WO2022014804A1 - 간 섬유화 위험도 예측용 마커 및 그를 이용하는 정보제공방법 - Google Patents

간 섬유화 위험도 예측용 마커 및 그를 이용하는 정보제공방법 Download PDF

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WO2022014804A1
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liver fibrosis
risk
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predicting
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배시현
성필수
차정훈
박진영
유윤석
서용배
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a genetic marker, a composition for diagnosing the advanced stage of liver fibrosis or for predicting the risk of liver fibrosis, and a method for providing information using the same.
  • Hepatic fibrosis refers to a state in which damaged liver tissue is not restored to normal hepatocytes but is transformed into fibrous tissue such as collagen. do. If these injuries are not cured in the early stage and become chronic, hepatic stellate cells (HSCs) become Activated and activated hepatic stellate cells are differentiated into proliferative myofibroblasts expressing ⁇ -SMA (alpha smooth muscle actin), and the differentiated myofibroblasts are various cells such as collagen and elastin. As extracellular matrix (ECM) is secreted, liver fibrosis is induced. In addition, according to a recent report, hepatic fibrosis is also induced through epithelial mesenchymal transition (EMT), a novel mechanism related to liver fibrosis.
  • EMT epithelial mesenchymal transition
  • Hepatic fibrosis is an unavoidable pathological result of the liver accompanying chronic liver damage, and a decrease in liver function inevitably appears in that the liver is replaced by a fibrous tissue that cannot perform a specific function of the liver, such as metabolism or bile secretion of biological substances.
  • Hepatic fibrosis is known to be reversible, composed of thin fibrils, and not to form nodules, so it may be possible to return to normal when the cause of liver damage is eliminated.
  • the exchange and binding between ECMs increase, leading to irreversible liver cirrhosis, in which thick fibrils and regenerated nodules are generated. Since the degree of liver fibrosis reflects the degree of chronic liver function impairment, liver fibrosis provides important information in predicting the severity and prognosis of chronic liver disease.
  • Determining the progression stage of liver fibrosis is very important in determining the treatment for liver fibrosis or observing the prognosis after treatment. Since fibrosis is not a change that appears evenly throughout the liver, a biopsy in which a biopsy tissue is obtained and morphologically observed has a risk that some tissues for which the biopsy is performed may not represent the overall situation of the liver. However, the important thing is that the accuracy can be improved only when a serum marker is developed using the markers identified in the liver biopsy tissue. Josep M. Llovet of the Barcelona Liver Cancer Research Council (BCLC), Spain, who is leading the academic community related to liver research, published a review paper on the recent guidelines recommending tissue biomarker research through liver cancer biopsy in clinical trial design among future treatment strategies for liver cancer. recommended.
  • BCLC Barcelona Liver Cancer Research Council
  • This guideline is ‘EASL-EORTC Clinical Practice Guidelines: Management of Hepatocellular Carcinoma’ (J Hepatol. 2012 Apr;56(4):908-43). Accordingly, there is a need for a diagnostic method capable of diagnosing the liver fibrosis stage, which can be used for the development of a simple and high-accuracy serum marker, and which has better accuracy than conventionally known methods.
  • An object of the present invention is to provide a marker for diagnosing the progress of liver fibrosis that can specifically discriminate, diagnose, or detect the progress of liver fibrosis.
  • Another object of the present invention is to provide an information providing method for predicting the risk of liver fibrosis by performing a statistical analysis through the combination of the above markers, and diagnosing the progression stage of liver fibrosis based on this.
  • Another object of the present invention is to provide an information providing method for predicting the risk of liver fibrosis by measuring the expression level of the marker.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for predicting or diagnosing the risk of liver fibrosis that can measure the expression level of the marker.
  • a marker composition for predicting the risk of liver fibrosis comprising at least one gene selected from the group consisting of CSF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 and SOX17.
  • the method further comprises the step of obtaining a reference value through the ROC curve for the gene combination and comparing the liver fibrosis prediction score and the reference value, but if the liver fibrosis prediction score is higher than the reference value, the risk of liver fibrosis is determined to be high. If the liver fibrosis prediction score is lower than the reference value, it can be determined that the risk of liver fibrosis is low.
  • the gene combination may include at least two types selected from the group consisting of JAK2, MAP3K14 and SOX17.
  • the gene combination may include CSF3R and MAP3K14.
  • the gene combination may include JAK2, MAPK8IP2 and SOX17.
  • the gene combination includes SOX17 and may further include at least three kinds of genes selected from the group consisting of CSF3R, JAK2, MAP3K14 and MAPK8IP2.
  • the method may further include comparing the measured expression level of mRNA or protein with the expression level of a normal group.
  • the present invention comprising measuring the expression level of mRNA of at least two genes selected from the group consisting of CSF3R, JAK2, MAP3K14 and MAPK8IP2 or a protein encoded by the gene, the measured When the expression level of mRNA or protein is the same as or higher than that of the normal group, the risk of liver fibrosis is predicted to be low, and when the measured expression level of mRNA or protein is lower than the expression level of the normal group, the risk of liver fibrosis is high.
  • An information provision method for predicting the risk of liver fibrosis is provided.
  • At least one selected from the group consisting of CSF3R, JAK2, MAP3K14 and MAPK8IP2 and mRNA of a gene comprising SOX17 or a protein encoded by the gene comprising the step of measuring the expression level
  • the risk of liver fibrosis is predicted to be low
  • the CSF3R When the expression level of at least one measured mRNA or protein selected from the group consisting of , JAK2, MAP3K14 and MAPK8IP2 is lower than the expression level of the normal group, the risk of liver fibrosis is predicted to be high, and the measured mRNA or protein of the SOX17 gene
  • the mRNA of at least two genes selected from the group consisting of SF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 and SOX17 or an agent for measuring the expression level of a protein encoded by the gene comprises an agent, A composition for predicting the risk of liver fibrosis is provided.
  • the agent for measuring the expression level of the mRNA may be sense and antisense primers or probes complementary to the mRNA of the gene.
  • the agent for measuring the expression level of the protein may include an antibody that specifically binds to the protein, an interacting protein, a ligand, an oligopeptide, a peptide nucleic acid (PNA), a nanoparticle, or an aptamer.
  • an antibody that specifically binds to the protein an interacting protein, a ligand, an oligopeptide, a peptide nucleic acid (PNA), a nanoparticle, or an aptamer.
  • the risk according to the liver fibrosis stage can be classified and predicted with high sensitivity and specificity. Through this, information on the progression stage of liver fibrosis can be obtained with high accuracy, and treatment for liver fibrosis can be effectively performed by applying an appropriate treatment for the progression stage of liver fibrosis.
  • the marker according to another aspect of the present invention can be used as a target for studying the mechanism of progressive liver fibrosis, developing a therapeutic agent, or building a model for predicting therapeutic effect.
  • FIG. 2 is a check of the mRNA expression level of the marker according to an aspect of the present invention by dividing the liver fibrosis stage;
  • FIG. 3 is a ROC curve of a gene combination including all markers according to an aspect of the present invention.
  • the present invention relates to a marker capable of diagnosing liver fibrosis as well as predicting the risk of liver fibrosis based on the progression stage of the liver fibrosis and its use.
  • the term marker refers to a molecule that is quantitatively or qualitatively associated with the existence of a biological phenomenon.
  • the marker is a gene product, including a gene, RNA, polynucleotide, peptide, or protein directly or indirectly related to an antecedent mechanism of the phenomenon; related metabolites; It may include both antibodies or other identifying molecules such as antibody fragments.
  • the term “gene signature” refers to a combination of markers that can predict the risk of liver fibrosis with good reliability.
  • liver fibrosis risk used in the present invention includes information on the progression stage of liver fibrosis in addition to the diagnosis of liver fibrosis disease. Based on the progression stage of liver fibrosis, it can be divided into a low-risk group in the early or early stage, and a high-risk group in the late stage.
  • the liver fibrosis progression stage can be classified as an early stage when it is stage 1 or 2, and a late stage when it is stage 3 or 4 according to the METAVIR liver fibrosis stage definition.
  • threshold or reference value used in the present invention can be obtained through statistical analysis, and can be understood as a number that can be determined whether a patient has or does not have a disease for a given condition.
  • a reference value in a diagnostic sense can be set to achieve a desired sensitivity and specificity depending on factors such as populations, prevalence, and clinical outcome, calculated through algorithms or computerized data analysis, or can be established
  • the reference value may be experimentally established through clinical studies such as those described in Examples to be described later.
  • it can be set to achieve maximum sensitivity, specificity or minimum error.
  • the reference value is set to achieve maximum sensitivity, specificity, accuracy, positive predictive value and negative predictive value.
  • the term sensitivity means the ability to detect a person in the late stage of liver fibrosis as a high-risk group
  • the specificity means the ability to detect a person in the early stage of liver fibrosis as a low-risk group
  • Accuracy refers to the probability of judging a person in the late stage of liver fibrosis as a high-risk group and a person in an early stage of liver fibrosis as a low-risk group. It means the probability of being in the late stage, and the negative predictive value can be understood as meaning the probability of being in the actual pre-stage liver fibrosis among those in the low-risk group.
  • the sensitivity, specificity, accuracy, positive predictive value, and negative predictive value may be calculated using the values in Table 1 below. In Table 1, the high-risk group and the low-risk group are divided based on the threshold obtained through the ROC curve.
