WO2022059303A1 - 蛍光ナノ粒子、および当該蛍光ナノ粒子を用いる染色方法 - Google Patents
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Classifications
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- G—PHYSICS
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
Definitions
- the present invention relates to fluorescent nanoparticles and a dyeing method using the fluorescent nanoparticles.
- Hematoxylin staining is well known as a staining method for observing tissue sections under a microscope. Hematoxylin can stain the intracellular nucleus in bluish purple, making it easier to observe the basic structure of living tissue.
- immunostaining is known as a method for specifically observing a specific substance in a tissue section.
- an antibody can be used to specifically label a specific target substance (antigen) in a tissue section, and the localization of a specific substance in a living tissue can be observed.
- fluorescent nanoparticles Phospher Integrated dot
- PID Phospher Integrated dot
- the fluorescent nanoparticles have many fluorescent dyes inside, they have high brightness and can detect the target substance with high sensitivity.
- Patent Document 1 discloses a technique relating to such fluorescent nanoparticles.
- the distribution of a specific protein in the living tissue can be obtained. Can be observed. For example, it is possible to observe how a specific protein is distributed in the nucleus of a specific cell in a living tissue.
- the present inventors in the above observation, when the tissue section is first immunostained with fluorescent nanoparticles and then the tissue section is stained with hematoxylin, the fluorescent nanoparticles are stained. It has been found that the brightness is reduced by about 29%, which may make it difficult to detect the target substance with high sensitivity.
- Hematoxylin oxidizes in the staining solution to become hematein, forms a complex with the metal in the staining solution, and is positively charged. Since the nucleic acid in the cell nucleus is negatively charged, it is electrostatically bound and stained.
- the fluorescent nanoparticles are negatively charged, and a phenomenon that the positively charged hematein complex is electrostatically adsorbed to the fluorescent nanoparticles is considered to occur. As a result, it is considered that the fluorescent nanoparticles are physically coated to block the color development and reduce the brightness of the fluorescent nanoparticles.
- the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide fluorescent nanoparticles in which a charge is shifted to the positive side from an arbitrary reference point. Another object of the present invention is to provide a dyeing method using the fluorescent nanoparticles.
- the fluorescent nanoparticles according to the embodiment of the present invention are fluorescent nanoparticles containing a fluorescent dye having a sulfo group and a resin containing the fluorescent dye having a sulfo group, and the fluorescent dye having the sulfo group.
- the following formula (1) representing the relationship with the positive charge imparting agent having a quaternary ammonium cation structure directly or indirectly bonded to the resin exceeds 0%.
- the staining method according to the embodiment of the present invention includes a step of staining cells or biological tissues using the above-mentioned fluorescent nanoparticles.
- the present invention it is possible to provide fluorescent nanoparticles whose electric charge is shifted to the positive side from an arbitrary reference point. Further, according to the present invention, it is possible to provide a method for staining cells or biological tissues using the fluorescent nanoparticles.
- the fluorescent nanoparticles according to the embodiment of the present invention are positively charged, which are directly or indirectly bound to the fluorescent dye having a sulfo group, the resin containing the fluorescent dye having the sulfo group, and the resin. Fluorescent nanoparticles containing an agent.
- the resin, the fluorescent dye, and the positive charge imparting agent will be described.
- thermoplastic resin for example, polystyrene, polyacrylonitrile, polyfran, or a similar resin can be preferably used.
- thermosetting resin for example, polyxylene, polylactic acid, glycidylmethacrylate, polymelamine, polyurea, polybenzoguanamine, polyamide, phenol resin, polysaccharide or a similar resin can be preferably used.
- Thermosetting resins especially melamine resins, suppress the elution of fluorescent dyes encapsulated in nanoparticles even by treatments such as dehydration, permeation, and encapsulation using organic solvents such as ethanol and xylene, which are performed after staining tissue sections. It is preferable in that it can be done.
- the nanoparticles are provided with a functional group for at least directly or indirectly binding a biomolecule recognition molecule to the surface.
- a functional group the same functional group as in the case of binding various biomolecules to each other can be used in the technical field to which the present invention belongs, but for example, an epoxy group and an amino group are preferable.
- the method for preparing the nanoparticles having a functional group is not particularly limited, but for example, a predetermined functional group is previously side-chained as a monomer for synthesizing a thermoplastic resin or a thermosetting resin constituting the nanoparticles.
- a predetermined functional group is previously side-chained as a monomer for synthesizing a thermoplastic resin or a thermosetting resin constituting the nanoparticles.
- the functional group possessed by the resin monomer unit constituting the thermoplastic resin is treated with a reagent to obtain the predetermined functional group.
- a method of conversion can be used.
- nanoparticles of a polystyrene-based resin having an epoxy group on the surface may be produced by copolymerizing with styrene using glycidyl methacrylate as a monomer. Further, styrene carboxylic acid or styrene sulfonic acid may be copolymerized with styrene to produce nanoparticles of a polystyrene-based resin having a carboxylic acid or sulfonic acid on the surface.
- nanoparticles of a polystyrene-based resin having an amino group on the surface may be produced by copolymerizing aminosulfonic acid with styrene.
- the epoxy group contained in the glycidyl methacrylate can also be converted into an amino group by a predetermined treatment.
- thermosetting resin for example, melamine resin nanoparticles are produced by copolymerizing using a melamine resin raw material (for example, MX035 manufactured by Sanwa Chemical Co., Ltd.) as a monomer. You may.
- a melamine resin raw material for example, MX035 manufactured by Sanwa Chemical Co., Ltd.
- the fluorescent nanoparticles according to this embodiment include a fluorescent dye.
- Fluorescent nanoparticles usually contain a plurality (many) fluorescent dyes.
- the fluorescent dye has a sulfo group.
- the fluorescent dye may be bound to the nanoparticles by physical or chemical force, and the fluorescent dye is incorporated into the nanoparticles, for example, by polymerizing the monomer in a solvent containing the fluorescent dye.
- the fluorescent dyes included in the nanoparticles or fixed to the surface of the particles are not particularly limited.
- the fluorescent dye for example, the following rhodamine-based dye molecule, BODIPY-based dye molecule, squarylium-based dye molecule, aromatic hydrocarbon-based dye molecule, coumarin-based dye, or a combination thereof can be used.
- green fluorescent dyes As a specific example of the coumarin-based dye, the following dyes that emit green fluorescence (hereinafter, appropriately referred to as green fluorescent dyes) are preferable.
- Fluorophores such as rhodamine dye molecules are preferable because they have relatively high light resistance, and among them, perylene dyes, pyrene dyes, and perylene diimides belonging to aromatic hydrocarbon dye molecules are preferable. Pyrene is preferred.
- red fluorescent dye the following dyes that emit red fluorescence (hereinafter, appropriately referred to as red fluorescent dye) are preferable.
- rhodamine-based dye molecule examples include 5-carboxy-rhodamine, 6-carboxy-rhodamine, 5,6-dicarboxy-rhodamine, rhodamine 6G, tetramethylrhodamine, X-rhodamine, Texas red, Spectrum Red, LD700 PERCHLORATE. , Derivatives thereof and the like.
- the fluorescent nanoparticles according to the present embodiment include a positive charge imparting agent in order to shift the charge to the positive side.
- the positive charge imparting agent has a quaternary ammonium cation structure.
- the positive charge-imparting agent is contained in the fluorescent nanoparticles in the form of being directly or indirectly bound to the resin of the fluorescent nanoparticles. It should be noted that shifting to the positive side does not necessarily mean that the entire fluorescent nanoparticles are positively charged, and it is sufficient that the charges of the fluorescent nanoparticles can be tilted to the positive side from an arbitrary reference point.
