WO2021262043A1 - Метод и реактивы для детекции активности люциферазы - Google Patents

Метод и реактивы для детекции активности люциферазы Download PDF

Info

Publication number
WO2021262043A1
WO2021262043A1 PCT/RU2021/050186 RU2021050186W WO2021262043A1 WO 2021262043 A1 WO2021262043 A1 WO 2021262043A1 RU 2021050186 W RU2021050186 W RU 2021050186W WO 2021262043 A1 WO2021262043 A1 WO 2021262043A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
luciferase
independently selected
biological sample
compound according
compound
Prior art date
Application number
PCT/RU2021/050186
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Илья Викторович ЯМПОЛЬСКИЙ
Original Assignee
Илья Викторович ЯМПОЛЬСКИЙ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from RU2020121381A external-priority patent/RU2826202C2/ru
Application filed by Илья Викторович ЯМПОЛЬСКИЙ filed Critical Илья Викторович ЯМПОЛЬСКИЙ
Publication of WO2021262043A1 publication Critical patent/WO2021262043A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C409/00—Peroxy compounds
    • C07C409/02—Peroxy compounds the —O—O— group being bound between a carbon atom, not further substituted by oxygen atoms, and hydrogen, i.e. hydroperoxides
    • C07C409/04—Peroxy compounds the —O—O— group being bound between a carbon atom, not further substituted by oxygen atoms, and hydrogen, i.e. hydroperoxides the carbon atom being acyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C57/00—Unsaturated compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C57/02—Unsaturated compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms with only carbon-to-carbon double bonds as unsaturation
    • C07C57/03—Monocarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D309/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings
    • C07D309/32—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
    • C07H15/10—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical containing unsaturated carbon-to-carbon bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase

Definitions

  • the present invention relates to biology, chemistry and biotechnology, in particular to the bioluminescent system of the Chaetopterus variopedatus worm.
  • Bioluminescence is the process of light emission by living organisms in the course of a biochemical reaction, in which chemical energy is converted into light energy.
  • the ability to bioluminescence is determined by the presence of a specific protein luciferase or photoprotein. Luciferases are enzymes that catalyze the oxidation of low molecular weight compounds - luciferins, converting them into oxyluciferins. Oxidation is accompanied by the release of light and the release of oxyluciferin.
  • the ability to bioluminescence is possessed by organisms belonging to the most different systematic groups. The mechanisms of known bioluminescent reactions are very diverse.
  • Marine polychaetes of the species Chaetopterus variopedatus are widespread in various parts of the ocean, including the coasts of New Zealand, Australia, Japan, and Brazil. It is a filter worm that lives in shallow water in a U-shaped tube, both ends of which protrude from the seabed. Under physical stress, the worm emits a flash of blue color and secretes glowing blue mucus when exposed to more aggressive action, indicating that the worm's nervous system controls its luminescent activity (Jeremy D. Mirza et al, Photochem. & Photobiol. Photochemistry and Photobiology. 2020, 10.1111 / php.13221).
  • bioluminescent systems luciferases, photoproteins, luciferins, etc.
  • proteins of the aquorin family are widely used to study the release and binding of Ca 2+ in biological systems, for example, during muscle contraction.
  • bioluminescent systems is described in detail, for example, in Cormier, ML et al., Photochem. & Photobiol. 49/4, 509-512 (1989), Smith, DF et al. in "Bioluminescence and Chemiluminescence: Current Status (P. Stanley & L. Krick, eds.), John Wiley and Sons, Chichester, UK 1991, 529-532.
  • the objective of the present invention is to establish the components of the bioluminescence system of the worm Chaetopterus variopedatus, in particular, to identify the substrate molecules of the bioluminescent reaction (luciferins), as well as to develop a method for detecting luciferase in a biological sample using luciferins of the worm Chaetopterus variopedatus and a method for detecting bioluminescence bioluminescence by means of the bioluminescence reaction Chaetopterus variopedatus.
  • luciferins bioluminescent reaction
  • the technical result consists in expanding the arsenal of technical means in the field of application of bioluminescent systems and is achieved by identifying the molecules of the bioluminescent reaction substrates (luciferins) of the Chaetopterus variopedatus worm, the oxidation of which is accompanied by the emission of light.
  • bioluminescent reaction substrates luciferins
  • These components of the boluminescent system of the Chaetopterus variopedatus worm are promising for use as reagents for a variety of analyzes, including diagnostic systems, quality control systems, drug testing systems, etc.
  • the present invention provides a worm luciferin molecule, namely (10E, 122) -9-hydroperoxyoctadecadenoic acid, characterized by the following structural formula:
  • the present invention also includes the use of compounds of general formula (I) or general formula (II) as a substrate for the enzyme luciferase (luciferin), the oxidation of this molecule leads to the appearance of light.
  • luciferase luciferin
  • Gly is a carbohydrate moiety of a monosaccharide
  • Polyol is independently selected and is a polyhydric alcohol
  • Acyl is independently selected and is a polyunsaturated fatty acid hydroperoxide characterized by the following structural formula: where n is independently selected and represents 0-3; x is independently selected and represents 1-5; m is independently selected and represents 1-6; y is independently selected and represents 0-7. s In particular embodiments of the invention, the polyhydric alcohol is independently selected and is a diol or a triol.
  • the carbohydrate moiety is aldopentose, aldohexose, ketopentose, or ketohexose.
  • the carbohydrate moiety is ribose, xylose, mannose, galactose, glucose, allose, ribulose, xylulose, fructose, or sorbose.
  • the present invention provides a worm luciferin molecule, namely a molecule 1 -rHflpoKCH-3 - (((2R, 3R, 4S, 5R, 6R) -3,4,5-TpnrHflpoKCH-6- (hydroxymethyl) tetrahydro- 2 ⁇ -pyran-2-yl) oxy) propan-2-yl (42.8E, 102) -7-hydroperoxyhexadeca-4,8,10-trienoate, also called 7-hydroperoxide 2-glycerol ⁇ -0-galactopyranoside (42 , 8E, 102) -hexadecatrienoate, characterized by the following structural formula: and / or its regioisomer 2-rHflpoKCH-3 - (((2R, 3R, 4S, 5R, 6R) -3,4,5-TpnrHflpoKCH-6- (hydroxymethyl) tetra
  • the present invention also includes the use of compounds of general formula (III) as a substrate for the enzyme luciferase (luciferin), the oxidation of this molecule leads to the appearance of light.
  • the present invention also includes a compound of general formula (IV): formula (IV), or a tautomer, stereoisomer or enantiomer, pharmaceutically acceptable salt, solvate or hydrate thereof, where: n is independently selected and represents 2-8; x 'is independently selected and represents 1-7; m is independently selected and represents 1-6.
  • the present invention also includes the use of compounds of general formula (IV) as a precursor of luciferin (preluciferin).
  • the present invention also includes a kit for detecting luciferase in a biological sample comprising the luciferin of the invention.
  • the kit further comprises a buffer, glycerol, and iron (II) salts.
  • kit components are contained in acceptable amounts.
  • the present invention also includes a bioluminescent composition comprising luciferase and at least one compound of the present invention.
  • the luciferase is recombinant.
  • the luciferase is a Chaetopterus variopedatus worm luciferase.
  • the present invention also provides a method for detecting (detecting) luciferase in a biological sample, comprising luciferase and / or lipoxygenase, and at least one compound of the invention.
