol.73 (Immunochemical Techniques (Part B)), the same book Vol.74 (Immunochemical Techniques (Part C)), and the same book Vol.
  • the book bound to human TIGIT by detecting or measuring the labeling substance or its amount.
  • the antibody of the invention or an amount thereof can be detected or measured.
  • the complex of the antibody of the present invention and human TIGIT and the secondary antibody to which the labeling substance is bound, or the anti-human TIGIT to which the labeling substance is bound which binds to the antibody of the present invention. It may be contacted with an antibody to detect or measure the labeling substance or its amount.
  • a wash step may be provided to remove the antibody of the invention or the secondary antibody or anti-human TIGIT antibody that could not bind to human TIGIT.
  • the cleaning step can be performed by the same method as the above-mentioned cleaning step arbitrarily performed after the step (1).
  • the secondary antibody and the anti-human TIGIT antibody the same ones as described in 3 above can be used.
  • the fluorescence emitted by the fluorescent substance can be detected or measured for the labeling substance or its amount using a plate reader or the like.
  • an enzyme used as a labeling substance
  • the color development, luminescence, its level, etc. are detected by adding a substrate that decomposes by the action of the enzyme and develops color, emits light, etc., using a plate reader or the like. Or it can be measured.
  • a radioactive substance is used as the labeling substance, the radiation dose emitted by the substance can be detected or measured by a scintillation counter or the like. Based on the data detected or measured in this way, the amount of human TIGIT can be quantified using image processing software (eg, ImageJ, etc.).
  • the method of the present invention is: (1') The steps of contacting the labeled human TIGIT and the human TIGIT in the sample with the antibody of the present invention, and (2') the step of detecting or measuring the antibody of the present invention bound to the labeled human TIGIT are included.
  • the method can be applied to, for example, the competitive method of EIA or ELISA.
  • the method for contacting the labeled human TIGIT and the human TIGIT in the sample with the antibody of the present invention is not particularly limited, but for example, the solution containing the labeled human TIGIT, the sample, and the present invention. This can be done by mixing with a solution containing an antibody.
  • the conditions for contacting the labeled human TIGIT and the human TIGIT with the antibody of the present invention the same conditions as those described in the above step (1) can be mentioned.
  • a labeled human TIGIT having a known sample and concentration is added to the carrier on which the antibody of the present invention is immobilized, or the human TIGIT in the sample is immobilized on the carrier.
  • the carrier can also be carried out by adding a labeled human TIGIT and the antibody of the present invention to the carrier.
  • the type of the carrier, the immobilization method, the blocking agent and the like the same ones as described in the above step (1) can be used.
  • a washing step may be provided to remove the antibody that could not bind to the human TIGIT or the labeled human TIGIT, or the human TIGIT or the labeled human TIGIT that could not bind to the antibody.
  • the cleaning liquid used in the cleaning step the same cleaning liquid as that described in the above step (1) can be used.
  • the method for detecting or measuring the antibody of the present invention bound to the labeled human TIGIT in the above step (2') was bound to the human TIGIT by detecting or measuring the labeled substance bound to the labeled human TIGIT or the amount thereof.
  • the antibody of the present invention or an amount thereof can be detected or measured.
  • the fluorescence emitted by the fluorescent substance can be detected or measured for the labeling substance or its amount using a plate reader or the like.
  • an enzyme used as a labeling substance
  • the color development, luminescence, its level, etc. are detected by adding a substrate that decomposes by the action of the enzyme and develops color, emits light, etc., using a plate reader or the like. Or it can be measured.
  • a radioactive substance is used as the labeling substance, the radiation dose emitted by the substance can be detected or measured by a scintillation counter or the like.
  • the labeled human TIGIT that can bind to the antibody of the present invention decreases, and the labeling level (eg, color development or fluorescence level) becomes weak.
  • the labeling level eg, color development or fluorescence level
  • Examples of the sample used in the method of the present invention include a sample collected from an animal. Further, the sample may be a sample known to contain human TIGIT (for example, including the morphology of cells expressing human TIGIT), or a sample in which it is unknown whether human TIGIT is contained. May be good. Examples of such animals include mammals such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, dogs, monkeys, orangutans, chimpanzees, and humans. Examples of animal-derived samples include blood, serum, plasma, saliva, urine, tears, sweat, milk, nasal juice, semen, pleural effusion, gastrointestinal secretions, cerebrospinal fluid, interstitial fluid, and lymph. , Preferably serum and plasma.
  • the cell population is obtained by culturing cells.
  • samples can be obtained by a method known per se, for example, serum or plasma can be prepared by collecting blood from a test animal according to a conventional method and separating humoral components, and cerebrospinal fluid can be prepared.
  • a drug containing the antibody of the present invention also provides a drug containing the antibody of the present invention as an active ingredient.
  • the antibody of the present invention can suppress immune activation mediated by activation of TIGIT in cytotoxic T cells (CTL) or natural killer (NK) cells such as CD8-positive T cells, and can also suppress regulatory T cells (Treg). It can enhance the ability to suppress immune response through activation of TIGIT in cells). Therefore, the medicine containing the antibody of the present invention can be used for the prevention or treatment of autoimmune diseases and diseases involved in the activation of CTL or NK cells.
  • Such diseases include, for example, rheumatoid arthritis, psoriasis, psoriatic arthritis, polysclerosis (MS), inflammatory bowel disease (IBD), celiac disease, transplant-to-host disease (GVHD), irritable bowel syndrome. Be done.
  • the diseases also include, for example, Sjogren's syndrome, non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and primary biliary cirrhosis.
  • Examples of the subject of administration of the drug of the present invention include primate animals, and examples of such primate animals include fox monkeys, loris, tsubai, monkeys (eg, cynomolgus monkeys, etc.), humans, and preferably humans.
  • the antibody of the present invention and the anti-human TIGIT agonistic antibody are preferably prepared as a pharmaceutical composition according to a conventional method.
  • the therapeutic agent of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier and / or an additive, if necessary.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, surfactants (PEG, Tween, etc.), excipients, antioxidants (ascorbic acid, etc.), colorants, flavoring agents, preservatives, stabilizers, buffers (phosphoric acid, citric acid, other organic acids). Etc.), chelating agents (EDTA etc.), suspending agents, tonicity agents, binders, disintegrants, phosphoric acids, fluidity promoters, citrates and the like.
  • the above-mentioned pharmaceutical composition is not limited to these, and may appropriately contain other commonly used carriers.
  • the anti-human TIGIT agonistic antibody is dissolved in an isotonic solution containing, for example, saline, glucose or other adjuvant.
  • Auxiliary agents include, for example, D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, and suitable solubilizing agents such as alcohol (ethanol, etc.), polyalcohol (propylene glycol, PEG, etc.), and the like. It may be used in combination with a nonionic surfactant (polysorbate 80, HCO-50) or the like.
  • the polypeptide can be encapsulated in microcapsules (microcapsules such as hydroxymethyl cellulose, gelatin, poly [methyl methacrylate]), and colloidal drug delivery systems (liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles and nanoparticles). It can also be a capsule (see Remington's Pharmaceutical Science 16th edition &, Oslo Ed. (1980), etc.).
  • microcapsules such as hydroxymethyl cellulose, gelatin, poly [methyl methacrylate]
  • colloidal drug delivery systems liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles and nanoparticles. It can also be a capsule (see Remington's Pharmaceutical Science 16th edition &, Oslo Ed. (1980), etc.).
  • the content of the anti-human TIGIT agonistic antibody in the pharmaceutical composition is, for example, about 0.01 to 100% by weight, preferably 0.1 to 99.9% by weight of the entire pharmaceutical composition.
  • the above-mentioned pharmaceutical composition can be administered either orally or parenterally, but is preferably administered parenterally. Specifically, it is administered to a patient by injection or transdermal administration.
  • the injection type for example, it can be administered systemically or locally by intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, or the like. Local injection, especially intramuscular injection, may be given at or around the treatment site.
  • the transdermal dosage form include ointments, gels, creams, poultices, patches and the like, which can be administered systemically or topically.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the dose can be selected, for example, in the range of 0.5 mg to 10 mg as an anti-human TIGIT agoistic antibody per 1 kg of body weight at a time.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention are not limited to these doses.
  • sequence numbers in the sequence listing of the present specification indicate the following sequences.
  • SEQ ID NO: 1 Amino acid sequence of human TIGIT (SEQ ID NO: 2) Amino acid sequence of Clone M1-8 H-CDR1 (SEQ ID NO: 3) Amino acid sequence of Clone M1-8 H-CDR2 (SEQ ID NO: 4) Clone M1-8 H -Amino acid sequence of CDR3 (SEQ ID NO: 5) Amino acid sequence of Clone M1-8 L-CDR1 (SEQ ID NO: 6) Amino acid sequence of Clone M1-8 L-CDR3 (SEQ ID NO: 7) Amino acid in Clone M1-8 heavy chain variable region Sequence (mouse-type heavy chain variable region) (SEQ ID NO: 8) Amino acid sequence of Clone M1-8 light chain variable region (mouse type light chain variable region)
  • Example 1 Preparation of novel anti-human TIGIT agonistic antibody (M1-8) ⁇ Preparation of recombinant human TIGIT-His-mFc protein>
  • the recombinant human TIGIT-His-mFc protein was prepared using the Expi293 Expression System (Thermo). After culturing cells transfected with the human TIGIT-His-mFc expression plasmid, recombinant human TIGIT-His- Purified mFc protein.
  • the obtained cells were washed twice with FACS buffer (PBS containing 1% FBS) and then suspended with FACS buffer to a cell density of 1 x 10 6 cells / mL.
  • the suspension was dispensed into 96-well V-bottom plates in 100 ⁇ L increments, centrifuged, and the supernatant was removed.
  • 100 ⁇ L of antiserum diluted with FACS buffer was dispensed into this plate and allowed to stand at 4 ° C. for 30 minutes.
  • 100 ⁇ L of AlexaFluoro647®-labeled anti-mouse IgG antibody was dispensed and allowed to stand at 4 ° C. for 30 minutes.
  • the antibody was suspended in 200 ⁇ L FACS buffer, and the bound antibody was measured using Cytomics FC500MPL.
  • Figure 1 shows the obtained Median fluorescence intensity.
  • an increase in antibody titer against doxycycline expression-inducing human TIGIT-expressing cells was observed.
  • Lymph nodes were removed from mice No. 1, 2, 4, and 5 with elevated antibody titers 3 days after final immunization, compressed and filtered on a 40 ⁇ m strainer, and suspended in DMEM.
  • P3-X63.Ag8.U1 (P3U1) was used as the fusion partner for hybridoma production.
  • Lymphocytes and P3U1 were washed 3 times each with DMEM and mixed so that the cell number ratio was 1: 1.
  • Cells washed twice with fusion buffer (0.3 M mannitol, 0.1 mM calcium chloride, 0.1 mM magnesium sulphate) were suspended in 1.51 x 10 7 cells / mL in fusion buffer.
  • BTX was used for cell fusion and performed according to the manual.
  • the fused cells were washed once with Clonal Cell TM -HY Medium C (STEMCELL), suspended in the same medium to 1.67 x 10 6 cells / mL, and then overnight at 37 ° C. and 5% CO 2 conditions. It was left still.
  • the obtained fusion cells were centrifuged, suspended in 1 x 10 6 cells / mL with ClonaCell TM -HY Medium C, mixed with ClonaCell TM -HY Medium D, and seeded on a plate. After culturing for 10 days under 37 ° C.
  • hybridoma colonies were picked using Clone Pix and seeded on plates containing 200 ⁇ L / well of ClonaCell TM -HY Medium E. After culturing for 3 days under the conditions of 37 ° C and 5% CO 2 , the culture supernatant was collected and subjected to screening.
  • Transiently expressed cells were generated according to the manual using the Expi293F expression system (Thermo). Specifically, Expi293F cells in the logarithmic growth phase were suspended to a cell density of 1x10 6 cells / mL, and then 35 mL each was dispensed into a 125 mL Meyer flask. 37.5 ⁇ g of TIGIT expression plasmid and 50 ⁇ L of 293Fectin were diluted in OptiMEM I medium to a final volume of 1.25 mL and allowed to stand at room temperature for 5 minutes. Diluted DNA solution and 293 Fectin solution were mixed and allowed to stand at room temperature for 20 minutes. The mixed solution was added to the cells, and the cells were collected by culturing at 37 ° C., 8% CO 2 , 120 rpm for 2 days.
  • ⁇ Primary screening (Mirrorball assay)> Primary screening was performed using transiently expressed cell lines and their parent strains. After harvesting the cells, they were washed 3 times with FACS buffer and diluted to 1 ⁇ g / mL with the same buffer as the cells suspended in 3 x 10 5 cells / mL Alexa Fluor® 647-labeled anti-mouse IgG (subclass 1+). 2a + 2b + 3) Equal amounts of the antibody were mixed and 20 ⁇ L each was dispensed into 384-well plates. To the plate, 10 ⁇ L of the hybridoma culture supernatant diluted 10-fold with FACS buffer was added, stirred with a plate mixer, and centrifuged for 1 minute. After allowing to stand at room temperature for 1 hour, the fluorescence intensity was measured using a plate imager (Mirrorball).
  • PBS containing 0.05% tween 20 100 ⁇ L of blocking buffer (PBS containing 20% immunoblock) was dispensed and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • Human, monkey, and mouse TIGIT-expressing cells were prepared using a doxycycline expression-inducing CHO cell line. That is, human, monkey, and mouse TIGIT expression plasmids were transfected into the doxycycline expression-inducing CHO cell line. After cloning the transfected cells by the limiting dilution method, TIGIT expression was induced by culturing in a doxycycline-containing medium, and cells whose expression was confirmed were selected as TIGIT-expressing cells.
  • ⁇ Secondary screening FACS
  • the secondary screening was performed by the same method as the blood antibody titer measurement. That is, human TIGIT-expressing cells inducing doxycycline expression were cultured for 2 days under the conditions of the presence or absence of doxycycline. After washing the cells with PBS, Cell Dissociation buffer (GIBCO) was added, and the cells were allowed to stand at room temperature for 10 minutes to detach the cells from the flask. The obtained cells were washed twice with FACS buffer (PBS containing 1% FBS) and then suspended with FACS buffer to a cell density of 1 x 10 6 cells / mL.
  • FACS buffer PBS containing 1% FBS
  • the suspension was dispensed into 96-well V-bottom plates in 100 ⁇ L increments, centrifuged, and the supernatant was removed.
  • 100 ⁇ L of the hybridoma culture supernatant diluted to 1 ⁇ g / mL with FACS buffer was added, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 30 minutes.
  • 100 ⁇ L of AlexaFluoro647®-labeled anti-mouse IgG antibody was dispensed and allowed to stand at 4 ° C. for 30 minutes. After washing twice with FACS buffer, the antibody was suspended in 200 ⁇ L FACS buffer, and the bound antibody was measured using Cytomics FC500MPL.
  • Figure 2 shows the binding activity of M1-8 antibody in the culture supernatant to human TIGIT-expressing cells that induce doxycycline expression.
  • ⁇ Tertiary screening (recombinant TIGIT, PVR expression cell junction inhibition assay)> Recombinant human TIGIT human IgG1 Fc fusion protein (R & D systems, 7898-TG-050) diluted to 2 nM in FACS buffer and hybridoma culture supernatant diluted to 10-1,000 ng / mL, respectively, in 96-well V-bottom plates 1: The mixture was mixed to 1 and allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • Doxycycline-induced human PVR-expressing cells cultured for 2 days in the presence of doxycycline were suspended in 1 x 10 6 cells / mL in FACS buffer and dispensed in 100 ⁇ L increments into a separate 96-well V-bottom plate.
  • the plate containing the cells was centrifuged, the supernatant was discarded, TIGIT, which had been mixed in advance, and the culture supernatant mixture were added, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 30 minutes.
  • 100 ⁇ L of AlexaFluoro647®-labeled anti-human IgG antibody was dispensed and allowed to stand at 4 ° C. for 30 minutes.
  • the cells were suspended in 200 ⁇ L of the FACS buffer, and the bound TIGIT-Fc was measured using Cytomics FC500MPL.
  • FIG. 3 shows the results of the recombinant TIGIT and PVR expression cell junction inhibition assay.
  • the commercially available anti-human TIGIT antibody (clone MSBA43) inhibited the binding between TIGIT and PVR-expressing cells, but did not inhibit the M1-8 antibody in the culture supernatant.
  • ⁇ Antibody isotyping by ELISA> Various anti-mouse isotype antibodies (ITM, BioLegend) diluted to 5 ⁇ g / mL with PBS were dispensed into 96 half-well ELISA plates in 50 ⁇ L increments and allowed to stand overnight at 4 ° C. Next, the plate was washed twice with a washing buffer (PBS containing 0.05% tween 20), and then 100 ⁇ L of SuperBlock (PBS) Blocking Buffer (Thermo) was dispensed and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • ITM anti-mouse isotype antibodies
  • the CDRs of the M1-8 antibody were defined according to the IMGT numbering system.
  • ⁇ Antibody purification> Incubate in ClonaCell TM -HY Medium E and add 0.5 mL of hybrid doma suspension in logarithmic growth phase to Daigo's T medium (10% Ultra Low IgG FBS, 1% MEM NEAA, 1% Sodium Pyruvate, 1% L-Alanyl-L). -Glutamine, 1% Penicillin-Streptomycin, 43% F-12 nutrient mixture, 43% Iscove's Modified Dulbecco's Medium) was added to a 24-well plate containing 0.5 mL and cultured under 37 ° C. and 5% CO 2 conditions.
  • the cells were added to a 6-well plate containing 4 mL of Daigo's T medium, and further cultured for 2 to 3 days to acclimatize to Daigo's T medium. After confirming that the cells were sufficiently acclimatized, they were added to a T-75 flask containing 45 mL of Daigo's T and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 conditions. After 7 to 10 days, the culture broth was collected and the culture supernatant was obtained by centrifugation. The monoclonal antibody was purified from the obtained culture supernatant with Protein A resin.
  • mouse IgG1 binding buffer 1.5 M Glycine-HCl, 3 M NaCl, pH 9.5
  • protein A sepharose resin was added.
  • mouse IgG1 binding buffer was used instead of PBS.
  • the obtained purified antibody was buffer-substituted in PBS using an ultrafiltration column (Amicon), and the concentration was measured by a spectrophotometer (NanoDrop).
  • Test antibody and IgG have a final concentration of 10 ⁇ g / mL to 100 ng / mL at a 3-fold ratio of 5 points, and PVR has a final concentration of 33 ⁇ g / mL to 333 ng / mL at a 3-fold ratio of 5 points.
  • a serial diluent was prepared.
  • Doxycycline expression induction 96-well plate transparent flat-bottomed cell culture surface-treated microplate in which doxycycline was added to 2 ⁇ g / mL of human TIGIT-expressing cells (hTIGIT / Jurkat) and medium was added in advance by 48 ⁇ L / well. , CORNING, 3598) were sown at 60 ⁇ L / well.
  • serially diluted test antibody, positive control, and negative control were added at a rate of 12 ⁇ L / well, and PVR with a final concentration of 3.3 ⁇ g / mL was added to the wells of 100% control, and medium was added to the wells of 0% control. 12 ⁇ L / well was added at a time. Incubate overnight in a CO 2 incubator (37 ° C, 5% CO 2 ).
  • Doxycycline was added to human TIGIT-expressing cells (hTIGIT / Jurkat) to induce doxycycline expression at 2 ⁇ g / mL, and 36 ⁇ L / well, 100% control and 0% control were added to the sample and positive control wells in advance, and to the negative control wells.
  • the wells were seeded at 60 ⁇ L / well on 96-well plates (transparent flat-bottomed cell culture surface-treated microplates, CORNING, 3598) supplemented with 48 ⁇ L / well medium.
  • serially diluted test antibody, positive control, and negative control were added at a rate of 12 ⁇ L / well, and PVR with a final concentration of 3.3 ⁇ g / mL was added to the wells of 100% control, and medium was added to the wells of 0% control. 12 ⁇ L / well was added at a time. Incubate overnight in a CO 2 incubator (37 ° C, 5% CO 2 ).
  • ⁇ Cell stimulation (Day 1) After removing the solution from the Anti-human CD3 coated plate and washing once with 200 ⁇ L / well PBS, 90 ⁇ L / well was transferred to the cell solution of each assay to which the sample was added on Day 0.
  • Anti-human CD28 (eBioscience, 16-0289) was diluted to a final concentration of 2 ⁇ g / mL and added to the plate in 10 ⁇ L / well increments. After stirring with a plate mixer (Titramax 100, Heidolph), the cells were cultured overnight in a CO 2 incubator (37 ° C, 5% CO 2 ).
  • Nano-Glo® Luciferase Assay System Promega, N1120 for measurement of Agonist assay and Antagonist assay
  • CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay System Promega, G7572 for measurement of Cytotoxicity / Growth inhibition assay )It was used.
  • Dissolve the Nano-Glo TM Luciferase Assay Substrate solution 50-fold diluted in Nano-Glo TM Luciferase Assay Buffer in 100 ⁇ L / well or CellTiter-Glo® Buffer in cells that have been warmed to room temperature from a CO 2 incubator.
  • Antagonist assay: Sample antagonist activity (%) (measured value of compound-100% mean control well) / (mean 0% control-100% mean control well) x 100 The calculated inhibition rate (%) was graphed using GraphPad Prism, and the IC50 value was calculated.
  • Figure 4 shows the measurement results of the biological activity of the M1-8 antibody.
  • the M1-8 antibody showed agonist activity but no antagonist activity.
  • the M1-8 antibody did not show cytotoxic activity against the human TIGIT-expressing cells used in this measurement under these conditions, and did not affect cell proliferation.
  • the cross-reactivity test of the obtained antibody was performed by FACS using human, monkey, and mouse TIGIT-expressing cells. That is, the doxycycline expression-inducing cells were cultured for 2 days under the condition of the presence or absence of doxycycline. After washing the cells with PBS, Cell Dissociation buffer (GIBCO) was added, and the cells were allowed to stand at room temperature for 10 minutes to detach the cells from the flask. The obtained cells were washed twice with FACS buffer (PBS containing 1% FBS) and then suspended with FACS buffer to a cell density of 1 x 10 6 cells / mL.
  • FACS buffer PBS containing 1% FBS
  • the suspension was dispensed into 96-well V-bottom plates in 100 ⁇ L increments, centrifuged, and the supernatant was removed.
  • 100 ⁇ L of purified antibody diluted to 1 ⁇ g / mL with FACS buffer was added, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 30 minutes.
  • 100 ⁇ L of AlexaFluoro647®-labeled anti-mouse IgG antibody was dispensed and allowed to stand at 4 ° C. for 30 minutes.
  • the antibody was suspended in 200 ⁇ L FACS buffer, and the bound antibody was measured using Cytomics FC500MPL.
  • FIG. 5 shows the results of cross-reactivity of M1-8 antibody to human, monkey, and mouse TIGIT. It was found that the antibody M1-8 binds to human and monkey TIGIT but not to mouse TIGIT.
  • the following antibodies / media were used in the examples below: Human; anti-CD3 (Hit3a), anti-CD4 (FITC, OKT4 or BV510, OKT4), anti-CD19 (BV421, HIB19), anti-CD25 (PE, BC96), anti-CD27 (BV510, O323), CD38 (FITC, HIT2) anti-CD45RA (BV421, HI100), anti-CD127 (FITC, A019D5), anti-CD138 (APC, MI15), anti-CXCR5 (PerCP / Cy5.5, J252D4), anti-human TIGIT ( PE-Cy7, A15153G) (both BioLegend), 7-aminoactinomycin D (Bay Bioscience), anti-TIGIT agonistic antibody (Clone M1-8, Takeda Pharmaceutical Company Limited).
  • Isotype control mIgG1 (MG1-45) (both Biolegend).
  • complete RPMI (added to RPMI 1640: 2 mM L-glutamine, 1% non-essential amino acid, 55 ⁇ M 2-mercaptoethanol (Thermo Fisher Scientific), 1 mM sodium pyruvate, 100 U / ml penicillin, 100 U / ml streptomycin, 10% FBS (Thermo Fisher Scientific)).
  • Example 2 Verification of suppression of CD8-positive T cell activation mediated by TIGIT activation Human peripheral blood was collected from four healthy subjects using a heparin blood collection tube (Terumo), and Ficoll-paque plus (GE healthcare). PBMC was separated using. CD8-positive T cells were isolated from PBMCs by MACS using a CD8 + T cell isolation kit (Miltenny). The cells were stained with CFSE (Invitrogen) reagent, suspended in RPMI1640 / 10% FBS / PSG medium, and seeded on 96-well round bottom plates at 1x10 5 cells / well.
  • CFSE Invitrogen
  • Dynabeads-M450 was suspended in Binding buffer (0.1 M sodium phosphate pH 7.6), washed once with a magnet, and then suspended again in Binding buffer, in which 2.5 ⁇ g / 10 7 beads, PVR- Fc and IgG1-Fc were mixed so that the total of PVR-Fc and IgG1-Fc was 2.5 ⁇ g / 107 beads, and the mixture was rotated at 4 ° C. overnight.
  • Binding buffer 0.1 M sodium phosphate pH 7.6
  • Example 3 Effect on Tfh cells Blood collected in a heparin blood collection vessel (TERUMO, Tokyo, Japan) was used as PBMC using Lymphoprep (Axis-Shield). In addition, CD4 + T cells were negatively selected using the CD4 + T Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec). The cell surface was stained with various antibodies and fractionated into the following cell populations by FACSAria III flow cytometer. Tfh; CD45RA-CXCR5 +, Naive T; CD45RA + CXCR5-, non-Tfh; CD45RA-CXCR5-.
  • the obtained CD4 + naive T cells and Tfh cells were set to 1 ⁇ 10 4 / well on a 96-well U plate, and Dynabeads human T-Activator CD3 / CD28 (Thermo Fisher Scientific) was added in the same amount as the cells to start culturing. Culturing was started at 4 wells under the same conditions for each cell, and after 24 hours, 48 hours, 72 hours, and 96 hours, TIGIT expression on the cells was analyzed using a FACSVerse flow cytometer. Cell proliferation was analyzed using FlowJo software version 10.4.2 (FlowJo, OR, USA).
  • Tfh cells with high TIGIT expression originally increased TIGIT expression by stimulation, whereas naive T cells with low TIGIT expression did not show an increase in TIGIT expression by stimulation.
  • each cell was stained and washed with 2 ⁇ M CellTrace Violet (Thermo Fisher Scientific) at 37 ° C for 7 minutes, anti-CD3 antibody 2 ⁇ g / ml, anti-CD28 antibody 1 ⁇ g / ml, and Isotype (mouse IgG1) or anti-TIGIT.
  • the agonistic antibody was cultured on a 96-well flat-bottomed plate immobilized on a solid phase at 10 ⁇ g / ml for 96 hours. Dead cells were stained and removed with 7-aminoactinomycin D, and live cells were analyzed using a FACSVerse flow cytometer. Cell proliferation was analyzed using FlowJo software version 10.4.2 (FlowJo, OR, USA).
  • the growth of Tfh cells was remarkably suppressed by anti-TIGITagonistic antibody stimulation, whereas the suppressive effect was not observed in naive T cells. That is, the selective growth inhibitory effect of the anti-TIGIT antagonist antibody on cells with high TIGIT expression was shown.
  • non-Tfh cells were also examined for TIGIT expression on the cells in the same manner as above.
  • TIGIT expression of an intermediate level between Tfh cells and naive T cells was observed (Fig. 7-2a).
  • the growth inhibitory effect of the anti-TIGIT agonistic antibody was compared between Tfh cells and non-Tfh cells by flow cytometric analysis using Cell Trance violet similar to the above, the antibody was also applied to non-Tfh cells. Although it shows a growth inhibitory effect, it was found to show a more selective inhibitory effect on Tfh cells (Fig. 7-2b).
  • Example 4 Effect of Tfh cells on B cells Blood collected in a heparin blood collection tube (TERUMO, Tokyo, Japan) was used as PBMC using Lymphoprep (Axis-Shield). In addition, CD19 + cells were positively selected using CD19 Microbeads. The cell surface was stained with various antibodies and fractionated into the following cell populations by FACSAria III flow cytometer. Memory B; CD19 + CD27 +, Effector T; CD25-CD45RA- (Tfh cells were isolated by the method of Example 3).
  • Tfh cells were cultured at 37 ° C. for 30 minutes on a 96-well U plate immobilized with Isotype (mouse IgG1) or anti-TIGIT agonistic antibody, 10 ⁇ g / ml.
  • Memory B cells were added thereto, and the cells were cultured in a medium mixed with 0.2 ⁇ g / ml Staphylococcal enterotoxin B (Sigma) for 1 week.
  • Dead cells were stained and removed with 7-aminoactinomycin D, and live cells were analyzed using a FACSVerse flow cytometer. The proportion of plasma cells was analyzed using FlowJo software version 10.4.2 (FlowJo, OR, USA), and IgG in the culture supernatant was measured using a human IgG ELISA kit (Bethyl).
  • Example 5 Effect on Treg cells Blood collected in a heparin blood collection vessel (TERUMO, Tokyo, Japan) was used as PBMC using Lymphoprep (Axis-Shield). In addition, CD4 + T cells were negatively selected using the CD4 + T Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec). The cell surface was stained with various antibodies and fractionated into the following cell fractions by FACSAria III flow cytometer (after 96 hours for Effector). Treg (FrI); CD25 + CD45RA +, Treg (FrII); CD25 + CD45RA-, Effector T; CD25-CD45RA-, non-Treg responder CD4 + T cells; CD25-.
  • Treg cells FrI
  • the obtained Treg cells FrI
  • anti-CD3 antibody 2 ⁇ g / ml anti-CD28 antibody 1 ⁇ g / ml
  • Isotype mouse IgG1
  • anti-TIGIT agonistic antibody at 10 ⁇ g / ml.
  • the cells were cultured in a medium containing 10 ng / ml of IL-2 (R & D) for 6 hours.
  • the CD4 + Effector T cells fractionated after 96 hours were stained with Cell Trace violet (CTV; Thermo Fisher Scientific) using the same method as in Example 2, washed, and 1: 1 with the activated Treg cells.
  • CTV Cell Trace violet
  • Treg cells stimulated with anti-TIGITagonistic antibody suppressed the proliferation of Effector T cells.
  • Stimulation of anti-TIGIT antagonist antibodies on Treg cells acted on the activation of Treg cells.
  • Treg cells FrI or Treg cells (FrII) were stimulated with anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody for 6 hours in the presence of Isotype (mouse IgG1) or anti-TIGIT agonistic antibody.
  • Isotype mouse IgG1
  • anti-TIGIT agonistic antibody Isotype or anti-TIGIT agonistic antibody.
  • Non-Treg responder CD4 + T cells CD25-
  • cell proliferation of responder T cells was analyzed using the dilution of CTV fluorescence as an index.
  • Treg cell fractions suppressed the proliferation of responder T cells, but activation of each Treg cell fraction in the presence of anti-TIGIT agonistic antibody further enhanced the activation of Treg cells, especially naive Treg cells.
  • the effect was more pronounced in Treg (FrI), also known as (Fig. 9-2).
  • Example 6 Effect on imikimod-induced lupus model mice
  • a 6-8 week old female C57BL / 6JJcl mouse (Claire Japan) was purchased, and a mouse of the same strain in which the human TIGIT (hTIGIT) gene was knocked in by a conventional method was used.
  • Homozygous and wild-type hTIGIT knock-in mice of the same generation obtained by mating were used. All experiments were conducted at Keio University School of Medicine Animal House, and were conducted in accordance with the regulations regarding animal experiments, etc. at Keio University School of Medicine.
  • Imiquimod-induced lupus model mice were prepared by applying 5% imiquimod cream (Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.) to the right auricle of 10-12 week-old female TIGIT-KI mice at 50 mg / kg three times a week.
  • the administration experiment was performed as follows. Both were administered twice a week. It was divided into 3 groups and analyzed on the 42nd day after the start.
  • Non-applied 300 ⁇ g / ml intraperitoneal administration of imiquimod non-applied / Isotype (mIgG1) anti-TIGIT: Imiquimod application / anti-TIGIT agonistic antibody 300 ⁇ g / ml intraperitoneally administered isotype: Imiquimod application / Isotype (mIgG1) 300 ⁇ g / ml intraperitoneally administered
  • mice spleen was removed and weighed. The spleen was finely chopped, passed through a 40 ⁇ m cell strainer, and hemolyzed using HLB solution (IBL), and the total number of spleen cells was measured.
  • Mouse splenocytes were cultured at 4 ° C. for 5 minutes using anti-CD16 / CD32 (BD Biosciences), and surface staining was performed in 20 minutes. The medium used for staining was PBS mixed with 0.5% BSA and 2 mM EDTA. Each cell was defined as follows: Tem; CD44 + CD62L-, Tfh; CXCR5 + PD-1 +, plasma cells; CD19-CD138 +, GC B cells; CD95 + GL7 +.
  • blood was collected and the anti-dsDNA antibody titer in the blood was measured with "Levis anti-dsDNA-mouse ELISA KIT" (manufactured by Shiba Goat).
  • splenomegaly and lymphocyte proliferation were suppressed in the anti-TIGIT agonistic antibody-administered group.
  • administration of the anti-TIGIT agonistic antibody significantly suppressed the increase in the proportion of plasma cells in B cells.
  • the proportion of activated T cells in T cells, the proportion of CD4 + Effector memory T (Tem) cells and Tfh cells in CD4-positive T cells the proportion of germinal center B cells in B cells, and the increase in anti-dsDNA antibody production. Also showed a tendency to suppress.
  • the anti-TIGIT agonistic antibody showed the ratio of Tem cells and Tfh cells in CD4-positive T cells, the ratio of germinal center B cells in B cells, and the ratio of germinal center B cells to isotype. It significantly suppressed the increase in the proportion of plasma cells in splenocytes and the increase in anti-dsRNA antibody production (Fig. 11-2). As described above, the anti-TIGIT agonistic antibody suppressed the proliferation of lymphocytes due to the disease, especially the proliferation of activated T cells. Furthermore, similar to the results of the culture experiment, the activation of B cells mediated by Tfh cells was also suppressed.
  • Example 7 Effect on Experimental Autoimmune encephalomyelitis (EAE) mice 12-week-old male TIGIT-KI mice were 200 ⁇ g of MOG 35-55 peptide (Synpeptide, Shanghai, China) and Freud. 400 ⁇ g of M. tuberculosis added to incomplete adjuvant (Difco Laboratories) was subcutaneously injected, and 400 ng of pertussis toxin (List Biologicals) was intraperitoneally administered on the same day and on the second day. On days 0, 2, 4, 10 and 17 of the start of induction, 100 ⁇ g of anti-TIGIT agonistic antibody or isotype (mIgG1) was intraperitoneally administered.
  • EAE Experimental Autoimmune encephalomyelitis
  • Clinical scores were measured daily by the following method and analyzed on day 30 (0, no change; 1, tail weakness; 2, tail paralysis; 3, hindlimb weakness; 4, forelimb weakness; 5 , Forelimb paralysis; 6, moribund or dead).
  • the cells infiltrating the brain, spinal cord, and spleen were analyzed by flow cytometry using various antibodies.
  • signals mediated by human TIGIT can be activated, thereby suppressing Tfh cells and activating Treg cells, which is useful for the prevention or treatment of immune / inflammatory diseases.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本発明は、抑制性免疫チェックポイント分子(TIGIT)を活性化する抗ヒトTIGIT抗体を有効成分とする免疫・炎症性疾患治療薬を提供する。また、以下のａ）及びｂ）：　ａ）重鎖可変領域の第３のＣＤＲが配列番号４のアミノ酸配列を含む　ｂ）軽鎖可変領域の第３のＣＤＲが配列番号６のアミノ酸配列を含む の特徴を有する抗体も提供される。