- the arbitrary reference point is a state in which fluorescent nanoparticles containing a negatively charged fluorescent dye do not contain a positive charge imparting agent.
- the type and amount of the positive charge-imparting agent is a positive charge having a quaternary ammonium cation structure that is directly or indirectly bonded to the fluorescent dye having a sulfo group in the fluorescent nanoparticles and the resin of the fluorescent nanoparticles.
- the following formula (1) which expresses the relationship with the imparting agent, is selected so as to exceed 0%.
- the charge of the fluorescent nanoparticles can be shifted to the positive side from an arbitrary reference point by canceling at least a part of the negative charge of the fluorescent dye in the fluorescent nanoparticles. can.
- equation (1) DFT value of O ⁇ in sulfo group in 1 molecule of fluorescent dye
- B N + in quaternary ammonium cation structure in 1 molecule of positive charge imparting agent DFT value of
- the value may exceed 0%, but from the viewpoint of further shifting the charge to the positive side, it is preferably 1% or more, and preferably exceeds 1%. It is preferably 3% or more, more preferably 5% or more, still more preferably 8% or more.
- the upper limit of the formula (1) is not particularly limited, but may be, for example, 10% or less.
- the positive charge imparting agent is positively charged in order to shift the charge of the fluorescent nanoparticles to the positive side.
- the positive charge imparting agent is preferably a compound having a quaternary ammonium cation structure.
- the type of the compound having a quaternary ammonium cation structure is not particularly limited as long as the nitrogen atom is positively charged.
- the positively charged nitrogen atom may or may not be part of the aromatic ring.
- the DFT value of the positively charged atom is preferably more than 0, preferably 0.05 or more, and preferably 0.2 or more from the viewpoint of shifting the charge of the fluorescent nanoparticles to the positive side. It is more preferably 0.3 or more, and even more preferably 0.3 or more.
- the compound having a quaternary ammonium cation structure preferably has an amino group.
- the compound having a quaternary ammonium cation structure via the amino group can be bonded to the resin of the fluorescent nanoparticles as shown below.
- the mode in which the positive charge imparting agent (R) is bound to the melamine resin is shown below.
- the compound having a quaternary ammonium cation structure is shown below.
- the numerical values shown below the compound are described above assuming that the fluorescent nanoparticles have 90,000 green fluorescent dyes or red fluorescent dyes in the number of molecules and 8,000 positive charge imparting agents in the number of molecules. It is obtained based on the equation (1) of.
- the specific calculation formula is as follows (2). The higher this value, the higher the ability of the positive charge imparting agent to cancel the negative charge of the fluorescent dye and shift the charge of the fluorescent nanoparticles to the positive side. A positive charge-imparting agent whose value does not exceed 0% cannot shift the charge of the fluorescent nanoparticles to the positive side. It was assumed that the above-mentioned green fluorescent dye or red fluorescent dye was used as the fluorescent dye.
- the DFT value of O ⁇ in the sulfo group in the red fluorescent dye is ⁇ 0.57, and since there are four of these, the total DFT value is 2.28. Further, the DFT value of O ⁇ in the sulfo group of the green fluorescent dye is ⁇ 0.59, and since this is one, the total DFT value is ⁇ 0.59.
- A DFT value of O ⁇ in sulfo group in 1 molecule of green or red fluorescent dye
- B N + DFT value in quaternary ammonium cation structure in 1 molecule of positive charge imparting agent
- Gaussian 16 (Revision B.01, M. J. Frisch, G. W. Trucks, H. B. Schlegel, G. E. Scuseria, M. A. Robb) manufactured by Gaussian, USA , J. R. Cheeseman, G. Scalmani, V. Barone, G. A. Petersson, H. Nakatsuji, X. Li, M. Caricato, A. V. Marenich, J. Bloino, B. G. Janesko, R. Gomperts, B. Mennucci, H. P. Hratchian, J. V. Ortiz, A. F. Izmaylov, J. L. Sonnenberg, D. Williams-Young, F. Ding, F.
- a stable structure was calculated by the Opt (Optimization) method from the structure such as "a mode in which a positive charge imparting agent is bound to the resin of fluorescent nanoparticles", and the charge was obtained by the ESP (Electrostatic Potential Fitting) method.
- Compound 21 Green fluorescent dye: 0.5% Red fluorescent dye: 0.1%
- the fluorescent nanoparticles according to this embodiment can be used by being added to, for example, a biomolecule recognition molecule.
- the biomolecule recognition molecule is, for example, a target substance or a molecule that specifically binds to a biomolecule bound to the target substance.
- the biomolecular recognition molecule labeled with the fluorescent nanoparticles binds to the target substance or the biomolecule bound to the target substance, the target substance is labeled by the fluorescent nanoparticles.
- the biomolecule recognition molecule is, for example, at least one selected from the group consisting of avidin, streptavidin and neutravidin.
- biomolecules and biomolecular recognition molecules that specifically bind to them include biotin-avidin, biotin-streptavidin, and biotin-neutravidin combinations.
- specifically binding can be interpreted as a general term in the technical field to which the present invention belongs, depending on such a combination, but it is a binding constant ( KA ) or its reciprocal dissociation. It can also be defined by a constant ( KD ).
- the biomolecule recognition molecule used in the present invention is preferably a biomolecule whose binding constant (KA ) with the biomolecule to be stained is in the range of 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 12 . ..
- biomolecule recognition molecule may be a target substance or an antibody that specifically binds to a biomolecule bound to the target substance.
- the average particle size of the fluorescent nanoparticles is not particularly limited, but is preferably 30 to 300 nm, more preferably 40 nm to 200 nm, from the viewpoint that bright spots can be preferably observed even with a general-purpose fluorescence microscope. If the average particle size exceeds 300 nm, the number of distinguishable bright spots per cell may decrease during observation after staining, making it difficult to observe bright spots. On the contrary, when the average particle size is less than 30 nm, the number of bright spots per cell may increase and it may be difficult to observe the bright spots.
- the average particle diameter can be taken as the average value by measuring the major axis of each particle (100 or more) shown in the image taken by the scanning electron microscope.
- the method for producing fluorescent nanoparticles according to the present invention is not particularly limited.
- the fluorescent nanoparticles according to the present invention are, for example, by the following steps: (1) mixing step, (2) polymerization step, (3) positive charge imparting agent addition step (4) cleaning step, and (5) addition step. Can be manufactured.
- the mixing step is a step of mixing the fluorescent dye as described above with one or more of the monomers or oligomers for resin formation.
- a proton feeder or a polymerization reaction accelerator can be optionally included.
- the fluorescent dye By mixing the fluorescent dye and the resin monomer in advance, the fluorescent dye can be combined with one or more of the monomers or oligomers to facilitate the incorporation of the fluorescent dye into the dye resin particles.
- thermosetting resin As a reaction accelerator for the thermoplastic resin, a known polymerization catalyst such as a metal can be used.
- an acid can be used as a reaction accelerator for the thermosetting resin. It is known that the reaction of melamine resin, urea resin, xylene resin, and phenol resin is promoted by an acid catalyst.
- the acid for example, formic acid, acetic acid, sulfuric acid, hydrochloric acid, nitric acid, p-toluenesulfonic acid, dodecylbenzenesulfonic acid and the like are known.
- the reaction of the thermosetting resin proceeds only by heating, but when a reaction accelerator is added, the reaction proceeds at a lower temperature, so that the reaction and performance can be added within a controllable range.
- fluorescent nanoparticles are obtained by thermally curing or radically polymerizing a resin monomer or oligomer that is electrically or covalently bonded to a fluorescent dye, or by thermally curing or radically polymerizing while incorporating the fluorescent dye. This is the process of forming.
- the reaction conditions (temperature, time) of the polymerization step are determined from the composition of the monomer or oligomer to be polymerized, and can be carried out according to a known method.