  • the luciferase is a Chaetopterus variopedatus worm luciferase.
  • the luciferase is a recombinant luciferase.
  • the biological sample is a tissue and / or a cell.
  • the biological sample has a pH in the range of 7 to 8.
  • the lipoxygenase is a recombinant lipoxygenase.
  • the method for detecting luciferase includes the following steps: a) adding a compound of the invention to a biological sample to obtain a reaction mixture; b) incubating the reaction mixture under conditions suitable for the onset of bioluminescence; c) detection of bioluminescence in the reaction mixture.
  • the concentration of the compound of the invention is 0.03-300 ⁇ M.
  • the luciferase is a recombinant luciferase.
  • the luciferase is a Chaetopterus variopedatus worm luciferase.
  • the biological sample is a tissue and / or a cell.
  • the biological sample has a pH in the range of 7 to 8.
  • the lipoxygenase is a recombinant lipoxygenase.
  • a method for detecting bioluminescence includes the following steps: a) expression of a luciferase gene in a biological sample; b) adding a compound of the invention to a biological sample; c) detection of bioluminescence.
  • the concentration of the compound of the invention is 0.03-300 ⁇ M.
  • the present invention provides reagents and reagent kits for implementing the methods of the present invention.
  • the present invention also includes the preparation of compounds of the invention.
  • Figure 1 The result of measuring the bioluminescence of Chaetopterus variopedatus luciferin, initiated by the injection of ferrous iron in time. Data are in logarithmic units.
  • Figure 4 Structures of luminescent-active compounds isolated from the biomass of the alga Chaetomorpha Nnit, established using NMR spectroscopy and HPLC-MS.
  • Figure 5 The dependence of the intensity of bioluminescence on the amount of the drug luciferin.
  • Figure 7 Kinetics of bioluminescent reaction of synthetic 9-, 10-, 12- and 13-hydroperoxides of octadecadienic (linoleic) acid ( 1 Og) and 9-, 10-, 12- and 13-hydroperoxides 1-oxopropylf-0-galactopyranoside (92,122 ) -octadecadienoate obtained by oxidation with singlet oxygen generated in the presence of methylene blue.
  • 1 ⁇ l luciferase fraction 1 mg / ml +1 ⁇ l 100 ⁇ M FeSCU + 1 ⁇ l 0.06 mM substrate solution in methanol.
  • Figure 8 Kinetics of bioluminescence reaction (logarithmic scale) of synthetic 9-, 10-, 12- and 13-hydroperoxides of octadecadienic (linoleic) acid ( 1 Og) and hydroperoxides of 2- and 3-glycerolph-0-galactopyranoside (97,127) -octadecadienoate obtained by oxidation with singlet oxygen generated in the presence of methylene blue.
  • 1 ⁇ l luciferase fraction 1 mg / ml +1 ⁇ l 100 ⁇ M FeSCU + 1 ⁇ l 0.3 ⁇ M substrate solution in methanol.
  • Figure 9 Kinetics of bioluminescence reaction (logarithmic scale) of synthetic 9-, 10-, 12- and 13-hydroperoxides of octadecadienic (linoleic) acid ( 1 Og) and analogs conjugated with fluorescent dyes obtained by oxidation with singlet oxygen generated in the presence of methylene blue ( MG).
  • 1 ⁇ l luciferase fraction 1 mg / ml +1 ⁇ l 100 ⁇ M FeSCU + 1 ⁇ l 0.3 ⁇ M substrate solution in methanol.
  • bioluminescence or “luminescence” as used herein means the process of emitting light resulting from a reaction between an enzyme and a substrate that generates light.
  • luciferin in this document means a compound that is a substrate for luciferase enzymes.
  • luciferase means a protein that has the ability to oxidize luciferin, where the oxidation reaction is accompanied by the release of light (luminescence) and the release of oxidized luciferin.
  • a "luciferase reaction mixture” contains the enzyme luciferase and materials that will enable the enzyme luciferase to generate a light signal.
  • the materials required and the specific concentrations and / or amounts of materials required to generate the luminescent signal will vary depending on the luciferase enzyme used as well as the type of luciferase assay being performed.
  • these materials may include: buffer to maintain the reaction at the correct pH, the Chaetopterus variopedatus luciferase enzyme, luciferin, and iron (II) salts.
  • a typical luciferase reaction mixture may contain Chaetopterus variopedatus luciferase, 50 mM sodium phosphate buffer pH 7.4 , 5% glycerol, 100 ⁇ M FeSCU.
  • a "luciferase detection mixture” contains materials that will allow the enzyme luciferase to be detected.
  • the materials required and the specific concentrations and / or amounts of materials required to generate the luminescent signal will vary depending on the luciferase enzyme used as well as the type of luciferase assay being performed.
  • these materials may include: reducing agents, detergents, salts, glycerol, amino acids, luciferase substrate - luciferin. Often other materials may be added to the solution, including: salts, glycerol, amino acids, etc.
  • a typical mixture for detecting luciferase may contain a luciferase substrate, luciferin.
  • the Chaetopterus variopedatus worm according to the present invention and / or its functional analog 50 mM sodium phosphate buffer pH 7.4, 100 ⁇ M FeSCU.
  • isolated means a molecule or cell that is in an environment other than the environment in which the molecule or cell naturally occurs.
  • these components can be in substantially purified form.
  • a substantially purified form means that the proteins are at least about 20% pure, often at least 30% pure, usually 50% pure, or at least 90% pure.
  • any of the conventional protein purification techniques described, for example, in Guide to Protein Purification, (Deuthser ed.) (Academic Press, 1990) can be used.
  • a lysate or protein preparation can be prepared from the original source and purified using HPLC, size exclusion chromatography, gel electrophoresis, affinity chromatography, and the like. Protein preparations can be tested for the presence of active luciferase or a luciferase-luciferin complex using the methods of the present invention.
  • mutant refers to a protein (particularly luciferase) disclosed in the present invention in which one or more amino acids have been added and / or substituted and / or removed (deleted) and / or inserted (inserted) at the N-terminus and / or C-terminus, and / or within the native amino acid sequences of the proteins of the present invention.
  • mutant refers to a nucleic acid molecule that encodes a mutant protein.
  • mutant herein refers to any variant that is shorter or longer than a protein or nucleic acid.
  • modifications, additions or deletions can also be introduced by a method including recombination, recursive sequence recombination, DNA mutagenesis by phosphothioate modification, mutagenesis based on the inclusion of a template containing uracil, mutagenesis based on a duplex containing gaps, repair mutagenesis with point mismatching mismatches using a repair-deficient host strain, chemical mutagenesis, radiogenic mutagenesis, deletion mutagenesis, mutagenesis using restriction of selection, mutagenesis using restriction of purification, artificial gene synthesis, matched mutagenesis, creation of a chimeric nucleic acid multimer, or a combination thereof.
  • the term “functional” means that a nucleotide or amino acid sequence can function for a specified test or task.
  • the term “functional” as used to describe luciferases means that a protein has the ability to produce a luminescent oxidation reaction of luciferin.
  • alkyl in this document means both unbranched and branched. In addition, “alkyl” can be either substituted or unsubstituted.
  • alkyl refers to groups typically having one to ten carbon atoms.
  • -Cmo-alkyl means methyl, ethyl, isopropyl, n-propyl.
