WO2022071458A1 - 老化細胞判定システム - Google Patents
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- Skeletal myoblasts used for such treatment are usually obtained by separating CD56-positive cells such as skeletal myoblasts and myosatellite cells from the skeletal muscle tissue to be transplanted, but to cells separated from the skeletal muscle tissue.
- CD56-positive cells such as skeletal myoblasts and myosatellite cells
- the skeletal muscle tissue is immersed in a proteolytic enzyme solution for a predetermined time, the enzyme treatment is performed, the obtained enzyme treatment solution is discarded, and then the proteolytic enzyme solution is again used.
- a method of recovering cells contained in an enzyme-treated solution obtained by immersing the cells in an enzyme-treated solution for a predetermined time is known (Patent Document 1).
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Abstract
筋芽細胞等の培養目的の細胞について、非破壊的かつ迅速に、老化の程度を判定する手段を提供する。 培養液中で、培養基材表面に接着すると、細胞質が培養基材上に広がっていくそのひろがりが、老化の程度が高い細胞ほど広く広がることを利用して、広がりの程度を、輝度、反射率または画像処理結果に基づき検出して老化の程度を判定する。広がりの速度から老化の程度を判別することも可能である。
Description
本発明は、目的細胞の培養のための細胞製品の、老化細胞の判定を行うシステムに関する。
近年、損傷した組織等の修復のために、種々の細胞を移植する試みが行われている。例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患により損傷した心筋組織の修復のために、胎児心筋細胞、骨格筋芽細胞、間葉系幹細胞、心臓幹細胞、ES細胞、iPS細胞等の利用が試みられている(非特許文献1)。
このような試みの一環として、スキャフォールドを利用して形成した細胞構造物や、細胞をシート状に形成したシート状細胞培養物が開発されてきた(非特許文献2)。
シート状細胞培養物の治療への応用については、火傷などによる皮膚損傷に対する培養表皮シートの利用、角膜損傷に対する角膜上皮シート状細胞培養物の利用、食道がん内視鏡的切除に対する口腔粘膜シート状細胞培養物の利用などの検討が進められており、その一部は臨床応用の段階に入っている。
シート状細胞培養物の治療への応用については、火傷などによる皮膚損傷に対する培養表皮シートの利用、角膜損傷に対する角膜上皮シート状細胞培養物の利用、食道がん内視鏡的切除に対する口腔粘膜シート状細胞培養物の利用などの検討が進められており、その一部は臨床応用の段階に入っている。
このような治療に用いる骨格筋芽細胞は、通常移植する対象の骨格筋組織から骨格筋芽細胞および筋衛星細胞などのCD56陽性細胞を分離して得るが、骨格筋組織から分離された細胞に含まれるCD56陽性細胞の割合を高める方策として、例えば、骨格筋組織をタンパク質分解酵素溶液に所定の時間浸漬して酵素処理を行って得られた酵素処理液を廃棄した後に、再度タンパク質分解酵素溶液に所定の時間浸漬して酵素処理を行って得られた酵素処理液に含まれる細胞を回収する方法などが知られている(特許文献1)。