  • the sensitivity may be calculated as A/(A+C) using the values in Table 1 above.
  • the specificity may be calculated as D/(B+D) using the values in Table 1 above.
  • the accuracy may be calculated as A+D/(A+B+C+D) using the values in Table 1 above.
  • the positive predictive value may be calculated as A/(A+B) using the values in Table 1 above.
  • the speech predictive value may be calculated as D/(C+D) using the values in Table 1 above.
  • Advanced Stage means the late stage according to the progress of liver fibrosis
  • Early Stage means the early stage according to the progress of liver fibrosis.
  • Liver fibrosis prediction score used in the present invention means a value for classifying the risk of liver fibrosis into a high-risk group or a low-risk group using a genetic signature, and It can be calculated using the regression coefficient value for each marker of univariate logistic regression analysis obtained through the ROC curve.
  • a marker capable of predicting or diagnosing the risk of liver fibrosis and a composition comprising the same are provided.
  • a marker according to an aspect of the present invention and a gene signature comprising the same may be derived through statistical analysis.
  • a marker for predicting or diagnosing the risk of liver fibrosis according to an aspect of the present invention and a method for providing information on a gene combination for performing an information providing method according to another aspect of the present invention using the same An example is shown in FIG. 1 . Referring to FIG. 1 .
  • a marker and a gene signature according to an aspect of the present invention may be derived through the steps of obtaining , and determining the gene signature through a regression analysis (univariate or multivariate regression analysis).
  • the nCounter Assay may be performed to derive markers related to the classification of liver fibrosis and its progression stages. Specifically, a normal group without hepatic fibrosis disease, a low-risk group with a low risk of liver fibrosis, and a high-risk group with a high risk of liver fibrosis were distinguished, and the expression or level of gene expression was checked for each group to determine the significant expression difference between the groups. It can be performed to derive a gene with Whether or not the expression of a gene or its expression level can be measured through an mRNA transcribed from the gene or a protein encoded by it, the mRNA or protein can be extracted from a sample obtained from a patient with a disease or a subject who wants to be tested.
  • the sample may be a biological sample derived from the subject, for example, liver tissue or liver tissue-derived cells, but is not limited thereto.
  • the sample may be from a fresh-frozen biopsy sample isolated in vitro or a formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) biopsy sample, but is not limited thereto.
  • the biopsy sample may be a surgical tissue or a tissue derived from a biopsy.
  • the nCounter Assay is only a preferred exemplary means selected to quickly check the expression difference of the gene, and the means for checking the expression difference of the gene in the present invention is not limited thereto.
  • the measurement of mRNA expression or expression level is RT-PCR, competitive RT-PCR (RT-PCR), real-time RT-PCR (RT-PCR), in-situ hybridization (in-situ hybridization). hybridization), RNase protection assay, Northern blot, and at least one method selected from the group consisting of a DNA chip, but is not limited thereto.
  • the determination of the presence or absence of a protein or measurement of its expression level is performed by immunohistochemistry staining, Western blot, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunoassay, radioimmunodiffusion, At least selected from the group consisting of ouchterlony immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS and protein chip It may be performed through one method, but is not limited thereto.
  • a regression coefficient and a reference value may be obtained through the statistical analysis, and the risk of liver fibrosis may be predicted or diagnosed using the regression coefficient and the reference value.
  • the statistical analysis may be performed through regression analysis.
  • the regression analysis may be performed through an ROC curve.
  • Univariable or multivariable analysis can be performed, and the markers according to an aspect of the present invention derived through the above-described method are CSF3R (Colony Stimulating Factor 3 Receptor), JAK2 (Janus Kinase 2), MAP3K14 (Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinase 14), MAPK8IP2 (Mitogen-Activated Protein Kinase 8 Interacting Protein 2), and SOX17 (SRY-Box Transcription Factor 17). It contains at least one gene selected from the group consisting of.
  • a gene combination excellent in AUC, sensitivity and specificity may be selected from among gene combinations including the above genes.
  • the gene signature may be selected to include at least two genes selected from the group consisting of CSF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 and SOX17, and preferably a gene combination comprising CSF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 and SOX17 can be selected.
  • an information providing method for predicting or diagnosing the risk of liver fibrosis using the marker is provided.
  • the information providing method comprises the steps of determining a gene combination using at least two genes selected from the group consisting of derived genetic markers CSF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 and SOX17; Measuring the expression level of the gene included in the determined gene combination; obtaining each regression coefficient value for each gene through regression analysis; obtaining a liver fibrosis prediction score using the regression coefficient value; obtaining a reference value through regression analysis for a gene combination including all of the genes; and comparing the liver fibrosis prediction score with the reference value.
  • the derived genetic marker in order to improve the reliability of predicting the risk of liver fibrosis, it is recommended to use the derived genetic marker as a gene combination including two or more of the derived genes rather than using a single one.
  • the gene combination includes at least two selected from the group consisting of JAK2, MAP3K14 and SOX17, or preferably includes CSF3R and MAP3K14.
  • JAK2, MAPK8IP2 and SOX17 it is preferable to include JAK2, MAPK8IP2 and SOX17. More preferably, the gene combination includes SOX17 and further includes at least three genes selected from the group consisting of CSF3R, JAK2, MAP3K14 and MAPK8IP2.
  • the expression of the gene may be measured or confirmed using the mRNA of the gene or the expression of a protein encoded by the gene.
  • the regression analysis may be performed using an ROC curve.
  • Regression coefficient values for each gene can be obtained through univariate logistic regression analysis.
  • the reference value may be obtained through multivariate logistic regression analysis.
  • the reference value may be obtained through multivariate logistic regression analysis using an ROC curve.
  • liver fibrosis prediction score is higher than the reference value, it may be determined that the risk of liver fibrosis is high in the later stage of progression. If the liver fibrosis prediction score is lower than the reference value, it may be determined that the risk of liver fibrosis is low in the initial stage of progression.
  • the information providing method measures the mRNA of at least two genes selected from the group consisting of CSF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 and SOX17 or the expression level of a protein encoded by the gene, and measured Comparing the expression level of mRNA or protein with the expression level measured in the normal group may be performed.
  • the expression levels of CSF3R, JAK2, MAP3K14 and MAPK8IP2 are the same or higher than in the normal group in the early stage of liver fibrosis, and their expression levels are lowered in the late stage of liver fibrosis. In addition, when comparing the early and late stages of liver fibrosis, the expression level is lowered in the late stage compared to the early stage of liver fibrosis.
  • the risk of liver fibrosis is predicted to be low, and the measured expression level is the normal group If it is lower than the expression level of , it can be predicted that the risk of liver fibrosis is high.
  • the expression level of SOX17 is higher in the late stage than in the early stage of liver fibrosis, and when the expression level of SOX17 is higher than the expression level of the normal group, it can be predicted that there is a risk of liver fibrosis. At this time, it can be predicted that the higher the expression level than the normal group, the higher the risk of liver fibrosis.
  • composition for predicting the risk of liver fibrosis using a marker according to an aspect of the present invention.
  • composition comprises at least one selected from the group consisting of SF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 and SOX17, preferably, mRNA of at least two genes or an agent for measuring the expression level of a protein encoded by the gene.
  • the agent for measuring the mRNA expression level may be, for example, sense and antisense primers or probes complementary to mRNA of a gene, but is not limited thereto.
  • the agent for measuring the expression level of the protein may include, for example, an antibody that specifically binds to the protein, an interacting protein, a ligand, an oligopeptide, a peptide nucleic acid (PNA), a nanoparticle, or an aptamer. It is not limited.
  • Specimens were collected from a total of 94 patients.
  • An extracorporeally isolated fresh-frozen biopsy sample (surgical tissue) was used as a sample for the experiment.
  • Written consent was obtained from the patient before participation in the trial, and approval from the Clinical Trial Review Committee of Ajou University Hospital (approval number: AJIRB-BMR-KSP-18-444) was obtained.
  • the collected specimens were classified according to the stage of liver fibrosis disease, there were 17 normal specimens, 12 stage 1 liver fibrosis, 12 stages 2 stage 2, 25 stage 3 stage 4 specimens, and a total of 77 specimens with liver fibrosis disease.
  • liver fibrosis The stages of liver fibrosis were classified according to the METAVIR liver fibrosis stage definition, and the degree of fibrosis was evaluated by histological analysis by a pathologist. Data obtained from patients were used to collect significant fibrosis-related variables in patient characteristics and univariate analyses.
  • variable (Variable) number of patients (n) coef Odds Ratio se(coef) z P-value lower .95 upper .95 age ( ⁇ 55 years vs ⁇ 55 years) 77 -0.0711 0.93 0.5097 -0.139 0.8891 0.34 2.53 gender (male vs female) 77 -0.3600 0.70 0.5878 -0.612 0.5402 0.22 2.24 HBV (None vs Yes) 74 1.7525 5.77 0.6048 2.898 0.0038 1.76 18.88 HCV (None vs Yes) 73 15.7653 7027141.58 1696.7344 0.009 0.9926 0.00 Inf AFP ( ⁇ 100ng/mL vs ⁇ 100ng/mL) 77 0.5008 1.65 0.4970 1.008 0.3140 0.62 4.37
  • RNA was extracted from surgical tissues (n 94) using RNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Germany) and DNase I treatment (Qiagen, Hilden, Germany) (Table 1). Total RNA integrity was verified using Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), and total RNA concentration was measured using Nanodrop 2000 (Thermo Fisher scientific, Waltham, MS, USA).