Description

免疫・炎症性疾患の治療薬
　本発明は、ヒトTIGITに対する抗体を含む、免疫・炎症性疾患の治療薬に関する。本発明はまた、免疫・炎症性疾患の治療活性を有し得る、特定の一次構造を有する抗ヒトTIGIT抗体等に関する。
（発明の背景）
　近年、免疫チェックポイントタンパク質を標的とした医薬、特に抗がん剤の開発が活発に行われている。免疫チェックポイントタンパク質は、免疫システムの異常賦活化による免疫・炎症性疾患の発症などを防止する因子であり、PD-1(Programmed cell death protein 1、別名CD279)、PD-L1（Programmed cell death ligand 1、別名B7-H1/CD274）、PD-L2（Programmed cell death ligand 2、別名：B7-DC/CD273）及びCTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4、別名CD152)などが主要な分子であることが知られている。また、上記以外の免疫チェックポイントタンパク質として、TIGIT（T-cell immunoreceptor with immunoglobulin and ITIM domains、別名zB7R1）が挙げられる。TIGITは、ナチュラルキラー（NK）細胞、細胞傷害性T細胞（CTL）、メモリーT細胞、制御性T細胞(regulatory T cell; Treg cell)、濾胞性ヘルパーT細胞（T follicular helper cell；Tfh cell）などに存在する免疫チェックポイント受容体である。CTL及びNK細胞では、TIGITと、その2つのリガンドであるCD155（PVR）又はCD112（Nectin2）のいずれかとの相互作用により、免疫活性化が抑制されるが、一方で、TregでのTIGIT発現は、その相互作用によって免疫応答を抑制する能力の増強が知られている。TIGITと、CD155又はCD112との結合による免疫抑制作用は、細胞傷害性T細胞及びNK細胞に発現する免疫活性化受容体CD226と、同一リガンド（即ち、CD155リガンド及びCD112リガンド）に対する競合阻害により生じる。
　TIGITを介したシグナル伝達に着目し、TIGITに対するアゴニストあるいは抗TIGITアゴニスティック抗体により、TIGIT陽性T細胞の機能抑制を介して免疫・炎症性疾患などを治療する方法について報告されている（特許文献１、２）。しかし、これまでに抗TIGITアゴニスティック抗体を含む承認された医薬は存在せず、治療効果、安全性等が優れた抗TIGIT抗体の創出が望まれている。
国際公開第2006/124667号 国際公開第2009/126688号
　従って、本発明は、ヒトTIGITに対する結合能を有し、該TIGITを介したシグナルを増強できる抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体を提供すること、ならびにヒトTIGITに対するアゴニスティック抗体を含む、新規な免疫・炎症性疾患の治療薬を提供することを課題とする。
　本発明者らは、免疫疾患の発症メカニズムの解明に基づく創薬ターゲットの探索に関する研究を行う中で、関節リウマチ患者においてTIGIT発現レベルが上昇していることを見出した。特に、健常人でもTIGIT発現レベルの高いTfh細胞、末梢ヘルパーT細胞（peripheral T ; Tph cell）、Treg細胞で疾患において有意にTIGIT発現レベルが高いことも確認した。さらに、関節リウマチ患者におけるTph細胞でのTIGIT発現レベルは疾患活動性とも相関することを見出した。そこで、TIGITを標的とすることで、関節リウマチなどの免疫・炎症性疾患の治療薬を開発できるのではないかとの着想を得て、本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。まず、マウス抗ヒトTIGIT（抗hTIGIT）抗体を複数樹立し、その樹立した抗体の中から、特に高いアゴニスティック抗体を複数選別した。選別したアゴニスティック抗体について、さらにTIGIT発現レベルの高いTfh細胞で増殖抑制を検証したところ、特定の抗体（Clone M1-8）が、Tfh細胞の増殖を抑制できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下を提供する。
［１］
　抑制性免疫チェックポイント分子(TIGIT)を活性化する抗ヒトTIGIT抗体を有効成分とする免疫・炎症性疾患治療薬。
［１’］
　哺乳動物に対して、抑制性免疫チェックポイント分子(TIGIT)を活性化する抗ヒトTIGIT抗体の有効量を投与することを特徴とする、該哺乳動物における免疫・炎症性疾患の治療方法。
［１”］
　免疫・炎症性疾患の治療における使用のための、抑制性免疫チェックポイント分子(TIGIT)を活性化する抗ヒトTIGIT抗体。
［２］
　Tfh細胞抑制作用を有する［１］に記載の治療薬。
［２’］
　抑制性免疫チェックポイント分子(TIGIT)を活性化する抗ヒトTIGIT抗体を含有してなる、Tfh細胞の抑制剤。
［３］
　Treg細胞活性化作用を有する［１］又は［２］に記載の治療薬。
［３’］
　抑制性免疫チェックポイント分子(TIGIT)を活性化する抗ヒトTIGIT抗体を含有してなる、Treg細胞の活性化剤。
［４］
　免疫・炎症性疾患が関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、全身性強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、IgG4関連疾患、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎、結節性多発動脈炎、ANCA関連血管炎、混合性結合組織病、脊椎関節炎、ベーチェット病、成人Still病、多発性硬化症、視神経脊髄炎、重症筋無力症、原発性胆汁性肝硬変、非アルコール性脂肪性肝疾患、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬（乾癬性関節炎）、尋常性白斑、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、特発性拡張型心筋症、1型糖尿病、バセドウ病、橋本病、IgA腎症、膜性腎症、溶血性貧血、及び特発性血小板減少性紫斑病からなる群から選択される、［１］ないし［３］のいずれかに記載の治療薬。
［５］
　抗ヒトTIGIT抗体がヒトTIGIT（配列番号１）に結合する抗体である［１］ないし［４］のいずれかに記載の治療薬。
［６］
　抗体が
　ａ）重鎖可変領域の第３のＣＤＲが配列番号４のアミノ酸配列を含み、かつ、
　ｂ）軽鎖可変領域の第３のＣＤＲが配列番号６のアミノ酸配列を含む、
［５］に記載の治療薬。
［７］
　抗体が
　ａ）以下を含む重鎖可変領域：
　　ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む第１のＣＤＲ；
　　ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第２のＣＤＲ；及び
　ｂ）以下を含む軽鎖可変領域：
　　ｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む第１のＣＤＲ；
　　ｉｉ）チロシン－アラニン－セリンのアミノ酸配列を含む第２のＣＤＲ；
を含む、［５］又は［６］に記載の治療薬。
［８］
　さらに抗体がＦｃドメインを含む、［５］ないし［７］のいずれかに記載の治療薬。
［９］
　前記Ｆｃドメインがヒト由来である、［８］に記載の治療薬。
［１０］
　前記Ｆｃドメインが変異Ｆｃドメインである、［８］又は［９］に記載の治療薬。
［１１］
　ａ）重鎖可変領域の第３のＣＤＲが配列番号４のアミノ酸配列を含み、かつ、
　ｂ）軽鎖可変領域の第３のＣＤＲが配列番号６のアミノ酸配列を含む、
抗体。
［１２］
　ヒトTIGIT（配列番号１）に結合する、［１１］に記載の抗体。
［１３］
　ａ）以下を含む重鎖可変領域：
　　ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む第１のＣＤＲ；
　　ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第２のＣＤＲ；及び
　ｂ）以下を含む軽鎖可変領域：
　　ｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む第１のＣＤＲ；
　　ｉｉ）チロシン－アラニン－セリンのアミノ酸配列を含む第２のＣＤＲ；
を含む、［１１］又は［１２］に記載の抗体。
［１４］
　さらにＦｃドメインを含む、［１１］ないし［１３］のいずれかに記載の抗体。
［１５］
　前記Ｆｃドメインがヒト由来である、［１４］に記載の抗体。
［１６］
　前記Ｆｃドメインが変異Ｆｃドメインである、［１４］又は［１５］に記載の抗体。
［１７］
　［１１］～［１６］のいずれかに記載の抗体をコードする、単離された核酸。
［１８］
　［１７］に記載の単離された核酸を含む、宿主細胞。
［１９］
　［１１］～［１６］のいずれかに記載の抗体の製造方法であって、前記抗体が製造される条件下で［１８］に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、方法。
　本発明によれば、ヒトTIGITに結合する抗体が提供される。当該抗体は免疫・炎症性疾患治療薬となり得るので、本発明は該治療薬を用いた免疫・炎症性疾患の治療に有用である。
組み換えヒトTIGIT-His-mFcタンパク質を免疫したマウスの抗血清中の抗体価の測定結果を表す。各グラフの縦軸は、蛍光強度の中央値（Median fluorescence intensity）を示す。各グラフの横軸は、log [plasma dilution]を示す。 培養上清中のM1-8抗体のドキシサイクリン発現誘導ヒトTIGIT発現細胞に対する結合活性を表す。 培養上清中のM1-8抗体の組み換えTIGITとPVR発現細胞との結合阻害活性を表す。 M1-8精製抗体のBiological activity（アゴニスト活性、アンタゴニスト活性、細胞傷害活性）を表す。 M1-8精製抗体のヒト、カニクイザル、及びマウスTIGIT発現細胞に対する結合活性を表す。 上から順に、CD8陽性細胞に対するTIGIT刺激による増殖抑制効果（% inhibition of proliferation）およびサイトカイン（IFNγ、Granzyme B、Perforin）の産生抑制効果（% Suppression of cytokines production）を表す。各グラフの横軸は、左から順に、CD3/PVR0、CD3/PVR0.075、CD3/PVR0.025、CD3/PVR0.75、CD3/PVR2.5を示す。 a：元々TIGITの発現の低い細胞(CD4+ ナイーブ T細胞)及び発現の高い細胞(Tfh細胞)において、TIGIT発現が刺激によりどのように変化するか示した図である。b：抗TIGIT アゴニスティック（agonistic）抗体による刺激がTfh細胞の増殖を抑制することを示した図である。 a：Tfh細胞、non-Tfh細胞及びCD4+ ナイーブ T細胞における活性化刺激によるTIGIT発現の経時変化を示す図である。Non-Tfh細胞はTfh細胞とナイーブT細胞との中間程度のTIGIT発現を示した。b：抗TIGIT アゴニスティック（agonistic）抗体による刺激がTfh細胞及びnon-Tfh細胞の増殖を抑制するが、その抑制効果はTfh細胞に対してより顕著であることを示す図である。 抗TIGIT agonistic抗体によるTfh細胞に対する刺激が、Tfh細胞を介するB細胞の活性化を抑制することを示した図である。Tfh細胞からのB細胞に対する刺激を、形質細胞の割合、培養上清中のIgG濃度で評価している。絶対値及びisotypeの結果を100とした時の相対値で示している。 抗TIGIT agonistic抗体によるTreg細胞に対する刺激が、Effector T細胞の細胞増殖を抑制したことを示す図である。 抗TIGIT agonistic抗体によるTreg細胞（FrI及びFrII）に対する刺激が、非Treg responder CD4+ T細胞（CD25-）の増殖を抑制すること、当該抑制効果はTreg細胞（FrI）においてより顕著であることを示す図である。右の棒グラフの縦軸は、抑制率(%)=[1-(共培養したresponder T細胞の増殖)/(単独培養したresponder T細胞の増殖)]×100を示す。*：p<0.05 抗TIGIT agonistic抗体が、イミキモド誘発ループスモデルマウスの脾腫を改善し脾臓リンパ球の増殖を抑制することを示した図である。非塗布、anti-TIGIT、isotypeそれぞれn=4, 3, 4の３群で比較した。 左から、抗TIGIT agonistic抗体が、イミキモド誘発ループスモデルマウスの脾臓中のT細胞に占めるCD69+（活性化）T細胞の割合、CD4+ T細胞に占めるCD4+ Effector memory T細胞及びTfh細胞の割合、B細胞に占める胚中心B細胞及び形質細胞の割合、並びに該マウス血漿中の抗dsDNA抗体量を、図１０と同様の３群で比較した図である。抗dsDNA抗体のみisotype群で１匹血液が採取できずn=3となっている。各データの箱ひげ図は、左から順に、非塗布群、anti-TIGIT塗布群及びisotype塗布群をそれぞれ示す。*：p<0.05 抗TIGIT agonistic抗体の投与が、イミキモド誘発ループスモデルマウスの免疫応答に及ぼす効果を示した図である。上段左から、脾臓中のCD4+ T細胞に占めるCD69+（活性化）T細胞の割合、CD4+ T細胞に占めるCD4+ Effector memory T（Tem）細胞及びTfh細胞の割合、B220+細胞に占める胚中心（GC）B細胞の割合、下段左から、脾細胞に占める形質細胞の割合、及び該マウス血漿中の抗dsDNA抗体量を、３群（isotypeのみ投与、イミキモド塗布＋anti-TIGIT投与、イミキモド塗布＋isotype投与それぞれn=4, 5, 5）で比較した。各棒グラフは、左から順に、非塗布群、isotype塗布群及びanti-TIGIT塗布群をそれぞれ示す。*：p<0.05 抗TIGIT agonistic抗体が、EAEマウスの臨床スコアを改善することを示した図である。1群6匹で施行し、isotype投与群、抗TIGIT agonistic抗体投与群について臨床スコアを時系列で示した。 抗TIGIT agonistic抗体投与により、EAEマウスの脳、脊髄、脾臓中のTreg細胞が増殖することを示した図である。1群3匹で施行し、isotype投与群、抗TIGIT agonistic抗体投与群それぞれにおける脳、脊髄、脾臓中の細胞を染色しTreg細胞の割合を比較した。各データの箱ひげ図は、左から順に、anti-TIGIT塗布群及びisotype塗布群をそれぞれ示す。
（発明の詳細な説明）
ヒトTIGITに結合する抗体又はその断片
　本発明は、特定の配列を含む相補性決定領域（CDR）を有し、ヒトTIGITに結合する抗体又はその断片を提供する。以下では、上記抗体と、その断片とを包含するものとして、「本発明の抗体」との用語を用いるものとする。また、本発明の抗体は、単離されたものでもよい。本明細書において、「単離された」とは、特定の成分（例：本発明の抗体、該抗体をコードする核酸等）が、その天然環境の成分（例：細胞等）から同定、分離され、あるいは回収されている状態を意味する。
　本発明の抗体は、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の第３のCDR（CDR3ともいう。）と、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の第３のCDRを含む。また、一態様において、本発明の抗体は、ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の第１のCDR（CDR1ともいう。）及びｉｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域第２のCDR（CDR2ともいう。）、並びにｉｉｉ）配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の第１のCDR及びｉｖ）チロシン－アラニン－セリン（ＹＡＳ）で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の第２のCDRを含む。配列番号２～４でそれぞれ示される重鎖可変領域のCDR1～3を含む重鎖可変領域の一例として、配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むものが挙げられるが、重鎖可変領域はこの配列を含むものに限定されるものではない。また、配列番号５、ＹＡＳ及び配列番号６でそれぞれ示されるCDR1～3を含む軽鎖可変領域の一例として、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むものが挙げられるが、軽鎖可変領域はこの配列を含むものに限定されるものではない。
抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体を含む免疫・炎症性疾患治療薬
　本発明は、抑制性免疫チェックポイント分子であるヒトTIGITを活性化する抗ヒトTIGIT抗体を有効成分とする免疫・炎症性疾患治療薬（以下、「本発明の治療薬」と称することがある。）を提供する。本発明の治療薬の有効成分である抗体の一態様として、特定の配列を含む相補性決定領域（CDR）を有し、ヒトTIGITに結合する抗体又はその断片が挙げられる。以下では、本発明の有効成分である上記抗体と、その断片とを包含するものとして、「抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体」との用語を用いるものとする。
　下述の実施例に示される通り、抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体は、濾胞性ヘルパーT（Tfh）細胞に対する抑制作用（以下、「Tfh細胞抑制作用」と称することがある。）を有するため、Tfh細胞の活性化に起因する免疫・炎症性疾患の治療効果を有する。さらに、抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体は、Treg細胞に対する活性化作用（以下、「Treg細胞活性化作用」と称することがある。）を有する。従って、本発明の別の態様において、抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体を含有してなる、Tfh細胞の抑制剤、あるいは抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体をTfh細胞に接触させる工程を含む、Tfh細胞の抑制方法が提供される。さらに別の態様において、抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体を含有してなる、Treg細胞の活性化剤、あるいは抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体をTreg細胞に接触させる工程を含む、Treg細胞の活性化方法も提供される。
　本明細書において、「免疫・炎症性疾患」とは、免疫寛容の破綻による炎症を伴う疾患を意味する。本発明の治療薬の対象疾患としての免疫・炎症性疾患としては、例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、全身性強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、IgG4関連疾患、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎、結節性多発動脈炎、ANCA関連血管炎、混合性結合組織病、脊椎関節炎、ベーチェット病、成人Still病、多発性硬化症、視神経脊髄炎、重症筋無力症、原発性胆汁性肝硬変、非アルコール性脂肪性肝疾患、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬（乾癬性関節炎）、尋常性白斑、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、特発性拡張型心筋症、1型糖尿病、バセドウ病、橋本病、IgA腎症、膜性腎症、溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病が挙げられる。本発明の治療薬の投与対象としては、例えば、霊長類動物が挙げられ、かかる霊長類動物としては、キツネザル、ロリス、ツバイ、サル（例：カニクイザル等）、ヒトが挙げられる。好ましくはヒトである。よって、抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体の有効量又は本発明の治療薬を前記霊長類動物に投与する治療方法も、本発明に含まれる。