  • aryl as used herein means groups containing an aromatic ring having from six to twenty carbon atoms, and the aryl may be mono, di, tri, or tetracyclic.
  • halogen in particular, chlorine, bromine, fluorine
  • - C 0, phenyl, phenyl -UNON.
  • An example of aryl groups would be: , phenyl.
  • the implementation of the methods of the present invention provides the appearance of luminescence of the reaction mixture containing the biological sample, if the specified sample contains luciferase using as a substrate luciferin according to the present invention and / or its functional analogs according to the invention.
  • luciferase is contained, for example, in the marine polychaetes Chaetopterus variopedatus capable of bioluminescence.
  • Bio samples can be obtained using a variety of technologies known in biology and include tissue samples, cells, extracts, homogenates, protein mixtures of various degrees of purification, etc.
  • biological samples can be obtained from marine polychaetes Chaetopterus variopedatus.
  • Bio samples may also contain isolated components (luciferase or luciferase and luciferin according to the present invention and / or functional analogs) of bioluminescent systems of Chaetopterus variopedatus polychaetes.
  • Biological samples can also express recombinant luciferase or functional mutants thereof.
  • the nucleic acid sequences for the expression of these proteins can be obtained from natural sources (for example, from polychaetes Chaetopterus variopedatus) or synthesized. Many methods are now known for cloning genes encoding proteins of known activity. Some of these methods are described in Maniatis, T., et al. (Molecular Cloning - A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1982) and Newman and Campagnoni (Neuromethods, v. 16, 1990, pp. 13-48). For example, an expression library can be prepared in suitable host cells and tested for luciferase activity.
  • a protein can be isolated from a protein preparation, its partial amino acid sequence is determined, and the corresponding cDNA is cloned from a cDNA sample from polychaetes Chaetopterus variopedatus.
  • the nucleic acid sequences must be inserted into the expression cassette.
  • the expression cassette may exist as an extrachromosomal element or may be incorporated into the genome of a cell by introducing said expression cassette into the cell.
  • a nucleic acid encoding a protein is operably linked to a regulatory sequence that may include promoters, enhancers, terminators, operators, repressors, and inducers.
  • Expression systems include, for example, bacterial systems, yeast cells, insects, fish, amphibians, or mammalian cells. Methods for making expression cassettes or systems for expressing a desired product are known to those skilled in the art. Cell lines that stably express luciferase can be selected by methods known in the art (for example, co-transfection with a selectable marker such as dhfr, gpt, neomycin, hygromycin, which makes it possible to identify and isolate transfected cells that contain a gene included into the genome).
  • the above expression systems can be used in prokaryotic or eukaryotic hosts. For protein production, host cells such as E. coii, B. subtilis, S. cerevisiae, insect cells in combination with baculovirus vectors, or cells of a higher organism such as vertebrates, for example, COS 7 cells, HEK 293, CHO , Xenopus oocytes, etc.
  • the term "functional" in relation to luciferase means that the specified protein is capable of using the luciferins of the invention, in particular (10E, 122) -9-hydroperoxyoctadecadenoic acid, 1-hydroxy-3- (((2P, 3P, 45.5P, 6P) -3.4, 5-trihydroxy-6- (hydroxymethyl) tetrahydro-2H-pyran-2-yl) oxy) propan-2-yl (42.8E, 102) -7-hydroperoxyhexadeca-4,8,10-trienoate, also called 7- hydroperoxide 2-glycerolf-0-galactopyranoside (42.8E, 102) -hexadecatrienoate, or 2-hydroxy-3 - (((2P, ZR, 45.5P, 6P) -3,4,5-trihydroxy-6- ( hydroxymethyl) tetrahydro-2H-pyran-2-yl) oxy) prop
  • nucleotide sequence "encoding" a polypeptide means that the polypeptide is produced from the nucleotide sequence during translation and transcription of mRNA. In this case, both the coding strand, identical to the mRNA and usually used in the sequence listing, and the complementary strand, which is used as a template for transcription, can be indicated. As is obvious to any person skilled in the art, the term also includes any degenerate nucleotide sequences encoding the same amino acid sequence. Nucleotide sequences encoding a polypeptide include sequences containing introns.
  • the methods of the present invention rely on the use of luciferins and / or functional analogs of the invention to detect luciferase activity in biological samples.
  • (10E, 122) -9-hydroperoxyoctadecadienoic acid is a compound having the following structural formula:
  • luciferin 1-rnflpoKcn-3 (((2R, 3R, 4S, 5R, 6R) - 3,4,5-trihydroxy-6- (hydroxymethyl) tetrahydro-2H-pyran-2-yl) oxy) propan-2-yl (42.8E, 107) - 7-hydroperoxyhexadeca-4,8,10-trienoate, also called 7-hydroperoxide 2-glycerolf-D-galactopyranoside (42.8E, 102) -hexadecatrienoate, having the following structural formula:
  • the regioisomer of the above compound is 2-hydroxy-3 - (((2P, 3P, 45.5P, 6P) -3,4,5-trihydroxy-6- (hydroxymethyl) tetrahydro-2H-pyran-2- yl) oxy) propyl (42.8E, 102) -7-hydroperoxyhexadeca-4,8,10-trienoate, also called 7-hydroperoxide 3-glycerolf-E-galactopyranoside (42.8E, 102) -hexadecatrienoate, having the following structural formula:
  • PUFA polyunsaturated fatty acid peroxide
  • PUFA polyunsaturated fatty acid peroxide
  • the recommended scheme for the synthesis of the specified compound includes 10 steps and uses heptin-1 as a starting material. Its advantages are: mild reaction conditions at the cross-coupling stages due to catalysis with copper salts and high yields when obtaining the corresponding propargyl bromides in the Appel reaction. Subsequent condensation of (42,72,102) -hexadeca-4,7,10-trienoic acid 8 with glyceryl tetraacetylglycoside, removal of acetyl protective groups, and peroxidation singlet oxygen in the presence of methylene blue lead to the target product - luciferin of the worm Chaetopterus variopedatus.
  • R 1 H
  • bioluminescence depends on the amount and preservation of luciferase in biological samples. It should also be noted the effect of light radiation, especially the UV part of the spectrum, on luciferin, leading to its degradation and loss of functionality.
  • the formation of the signal is influenced by the pH of the reaction mixture.
  • the formation of a bioluminescent signal occurs in the pH range from 6.0 to 9.8, usually in the pH range from 6.5 to 9.0, mainly in the range from 7.0 to 8.0.
  • Any standard buffer solutions for a given pH range can be used to adjust the pH, including phosphate buffer, HEPES, Tris-HCI.
  • the molarity of the buffer solution does not exceed 2, for example, does not exceed 1, more often in the range from 0.05 to 0.4, usually from 0.1 to 0.2.
  • reaction mixtures for the needs of the present invention may also contain protease inhibitors, for example, phenylacetic acid or oxalic acid in standard concentrations.
  • luciferin according to the present invention and / or its functional analogs according to the invention are added to a biological sample to a final concentration of 0.03-300 ⁇ M, more often 1-5 ⁇ M.
  • a reagent mixture is added to the sample, including a buffer solution, components that stabilize and protect the enzymes of the bioluminescent system from degradation by proteases, and a FeSCU solution.
  • a buffer solution, components that protect enzymes from degradation by proteases, and then a solution of luciferin according to the present invention and / or its functional analogs and a solution of FeSCU are added to the biological sample.