  • Sample gene expression was performed using the nCounter PanCancer Pathway Panel (Nanostring Technologies, Seattle, WA) using nCounter MAX (Nanostring, Technologies, Seattle, WA, USA).
  • the panel analyzed 770 genes, including 40 control genes, and each reaction contained 100 ng of total RNA and reporter and capture probes in 15 ⁇ l aliquots. Quality control and normalization of raw data was performed using nSolver Analysis Software v 4.0 (Nanostring Technologies, Seattle, WA, USA).
  • nSolver Analysis Software v 4.0 NaSolver Analysis Software v 4.0
  • 730 endogenous genes and 40 housekeeping genes were identified. These genes were normalized using nSolver software.
  • Geometric mean in Positive Control Normalization For the program setting for standardization, select Geometric mean in Positive Control Normalization, Range as 0.3-3, and Standard in CodeSet Content (Reference or Housekeeping) Normalization, Codeset Content for Endogenous genes, Normalization Codes for Housekeeping genes. was selected, geometric mean was selected, and the range was set to 0.1-10.
  • Logistic regression analysis is an analysis method to analyze the effect of a quantitative variable that can be scored as an analysis for use in future predictive models by expressing the relationship between the dependent variable and the independent variable as a specific function on the dichotomous variable, and p ⁇ 0.05 were considered to be academically significant.
  • Stages 1 and 2 of liver fibrosis were classified as a low-risk group for liver fibrosis, and stages 3 and 4 of liver fibrosis were classified as a high-risk group, and genes with differences in gene expression were identified between the low-risk and high-risk groups.
  • 71 genes out of 730 endogenous genes were statistically significantly differentially expressed. was found (P ⁇ 0.05).
  • Equation 1 n is the total number of selected DEGs, and k is the number of genes included in combination.
  • Multivariate logistic regression analysis was performed to determine the relevance of gene signatures and clinicopathological features (p ⁇ 0.05). Sensitivity and specificity were obtained and used to obtain the optimal gene combination, and in addition, accuracy, positive predictive value, and negative predictive value were additionally obtained and utilized.
  • the candidate gene signature of the optimal gene combination was obtained under the conditions of p ⁇ 0.05, AUC > 0.800, sensitivity > 80%, and specificity > 80%, and the optimal gene combination ( gene combinations) were identified. If the AUC is 0.800 or less or the sensitivity and specificity are 80% or less, there is a problem in that the reliability of the diagnosis and prediction of a disease using the same is lowered.
  • An optimal gene combination was obtained under one condition.
  • the training cohort was divided into two folds (training set and test set) and the results were confirmed by applying the reference values from the training set to the test set. . Accuracy was calculated based on p ⁇ 0.05 for the test set.
  • CSF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 and SOX17 genes was different in the normal group and in subjects with liver fibrosis. Looking at the change in expression of each gene between the normal group and the early stage of liver fibrosis, it was found that the expression of CSF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 and SOX17 genes increased compared to the normal group in the early stage of liver fibrosis.
  • CSF3R CSF3R
  • JAK2 JAK2
  • M3 MAP3K14
  • MAPK8IP2 MAPK8IP2
  • S SOX17 as an abbreviation.
  • C-J refers to the gene combination of CSF3R and JAK2.
  • YI Youden Index
  • Liver fibrosis prediction score (Liver fibrosis) using the logistic regression coeffieient values for each gene obtained from univariate logistic regression for the selected CSF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 and SOX17 five gene combinations prediction score) was obtained.
  • the regression coefficient values for each gene are shown in Table 6 below.
  • liver fibrosis prediction score using the gene-specific regression coefficients in Table 6 above can be calculated using the formula (-0.007283) ⁇ CSF3R+(-0.005178) ⁇ JAK2+(-0.002994) ⁇ MAP3K14+(-0.059009) ⁇ MAPK8IP2+0.027697 ⁇ SOX17.
  • each gene means the expression level of each gene in the sample to be tested to predict the risk by checking the progress of liver fibrosis, and nSolver It is a value that has been normalized using the 4.0 software.
  • liver fibrosis Early or late judgment of liver fibrosis can be made using the reference value obtained through the ROC curve analysis for the above five gene combinations, and through this, the risk according to the progress of liver fibrosis is determined, and Prediction may be performed.
  • the results of the ROC curve analysis performed to obtain the reference value are shown in FIG. 3 .
  • the threshold derived through the ROC curve analysis was confirmed to be -8.436595. If the liver fibrosis prediction score of the sample to be tested exceeded the derived reference value, it was classified as a high-risk group, and if it was less than or equal to the derived reference value, it was classified as a low-risk group, and progressive liver fibrosis was predicted for the high-risk group.
  • the regression coefficient and the derived reference value of Table 6 are values obtained based on the gene expression analysis value obtained through the nCounter assay in an embodiment of the present invention, and the measuring method for obtaining the RNA expression value is different from this example
  • the regression coefficient and the reference value obtained therefrom may also be different from the aforementioned numerical values.
  • Multivariate analysis explains the degree of actual influence of each factor by correcting the effects of several risk factors that affect one dependent variable with one model. All of these become the corrected Odds Ratio.
  • variable n coef Odds Ratio se(coef) z P-value lower .95 upper .95 Liver fibrosis prediction score (low vs high) 77 4.9034 134.75 0.9033 5.429 5.68E-08 22.94 791.37
  • the gene signature and HBV derived according to an aspect of the present invention are factors capable of independently predicting progressive liver fibrosis.
  • progressive liver fibrosis can be independently diagnosed with a gene signature alone.

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Abstract

본 발명은 간 섬유화 위험도 예측용 마커 및 그를 이용하는 정보제공방법에 관한 것으로, 상세하게는, CSF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 및 SOX17 유전자 마커 조합을 이용한 회귀분석을 수행하여 간 섬유화 예측 점수를 구하고 간 섬유화 위험도에 대한 판별이 수행됨으로써, 높은 민감도 및 특이도로 간 섬유화 단계에 따른 위험도를 구분하여 예측할 수 있는 간 섬유화 위험도 예측용 마커 및 그를 이용하는 정보제공방법에 관한 것이다.

Description

간 섬유화 위험도 예측용 마커 및 그를 이용하는 정보제공방법
본 발명은 간 섬유화의 진행단계 진단용 또는 간 섬유화 위험도 예측용 유전자 마커, 조성물 및 그를 이용한 정보제공방법에 관한 것이다.
간 섬유화(hepatic fibrosis)는 손상된 간 조직이 정상적인 간세포로 복구되지 않고 콜라겐과 같은 섬유 조직으로 변형된 상태를 말하며, 일반적으로 바이러스성, 알코올성, 약물 독성, 자가면역성 등 다양한 원인에 의한 간세포 손상에서 시작된다. 이러한 손상이 초기에 완치되지 못하고 만성화되면 손상된 간세포 주위로 모인 다양한 염증세포들이 분비하는 PDGF(platerlet-derived growth factor), TGF-β와 같은 인자들에 의해 간성상세포(hepatic stellate cell; HSC)가 활성화되고, 활성화된 간성상세포는 α-SMA(alpha smooth muscle actin)를 발현하는 증식성의 근섬유아세포(myofibroblast)로 분화되며, 분화된 근섬유아세포는 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin)과 같은 다양한 세포외기질(extracellular matrix; ECM)을 분비하게 되면서 간 섬유화를 유도하게 된다. 또한, 최근 보고에 의하면 간 섬유화와 관련하여 새로운 기전인 상피세포의 중간엽세포로의 전환(epithelial mesenchymal transition, EMT)을 통하여서도 간 섬유화가 유발된다고 한다.
간 섬유화는 만성적인 간 손상에 수반되는 불가피한 간의 병리학적 결과로써, 생체 물질의 대사 또는 담즙분비 등 간의 고유 기능을 수행할 수 없는 섬유 조직으로 간이 대체된다는 점에서 간 기능의 저하가 필연적으로 나타난다. 간 섬유화는 가역적이고, 가느다란 소섬유(thin fibril)로 구성되며 결절(nodule) 형성이 없는 것으로 알려져 있어, 간의 손상 원인이 소실되면 정상으로 회복되는 것이 가능할 수 있다. 그러나, 섬유화 과정이 반복적으로 지속되면 ECM 간의 교환, 결합이 증가하여 굵은 소섬유(thick fibril) 및 재생성 결절이 생성되는 비가역적인 간경화 (liver cirrhosis)로 진행될 수 있다. 간 섬유화 정도가 만성적 간기능의 손상 정도를 반영하므로, 간 섬유화는 만성 간질환의 경중과 예후 예측에 있어 중요한 정보를 제공한다.