　本明細書において、「Tfh細胞抑制作用」には、Tfh細胞の増殖抑制作用と、Tfh細胞の機能の抑制作用との両方が包含されるものとする。かかるTfh細胞の機能としては、例えば、B細胞の成熟と活性化、抗体産生の促進効果などが挙げられる。また、「Treg細胞活性化作用」には、Treg細胞の増殖促進作用と、Treg細胞の機能の活性化作用との両方が包含されるものとする。かかるTreg細胞の機能としては、例えば、エフェクターＴ細胞の抑制を介した、自己免疫応答の抑制、IL-10やTGFβなどの抗炎症性サイトカインの分泌を介した、過剰な炎症の抑制機能などが挙げられる。
（抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体）
　一態様において、抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体は、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の第３のCDR（CDR3ともいう。）と、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の第３のCDRを含む。また、抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体は、さらにｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の第１のCDR（CDR1ともいう。）及びｉｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域第２のCDR（CDR2ともいう。）、並びにｉｉｉ）配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の第１のCDR及びｉｖ）チロシン－アラニン－セリン（ＹＡＳ）で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の第２のCDRを含み得る。配列番号２～４でそれぞれ示される重鎖可変領域のCDR1～3を含む重鎖可変領域の一例として、配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むものが挙げられるが、重鎖可変領域はこの配列を含むものに限定されるものではない。また、配列番号５、ＹＡＳ及び配列番号６でそれぞれ示されるCDR1～3を含む軽鎖可変領域の一例として、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むものが挙げられるが、軽鎖可変領域はこの配列を含むものに限定されるものではない。
　抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体は、TIGITに結合することで、TIGITを活性化する（換言すれば、TIGITに対してアゴニスト活性を発揮する）ことが可能となる。本明細書において、「TIGITを活性化する」とは、該抗体を結合させていない対照（TIGITの活性化作用を有さない抗体を接触させた群も含む。）と比較して、あるいは該抗体を結合させる前と比較して、該抗体を結合させることで、TIGITを介したシグナルが活性化することを意味する。また、本明細書において、「抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体」は、該抗体を結合させていない対照と比較して、あるいは該抗体を結合させる前と比較して、該抗体を結合させることで、TIGITを介したシグナルが活性化する抗体を意味する。かかるTIGITを介したシグナルの活性化は、自体公知の方法のいずれかの方法、例えばルシフェラーゼアッセイなどにより評価することができる。また、かかる評価方法により、上記で記載した具体的なCDR1～3を含む抗体以外の抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体をスクリーニングすることもできる。
　本明細書において、「結合する」という用語は、「結合する能力を有すること(having an ability to bind)」を意味し、1つ又はそれ以上の他の分子と非共有結合複合体を形成する能力を指す。本発明の複合体の例として、抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体とTIGITとの複合体が挙げられる。抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体は、配列番号１で示されるアミノ酸配列（NCBI Reference Sequence: NP_776160.2）からなるヒトTIGITタンパク質に結合する。一態様において、抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体は、ヒトTIGITタンパク質だけでなく、ヒト以外の霊長類（例：カニクイザル等）のTIGITにも結合するが、げっ歯類（例：マウス等）のTIGITには結合しない。従って、以下では、「ヒトTIGIT」を「霊長類TIGIT」と読み替えることもできる。かかる抗体の結合能は、自体公知の方法のいずれかにより評価することができ、例えば、TIGITと抗体とを接触させ、TIGITと結合した抗体を検出又は測定することにより行うことができる。
　抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体は、上記重鎖可変領域のCDR3及び軽鎖可変領域のCDR3を含むものであればいかなる抗体又はその断片であってもよい。抗体のクラスは、特に限定されず、IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等のいずれのアイソタイプであってもよい。好ましくは、IgG又はIgMであり、精製の容易性等を考慮するとより好ましくはIgGである。また、抗体の断片としては、上記重鎖可変領域のCDR3及び軽鎖可変領域のCDR3を含み、ヒトTIGITに結合するものであれば特に限定されず、例えば、上記CDRを有する、Fab、Fab’、F（ab’）2等の抗体断片などが挙げられる。
　また、抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体は、フルボディの抗体や、Fab領域とFcドメインとを結合させた抗体のように、Fcドメインを有することが好ましい。かかるFcドメインは、野生型のものであってもよいが、変異体であってもよい。当技術分野で既知のとおり、抗体のFcドメインは、多数のFcレセプター及びリガンドと相互作用し、エフェクター機能と称される重要な機能を与える。かかるFcレセプターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ヒトにおける）アイソフォームFcγRIa、FcγRIb及びFcγRIcを含むFcγRI（CD64）；アイソフォームFcγRIIa（アロタイプH131及びR131を含む）、FcγRIIb（FcγRIIb-1及びFcγRIIb-2を含む）及びFcγRIIcを含むFcγRII（CD32）；並びにアイソフォームFcγRIIIa（アロタイプV158及びF158を含み、抗体依存性細胞傷害（ADCC）と関連する））及びFcγRIIIb（アロタイプFcγRIIIb-NA1及びFcγRIIIb-NA2を含む）を含むFcγRIII（CD16）；FcRn（新生児型レセプター）、C1q（補体依存性細胞傷害（CDC）に関与する補体タンパク質）並びにFcRn（血清半減期に関与する新生児型レセプター）。適したアミノ酸変異は、以下で概説されるように、１つ以上の位置でなされ得る：例えば、US特許出願11／841,654及びそこで引用される参考文献、US2004／013210、US2005／0054832、US2006／0024298、US2006／0121032、US2006／0235208、US2007／0148170。
　また、抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体の上記CDR以外の部分（例えば、CDR以外の可変領域部分、定常領域、Fcドメインなど）は、TIGITに対してアゴニスト活性を有する限りいかなるアミノ酸配列からなってもよく、また、いかなる動物に由来してもよい。かかる動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、イヌ、サル、オランウータン、チンパンジー、ヒトなどの哺乳動物が挙げられるが、好ましくはヒト由来である。
　抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体は、抗体又はその断片をコードする核酸又はベクターを使用して遺伝子工学的に生産することができる。例えば、抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体をコードする核酸を宿主細胞に導入して抗体又はその断片を発現させ、該抗体又はその断片を自体公知の方法により単離することができる。かかる単離方法としては、例えば、プロテインA等を用いたアフィニティカラム、その他のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析などが挙げられ、これらの方法を適宜組み合わせてもよい。また、抗体の断片は、上記で作製したフルボディの抗体をパパイン、ペプシン等の酵素で処理して作製することもできる。
（抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体をコードする核酸）
　本発明は、前記本発明の抗体をコードする単離された核酸（以下、「本発明の核酸」と称することがある。）を提供する。本発明の核酸には、本発明の抗体の重鎖をコードする核酸及び軽鎖をコードする核酸、抗体の断片をコードする核酸などが包含される。本発明の抗体や抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体又はその断片をコードする核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよいが、好ましくはDNAである。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNA又はDNA：RNAのハイブリッドでもよい。また、抗体又はその断片をコードする核酸は、in vitro又は細胞中で、ポリペプチドを発現できる限り、天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はこれらの混合物を含んでもよい。
　抗体又はその断片をコードする核酸（例えば、本発明の核酸）は、自体公知の方法により構築することができる。例えば、配列表に記載した抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体のアミノ酸配列に基づき、該アミノ酸をコードする塩基配列を設計し、化学的にDNA鎖を合成するか、若しくは合成した一部オーバーラップするオリゴDNA短鎖を、PCR法やGibson Assembly法を利用して接続することにより、抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体の全長又は一部をコードするDNAを構築することが可能である。
　また、抗体又はその断片をコードする核酸は、発現ベクターに組み込むことができる。従って、上述した抗体又はその断片をコードする核酸のいずれかを含む発現ベクターが提供される。この場合において、抗体の重鎖をコードする核酸と、抗体の軽鎖をコードする核酸は、別々の発現ベクターに組み込んでもよいし、１つの発現ベクターに組み込んでもよい。1つの発現ベクターに組み込む場合には、これら２種類の核酸は、ポリシストロニック発現を可能にする配列を介して組み込んでもよい。ポリシストロニック発現を可能にする配列を用いることにより、1種類の発現ベクターに組み込まれている複数の遺伝子をより効率的に発現させることが可能になる。ポリシストロニック発現を可能にする配列としては、例えば、2A配列（例：口蹄疫ウイルス（FMDV）由来の2A配列（F2A）、ウマ鼻炎Aウイルス（ERAV）由来の2A配列（E2A）、Porcine teschovirus（PTV-１）由来の2A配列（P2A）、Thosea asigna virus（TaV）由来の2A配列（T2A配列）（PLoS ONE 3, e2532, 2008、Stem Cells 25, 1707, 2007））、内部リボソームエントリー部位（IRES）（U.S. Patent No. 4,937,190）などが挙げられる。
　上記ベクターに使用されるプロモーターとしては、例えば、EF1αプロモーター、CAGプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV－TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーター、TCR Vα遺伝子プロモーター、TCR Vβ遺伝子プロモーターなどが用いられる。
　上記ベクターは、上記プロモーターの他に、所望により、転写及び翻訳調節配列、リボソーム結合部位、エンハンサー、複製起点、ポリA付加シグナル、選択マーカー遺伝子などを含んでいてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。
（抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体をコードする核酸を含む宿主細胞）
　本発明の一実施態様において、上述した本発明の核酸の重鎖をコードする核酸と、軽鎖をコードする核酸とを含む発現ベクターを宿主細胞内に導入し、該細胞内で抗体を形成させることができる。従って、本発明の一態様において、本発明の核酸又はベクターを含む、宿主細胞（以下、「本発明の宿主細胞」と称することがある。）が提供される。さらに、前記宿主細胞を用いた、本発明の抗体の製造方法（以下、「本発明の製法」と称することがある。）が提供される。本発明の製法は、本発明の宿主細胞を、本発明の抗体が製造される条件下で培養する工程を含む。
　本発明の抗体や抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体を発現させる細胞として利用可能な細胞として、例えば、哺乳動物細胞が挙げられる。かかる哺乳動物細胞としては、例えば、American Type Culture Collection（ATCC）、Manassas、VAから入手可能な多くの不死化細胞株が挙げられ、これには、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HEK 293細胞、NSO細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞、サル腎臓細胞（COS）、ヒト肝細胞ガン細胞（例えば、Hep G2）、及び多数の他の細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。細菌（例：大腸菌等）、酵母、昆虫及び植物を含む（これらに限定されない）非哺乳動物細胞を用いて、組換え抗体を発現させることもできる。また、抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体は、ウシやニワトリなどのトランスジェニック動物において製造することもできる。
　抗体又はその断片をコードする核酸（例えば、本発明の核酸）又はベクターを宿主細胞に導入する方法に特に限定はなく、公知の方法を用いることができる。核酸やプラスミドベクターを導入する場合には、例えば、リン酸カルシウム共沈殿法、PEG法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法などにより行うことができる。抗体又はその断片をコードする核酸はまた、RNAの形態で直接細胞に導入し、細胞内で抗体を発現するために用いてもよい。RNAの導入方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、リポフェクション法や電気穿孔法などが好適に使用できる。
（抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体の製造方法）
　得られた組換え宿主細胞は、発現に適した条件下（例えば、インデューサーの存在下、適した非ヒト動物中、適した塩、増殖因子、抗生物質、栄養補助剤などを添加した培地など）で維持でき、それによりコードされた１つ以上のポリペプチドが製造される。いくつかの場合において、重鎖が１つの細胞で製造され、軽鎖が別の細胞で製造される。
　本発明の抗体や抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体を発現させる細胞として哺乳動物細胞を用いる場合には、該細胞を培養する培地としては、例えば、約5～約20%の胎児ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）〔Science，122，501 (1952)〕，ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）〔Virology，8，396 (1959)〕，RPMI 1640培地〔The Journal of the American Medical Association，199，519 (1967)〕，199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine，73，1 (1950)〕などが用いられる。培地のpHは、好ましくは約6～約8である。培養は、通常約30℃～約40℃で行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
ヒトTIGITの検出若しくは測定用試薬又はキット
　上述の通り、本発明の抗体は、ヒトTIGITに対する結合能を有する。従って、別の態様において、本発明の抗体を含む、ヒトTIGIT（又はヒト以外のTIGIT）の検出又は測定用試薬（以下、「本発明の試薬」と称することがある。）が提供される。かかる本発明の抗体に、標識物質などを結合させて抗体自体をヒトTIGITの検出又は測定用試薬として用いることもできるし、他の試薬などと組み合わせて、ヒトTIGITを検出又は測定することもできる。よって、本発明の抗体を含む、ヒトTIGITの検出又は測定用キット（以下、「本発明のキット」と称することがある。）も提供される。本発明の試薬又はキットは、ウエスタンブロッティング、免疫染色、EIA（Enzyme Immunoassay）又はELISA（Enzyme-Linked immunosorbent assay）を用いた方法（例：直接法、間接法、競合法、サンドイッチ法等）などに用いることができる。
　本発明の試薬又はキットには、本発明の抗体に加えて他の抗体（その断片を含む、以下同様）又は試薬等が含まれていてもよく、これらの抗体又は試薬等は、あらかじめ上記抗体と一緒になっていてもよいし、別々の容器に格納されていてもよい。抗体又は試薬等としては、ヒトTIGITに結合する本発明の抗体とは異なる抗体又はその断片（以下、「抗ヒトTIGIT抗体」と称することがある。）、二次抗体、標識物質（例えば、蛍光色素（例：フルオレセイン等）、酵素（例：Horseradish peroxidase：HRP、アルカリホスファターゼ（AP）等）、放射性物質など）、基質（APの基質であるPNPP（p-ニトロフェニルホスフェート）、HRPの基質であるABTS (2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt)、OPD(o-phenylenediamine dihydrochloride)、TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)等）、酵素の反応を停止するための停止液、担体、標識物質が結合したヒトTIGIT（以下、「標識ヒトTIGIT」と称することがある。）、反応容器の他に、処理液や抗体を希釈するための緩衝液、濃度が既知の標準物質、陽性対照（例、組換えヒトTIGIT等）、陰性対照、プロトコールを記載した指示書などが挙げられる。これらの試薬等は、必要に応じてあらかじめ混合しておくこともできる。