  • the reaction mixture may contain small amounts of used solvents.
  • bioluminescent signal occurs in a wide temperature range - from 4 to 40 ° C, optimally at 20-25 ° C.
  • the maximum luminescence intensity is observed at the moment of initiation of the reaction. Then there is a decline, the rate of which is determined by the activity of enzymes and the initial concentrations of substrates. Under certain conditions (there are many substrates, enzyme activity is low, the reaction temperature is lowered), the reaction can be observed for 30 minutes or more (figure 1).
  • the methods of the present invention include detecting bioluminescence that occurs in a biological sample containing luciferase upon the appearance of luciferin therein.
  • Bioluminescence can be detected using methods known to those skilled in the art, in particular by visual screening or with using a luminometer, photometer, fluorimeter, digital camera, using photosensitive film.
  • the maximum luminescence intensity can be used, which is achieved 1-5 seconds after the initiation of the bioluminescent reaction, or the rate of increase in luminescence in the interval up to 30 minutes after the initiation of the bioluminescent reaction, for example, within 1, 5, 10, 20, 30, 60 sec after initiation of reaction or longer.
  • the measured luminescence is flashes of light rather than sustained luminescence.
  • the luminescence intensity depends on the activity of the enzymes of the bioluminescent system present in the sample, the initial concentrations of the substrates and the temperature of the reaction mixture and usually ranges from 10 kv / s to 10 million kv / s, more often 100-100,000 kv / s.
  • the reaction lasts at least 5 minutes after initiation, usually 10-15 minutes, sometimes (depending on conditions) 30 or more minutes.
  • the light emitted during the oxidation of luciferin according to the present invention and / or its functional analogs is in the range from 440 to 510 nm, more often in the range from 450 to 475 nm, with an emission maximum at 455-461 nm.
  • the methods and reagents of the present invention can be used in a wide variety of in vivo and in vitro bioluminescence assays.
  • the methods and reagents of the present invention can be used to identify the active components of the bioluminescent system of Chaetopterus variopedatus polychaetes during their purification.
  • the methods and reagents of the present invention can be used to detect functional analogues of enzymes of the bioluminescent system of polychaetes Chaetopterus variopedatus in biological samples.
  • the methods and reagents of the present invention can be used to detect recombinant luciferase activity in host cells.
  • a nucleic acid encoding a luciferase is to be obtained for use.
  • the resulting nucleic acid must be inserted into an expression cassette that provides for the temporary or permanent expression of this nucleic acid in host cells, for example, under promoters of interest to the researcher.
  • the expression cassette may contain elements that provide targeted delivery of the construct to the cells or cell compartments of interest, or be contained in particles that provide targeted delivery. After transfection of cells with an expression cassette (for example, as part of an expression vector) and after the time required for production in cells the expression product, detection of luciferase activity within cells or in a cell lysate can be performed.
  • kits for use in the above-described applications are also provided.
  • kits typically comprise a luciferin according to the present invention and / or a functional analogue thereof, preferably with a buffer solution to dissolve said substrate and / or add it to biological samples.
  • the luciferin of the present invention and / or its functional analog can be present in dissolved form in an appropriate storage medium, such as an aqueous or buffered solution, usually in an appropriate container.
  • the luciferin of the present invention and / or a functional analogue thereof may be present in the kit in lyophilized form.
  • the claimed kits may further include instructions for performing the claimed methods. These instructions can be present in the claimed kits in various forms (for example, in print or on electronic media in the form of a text and / or graphic file) in the amount of one or more.
  • bioluminescent compositions for use in the above-described uses.
  • the compositions typically comprise the luciferin of the present invention and / or a functional analogue thereof, preferably with a buffer solution to dissolve said substrate and / or add it to biological samples.
  • the luciferin of the present invention and / or a functional analogue thereof may be present in dissolved form in an appropriate storage medium such as an aqueous or buffered solution.
  • the luciferin of the present invention and / or a functional analogue thereof may be present in the composition in lyophilized form.
  • compositions may further comprise auxiliary substances, in particular adjuvants, solvents and / or excipients, such that are compatible with the compounds constituting the essence of this invention and that do not destroy the biological activity of these compounds.
  • Luciferase samples for luminescence activity measurements and in vitro conversion experiments were prepared according to the following procedure.
  • the final precipitate was diluted in 35 ml of 10 mM phosphate buffer with pH 6 and dialyzed for 1 h at 4 ° C.
  • the resulting sample was centrifuged at 25000 g x 20 min at 4 ° C, the supernatant was passed through a 30 x 100 mm column with Cellulose DEAE-32 (Serva) equilibrated with 10 mM phosphate buffer with pH 6.
  • 500 ⁇ l of 2 M phosphate buffer at pH 9 and applied to a 16 x 200 mm column with Sepharose DEAE FF (GE Sweden) equilibrated with 10 mM phosphate buffer pH 7.5.
  • the active fractions were pooled, diluted with water to a final buffer concentration of 25 mM, and loaded at a rate of 2 ml / min onto a 10 x 500 mm column with Sepharose DEAE FF equilibrated with 10 mM phosphate buffer pH 7.5. After washing the column, the samples were eluted with a linear gradient of 300 ml of 0.5 M NaCl in phosphate buffer at a rate of 4 ml / min.
  • Luciferin was extracted from frozen C. variopedatus biomass with 20 ml of 70% ethanol for 1 hour at 0 ° C, after which it was centrifuged at 25000 g x 20 min at 4 ° C. The resulting supernatant was diluted with an equal volume of distilled water and applied to a C16M concentrating cartridge (Biohimmak, Moscow). After washing with 50% ethanol, the sample was eluted with 2 ml of 96% ethanol and its volume was brought to 100 ⁇ l in a vacuum concentrator "Eppendorf 5301". The resulting luciferin preparation was further used as a substrate in the reactions being carried out.
  • the filtrate was applied to a 20x100 mm column containing the Diasorb-60-S16T sorbent (Biohimmak, Moscow). The column was washed with 50% ethanol-water solution. The desired substance was eluted from the sorbent with 96% ethanol under isocratic conditions. Active samples were combined, a total of 10 ml was obtained. The resulting sample was dried on an evaporator and diluted in 400 ⁇ l of 96% ethanol and purified using reverse phase HPLC. A semi-preparative column (9.4 x 250 mm), ZORBAX Eclipse XDB-C18 (Agilent Technologies), connected to an Agilent 1260 Infinity LC chromatograph was used.
  • the resulting active peak fractions were dried on an Eppendorf concentrator 5301 rotary evaporator at room temperature and diluted in 100 ⁇ L of 96% ethanol. Then, gel filtration chromatography of these practically homogeneous substances was carried out on a Superdex Peptide 10/300 GL column in a mixture of 0.1% formic acid and 50% acetonitrile. The fractions containing the activity were combined and dried on a rotary evaporator.
  • (10E, 122) -9-hydroperoxyoctadecadienoic acid (table 1) is a linear molecule containing a carboxyl group ( 13 ⁇ 174.89 ppm and a broadened proton singlet at 12 ppm), two double bonds and hydroperoxide group (singlet proton at 11.27 ppm and tertiary carbon at 85.08 ppm).
  • Structure peak # 3 ( Figure 4) corresponds to (10E, 122) -9-hydroperoxyoctadeca-10,12-dienoic acid.
