WO2022073144A1 - Formulación inmunogénica que contiene una cepa bcg modificada que expresa una proteína de andesvirus (andv) útil para prevenir y tratar infecciones por virus hanta-andv - Google Patents

Formulación inmunogénica que contiene una cepa bcg modificada que expresa una proteína de andesvirus (andv) útil para prevenir y tratar infecciones por virus hanta-andv Download PDF

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Definitions

  • An immunogenic formulation useful for preparing a vaccine against Andesvirus comprises at least one attenuated strain of Mycobacterium bovis, Bacillus Calmette-Guérin (BCG), which recombinantly expresses one or more proteins or immunogenic fragments of ANDV.
  • BCG Bacillus Calmette-Guérin
  • Hantaviruses are the etiological agent of two diseases in humans: hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) and hantavirus cardiopulmonary syndrome (HCPS). These viruses with a worldwide distribution are classified as old world hantaviruses responsible for FHSR, with the following species predominating in Europe and Asia: Hantaan virus (HTNV) and Seoul virus (SEOV), among others.
  • HTNV Hantaan virus
  • SEOV Seoul virus
  • the new world hantaviruses produce SCHP and include 36 species, among them: Andesvirus (ANDV), Sin remind (SNV) and Choclo virus (CHOV) which are distributed in America.
  • the ANDV species is endemic to America and has a high virulence compared to other hantaviruses, to date it is the only species capable of human-to-human transmission. It is worth mentioning that the development of vaccines against old world hantavirus species is at the forefront, however, these do not offer protection against new world species.
  • ANDV is an antisense or negative RNA virus that comprises in its genome a small segment (S) that encodes the nucleocapsid protein (N), a medium segment (M) that encodes a precursor glycoprotein that gives rise to the Gn and Ge glycoproteins, and a large segment (L) encoding RNA-dependent polymerase.
  • S small segment
  • M medium segment
  • L large segment
  • the inventors have developed a new vaccine, with a different strategy from those developed by other groups, which is based mainly on the ANDV N protein, not on Gn and Ge, and uses the attenuated Mycobacterium strain as a vector.
  • bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), which has demonstrated safe use in neonates for more than 100 years and is known to act as an adjuvant and induce responses that confer long-term immunity.
  • BCG Bacillus Calmette-Guérin
  • the inventors have shown that by using the virus nucleocapsid protein (N), immunity is generated that allows the ANDV infection to be controlled.
  • rBCG-N-ANDV expresses recombinant N-ANDV.
  • a monoclonal antibody specific against N-ANDV was used as the primary antibody, followed by a secondary antibody linked to horseradish peroxidase (HRP).
  • Colonies 2 and 3 (C2 FT and C3 FT) correspond to Used of rBCG-N-ANDV colonies.
  • a positive control recombinant N-ANDV expressed in E. coli, N-ANDV
  • negative controls lysate of rBCG-P-hMPV, of BL21-P and water, H2O
  • FIG. 1 Animals vaccinated with rBCG-N-ANDV show weight gain.
  • BALB/c male mice 4-6 weeks of age were vaccinated with BCG-WT or rBCG-N-ANDV, or received vehicle (PBS) on days 0 and 14 (booster). Weight measurements were made several times a week during the 28-day duration of the study.
  • Data are represented as mean + SEM from three animals per group.
  • FIG. 3 Mice immunized with the rBCG-N-ANDV vaccine have a similar clinical score compared to mice vaccinated with BCG WT.
  • BALB/c male mice 4-6 weeks of age were vaccinated with BCG-WT or rBCG-N-ANDV, or received vehicle (PBS) on days 0 and 14 (booster).
  • Clinical measurements were performed several times a week during the 28-day duration of the study.
  • B. Specific adverse reaction to immunization score, from 0 to 3. Data are plotted as mean + SEM from three animals per group.
  • the rBCG-N-ANDV vaccine generates populations of antigen-specific T lymphocytes.
  • BALB/c male mice 4-6 weeks of age were vaccinated with BCG-WT or rBCG-N-ANDV, or received vehicle (PBS) on days 0 and 14 (booster).
  • PBS received vehicle
  • the animals were euthanized and spleen cells were obtained to generate ex vivo stimulation assays with recombinant protein N-ANDV (10 pg/mL and 2 pg/mL) and PPD-B (20 pg/mL).
  • flow cytometric analyzes were performed on spleen cells with various markers.
  • A-C Increase in CD4+ T lymphocytes expressing activation markers CD69 and CD71.
  • D-F Increase in CD8+ T lymphocytes expressing activation markers CD25, CD69, and CD71.
  • rBCG-N-ANDV induces proliferation of spleen cells from immunized mice after restimulation with N-ANDV.
  • BALB/c male mice 4-6 weeks of age were vaccinated with BCG-WT or rBCG-N-ANDV, or received vehicle (PBS) on days 0 and 14 (booster).
  • PBS received vehicle
  • the animals were euthanized and spleen cells were obtained to generate ex vivo stimulation assays with recombinant protein N-ANDV (10 pg/mL and 2 pg/mL) and PPD-B (20 pg/mL).
  • the spleen cell culture supernatants were obtained 72 hours after incubation and the levels of soluble factors were determined by ELISA.
  • the invention corresponds to a live attenuated vaccine based on Mycobacterium bovis, preferably of the Bacillus Calmette-Guérin (BCG) strain that generates the recombinant expression of a heterologous viral antigen, especially the Nucleoprotein (N) of Andesvirus (ANDV) or its fragments. immunogenic.