　上記試薬又はキットに含まれる本発明の抗体は、あらかじめ担体に固相化されていてもよい。本発明に用いる担体としては特に限定されず、例えば、ポリスチレンなどのポリマー、ガラスビーズ、磁性粒子、マイクロプレート、イムノクロマトグラフィー用濾紙、ガラスフィルターなどの不溶性担体を挙げることができる。好ましくは、ELISAに用いるマイクロプレートである。また、ヒトTIGIT（標識されたヒトTIGIT、BSAなどの他のペプチドが結合したヒトTIGITも含む）が上記担体（好ましくは、マイクロプレート）に固相化されていてもよい。従って、本発明の一実施態様において、本発明の抗体が固相化されたマイクロプレートを含むELISA用の試薬又はキット、あるいはヒトTIGITが固相化されたマイクロプレート及び本発明の抗体を含むELISA用の試薬又はキットが提供される。
　二次抗体を含む本発明の試薬又はキットは、例えば、ウエスタンブロッティング、免疫染色、EIA又はELISAの間接法などに用いることができる。二次抗体は、本発明の抗体と結合できる限り特に限定されず、適宜選択することができる。また、二次抗体は、上記の標識物質が結合していることが好ましく、上記試薬又はキットには、該標識物質に対する上記基質等を含んでいてもよい。本発明の試薬又はキットをELISA間接法に用いる場合には、例えば、マイクロプレートにヒトTIGITを固相化し、本発明の抗体、続けてその抗体に対する酵素標識された二次抗体を反応させ、洗浄後、マイクロプレートに残る酵素活性を検出又は測定することで、ヒトTIGIT又はその量を検出又は測定することができる。
　標識ヒトTIGITを含む本発明の試薬又はキットは、例えば、EIA又はELISAの競合法などに用いることができる。標識ヒトTIGITは、本発明の抗体と結合できる限り特に限定されない。ヒトTIGITに結合させる標識物質としては、特に限定されず、例えば、上記の蛍光色素、酵素などが挙げられる。標識物質は、ヒトTIGITに直接結合させてもよく、間接的に結合させてもよい。直接的な結合は、例えば、リンカー（例：NHSエステル、マレイミド等）等を介した架橋反応などにより行われるが、この方法に限定されない。間接的な結合は、例えば、ビオチンに１つ以上のタグ（例：ビオチン等）を結合させ、該タグに結合する物質（例：（ストレプト）アビジン、タグに対する抗体等）を介して、標識物質とタグとを結合させることなどにより行うことができる。従って、標識ヒトTIGITは、タグが付加したヒトTIGITと、該タグに結合する物質を有する標識物質とが、異なる物質である形態により提供されてもよい。上記試薬又はキットには、標識ヒトTIGIT以外にも、標識物質に対する、上述の基質等を含んでいてもよい。本発明の試薬又はキットをEIA又はELISAの競合法に用いる場合には、例えば、マイクロプレートに本発明の抗体を固相化し、ヒトTIGITを含む試料及び濃度が既知の標識ヒトTIGITを、同一マイクロプレート内で同時に反応させ、反応後にマイクロプレートに残る酵素活性を検出又は測定することで、ヒトTIGIT又はその量を検出又は測定することができる。
　抗ヒトTIGITを含む本発明の試薬又はキットは、例えば、ELISAサンドイッチ法などに用いることができる。ヒトTIGITに結合する抗体は、ヒトTIGITに結合できる限り特に限定されないが、標識物質が結合していることが好ましい。かかる標識物質としては、特に限定されず、例えば、上記の蛍光色素、酵素などが挙げられる。上記試薬又はキットには、抗ヒトTIGIT抗体以外にも、標識物質に対する上記基質等を含んでいてもよい。本発明の試薬又はキットをELISAサンドイッチ法に用いる場合には、例えば、マイクロプレートに本発明の抗体を固相化し、ヒトTIGITを反応させ、続いて標識した抗ヒトTIGIT抗体を反応させ、洗浄後、マイクロプレートに残る酵素活性を検出又は測定することで、ヒトTIGITを検出又は測定することができる。
　抗ヒトTIGIT抗体は、ヒトTIGITやその部分ペプチド、あるいはアミノ酸等が付加された修飾ヒトTIGITを免疫原として用い、既存の一般的な製造方法によって製造することができる。かかる抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAb）、これらの断片などが含まれるが、これらに限定されない。好ましい抗体は、モノクローナル抗体又はその断片である。抗体又はその抗体の断片としては、例えば、ヒトTIGITへの結合能を有する、Fab、Fab’、F（ab’）2等の断片等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール（PEG）等のタンパク質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などが挙げられるが、これらに限定されない。また、上記抗ヒトTIGIT抗体として、市販の抗体を用いてもよい。
ヒトTIGITの検出又は測定方法
　別の態様において、本発明は、本発明の抗体、試薬又はキットを用いた、ヒトTIGITの検出又は測定方法（以下、「本発明の方法」と称することがある。）を提供する。一実施態様において、本発明の方法は、
　　（１）試料中のヒトTIGITと、本発明の抗体とを接触させる工程、及び
　　（２）該ヒトTIGITと結合した本発明の抗体を検出又は測定する工程
を含む。前記方法は、例えば、ウエスタンブロッティング、免疫染色、EIA又はELISA（例：直接法、間接法、サンドイッチ法等）などに適用することができる。
　上記工程（１）において、試料中のヒトTIGITと、本発明の抗体とを接触させる方法は特に限定されないが、例えば、試料と、本発明の抗体を含む溶液とを混合することなどにより行うことができる。試料が組織切片である場合には、該組織切片に、本発明の抗体を含む溶液を添加することにより、ヒトTIGITと本発明の抗体とを接触させることもできる。ヒトTIGITと本発明の抗体とを接触させる際の条件としては、特に制限されないが、通常0～45℃の温度下で接触させ、好ましくは0～40℃の温度下で接触させ、より好ましくは4～37℃の温度下で、さらに好ましくは25℃～37℃の温度下で接触させる。また、接触させる時間としても特に制限はないが、通常5分～6時間であり、好ましくは10分～2時間、より好ましくは20分～1時間である。
　また、上記工程（１）は、本発明の抗体が固相化された担体に、試料を添加すること、又は試料中のヒトTIGITを担体に固相化させ、該担体に本発明の抗体を添加することなどにより行うことができる。かかる担体としては、上記１．で記載のものと同様のものを用いることができる。本発明の抗体又は試料中のヒトTIGITを担体に固相化させる方法としては、特に制限されないが、例えば、物理吸着、静電的相互作用、疎水的相互作用、架橋剤等を利用する方法などが挙げられる。本発明の抗体の固相化時の溶液中での濃度は、担体の材質、形状、固定化の方法等に合わせて適宜調整すればよく、例えば、5～50μg/mLの濃度が挙げられ、好ましくは10～40μg/mLである。ヒトTIGITを固相化する場合にも、ヒトTIGITの溶液中の濃度を適宜調節することができる。固相化後の担体に対しブロッキング剤によるブロッキング操作を行なうと、本発明の抗体又はヒトTIGITの非特異吸着が抑えられ、測定時のバックグラウンドも抑えられる。ブロッキング剤は、EIA、ELISAなどの抗原抗体反応を利用した測定の分野で通常用いられる剤の中から適宜選択すればよく、好ましいブロッキング剤として、コラーゲンペプチドが挙げられる。
　工程（１）の後に、ヒトTIGITに結合できなかった抗体や、抗体に結合できなかったヒトTIGITを除去するため、洗浄工程を設けてもよい。洗浄工程に用いる洗浄液としては、例えば、緩衝液（pH6～8）などが挙げられ、より具体的には、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、HEPES緩衝液などが挙げられる。また、これらの緩衝液には、塩類、界面活性化剤、タンパク質、糖、双性イオン化合物等を適宜含有していてもよい。また、市販の免疫反応用キットに含まれる洗浄液も好適に用いられる。
　上記工程（２）における、ヒトTIGITと結合した本発明の抗体を検出又は測定する方法は特に制限されず、自体公知の方法により行うことができる。かかる方法としては、「Methods in ENZYMOLOGY」Vol.70(Immunochemical Techniques(Part A))、同書Vol.73(Immunochemical Techniques(Part B))、同書Vol.74(Immunochemical Techniques(Part C))、同書Vol.84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、同書Vol.92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同書Vol.121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))（以上、アカデミックプレス社発行）などに記載の方法が挙げられる。
　具体的には、例えば、上記工程（１）で標識物質が結合された本発明の抗体を用いた場合には、該標識物質又はその量を検出又は測定することで、ヒトTIGITと結合した本発明の抗体又はその量を検出又は測定することができる。あるいは、工程（２）の後に、本発明の抗体とヒトTIGITとの複合体と、本発明の抗体に結合する、標識物質が結合された二次抗体、あるいは標識物質が結合された抗ヒトTIGIT抗体とを接触させ、その標識物質又はその量を検出又は測定してもよい。検出又は測定の前に、本発明の抗体又はヒトTIGITに結合できなかった二次抗体又は抗ヒトTIGIT抗体を除去するため、洗浄工程を設けてもよい。洗浄工程は、上述した、工程（１）の後に任意に行う洗浄工程と同様の方法により行うことができる。また、二次抗体及び抗ヒトTIGIT抗体は、上記３で記載したものと同様のものを用いることができる。
　標識物質として蛍光物質を用いる場合には、それが発する蛍光を、プレートリーダー等を用いて、標識物質又はその量を検出又は測定することができる。また、標識物質として酵素を用いる場合には、当該酵素の作用によって分解して発色、発光等する基質を添加することにより、その発色、発光や、そのレベル等を、プレートリーダー等を用いて検出又は測定することができる。また、標識物質として放射性物質を用いる場合には、当該物質の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により検出又は測定することができる。このようにして検出又は測定されたデータに基づき、画像処理ソフト（例：Image J等）などを用いてヒトTIGITの量を定量化することもできる。
　また、本発明の方法の別の実施態様において、本発明の方法は、
　（１’）標識ヒトTIGIT及び試料中のヒトTIGITと、本発明の抗体とを接触させる工程、及び
　（２’）該標識ヒトTIGITと結合した本発明の抗体を検出又は測定する工程
を含む。前記方法は、例えば、EIA又はELISAの競合法などに適用することができる。
　上記工程（１’）において、標識ヒトTIGIT及び試料中のヒトTIGITと、本発明の抗体とを接触させる方法は特に限定されないが、例えば、標識ヒトTIGITを含む溶液と、試料と、本発明の抗体を含む溶液とを混合することなどにより行うことができる。標識ヒトTIGIT及びヒトTIGITと本発明の抗体とを接触させる際の条件としては、上記工程（１）で記載した条件と同様の条件が挙げられる。
　また、上記工程（１’）は、本発明の抗体が固相化された担体に、試料及濃度が既知の標識ヒトTIGITを添加すること、又は試料中のヒトTIGITを担体に固相化させ、該担体に標識ヒトTIGIT及び本発明の抗体を添加することなどにより行うこともできる。かかる担体の種類や、固相化方法、ブロッキング剤等については、上記工程（１）で記載のものと同様のものを用いることができる。
　工程（１’）の後に、ヒトTIGIT又は標識ヒトTIGITに結合できなかった抗体や、抗体に結合できなかったヒトTIGIT又は標識ヒトTIGITを除去するため、洗浄工程を設けてもよい。洗浄工程に用いる洗浄液としては、上記工程（１）で記載のものと同様のものを用いることができる。
　上記工程（２’）における、標識ヒトTIGITと結合した本発明の抗体を検出又は測定する方法は、標識ヒトTIGITに結合した標識物質又はその量を検出又は測定することで、ヒトTIGITと結合した本発明の抗体又はその量を検出又は測定することができる。
　標識物質として蛍光物質を用いる場合には、それが発する蛍光を、プレートリーダー等を用いて、標識物質又はその量を検出又は測定することができる。また、標識物質として酵素を用いる場合には、当該酵素の作用によって分解して発色、発光等する基質を添加することにより、その発色、発光や、そのレベル等を、プレートリーダー等を用いて検出又は測定することができる。また、標識物質として放射性物質を用いる場合には、当該物質の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により検出又は測定することができる。本発明の方法において、試料中に含まれるヒトTIGITの量が多い場合は、本発明の抗体と結合できる標識ヒトTIGITが減少し、標識レベル（例：発色又は蛍光レベル）が弱くなる。一方で、試料中のヒトTIGITの量が少ない場合は、本発明の抗体と結合できる標識ヒトTIGITが増加し、標識レベル（例：発色又は蛍光レベル）が強くなる。
　本発明の方法で用いる試料としては、例えば、動物から採取した試料が挙げられる。また、前記試料は、ヒトTIGITを含むこと（例えば、ヒトTIGITを発現する細胞の形態などを含むこと）が既知の試料であってもよいし、ヒトTIGITが含まれるか不明な試料であってもよい。かかる動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、イヌ、サル、オランウータン、チンパンジー、ヒトなどの哺乳動物が挙げられる。動物由来の試料としては、例えば、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙、汗、乳汁、鼻汁、精液、胸水、消化管分泌液、脳脊髄液、組織間液、及びリンパ液などが挙げられ、好ましくは血清及び血漿である。また、細胞を培養することで得られる細胞集団であることもまた好ましい。これらの試料は、自体公知の方法により得ることができ、例えば、血清や血漿は、常法に従って被検動物から採血し、液性成分を分離することにより調製することができ、脳脊髄液は、脊椎穿刺等の公知の手段により採取することができる。
本発明の抗体を含む医薬
　また本発明は、上記本発明の抗体を有効成分として含有する医薬を提供する。本発明の抗体により、CD8陽性T細胞などの細胞傷害性T細胞（CTL）又はナチュラルキラー（NK）細胞でのTIGITの活性化を介した免疫活性化を抑制でき、また制御性T細胞（Treg細胞）でのTIGITの活性化を介した免疫応答抑制能力を増強し得る。従って、本発明の抗体を含有してなる医薬は、自己免疫疾患や、CTL又はNK細胞の活性化に関与する疾患の予防又は治療のために用いることができる。かかる疾患としては、例えば、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、多発性硬化症（MS）、炎症性腸疾患（IBD）、セリアック病、移植片対宿主病（GVHD）、過敏性腸症候群が挙げられる。また、上記疾患として、例えば、シェーグレン症候群、非アルコール性脂肪肝炎（NASH）及び原発性胆汁性肝硬変も挙げられる。本発明の医薬の投与対象としては、例えば、霊長類動物が挙げられ、かかる霊長類動物としては、キツネザル、ロリス、ツバイ、サル（例：カニクイザル等）、ヒト、好ましくはヒト、が挙げられる。
　本発明の抗体や抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体は、常法に従って医薬組成物として調製することが好ましい。更に、本発明の治療薬は、必要に応じ、医薬的に許容される担体及び/又は添加物を含んでもよい。例えば、界面活性剤（PEG、Tween等）、賦形剤、酸化防止剤（アスコルビン酸等）、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤（リン酸、クエン酸、他の有機酸等）、キレート剤（EDTA等）、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含むことができる。しかしながら、上記医薬組成物は、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜含んでいてもよい。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。また、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン及び免疫グロブリン等のタンパク質、並びに、アミノ酸を含んでいてもよい。注射用の水溶液とする場合には、抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体を、例えば、生理食塩水、ブドウ糖又はその他の補助薬を含む等張液に溶解する。補助薬としては、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、さらに、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、PEG等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート80、HCO-50）等と併用してもよい。
　また、必要に応じポリペプチドをマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ[メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム(リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等)とすることもできる（Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition ＆， Oslo Ed． (1980)等参照）。
　医薬組成物中の抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体の含有量は、例えば、医薬組成物全体の約0.01～100重量％、好ましくは0.1～99.9重量％である。
　上記医薬組成物は、経口又は非経口のいずれでも投与可能であるが、好ましくは非経口投与される。具体的には、注射及び経皮投与により患者に投与される。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射又は皮下注射等により全身又は局所的に投与することができる。治療部位又はその周辺に局所注入、特に筋肉内注射してもよい。経皮投与剤型の例としては、例えば、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、湿布剤、及び貼付剤等があげられ、全身又は局所的に投与することができる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、1回につき体重1kgあたり抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体として0.5mg～10mgの範囲で選ぶことが可能である。しかしながら、本発明の医薬組成物は、これらの投与量に制限されるものではない。
　本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
（配列番号１）ヒトTIGITのアミノ酸配列
（配列番号２）Clone M1-8 H－CDR1のアミノ酸配列
（配列番号３）Clone M1-8 H－CDR2のアミノ酸配列
（配列番号４）Clone M1-8 H－CDR3のアミノ酸配列
（配列番号５）Clone M1-8 L－CDR1のアミノ酸配列
（配列番号６）Clone M1-8 L－CDR3のアミノ酸配列
（配列番号７）Clone M1-8 重鎖可変領域のアミノ酸配列（マウス型重鎖可変領域）
（配列番号８）Clone M1-8 軽鎖可変領域のアミノ酸配列（マウス型軽鎖可変領域）