  • the configuration of the double bonds was determined based on the values of the spin-spin coupling constants (SSCCs), which were 15 Hz for the 10-11 bond and 11 Hz for the 12-13 bond.
  • SSCCs spin-spin coupling constants
  • the structure ideally corresponds to the mass of the molecular ion 311 .222; the additional major peak 293.212 in the mass spectrum is the product of the reduction of a peroxide with a carbonyl group at position 9.
  • PUFA and their derivatives were dissolved in 1 ml of methanol and the resulting solution was placed in an ampoule. A solution of 0.1 mg / ml methylene blue (0.13 mmol) in methanol was added. A lamp (Nova II, 150 W) was placed at a distance of 15-20 cm in front of the ampoule and oxygen was bubbled through the reaction mixture for 4-6 h, until TLC showed complete conversion of the starting PUFA and their derivatives into more polar products. Then the reaction mixture was evaporated, dissolved in 3 ml of dichloromethane and washed with water (2 x 1 ml) and saturated NaCl solution (1 x 1 ml).
  • (10E, 12Z) -9-hydropepoxyoktadeka-10,12-dienic acid for the detection of luciferase in biological samples.
  • Luciferin ((10E, 122) -9-hydroperoxyoctadeca-10,12-dienoic acid) was obtained as described above in the Extraction, Separation and Purification of Chaetopterus Luciferase Substrates.
  • the background luminescence of the luciferase fraction was first measured, then aliquots of a solution of (10E, 12Z) -9-hydroperoxyoctadeca-10,12-dienoic acid were added.
  • the bioluminescent reaction was initiated by injecting 1 ⁇ L of a 100 ⁇ M solution of ferrous sulfate (Fe 2+ ) into the measuring cuvette. In all cases, the luminescence of biological samples was detected.
  • luciferin preparation ((10E, 127) -9-hydroperoxyoctadeca-10, 12-dienoic acid), preliminarily diluting it in methanol to obtain different concentrations.
  • the bioluminescent reaction was initiated by injecting 10 ⁇ L of a 25 ⁇ M ferrous sulfate (Fe 2+ ) solution into the measuring cuvette.
  • the resulting dependence is close to linear: when the amount of luciferin is varied, the intensity of bioluminescence changes by more than 100 times ( Figure 5).
  • Luciferin ((10E, 12Z) -9-rnflponepoKCHOKTafleKa-10,12-flneHOBan acid) was obtained as described above in the Extraction, Separation and Purification of Chaetopterus Luciferase Substrates. Clarified tissue lysates from Chaetopterus variopedatus were used as biological samples. Tissue lysates were obtained as described above in the section "Obtaining partially purified luciferase".
  • Polyunsaturated fatty acid hydroperoxides were obtained as described above in the sections "General procedure for the preparation of PUFA peroxides using LOX lipoxygenases” and "General procedure for the preparation of PUFA peroxides by oxidation with singlet oxygen in the presence of methylene blue".
  • Linoleic acid peroxides were used as model substrates.
  • LOX 9-hydroperoxide (10E, 122) octadecade of nanoic (linoleic) acid.
  • LOX 9- and 13-hydroperoxides of octadecatrienoic (linolenic) acid.
  • glycolipid hydroperoxides containing a diol linker for the detection of luciferase in biological samples.
  • Glycolipid hydroperoxides were obtained as described above in the section "General procedure for the preparation of PUFA peroxides by oxidation with singlet oxygen in the presence of methylene blue".
  • a protein preparation from the biomass of the Chaetopterus variopedatus worm chromatographically purified on a Superdex 200 column. This preparation was obtained as described above in the section "Obtaining partially purified luciferase”.
  • glycolipid hydroperoxides containing a triol linker for the detection of luciferase in biological samples.
  • Glycolipid hydroperoxides were obtained as described above in the section "General procedure for the preparation of PUFA peroxides by oxidation with singlet oxygen in the presence of methylene blue".
  • a protein preparation from the biomass of the Chaetopterus variopedatus worm chromatographically purified on a Superdex 200 column. This preparation was obtained as described above in the section "Obtaining partially purified luciferase”. 1 ⁇ l 0.3 ⁇ M glycolipid hydroperoxide substrate solution in methanol, 1 ⁇ l 100 ⁇ M FeSCU
  • Polyunsaturated fatty acid hydroperoxides conjugated with fluorescent dyes were obtained as described above in the section "General procedure for the preparation of polyunsaturated fatty acids peroxides by oxidation with singlet oxygen in the presence of methylene blue".
  • a mixture of 9-, 10-, 12-, and 13-hydroperoxides of linoleic acid conjugated with fluorescein (9,10,12,13-hydroperoxides 2- (6- (((9, 127) -octadeca-9 , 12-dienoyl) oxy) -3-oxo-3N-xanthen-9-yl) benzoic acid) and a mixture of 9-, 10-, 12- and 13-hydroperoxides of linoleic acid conjugated with eosin (9,10,12, 13-hydroperoxides 2- (2,4,5,7-tetrabromo-6 - (((9, 127) -9-hydroperoxyoctadeca-9,12-dienoyl) oxy) -3-oxo-3N-xanthen-9-yl ) benzoic acid).
  • the bioluminescent reaction was initiated by injecting 1 ⁇ L of a 100 ⁇ M solution of iron sulfate (Fe2 +) into the measuring cuvette. In all cases, the luminescence of biological samples was detected.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

Компоненты биолюминесцентных систем - широко используемые реагенты для множества анализов, включая диагностические системы, системы контроля качества, системы тестирования лекарственных препаратов и т.д. Настоящая группа изобретений раскрывает компоненты биолюминесцентной системы червя Chaetopterus variopedatus, в частности люциферины и их функциональные аналоги. Кроме того, настоящая группа изобретений раскрывает метод выявления люциферазы в биологических образцах с использованием субстратов (люциферинов и их функциональных аналогов) биолюминесцентной системы червя Chaetopterus variopedatus, а также способ детекции биолюминесценции в биологическом образце.

Description

МЕТОД И РЕАКТИВЫ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ АКТИВНОСТИ ЛЮЦИФЕРАЗЫ
Область техники
Настоящее изобретение относится к биологии, химии и биотехнологии, а именно к биолюминесцентной системе червя Chaetopterus variopedatus.
Уровень техники
Биолюминесценция - процесс излучения света живыми организмами в ходе биохимической реакции, в которой химическая энергия превращается в световую. Способность к биолюминесценции определяется наличием специфического белка люциферазы или фотопротеина. Люциферазы — это ферменты, которые катализируют окисление низкомолекулярных соединений - люциферинов, превращая их в оксилюциферины. Окисление сопровождается выделением света и высвобождением оксилюциферина. Способностью к биолюминесценции обладают организмы, принадлежащие к самым разным систематическим группам. Механизмы известных биолюминесцентных реакций весьма разнообразны.
Например, у ряда морских кишечнополостных описаны системы, включающие белки семейства экворина (Prasher, et al., Biochem. 1987, 26:1326-1332; Tsuji et al., Photochem Photobiol, 1995 62(4):657-661). Это семейство фотопротеинов, содержащих ковалентно связанный с ними люциферин, который в присутствии ионов Са2+ подвергается химическим превращениям с образованием продукта в возбужденном электронном состоянии.