  • BCG Bacillus Calmette-Guérin
  • N Nucleoprotein
  • ANDV Andesvirus
  • the invention aims at an immunogenic formulation that confers protection against New World Hantavirus and/or the development of Hantavirus cardiopulmonary syndrome (SCPH), comprising an attenuated recombinant strain of Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), in an amount between 10 4 -10 9 colony-forming units (CFU) per dose, which expresses at least one protein or immunogenic fragment of the Andesvirus virus (ANDV), in a pharmaceutically acceptable saline buffer solution.
  • the protein or immunogenic fragment of the Andesvirus virus corresponds to the N protein of ANDV or its immunogenic fragments, where the protein has an amino acid sequence that is at least 75% identical to the amino acid sequence of SEO. ID NO:1 and is preferably at least 95% identical to the SEO. ID NO: 1.
  • the genes that code for ANDV N protein or its immunogenic fragments are inserted in the Mycobacterium BCG genome or in extrachromosomal plasmids, in one or more copies, and are regulated or commanded by endogenous promoters or Mycobacterium BCG exogenous, constitutive or inducible.
  • the genes encoding the ANDV N protein or its immunogenic fragments correspond to a nucleotide sequence that is at least 75% identical to SEO. ID NO: 2, and preferably at least 95% identical to the SEO. ID NO: 2.
  • ANDV N protein or its immunogenic fragments can be expressed by BCG in soluble-cytoplasmic form, secreted extracellularly or as cell membrane-bound proteins.
  • the BCG strain used is preferably chosen from BCG Danish or BCG Pasteur.
  • the immunogenic protein or fragment of the Andesvirus virus corresponds to amino acid sequences with at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or more identity with respect to the N protein sequence of ANDV, defined according to SEO. ID NO:1, where the difference includes substitutions, deletions, additions or insertions.
  • the bacterium must be transformed with a vector containing a nucleotide sequence that codes for said protein, where the invention includes a nucleotide sequence that has at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or more of identity with respect to the nucleotide sequence, defined according to SEO. ID NO:2 and its equivalents product of the degeneracy of the genetic code.
  • the immunogenic formulation of the invention is stabilized by freezing, lyophilization or in buffered saline solution and excipients for injectable preparations, for preservation prior to use.
  • excipients include: sodium glutamate, magnesium sulfate heptahydrate, potassium hydrogen phosphate, citric acid monohydrate, L-asparagine monohydrate, iron and ammonium citrate, glycerol, and water for injections and any other available in the art, at the time of executing the invention.
  • the use of the described immunogenic formulation is protected to prepare a vaccine to prevent, treat, or attenuate ANDV infections and the development of Hantavirus cardiopulmonary syndrome (SCPH), where said formulation contains between 1X10 4 -1X10 9 CFU (colony forming units) of the recombinant attenuated strain of Mycobacterium BCG stabilized with a saline solution.
  • SCPH Hantavirus cardiopulmonary syndrome
  • This vaccine can be administered subcutaneously, percutaneously, or subdermally in physiologically acceptable saline.
  • the Danish or Pasteur strain of BCG is used, and we transform it at the genome level, constitutively expressing the ANDV N protein during its replicative cycle.
  • the synthesis of this protein does not generate alterations or impediments in the replicative capacity of the bacteria, so it would not exert a toxic effect on the vector strain.
  • the recombinant BCG vaccine expressing ANDV N protein (rBCG-N-ANDV) according to the present invention can be used in individuals of all ages.
  • the invention consists of a vaccine developed in order to prevent hantavirus cardiopulmonary syndrome (SCPH).
  • SCPH hantavirus cardiopulmonary syndrome
  • BCG is a good vehicle for vaccine development as it has been shown to be safe in neonates, children and adults. It can be easily produced on a large scale at low cost and is stable to temperature changes.
  • BCG acts as an adjuvant and induces a Thl response (T helper lymphocyte), which is necessary for the elimination of the virus.
  • the BCG vector where the viral protein is expressed, has been widely used for almost 100 years in humans.
  • the N protein of ANDV is highly conserved in all subtypes of hantaviruses in the new world (36 species), so this vaccine could confer protection against the development of cardiopulmonary syndrome due to hantavirus throughout the Americas.
  • the vaccines of the invention contain live attenuated recombinant strains of Mycobacterium bovis, preferably Bacillus Calmette-Guérin (BCG), for example BCG Danish or Pasteur strains that recombinantly or heterologously express one or more proteins or immunogenic ANDV fragments, especially the protein N or its immunogenic fragments.
  • BCG Bacillus Calmette-Guérin
  • the vaccines of the invention comprise between lxlO 4 - lxlO 9 CFU (colony-forming units) of the strains described per dose, and can be kept preserved, prior to administration, in lyophilized form or in a saline solution and stabilizing excipients in cold.
  • Examples of appropriate stabilizing solutions for the immunogenic formulations or vaccines of the invention are: Dilute Sauton SSI solution (125 pg MgSO 4 , 125 pg K2HPO4, 1 mg L-asparagine, 12.5 pg ferric ammonium citrate, 18.4 mg 85% glycerol, 0.5 mg citric acid, in 1 mL H2O) at 4°C;
  • volume solution volume of 25% lactose and Proskauer and Beck Medium supplemented with glucose and Tween 80 (PBGT: 0.5 g asparagine; 5.0 g monopotassium phosphate; 1.5 g magnesium citrate; 0.5 g potassium sulfate ; 0.5 ml Tween 80 and 10.0 g glucose per liter of distilled water) lyophilized and stored in the temperature range between 4°C and 25°C.