　本発明を以下の実施例でさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はそれら実施例に限定されない。
実施例１：新規抗ヒトTIGITアゴニスティック抗体（M1-8）の作製
＜組み換えヒトTIGIT-His-mFcタンパク質の作製＞
　組み換えヒトTIGIT-His-mFcタンパク質の調製は、Expi293 Expression System（Thermo）を用いて行った。ヒトTIGIT-His-mFc発現プラスミドをトランスフェクトした細胞を培養後、その培養上清からNi-NTA カートリッジ（富士フイルム和光純薬社）カラムとSuperdex200 pgカラムによるゲルろ過によって、組み換えヒトTIGIT-His-mFcタンパク質を精製した。
＜免疫方法＞
　6-8週齢のCD2F1雌マウスの両膝窩に、組み換えヒトTIGIT-His-mFcタンパク質をTiterMaxと共に10 μg/匹となるように皮下免疫した。以後3～4日おきに同量の免疫原をCpG/Alumと共に11回追加免疫した。リンパ節を摘出する３日前に最終免疫として、免疫原をリン酸緩衝生理食塩水（PBS, pH 7.4）で1 mg/mLに希釈したものを100 μLずつ腹腔内投与した。
＜血中抗体価の測定＞
　初回免疫から36日後に尾静脈から採血し、得られた血液を生理食塩水で100倍希釈した。希釈した血液を4℃で5分間遠心した後上清を回収することで抗血清を得た。抗体価は下記の方法により測定した。ドキシサイクリン発現誘導ヒトTIGIT発現細胞をドキシサイクリン有無の条件下で2日間培養した。細胞をPBSで洗浄したのち、Cell Dissociation buffer（GIBCO）を添加し、室温で10分間静置することで、細胞をフラスコから剥離した。得られた細胞をFACSバッファー（1% FBSを含むPBS）で2回洗浄後、1 x 106 cells/mLの細胞密度になるように、FACSバッファーを用いてそれぞれ懸濁した。懸濁液を100 μLずつ96ウェルV底プレートに分注し、遠心したのち上清を除去した。このプレートに、FACSバッファーで希釈した抗血清を100 μLずつ分注し、4℃で30分間静置した。FACSバッファーで3回洗浄後、AlexaFluoro647（登録商標）標識された抗マウスIgG抗体を100 μLずつ分注し、4℃で30分間静置した。FACSバッファーで2回洗浄後、200 μLのFACSバッファーで懸濁し、結合した抗体をCytomics FC500MPLを用いて測定した。
　図1に得られたMedian fluorecence intensityを示す。組み換えTIGITタンパク質を免疫したマウスの抗血清において、ドキシサイクリン発現誘導ヒトTIGIT発現細胞に対する抗体価の上昇が認められた。
＜モノクローナル抗体の作製＞
　最終免疫3日後に、抗体価上昇が認められたマウス、No.1, 2, 4, 5からリンパ節を摘出し、40 μmストレーナー上で、圧迫、ろ過し、DMEMに懸濁した。ハイブリドーマ作製のための融合パートナーにはP3-X63.Ag8.U1 (P3U1) を用いた。リンパ球及びP3U1をそれぞれDMEMで3回洗浄し、細胞数の比が1:1になるように混合した。フュージョンバッファー（0.3M mannitol, 0.1 mM calcium chloride, 0.1 mM magnesium sulphate）で2回洗浄した細胞を1.51 x 107 cells/mLにフュージョンバッファーで懸濁した。細胞融合にはBTXを用いて、マニュアルに従い実施した。融合後の細胞をClonalCellTM-HY Medium C（STEMCELL）で１回洗浄し、同培地で1.67 x 106 cells/mLになるように懸濁後、37℃、5% CO2条件下で一晩静置した。得られた融合細胞を遠心し、ClonaCellTM-HY Medium Cで1 x 106 cells/mLに懸濁後、ClonaCellTM-HY Medium Dと混合し、プレートに播種した。37℃、5% CO2条件下で10日間培養後、Clone Pixを用いてハイブリドーマコロニーをピッキングし、ClonaCellTM-HY Medium Eを200 μL/wellずつ添加したプレートに播種した。37℃、5% CO2条件下で3日間培養後培養上清を回収し、スクリーニングに供した。
＜一過性発現細胞の作製＞
　一過性発現細胞は、Expi293F 発現システム（Thermo）を用いてマニュアルに従って作製した。具体的には、対数増殖期にあるExpi293F細胞を1x106 cells/mLの細胞密度になるように懸濁後、35 mLずつ125 mLマイヤーフラスコに分注した。37.5 μgのTIGIT発現プラスミドと、50 μLの293FectinをそれぞれOptiMEM I培地に最終容量1.25 mLになるように希釈し室温で5分間静置した。希釈したDNA溶液と293Fectin溶液を混合し、さらに室温で20分間静置した。混合液を細胞に添加し37℃、8% CO2、120 rpmで２日間培養し細胞を回収した。
＜一次スクリーニング（Mirrorball assay）＞
　一次スクリーニングは一過性発現細胞株及びその親株を用いて行った。細胞を回収後、FACSバッファーで３回洗浄し、3 x 105 cells/mLに懸濁した細胞と同バッファーで1 μg/mLに希釈したAlexaFluor（登録商標）647標識抗マウスIgG（サブクラス1+2a+2b+3）抗体を等量ずつ混合し、20 μLずつ384ウェルプレートにそれぞれ分注した。そのプレートに、FACSバッファーで10倍希釈したハイブリドーマの培養上清を10 μLずつ添加し、プレートミキサーで撹拌後、１分間遠心した。室温で１時間静置後、プレートイメージャー（Mirrorball）を用いて蛍光強度を測定した。
＜ELISA法による培養上清中の抗体濃度測定＞
　96ハーフウェルELISAプレートにPBSで5 μg/mLに希釈した抗マウスIgG（サブクラス1+2a+2b+3）抗体を50 μLずつ分注し、4℃で一晩静置した。次に、洗浄バッファー（0.05% tween 20を含むPBS）でプレートを2回洗浄したのち、ブロッキングバッファー（20% イムノブロックを含む PBS）を100 μLずつ分注し、室温で1時間静置した。このプレートに、アッセイバッファー（10% イムノブロックを含むPBS）で100倍又は1,000倍希釈したハイブリドーマ培養上清又は、マウスIgG1スタンダード溶液（0-300 ng/mL）を50 μLずつ添加し、室温で1時間静置した。洗浄バッファーで3回洗浄したプレートに、HRP標識抗マウスIgG（サブクラス1+2a+2b+3）抗体を50 μLずつ分注し、室温で1時間静置した。洗浄バッファーで3回洗浄後、Sure Blue/TMB Peroxidase Substrate（KPL）を50 μLずつ分注し室温で5分間反応させた。0.5 M硫酸を50 μLずつ分注し反応を停止させたのち、プレートリーダー（SpectraMax）を用いて、450 nmの吸光度を測定した。検量線の作成及び濃度の算出にはSoftmaxを用いた。
　ヒト、サル、及びマウスTIGIT発現細胞はドキシサイクリン発現誘導CHO細胞株を用いて作製した。すなわち、ドキシサイクリン発現誘導CHO細胞株にヒト、サル、及びマウスTIGIT発現プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を限界希釈法にてクローニングした後、ドキシサイクリン含有培地で培養することによりTIGITの発現を誘導し、発現の確認された細胞をTIGIT発現細胞として選択した。
＜二次スクリーニング（FACS）＞
　二次スクリーニングは、血中抗体価測定と同様の方法で行った。すなわち、ドキシサイクリン発現誘導ヒトTIGIT発現細胞をドキシサイクリン有無の条件下で2日間培養した。細胞をPBSで洗浄したのち、Cell Dissociation buffer（GIBCO）を添加し、室温で10分間静置することで、細胞をフラスコから剥離した。得られた細胞をFACSバッファー（1% FBSを含むPBS）で2回洗浄後、1 x 106 cells/mLの細胞密度になるように、FACSバッファーを用いてそれぞれ懸濁した。懸濁液を100 μLずつ96ウェルV底プレートに分注し、遠心したのち上清を除去した。このプレートに、FACSバッファーで1 μg/mLに希釈したハイブリドーマ培養上清を100 μLずつ添加し、4℃で30分間静置した。FACSバッファーで3回洗浄後、AlexaFluoro647（登録商標）標識された抗マウスIgG抗体を100 μLずつ分注し、4℃で30分間静置した。FACSバッファーで2回洗浄後、200 μLのFACSバッファーで懸濁し、結合した抗体をCytomics FC500MPLを用いて測定した。
　図2に培養上清中のM1-8抗体のドキシサイクリン発現誘導ヒトTIGIT発現細胞に対する結合活性を示した。
＜三次スクリーニング（組み換えTIGIT、PVR発現細胞結合阻害アッセイ）＞
　FACSバッファーで2 nMに希釈した組み換えヒトTIGITヒトIgG1Fc融合タンパク質（R&D systems, 7898-TG-050）と10-1,000 ng/mLに希釈したハイブリドーマ培養上清をそれぞれ96ウェルV底プレート中で1:1になるように混合し、室温で30分間静置した。ドキシサイクリン存在下で２日間培養したドキシサイクリン発現誘導ヒトPVR発現細胞をFACSバッファーで1 x 106 cells/mLに懸濁し、100 μLずつ別の96ウェルV底プレートに分注した。細胞を含むプレートを遠心し、上清を廃棄後あらかじめ混合していたTIGIT、培養上清混合液を添加し4℃で30分間静置した。FACSバッファーで３回洗浄後、AlexaFluoro647（登録商標）標識された抗ヒトIgG抗体を100 μLずつ分注し、4℃で30分間静置した。FACSバッファーで2回洗浄後、200 μLのFACSバッファーで懸濁し、結合したTIGIT-FcをCytomics FC500MPLを用いて測定した。
　図3に組み換えTIGIT、PVR発現細胞結合阻害アッセイの結果を示す。市販の抗ヒトTIGIT抗体（clone MSBA43）はTIGITとPVR発現細胞の結合を阻害したが、培養上清中のM1-8抗体は阻害しなかった。
＜ELISA法による抗体のアイソタイピング＞
　96ハーフウェルELISAプレートにPBSで5 μg/mLに希釈した各種抗マウスアイソタイプ抗体（ITM、BioLegend）を50 μLずつ分注し、4℃で一晩静置した。次に、洗浄バッファー（0.05% tween 20を含むPBS）でプレートを2回洗浄したのち、SuperBlock (PBS) Blocking Buffer（Thermo）を100 μLずつ分注し、室温で1時間静置した。このプレートに、アッセイバッファー（10% SuperBlock (PBS) Blocking Bufferを含むPBS）で10倍希釈したハイブリドーマ培養上清を50 μLずつ添加し、室温で1時間静置した。洗浄バッファーで3回洗浄したプレートに、HRP標識抗マウスIgG抗体を50 μLずつ分注し、室温で1時間静置した。洗浄バッファーで3回洗浄後、Sure Blue/TMB Peroxidase Substrate（KPL）を50 μLずつ分注し室温で5分間反応させた。0.5 M硫酸を50 μLずつ分注し反応を停止させたのち、プレートリーダー（SpectraMax）を用いて、450 nmの吸光度を測定した。アイソタイピングの結果、M1-8抗体はmouse IgG1/kであることが分かった。
＜抗体のCDR領域の決定＞
　M1-8抗体のCDRはIMGTナンバリングシステムに従って定義した。
＜抗体精製＞
　ClonaCellTM-HY Medium Eで培養し、対数増殖期にあるハイブリドーマ懸濁液0.5 mLをDaigo’s T培地（10% Ultra Low IgG FBS, 1% MEM NEAA, 1% Sodium Pyruvate, 1% L-Alanyl-L-Glutamine, 1% Penicillin-Streptomycin, 43% F-12 nutrient mixture, 43% Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium）0.5 mLを含む24ウェルプレートに添加し、37℃、5%CO2条件下で培養した。2～3日培養後、Daigo’s T培地4 mLを含む6ウェルプレートに添加しさらに、2～3日培養することでDaigo’s T培地に馴化させた。細胞が十分に馴化したことを確認後、45 mLのDaigo’s Tを含むT-75フラスコに添加し、37℃、5% CO2条件下で培養した。7～10日後に培養液を回収し、遠心により培養上清を得た。
　モノクローナル抗体は、得られた培養上清からプロテインAレジンにより精製した。培養上清にPBSを用いて平衡化した0.6 mLの50%スラリープロテインAセファロースレジンを添加し、４℃で一晩振盪した。4℃で10分間遠心後、上清を一部吸引除去し残った培地でレジンを懸濁後24ウェルフィルタープレート（Whatman）に添加した。レジンを5 mLのPBSで３回洗浄後、2.5 mLの溶出バッファー（0.1 M Glycine-HCl/0.3 M NaCl, pH 3.0）で結合した抗体を溶出した。溶出液は、0.3 mLの中和バッファー（1 M Tris-HCl, pH 8.0）を用いてすぐに中和した。マウスIgG1の精製は、培養上清をマウスIgG1結合バッファー（1.5 M Glycine-HCl, 3 M NaCl, pH 9.5）と等量混合してからプロテインAセファロースレジンを添加した。また、洗浄の際はPBSの代わりにマウスIgG1結合バッファーを用いて洗浄した。得られた精製抗体は、限外ろ過カラム（Amicon）を用いてPBSにバッファー置換し、分光光度計（NanoDrop）により濃度測定した。
＜精製抗体のBiological activityの測定＞
・抗体の段階希釈溶液の調製 (Day 0)
　被検抗体及びポジティブコントロールとしてPVR (Recombinant Human CD155/PVR、R&D systems, 2530-CD-050)、ネガティブコントロールとしてIgGを培地 (RPMI1640：富士フイルム和光純薬, 189-02025、10% FBS：CORNING, 37-076-CVR, 1×PS：ペニシリン-ストレプトマイシン溶液(×100)、富士フイルム和光純薬, 168-23191)で段階希釈した。被検抗体とIgGは最終濃度10 μg/mLから100 ng/mLまで3倍公比で5点濃度、PVRは最終濃度33 μg/mLから333 ng/mLまで3倍公比で5点濃度の段階希釈液を調製した。
・コーティングプレートの準備 (Day 0)
　Anti-human CD3 (eBioscience, 16-0037) をPBS (D-PBS(-)、富士フイルム和光純薬, 045-29795)で3 μg/mLに希釈し、96ウェルプレート (黒 ソリッド 平底 細胞培養表面処理ポリスチレン マイクロプレート、CORNING, 3916)に50 μL/wellずつ添加した。シールをして4℃の冷蔵庫で一晩静置した。
・細胞の播種とサンプルの添加(agonist assay) (Day 0)
　ドキシサイクリン（Doxycycline）発現誘導ヒトTIGIT発現細胞（hTIGIT/Jurkat）に2 μg/mLになるようドキシサイクリンを添加し、あらかじめ48 μL/wellずつ培地を添加した96ウェルプレート(透明 平底　細胞培養表面処理 マイクロプレート、CORNING, 3598) に60 μL/wellずつ播種した。さらに先に段階希釈した被検抗体及びポジティブコントロール、ネガティブコントロールを12 μL/wellずつ添加し、100%コントロールのウェルには最終濃度3.3 μg/mLのPVR、0%コントロールのウェルには培地をそれぞれ12 μL/wellずつ添加した。CO2インキュベーター（37℃, 5%CO2）で一晩培養した。
・細胞の播種とサンプルの添加(antagonist assay) (Day 0)
　ドキシサイクリン発現誘導ヒトTIGIT発現細胞（hTIGIT/Jurkat）に2 μg/mLになるようDoxycyclineを添加し、あらかじめサンプル及びポジティブコントロール、ネガティブコントロールのウェルには36 μL/well、100%コントロール及び0%コントロールのウェルには48 μL/wellの培地を添加した96ウェルプレート(透明 平底　細胞培養表面処理 マイクロプレート、CORNING, 3598)に60 μL/wellずつ播種した。先に段階希釈した被検抗体及びポジティブコントロール、ネガティブコントロールを12 μL/wellずつ添加し、100%コントロールのウェルには培地、0%コントロールのウェルには最終濃度3.3 μg/mLのPVRをそれぞれ12 μL/wellずつ添加した。さらにサンプル及びポジティブコントロール、ネガティブコントロールのウェルには最終濃度3.3 μg/mLのPVR を12 μL/wellずつ添加した。CO2インキュベーター（37℃, 5%CO2）で一晩培養した。
・細胞の播種とサンプルの添加(Cytotoxicity/Growth inhibition assay) (Day 0)
　ドキシサイクリン発現誘導ヒトTIGIT発現細胞（hTIGIT/Jurkat）に2 μg/mLになるようドキシサイクリンを添加し、あらかじめ48 μL/wellずつ培地を添加した96ウェルプレート(透明 平底　細胞培養表面処理 マイクロプレート、CORNING, 3598)に、0%コントロールのウェル以外は60 μL/wellずつ播種した。0%コントロールのウェルには60 μL/wellの培地を添加した。さらに先に段階希釈した被検抗体及びポジティブコントロール、ネガティブコントロールを12 μL/wellずつ添加し、100%コントロールのウェルには最終濃度3.3μg/mLのPVR、0%コントロールのウェルには培地をそれぞれ12 μL/wellずつ添加した。CO2インキュベーター（37℃, 5%CO2）で一晩培養した。
・細胞の刺激 (Day 1)
　Anti-human CD3コーティングプレートの溶液を除き、200 μL/wellのPBSで1回洗浄後、Day0でサンプルを添加した各アッセイの細胞溶液を90 μL/well移した。Anti-human CD28(eBioscience, 16-0289) を最終濃度2 μg/mLに希釈し、そのプレートに10 μL/wellずつ添加した。プレートミキサー(Titramax 100, Heidolph)で攪拌後、CO2インキュベーター（37℃, 5%CO2）で一晩培養した。
・測定 (Day 2)
　Agonist assayとAntagonist assayの測定にはNano-Glo（登録商標） Luciferase Assay System(Promega, N1120) 、Cytotoxicity/Growth inhibition assay の測定にはCellTiter-Glo（登録商標） Luminescent Cell Viability Assay System(Promega, G7572)を使用した。CO2インキュベーターから細胞を室温に戻した細胞に、Nano-GloTMLuciferase Assay Bufferで50倍希釈したNano-GloTMLuciferase Assay Substrate溶液を100 μL/well、あるいはCellTiter-Glo（登録商標）Bufferで溶解したCellTiter-Glo（登録商標）Substrate溶液を100 μL/well添加し、プレートミキサー(Titramax 100, Heidolph)で攪拌、3分間インキュベート後に、マルチラベルカウンターEnvision（2103 Envision, PerkinElmer）で1秒間の発光値を測定した。
・解析
サンプルの値は、以下の計算式で算出した。
Agonist assay：
サンプルのagonist活性(%) = (1 -(化合物の測定値-100%コントロールウェルの平均値) /(0%コントロールの平均値-100%コントロールウェルの平均値))×100
計算された発現度(%)を、GraphPad Prismを用いグラフ化し、EC50値を算出した。
Antagonist assay：
サンプルのantagonist活性(%) = (化合物の測定値-100%コントロールウェルの平均値) /(0%コントロールの平均値-100%コントロールウェルの平均値)×100
計算された阻害率(%)を、GraphPad Prismを用いグラフ化し、IC50値を算出した。
Cytotoxicity/Growth inhibition assay：