- the cleaning step is a step of removing impurities such as surplus resin raw materials, fluorescent dyes, and emulsifiers from the obtained dispersion of fluorescent nanoparticles.
- the resin component is centrifuged from the reaction solution, the supernatant is removed, and then ultrapure water is added and ultrasonically irradiated to disperse the resin component again for cleaning. It is preferable that the series of washing operations of centrifugation, removal of the supernatant, and redispersion in ultrapure water are repeated a plurality of times until no absorption / fluorescence derived from the resin or dye is observed in the supernatant.
- the optional addition step is a step of adding a biomolecule recognition molecule to the surface of the fluorescent nanoparticles that have completed the cleaning step (4).
- a biomolecule recognition molecule is added via the added PEG. ..
- these steps will be described.
- Amino group introduction reagents can be used to introduce amino groups into fluorescent nanoparticles by known means. Specifically, the fluorescent nanoparticles obtained in the polymerization step are dispersed in pure water, and the above-mentioned amino group-introducing reagent is reacted with this. After completion of the reaction, fluorescent nanoparticles having an amino group introduced on the surface can be obtained by centrifugation or filtration. Conditions such as the type and amount of the amino group-introducing reagent to be used, the reaction temperature and the reaction time may be appropriately prepared in consideration of the properties of the fluorescent nanoparticles and the like.
- PEGylation reagents can be used to introduce PEG into fluorescent nanoparticles by known means.
- the N-hydroxysuccinimidyl ester group of the PEGylation reagent is added by reacting with the above amino group introduced into the dye resin particles.
- a PBS containing 2 mM (molar concentration) of EDTA was added to the PEGylation reagent succinimimidyl- [(N-maleomidopulationamide) -dodecaethyleneglycol] ester (Thermoscientific's "SM (PEG) (trademark)).
- PEG can be introduced by reacting with particles adjusted to a final concentration of 10 mM and adjusted to 3 nM at room temperature for 30 minutes.
- Conditions such as the type and amount of the PEGylation reagent used, the reaction temperature and the reaction time may be appropriately adjusted in consideration of the properties of the fluorescent nanoparticles and the like.
- the biomolecule recognition molecule can be added to the fluorescent nanoparticles by reacting and binding the maleimide group of PEG added to the fluorescent nanoparticles and the thiol group added to the biomolecule recognition molecule.
- streptavidin is subjected to thiol group addition treatment using 2-Iminothiolane or SATA, and an excess reaction reagent is removed by a gel filtration column to obtain a streptavidin solution capable of binding to fluorescent nanoparticles.
- the PEG-added fluorescent nanoparticles obtained above and streptavidin can be mixed in PBS containing 2 mM of EDTA and reacted for 1 hour to bind the fluorescent nanoparticles and streptavidin.
- Conditions such as the type and amount of the biomolecule recognition molecule to be used, the reaction temperature, and the reaction time may be appropriately adjusted in consideration of the properties of the fluorescent nanoparticles and the use of the fluorescent nanoparticles.
- the staining method according to the embodiment of the present invention includes a step of staining cells or biological tissues using the fluorescent nanoparticles according to the embodiment of the present invention.
- the staining method according to the embodiment of the present invention may further include a step of staining cells or living tissue with hematoxylin.
- the above-mentioned immunostaining step and the step of staining with hematoxylin may be performed by a known method. Specifically, when the tissue section is stained, for example, it may be performed as follows.
- tissue sections immunostained as described above are stained with Meyer's hematoxylin solution for 5 minutes to perform hematoxylin staining. Further, staining with eosin may be performed.
- tissue sections that have completed the immunostaining step and the morphological observation staining step are immersed in pure ethanol for 5 minutes four times to be washed and dehydrated. Subsequently, the operation of immersing in xylene for 5 minutes is performed four times to perform transparency. Finally, a tissue section is encapsulated with an encapsulant (Merck's "Enteran New").
- the tissue section after the immobilization treatment step is irradiated with a predetermined excitation light corresponding to the fluorescent dye to emit fluorescence.
- the tissue section in that state is observed and imaged with a fluorescence microscope (“BX-53” manufactured by Olympus Corporation) and a digital camera for a microscope (“DP73” manufactured by Olympus Corporation).
- the excitation light is set to 575 to 600 nm by passing it through an optical filter. Further, the range of the wavelength (nm) of the fluorescence to be observed is also set to 612 to 692 nm by passing through an optical filter.
- the conditions of the excitation wavelength at the time of microscopic observation and image acquisition are such that the irradiation energy near the center of the visual field is 900 W / cm 2 when excited at 580 nm.
- the exposure time at the time of image acquisition is arbitrarily set (for example, set to 4000 ⁇ sec) so that the brightness of the image is not saturated, and the image is taken.
- the present embodiment it is possible to provide fluorescent nanoparticles shifted to the positive side. Therefore, it is possible to provide fluorescent nanoparticles whose brightness does not easily decrease even by hematoxylin staining.
- A DFT value of O ⁇ in sulfo group in 1 molecule of green fluorescent dye or red firefly dye
- B N + DFT value in quaternary ammonium cation structure in 1 molecule of positive charge imparting agent
- Positive charge imparting agent 1 1-Propanaminium, 3-amino-N, N, N-triethyl-, chloride
- Positive charge imparting agent 2 Ethanaminium, 2-hydrazinyl-N, N, N-trimethyl-2-oxo-, chloride
- Positive charge imparting agent 3 1-Decanaminium, 10-amino-N, N, N-trimethyl-, bromide
- Positive charge imparting agent 4 1-Propanaminium, 3-amino-N, N, N-triethyl-, chloride
- Positive charge imparting agent 5 1-Pentanaminium, 5-amino-N, N, N-trimethyl-, hydroxide
- Positive charge imparting agent 6 Methanaminium, 1- (4-amino-1-oxobutoxy) -
- the positive charge-imparting agents 1 to 7 are all compounds having a quaternary ammonium cation structure, but the DFT values of the positively charged nitrogen atoms (N + ) are different. Specifically, the N + DFT value of the positive charge imparting agents 1 to 6 exceeds 0 and has the ability to cancel the negative charge of the fluorescent dye, whereas the positive charge imparting agent 7 has the ability to cancel the negative charge. There was no.
- fluorescent nanoparticles having a more appropriate charge can be provided, which is useful for various immunostaining. It is particularly useful for fluorescent immunostaining performed with hematoxylin staining.