骨格筋芽細胞を、例えばシート状細胞培養物作成のための材料としての細胞製品とする場合、細胞を培養して細胞数を増加させるが、細胞が老化していると増殖は途中で停止してしまい、一定数の細胞が得られないこととなる。
その様なリスクを回避するために、培養に供する細胞の老化の程度を判定し、判定対象である細胞含有液中の、老化細胞の含有率が許容範囲であるかどうかを判定する必要がある。
その様なリスクを回避するために、培養に供する細胞の老化の程度を判定し、判定対象である細胞含有液中の、老化細胞の含有率が許容範囲であるかどうかを判定する必要がある。
従来、細胞培養のための細胞の、老化の程度を知るためには、細胞が含まれている液の一部をサンプリングして分析検査していたので、非破壊検査とはいえず、細胞の一部は検査のために失われることになっていた。また、分析には時間がかかるものであった。
細胞が生きたままで、分裂の活性度を判定する技術として、結合させても細胞が死滅しない色素を用いて顕微鏡観察するものが公知であった(特許文献2)。
しかしながら、この観察法は、人間が顕微鏡観察して判別するものであり、例えば大量の対象細胞を自動的に判別すること、はできなかった。また 、判断に大幅な時間がかかること、人間による目視観察の場合判断にバラつきが生じること、という問題があった。
細胞が生きたままで、分裂の活性度を判定する技術として、結合させても細胞が死滅しない色素を用いて顕微鏡観察するものが公知であった(特許文献2)。
しかしながら、この観察法は、人間が顕微鏡観察して判別するものであり、例えば大量の対象細胞を自動的に判別すること、はできなかった。また 、判断に大幅な時間がかかること、人間による目視観察の場合判断にバラつきが生じること、という問題があった。
Haraguchi et al., Stem Cells Transl Med. 2012 Feb;1(2):136-41
Sawa et al., Surg Today. 2012 Jan;42(2):181-4
従来、培養した細胞を細胞製品として供給しようとする場合、細胞製品をさらに培養する際に増殖が途中で停止してしまうような老化した細胞が含まれてしまうと細胞製品として不適格であるので、細胞製品の老化の程度を判定しておく必要があり、非破壊的に判定できれば、細胞のロスなく不適格品供給リスクが回避できるので、そのような判定が望まれていた。
また、非破壊的細胞老化判定は、迅速簡便に行えるものであることが望ましい。さらに、老化の程度の判定には、バラつきのない精度の高い判定が望まれていた。
また、非破壊的細胞老化判定は、迅速簡便に行えるものであることが望ましい。さらに、老化の程度の判定には、バラつきのない精度の高い判定が望まれていた。
本発明者等は、上述した問題を解決するために鋭意検討した結果、培養を行おうとする細胞が培養基材へ接着する時に、その細胞質の面積が広がるが、その広がり方が老化した細胞と老化していない細胞とで、大きく異なること、また 、細胞増殖の後の状態においても、老化した細胞とそうでない細胞で広がりが異なることを発見した。
さらに、細胞質の面積の広がりは、非破壊的に、光の反射率、細胞の輝度または撮像した画像情報によって検出することが可能であることを見出した。そして、このような知見に基づきさらに研究を重ねた結果、培養の対象である目的細胞の老化の程度が非破壊的な手法によって、かつ迅速に、検出することができ、細胞製品の品質の検査を自動化することもできることを見出し、本発明を完成させた。
また、細胞質面積が、培養基材へ接着してから拡大していく速さ、および細胞の増殖時の拡大の速さ、即ち面積の時間変化率も、培養細胞の老化の程度に応じて異なることも見出したので、単位時間当たり面積変化率を検出することによっても、培養細胞の老化の程度が判定でき、本発明はこれも含む。
すなわち本発明は、以下に関する。
[1]目的細胞の老化を判定するためのシステムであって、
培養基材上の目的細胞の細胞質の面積の変化を検出する検出部、と
検出部の検出結果から細胞の老化を判定する判定部とを含む
目的細胞老化判定システム。
[2]判定部が、目的細胞の培養基材への接着時以降の面積変化から老化を判定する、[1]に記載のシステム。
[3]検出部が、細胞の輝度、反射率または画像情報により細胞質の面積変化を検出する、[1]または[2]に記載のシステム。
[4]細胞質の面積の変化を、面積の時間変化率によって検出する、[1]~[3]のいずれか一つに記載のシステム。
[5]判定部が、細胞質面積変化の、老化の程度による相違を、実測した老化の程度を判定部に学習させることによって判定をおこなう、[1]~[4]のずれか一つに記載のシステム。