  • PBGT glucose and Tween 80
  • the genes that code for the N protein or its immunogenic fragments are inserted into a plasmid, which is incorporated into the bacterium by any available technique.
  • the plasmid pMV361 is used, incorporated into the bacterium by electrotransformation, and integrated into the bacterial genome by the action of mycobacteriophage integrases.
  • These genes can also be inserted into extrachromosomal plasmids, such as pMV261, which is incorporated into the Mycobacterium by electrotransformation, and is maintained extrachromosomally in the bacterium.
  • genes may be in one or more copies, and their expression is controlled by endogenous BCG promoters, constitutive or inducible, for example the promoter of the hsp60 gene and the promoter of the acr gene, respectively.
  • BCG promoters constitutive or inducible, for example the promoter of the hsp60 gene and the promoter of the acr gene, respectively.
  • proteins, or immunogenic ANDV fragments can be expressed by BCG or other attenuated strains of Mycobacterium, in a soluble-cytoplasmic form, secreted extracellularly, or as membrane-bound proteins.
  • Example I Recombinant BCG Danish strain for the N gene of ANDV.
  • the BCG Danish strain was transformed by electrotransformation with the plasmid pMV361/N, derived from the plasmid pMV361, which integrates only once into the bacterial genome.
  • This plasmid contains the SEO gene.
  • ID NO. 1 the one that codes for the N protein of ANDV, SEO. ID NO. 2, which is expressed under the control of the endogenous and constitutive promoter of the BCG hsp60 gene.
  • PBS solution 137 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 4.3 mM Na 2 HPO 4 ; 1.47 mM KH 2 PO 4 , pH 7.4
  • BCGs A fraction of recombinant BCGs was subjected to a protein extraction protocol to evaluate the presence of the recombinant N antigen in it. For this, these BCGs were resuspended in a lysis buffer (50 mM Tris, 5 mM EDTA, 0.6% SDS, protease inhibitor IX cocktail), subjected to ultrasound pulses (20 pulses of 20 seconds, with a resting stage 5 minutes every 10 pulses) and then frozen at -20°C until used in Western blot.
  • a lysis buffer 50 mM Tris, 5 mM EDTA, 0.6% SDS, protease inhibitor IX cocktail
  • Example II Clinical evaluation of animals vaccinated with a formulation of the recombinant Danish BCG strain for the N gene of ANDV.
  • mice of 4-6 weeks of age were vaccinated with the formulation of the invention, the animals received a subcutaneous injection in the neck with 1x10 8 CFU of rBCG-N-ANDV, or with the untransformed strain BCG-WT. or received only vehicle (PBS) at days 0 and 14 of the trial. Weight measurements were made several times a week during the 28-day duration of the study. The results of this test are shown in Figure 2, where we can highlight that the animals vaccinated with rBCG-N-ANDV presented an increase in weight according to their age and did not present problems in weight gain.
  • Example III Evaluation of the immunogenicity of the formulation comprising rBCG-N-ANDV.
  • IL-2 measured by ELISA shows a greater secretion of this interleukin in spleen cells derived from mice immunized with rBCG-N-ANDV when stimulated with recombinant protein N-ANDV, when compared to control groups ( Figure 5 ), which indicates that there is an antigen-specific cell proliferation.

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Abstract

La invención se refiere a una formulación inmunogénica que contiene la cepa Bacilo Calmette- Guerin (BCG) en una concentración entre 104-109 bacterias, que expresa al menos una proteína o fragmento inmunogénico de Andesvirus (ANDV), en una solución tampón salina farmacéuticamente aceptable, que sirve para preparar una vacuna útil para prevenir, tratar o atenuar infecciones de ANDV. ANDV pertenece a la familia de Hantavirus y es un patógeno humano altamente virulento, que afecta anualmente a decenas de personas en Chile generando en algunos infectados un Síndrome Cardiopulmonar por Hantavirus (SCPH).

Description

FORMULACIÓN INMUNOGÉNICA QUE CONTIENE UNA CEPA BCG MODIFICADA QUE EXPRESA UNA PROTEÍNA DE ANDESVIRUS (ANDV) ÚTIL PARA PREVENIR Y TRATAR INFECCIONES POR VIRUS HANTA-ANDV
MEMORIA DESCRIPTIVA
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Se divulga una formulación inmunogénica útil para preparar una vacuna contra Andesvirus (ANDV), donde esta formulación comprende al menos una cepa atenuada de Mycobacterium bovis, Bacilo Calmette-Guérin (BCG), que expresa de manera recombinante una o más proteínas o fragmentos inmunogénicos de ANDV.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los Hantavirus son el agente etiológico de dos enfermedades en humanos: la fiebre hemorrágica con síndrome renal (FHSR) y el síndrome cardiopulmonar por hantavirus (SCPH). Estos virus de distribución mundial son clasificados como hantavirus del viejo mundo responsables del FHSR, predominan en Europa y Asia las especies: Hantaan virus (HTNV) y Seoul virus (SEOV), entre otros. Por otro lado, los hantavirus del nuevo mundo producen SCHP e incluye a 36 especies, entre ellas: Andesvirus (ANDV), Sin nombre (SNV) y Choclo virus (CHOV) los cuales se distribuyen en América.