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Abstract
本発明は、蛍光ナノ粒子の電荷を任意の基準点から正側にシフトさせた蛍光ナノ粒子を提供することに関する。スルホ基を有する蛍光色素と、前記スルホ基を有する蛍光色素を内包した樹脂とを含む蛍光ナノ粒子であって、前記スルホ基を有する蛍光色素と、前記樹脂に直接的または間接的に結合している、第4級アンモニウムカチオン構造を有する正電荷付与剤との関係を表す下記の式(1)が0%を超える、蛍光ナノ粒子。 式(1)において、A:1分子の蛍光色素内において、スルホ基におけるO-のDFT値B:1分子の正電荷付与剤内にいて、第4級アンモニウムカチオン構造におけるN+のDFT値
Description
本発明は、蛍光ナノ粒子、および当該蛍光ナノ粒子を用いる染色方法に関する。
顕微鏡下で組織切片を観察するための染色法としてヘマトキシリン染色がよく知られている。ヘマトキシリンは細胞内の核を青紫色に染色し、生体組織の基本構造を観察しやすくすることができる。
一方、組織切片内の特定の物質を特異的に観察する方法として免疫染色が知られている。免疫染色では、抗体を用いて組織切片中の特定の標的物質(抗原)を特異的に標識し、生体組織内の特定の物質の局在などを観察することができる。
また、上記のような免疫染色に用いることができる標識物質として蛍光ナノ粒子(PID:Phospher Integrated dot)が知られている。蛍光ナノ粒子は、その内部において多くの蛍光色素を有するため輝度が高く、高感度に標的物質を検出することができる。たとえば、特許文献1はこのような蛍光ナノ粒子に関する技術を開示している。
上記のようなヘマトキシリンを用いて組織切片内の生体組織の基本構造を観察する方法と、上記のような蛍光ナノ粒子を用いる免疫染色とを組み合わせると、生体組織中における特定のタンパク質の分布などを観察することができる。例えば生体組織中の特定の細胞の核において特定のタンパク質がどのように分布しているかを観察することができる。
しかしながら、本発明者らが検討したところ、上記のような観察において、先ず、蛍光ナノ粒子を用いて組織切片を免疫染色し、次に、ヘマトキシリンを用いて組織切片を染色すると、蛍光ナノ粒子の輝度が約29%低下し、標的物質を高感度に検出することが困難になる場合があることを見いだした。
本発明者らは鋭意検討し、その理由を次のように考えた。ヘマトキシリンは染色液中で酸化しヘマテインとなり染色液中の金属と錯体を形成し正に帯電する。そして細胞核中の核酸は負に帯電しているため静電的に結合し染色が行われる。
一方、蛍光ナノ粒子は負に帯電していると考えられ、正に帯電したヘマテインの錯体が蛍光ナノ粒子にも静電的に吸着する現象が発生すると考えられる。これにより蛍光ナノ粒子が物理的に被覆されることで発色が遮られ蛍光ナノ粒子の輝度が下がると考えられる。
このように免疫染色をする際には静電的な力が関係するため、蛍光ナノ粒子の電荷は重要である。本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、電荷を任意の基準点から正側にシフトさせた蛍光ナノ粒子を提供することを目的とする。また、本発明は、当該蛍光ナノ粒子を用いた染色方法を提供することを目的とする。
本発明の一実施形態に係る蛍光ナノ粒子は、スルホ基を有する蛍光色素と、前記スルホ基を有する蛍光色素を内包した樹脂とを含む蛍光ナノ粒子であって、前記スルホ基を有する蛍光色素と、前記樹脂に直接的または間接的に結合している、第4級アンモニウムカチオン構造を有する正電荷付与剤との関係を表す下記の式(1)が0%を超える。
また、本発明の一実施形態に係る染色方法は、上記の蛍光ナノ粒子を用いて細胞または生体組織を染色する工程を有する。
本発明によれば、その電荷を任意の基準点から正側にシフトさせた蛍光ナノ粒子を提供することができる。また、本発明によれば、当該蛍光ナノ粒子を用いて細胞または生体組織を染色する方法を提供することができる。
[蛍光ナノ粒子]
本発明の実施の形態に係る蛍光ナノ粒子は、スルホ基を有する蛍光色素と、前記スルホ基を有する蛍光色素を内包した樹脂と、前記樹脂に直接的または間接的に結合している正電荷付与剤とを含む蛍光ナノ粒子である。以下、樹脂、蛍光色素、正電荷付与剤について説明する。
本発明の実施の形態に係る蛍光ナノ粒子は、スルホ基を有する蛍光色素と、前記スルホ基を有する蛍光色素を内包した樹脂と、前記樹脂に直接的または間接的に結合している正電荷付与剤とを含む蛍光ナノ粒子である。以下、樹脂、蛍光色素、正電荷付与剤について説明する。
(樹脂)
樹脂はナノ粒子を形成する母体である。ナノ粒子を構成する樹脂として、次のような熱可塑性樹脂または熱硬化性樹脂を用いることができる。熱可塑性樹脂としては、例えば、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリフラン、または、これに類する樹脂を好適に用いることができる。熱硬化性樹脂としては、例えば、ポリキシレン、ポリ乳酸、グリシジルメタクリレート、ポリメラミン、ポリウレア、ポリベンゾグアナミン、ポリアミド、フェノール樹脂、多糖類またはこれに類する樹脂を好適に用いることができる。熱硬化性樹脂、特にメラミン樹脂は、組織切片の染色後に行われる、エタノールやキシレンなどの有機溶媒を用いる脱水、透徹、封入などの処理によっても、ナノ粒子に内包させた蛍光色素の溶出を抑制できる点で好ましい。
樹脂はナノ粒子を形成する母体である。ナノ粒子を構成する樹脂として、次のような熱可塑性樹脂または熱硬化性樹脂を用いることができる。熱可塑性樹脂としては、例えば、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリフラン、または、これに類する樹脂を好適に用いることができる。熱硬化性樹脂としては、例えば、ポリキシレン、ポリ乳酸、グリシジルメタクリレート、ポリメラミン、ポリウレア、ポリベンゾグアナミン、ポリアミド、フェノール樹脂、多糖類またはこれに類する樹脂を好適に用いることができる。熱硬化性樹脂、特にメラミン樹脂は、組織切片の染色後に行われる、エタノールやキシレンなどの有機溶媒を用いる脱水、透徹、封入などの処理によっても、ナノ粒子に内包させた蛍光色素の溶出を抑制できる点で好ましい。
ナノ粒子は、表面に少なくとも直接的または間接的に生体分子認識分子を結合させるための官能基を備えることが好ましい。このような官能基としては、本発明の属する技術分野において様々な生体分子同士を結合させる場合と同様の官能基を利用することができるが、例えば、エポキシ基およびアミノ基が好ましい。
官能基を有するナノ粒子の調製方法は特に限定されるものではないが、例えば、ナノ粒子を構成する熱可塑性樹脂または熱硬化性樹脂を合成するためのモノマーとして、所定の官能基をあらかじめ側鎖に有する(コ)モノマーを(共)重合させるか、熱可塑性樹脂または熱硬化性樹脂の合成後に、それを構成している樹脂モノマー単位が有する官能基を試薬処理して前記所定の官能基に変換する方法を用いることができる。
熱可塑性の樹脂を用いてナノ粒子を製造する場合、例えば、スチレンと共にグリシジルメタクリレートをモノマーとして用いて共重合させることにより、表面にエポキシ基を有するポリスチレン系樹脂のナノ粒子を製造してもよい。また、スチレンとともにスチレンカルボン酸またはスチレンスルホン酸を共重合させて、表面にカルボン酸またはスルホン酸を有するポリスチレン系樹脂のナノ粒子を製造してもよい。また、スチレンと共にアミノスルホン酸を共重合させて表面にアミノ基を有するポリスチレン系樹脂のナノ粒子を製造してもよい。なお、前記グリシジルメタクリレートが有するエポキシ基は、所定の処理によりアミノ基に変換することもできる。
一方、熱硬化性の樹脂を用いてナノ粒子を製造する場合、例えば、メラミン樹脂原料(例えば三和ケミカル社製MX035)をモノマーとして用いて共重合させることにより、メラミン系樹脂のナノ粒子を製造してもよい。
