KR101671776B1

KR101671776B1 - Asgr1 또는 자칼린을 이용한 간섬유화 또는 간경화 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101671776B1
Application number: KR1020140035425A
Authority: KR
Inventors: 양정원; 김은정; 박성민; 양세란
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2014-03-26
Filing date: 2014-03-26
Publication date: 2016-11-02
Also published as: KR20150111710A

Abstract

본 발명은 ASGR1(Asialoglycoprotein receptor1) 또는 자칼린(jacalin)을 이용한 간섬유화 또는 간경화 치료용 조성물에 관한 것으로, ASGR1을 과발현시키거나 자칼린을 처리했을 때, 활성화된 HSC의 마커인 α-SMA의 발현이 유의적으로 감소하는 것을 확인한바, 본 발명의 조성물은 간 섬유화 또는 간경화 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ASGR1 또는 자칼린을 이용한 간섬유화 또는 간경화 치료용 조성물 {Composition with ASGR1 or jacalin against hepatic fibrosis or hepatic cirrhosis}

본 발명은 간 섬유화 또는 간경화 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 ASGR1 또는 자칼린을 이용한 간섬유화 또는 간경화 치료용 조성물에 관한 것이다.

간 섬유화는 일반적으로 알코올, 콜레스테롤, 자가면역 등에 의한 간세포 손상에서부터 시작된다. 손상된 간세포 주위로 다양한 염증세포들이 모이게 되고, 이들이 분비하는 PDGF(platelet-derived growth factor), TGF-β(Transforming growth factor beta) 등의 인자들에 의해서 휴지 상태에 있던 HSC(hepatic stellate cell)이 활성화된다.

활성화된 HSC는 α-SMA(alpha smooth muscle actin)를 발현하는 증식성의 근섬유모세포(myofibroblast)로 바뀌게 되며, 근섬유모세포는 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin) 등과 같은 다양한 ECM(extra cellular matrix) 성분들을 분비해서 간의 섬유화를 유도한다. 간 섬유화가 계속 진행되면 간경화에 이르게 되고 간암이 유발될 확률이 높아진다.

현재 간질환 환자는 전 세계적으로 8억 명에 이르고 있고, 국내의 경우 간질환은 암을 제외한 사망요인 4위에 해당하는 난치성 질환으로 분류되고 있다. 중증 간질환의 가장 효과적인 치료 방법은 간 이식이지만 간 공여자의 희소성, 높은 수술 비용 등의 문제로 인해서 실제로 간 이식이 이루어지는 경우는 극히 제한적이다.

최근 이러한 문제점을 극복하기 위해서 높은 증식능력을 갖는 줄기세포에서 분화시킨 간세포를 간 이식 대신 사용할 수 있을 것이라고 기대되고 있지만, 이 또한 생체 내에서의 생존율이 낮고 면역거부반응을 일으킬 수 있는 위험이 있어서 큰 치료효과를 기대하기 어려운 실정이다.

한편, ASGR1(Asialoglycoprotein receptor1)은 간세포에 특이적으로 존재하는 세포막 단백질로, 간세포 내에서 헤파티티스 B (hepatitis B)를 포함한 바이러스의 감염을 유발하거나, 간에 특이적인 약물 수송체 (drug delivery)의 타겟(target)으로 작용한다.

또한, 잭프루트(jackfruit)에 존재한다고 알려진 자칼린(jacalin)은 ASGR1와 마찬가지로 렉틴(lectin)을 기반으로 하는 단백질인데, 사람의 혈청에 있는 IgG 또는 인간 플라스마 글리코프로테인 (human plasma glycoproteins)을 분리하는데 이용된다.

본 발명에서는 상기에서 설명한 ASGR1 또는 자칼린을 이용하여 간의 섬유화 또는 간경화를 감소시킬 수 있는지 확인해 보고자 하였다.

대한민국 특허등록번호 제10-0445640호 (등록일자 2004. 08. 13)에는, 간섬유증 및 간경화 치료에 유효한 양의 부테인(butein)을 함유하는 감섬유증 및 간경화 치료제 조성물이 기재되어 있다. 또한, 대한민국 특허공개번호 제10-2007-0062426호 (공개일자 2007. 06. 15)에는, EPO(erythropoietin)을 유효성분으로 함유하는 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 기재되어 있다.

본 발명에서는 활성화된 HSC 세포주인 LX-2에 ASGR1을 과발현시키거나 자칼린을 처리했을 때 활성화된 HSC의 마커인 α-SMA의 발현이 유의적으로 감소하는 것을 확인했다.