サンプルの細胞傷害性(%) = (1 -(化合物の測定値-0%コントロールウェルの平均値) / (100%コントロールの平均値-0%コントロールウェルの平均値))×100
計算された傷害性(%)を、GraphPad Prismを用いグラフ化し、IC50値を算出した。
　図4にM1-8抗体のBiological activityの測定結果を示す。M1-8抗体はアゴニスト活性を示したが、アンタゴニスト活性は示さなかった。また、M1-8抗体は、本測定に用いたヒトTIGIT発現細胞に対して、本条件下では、細胞傷害活性を示さず、また細胞増殖にも影響を与えなかった。
＜交差反応性試験＞
　得られた抗体の交差反応性試験は、ヒト、サル、及びマウスTIGIT発現細胞を用いてFACSにより行った。すなわち、ドキシサイクリン発現誘導細胞をドキシサイクリン有無の条件下で2日間培養した。細胞をPBSで洗浄したのち、Cell Dissociation buffer（GIBCO）を添加し、室温で10分間静置することで、細胞をフラスコから剥離した。得られた細胞をFACSバッファー（1% FBSを含むPBS）で2回洗浄後、1 x 106 cells/mLの細胞密度になるように、FACSバッファーを用いてそれぞれ懸濁した。懸濁液を100 μLずつ96ウェルV底プレートに分注し、遠心したのち上清を除去した。このプレートに、FACSバッファーで1 μg/mLに希釈した精製抗体を100 μLずつ添加し、4℃で30分間静置した。FACSバッファーで3回洗浄後、AlexaFluoro647（登録商標）標識された抗マウスIgG抗体を100 μLずつ分注し、4℃で30分間静置した。FACSバッファーで2回洗浄後、200 μLのFACSバッファーで懸濁し、結合した抗体をCytomics FC500MPLを用いて測定した。
　図5にM1-8抗体のヒト、サル、マウスTIGITに対する交差反応性の結果を示す。抗体M1-8はヒトとサルTIGITには結合するが、マウスTIGITには結合しないことが分かった。
下記の実施例では以下の抗体・培地を使用した: 
　Human; anti-CD3 (Hit3a), anti-CD4 (FITC, OKT4 or BV510, OKT4), anti-CD19(BV421, HIB19), anti-CD25 (PE, BC96), anti-CD27(BV510, O323), CD38(FITC, HIT2)anti-CD45RA (BV421, HI100), anti-CD127 (FITC, A019D5), anti-CD138(APC, MI15), anti-CXCR5(PerCP/Cy5.5, J252D4), anti-human TIGIT(PE-Cy7, A15153G) (いずれもBioLegend), 7-aminoactinomycin D(Bay Bioscience), anti-TIGIT agonistic antibody(Clone M1-8, 武田薬品工業)。
　Mouse; 表面染色anti-CD44 (FITC, IM7) , anti-CD62L (PE, MEL-14) , anti-CD69 (APC,H.12F3), anti-CD95(APC, SA367H8), anti-CD138 (BV421, 281-2), anti-CD185(PE, L138D7), anti-GL7(PE-Cy7, GL7) , (いずれもBioLegend), anti-B220(PE, RA3-6B2), anti-CD3ε (PE-cy5, 145-2C11), anti-CD4 (eFluor450 or APC(いずれもThermo Fisher Scientific). 細胞内染色 anti-Foxp3 (PE, FJK-16s　Thermo Fisher Scientific)。
　Isotype control; mIgG1(MG1-45) (いずれもBiolegend)。
　complete RPMI(RPMI1640に以下添加: 2 mM L-グルタミン, 1% 非必須アミノ酸, 55 μM 2-メルカプトエタノール(Thermo Fisher Scientific), 1 mM ピルビン酸ナトリウム, 100 U/ml ペニシリン, 100 U/ml ストレプトマイシン, 10% FBS (Thermo Fisher Scientific)) 。
　統計解析は、Wilcoxon順位和検定を用いて連続変数間の差を調べた。P値<0.05が有意であると考えた。すべての統計解析はJMP 15 (SAS Institute )を用いて実施した。
実施例２：TIGITの活性化を介したCD8陽性T細胞の活性化抑制の検証
　4名の健常者からヒト末梢血をヘパリン採血管(テルモ)にて採血し、Ficoll-paque plus(GE healthcare)を用いてPBMCを分離した。PBMCからCD8陽性T細胞を、CD8+ T cell isolation kit(ミルテニー)を用いたMACSにて分離した。それらの細胞をCFSE(Invitrogen)試薬にて染色した後に、RPMI1640/10% FBS/PSG培地に懸濁し、1x105cells/wellで96ウェル丸底プレートに播種した。播種した細胞に抗human CD3抗体(Biolegend)とhuman PVR-Fc(R&D systems)またはhuman IgG1-Fc(R&D systems)をDynabeads-M450(Invitrogen)に結合させたものを1x105 beads/wellとなるように混合し、5% CO2、37℃条件下にて3日間培養した。
　Dynabeads-M450への抗体結合方法は以下の通りである。Dynabeads-M450をBinding buffer(0.1 M sodium phosphate pH 7.6)に懸濁し、マグネットを用いて1回洗浄した後に、再度Binding bufferに懸濁し、そこに抗CD3抗体を2.5 μg/107 beads、PVR-FcとIgG1-FcをPVR-FcとIgG1-Fcの合計が2.5 μg/107beadsとなるように混合し、4℃にて一晩回転しながら混合した。翌日、Wash buffer(PBS/0.1% BSA/2 mM EDTA)にてマグネットを用いて2回洗浄後、Blocking buffer(0.2 M Tris-HCl pH 8.5/0.1% BSA)にて室温にて4時間、回転しながら混合した。Wash bufferとマグネットを用いて1回洗浄し、最後にWash bufferに4x107 beads/mlとなるように懸濁した。作製したDynabeads/抗体/Fc複合体は４℃にて保存し、以降の実験に使用した。
　CD8陽性T細胞とDynabeads/抗CD3抗体/PVR-Fcを混合し、5%CO2、37℃条件下にて3日間培養した後に、培養上清を回収しELISA法にてIFNγ(Biolegend)、GranzymeB(Mabtech)、Perforin(Mabtech) の産生量を測定した。また細胞を回収し、抗CD3抗体-APCCy7、抗CD8抗体-BV421、抗CD4抗体-BV510 (すべてBiolegend)にて染色し、CFSEとともにFACSにて検出し、CFSEの希釈割合をもとに細胞増殖の割合を定量的に解析した。結果を図６に示す。図６より、PVR-Fcの量依存的にCD8陽性T細胞の増殖およびサイトカイン(IFNγ、Granzyme B、Perforin)の産生量が抑制された。これらの結果から、PVRがそのリガンドであるTIGITへの結合を介してCD8陽性T細胞の活性化を抑制すること、ならびに抗TIGITアゴニスティック（agonistic）抗体がCD8陽性T細胞の活性化を抑制することが示唆された。
実施例３：Tfh細胞に及ぼす効果
　ヘパリン採血管(TERUMO, Tokyo, Japan) に採血した血液をLymphoprep(Axis-Shield)を用いてPBMCとした。さらに、CD4+ T Cell Isolation Kit(Miltenyi Biotec)を用いてCD4+ T 細胞をネガティブセレクションした。各種抗体を用いて細胞表面を染色し、FACSAria III flow cytometerで以下の各細胞集団に分画した。Tfh; CD45RA-CXCR5+, Naive T; CD45RA+CXCR5-, non-Tfh; CD45RA-CXCR5-。
　得られたCD4+ ナイーブ T細胞, Tfh細胞を96 穴Uプレートで1×104/wellとしDynabeads human T-Activator CD3/CD28(Thermo Fisher Scientific)を細胞と同量加え培養開始した。各細胞同条件において4 wellで培養開始し、24時間、48時間、72時間、96時間後に、細胞上のTIGIT発現をFACSVerseフローサイトメーターを用いて解析した。細胞増殖をFlowJo software version 10.4.2 (FlowJo, OR, USA)を用いて解析した。
　結果は、図７－１ａの通り元々TIGIT発現の高いTfh細胞では刺激によりTIGIT発現がさらに上昇するのに対し、TIGIT発現の低いナイーブ T細胞では刺激によりTIGIT発現の上昇はみられなかった。
　また、各細胞を2 μMのCellTrace Violet(Thermo Fisher Scientific)で37℃、7分間染色、洗浄し、抗CD3抗体2 μg/ml、抗CD28抗体1 μg/ml、及びIsotype(mouseIgG1)もしくは抗TIGIT agonistic抗体を10 μg/mlで固相化した96 穴平底プレートで96時間培養を行った。死細胞は7-aminoactinomycin Dで染色除去し、生細胞をFACSVerseフローサイトメーターを用いて解析した。細胞増殖をFlowJo software version 10.4.2 (FlowJo, OR, USA)を用いて解析した。
　結果は図７－１ｂに示す通り、Tfh細胞においては抗TIGIT agonistic抗体刺激により増殖が顕著に抑制されたのに対し、ナイーブT細胞では抑制効果は認められなかった。即ち、TIGIT発現の高い細胞に対する抗TIGIT agonistic抗体の選択的な増殖抑制効果が示された。
　CD4+ ナイーブ T細胞, Tfh細胞に加えて、non-Tfh細胞についても、上記と同様にして細胞上のTIGIT発現を調べた。その結果、non-Tfh細胞ではTfh細胞とナイーブT細胞との中間程度のTIGIT発現が認められた（図７－２ａ）。
　また、上記と同様のCellTrance violetを用いたフローサイトメトリー解析により、抗TIGIT agonistic抗体の増殖抑制効果をTfh細胞とnon-Tfh細胞とで比較したところ、当該抗体はnon-Tfh細胞に対しても増殖抑制効果を示すが、Tfh細胞に対してより選択的に抑制効果を示すことがわかった（図７－２ｂ）。
実施例４：Tfh細胞によるB細胞に対する効果
　ヘパリン採血管(TERUMO, Tokyo, Japan)に採血した血液をLymphoprep(Axis-Shield)を用いてPBMCとした。さらに、CD19 Microbeadsを用いてCD19+細胞をポジティブセレクションした。各種抗体を用いて細胞表面を染色し、FACSAria III flow cytometerで以下の各細胞集団に分画した。メモリーB; CD19+CD27+, Effector T; CD25-CD45RA-(Tfh細胞に関しては実施例３の方法で単離)。
　Tfh細胞をIsotype(mouseIgG1)もしくは抗TIGIT agonistic抗体, 10 μg/mlで固相化した96穴Uプレートで37℃、30分培養した。そこにメモリーB細胞を加え、0.2 μg/mlのStaphylococcal enterotoxin B (Sigma)を混合した培地で1週間培養した。死細胞を7-aminoactinomycin Dで染色除去し、生細胞をFACSVerseフローサイトメーターを用いて解析した。形質細胞の割合をFlowJo software version 10.4.2 (FlowJo, OR, USA)を用いて解析し、培養上清中のIgGを、ヒトIgG ELISA kit(Bethyl)を用いて測定した。
　結果は、図８の通り抗TIGIT agonistic抗体で刺激したTfh細胞と共培養した群で形質細胞の増殖を抑え、IgGの産生も抑制した。
実施例５：Treg細胞に及ぼす効果
　ヘパリン採血管(TERUMO, Tokyo, Japan)に採血した血液をLymphoprep(Axis-Shield)を用いてPBMCとした。さらに、CD4+ T Cell Isolation Kit(Miltenyi Biotec) を用いてCD4+ T 細胞をネガティブセレクションした。各種抗体を用いて細胞表面を染色し、FACSAria III flow cytometerで以下の各細胞フラクションに分画した(Effectorに関しては96時間経過後)。 Treg(FrI); CD25+CD45RA+, Treg(FrII); CD25+CD45RA-, Effector T; CD25-CD45RA-, 非Treg responder CD4+ T細胞; CD25-。
　得られたTreg細胞(FrI)を、抗CD3抗体2 μg/ml, 抗CD28抗体1 μg/ml, 及びIsotype(mouseIgG1)もしくは抗TIGIT agonistic抗体を10 μg/ml で固相化した96 穴平底プレートで、IL-2 (R&D)10 ng/mlを加えた培地で6時間培養した。一方、96時間経過後に分画したCD4+Effector T細胞を、実施例２同様の方法を用いてCellTrace violet(CTV; Thermo Fisher Scientific)で染色、洗浄し、活性化処理したTreg細胞と1:1(各1x104)で96時間培養した。死細胞は7-aminoactinomycin Dで染色除去し、生細胞をFACSVerseフローサイトメーターを用いて解析した。細胞増殖をFlowJo software version 10.4.2 (FlowJo, OR, USA)を用いて解析した。
　結果は、図９－１の通り抗TIGIT agonistic抗体で刺激したTreg細胞は、Effector T細胞の増殖を抑制した。抗TIGIT agonistic抗体のTreg細胞に対する刺激がTreg細胞の活性化に働いた。
　上記と同様にして、Treg細胞(FrI)又はTreg細胞(FrII)を、Isotype(mouseIgG1)もしくは抗TIGIT agonistic抗体の存在下、抗CD3抗体及び抗CD28抗体で6時間刺激した。非Treg responder CD4+ T細胞（CD25-）をCTVで標識し、活性化処理した各Treg細胞フラクションと1:1(各1x104)の割合で96時間共培養した。その後、上記と同様にしてresponder T細胞の細胞増殖をCTV蛍光の希釈を指標にして解析した。その結果、いずれのTreg細胞フラクションもresponder T細胞の増殖を抑制したが、抗TIGIT agonistic抗体の存在下で各Treg細胞フラクションを活性化すると、Treg細胞の活性化がより増強され、特にナイーブTreg細胞としても知られるTreg(FrI)においてその効果はより顕著であった（図９－２）。
実施例６：イミキモド誘発ループスモデルマウスに及ぼす効果
　6-8週齢のメスC57BL/6JJclマウス(日本クレア)を購入し、常法により作製したヒトTIGIT（hTIGIT）遺伝子をノックインした同系統のマウスと交配させて得た、同世代のホモ型、野生型のhTIGITノックインマウスを使用した。実験はいずれも慶應義塾大学医学部動物舎で行い、慶應義塾大学医学部における動物実験等に関する規程に従って施行した。
　10-12週齢のメスのTIGIT-KIマウスの右耳介に5% イミキモドクリーム(持田製薬)を50 mg/kgで週３回塗布することでイミキモド誘発ループスモデルマウスを作製した。投与実験は以下の通り行った。いずれも週２回で投与した。３群に分け開始４２日目に解析した。
非塗布：イミキモド非塗布/Isotype(mIgG1)を300 μg/ml腹腔内投与
anti-TIGIT：イミキモド塗布/抗TIGIT agonistic抗体を300 μg/ml腹腔内投与
isotype：イミキモド塗布/Isotype(mIgG1)を300 μg/ml腹腔内投与
　マウス脾臓を摘出し重量を測った。脾臓を細かく刻み40 μmのセルストレーナーを通しHLB solution(IBL)を用いて溶血処理を行い、全脾細胞数を測定した。マウス脾細胞をanti-CD16/CD32 (BD Biosciences)を用いて４℃で５分培養し、表面染色を20分で行った。染色時の培地はPBSに0.5% BSAと2 mM EDTAを混和したものを使用した。各細胞は以下のように定義した: Tem; CD44+CD62L-, Tfh; CXCR5+PD-1+, plasma cells; CD19-CD138+, GC B cells; CD95+GL7+。解析時、血液を採取し、「レビス抗dsDNA-マウスELISA KIT」(シバヤギ社製)で血中の抗dsDNA抗体価を測定した。
　結果は、図１０に示した通り、抗TIGIT agonistic抗体投与群において脾腫、及びリンパ球の増殖を抑制した。図１１－１に示した通り、抗TIGIT agonistic抗体の投与は、B細胞における形質細胞の割合の増大を有意に抑制した。また、T細胞における活性化T細胞の割合、CD4陽性T細胞におけるCD4+ Effector memory T (Tem) 細胞, Tfh細胞の割合、B細胞における胚中心B細胞の割合の増大、抗dsDNA抗体の産生の増大に対しても抑制傾向を示した。マウスの個体数を増やして同様の実験を行ったところ、抗TIGIT agonistic抗体は、isotypeに対して、CD4陽性T細胞におけるTem細胞, Tfh細胞の割合、B細胞における胚中心B細胞の割合、及び脾細胞における形質細胞の割合の増大、並びに抗dsRNA抗体産生の増大を有意に抑制した（図１１－２）。
　以上のように、抗TIGIT agonistic抗体は、疾患によるリンパ球の増殖、特に活性化T細胞の増殖を抑制した。さらに、培養実験での結果同様Tfh細胞を介したB細胞の活性化も抑制した。
実施例７：実験的自己免疫性脳脊髄炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis: EAE)マウスに及ぼす効果
　12週齢のオスTIGIT-KI マウスを200 μgのMOG35-55peptide (Synpeptide, Shanghai, China) とフロイト不完全アジュバンドに400 μgのM. tuberculosisを加えたもの(Difco Laboratories)を皮下注し, さらに同日, 及び2日目に百日咳毒素(List Biologicals)400ngを腹腔内投与した。誘導開始0, 2, 4, 10, 17日に抗TIGIT agonistic抗体もしくはisotype(mIgG1)を100 μg腹腔内投与した。連日, 以下の方法で臨床スコアを測定し30日目に解析とした(0, 変化なし; 1, 尾の筋力低下; 2, 尾の麻痺; 3, 後肢筋力低下; 4, 前肢筋力低下; 5, 前肢麻痺; 6, 瀕死もしくは死)。脳、脊髄、脾臓に浸潤する細胞の解析は、各種抗体を用いてフローサイトメトリーで解析した。
　結果は、図１２に示した通り抗体投与群においてEAEの臨床スコアを軽減させた。図１３に示したとおり抗体投与群では脳、脊髄、脾臓いずれにおいてもTreg細胞の増殖を促す傾向がみられた。
結果・考察
　以上の結果から、抗TIGIT agonistic抗体がTfh細胞に対する抑制効果、及びB細胞に対するTfh細胞を介した抑制効果をin vitro、in vivoいずれにおいても証明した。Treg細胞に対して、抗TIGIT agonistic抗体がin vitroにおいて実際にエフェクターT細胞に対する抑制効果を示し、in vivoにおいても本抗体投与によりTreg細胞の増殖促進が示唆される結果を確認した。疾患モデル動物を用いた検討では、本抗体の有効性が確認された。以上の効果は、いずれも従来の抗体ではみられなかった効果である。免疫・炎症性疾患において活性化T細胞を抑制し、Treg細胞を活性化することは治療薬として理にかなっており、今後幅広くヒトの免疫・炎症性疾患治療薬となり得る。
　本発明により、ヒトTIGITを介したシグナルを活性化でき、それによりTfh細胞の抑制及びTreg細胞の活性化が可能となるため、免疫・炎症性疾患の予防又は治療に有用である。
　本出願は、2020年10月9日付で日本国に出願された特願2020-171278を基礎としており、ここで言及することによりその内容のすべてが本明細書に組み込まれるものである。