La especie ANDV es endémica de América y presenta una alta virulencia respecto a otros hantavirus, hasta la fecha es la única especie capaz de transmitirse de humano a humano. Cabe mencionar que el desarrollo de vacunas contra especies de hantavirus del viejo mundo está a la vanguardia, sin embargo, estas no ofrecen protección contra las especies del nuevo mundo.
ANDV es un virus de RNA antisentido o negativo que comprende en su genoma un segmento pequeño (S) que codifica la proteína de la nucleocápside (N), un segmento mediano (M) que codifica una glicoproteína precursora que origina las glicoproteínas Gn y Ge, y un segmento grande (L) que codifica la polimerasa dependiente de ARN.
Actualmente, no existe un tratamiento profiláctico capaz de generar memoria inmunológica en el hospedero contra la infección por ANDV.
En el estado del arte hemos encontrado algunos documentos que divulgan o protegen vacunas contra ANDV, entre los que se encuentran WO2019178286A1, CL201802306 y CL201101085, donde todos estos documentos emplean las glicoproteínas de cubierta de ANDV, Gn y Ge, como partículas inmunogénicas. Estas proteínas constituyen el blanco más obvio para una vacuna dado que al estar en la cápside se considera que están más expuestas al reconocimiento del sistema inmune del hospedero. Por otra parte, D. M. Custer et al. (Journal of Virology, 2003, vol. 77, no 18, p. 9894-9905) divulga una vacuna de ADN que comprende el segmento genómico M de ANDV, el que como ya indicamos, codifica también para Gn y Ge. A pesar de que esta estrategia es prometedora, hasta el momento no existe legislación ni autorización sanitaria para la inoculación de ADN foráneo en un hospedero humano.
Ante este escenario los inventores han desarrollado una nueva vacuna, con una estrategia diferente a las desarrolladas por otros grupos, la que está basada principalmente en la proteína N de ANDV, no en Gn y Ge, y que emplea como vector la cepa atenuada de Mycobacterium bovis, Bacilo Calmette-Guérin (BCG), la que ha demostrado desde hace más de 100 años un uso seguro en neonatos y que se sabe actúa como adyuvante e induce respuestas que confieren inmunidad a largo plazo. Sorprendentemente, los inventores han demostrado que al usar la proteína de la nucleocápside del virus (N), si se genera inmunidad que permite controlar la infección por ANDV.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. rBCG-N-ANDV expresa N-ANDV recombinante. Un anticuerpo monoclonal específico contra N-ANDV se usó como anticuerpo primario, seguido de un anticuerpo secundario unido a peroxidasa de rabanito (HRP). Colonias 2 y 3 (C2 FT y C3 FT) corresponden a Usados de colonias rBCG-N-ANDV. Se muestran además un control positivo (N-ANDV recombinante expresada en E. coli, N-ANDV) y controles negativos (lisado de rBCG-P-hMPV, de BL21-P y agua, H2O).
Figura 2. Animales vacunados con rBCG-N-ANDV presentan ganancia de peso. Ratones macho BALB/c de 4 - 6 semanas de edad fueron vacunados con BCG-WT o rBCG-N-ANDV, o recibieron vehículo (PBS) los días 0 y 14 (booster). Mediciones de peso fueron realizadas varias veces por semana durante los 28 días de duración del estudio. A. Cambio relativo en los porcentajes (%) de peso desde el día 0. B. Peso absoluto (en gramos) desde el día 0. Los datos se representan como media + SEM desde tres animales por grupo.
Figura 3. Ratones inmunizados con la vacuna rBCG-N-ANDV tienen un puntaje clínico similar en comparación a ratones vacunados con BCG WT. Ratones macho BALB/c de 4 - 6 semanas de edad fueron vacunados con BCG-WT o rBCG-N-ANDV, o recibieron vehículo (PBS) los días 0 y 14 (booster). Mediciones clínicas fueron realizadas varias veces por semana durante los 28 días de duración del estudio. A. Puntaje clínico completo, abarcando constantes fisiológicas, comportamiento, aspecto, y reacciones adversas a la inmunización, con cada categoría recibiendo puntuación de 0 a 3. B. Puntaje específico de reacción adversa a la inmunización, de 0 a 3. Los datos se representan como media + SEM desde tres animales por grupo.
Figura 4. La vacuna rBCG-N-ANDV genera poblaciones de linfocitos T antígeno-específicos. Ratones macho BALB/c de 4 - 6 semanas de edad fueron vacunados con BCG-WT o rBCG-N-ANDV, o recibieron vehículo (PBS) los días 0 y 14 (booster). Al día 28, los animales fueron eutanasiados y se obtuvieron células de bazo para generar ensayos de estimulación ex vivo con proteína recombinante N-ANDV (10 pg/mL y 2 pg/mL) y PPD-B (20 pg/mL). Luego de 72h de incubación, se realizaron análisis de citometría de flujo en células de bazo con diversos marcadores. A-C: Aumento de linfocitos T CD4+ expresando marcadores de activación CD69 y CD71. D-F: Aumento de linfocitos T CD8+ expresando marcadores de activación CD25, CD69, y CD71. Datos representados como media ± EM obtenidos de 3 ratones por grupo. **p<0.01, 2-way ANOVA seguido de Tukey's multiple comparisons test.