이를 바탕으로 본 발명에서는 ASGR1의 과발현 또는 자칼린을 이용한 간섬유화 또는 간경화 치료용 조성물을 개발하여 제공하고자 한다.

본 발명은 제1형태로, ASGR1(Asialoglycoprotein receptor1)을 암호화하는 유전자 또는 ASGR1 단백질을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 간섬유화 또는 간경화 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 ASGR1(Asialoglycoprotein receptor1) 유전자는 시퀀스가 이미 공지되어 있기 때문에 GenBank(NCBI) 등에서 그 서열을 확인할 수 있고, ATCC를 통해서 해당 유전자 또는 그 유전자가 삽입된 벡터를 입수할 수 있다. 또한, ASGR1 단백질은 ASGR1(Asialoglycoprotein receptor1) 유전자를 발현시켜 수득할 수 있다.

한편, 상기 본 발명의 제1형태 간섬유화 또는 간경화 치료용 조성물에 있어서, 상기 ASGR1(Asialoglycoprotein receptor1)을 암호화하는 유전자는, 바람직하게 벡터에 삽입되어 있는 것일 수 있다. 이때, 상기 벡터는 일 예로 바이러스 삽입용 벡터일 수 있다.

ASGR1을 암호화하는 유전자를 벡터에 삽입한 후, 바이러스에 도입할 수 있는데, 이 바이러스를 활성화된 HSC(hepatic stellate cell)에 감염시킬 경우, 해당 유전자가 HSC 내에서 발현되어, HSC의 활성화를 억제시키는 결과 간섬유화 또는 간경화 진행을 억제시킬 수 있는 것이다. 해당 유전자의 벡터 삽입, 바이러스로의 도입, 이 바이러스를 이용한 HSC의 감염 등은 공지의 유전공학적 또는 의학적 기술을 이용할 수 있으므로, 구체적인 기재는 생략하기로 한다.

한편, 본 발명은 제2형태로 자칼린(jacalin)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 간섬유화 또는 간경화 치료용 조성물을 제공한다. 자칼린은 일 예로, 잭프루트(jackfruit)로부터 수득할 수 있다.

한편, 본 발명의 제1형태 또는 제2형태에 있어서, 상기 간섬유화 또는 간경화 치료용 조성물은, 일 예로 간성상세포(hepatic stellate cell)의 활성화 및 증식을 억제함으로써, 간섬유화 또는 간경화 치료 효능을 보일 수 있다.

한편, 본 발명의 제1형태 또는 제2형태에 있어서, 상기 간섬유화 또는 간경화 치료용 조성물은, 일 예로 염증에 의해 감염된 간 조직 및 간세포의 손상을 회복시킬 수 있다.

한편, 본 발명의 제1형태 또는 제2형태에 있어서, 상기 조성물은 일 예로, 약학 조성물일 수 있다. 이때, 상기 약학 조성물은 바람직하게 주사제 또는 경구용 약제일 수 있다.

본 발명의 간섬유화 또는 간경화 치료용 조성물에서ASGR1(Asialoglycoprotein receptor1) 단백질 또는 자칼린의 유효량은 투여방법, 제제형태, 환자의 나이, 환자의 체중, 환자의 감수성 및 질환의 상태에 따라 적절하게 선택될 수 있으며, 구체적으로 한정하는 것은 아니지만, 일반적으로 ASGR1 단백질 또는 자칼린을 1~2,000㎎/㎏체중의 농도로 투여되도록 제형화할 수 있다. 다만, 유효성분의 투여량이 상기 범위를 벗어날 수도 있다.

ASGR1 단백질 또는 자칼린을 상기한 범위 내로 투여하기 위한 제제는 통상의 형태를 가질 수 있는데, 예를 들면 알약, 캅셀 등의 경구용 약제나 주사제 등의 형태일 수 있다. 이들을 경구 또는 각종의 비경구 투여 경로를 통해 간섬유화 또는 간경화 치료의 목적으로 투여할 수 있는데, 제형에 따라 당업계에 널리 알려진 적합한 각종의 부형제, 담체 또는 희석제 등을 함유할 수 있다.