Claims (19)

  1. 　抑制性免疫チェックポイント分子(TIGIT)を活性化する抗ヒトTIGIT抗体を有効成分とする免疫・炎症性疾患治療薬。
  2. 　Tfh細胞抑制作用を有する請求項１に記載の治療薬。
  3. 　Treg細胞活性化作用を有する請求項１又は２に記載の治療薬。
  4. 　免疫・炎症性疾患が関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、全身性強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、IgG4関連疾患、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎、結節性多発動脈炎、ANCA関連血管炎、混合性結合組織病、脊椎関節炎、ベーチェット病、成人Still病、多発性硬化症、視神経脊髄炎、重症筋無力症、原発性胆汁性肝硬変、非アルコール性脂肪性肝疾患、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬（乾癬性関節炎）、尋常性白斑、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、特発性拡張型心筋症、1型糖尿病、バセドウ病、橋本病、IgA腎症、膜性腎症、溶血性貧血、及び特発性血小板減少性紫斑病からなる群から選択される、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の治療薬。
  5. 　抗ヒトTIGIT抗体がヒトTIGIT（配列番号１）に結合する抗体である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の治療薬。
  6. 　抗体が
    　ａ）重鎖可変領域の第３のＣＤＲが配列番号４のアミノ酸配列を含み、かつ、
    　ｂ）軽鎖可変領域の第３のＣＤＲが配列番号６のアミノ酸配列を含む、
    請求項５に記載の治療薬。
  7. 　抗体が
    　ａ）以下を含む重鎖可変領域：
    　　ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む第１のＣＤＲ；
    　　ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第２のＣＤＲ；及び
    　ｂ）以下を含む軽鎖可変領域：
    　　ｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む第１のＣＤＲ；
    　　ｉｉ）チロシン－アラニン－セリンのアミノ酸配列を含む第２のＣＤＲ；
    を含む、請求項５に記載の治療薬。
  8. 　さらに抗体がＦｃドメインを含む、請求項５に記載の治療薬。
  9. 　前記Ｆｃドメインがヒト由来である、請求項８に記載の治療薬。
  10. 　前記Ｆｃドメインが変異Ｆｃドメインである、請求項８又は９に記載の治療薬。
  11. 　ａ）重鎖可変領域の第３のＣＤＲが配列番号４のアミノ酸配列を含み、かつ、
    　ｂ）軽鎖可変領域の第３のＣＤＲが配列番号６のアミノ酸配列を含む、
    抗体。
  12. 　ヒトTIGIT（配列番号１）に結合する、請求項１１に記載の抗体。
  13. 　ａ）以下を含む重鎖可変領域：
    　　ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む第１のＣＤＲ；
    　　ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第２のＣＤＲ；及び
    　ｂ）以下を含む軽鎖可変領域：
    　　ｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む第１のＣＤＲ；
    　　ｉｉ）チロシン－アラニン－セリンのアミノ酸配列を含む第２のＣＤＲ；
    を含む、請求項１１に記載の抗体。
  14. 　さらにＦｃドメインを含む、請求項１１に記載の抗体。
  15. 　前記Ｆｃドメインがヒト由来である、請求項１４に記載の抗体。
  16. 　前記Ｆｃドメインが変異Ｆｃドメインである、請求項１４に記載の抗体。
  17. 　請求項１１に記載の抗体をコードする、単離された核酸。
  18. 　請求項１７記載の単離された核酸を含む、宿主細胞。
  19. 　請求項１１に記載の抗体の製造方法であって、前記抗体が製造される条件下で請求項１８に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、方法。
PCT/JP2021/037471 2020-10-09 2021-10-08 免疫・炎症性疾患の治療薬 WO2022075474A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202180069100.8A CN116406292A (zh) 2020-10-09 2021-10-08 免疫·炎症性疾病的治疗药
EP21877773.8A EP4226943A1 (en) 2020-10-09 2021-10-08 Therapeutic agent for immune/inflammatory disease
JP2022555605A JPWO2022075474A1 (ja) 2020-10-09 2021-10-08
US18/030,901 US20230374128A1 (en) 2020-10-09 2021-10-08 Therapeutic agent for immune/inflammatory disease