(蛍光色素)
本実施の形態に係る蛍光ナノ粒子は、蛍光色素を含む。蛍光ナノ粒子は、通常、複数(多数)の蛍光色素を含む。蛍光色素はスルホ基を有する。
本実施の形態に係る蛍光ナノ粒子は、蛍光色素を含む。蛍光ナノ粒子は、通常、複数(多数)の蛍光色素を含む。蛍光色素はスルホ基を有する。
蛍光色素は、ナノ粒子に物理的または化学的な力で結合されていればよく、蛍光色素は例えば、蛍光色素を含む溶媒中でモノマーを重合させることでナノ粒子に取り込まれる。
上記樹脂を構成するモノマーを重合して蛍光色素を取り込みつつナノ粒子を形成する際に、ナノ粒子に内包または粒子の表面に固定させる蛍光色素は特に制限されない。蛍光色素としては、例えば、以下のローダミン系色素分子、BODIPY系色素分子、スクアリリウム系色素分子、芳香族炭化水素系色素分子、クマリン系色素または、これらの組合せを用いることができる。
クマリン系色素の具体例としては、緑色の蛍光を発する以下に示す色素(以下、適宜、緑色蛍光色素という)が好ましい。
ローダミン系色素分子などの蛍光色素は、比較的耐光性が高いため好ましく、なかでも芳香族炭化水素系色素分子に属するペリレン(perylene)系色素やピレン(Pyrene)系色素、ペリレンジイミド(perylene diimide)系色素が好ましい。
ペリレン系蛍光色素の具体例としては、赤色の蛍光を発する以下に示す色素(以下、適宜、赤色蛍光色素という)が好ましい。
ローダミン系色素分子の具体例としては、5-カルボキシ-ローダミン、6-カルボキシ-ローダミン、5,6-ジカルボキシ-ローダミン、ローダミン 6G、テトラメチルローダミン、X-ローダミン、テキサスレッド、Spectrum Red、LD700 PERCHLORATE、それらの誘導体などが挙げられる。
(正電荷付与剤および蛍光ナノ粒子の電荷)
本実施の形態に係る蛍光ナノ粒子は、その電荷を正側にシフトさせるために正電荷付与剤を含む。正電荷付与剤は第4級アンモニウムカチオン構造を有する。正電荷付与剤は蛍光ナノ粒子の樹脂に直接的または間接的に結合する形で蛍光ナノ粒子中に含まれている。なお、正側にシフトさせるとは、蛍光ナノ粒子の全体が正に帯電するということが必ずしも必要というわけではなく、任意の基準点から蛍光ナノ粒子の電荷を正側に傾けることができればよい。ここで任意の基準点とは、負に帯電した蛍光色素を含む蛍光ナノ粒子において、正電荷付与剤を含んでいない状態である。
本実施の形態に係る蛍光ナノ粒子は、その電荷を正側にシフトさせるために正電荷付与剤を含む。正電荷付与剤は第4級アンモニウムカチオン構造を有する。正電荷付与剤は蛍光ナノ粒子の樹脂に直接的または間接的に結合する形で蛍光ナノ粒子中に含まれている。なお、正側にシフトさせるとは、蛍光ナノ粒子の全体が正に帯電するということが必ずしも必要というわけではなく、任意の基準点から蛍光ナノ粒子の電荷を正側に傾けることができればよい。ここで任意の基準点とは、負に帯電した蛍光色素を含む蛍光ナノ粒子において、正電荷付与剤を含んでいない状態である。
正電荷付与剤の種類および量は、蛍光ナノ粒子中のスルホ基を有する蛍光色素と、蛍光ナノ粒子の樹脂に直接的または間接的に結合している、第4級アンモニウムカチオン構造を有する正電荷付与剤との関係を表す下記の式(1)が0%を超えるように選択される。下記の式(1)が0%を超える場合、蛍光ナノ粒子中の蛍光色素の負電荷の少なくとも一部を打ち消すようにして蛍光ナノ粒子の電荷を任意の基準点から正側にシフトさせることができる。
上記のように式(1)において、その値は0%を超えていればよいが、さらに電荷を正側にシフトさせるという観点から、1%以上であることが好ましく、1%を超えることが好ましく、3%以上であることがさらに好ましく、5%以上であることがさらに好ましく、8%以上であることがさらに好ましい。式(1)の上限は特に制限されないものの、例えば10%以下とすることができる。
正電荷付与剤は、蛍光ナノ粒子の電荷を正側にシフトさせるために正に帯電している。具体的には正電荷付与剤は第4級アンモニウムカチオン構造を有する化合物であることが好ましい。第4級アンモニウムカチオン構造を有する化合物の種類は、窒素原子が正に帯電していれば特に制限されない。正に帯電する窒素原子は、芳香族環の一部であってもよいし、芳香族環の一部でなくてもよい。正に帯電した原子のDFT値は、蛍光ナノ粒子の電荷を正側にシフトさせるという観点から、0を超えることが好ましく、0.05以上であることが好ましく、0.2以上であることがさらに好ましく、0.3以上であることがさらに好ましい。
また、第4級アンモニウムカチオン構造を有する化合物はアミノ基を有することが好ましい。当該アミノ基を介して第4級アンモニウムカチオン構造を有する化合物は、蛍光ナノ粒子の樹脂に以下に示すように結合することができる。以下にメラミン樹脂に正電荷付与剤(R)が結合する態様を示す。
第4級アンモニウムカチオン構造を有する化合物の具体例を以下に示す。なお、化合物の下に示す数値は、蛍光ナノ粒子中に分子数にして90000個の緑色蛍光色素または赤色蛍光色素があり、分子数にして8000個の正電荷付与剤があると仮定して上記の式(1)に基づいて求めたものである。具体的な計算式は、以下の式(2)のようになる。この数値が高いほど、正電荷付与剤は蛍光色素の負電荷を打ち消して蛍光ナノ粒子の電荷を正側にシフトさせる能力が高いことを示す。この数値が0%を超えない正電荷付与剤は、蛍光ナノ粒子の電荷を正側にシフトさせることができない。なお、蛍光色素としては上記の緑色蛍光色素または赤色蛍光色素を用いたと仮定した。また、赤色蛍光色素内スルホ基におけるO-のDFT値は-0.57であり、これが4つあるのでDFT値の合計は2.28である。また、緑色蛍光色素のスルホ基におけるO-のDFT値は-0.59であり、これが1つであるのでDFT値の合計は-0.59である。
なお、DFT値の算出には、米国Gaussian社製のGaussian16(Revision B.01,M. J. Frisch, G. W. Trucks, H. B. Schlegel, G. E. Scuseria, M. A. Robb, J. R. Cheeseman, G. Scalmani, V. Barone, G. A. Petersson, H. Nakatsuji, X. Li, M. Caricato, A. V. Marenich, J. Bloino, B. G. Janesko, R. Gomperts, B. Mennucci, H. P. Hratchian, J. V. Ortiz, A. F. Izmaylov, J. L. Sonnenberg, D. Williams-Young, F. Ding, F. Lipparini, F. Egidi, J. Goings, B. Peng, A. Petrone, T. Henderson, D. Ranasinghe, V. G. Zakrzewski, J. Gao, N. Rega, G. Zheng, W. Liang, M. Hada, M. Ehara, K. Toyota, R. Fukuda, J. Hasegawa, M. Ishida, T. Nakajima, Y. Honda, O. Kitao, H. Nakai, T. Vreven, K. Throssell, J. A. Montgomery, Jr., J. E. Peralta, F. Ogliaro, M. J. Bearpark, J. J. Heyd, E. N. Brothers, K. N. Kudin, V. N. Staroverov, T. A. Keith, R. Kobayashi, J. Normand, K. Raghavachari, A. P. Rendell, J. C. Burant, S. S. Iyengar, J. Tomasi, M. Cossi, J. M. Millam, M. Klene, C. Adamo, R. Cammi, J. W. Ochterski, R. L. Martin, K. Morokuma, O. Farkas, J. B. Foresman, and D. J. Fox, Gaussian, Inc., Wallingford CT, 2016.)ソフトウェアを用い、計算手法として密度汎関数法(B3LYP/6-31G(d、p))を用いた。上記の「蛍光ナノ粒子の樹脂に正電荷付与剤が結合する態様」のような構造からOpt (Optimization)法によって安定構造を計算し、ESP (Electrostatic Potential Fitting)法によってその電荷を求めた。