본 발명에 의할 경우, ASGR1을 과발현시키거나 자칼린을 처리했을 때, 활성화된 HSC의 마커인 α-SMA의 발현이 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 조성물은 간섬유화 또는 간경화 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에서 제작한 ASGR1와 GFP를 발현하는 렌티바이러스 벡터의 맵이다.
도 2는 ASGR1 바이러스 제작 및 트랜스펙션의 효율 확인시켜 주는 결과로, 293T 세포에 ASGR1 벡터 또는 pMIRNA1 (Mock)을 패키징 플라스미드 (pLP1, pLP2, pLP/VSVG)와 함께 트랜스펙션시켜서 바이러스를 만든 후, 형광현미경으로 GFP가 발현하는 것을 확인시켜 주는 사진이다.
도 3은 바이러스 감염 효율을 확인시켜 주는 결과로, ASGR1 바이러스와 pMIRNA1 (Mock) 바이러스를 HDF에 감염시킨 후 형광현미경으로 GFP의 발현을 확인시켜 주는 사진이며, 웨스턴 블랏팅을 통해 ASGR1이 ASGR1 바이러스를 감염시킨 HDF에서만 발현하는 것을 확인시켜 준다.
도 4는 LX-2에 ASGR1 바이러스와 자칼린(Jacalin)이 미치는 효과를 확인시켜 주는 결과로, LX-2에 ASGR1 바이러스를 감염시키거나 자칼린을 처리한 후, RT-PCR을 통해 α-SMA의 발현이 ASGR1 바이러스를 감염시키거나 자칼린을 처리한 LX-2에서 유의적으로 감소하는 것을 확인시켜 준다.

알코올, 콜레스테롤 등으로 인해 간 손상이 발생하면 손상된 간세포 주변으로 다양한 염증세포들이 모이게 되며, 이들이 분비하는 PDGF, TGF-β등으로 인해 HSC가 활성화된다. 활성화된 HSC는 ECM 성분들과 콜라겐의 분해를 막는 다양한 효소들을 분비해서 간 섬유화를 유도한다.

만일 간 손상을 일으키는 원인물질들이 제거되면 활성화된 HSC는 다시 휴지상태의 HSC로 돌아가지만, 그렇지 않을 경우 계속 HSC가 활성화된 상태로 유지되면서 점차 간 섬유화가 진행되고 더 악화되어서 간경화와 간암이 유발될 확률이 높아진다.

본 발명자들은 간 섬유화의 주요 원인인 HSC의 활성화를 막기 위해서 렌티바이러스 벡터 (lentivirus vector)인 pMIRNA1을 이용해서 간에 특이적으로 존재하는 세포막 단백질인 ASGR1을 과발현하는 벡터를 제작하였으며, ASGR1 바이러스를 293T와 HDF에 각각 트랜스펙션(transfection), 감염(infection)시켜서 ASGR1 바이러스의 효율을 확인했다.

한편, ASGR1과 함께 사용된 자칼린(jacalin)은 잭프루트 (jackfruit)에 존재한다고 알려진 단백질로 ASGR1와 마찬가지로 렉틴(lectin) 기반으로 하고 있다.

본 발명에서는 활성화된 HSC 세포주인 LX-2에 ASGR1의 과발현 또는 자칼린 처리가 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위해서 LX-2에 ASGR1을 과발현시키거나, 자칼린을 처리한 뒤 RT-PCR을 통해서 HSC의 활성화 마커인 a-SMA의 mRNA 발현량을 확인해 보았다.

그 결과, 대조군(control)에 비해서 ASGR1을 과발현시키거나 자칼린을 처리한 LX-2에서, α-SMA의 mRNA 발현량이 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, ASGR1과 자칼린이 간의 섬유화를 억제시킬 수 있을 것으로 여겨진다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[ 실시예 1: ASGR1 발현 벡터 제작]

(1) 실험 재료 및 방법

본 실험에서 사용된 인간 유래 ASGR1 cDNA 플라스미드 (MGC-29585)는 ATCC에서 구입하였다. PCR을 이용해서 앞, 뒤에 각각 EcoR1과 Not1이 달린 인간 유래 ASGR1 cDNA를 얻은 후, TOPcloner^TM Blunt core kit (enzynomics, 대전, 한국)를 이용해서 ASGR1 과 T-벡터를 라이게이션하였다.

라이게이션한 산물(product)를 HIT-DH5α (RBC Biosience Crop, 대만)에 트랜스포메이션(transformation) 한 뒤, 다음날 생성된 콜로니를 LB 배지에서 증폭시킨 후 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Mini Extraction Kit (Bioneer, 대전, 한국)을 이용해서 플라스미드 DNA를 추출했다.