[6]目的細胞が筋芽細胞である、[1]~[5]のいずれか一つに記載のシステム。
[1]目的細胞の老化を判定するためのシステムであって、
培養基材上の目的細胞の細胞質の面積の変化を検出する検出部、と
検出部の検出結果から細胞の老化を判定する判定部とを含む
目的細胞老化判定システム。
[2]判定部が、目的細胞の培養基材への接着時以降の面積変化から老化を判定する、[1]に記載のシステム。
[3]検出部が、細胞の輝度、反射率または画像情報により細胞質の面積変化を検出する、[1]または[2]に記載のシステム。
[4]細胞質の面積の変化を、面積の時間変化率によって検出する、[1]~[3]のいずれか一つに記載のシステム。
[5]判定部が、細胞質面積変化の、老化の程度による相違を、実測した老化の程度を判定部に学習させることによって判定をおこなう、[1]~[4]のずれか一つに記載のシステム。
[6]目的細胞が筋芽細胞である、[1]~[5]のいずれか一つに記載のシステム。
本発明は、目的細胞の老化の程度を、非破壊的に迅速に判定できるため、細胞製品の品質を細胞を失うことなく、迅速に判定することが可能である。また、判定は非破壊的かつ非接触で、光を利用して検出器や画像処理手段を用いておこなうことができるため、人手を介さない自動判別が可能となり、判断にバラつきが生じるおそれも大きく減少し、判定基準の客観化、安定化も達成することができる。
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。
本発明において、「細胞」とは、生体由来組織から分離された任意の細胞を含むことができる。非限定的に、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞などおよび幹細胞(例えば、筋芽細胞(例えば、骨格筋芽細胞)(筋芽細胞は、筋衛星細胞を含む)、間葉系幹細胞(例えば、骨髄、脂肪組織、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、胎盤、臍帯血由来のものなど)、心臓幹細胞などの組織幹細胞、胚性幹細胞など)が挙げられる。本発明における細胞は平面で接触する複数の膜の間において複数の膜と直接接触または複数の膜に隣接するようにして膜に取り囲まれるようにして局在する細胞であってよい。本発明において細胞は、好ましくは骨格筋芽細胞などの骨格筋組織中のCD56陽性細胞または骨髄、脂肪組織、末梢血由来の間葉系幹細胞が挙げられる。
本発明 において、「細胞の老化」とは、細胞の分裂回数にはある程度の上限があり、分裂回数が多くなるとそれ以上分裂を行わなくなることをいう。すなわち、細胞の老化とは細胞が分裂を停止し、増殖できなくなった状態が不可逆的に引き起こされることである。
したがって、細胞を増殖させる際に老化した細胞が多く含まれると、その増殖性が低下すると考えられる。
したがって、細胞を増殖させる際に老化した細胞が多く含まれると、その増殖性が低下すると考えられる。
本明細書において、「輝度」とは、細胞を観察した場合の、細胞の明るさの程度を言い、視野中の細胞質部分が、地の部分よりも明るくなることから、視野全体の輝度を測定すれば、視野中の細胞質の面積が求められる。
「反射率」とは、細胞に対して光を照射した際の、反射してくる光の強度の照射光強度に対する比率である。
これらは、フォトセルによって光強度を測定すれば定量的に検出することができる。
「反射率」とは、細胞に対して光を照射した際の、反射してくる光の強度の照射光強度に対する比率である。
これらは、フォトセルによって光強度を測定すれば定量的に検出することができる。
老化の程度が高いほど、基材に接着した際の細胞質の拡大量が多くなり、代表的な若い筋芽細胞は、基材に接着した際に接着前の200%程度にひろがるが、老化した細胞は300%程度である。
よって、老化の程度は、接着時の細胞質の広がりの程度に対応した、画像輝度、光反射率、または、画像処理によって周知の画像認識手法で、細胞質面積を検出することができる。
よって、老化の程度は、接着時の細胞質の広がりの程度に対応した、画像輝度、光反射率、または、画像処理によって周知の画像認識手法で、細胞質面積を検出することができる。
また、細胞増殖後の細胞質の広がりも、老化の程度が高いほど大きいので、基材上で増殖した後の細胞の細胞質の広がりからも、老化の程度を判定することができる。