(生体分子認識分子)
本実施の形態に係る蛍光ナノ粒子は、例えば生体分子認識分子に付加されて使用されうる。
本実施の形態に係る蛍光ナノ粒子は、例えば生体分子認識分子に付加されて使用されうる。
生体分子認識分子は、例えば、標的物質、または標的物質に結合した生体分子に特異的に結合する分子である。蛍光ナノ粒子で標識されている生体分子認識分子が標的物質、または標的物質に結合した生体分子に結合することで、標的物質が蛍光ナノ粒子によって標識されることになる。
生体分子認識分子は、例えば、アビジン、ストレプトアビジンおよびニュートラアビジンからなる群より選ばれる少なくとも1種である。
生体分子およびそれに特異的に結合する生体分子認識分子の組み合わせの例には、ビオチン-アビジン、ビオチン-ストレプトアビジン、ビオチン-ニュートラアビジンの組み合わせが含まれる。なお、特異的に結合するとは、このような組み合わせに応じて、本発明の属する技術分野における一般的な用語として解釈することが可能であるが、結合定数(KA)またはその逆数である解離定数(KD)によって定義することも可能である。
すなわち、本発明で用いられる生体分子認識分子は、染色対象となる生体分子との間の結合定数(KA)が1×105~1×1012の範囲にある生体分子とすることが好ましい。
また、生体分子認識分子は、標的物質、または標的物質に結合した生体分子に特異的に結合する抗体であってもよい。
(平均粒子径)
蛍光ナノ粒子の平均粒子径は、特に限定されないが、汎用の蛍光顕微鏡でも好適に輝点の観察が可能となる観点から、好ましくは30~300nmであり、より好ましくは40nm~200nmである。平均粒子径が300nmを超える場合、染色後の観察の際に細胞1個当たりの区別しうる輝点数が減って輝点観察がしにくくなるおそれがある。逆に平均粒子径が30nm未満の場合、細胞1個当たりの輝点数が増えて輝点観察がしにくくなるおそれがある。なお、平均粒子径は走査型電子顕微鏡で撮影した画像に写っている各粒子(100個以上)の長径を測定し、その平均値とすることができる。
蛍光ナノ粒子の平均粒子径は、特に限定されないが、汎用の蛍光顕微鏡でも好適に輝点の観察が可能となる観点から、好ましくは30~300nmであり、より好ましくは40nm~200nmである。平均粒子径が300nmを超える場合、染色後の観察の際に細胞1個当たりの区別しうる輝点数が減って輝点観察がしにくくなるおそれがある。逆に平均粒子径が30nm未満の場合、細胞1個当たりの輝点数が増えて輝点観察がしにくくなるおそれがある。なお、平均粒子径は走査型電子顕微鏡で撮影した画像に写っている各粒子(100個以上)の長径を測定し、その平均値とすることができる。
[蛍光ナノ粒子の製造方法]
本発明に係る蛍光ナノ粒子の製造方法は、特に限定されない。本発明に係る蛍光ナノ粒子は、例えば、以下の各工程:(1)混合工程、(2)重合工程、(3)正電荷付与剤付加工程(4)洗浄工程、および(5)付加工程により製造されうる。
本発明に係る蛍光ナノ粒子の製造方法は、特に限定されない。本発明に係る蛍光ナノ粒子は、例えば、以下の各工程:(1)混合工程、(2)重合工程、(3)正電荷付与剤付加工程(4)洗浄工程、および(5)付加工程により製造されうる。
(1)原料調製・混合工程
混合工程は、前述したような蛍光色素と、樹脂形成用のモノマーまたはオリゴマーの1種または2種以上とを混合する工程である。この混合させる物として、任意にプロトン供給剤や重合反応促進剤を含めることができる。
混合工程は、前述したような蛍光色素と、樹脂形成用のモノマーまたはオリゴマーの1種または2種以上とを混合する工程である。この混合させる物として、任意にプロトン供給剤や重合反応促進剤を含めることができる。
蛍光色素と樹脂モノマーとを事前に混合させることで、蛍光色素とモノマーまたはオリゴマーの1種または2種以上と結合させて、色素樹脂粒子内に蛍光色素を取り込みやすくすることができる。
熱可塑性樹脂の反応促進剤として、例えば金属等の公知の重合触媒を用いる事ができる。一方、熱硬化性樹脂の反応促進剤として、例えば酸を用いる事ができる。メラミン樹脂や尿素樹脂、キシレン樹脂、フェノール樹脂は、いずれも酸触媒により反応が促進される事が知られている。酸としては、例えば、ギ酸、酢酸、硫酸、塩酸、硝酸、パラトルエンスルホン酸、ドデシルベンゼンスルホン酸、等が知られている。熱硬化性樹脂の反応は加温のみでも進行するが、反応促進剤を加えるとより低温で進行するので、反応や性能を制御できる範囲で添加することができる。
(2)重合工程
重合工程は、蛍光色素と電気的結合もしくは共有結合した樹脂モノマーまたはオリゴマーを熱硬化やラジカル重合させるか、蛍光色素を取り込みながら熱硬化やラジカル重合させることにより、蛍光ナノ粒子を形成する工程である。重合工程の反応条件(温度、時間)は、重合させるモノマーまたはオリゴマーの組成から決定され、公知の方法に則して行うことができる。
重合工程は、蛍光色素と電気的結合もしくは共有結合した樹脂モノマーまたはオリゴマーを熱硬化やラジカル重合させるか、蛍光色素を取り込みながら熱硬化やラジカル重合させることにより、蛍光ナノ粒子を形成する工程である。重合工程の反応条件(温度、時間)は、重合させるモノマーまたはオリゴマーの組成から決定され、公知の方法に則して行うことができる。
(3)正電荷付与剤付加工程
正電荷付加工程では、正電荷付与剤を含む溶液中に、得られた蛍光ナノ粒子を分散させる。これにより蛍光ナノ粒子の樹脂に正電荷付与剤を付加させることができる。
正電荷付加工程では、正電荷付与剤を含む溶液中に、得られた蛍光ナノ粒子を分散させる。これにより蛍光ナノ粒子の樹脂に正電荷付与剤を付加させることができる。
(4)洗浄工程
洗浄工程は、得られた蛍光ナノ粒子の分散液から、余剰の樹脂原料や蛍光色素、乳化剤等の不純物を除く工程である。例えば、反応液から樹脂成分を遠心分離し、上澄み除去後、超純水を加えて超音波照射して再度分散させることで洗浄を行う。遠心分離、上澄み除去、超純水への再分散の一連の洗浄操作は、上澄みに樹脂や色素に由来する吸光・蛍光が見られなくなるまで、複数回繰り返し行うことが好ましい。
洗浄工程は、得られた蛍光ナノ粒子の分散液から、余剰の樹脂原料や蛍光色素、乳化剤等の不純物を除く工程である。例えば、反応液から樹脂成分を遠心分離し、上澄み除去後、超純水を加えて超音波照射して再度分散させることで洗浄を行う。遠心分離、上澄み除去、超純水への再分散の一連の洗浄操作は、上澄みに樹脂や色素に由来する吸光・蛍光が見られなくなるまで、複数回繰り返し行うことが好ましい。
(5)付加工程
任意に行われる付加工程は、洗浄工程(4)を終えた蛍光ナノ粒子の表面に対して生体分子認識分子を付加させる工程である。具体的な手順の一例としては、蛍光ナノ粒子の表面にアミノ基を導入し、導入されたアミノ基を介してPEGを付加し、次に付加されたPEGを介して生体分子認識分子を付加させる。以下、これらの工程について説明する。
任意に行われる付加工程は、洗浄工程(4)を終えた蛍光ナノ粒子の表面に対して生体分子認識分子を付加させる工程である。具体的な手順の一例としては、蛍光ナノ粒子の表面にアミノ基を導入し、導入されたアミノ基を介してPEGを付加し、次に付加されたPEGを介して生体分子認識分子を付加させる。以下、これらの工程について説明する。