간 섬유화의 진행 단계를 판별하는 것은 간 섬유화에 대한 치료법을 결정하거나 또는 치료 후 예후 관찰에 있어 매우 중요하다. 섬유화는 간 전체에서 고르게 나타나는 변화가 아니기 때문에, 생검조직을 얻어 형태학적으로 관찰이 수행되는 조직검사는 조직검사가 수행되는 일부의 조직이 간 전체의 상황을 대표하지 못하는 위험성이 있다. 하지만 중요한 것은 간 생검조직에서 확인된 마커를 활용하여 혈청 마커를 개발해야 정확성을 높일 수 있다는 것이다. 간 연구와 관련된 학계를 주도하고 있는 스페인 바르셀로나 간암 연구회 (BCLC)의 Josep M. Llovet는 리뷰 논문을 통해 간암의 미래 치료전략 중 임상시험 디자인에 간암 생검을 통해 tissue biomarker 연구를 권장하는 최근 가이드라인을 추천하였다. 해당 가이드라인은 ‘EASL-EORTC Clinical Practice Guidelines: Management of Hepatocellular Carcinoma’(J Hepatol. 2012 Apr;56(4):908-43)이다. 이에 간편하면서도 정확도가 높은 혈청마커의 개발에 활용될 수 있으며, 종래 알려진 방법 보다 정확도가 우수한 간 섬유화 단계를 진단할 수 있는 진단 방법이 필요한 실정이다.
본 발명은 간 섬유화의 진행 정도를 특이적으로 판별, 진단 또는 검출 가능한 간 섬유화 진행 진단용 마커를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 상기 마커의 조합을 통한 통계학적 분석을 수행하고, 이를 기반으로 간 섬유화의 진행단계를 진단하여 간 섬유화의 위험도를 예측하는 정보제공방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 상기 마커의 발현 수준을 측정하여 간 섬유화의 위험도를 예측하는 정보제공방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 상기 마커의 발현 수준을 측정할 수 있는 간 섬유화 위험도 예측 또는 진단용 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, CSF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 및 SOX17로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자를 포함하는, 간 섬유화 위험도 예측용 마커 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, CSF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 및 SOX17로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2종의 유전자를 이용하여 유전자 조합을 결정하는 단계; 결정된 유전자 조합에 포함되는 유전자별 발현 수준을 측정하는 단계;
회귀분석을 통해 상기 유전자별로 발현 수준에 대한 회귀 계수 값을 구하는 단계; 및 상기 회귀 계수 값을 이용하여 간 섬유화 예측 점수를 구하는 단계;를 더 포함하는, 간 섬유화 위험도 예측을 위한 정보제공방법이 제공된다.
또한, 상기 유전자 조합에 대해 ROC 곡선을 통해 기준값을 구하고 상기 간 섬유화 예측 점수 및 상기 기준값을 비교하는 단계를 더 포함하되, 상기 간 섬유화 예측 점수가 상기 기준값보다 높으면 간 섬유화 위험도가 높은 것으로 판단이 이루어지고 상기 간 섬유화 예측 점수가 상기 기준값보다 낮으면 간 섬유화 위험도가 낮은 것으로 판단이 이루어질 수 있다.
또한, 상기 유전자 조합은 JAK2, MAP3K14 및 SOX17로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 2종을 포함할 수 있다.
또한, 상기 유전자 조합은 CSF3R 및 MAP3K14를 포함할 수 있다.
또한, 상기 유전자 조합은 JAK2, MAPK8IP2 및 SOX17를 포함할 수 있다.
또한, 상기 유전자 조합은 SOX17를 포함하고 CSF3R, JAK2, MAP3K14 및 MAPK8IP2로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 3종의 유전자를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, CSF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 및 SOX17 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 로지스틱 회귀분석을 통해 상기 유전자별로 발현 수준에 대한 회귀 계수 값을 구하는 단계; 및 상기 회귀 계수 값을 이용하여 간 섬유화 예측 점수를 구하는 단계;를 더 포함하는, 간 섬유화 위험도 예측을 위한 정보제공방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, CSF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 및 SOX17로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 2종의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의하여 암호화되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 간 섬유화 위험도 예측을 위한 정보제공방법이 제공된다.
또한, 측정된 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 정상군의 발현 수준과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, CSF3R, JAK2, MAP3K14 및 MAPK8IP2로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 2종의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의하여 암호화되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하되, 측정된 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 정상군의 발현 수준과 같거나 그보다 높은 경우 간 섬유화 위험도가 낮은 것으로 예측하고, 측정된 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 정상군의 발현 수준보다 낮은 경우 간 섬유화 위험도가 높은 것으로 예측하는, 간 섬유화 위험도 예측을 위한 정보제공방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, CSF3R, JAK2, MAP3K14 및 MAPK8IP2로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 및, SOX17를 포함하는 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의하여 암호화되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하되, 상기 CSF3R, JAK2, MAP3K14 및 MAPK8IP2로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 측정된 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 정상군의 발현 수준과 같거나 그보다 높은 경우 간 섬유화 위험도가 낮은 것으로 예측하고, 상기 CSF3R, JAK2, MAP3K14 및 MAPK8IP2로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 측정된 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 정상군의 발현 수준보다 낮은 경우 간 섬유화 위험도가 높은 것으로 예측하고, 상기 SOX17 유전자의 측정된 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 정상군의 발현 수준보다 높은 경우 간 섬유화 위험도가 있는 것으로 예측하는, 간 섬유화 위험도 예측을 위한 정보제공방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, SF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 및 SOX17로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 2종의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의하여 암호화되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 간 섬유화 위험도 예측용 조성물이 제공된다.
또한, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있다.
또한, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 올리고펩타이드, PNA(peptide nucleic acid), 나노입자 또는 압타머를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 정보제공방법에 의하면 높은 민감도 및 특이도로 간 섬유화 단계에 따른 위험도를 구분하여 예측할 수 있다. 이를 통하여, 간 섬유화의 진행 단계에 대한 정보를 높은 정확도로 얻을 수 있으며, 간 섬유화 진행 단계에 맞는 적절한 치료법을 적용하여 효과적으로 간 섬유화에 대한 치료가 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 따른 마커는 진행성 간 섬유화의 메커니즘을 연구하거나 치료제 개발을 위한 표적으로 활용되거나 치료효과 예측을 위한 모델 구축에 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 정보제공방법의 전체 공정을 도시한 것,
도 2는 본 발명의 일 측면에 따른 마커의 mRNA 발현량을 간 섬유화 단계를 구분하여 확인한 것,
도 3은 본 발명의 일 측면에 따른 마커를 모두 포함하는 유전자 조합의 ROC 곡선.
본 발명은 간 섬유화를 진단할 수 있을 뿐 아니라 간 섬유화의 진행단계에 기반하여 간 섬유화의 위험도를 예측할 수 있는 마커 및 그 이용에 관한 것이다.
이하, 본 발명에 대해 보다 상세히 설명한다.
본 발명에서 사용되는 용어 마커는 생물학적 현상의 존재와 정량적 또는 정성적으로 연관된 분자를 의미한다. 상기 마커는 현상의 선행 기작과 직접 또는 간접적으로 관련되는 유전자, RNA, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 단백질을 포함하는 유전자 산물; 관련 대사물들; 항체들 또는 항체 단편들과 같은 기타 확인용 분자들 모두를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 유전자 시그니처(gene signature)는 간 섬유화 위험도를 우수한 신뢰도로 예측할 수 있는 마커의 조합을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 간 섬유화 위험도는 간 섬유화 질병에 대한 진단 외에도 간 섬유화 진행 단계에 대한 정보를 포함한다. 간 섬유화 진행 단계에 기반하여 초기 또는 전기(early stage)인 경우 저위험군, 후기(late stage)인 경우 고위험군으로 구분될 수 있다. 여기에서, 간 섬유화 진행 단계는 METAVIR간 섬유화 단계 정의에 따른 1단계 또는 2단계인 경우 초기로, 3단계 또는 4단계인 경우 후기로 분류될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 역치 또는 기준값(Threshold)은 통계분석을 통하여 얻을 수 있으며, 환자가 주어진 병태에 대하여 질환이 있거나 없는 것으로 판단할 수 있는 수치로 이해될 수 있다. 이하에서는 기준값으로 기재하기로 한다. 일반적으로 진단적인 의미에서의 기준값은 집단(populations), 유병률, 및 임상적 성과와 같은 요인들에 의존하여 원하는 민감도 및 특이도를 달성하도록 설정될 수 있으며, 알고리즘 또는 전산화된 데이터 분석을 통해 계산되거나 확립될 수 있다. 기준값은 후술할 실시예에 기재된 것과 같은 임상적 연구를 통해 실험적으로 확립될 수도 있다. 사용된 질환 예측 모델에 의존하여, 최대의 민감도, 특이도 또는 최소 오차를 달성하도록 설정될 수 있다. 본 발명에 따른 일 실시예에서, 기준값은 최대의 민감도, 특이도, 정확도, 양성 예측도 및 음성 예측도를 달성하도록 설정된다.