Figura 5. rBCG-N-ANDV induce proliferación de células del bazo de ratones inmunizados luego de la reestimulación con N-ANDV. Ratones macho BALB/c de 4 - 6 semanas de edad fueron vacunados con BCG-WT o rBCG-N-ANDV, o recibieron vehículo (PBS) los días 0 y 14 (booster). Al día 28, los animales fueron eutanasiados y se obtuvieron células de bazo para generar ensayos de estimulación ex vivo con proteína recombinante N-ANDV (10 pg/mL y 2 pg/mL) y PPD-B (20 pg/mL). Los sobrenadantes de cultivo de células de bazo se obtuvieron a las 72h post incubación y se determinó niveles de factores solubles mediante ELISA. Datos representados como media ± SEM obtenidos de 3 ratones por grupo. ****p<0,0001, 2-way ANOVA seguido de Tukey's multiple comparisons test.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La invención corresponde a una vacuna viva atenuada basada en Mycobacterium bovis, preferentemente de la cepa Bacilo Calmette-Guérin (BCG) que genera la expresión recombinante de un antígeno viral heterólogo, en especial la Nucleoproteína (N) de Andesvirus (ANDV) o sus fragmentos inmunogénicos.
Específicamente la invención apunta a una formulación inmunogénica que confiere protección contra Hantavirus del nuevo mundo y/o el desarrollo de síndrome cardiopulmonar por Hantavirus (SCPH), que comprende cepa recombinante atenuada de Mycobacterium bovis Bacilo Calmette-Guérin (BCG), en una cantidad entre 104-109 unidades formadoras de colonia (UFC) por dosis, la que expresa al menos una proteína o fragmento inmunogénico del virus Andesvirus (ANDV), en una solución tampón salina farmacéuticamente aceptable. De manera preferente la proteína o fragmento inmunogénico del virus Andesvirus corresponde a la proteína N de ANDV o sus fragmentos inmunogénicos, donde la proteína tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 75% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEO. ID NO:1 y preferentemente es al menos un 95% idéntica a la SEO. ID NO: 1.
En la formulación inmunogénica de la invención los genes que codifican para la proteína N de ANDV o sus fragmentos inmunogénicos se encuentran insertos en el genoma de Mycobacterium BCG o en plásmidos extracromosomales, en una o varias copias, y están regulados o comandados por promotores endógenos o exógenos de Mycobacterium BCG, constitutivos o inducibles. Los genes que codifican para la proteína N de ANDV o sus fragmentos inmunogénicos corresponden a una secuencia nucleotídica al menos un 75% idéntica a la SEO. ID NO: 2, y preferentemente al menos un 95% idéntica a la SEO. ID NO: 2. Como resultado, la proteína N de ANDV o sus fragmentos inmunogénicos pueden ser expresados por BCG de forma soluble-citoplasmática, secretada extracelularmente o como proteínas unidas a membrana celular. La cepa de BCG empleada se escoge preferentemente entre BCG Danish o BCG Pasteur.
En una realización de la invención, la proteína o fragmento inmunogénico del virus Andesvirus corresponden secuencias de aminoácidos con al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más de identidad con respecto a la secuencia de la proteína N de ANDV, definida de acuerdo a la SEO. ID NO:1, en donde la diferencia incluye sustituciones, supresiones, adiciones o inserciones. Asimismo, para el experto en la técnica será evidente que para obtener esta expresión proteica se debe transformar la bacteria con un vector que contenga una secuencia nucleotídica que codifique para dicha proteína, donde la invención incluye una secuencia nucleotídica que con al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más de identidad con respecto a la secuencia nucleotídica, definida de acuerdo a la SEO. ID NO:2 y sus equivalentes producto de la degeneración del código genético.
Al formularse, la formulación inmunogénica de la invención es estabilizada por congelamiento, liofilización o en solución salina tampón y excipientes para preparaciones inyectables, para su conservación previa a su uso. Entre los excipientes apropiados se encuentran: glutamato de sodio, sulfato de magnesio heptahidrato, hidrogenofosfato de potasio, ácido cítrico monohidrato, L- asparagina monohidrato, citrato de hierro y amonio, glicerol, y agua para preparaciones inyectables y cualquier otro disponible en la técnica, al momento de ejecutar la invención.
En otra realización de la invención se protege el uso de la formulación inmunogénica descrita para preparar una vacuna para prevenir, tratar, o atenuar infecciones de ANDV y el desarrollo de síndrome cardiopulmonar por Hantavirus (SCPH), donde dicha formulación contiene entre 1X104-1X109 UFC (unidades formadores de colonia) de la cepa atenuada recombinante de Mycobacterium BCG estabilizada con una solución salina. Esta vacuna puede ser administrada de forma subcutánea, percutánea o subdérmica en solución salina fisiológicamente aceptable.
Para generar la formulación que se protege en esta invención, se utiliza la cepa Danish o Pasteur de BCG, y la transformamos a nivel de genoma, expresando la proteína N de ANDV de manera constitutiva durante su ciclo replicativo. La síntesis de esta proteína no genera alteraciones ni impedimentos en la capacidad replicativa de la bacteria, por lo cual no ejercería un efecto de toxicidad a la cepa vector.