추출한 플라스미드 DNA와 GFP를 발현하는 렌티바이러스 벡터 (lentivirus vector)인 pMIRNA1(한양대학교 김형범 제공)에 EcoR1과 N ot1를 37℃에서 2시간 처리한 후, T4 DAN 라이게이즈(ligase)를 이용해서 라이게이션한 다음, DH5α에 트랜스포메이션했다.

다음날, 콜로니를 LB 배지에서 증폭한 뒤, DNA를 추출해서 ASGR1와 GFP를 동시에 발현하는 렌티바이러스 벡터를 얻었다.

(2) 실험 결과

상기와 같은 실험으로부터, 인간에서 유래한 ASGR1 cDNA를, GFP를 발현하는 렌티바이러스 벡터 (lentivirus vector)인 pMIRNA1에 삽입하여 ASGR1와 GFP를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 제작했다 (도 1).

도 1은 본 발명에서 제작한 ASGR1와 GFP를 발현하는 렌티바이러스 벡터의 맵이다.

[ 실시예 2: ASGR1 바이러스 제작 및 트랜스펙션 효율 확인]

(1) 실험 재료 및 방법

본 실험에서 사용된 pMIRNA1, pLP1, pLP2 그리고 pLP/VSVG 플라스미드는 한양대학교 김형범로부터 제공받아 사용하였다.

100mm 세포 배양 접시에 293T 세포를을 10⁵/cm²으로 해동한 뒤, 다음날 배지(DMEM high glucose, 10% FBS, 1% P/S)를 제거하고, P/S가 들어있지 않은 배지를 9ml 씩 넣었다.

1.5ml 튜브 2개에 각각 'DMEM high glucose'를 200ul (tubeA), 800u l(tubeB)씩 넣고, tubeA에는 리포펙타민(lipopectamine) 2000 시약 (invitrogen, 미국) 52ul, tubeB 에는 pLP1 4ug, pLP2 4ug, pLP/VSVG 2ug, ASGR1 6ug 를 각각 넣었다. Mock의 경우, ASGR1 대신 pMIRNA1을 넣었다.

5분 후, tubeA와 tubeB를 섞고 20분 후 접시에 한 방울씩 떨어뜨렸다. 트랜스펙션(transfection) 48시간 후, 형광현미경으로 GFP 발현을 확인한 뒤, 바이러스가 들어있는 상등액을 회수해서 0.45um 필터로 여과한 후 -70℃에서 보관했으며, 상등액 회수는 총 3일간 수행했다.

(2) 실험 결과

상기에서 살펴본 바와 같이, 리포펙타민 2000 (Lipopectamine 2000) 시약을 이용해서, 293T 세포에 타겟 플라스미드 (target plasmid)인 ASGR1 벡터 또는 pMIRNA1와 패키징 플라스미드 (packaging plasmids)인 pLP1, pLP2, pLP/VSVG를 트랜스펙션시켜서 바이러스를 만들었다.

형광현미경으로 확인 결과, ASGR1와 Mock 모두에서 GFP가 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (도 2).

도 2는 ASGR1 바이러스 제작 및 트랜스펙션의 효율 확인시켜 주는 결과로, 293T 세포에 ASGR1 벡터 또는 pMIRNA1 (Mock)을 패키징 플라스미드 (pLP1, pLP2, pLP/VSVG)와 함께 트랜스펙션시켜서 바이러스를 만든 후, 형광현미경으로 GFP가 발현하는 것을 확인시켜 주는 사진이다.

[ 실시예 3: 바이러스 감염 효율 확인 및 LX -2에 ASGR1 바이러스와 자칼린이 미치는 효과 확인]

(1) 실험 재료 및 방법

HDF(Human dermal fibroblast) 또는 활성화되어 있는 HSC(hepatic stellate cell) 세포주 LX-2를 6웰 세포 배양 플레이트에 해동한 뒤, 세포가 약 40-50% 정도 차면 배지(DMEM high glucose, 10% FBS, 1% P/S)를 제거하고, ASGR1 / Mock 바이러스를 3ml씩 접시에 넣어서 세포에 감염시켰다.

다음날도 같은 방법으로 감염시켰다. 마지막 감염 다음날 신선한 배지로 바꿔준 뒤 72시간 후에 형광현미경으로 GFP의 발현을 확인한 후, RNA와 단백질을 추출했다. 자칼린의 경우, 25ug/ml로 LX-2에 처리한 뒤, 48시간 후에 RNA를 추출했다.

RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction)을 위해, 우선 바이러스를 감염시킨 LX-2에서 Trizol (Invitrogen, 미국)을 이용해서 RNA를 추출한 후, Maxime RT PreMix Kit (iNtRON Biotechnology, 경기, 한국)을 사용해서 cDNA로 합성했다. 합성한 cDNA는 RT-PCR kit (Bioneer, 대전, 한국)을 사용해서 증폭시킨 뒤, 1% 아가로스 겔에 로딩해서 확인했다.

웨스턴 블랏팅 (western blotting)을 위해, 우선 바이러스를 감염시킨 HDF에서 RIPA 버퍼를 이용해 단백질을 추출한 뒤, PierceBCA Protein Assay Kit (Thermo, 미국)을 사용해서 정량했다. 10% SDA-PAGE에 단백질을 30ug씩 로딩한 뒤 electrophoresis power supply (Bio-Rad, 미국)을 이용해서 100V에서 런닝한 후, 50V에서 2시간 30분 nitrocellulose membrane (Bio-Rad, 미국)에 트랜스퍼했다. 단백질이 트랜스퍼된 멤브레인을 5% 스킴 밀크 (skim milk)로 상온에서 1시간 블라킹(blocking)한 뒤, ASGR1/2와 goat anti-rabbit IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 각각 상온에서 2시간, 1시간 반응시킨 후, Pierce ECL Western Blotting substrate (Thermo, 미국)에 노출시켜서 현상했다.

(2) 실험 결과

상기에서 살펴본 바와 같이, ASGR1 바이러스의 감염 효율을 확인하기 위해서 HDF(human dermal fibroblast)에 ASGR1 바이러스를 감염시킨 후, 형광현미경으로 GFP의 발현을 확인한 결과, ASGR1과 Mock 모두에서 GFP가 발현하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 상기에서 살펴본 바와 같이 HDF에서 단백질을 추출한 뒤, mRNA와 단백질 수준에서의 ASGR1 발현량을 확인해 본 결과, Mock과 대조군에서는 ASGR1이 발현되지 않는 반면에 ASGR1 바이러스를 감염시킨 HDF에서는 ASGR1이 발현하는 것을 확인할 수 있었다 (도 3).

도 3은 바이러스 감염 효율을 확인시켜 주는 결과로, ASGR1 바이러스와 pMIRNA1 (Mock) 바이러스를 HDF에 감염시킨 후 형광현미경으로 GFP의 발현을 확인시켜 주는 사진이며, 웨스턴 블랏팅을 통해 ASGR1이 ASGR1 바이러스를 감염시킨 HDF에서만 발현하는 것을 확인시켜 주는 결과이다.

한편, 상기에서 살펴본 바와 같이, 활성화되어 있는 HSC(hepatic stellate cell) 세포주인 LX-2에 ASGR1 바이러스를 감염시키거나 자칼린(Jacalin)을 처리한 후, 활성화된 HSC의 마커인 α-SMA의 mRNA 발현 수준을 RT-PCR을 통해서 확인해 보았다.

RT-PCR 결과, ASGR1의 mRNA는 ASGR1 바이러스를 감염시킨 세포에서만 발현됨을 확인할 수 있었으며, α-SMA의 mRNA는 ASGR1을 감염시키거나 자칼린을 처리한 세포에서 발현이 대조군(control) 보다 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다 (도 4).

도 4는 LX-2에 ASGR1 바이러스와 자칼린(Jacalin)이 미치는 효과를 확인시켜 주는 결과로, LX-2에 ASGR1 바이러스를 감염시키거나 자칼린을 처리한 후, RT-PCR을 통해 α-SMA의 발현이 ASGR1 바이러스를 감염시키거나 자칼린을 처리한 LX-2에서 유의적으로 감소하는 것을 확인시켜 준다.

Claims

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자칼린(jacalin)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 간섬유화 또는 간경화 치료용 약학 조성물.
제4항에 있어서,
상기 간섬유화 또는 간경화 치료용 약학 조성물은,
간성상세포(hepatic stellate cell)의 활성화 및 증식을 억제함을 특징으로 하는 간섬유화 또는 간경화 치료용 약학 조성물.
제4항에 있어서,
상기 간섬유화 또는 간경화 치료용 약학 조성물은,
염증에 의해 감염된 간 조직 및 간세포의 손상을 회복시킴을 특징으로 하는 간섬유화 또는 간경화 치료용 약학 조성물.
삭제
제4항에 있어서,
상기 약학 조성물은,
주사제 또는 경구용 약제인 것을 특징으로 하는 간섬유화 또는 간경화 치료용 약학 조성물.