본 발명에서 사용되는 용어 민감도(Sensitivity)는 간 섬유화 후기에 있는 사람을 고위험군으로 검출하는 능력을 의미하고, 특이도(Specificity)는 간 섬유화 초기에 잇는 사람을 저위험군으로 검출하는 능력을 의미하고, 정확도(Accuracy)는 간 섬유화 후기에 있는 사람을 고위험군으로 판단하고 간 섬유화 초기에 있는 사람을 저위험군으로 판단하는 확률을 의미하고, 양성 예측도(Positive Predictive Value)는 고위험군으로 나온 것 중에 실제 간 섬유화 후기에 있을 확률을 의미하며, 음성 예측도(Negative Predictive Value)는 저위험군으로 나온 것 중에 실제 간 섬유화 전기에 있을 확률을 의미하는 것으로 이해될 수 있다. 상기 민감도, 특이도, 정확도, 양성예측도 및 음성예측도는 하기 표 1의 값을 이용하여 계산될 수 있다. 표 1에서, 고위험군 및 저위험군은 ROC 곡선을 통해 얻어진 기준값(Threshold)을 기준으로 구분된다.
Advanced Stage (number) Early Stage
(number)		 계 (number)
고위험군 (number) A (True Positive) B (False Positive) Total
(Test Positive)
저위험군 (number) C (False Negative) D (True Negative) Total
(Test Negative)
Total
(Advanced Stage)		 Total
(Early Stage)		 Total
상기 민감도는 상기 표 1의 값을 이용하여 A/(A+C)로 계산될 수 있다. 상기 특이도는 상기 표 1의 값을 이용하여 D/(B+D)로 계산될 수 있다. 상기 정확도는 상기 표 1의 값을 이용하여 A+D/(A+B+C+D)로 계산될 수 있다. 상기 양성 예측도는 상기 표 1의 값을 이용하여 A/(A+B)로 계산될 수 있다. 상기 음성 예측도는 상기 표 1의 값을 이용하여 D/(C+D)로 계산될 수 있다. 상기 표 1에서, Advanced Stage는 간 섬유화 진행도에 따른 후기를 의미하고, Early Stage는 간 섬유화 진행도에 따른 초기를 의미한다.
본 발명에서 질병에 대한 검사 또는 진단과 관련된 통계분석시 사용된 용어는 전술한 용어를 제외하면 회귀분석(Regression analysis) 및 ROC(Receiver Operation Characteristic) 곡선과 연관하여 본 기술분야에서 통상적으로 이해되는 의미로 해석될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 간 섬유화 예측 점수(Liver fibrosis prediction score)는 유전자 시그니처를 이용하여 간 섬유화의 위험도를 고위험군 또는 저위험군으로 구분하기 위한 값을 의미하며, 본 발명의 일 측면에 따른 유전자 시그니처의 ROC 곡선을 통해 구한 단변량 로지스틱 회귀분석(Univariate Logistic Regression Analysis)의 마커별 회귀 계수 값을 이용하여 계산될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 간 섬유화 위험도를 예측 또는 진단할 수 있는 마커 및 그를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 측면에 따른 마커 및 그를 포함하는 유전자 시그니처는 통계분석을 통해 도출될 수 있다. 통계분석을 통해 본 발명의 일 측면에 따른 간 섬유화의 위험도 예측 또는 진단용 마커 및 그를 이용하여 본 발명의 다른 측면에 따른 정보제공방법을 수행하기 위한 유전자 조합에 대한 정보를 제공하는 방법에 대한 공정의 일 예를 도 1에 도시하였다. 도 1을 참조하면, nCounter Assay를 수행하여 발현 수준 또는 발현 패턴에 대한 발현 데이터(Expression Data)를 얻는 단계, 상관분석(Correlation Analysis)을 통해 간 섬유화 단계에 따라 발현이 다른 유전자(Differentially Expressed Genes)에 대한 정보를 얻는 단계, 유전자 콤보 분석(Combo Gene Analysis) 및 교차검증(Cross Validation)을 포함한 머신 러닝(Machine Learning)을 수행하여 최적 유전자 조합인 유전자 시그니처의 후보(Candidate of Gene Signatures)에 대한 정보를 얻는 단계 및 회귀분석(Univariate or Multivariate Regression Analysis)를 통해 유전자 시그니처를 확정하는 단계를 통하여 본 발명의 일 측면에 따른 마커 및 유전자 시그니처가 도출될 수 있다.
상기 nCounter Assay는 간 섬유화 및 그 진행 단계의 구분과 관련된 마커를 도출하기 위하여 수행될 수 있다. 상세하게는, 간 섬유화 질환이 없는 정상군, 간 섬유화의 위험도가 낮은 저위험군 및 간 섬유화의 위험도가 높은 고위험군을 구분하고 구별된 그룹별로 유전자의 발현 여부 또는 발현 수준을 확인하여 그룹별 유의미한 발현 차이가 있는 유전자를 도출하기 위하여 수행될 수 있다. 유전자의 발현 여부 또는 그 발현 수준은 상기 유전자로부터 전사되는 mRNA 또는 그에 의하여 암호화되는 단백질을 통해 측정될 수 있으며, 상기 mRNA 또는 단백질은 질환자 또는 검사를 원하는 대상자로부터 얻은 시료로부터 추출될 수 있다. 상기 시료는 상기 대상자로부터 유래되는 생물학적 시료로, 예를 들면, 간 조직 또는 간 조직 유래 세포일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 시료는 체외로 분리된 냉동(fresh-frozen) 생검 샘플 또는 포르말린-고정된 파라핀-포매된(formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE) 생검 샘플에서 유래한 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 생검 샘플은 수술조직 또는 조직검사(biopsy) 유래 조직일 수 있다.
nCounter Assay는 유전자의 발현 차이를 빠르게 확인하기 위하여 선택된 바람직한 일 예시의 수단일 뿐 본 발명에서 유전자의 발현 차이를 확인하는 수단이 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, mRNA의 발현 여부 또는 발현 수준의 측정은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR), 인-시투 혼성화(in-situ hybridization), RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던 블랏 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 방법을 통해 수행될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 예로, 단백질의 존재 여부의 확인 또는 그 발현 수준의 측정은 면역조직화학염색(immunohistochemistry stain), 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테를로니(ouchterlony) 면역확산, 로케트(rocket) 면역전기영동, 면역침전 분석(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), FACS 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 방법을 통해 수행될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
유전자의 발현값을 얻은 후, 그에 대한 통계분석이 수행될 수 있다. 상기 통계분석을 통해 회귀 계수 및 기준값을 얻을 수 있으며, 상기 회귀 계수 및 기준값을 이용하여 간 섬유화 위험도를 예측 또는 진단할 수 있다.
상기 통계분석은 회귀분석을 통해 수행될 수 있다. 상기 회귀분석은 ROC 곡선을 통해 수행될 수 있다. 단변량(Univariable) 또는 다변량(Multivariable) 분석이 수행될 수 있으며, 전술한 방법을 통하여 도출된 본 발명의 일 측면에 따른 마커는 CSF3R(Colony Stimulating Factor 3 Receptor), JAK2(Janus Kinase 2), MAP3K14(Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinase 14), MAPK8IP2(Mitogen-Activated Protein Kinase 8 Interacting Protein 2) 및 SOX17(SRY-Box Transcription Factor 17)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자를 포함한다. 유전자 시그니처는 상기 유전자를 포함하는 유전자 조합 중에서 AUC, 민감도 및 특이도가 우수한 유전자 조합이 선택될 수 있다. 상기 유전자 시그니처는 CSF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 및 SOX17로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 2종의 유전자를 포함하도록 선택될 수 있으며, 바람직하게는 CSF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 및 SOX17를 포함하는 유전자 조합이 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 마커를 활용하는 간 섬유화 위험도 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법이 제공된다.
본 발명의 바람직한 일 예시에 따른 정보제공방법은 도출된 유전자 마커 CSF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 및 SOX17로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2종의 유전자를 이용하여 유전자 조합을 결정하는 단계; 결정된 유전자 조합에 포함되는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 회귀분석을 통해 상기 유전자별로 각각의 회귀 계수 값을 구하는 단계; 상기 회귀 계수 값을 이용하여 간 섬유화 예측 점수를 구하는 단계; 상기 유전자를 모두 포함하는 유전자 조합에 대해 회귀분석을 통해 기준값을 구하는 단계; 및 상기 간 섬유화 예측 점수 및 상기 기준값을 비교하는 단계;를 포함하여 수행될 수 있다.
간 섬유화 위험도 예측의 신뢰도를 향상시키기 위하여, 도출된 유전자 마커를 단일로 이용하지 않고 도출된 유전자들 중 2종 이상을 포함하는 유전자 조합으로 이용하는 것이 좋다. 바람직하게는, 상기 유전자 조합은 JAK2, MAP3K14 및 SOX17로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 2종을 포함하거나 CSF3R 및 MAP3K14를 포함하는 것이 좋다. 또는, JAK2, MAPK8IP2 및 SOX17를 포함하는 것이 좋다. 보다 바람직하게는, 상기 유전자 조합은 SOX17를 포함하고 CSF3R, JAK2, MAP3K14 및 MAPK8IP2로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 3종의 유전자를 더 포함하는 것이 좋다.
상기 유전자의 발현은 상기 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의하여 암호화되는 단백질의 발현을 이용하여 측정 또는 확인될 수 있다.
상기 회귀분석은 ROC 곡선을 이용하여 수행될 수 있다. 각 유전자별 회귀 계수 값은 단변량 로지스틱 회귀분석을 통해 얻어질 수 있다. 상기 기준값은 다변량 로지스틱 회귀분석을 통해 얻어질 수 있다. 상세하게는, 상기 기준값은 ROC 곡선을 이용한 다변량 로지스틱 회귀분석을 통해 얻어질 수 있다.