Dos características a destacar de esta invención corresponden a su perfil de seguridad e inmunogenicidad, los cuales hemos evaluado en un modelo preclínico murino. Nuestros resultados de curvas de crecimiento y de manifestaciones clínicas en ratones inmunizados indican que la administración de esta vacuna no genera reacciones adversas significativas, teniendo un efecto similar al de BCG sin transformar o WT (por sus siglas en inglés, wild type). Con respecto a la inmunogenicidad de esta vacuna, hemos observado que genera una proliferación y activación de células T CD4+ y CD8+ específicas contra el antígeno purificado N-ANDV, estímulos esenciales para producir una respuesta inmune y generar memoria inmunológica. El perfil de seguridad e inmunogenicidad observado para la vacuna de la presente invención la convierten en una herramienta segura de inmunización.
Actualmente no existe vacuna o tratamiento efectivos aprobados para la prevención o el tratamiento de la infección por ANDV. La vacuna BCG recombinante que expresa la proteína N de ANDV (rBCG-N-ANDV) de acuerdo a la presente invención puede ser utilizada en individuos de todas las edades. La invención consiste en una vacuna desarrollada con el fin de prevenir el síndrome cardiopulmonar por hantavirus (SCPH). BCG es un buen vehículo para el desarrollo de vacunas, ya que ha demostrado ser segura en neonatos, niños y adultos. Se puede producir fácilmente a gran escala con bajos costos y es estable a los cambios de temperatura. Sumado a esto, la BCG actúa como adyuvante e induce una respuesta Thl (linfocito T helper), la que es necesaria para la eliminación del virus. A diferencia de otras formulaciones, el vector BCG, donde se expresa la proteína viral, ha sido ampliamente utilizado durante casi 100 años en humanos. Sumado a esto, la proteína N de ANDV es altamente conservada en todos los subtipos de hantavirus del nuevo mundo (36 especies), por lo que esta vacuna podría conferir protección contra el desarrollo de síndrome cardiopulmonar por hantavirus en toda América.
Como resumen de resultados logrados por la presente invención, podemos destacar:
-La administración de la vacuna rBCG-N-ANDV en modelo BALB/c es segura para los animales inmunizados.
-La inmunización con la vacuna rBCG-N-ANDV genera poblaciones de linfocitos T de manera específica, por lo cual es inmunogénica a nivel celular.
Las vacunas de la invención contienen cepas vivas recombinantes atenuadas de Mycobacterium bovis, preferentemente Bacilo Calmette-Guérin (BCG), por ejemplo las cepas BCG Danish o Pasteur que expresan de manera recombinante o heteróloga una o más proteínas o fragmentos inmunogénicos ANDV, en especial la proteína N o sus fragmentos inmunogénicos. Las vacunas de la invención comprenden entre lxlO4- lxlO9 UFC (unidades formadores de colonia) de las cepas descritas por dosis, y pueden mantenerse conservadas, previo a su administración, de forma I iofil izada o en una solución salina y excipientes estabilizadores en frío.
Ejemplos de soluciones estabilizadoras apropiadas para las formulaciones inmunogénicas o vacunas de la invención son: Solución diluida Sauton SSI (125 pg MgSO4, 125 pg K2HPO4, 1 mg L-asparragina, 12,5 pg citrato de amonio férrico, 18,4 mg 85% glicerol, 0,5 mg ácido cítrico, en 1 ml de H2O) a 4°C;
- PBS (137 mM NaCI; 2,7 mM KCI; 4,3 mM Na2HPO4; 1,47 mM KH2PO4, pH 7,4) suplementado con Tween 80 a 0,02% y Glicerol 20% a -80°C; o
Solución volumen: volumen de lactosa 25% y Medio Proskauer y Beck suplementado con glucosa y Tween 80 (PBGT: 0,5 g asparragina; 5,0 g fosfato monopotasio; 1,5 g citrato de magnesio; 0,5 g sulfato de potasio; 0,5 ml Tween 80 y 10,0 g glucosa por litro de agua destilada) liofilizada y conservada en el rango de temperaturas entre 4°C y 25°C.
Para obtener las cepas recombinantes de la invención, los genes que codifican para la proteína N o sus fragmentos inmunogénicos, se insertan en un plásmido, el que se incorpora a la bacteria por cualquier técnica disponible. En una realización se utiliza el plásmido pMV361, se incorpora a la bacteria mediante electrotransformación, y se integra en el genoma bacteriano por acción de integrasas de mycobacteriófagos. También estos genes se pueden insertar en plásmidos extracromosomales, como por ejemplo pMV261, que se incorpora al Mycobacterium por electrotransformación, y se mantiene de forma extracromosomal en la bacteria. Estos genes pueden estar en una o varias copias, y su expresión está comandada por promotores endógenos de BCG, constitutivos o inducibles, por ejemplo el promotor del gen hsp60 y el promotor del gen acr respectivamente. Estas proteínas, o fragmentos inmunogénicos de ANDV, pueden ser expresados por BCG u otras cepas atenuadas de Mycobacterium, de forma soluble-citoplasmática, secretada extracelularmente o como proteínas unidas a la membrana.
La secuencia aminoacídicas de la proteína N de ANDV se encuentra en la SEO. ID No.l, y la secuencia nucleotídica del gen que codifica para esta proteína N de ANDV se encuentra SEO. ID NO. 2:
EJEMPLOS
Estos ejemplos son solamente ilustrativos y no pretenden limitar el rango de producción o aplicación de la invención. Aunque en las siguientes descripciones se utilicen términos específicos, su uso es sólo descriptivo y no limitante.