Морские полихеты вида Chaetopterus variopedatus широко распространены в различных частях океана, включая побережья Новой Зеландии, Австралии, Японии и Бразилии. Это фильтрующий червь, живущий на мелководье в U- образной трубке, оба конца которой торчат из морского дна. При физическом стрессе червь излучает вспышку голубого цвета и выделяет светящуюся голубую слизь при более агрессивном воздействии, что свидетельствует о том, что нервная система червя контролирует его люминесцентную активность (Jeremy D. Mirza et al, Photochem. & Photobiol. Photochemistry and Photobiology. 2020, 10.1111/php.13221).
Компоненты биолюминесцентных систем (люциферазы, фотопротеины, люциферины и т.д.) - широко используемые реагенты для множества анализов, включая диагностические системы, системы контроля качества и т.д. Например, белки семейства экворина широко используются для исследований высвобождения и связывания Са2+ в биологических системах, например, во время мышечного сокращения. Использование биолюминесцентных систем в подробностях описано, например, в Cormier, M.L. et al., Photochem. & Photobiol. 49/4, 509-512 (1989), Smith, D.F. et al. in "Bioluminescence and Chemiluminescence: Current Status (P. Stanley & L. Krick, eds.), John Wiley and Sons, Chichester, U.K. 1991 , 529-532.
Несмотря на большое количество биолюминесцентных систем, используемых на сегодняшний день, сохраняется потребность в расширении линейки люциферин- люциферазных пар, обладающих новыми свойствами. Расшифровка новых компонентов биолюминесцентных систем позволяет расширить спектр доступных анализов и приложений для использования.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является установление компонентов биолюминесцентной системы червя Chaetopterus variopedatus, в частности идентификация молекул субстратов биолюминесцентной реакции (люциферинов), а также разработка способа выявления люциферазы в биологическом образце с помощью люциферинов червя Chaetopterus variopedatus и способа детекции биолюминесценции посредством субстратов биолюминесцентной реакции (люциферинов) червя Chaetopterus variopedatus.
Технический результат состоит в расширении арсенала технических средств в области применения биолюминесцентных систем и достигается за счет идентификации молекул субстратов биолюминесцентной реакции (люциферинов) червя Chaetopterus variopedatus, окисление которых сопровождается испусканием света. Указанные компоненты бюолюминесцентной системы червя Chaetopterus variopedatus являются перспективными для применения в качестве реагентов для множества анализов, включая диагностические системы, системы контроля качества, системы тестирования лекарственных препаратов и т.д.
Указанный технический результат достигается посредством разработки и создания соединений общей формулы (I) или общей формулы (II):
Figure imgf000003_0001
формула ( I), или его таутомер, стереоизомер или энантиомер, фармацевтически приемлемая соль, сольват или гидрат, где: п выбирается независимо и представляет собой 0-3; х выбирается независимо и представляет собой 1-5; m выбирается независимо и представляет собой 1-6; у выбирается независимо и представляет собой 0-7; R выбирается независимо и представляет собой -Смо-алкил, замещенный или незамещенный моно, ди, три или тетрациклический Сб-го-арил, необязательно содержащий гетероатом, выбранный из 0-3 атомов О, 0-6 атомов N, 0-3 атомов S, 0- 2 атомов Si, где указанный моно, ди, три или тетрациклический Сб-го-арил может быть замещен 1-6 заместителями, выбранными из галогена, -С=0, фенила, фенил-
СООН.
В частных вариантах воплощения, настоящее изобретение обеспечивает молекулу люциферина червя, а именно (10Е,122)-9-гидропероксиоктадекад неновую кислоту, характеризующуюся следующей структурной формулой:
Figure imgf000004_0001
Настоящее изобретение также включает применение соединений общей формулы (I) или общей формулы (II) в качестве субстрата для фермента люциферазы (люциферина), окисление данной молекулы приводит к появлению света.
Указанный технический результат достигается также посредством разработки и создания соединений общей формулы (III):
Gly-Polyol-Acyl формула (III), или его таутомер, стереоизомер или энантиомер, фармацевтически приемлемая соль, сольват или гидрат, где
Gly представляет собой углеводный фрагмент моносахарида,
Polyol выбирается независимо и представляет собой многоатомный спирт;
Acyl выбирается независимо и представляет собой гидропероксид полиненасыщенной жирной кислоты, который характеризуется следующей структурной формулой:
Figure imgf000004_0002
где п выбирается независимо и представляет собой 0-3; х выбирается независимо и представляет собой 1-5; m выбирается независимо и представляет собой 1-6; у выбирается независимо и представляет собой 0-7. з В частных вариантах воплощения изобретения многоатомный спирт выбирается независимо и представляет собой диол или триол.
В частных вариантах воплощения изобретения углеводный фрагмент представляет собой альдопентозу, альдогексозу, кетопентозу или кетогексозу. В более конкретных вариантах воплощения изобретения углеводный фрагмент представляет собой рибозу, ксилозу, маннозу, галактозу, глюкозу, аллозу, рибулозу, ксилулозу, фруктозу или сорбозу.
В частных вариантах воплощения, настоящее изобретение обеспечивает молекулу люциферина червя, а именно молекулу 1 -rHflpoKCH-3-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-TpnrHflpoKCH-6- (гидроксиметил)тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)окси)пропан-2-ил(42,8Е,102)-7- гидропероксигексадека-4,8,10-триеноат, также называемую 7-гидропероксид 2-глицерол^-0- галактопиранозид (42,8Е,102)-гексадекатриеноата, характеризующуюся следующей структурной формулой:
Figure imgf000005_0001
и/или его региоизомер 2-rHflpoKCH-3-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-TpnrHflpoKCH-6- (гидроксиметил)тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)окси)пропил (4Z.8E, 102)-7-гидропероксигексадека- 4,8,10-триеноат, также называемый 7-гидропероксид З-глицерол^-О-галактопиранозид (47,8Е,107)-гексадекатриеноата, характеризующийся следующей структурной формулой:
Figure imgf000005_0002
Настоящее изобретение также включает применение соединений общей формулы (III) в качестве субстрата для фермента люциферазы (люциферина), окисление данной молекулы приводит к появлению света.
Настоящее изобретение также включает соединение общей формулы (IV):
Figure imgf000006_0001
формула (IV), или его таутомер, стереоизомер или энантиомер, фармацевтически приемлемая соль, сольват или гидрат, где: п выбирается независимо и представляет собой 2-8; х’ выбирается независимо и представляет собой 1-7; m выбирается независимо и представляет собой 1-6.
Настоящее изобретение также включает применение соединений общей формулы (IV) в качестве предшественника люциферина (предлюциферина).
Настоящее изобретение также включает набор для детекции люциферазы в биологическом образце, включающий люциферин по изобретению.
В частных вариантах воплощения изобретения набор дополнительно включает буфер, глицерин и соли железа (II).
В частных вариантах воплощения изобретения указанные компоненты набора содержатся в допустимых количествах.
Настоящее изобретение также включает биолюминесцентные композицию, включающую люциферазу и, по меньшей мере, одно соединение по настоящему изобретению. В частных вариантах воплощения изобретения люцифераза является рекомбинантной. В частных вариантах воплощения изобретения люцифераза представляет собой люциферазу червя Chaetopterus variopedatus.