상기 간 섬유화 예측 점수가 상기 기준값보다 높으면 간 섬유화가 후기 진행단계에 있어 위험도가 높은 것으로 판단이 수행될 수 있다. 상기 간 섬유화 예측 점수가 상기 기준값보다 낮으면 간 섬유화가 초기 진행 단계에 있어 위험도가 낮은 것으로 판단이 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 예시에 따른 정보제공방법은 CSF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 및 SOX17로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 2종의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의하여 암호화되는 단백질의 발현 수준을 측정하고, 측정된 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 정상군에서 측정된 발현 수준과 비교하여 수행될 수 있다.
CSF3R, JAK2, MAP3K14 및 MAPK8IP2는 간 섬유화 초기에서는 정상군에 비하여 그 발현 수준이 같거나 높아지고, 간 섬유화 후기에서는 그 발현 수준이 낮아진다. 또한, 간 섬유화 초기와 후기를 비교하면, 간 섬유화 초기에 비하여 후기에서 그 발현 수준이 낮아진다. 이러한 발현 특성을 고려하여, 검사 대상에서 측정된 CSF3R, JAK2, MAP3K14 및 MAPK8IP2의 발현 수준이 정상군의 발현 수준과 같거나 그보다 높은 경우 간 섬유화 위험도가 낮은 것으로 예측하고, 측정된 발현 수준이 정상군의 발현 수준보다 낮은 경우 간 섬유화 위험도가 높은 것으로 예측될 수 있다.
SOX17은 간 섬유화 초기에서보다 후기에서 그 발현 수준이 높아지는데, SOX17의 발현 수준이 정상군의 발현 수준보다 높은 경우 간 섬유화 위험도가 있는 것으로 예측이 수행될 수 있다. 이 때, 상기 정상군보다 발현 수준이 높아질수록 간 섬유화 위험도는 높아지는 것으로 예측될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명의 일 측면에 따른 마커를 이용한 간 섬유화 위험도 예측용 조성물이 제공된다.
상기 조성물은 SF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 및 SOX17로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나, 바람직하게는, 적어도 2종의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의하여 암호화되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함할 수 있다.
상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 예를 들면 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 예를 들면 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 올리고펩타이드, PNA(peptide nucleic acid), 나노입자 또는 압타머를 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 첨부된 특허청구범위를 제한하는 것이 아니며, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 실시예에 대한 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예
<검체 수집>
총 94명의 환자로부터 검체를 수집하였다. 체외로 분리된 냉동 (fresh-frozen) 생검 샘플 (수술조직) 을 실험을 위한 시료로 사용하였다. 시험 참여 전에 환자로부터 서면 동의를 받았으며, 아주대병원의 임상시험심사위원회의 승인 (승인번호: AJIRB-BMR-KSP-18-444)을 받았다. 수집된 검체를 간 섬유화 질환 단계에 따라 구분하면 정상 17개, 간 섬유화 1단계 12개, 2단계 12개, 3단계 25개 및 4단계 28개로, 간 섬유화 질환을 가진 검체는 총 77개였다. 간 섬유화의 단계는 METAVIR 간 섬유화 단계 정의에 따라 구분하였으며, 병리과 전문의에 의해 조직학적 분석으로 섬유화 정도가 평가되었다. 환자로부터 얻어진 데이터를 사용하여 환자의 특징 및 단변량 분석에서 유의성 있는 섬유화와 관련된 변수를 수집하였다.
<임상정보의 통계분석>
94명의 환자 중 간 섬유화 질환을 가진 77개 검체의 환자 임상정보를 단변수 로지스틱 회귀(Univariable Logistic Regression)법으로 분석하여 확인하였으며, 분석 결과는 하기 표 2에 나타냈다.
변수
(Variable)		 환자수
(n)		 coef Odds Ratio se(coef) z P-value lower .95 upper .95
연령
(<55세 vs ≥55세)		 77 -0.0711 0.93 0.5097 -0.139 0.8891 0.34 2.53
성별
(남성 vs 여성)		 77 -0.3600 0.70 0.5878 -0.612 0.5402 0.22 2.24
HBV
(없음 vs 있음)		 74 1.7525 5.77 0.6048 2.898 0.0038 1.76 18.88
HCV
(없음 vs 있음)		 73 15.7653 7027141.58 1696.7344 0.009 0.9926 0.00 Inf
AFP
(<100ng/mL vs ≥100ng/mL)		 77 0.5008 1.65 0.4970 1.008 0.3140 0.62 4.37
표 2를 참조하면, 단변수 회귀분석 결과로 유전자 조합 외에 항목별로 분석한 결과, HBV(Hepatitis B) 존재유무에 따라 간 섬유화 저위험군과 고위험군에서 유의성 있게 상이한 것으로 나타났으며, HBV 또한 진행성 간 섬유화를 구분할 수 있는 것을 확인할 수 있다.
<RNA 추출>
RNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Germany)와 DNase I treatment (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여, 수술 조직 (n=94)으로부터 총 RNA를 추출하였다 (표 1). 총 RNA integrity는 Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)을 사용하여 검증하였으며, 총 RNA 농도는 Nanodrop 2000 (Thermo Fisher scientific, Waltham, MS, USA)을 사용하여 측정하였다.
<유전자 발현 분석>
검체 유전자 발현은 nCounter MAX (Nanostring, Technologies, Seattle, WA, USA)를 이용한 nCounter PanCancer Pathway Panel (Nanostring Technologies, Seattle, WA)을 사용하여 수행하였다. 상기 패널(panel)은 40개의 컨트롤 유전자를 포함한 770개의 유전자를 분석하였으며, 각각의 반응은 15 ㎕ 앨리콧(aliquot) 중의 총 RNA 100 ng 및 리포터 및 캡쳐 프로브를 포함하였다. 데이터 (raw data)의 보정 (Quality control and normalization)은 nSolver Analysis Software v 4.0 (Nanostring Technologies, Seattle, WA, USA)을 사용하여 수행하였다. 분석된 770개 유전자 중 Endogenous 유전자가 730개, Housekeeping 유전자가 40개였으며, 이들 유전자는 nSolver 소프트웨어를 이용하여 표준화(Normalization) 작업이 진행되었다. 표준화를 위한 프로그램의 설정은 Positive Control Normalization에서 Geometric mean을 선택, Range 는 0.3-3으로 하고, CodeSet Content (Reference or Housekeeping) Normalization에서 Standard 로 하여, Codeset Content는 Endogenous 유전자들, Normalization Codes는 Housekeeping 유전자들을 선택하고, Geometric mean을 선택, Range는 0.1-10 으로 설정하였다.
전술한 설정으로 데이터 표준화 작업을 진행하고, 730개 유전자의 표준화된 발현량의 값을 구하였다.
집단의 표본 수가 작아 정규성을 만족하지 못하는 경우 서로 다른 두 집단의 차이를 분석하는 방법인 윌콕슨 순위합 검정(Wilcoxon rank sum test)을 사용하여 평가하였으며, p<0.05를 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다.
로지스틱 회귀 분석은 종속 변수와 독립 변수간의 관계를 구체적인 함수로 나타내어 향후 예측 모델에 사용하기 위한 분석으로 점수화할 수 있는 정량적 변수가 이분형 변수에 미치는 영향을 분석하는 분석 방법이며, p<0.05를 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다.
<간 섬유화 단계에 따른 발현량이 상이한 유전자의 확인>
간 섬유화 1단계 및 2단계를 간 섬유화 저위험군으로, 간 섬유화 3단계 및 4단계를 간 섬유화 고위험군으로 구분하고, 저위험군 및 고위험군 사이에서 유전자 발현에 차이가 있는 유전자를 확인하였다. 간 섬유화 환자 코호트(n=77)에서 저위험군(n=24)및 고위험군(n=53) 간의 상이한 유전자 발현을 분석한 결과, 730개 Endogenous 유전자 중에서 71개 유전자가 통계적으로 유의하게 상이하게 발현된 것으로 나타났다(P<0.05). 상세하게는, 71개 유전자 중 10개 유전자는 저위험군에서보다 고위험군에서 발현이 증가되고, 61개 유전자는 저위험군에서보다 고위험군에서 발현이 감소한 것으로 나타났다. 이 71개 유전자의 일부 통계분석 결과를 하기 표 3에 나타냈다.
SEQ 유전자
(Gene)		 검체수
(n)		 Logistic Regression P-value (FS1,2 vs 3,4) Wilcoxon P-value Fold Change
8 SOX17 77 1.62E-03 4.61E-05 2.09
29 JAK2 77 2.48E-04 8.55E-09 -2.33
37 CSF3R 77 4.26E-05 1.14E-06 -2.59
40 MAPK8IP2 77 3.79E-04 5.68E-03 -2.62
71 MAP3K14 77 2.41E-03 1.26E-07 -6.37
<통계적 조합 유전자 분석 수행>
간 섬유화 단계 진단을 위한 최적 유전자 조합을 찾기 위하여, 간 섬유화 진행 단계에 따라 발현에 차이가 있는 71개 유전자에 대하여 조합 통계분석을 수행하였다. 조합 통계분석은 Logistic Regression 조합 분석, ROC(Receiver Operation Characteristic) 조합 분석 및 Cross Validation 조합 분석(300회 교차분석)을 통해 수행하였다. 여기에서, 각 조합분석은 Single 내지 Combo10으로 하였으며, 이는 조합한 유전자의 수를 의미한다. 상세하게는, Single은 1개 유전자를, Combo10은 10개 유전자를 조합한 것을 의미한다.