Ejemplo I Cepa BCG Danish recombinante para el gen N de ANDV. La cepa BCG Danish fue transformada mediante electrotransformación con el plásmido pMV361/N, derivado del plásmido pMV361, que se integra una sola vez en el genoma de la bacteria. Este plásmido contiene el gen de la SEO. ID NO. 1 el que codifica para la proteína N de ANDV, SEO. ID NO. 2, el cual se expresa bajo control del promotor endógeno y constitutivo del gen hsp60 de BCG. Las colonias recombinantes resultantes se crecieron (a 37°C en medio de cultivo Middlebrock 7H9 suplementado, con Kanamicina 25 ug/mL como antibiótico de selección) hasta OD6oonm=l, fueron centrifugadas a 11.000 rpm por 20 min (rotor eppendorf modelo 5702/R A-4-38) y se resuspendieron en solución PBS (137 mM NaCI; 2,7 mM KCI; 4,3 mM Na2HPO4; 1,47 mM KH2PO4, pH 7,4), generando dosis de 108 UFC por 100 pl y se conservaron a -80°C hasta su uso como vacuna en animales. Se descartó la presencia de agentes contaminantes sembrando algunas de las dosis en placas de LB y 7H9 sin antibióticos. Asimismo, se confirmó que las dosis fuesen precisas respecto al número de UFCs, realizando diluciones seriadas en placas de 7H9 y conteo de colonias, desde los viales de dosis.
Una fracción de BCGs recombinantes fue sometida a un protocolo de extracción de proteínas, para evaluar la presencia del antígeno N recombinante en ella. Para ello, estas BCGs fueron resuspendidas en un buffer de lisis (Tris 50 mM, EDTA 5 mM, SDS 0.6 %, coctel de inhibidor de proteasas IX ), sometidas a pulsos de ultrasonido (20 pulsos de 20 segundos, con una etapa de descanso de 5 minutos cada 10 pulsos) y luego congeladas a -20°C hasta su uso en Western blot.
Por Western blot, con el uso de anticuerpos monoclonales específicos para la proteína N de ANDV, los inventores observaron que esta cepa de BCG transformada expresa de manera recombinante la proteína N de ANDV en el citoplasma. Los resultados se muestran en la Figura 1, donde se observa la expresión de la proteína N de ANDV en 2 colonias de rBCG-N-ANDV, denominadas C2 FT y C3 FT.
Ejemplo II Evaluación clínica de animales vacunados con una formulación de la cepa BCG Danish recombinante para el gen N de ANDV.
Ratones macho BALB/c de 4 - 6 semanas de edad fueron vacunados con la formulación de la invención, los animales recibieron una inyección subcutánea en el cuello con lxlO8 UFC de rBCG-N- ANDV, o con la cepa sin transformar BCG-WT o recibieron sólo vehículo (PBS) a los días 0 y 14 del ensayo. Mediciones de peso fueron realizadas varias veces por semana durante los 28 días de duración del estudio. Los resultados de este ensayo se muestran en la Figura 2, donde podemos resaltar que los animales vacunados con rBCG-N-ANDV presentaron un alza de peso acorde a su edad y no presentaron problemas en la ganancia de peso.
La ganancia de peso del grupo que recibió la formulación de la invención es menor al grupo control sin inmunizar (Figura 2A) y al grupo inmunizado con BCG, sin embargo, el peso absoluto de estos animales es similar a los animales de los grupos controles (Figura 2B).
Adicional a la ganancia de peso se estudió un puntaje clínico completo para cada animal donde se evaluaron constantes fisiológicas, comportamiento, aspecto, y reacciones adversas a inmunización, con cada categoría recibiendo puntuación de 0 a 3, donde la peor condición obtendría un máximo de 12 puntos y la mejor condición 0 puntos. Los resultados muestran que los animales inmunizados con rBCG-N-ANDV no presentaron alteraciones fisiológicas ni de comportamiento, con un puntaje fisiológico que no sobrepasó los 3 puntos, de manera similar al grupo control inmunizado con BCG sin transformar (Figura 3A).
Finalmente se evaluó el desarrollo de reacciones en sitio de inoculación, observamos que todos los animales inmunizados con rBCG-N-ANDV presentaron formación de un pseudo-granuloma, el cual comenzó ha aparecer a partir del quinto (5to) día post inmunización (Figura 3B). Este pseudo- granuloma se vio acompañado con zonas alopécicas en epidermis, sin aparición de eritema, edema o disrup on de tejido. Los animales no mostraron señales de alteraciones sistémicas a raíz de esta reacción. Por otra parte, los animales del grupo control BCG-WT también desarrollaron pseudo- granuloma, el cual se evidenció desde el séptimo (7mo) día post inoculación (Figura 3B). En este grupo sólo un animal presentó zonas de alopecia, sin mayor compromiso local ni sistémico. Podemos concluir a raíz de estos datos, que la vacuna rBCG-N-ANDV en dosis altas es segura y no genera reacciones adversas en comparación a la BCG WT, en este esquema de inmunización en ratones BALB/c.
Ejemplo III: Evaluación de inmunogenicidad de la formulación que comprende rBCG-N-ANDV.