Кроме того, настоящее изобретение также обеспечивает способ выявления (детекции) люциферазы в биологическом образце, включающем люциферазу и/или липоксигеназу, и, по меньшей мере, одно соединение по изобретению. В частных вариантах воплощения изобретения люцифераза представляет собой люциферазу червя Chaetopterus variopedatus. В частных вариантах воплощения изобретения люцифераза представляет собой рекомбинантную люциферазу. В частных вариантах воплощения изобретения биологический образец представляет собой ткань и/или клетку. В частных вариантах воплощения изобретения биологический образец характеризуется значением pH в диапазоне от 7 до 8. В частных вариантах воплощения изобретения липоксигеназа представляет собой рекомбинантную липоксигеназу.
В частных вариантах воплощения изобретения способ выявления люциферазы включает следующие этапы: а) добавление соединения по изобретению к биологическому образцу для получения реакционной смеси; б) инкубирование реакционной смеси в условиях, подходящих для возникновения биолюминесценции; в) детектирование биолюминесценции в реакционной смеси.
В частных вариантах воплощения изобретения концентрация соединения по изобретению составляет 0.03 - 300 мкМ.
Кроме того, обеспечивается способ детекции биолюминесценции в биологическом образце, включающем люциферазу и/или липоксигеназу, и, по меньше мере, одно соединение по изобретению. В частных вариантах воплощения изобретения люцифераза представляет собой рекомбинантную люциферазу. В частных вариантах воплощения изобретения люцифераза представляет собой люциферазу червя Chaetopterus variopedatus. В частных вариантах воплощения изобретения биологический образец представляет собой ткань и/или клетку. В частных вариантах воплощения изобретения биологически образец характеризуется значением pH в диапазоне от 7 до 8. В частных вариантах воплощения изобретения липоксигеназа представляет собой рекомбинантную липоксигеназу.
В частных вариантах воплощения изобретения способ детекции биолюминесценции включает следующие этапы: а) экспрессию гена люциферазы в биологическом образце; б) добавление соединения по изобретению к биологическому образцу; в) детектирование биолюминесценции.
В частных вариантах воплощения изобретения концентрация соединения по изобретению составляет 0.03 - 300 мкМ.
Также настоящее изобретение обеспечивает реактивы и наборы реактивов для реализации методов настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также включает получение соединений по изобретению.
Для более полного раскрытия вышеперечисленных характеристик настоящего изобретения ниже предлагается детальное описание изобретения, кратко сформулированного выше, в виде ссылок на воплощения, некоторые из которых проиллюстрированы дополнительными фигурами. При этом следует отметить, что прилагаемые фигуры иллюстрируют лишь типичные воплощения настоящего изобретения и, следовательно, не должны быть восприняты в качестве ограничения объема изобретения, которое может допускать другие, в равной степени эффективные, воплощения.
Подробное раскрытие изобретения
Краткое описание чертежей
Фигура 1. Результат измерения биолюминесценции люциферина Chaetopterus variopedatus, инициированной впрыском двухвалентного железа во времени. Данные приведены в логарифмических единицах.
Фигура 2. Гель-фильтрация образца люциферазы Chaetopterus на колонке Superdex
200. Фигура 3. Хроматография образца люциферина из водоросли С. Нпит на колонке С18.
Стрелками указаны пики, проявляющие люминесцентную активность.
Фигура 4. Структуры люминесцентно-активных соединений, выделенных из биомассы водоросли Chaetomorpha Нпит, установленные с использованием методов ЯМР- спектроскопии и ВЭЖХ-МС.
Фигура 5. Зависимость интенсивности биолюминесценции от количества препарата люциферина.
Фигура 6. Кинетика биолюминесцентной реакции (логарифмическая шкала) синтетического ((10Е,122)-9-гидропероксиоктадека- 10, 12-д неновая кислота) и его функциональных аналогов, полученных окислением соевой липооксигеназой (LOX) или синглетным кислородом, генерируемым в присутствии метиленового голубого (1Ог). 1 мкл люциферазной фракции 1 мг/мл +1 мкл 100 мкМ FeSCU + 1 мкл раствора субстрата в метаноле 0,3 мкМ.
Фигура 7. Кинетика биолюминесцентной реакции синтетических 9-,10-,12- и 13- гидропероксидов октадекадиеновой (линолевой) кислоты (1Ог) и 9-,10-,12- и 13- гидропероксиды 1-оксопропилф-0-галактопиранозид (92,122)-октадекадиеноата, полученных окислением синглетным кислородом, генерируемым в присутствии метиленового голубого. 1 мкл люциферазной фракции 1 мг/мл +1 мкл 100 мкМ FeSCU + 1 мкл раствора субстрата в метаноле 0,06 mM.
Фигура 8. Кинетика биолюминесцентной реакции (логарифмическая шкала) синтетических 9-,10-,12- и 13- гидропероксидов октадекадиеновой (линолевой) кислоты (1Ог) и гидропероксидов 2- и 3-глицеролф-0-галактопиранозид-(97,127)-октадекадиеноата, полученных окислением синглетным кислородом, генерируемым в присутствии метиленового голубого. 1 мкл люциферазной фракции 1 мг/мл +1 мкл 100 мкМ FeSCU + 1 мкл раствора субстрата в метаноле 0,3 мкМ.
Фигура 9. Кинетика биолюминесцентной реакции (логарифмическая шкала) синтетических 9-,10-,12- и 13- гидропероксидов октадекадиеновой (линолевой) кислоты (1Ог) и аналогов сопряженных с флуоресцентными красителями, полученных окислением синглетным кислородом, генерируемым в присутствии метиленового голубого (МГ). 1 мкл люциферазной фракции 1 мг/мл +1 мкл 100 мкМ FeSCU + 1 мкл раствора субстрата в метаноле 0,3 мкМ.
Определения и термины
Различные термины, относящиеся к объектам настоящего изобретения, используются выше и также в описании и в формуле изобретения. Если иное не оговаривается, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же самое значение, которое понятно для специалистов в данной области. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
Термин «биолюминесценция» или «люминесценция» в настоящем документе означает процесс излучения света, получаемый в результате реакции между ферментом и субстратом, который генерирует свет.
Термин «люциферин» в настоящем документе означает соединение, являющееся субстратом для ферментов люцифераз.
Термин «функциональные аналоги» используется в настоящем изобретении для описания химических соединений, которые выполняют одну и туже функцию и/или могут быть использованы для одного и того же назначения.
Как здесь используется, термин «люцифераза» означает белок, который обладает способностью к окислению люциферина, где реакция окисления сопровождается выделением света (люминесценцией) и происходит освобождение окисленного люциферина.
«Реакционная смесь люциферазы» содержит фермент люциферазу и материалы, которые позволят ферменту люциферазе генерировать световой сигнал. Необходимые материалы и конкретные концентрации и/или количества материалов, необходимых для генерации люминесцентного сигнала, варьируются в зависимости от используемого фермента люциферазы, а также от типа выполняемого анализа на основе люциферазы. Как правило, для люциферазы червя Chaetopterus variopedatus, эти материалы могут включать: буфер для поддержания реакции при правильном pH, фермент люцифераза червя Chaetopterus variopedatus, люциферин и соли железа (II). Часто к раствору могут добавляться другие материалы, в том числе: соли, в частности, хлорид натрия, ацетат натрия, цитрат натрия глицерин, аминокислоты и др. Типичная реакционная смесь люциферазы может содержать люциферазу червя Chaetopterus variopedatus, 50 мМ натрий-фосфатный буфер pH 7.4, 5% глицерин, 100 мкМ FeSCU.