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020-171278 2020-10-09
JP2020171278 2020-10-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022075474A1 true WO2022075474A1 (ja) 2022-04-14

Family

ID=81126094

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2021/037471 WO2022075474A1 (ja) 2020-10-09 2021-10-08 免疫・炎症性疾患の治療薬

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230374128A1 (ja)
EP (1) EP4226943A1 (ja)
JP (1) JPWO2022075474A1 (ja)
CN (1) CN116406292A (ja)
WO (1) WO2022075474A1 (ja)

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4937190A (en) 1987-10-15 1990-06-26 Wisconsin Alumni Research Foundation Translation enhancer
US20040013210A1 (en) 2000-10-19 2004-01-22 Gianmario Bollano Module for generating circuits for decoding convolutional codes, related method and circuit
US20050054832A1 (en) 2002-03-01 2005-03-10 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US20060024298A1 (en) 2002-09-27 2006-02-02 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
JP2006512407A (ja) * 2002-09-27 2006-04-13 ゼンコー・インコーポレイテッド 最適化Ｆｃ変異体およびそれらの生成方法
JP2008544746A (ja) * 2005-05-12 2008-12-11 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド 免疫応答を調節するための組成物および方法
JP2011523034A (ja) * 2008-04-09 2011-08-04 ジェネンテック， インコーポレイテッド 免疫関連疾患の治療のための新規組成物と方法
WO2015143343A2 (en) * 2014-03-21 2015-09-24 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods and compositions for treatment of immune-related diseases or disorders and/or therapy monitoring
JP2020171278A (ja) 2019-04-11 2020-10-22 日清フーズ株式会社 蕎麦製品

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4937190A (en) 1987-10-15 1990-06-26 Wisconsin Alumni Research Foundation Translation enhancer
US20040013210A1 (en) 2000-10-19 2004-01-22 Gianmario Bollano Module for generating circuits for decoding convolutional codes, related method and circuit
US20050054832A1 (en) 2002-03-01 2005-03-10 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US20060024298A1 (en) 2002-09-27 2006-02-02 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
JP2006512407A (ja) * 2002-09-27 2006-04-13 ゼンコー・インコーポレイテッド 最適化Ｆｃ変異体およびそれらの生成方法
JP2008544746A (ja) * 2005-05-12 2008-12-11 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド 免疫応答を調節するための組成物および方法
JP2011523034A (ja) * 2008-04-09 2011-08-04 ジェネンテック， インコーポレイテッド 免疫関連疾患の治療のための新規組成物と方法
WO2015143343A2 (en) * 2014-03-21 2015-09-24 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods and compositions for treatment of immune-related diseases or disorders and/or therapy monitoring
JP2020171278A (ja) 2019-04-11 2020-10-22 日清フーズ株式会社 蕎麦製品

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Immunochemical Techniques", vol. 121, ACADEMIC PRESS, article "Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods"
"Remington's Pharmaceutical Science", 1980
PROCEEDING OF THE SOCIETY FOR THE BIOLOGICAL MEDICINE, vol. 73, 1950, pages 1
SCIENCE, vol. 122, 1952, pages 501
THE JOURNAL OF THE AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION, vol. 199, 1967, pages 519
VIROLOGY, vol. 8, 1959, pages 396

Also Published As

Publication number Publication date
EP4226943A1 (en) 2023-08-16
US20230374128A1 (en) 2023-11-23
CN116406292A (zh) 2023-07-07
JPWO2022075474A1 (ja) 2022-04-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230348602A1 (en) Novel anti-pd-1 antibodies
US20230167186A1 (en) Methods of administering anti-ox40 antibodies
US20230406932A1 (en) Antibodies that modulate a biological activity expressed by a cell
US10696745B2 (en) Anti-PD-L1 antibodies
WO2017020291A1 (en) Novel anti-pd-l1 antibodies
KR20200061402A (ko) 항-cd38 항체 및 항-cd3 및 항-cd28 항체와의 조합
WO2017024515A1 (en) Novel anti-pd-1 antibodies
US11440965B2 (en) Anti-OX40 antibody
TW201343675A (zh) 抗－ｈｌａ－ｂ＊２７抗體及其用途
CN106243225B (zh) 新型抗-pd-l1抗体
US20230357407A1 (en) Bispecific anti pd1-anti tim3 antibodies
US20210115143A1 (en) Anti-pd-l1 antibody and use thereof
TWI713464B (zh) 針對Fcγ受體IIB及Fcε受體的新穎抗體
WO2022075474A1 (ja) 免疫・炎症性疾患の治療薬
CN114364698B (zh) 结合cd3的互补决定区和含所述cdr的双特异性抗原结合分子
AU2017217814A1 (en) Anti-citrullinated HLA polypeptide antibodies and uses thereof
EA044327B1 (ru) Антитело к pd-l1 и его применение
JP2024500511A (ja) 抗ｐｄ－ｌ１抗体及びその使用
JP2023528778A (ja) 抗ｐｄ－１抗体

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21877773

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022555605

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021877773

Country of ref document: EP

Effective date: 20230509