Para evaluar la inmunogenicidad de la vacuna de la invención ratones macho BALB/c de 4 - 6 semanas de edad fueron vacunados con BCG-WT o rBCG-N-ANDV en dosis de lxlO8 UFC, o recibieron vehículo (PBS) a los días 0 y 14 (booster). Al día 28, animales fueron eutanasiados y se obtuvieron células de bazo para generar ensayos de estimulación ex vivo con proteína recombinante N-ANDV (10 pg/mL y 2 pg/mL) y de Mycobacterium (20 pg/mL) como control de especificidad. Luego de 72h de incubación, se realizaron análisis de citometría de flujo en células de bazo con diversos marcadores.
Los resultados muestran que la inmunización con rBCG-N-ANDV generó poblaciones celulares CD4+ y CD8+ antígeno específicas, los cuales se activaron en presencia del antígeno de interés N-ANDV, expresando marcadores de activación tales como CD69 (Figura 4B y 4E) y CD71 (Figura 4C y 4F). También se encontraron diferencias significativas en la expresión del receptor de IL-2 en células T CD8+, al compararse con grupos controles. La expresión de IL-2 medida por ELISA, nos muestra una mayor secreción de esta interleucina en células de bazo derivados de ratones inmunizados con rBCG- N-ANDV al ser estimulados con proteína recombinante N-ANDV, al compararse con grupos controles (Figura 5), los que nos indica que hay una proliferación celular antígeno específica.
Estos resultados demuestran que animales inmunizados con rBCG-N-ANDV desarrollan inmunidad contra la proteína N-ANDV, lo que otorgan una protección contra Hantavirus, específicamente contra Andesvirus (ANDV), permitiendo de este modo la prevención del desarrollo del Síndrome Cardiopulmonar por Hantavirus (SCPH).

Claims

REIVINDICACIONES
1. Formulación inmunogénica que confiere protección contra Hantavirus y/o el desarrollo de síndrome cardiopulmonar por Hantavirus (SCPH) CARACTERIZADA porque comprende una cepa recombinante atenuada de Mycobacterium Bacilo Calmette-Guérin (BCG), en una cantidad entre 104-109 UFC por dosis, la que expresa al menos una proteína o fragmento inmunogénico del virus Andesvirus (ANDV), en una solución tampón salina farmacéuticamente aceptable.
2. La formulación inmunogénica de acuerdo con cláusula 1, CARACTERIZADA porque, la proteína o fragmento inmunogénico del virus Andesvirus corresponde a la proteína N de ANDV o sus fragmentos inmunogénicos.
3. La formulación inmunogénica de la cláusula 2, CARACTERIZADA porque la proteína o fragmento inmunogénico del virus Andesvirus corresponde a una secuencia de aminoácidos al menos un 75% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEO. ID NO: 1.
4. La formulación inmunogénica de la cláusula 3, CARACTERIZADA porque la proteína o fragmento inmunogénico del virus Andesvirus es al menos un 95% idéntica a la secuencia SEO. ID NO: 1.
5. La formulación inmunogénica de la cláusula 2, CARACTERIZADA porque los genes que codifican para la proteína N de ANDV o sus fragmentos inmunogénicos se encuentran insertos en el genoma de Mycobacterium BCG o en plásmidos extracromosomales, en una o varias copias.
6. La formulación inmunogénica de la cláusula 5, CARACTERIZADA porque los genes que codifican para la proteína N de ANDV o sus fragmentos inmunogénicos corresponden a una secuencia nucleotídica al menos un 75% idéntica a la SEQ ID NO: 2.
7. La formulación inmunogénica de la cláusula 6, CARACTERIZADA porque los genes que codifican para la proteína N de ANDV o sus fragmentos inmunogénicos corresponden a una secuencia nucleotídica al menos un 95% idéntica a la SEQ ID NO: 2.
8. La formulación inmunogénica de la cláusula 7, CARACTERIZADA porque la expresión de los genes están comandados por promotores endógenos o exógenos de Mycobacterium BCG, constitutivos o inducibles.
9. La formulación inmunogénica de la cláusula 8, CARACTERIZADA porque la proteína N de ANDV o sus fragmentos inmunogénicos pueden ser expresados por BCG de forma soluble-citoplasmática, secretada extracelularmente o como proteínas unidas a membrana celular.
10. La formulación inmunogénica de la cláusula 1, CARACTERIZADA porque es estabilizada por congelamiento, liofilización o en solución salina tampón y excipientes para su conservación previa a su uso.
11. La formulación inmunogénica de la cláusula 9, CARACTERIZADA porque es estabilizada por congelamiento, liofilización o en solución salina tampón y excipientes para su conservación previa a su uso.
12. La formulación inmunogénica de la cláusula 1, CARACTERIZADA porque la cepa recombinante atenuada es BCG Danish o BCG Pasteur.
13. Uso de la formulación inmunogénica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores CARACTERIZADO porque sirve para preparar una vacuna para prevenir, tratar o atenuar infecciones de ANDV y/o el desarrollo de síndrome cardiopulmonar por Hantavirus (SCPH), donde dicha formulación contiene entre lxlO4 - lxlO9 unidades formadoras de colonia de la cepa atenuada recombinante de Mycobacterium BCG estabilizada con una solución salina fisiológicamente aceptable.
14. Uso de la reivindicación 13, CARACTERIZADO porque sirve para preparar una vacuna para prevenir, tratar o atenuar infecciones de ANDV y/o el desarrollo de síndrome cardiopulmonar por Hantavirus (SCPH), para ser administrada de forma subcutánea, percutánea o subdérmica en solución salina fisiológicamente aceptable.
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