(アミノ基導入)
アミノ基導入試薬を用いて、公知の手段により蛍光ナノ粒子にアミノ基を導入することができる。具体的には、重合工程で得られた蛍光ナノ粒子を純水中に分散させ、これに前述したアミノ基導入試薬を反応させる。反応終了後、遠心分離又はろ過により表面にアミノ基が導入された蛍光ナノ粒子を得ることができる。使用するアミノ基導入試薬の種類や添加量、反応温度および反応時間等の条件は、蛍光ナノ粒子の性状などを考慮しながら、適宜調製すればよい。
アミノ基導入試薬を用いて、公知の手段により蛍光ナノ粒子にアミノ基を導入することができる。具体的には、重合工程で得られた蛍光ナノ粒子を純水中に分散させ、これに前述したアミノ基導入試薬を反応させる。反応終了後、遠心分離又はろ過により表面にアミノ基が導入された蛍光ナノ粒子を得ることができる。使用するアミノ基導入試薬の種類や添加量、反応温度および反応時間等の条件は、蛍光ナノ粒子の性状などを考慮しながら、適宜調製すればよい。
(PEG付加)
PEG化試薬を用いて、公知の手段により蛍光ナノ粒子にPEGを導入することができる。例えば、PEG化試薬のN-ヒドロキシスクシンイミジルエステル基を色素樹脂粒子に導入した上記アミノ基と反応させて付加する。具体的には、PEG化試薬のsuccinimidyl-[(N-maleomidopropionamid)-dodecaethyleneglycol]ester(サーモサイエンティフィック社製「SM(PEG)(商標))を、EDTAを2mM(モル濃度)含有したPBSに最終濃度10mMとなるよう調整、3nMに調整した粒子と室温で30分反応させることで、PEGを導入することができる。
PEG化試薬を用いて、公知の手段により蛍光ナノ粒子にPEGを導入することができる。例えば、PEG化試薬のN-ヒドロキシスクシンイミジルエステル基を色素樹脂粒子に導入した上記アミノ基と反応させて付加する。具体的には、PEG化試薬のsuccinimidyl-[(N-maleomidopropionamid)-dodecaethyleneglycol]ester(サーモサイエンティフィック社製「SM(PEG)(商標))を、EDTAを2mM(モル濃度)含有したPBSに最終濃度10mMとなるよう調整、3nMに調整した粒子と室温で30分反応させることで、PEGを導入することができる。
使用するPEG化試薬の種類や添加量、反応温度および反応時間等の条件は、蛍光ナノ粒子の性状などを考慮しながら、適宜調整すればよい。
(生体分子認識分子の付加)
蛍光ナノ粒子に付加したPEGのマレイミド基と生体分子認識分子に付加したチオール基とを反応して結合させることで生体分子認識分子を蛍光ナノ粒子に付加させることができる。具体例としては、ストレプトアビジンを、2-IminothiolaneやSATAを用いてチオール基付加処理を行い、ゲルろ過カラムにより過剰の反応試薬を除去することにより蛍光ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジン溶液を得る。上記で得られたPEGを付加した蛍光ナノ粒子とストレプトアビジンとを、EDTAを2mM含有したPBS中で混合し、1時間反応させることで蛍光ナノ粒子とストレプトアビジンとを結合させることができる。
蛍光ナノ粒子に付加したPEGのマレイミド基と生体分子認識分子に付加したチオール基とを反応して結合させることで生体分子認識分子を蛍光ナノ粒子に付加させることができる。具体例としては、ストレプトアビジンを、2-IminothiolaneやSATAを用いてチオール基付加処理を行い、ゲルろ過カラムにより過剰の反応試薬を除去することにより蛍光ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジン溶液を得る。上記で得られたPEGを付加した蛍光ナノ粒子とストレプトアビジンとを、EDTAを2mM含有したPBS中で混合し、1時間反応させることで蛍光ナノ粒子とストレプトアビジンとを結合させることができる。
使用する生体分子認識分子の種類や添加量、反応温度および反応時間等の条件は、蛍光ナノ粒子の性状や蛍光ナノ粒子の用途などを考慮しながら、適宜調整すればよい。
[細胞染色方法]
本発明の実施の形態に係る染色方法は、本発明の実施の形態に係る蛍光ナノ粒子を用いて細胞または生体組織を染色する工程を有する。また、本発明の実施の形態に係る染色方法は、ヘマトキシリンを用いて細胞または生体組織を染色する工程をさらに有してもよい。
本発明の実施の形態に係る染色方法は、本発明の実施の形態に係る蛍光ナノ粒子を用いて細胞または生体組織を染色する工程を有する。また、本発明の実施の形態に係る染色方法は、ヘマトキシリンを用いて細胞または生体組織を染色する工程をさらに有してもよい。
上記の免疫染色する工程およびヘマトキシリンを用いて染色する工程は、公知の方法で行われればよい。具体的には、組織切片を染色する場合は、例えば以下のように行われればよい。
《蛍光免疫染色法》
(1)脱パラフィン処理工程
染色したい組織のパラフィン切片が載置されたスライドを用意し、脱パラフィン処理を行う。
(1)脱パラフィン処理工程
染色したい組織のパラフィン切片が載置されたスライドを用意し、脱パラフィン処理を行う。
(2)賦活化処理工程
脱パラフィン処理をされた組織切片中の有機溶媒を水に置換する。置換後、スライドをクエン酸緩衝液中(pH6.0)中で121℃、15分間オートクレーブ処理することで、組織切片中の抗原の賦活化処理を行う。賦活化処理後のスライドをPBSにより洗浄し、洗浄した組織切片に対してBSAを1%含有するPBSを用いて1時間ブロッキング処理を行う。
脱パラフィン処理をされた組織切片中の有機溶媒を水に置換する。置換後、スライドをクエン酸緩衝液中(pH6.0)中で121℃、15分間オートクレーブ処理することで、組織切片中の抗原の賦活化処理を行う。賦活化処理後のスライドをPBSにより洗浄し、洗浄した組織切片に対してBSAを1%含有するPBSを用いて1時間ブロッキング処理を行う。
(3)免疫染色処理工程
(3-1)1次反応
BSAを1%含有するPBSに1次抗体を溶解させ、当該溶液を上述のブロッキング処理した組織切片に対して4℃で1晩反応させる。
(3-2)2次反応
1次反応を行った組織切片をPBSで洗浄した後、1%BSA含有のPBSで6μg/mLに希釈したビオチン化2次抗体と室温30分間反応させる。
(3-3)蛍光ナノ粒子による標識
2次反応を行った組織切片に対して、1%BSA含有のPBSで希釈した前述の本発明の実施の形態に係る、ストレプトアビジンが付加された蛍光ナノ粒子を、中性のpH環境(pH6.9~7.4)、室温の条件下で3時間反応させる。該反応後の組織切片をPBSで洗浄する。
(3-1)1次反応
BSAを1%含有するPBSに1次抗体を溶解させ、当該溶液を上述のブロッキング処理した組織切片に対して4℃で1晩反応させる。
(3-2)2次反応
1次反応を行った組織切片をPBSで洗浄した後、1%BSA含有のPBSで6μg/mLに希釈したビオチン化2次抗体と室温30分間反応させる。
(3-3)蛍光ナノ粒子による標識
2次反応を行った組織切片に対して、1%BSA含有のPBSで希釈した前述の本発明の実施の形態に係る、ストレプトアビジンが付加された蛍光ナノ粒子を、中性のpH環境(pH6.9~7.4)、室温の条件下で3時間反応させる。該反応後の組織切片をPBSで洗浄する。
(4)形態観察染色工程
上記のように免疫染色した組織切片をマイヤーのヘマトキシリン液で5分間染色してヘマトキシリン染色を行う。なお、さらにエオジンで染色を行ってもよい。
上記のように免疫染色した組織切片をマイヤーのヘマトキシリン液で5分間染色してヘマトキシリン染色を行う。なお、さらにエオジンで染色を行ってもよい。
(5)固定化処理工程