본 연구에서의 모든 통계분석은 오픈 소스 통계 프로그램 환경 R 언어(open source statistical programming environment R language)(Version 3.4.3)을 사용하여 수행하였다. 트레이닝 코호트에서, 윌콕슨 순위합 검정(Wilcoxon rank sum test)을 통하여 상이하게 발현되는 유전자(DEGs)를 과발현 혹은 저발현된 것으로 분류하여(p <0.05 및 |폴드-변화(fold-change)| > 2), 저위험군(Fibrosis Stage 1,2)을 고위험군(Fibrosis Stage 3,4)과 비교하였다. DEGs를 추가로 단변량 로지스틱 회귀분석(univariate logistic regression)을 사용하여 선발(shortlist)하였다. 선발된 DEGs의 수를 조합하여 분석하였고, 유전자 조합(gene combinations)의 총 수는 하기 수학식 1을 사용하여 계산하였다.
Figure PCTKR2020018908-appb-M000001
상기 수학식 1에서, n은 선발된 DEGs 총 수이고, k는 조합하여 포함시킨 유전자의 수이다.
다변량 로지스틱 회귀분석(multivariate logistic regression analysis)를 수행하여 유전자 시그니쳐(gene signatures) 및 임상병리학적 특징의 관련성을 측정하였다(p<0.05). 최적 유전자 조합을 구하기 위해 민감도 및 특이도를 구하여 이용하였으며, 이외에, 정확도, 양성 예측도 및 음성 예측도를 함께 구하여 부가적으로 활용하였다.
최적 유전자 조합의 후보 유전자 시그니쳐는 p < 0.05, AUC > 0.800, 민감도(sensitivity) > 80% 및 특이도(specificity) > 80% 조건으로 구하고, k-fold 교차 검증에 의해 계층화하여 최적의 유전자 조합(gene combination)을 동정하였다. AUC가 0.800이하이거나 민감도 및 특이도가 80% 이하에 해당되는 경우에는 그를 활용한 질병의 진단 및 예측에 대한 신뢰도가 저하되는 문제가 있으므로, 우수한 진단 또는 예측을 수행할 수 있는 모델 구축을 위해 전술한 조건으로 최적 유전자 조합을 구하였다. 트레이닝 코호트는 2개의 폴드(트레이닝 세트 및 시험 세트)로 나누어 트레이닝 세트에서의 기준 값을 테스트 세트에 적용하여 결과를 확인하였으며, 트레이닝 세트와 시험 세트의 환자군은 무작위로 나누었고 이를 300회 반복하여 테스트하였다. 정확도는 시험 세트에 대하여 p <0.05를 근거하여 계산하였다.
후보 조합유전자 통계분석 결과, 민감도 92.45%, 특이도 91.67% 및 정확도 92.21%으로, 모든 항목에서 90% 이상의 수치를 만족하여 예측 정확도가 현저히 우수한 조합을 확인하였으며, 그 결과를 표 4에 나타냈다.
유전자조합 유전자수 Logistic Regression Continuous P-value ROC
AUC		 Pre
Vali-
dation
정확도		 Logistic Regression Discrete P-value threshold 민감도 특이도 정확도 양성
예측도		 음성
예측도
CSF3R_JAK2_MAP3K14_MAPK8IP2_SOX17 5 5.80E-04 0.951 77.33 5.68E-08 -8.436595 92.45 91.67 92.21 96.08 84.62
표 4를 참조하면, 조합 통계분석 결과 CSF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 및 SOX17 5개 유전자들을 조합하여 분석하였을 때 민감도, 특이도, 정확도, 예측도가 현저히 높게 나타남을 확인하였다. 또한 5개 유전자의 간 섬유화 단계별 유전자 발현의 분석 결과 통계적으로 유의하게 상이하게 발현되는 것을 확인하였다(p<0.05). 전술한 5개 유전자의 간 섬유화 단계별 발현량을 mRNA 레벨에서 확인한 결과는 도 2에 나타냈다.
도 2를 참조하면, CSF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 및 SOX17 유전자는 정상군과 간 섬유화를 가진 대상에서의 발현이 상이한 것으로 나타났다. 정상군 및 간 섬유화 초기 사이에서 각 유전자별 발현의 변화를 살펴보면, CSF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 및 SOX17 유전자 간 섬유화 초기에서는 정상군에 비해 발현이 증가하는 것으로 나타났다. 간 섬유화 초기 및 후기에 있어서의 각 유전자별 발현의 변화를 살펴보면, CSF3R, JAK2, MAP3K14 및 MAPK8IP2 유전자는 간 섬유화 초기에서보다 후기에서 발현이 저감되는 것으로 나타나고, SOX17 유전자는 초기에서보다 후기에서 발현이 증가되는 것으로 나타났다. 이를 통하여, 전술한 5개 유전자의 발현이 간 섬유화 단계에 따라 상이하게 나타나는 것을 확인할 수 있다.
다음으로 CSF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 및 SOX17 5개 유전자들을 이용하여 Single 내지 Combo5 조합으로 총 31개 조합을 생성하여 유전자 조합별로 정확도, 민감도 및 특이도를 비교하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타냈다. 하기 표 5의 유전자 조합에 있어서, C는 CSF3R, J는 JAK2, M3는 MAP3K14, M8은 MAPK8IP2, S는 SOX17을 약어로 표현한 것이다. 예를 들어, C-J는 CSF3R 및 JAK2의 유전자 조합을 의미한다. 또한, 하기 표 5에 있어서, YI(Youden Index)는 특이도와 민감도 합이 최대가 되는 위치를 찾아 ROC 커브에서 기준값(threshold)를 구하기 위한 것으로, 민감도와 특이도의 합에서 1을 빼는 계산식을 통하여 구하였다. 진단 또는 예측 모델의 평가에 있어서, 민감도와 특이도의 합이 높은 것이 바람직하며, YI는 유전자 조합을 적용한 모델의 우수성을 확인하기 위한 중요한 지표로 활용될 수 있다. ROC의 AUC(Area Under the Curve)는 전체적인 민감도와 특이도의 상관 관계를 보여줄 수 있는 성능 평가 기준으로, 모델의 정확도를 평가하기 위하여 참조하였다.
SEQ 유전자 조합 유전자 수 ROC AUC 민감도 특이도 정확도 YI
1 C-J-M3-M8-S 5 0.951 92.45 91.67 92.21 0.8412
2 J-M3-M8-S 4 0.932 96.23 83.33 92.21 0.7956
3 J-M8-S 3 0.926 96.23 83.33 92.21 0.7956
4 J-M3-S 3 0.925 96.23 79.17 90.91 0.754
5 C-J-M3-S 4 0.932 92.45 83.33 89.61 0.7578
6 J-S 2 0.913 92.45 83.33 89.61 0.7578
7 C-J 2 0.892 98.11 70.83 89.61 0.6894
8 C-J-S 3 0.926 92.45 79.17 88.31 0.7162
9 C-J-M8_S 4 0.945 84.91 91.67 87.01 0.7658
10 M3-M8-S 3 0.894 90.57 79.17 87.01 0.6974
11 C-J-M3 3 0.909 92.45 75 87.01 0.6745
12 C-M3-M8 3 0.886 96.23 66.67 87.01 0.629
13 C-M8 2 0.859 96.23 66.67 87.01 0.629
14 C-M3-M8-S 4 0.932 81.13 95.83 85.71 0.7696
15 C-M3-S 3 0.921 84.91 87.5 85.71 0.7241
16 C-M3 2 0.887 86.79 83.33 85.71 0.7012
17 C-J-M3-M8 4 0.91 90.57 75 85.71 0.6557
18 C-M8-S 3 0.927 84.97 83.33 84.42 0.6824
19 J-M3 2 0.924 84.91 83.33 84.42 0.6824
20 M3-S 2 0.902 84.91 83.33 84.42 0.6824
21 M8-S 2 0.874 86.79 79.17 84.42 0.6596
22 J-M3-M8 3 0.909 81.13 87.5 83.12 0.6863
23 C-S 2 0.906 75.47 91.67 80.52 0.6714
24 C-J-M8 3 0.887 77.36 87.5 80.52 0.6486
25 M3-M8 2 0.829 86.19 66.67 80.52 0.5346
26 J-M8 2 0.885 64.15 95.83 74.03 0.5998
27 S 1 0.792 62.26 91.67 71.43 0.5393
28 M8 1 0.698 79.25 25 62.34 0.0425
29 J 1 0.912 86.79 0 59.74 -0.1321
30 M3 1 0.878 86.79 0 59.74 -0.1321
31 C 1 0.848 86.79 0 59.74 -0.1321
상기 표 5를 참조하면, CSF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 또는 SOX17 5개 유전자를 단독으로 이용하는 경우(seq.27-31)에 비하여, 전술한 유전자군에서 적어도 2종 이상을 함께 이용하는 경우 AUC, 민감도, 특이도, 정확도 및 YI 값이 현저히 증가되는 것으로 나타났다. 민감도, 특이도 및 정확도>80.0 및 AUC>0.8를 만족하는 많은 우수한 유전자 조합이 확인되었으며, CSF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 및 SOX17 5개 유전자들을 모두 조합한 경우(seq.1) AUC 및 YI가 가장 우수한 것을 확인하였다.