すなわち、細胞増殖後の細胞質の広がりを、画像輝度、光反射率、または、画像処理による周知の画像認識手法で、細胞質面積を検出して老化の程度を判定することができる。
本発明の、接着時以降の面積変化を検出すること、には、細胞増殖後の細胞質面積を検出することも含まれる。
すなわち、細胞増殖後の細胞質の広がりを、画像輝度、光反射率、または、画像処理による周知の画像認識手法で、細胞質面積を検出して老化の程度を判定することができる。
本発明の、接着時以降の面積変化を検出すること、には、細胞増殖後の細胞質面積を検出することも含まれる。
さらに、上記した指標すなわち輝度、反射率または画像処理により求めた面積値の、時間変化率で老化の程度を判定することもできる。
老化した細胞(図1の1)は、図に示すように、若い細胞(図1の2)よりも細胞質がより広がるが、広がりの速さも細胞質の弾力がない分だけ速く広がるので、上記した指標の変化率から、老化の程度を判定することも可能である。
老化した細胞(図1の1)は、図に示すように、若い細胞(図1の2)よりも細胞質がより広がるが、広がりの速さも細胞質の弾力がない分だけ速く広がるので、上記した指標の変化率から、老化の程度を判定することも可能である。
輝度、反射率または画像認識した細胞質面積は、人手を介さず自動的に検出可能であるから、老化状態判定は、自動化が可能である。
老化状態の判定基準として、上記したような測定値に判断閾値を設定すれば、自動的な細胞製品品質判定システムを構築することができる。
したがって、細胞製品の出荷前検査のような場面において、製品の老化の程度の等級を、自動的に判定し細胞製品の品質分け等が効率よく行えるようになる。
したがって、細胞製品の出荷前検査のような場面において、製品の老化の程度の等級を、自動的に判定し細胞製品の品質分け等が効率よく行えるようになる。
また、この判断閾値は、システム運用時の判定結果を、実際にサンプリングして分析した実測結果によって校正することが可能であり、運用するにしたがって、判定結果の成績の蓄積が可能となり、システムの精度を高めていくことか可能となる。
1: 老化した細胞の場合
2: 若い細胞の場合
2: 若い細胞の場合
Claims (6)
- 目的細胞の老化を判定するためのシステムであって、
培養基材上の目的細胞の細胞質の面積の変化を検出する検出部、と
検出部の検出結果から細胞の老化を判定する判定部とを含む
目的細胞老化判定システム。 - 判定部が、目的細胞の培養基材への接着時以降の面積変化から老化を判定する、請求項1に記載のシステム。
- 検出部が、細胞の輝度、反射率または画像情報により細胞質の面積変化を検出する、請求項1または2に記載のシステム。
- 細胞質の面積の変化を、面積の時間変化率によって検出する、請求項1~3のいずれか一項に記載のシステム。
- 判定部が、細胞質面積変化の、老化の程度による相違を、実測した老化の程度を判定部に学習させることによって判定をおこなう、請求項1~4のずれか一項に記載のシステム。
- 目的細胞が筋芽細胞である、請求項1~5のいずれか一項に記載のシステム。
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JP2011229412A (ja) * | 2010-04-23 | 2011-11-17 | Nagoya Univ | 細胞評価装置、インキュベータ、プログラム、培養方法、手技評価装置、および、細胞評価モデル構築装置 |
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SOKOLOV IGOR, GUZ NATALI V., IYER SWAMINATHAN, HEWITT AMY, SOKOLOV NINA A., ERLICHMAN JOSEPH S., WOODWORTH CRAIG D.: "Recovery of Aging-Related Size Increase of Skin Epithelial Cells: In vivo Mouse and In vitro Human Study", PLOS ONE, vol. 10, no. 3, 25 March 2015 (2015-03-25), pages e0122774, XP055918664, DOI: 10.1371/journal.pone.0122774 * |
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