免疫染色工程および形態観察染色工程を終えた組織切片に対して、純エタノールに5分間浸漬する操作を4回行い、洗浄および脱水を行う。続いて、キシレンに5分間浸漬する操作を4回行い、透徹を行う。最後に、封入剤(メルク社製「エンテランニュー」)を用いて、組織切片を封入する。
免疫染色工程および形態観察染色工程を終えた組織切片に対して、純エタノールに5分間浸漬する操作を4回行い、洗浄および脱水を行う。続いて、キシレンに5分間浸漬する操作を4回行い、透徹を行う。最後に、封入剤(メルク社製「エンテランニュー」)を用いて、組織切片を封入する。
(6)観察・計測工程
固定化処理工程を終えた組織切片に対して蛍光色素に対応する所定の励起光を照射して、蛍光を放出させる。その状態の組織切片を蛍光顕微鏡(オリンパス社製「BX-53」)、顕微鏡用デジタルカメラ(オリンパス社製「DP73」)により観察および撮像を行う。上記励起光は、光学フィルターに通すことで575~600nmに設定する。また、観察する蛍光の波長(nm)の範囲についても、光学フィルターを通すことで612~692nmに設定する。顕微鏡観察および画像取得時の励起波長の条件は、580nmの励起では視野中心部付近の照射エネルギーが900W/cm2となるようにする。画像取得時の露光時間は、画像の輝度が飽和しないように任意に設定(例えば4000μ秒に設定)して撮像する。
固定化処理工程を終えた組織切片に対して蛍光色素に対応する所定の励起光を照射して、蛍光を放出させる。その状態の組織切片を蛍光顕微鏡(オリンパス社製「BX-53」)、顕微鏡用デジタルカメラ(オリンパス社製「DP73」)により観察および撮像を行う。上記励起光は、光学フィルターに通すことで575~600nmに設定する。また、観察する蛍光の波長(nm)の範囲についても、光学フィルターを通すことで612~692nmに設定する。顕微鏡観察および画像取得時の励起波長の条件は、580nmの励起では視野中心部付近の照射エネルギーが900W/cm2となるようにする。画像取得時の露光時間は、画像の輝度が飽和しないように任意に設定(例えば4000μ秒に設定)して撮像する。
本実施の形態によれば、正側にシフトした蛍光ナノ粒子を提供できる。このため、ヘマトキシリン染色によっても輝度が下がりにくい蛍光ナノ粒子を提供できる。
以下、本実施の形態に係る発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本実施の形態に係る発明はこれらの実施例により限定されない。
蛍光ナノ粒子中に分子数にして90000個の緑色蛍光色素または赤色蛍光色素があり、分子数にして8000個の正電荷付与剤があると仮定して、下記の式(2)に従って、電荷が改善された割合を計算した。DFT値、計算結果などを表1に示す。
正電荷付与剤1~7は、以下のものを用いたと仮定した。なお、正電荷付与剤1~7は、それぞれ上記した化合物7、化合物16、化合物6、化合物8、化合物4、化合物9、化合物3に対応する。
正電荷付与剤1:1-Propanaminium, 3-amino-N,N,N-triethyl-,chloride
正電荷付与剤2:Ethanaminium, 2-hydrazinyl-N,N,N-trimethyl-2-oxo-,chloride
正電荷付与剤3:1-Decanaminium, 10-amino-N,N,N-trimethyl-,bromide
正電荷付与剤4:1-Propanaminium, 3-amino-N,N,N-triethyl-,chloride
正電荷付与剤5:1-Pentanaminium, 5-amino-N,N,N-trimethyl-,hydroxide
正電荷付与剤6:Methanaminium, 1-(4-amino-1-oxobutoxy)-N,N,N-trimethyl-, chloride
正電荷付与剤7:1-Propanaminium, 3-amino-N,N,N-trimethyl-,iodide
正電荷付与剤1:1-Propanaminium, 3-amino-N,N,N-triethyl-,chloride
正電荷付与剤2:Ethanaminium, 2-hydrazinyl-N,N,N-trimethyl-2-oxo-,chloride
正電荷付与剤3:1-Decanaminium, 10-amino-N,N,N-trimethyl-,bromide
正電荷付与剤4:1-Propanaminium, 3-amino-N,N,N-triethyl-,chloride
正電荷付与剤5:1-Pentanaminium, 5-amino-N,N,N-trimethyl-,hydroxide
正電荷付与剤6:Methanaminium, 1-(4-amino-1-oxobutoxy)-N,N,N-trimethyl-, chloride
正電荷付与剤7:1-Propanaminium, 3-amino-N,N,N-trimethyl-,iodide
表1中の評価は以下の基準で行った。
正電荷付与剤のN+の電荷(DFT値) 0.3以上 ◎
正電荷付与剤のN+の電荷(DFT値) 0.2以上0.3未満 ○
正電荷付与剤のN+の電荷(DFT値) 0を超えて0.2未満 △
正電荷付与剤のN+の電荷(DFT値) 0以下 ×
正電荷付与剤のN+の電荷(DFT値) 0.3以上 ◎
正電荷付与剤のN+の電荷(DFT値) 0.2以上0.3未満 ○
正電荷付与剤のN+の電荷(DFT値) 0を超えて0.2未満 △
正電荷付与剤のN+の電荷(DFT値) 0以下 ×
正電荷付与剤1~7はいずれも、第4級アンモニウムカチオン構造を有する化合物であるが、正に帯電した窒素原子(N+)のDFT値は異なるものとなった。具体的には、正電荷付与剤1~6のN+のDFT値は0を超えて蛍光色素の負の電荷を打ち消す能力があるのに対し、正電荷付与剤7では0であり、当該能力がなかった。
本出願は、2020年9月17日出願の特願2020-156233に基づく優先権を主張する。当該出願明細書に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
本実施の形態に係る蛍光ナノ粒子によれば、より適切な電荷を持つ蛍光ナノ粒子を提供でき、種々の免疫染色に有用である。特に、ヘマトキシリン染色と共に行われる蛍光免疫染色に有用である。
Claims (7)
- 前記正電荷付与剤の前記第4級アンモニウムカチオン構造におけるN+のDFT値は0を超える、請求項1に記載の蛍光ナノ粒子。
- 前記式(1)が1%を超える、請求項1または2に記載の蛍光ナノ粒子。
- 前記樹脂はメラミン系樹脂である、請求項1~3のいずれか一項に記載の蛍光ナノ粒子。
- 前記蛍光色素はペリレン系色素またはクマリン系色素である、請求項1~4のいずれか一項に記載の蛍光ナノ粒子。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載の蛍光ナノ粒子を用いて細胞または生体組織を染色する工程を有する、染色方法。
- ヘマトキシリンを用いて前記細胞または前記生体組織を染色する工程をさらに有する、請求項6に記載の染色方法。
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---|---|---|---|---|
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WO2014203614A1 (ja) * | 2013-06-19 | 2014-12-24 | コニカミノルタ株式会社 | 生体分子染色用の蛍光ナノ粒子およびその製造方法 |
WO2015045961A1 (ja) * | 2013-09-26 | 2015-04-02 | コニカミノルタ株式会社 | 蛍光ナノ粒子標識体、多重免疫染色剤キットおよび多重免疫染色法 |
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