<유전자 시그니처 후보의 통계분석을 통한 간 섬유화 예측 점수 도출>
선별된 CSF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 및 SOX17 5개 유전자 조합에 대해서 단변량 로지스틱 회귀분석(Univariate logistic regression)에서 구한 각 유전자별 회귀 계수(Logistic regression coeffieient) 값을 이용하여 간 섬유화 예측 점수(Liver fibrosis prediction score)를 구하였다. 각 유전자별 회귀 계수 값은 하기 표 6에 나타냈다.
SEQ 유전자 회귀계수
1 CSF3R -0.007283
2 JAK2 -0.005178
3 MAP3K14 -0.002994
4 MAPK8IP2 -0.059009
5 SOX17 0.027697
상기 표 6의 유전자별 회귀 계수를 이용한 간 섬유화 예측 점수는 (-0.007283)×CSF3R+(-0.005178)×JAK2+(-0.002994)×MAP3K14+(-0.059009)×MAPK8IP2+0.027697×SOX17의 수식을 통해 계산될 수 있다. 여기에서, 각 유전자는 간 섬유화 진행 정도를 확인하여 위험도를 예측하고자 하는 검사대상 시료에서의 각 유전자의 발현량을 의미하며, 이전 실험단계에서 nCounter assay를 통해 구한 유전자 발현 분석 값의 raw data를 nSolver 4.0 소프트웨어를 사용하여 표준화(Normalization) 작업이 진행된 값이다.
상기 5개 유전자 조합에 대한 ROC 곡선 분석을 통하여 구한 기준값을 활용하여 간 섬유화에 대한 초기 또는 후기 판단이 이루어질 수 있으며, 이를 통하여 간 섬유화 진행 정도에 따른 위험도가 판별되고 후기에 있는 진행성 간 섬유화에 대한 예측이 수행될 수 있다. 상기 기준값을 구하기 위하여 수행된 ROC 곡선 분석 결과는 도 3에 나타냈다.
ROC 곡선 분석을 통해 도출된 기준값(threshold)은 -8.436595인 것으로 확인되었다. 검사대상 시료의 간 섬유화 예측 점수가 상기 도출된 기준값을 초과하는 경우 고위험군, 상기 도출된 기준값보다 작거나 같은 경우 저위험군으로 판별되었으며, 고위험군에 대하여 진행성 간섬유화인 것으로 예측이 수행되었다.
상기 표 6의 회귀 계수 및 상기 도출된 기준값은 본 발명의 일 실시예에서 nCounter assay를 통해 얻은 유전자 발현 분석 값에 기반하여 얻어진 값이며, RNA 발현값을 얻기 위한 측정방법이 본 실시예와 상이하게 되어 얻어진 발현값의 수치가 달라지게 되는 경우에는 그를 통해 얻어지는 회귀 계수 및 기준값도 전술한 수치와 달라질 수 있음은 물론이다.
다변량 분석은 하나의 종속변수에 영향을 미치는 여러 위험인자들의 영향을 서로 보정하여 각 인자들이 실제로 미치는 영향의 정도를 하나의 모형으로 설명한 것으로 이때 얻어지는 Odds Ratio (영향을 미치는 정도)는 다른 변수들의 영향이 모두 보정된 상태의 Odds Ratio 가 된다.
최적의 유전자 조합인 CSF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 및 SOX17 5개 유전자 조합의 유전자 시그니처에 대하여 단변량 분석을 수행한 후 통계적으로 유의한 인자에 대해서 다변량 분석을 수행하였다. 상세하게는, 유전자 시그니처와 HBV 사이의 관련성을 평가하고 그 결과를 표 7 및 8에 나타냈다. 하기 표 7은 유전자 시그니처에 대한 단변량 분석 수행 결과이고, 하기 표 8은 유전자 시그니처 및 HBV에 대한 다변량 분석 수행 결과이다.
변수 n coef Odds Ratio se(coef) z P-value lower .95 upper .95
간 섬유화 예측 점수
(low vs high)		 77 4.9034 134.75 0.9033 5.429 5.68E-08 22.94 791.37
변수 n coef Odds Ratio se
(coef)		 z P-value lower .95 upper .95
간 섬유화 예측 점수
(low vs high)		 74 5.164 174.91
(19.03-1603.36)		 1.130 4.568 4.91E-06 19.08 1603.36
HBV 2.444 11.52
(1.00-132.63)		 1.247 1.961 4.99E-02 1.00 132.63
표 7 및 8을 참조하면, 본 발명의 일 측면에 따라 도출된 유전자 시그니처 및 HBV는 진행성 간 섬유화에 대한 독립적인 예측이 수행 가능한 인자인 것으로 확인되었다. 또한, 유전자 시그니처만으로도 독립적으로 진행성 간 섬유화를 진단할 수 있는 것을 확인하였다.

Claims (15)

  1. CSF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 및 SOX17로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자를 포함하는, 간 섬유화 위험도 예측용 마커 조성물.
  2. CSF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 및 SOX17로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2종의 유전자를 이용하여 유전자 조합을 결정하는 단계;
    결정된 유전자 조합에 포함되는 유전자별 발현 수준을 측정하는 단계;
    회귀분석을 통해 상기 유전자별로 발현 수준에 대한 회귀 계수 값을 구하는 단계; 및
    상기 회귀 계수 값을 이용하여 간 섬유화 예측 점수를 구하는 단계;를 더 포함하는, 간 섬유화 위험도 예측을 위한 정보제공방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 유전자 조합에 대해 ROC 곡선을 통해 기준값을 구하고 상기 간 섬유화 예측 점수 및 상기 기준값을 비교하는 단계를 더 포함하되,
    상기 간 섬유화 예측 점수가 상기 기준값보다 높으면 간 섬유화 위험도가 높은 것으로 판단이 이루어지고 상기 간 섬유화 예측 점수가 상기 기준값보다 낮으면 간 섬유화 위험도가 낮은 것으로 판단이 이루어지는, 간 섬유화 위험도 예측을 위한 정보제공방법.
  4. 제 2항에 있어서,
    상기 유전자 조합은 JAK2, MAP3K14 및 SOX17로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 2종을 포함하는, 간 섬유화 위험도 예측을 위한 정보제공방법.
  5. 제 2항에 있어서,
    상기 유전자 조합은 CSF3R 및 MAP3K14를 포함하는, 간 섬유화 위험도 예측을 위한 정보제공방법.
  6. 제 2항에 있어서,
    상기 유전자 조합은 JAK2, MAPK8IP2 및 SOX17를 포함하는, 간 섬유화 위험도 예측을 위한 정보제공방법.
  7. 제 2항에 있어서,
    상기 유전자 조합은 SOX17를 포함하고 CSF3R, JAK2, MAP3K14 및 MAPK8IP2로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 3종의 유전자를 더 포함하는, 간 섬유화 위험도 예측을 위한 정보제공방법.
  8. CSF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 및 SOX17 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
    로지스틱 회귀분석을 통해 상기 유전자별로 발현 수준에 대한 회귀 계수 값을 구하는 단계; 및
    상기 회귀 계수 값을 이용하여 간 섬유화 예측 점수를 구하는 단계;를 더 포함하는, 간 섬유화 위험도 예측을 위한 정보제공방법.
  9. CSF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 및 SOX17로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 2종의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의하여 암호화되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 간 섬유화 위험도 예측을 위한 정보제공방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    측정된 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 정상군의 발현 수준과 비교하는 단계를 더 포함하는, 간 섬유화 위험도 예측을 위한 정보제공방법.
  11. CSF3R, JAK2, MAP3K14 및 MAPK8IP2로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 2종의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의하여 암호화되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하되,
    측정된 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 정상군의 발현 수준과 같거나 그보다 높은 경우 간 섬유화 위험도가 낮은 것으로 예측하고, 측정된 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 정상군의 발현 수준보다 낮은 경우 간 섬유화 위험도가 높은 것으로 예측하는, 간 섬유화 위험도 예측을 위한 정보제공방법.
  12. CSF3R, JAK2, MAP3K14 및 MAPK8IP2로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 및, SOX17를 포함하는 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의하여 암호화되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하되,
    상기 CSF3R, JAK2, MAP3K14 및 MAPK8IP2로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 측정된 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 정상군의 발현 수준과 같거나 그보다 높은 경우 간 섬유화 위험도가 낮은 것으로 예측하고, 측정된 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 정상군의 발현 수준보다 낮은 경우 간 섬유화 위험도가 높은 것으로 예측하고,
    상기 SOX17 유전자의 측정된 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 정상군의 발현 수준보다 높은 경우 간 섬유화 위험도가 있는 것으로 예측하는, 간 섬유화 위험도 예측을 위한 정보제공방법.
  13. SF3R, JAK2, MAP3K14, MAPK8IP2 및 SOX17로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 2종의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의하여 암호화되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 간 섬유화 위험도 예측용 조성물.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  15. 제 13항에 있어서,
    상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 올리고펩타이드, PNA(peptide nucleic acid), 나노입자 또는 압타머를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
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