«Смесь для обнаружения люциферазы» содержит материалы, которые позволят обнаружить фермент люциферазу. Необходимые материалы и конкретные концентрации и/или количества материалов, необходимых для генерации люминесцентного сигнала, будут варьируются в зависимости от используемого фермента люциферазы, а также от типа выполняемого анализа на основе люциферазы. В общем, для люциферазы червя Chaetopterus variopedatus эти материалы могут включать в себя: восстановители, детергенты, соли, глицерин, аминокислоты, субстрат люциферазы - люциферин. Часто к раствору могут добавляться другие материалы, в том числе: соли, глицерин, аминокислоты и т. д. Типичная смесь для обнаружения люциферазы может содержать субстрат люциферазы - люциферин червя Chaetopterus variopedatus согласно настоящему изобретению и/или его функциональный аналог, 50 мМ натрий-фосфатный буфер pH 7.4, 100 мкМ FeSCU.
Как здесь используется, термин «выделенный» означает молекулу или клетку, которые находятся в среде, отличной от среды, в которой молекула или клетка находятся в естественных условиях. Например, указанные компоненты могут находиться по существу в очищенной форме. По существу, очищенная форма означает, что белки являются, по меньшей мере, приблизительно на 20% чистыми, часто, по меньшей мере, на 30% чистыми, обычно на 50% чистыми, или, по меньшей мере, на 90% чистыми.
Для выделения белков могут быть использованы любые обычные методики очистки белка, описанные, например, в Guide to Protein Purification, (Deuthser ed.) (Academic Press, 1990). Например, из исходного источника может быть приготовлен лизат или белковый препарат и очищен с использованием ВЭЖХ, эксклюзионной хроматографии, гель- электрофореза, аффинной хроматографии и т.п. Белковые препараты могут быть протестированы на наличие активной люциферазы или комплекса люциферазы и люциферина с помощью методов настоящего изобретения.
Как здесь используется, термин "мутант" или "производное" относятся к белку (в частности, к люциферазе), раскрытому в настоящем изобретении, в котором одна или более аминокислот добавлены и/или замещены и/или удалены (делетированы) и/или вставлены (инсертированы) в N-конец и/или С-конец, и/или в пределах нативных аминокислотных последовательностей белков настоящего изобретения. Как здесь используется, термин "мутант" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует мутантный белок. Кроме того, термин "мутант" здесь относится к любому варианту, который короче или длиннее белка или нуклеиновой кислоты.
Модификации, а также добавки или делеции могут быть встроены любым методом, известным в данной области (см., например, Gustin et al., Biotechniques (1992) 14: 22; Barany, Gene (1985) 37: 11-123; и Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 199:537-539), Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), CSH Press, pp. 15.3-15.108), включая ошибочно- направленную ПЦР, перестановку, сайт-направленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов, мутагенез с использованием ПЦР на основе спаренных молекул, мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, рекурсивный согласованный мутагенез, экспоненциальный согласованный мутагенез, сайт-направленный мутагенез, случайный мутагенез, генную повторную сборку, генный сайт-насыщенный мутагенез (GSSM), повторную сборку при проведении синтеза лигированием (SLR), или их сочетание. Указанные модификации, добавления или делеции могут быть также встроены способом, включающим рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательности, мутагенез ДНК путем фосфотиоатной модификации, мутагенез на основе включения матрицы, содержащей урацил, мутагенез на основе дуплекса, содержащего бреши, репарационный мутагенез с точечными ошибочными спариваниями, мутагенез с использованием штамма-хозяина, дефицитного по репарации, химический мутагенез, радиогенный мутагенез, делеционный мутагенез, мутагенез с использованием ограничения по селекции, мутагенез с использованием ограничения по очистке, искусственный синтез гена, согласованный мутагенез, создание химерного мультимера нуклеиновой кислоты или их сочетание.
Как здесь используется, термин "функциональный" означает, что нуклеотидная или аминокислотная последовательность может функционировать для указанного испытания или задачи. Термин "функциональный", используемый для описания люцифераз, означает, что белок обладает способностью производить сопровождающуюся люминесценцией реакцию окисления люциферина.
Термин «алкил» в настоящем документе означает как неразветвленные, так и разветвленные. Кроме того, «алкил» может быть как замещенным, так и незамещенным.
Термин «алкил» в настоящем документе относится к группам, обычно имеющим от одного до десяти атомов углерода. Например, термин -Смо-алкил означает метил, этил, изопропил, н-пропил.
Термин «арил» в настоящем документе означает группы, содержащие ароматический цикл, имеющий от шести до двадцати атомов углерода, причем арил может представлять собой моно, ди, три или тетрацикл. В частных вариантах воплощения изобретения арил представляет собой замещенный или незамещенный моно, ди, три или тетрациклический Сб- 2о-арил, необязательно содержащий гетероатом, выбранный из 0-3 атомов О, 0-6 атомов N, 0- 3 атомов S,0 -2 атомов Si, где указанный моно, ди, три или тетрациклический Сб-го-арил может быть замещен 1-6 заместителями, выбранными из галогена (в частности, хлор, бром, фтор), - С=0, фенила, фенил-СООН. Примером арильных групп могут быть:
Figure imgf000011_0001
, фенил.
Биологические образцы
Реализация методов настоящего изобретения обеспечивает возникновение люминесценции реакционной смеси, содержащей биологический образец, если указанный образец содержит люциферазу, использующую в качестве субстрата люциферин согласно настоящему изобретению и/или его функциональные аналоги по изобретению. Такую люциферазу содержат, например, способные к биолюминесценции морские полихеты Chaetopterus variopedatus.
Биологические образцы могут быть получены с помощью различных технологий, известных в биологии, и включают образцы тканей, клеток, экстракты, гомогенаты, белковые смеси различной степени очистки и т.д. Например, биологические образцы могут быть получены из морских полихет Chaetopterus variopedatus.
Биологические образцы могут также содержать выделенные компоненты (люциферазу или люциферазу и люциферин согласно настоящему изобретению и/или функциональные аналоги) биолюминесцентных систем полихет Chaetopterus variopedatus.
Биологические образцы могут также экспрессировать рекомбинантную люциферазу или её функциональные мутанты. Последовательности нуклеиновых кислот для экспрессии указанных белков могут быть получены из природных источников (например, из полихет Chaetopterus variopedatus) или синтезированы. В настоящее время известно множество методов для клонирования генов, кодирующих белки, обладающие известной активностью. Частично такие методы описаны в Maniatis, Т., et а\. (Molecular Cloning--A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1982) и Newman и Campagnoni (Neuromethods, v. 16, 1990, pp 13-48). Например, может быть приготовлена экспрессионная библиотека в подходящих клетках-хозяевах и протестирована на активность люциферазы. Или может быть осуществлено выделение белка из белкового препарата, определена его частичная аминокислотная последовательность и осуществлено клонирование соответствующей кДНК из образца кДНК из полихет Chaetopterus variopedatus. Последовательности нуклеиновых кислот должны быть встроены в кассету экспрессии. Кассета экспрессии может существовать как внехромосомный элемент или может быть включена в геном клетки в результате введения указанной кассеты экспрессии в клетку. В кассете экспрессии нуклеиновая кислота, кодирующая белок, является функционально связанной с регуляторной последовательностью, которая может включить промоторы, энхансеры, терминаторы, операторы, репрессоры и индукторы. После введения кассеты экспрессии в клетку в ней может образовываться функциональный белок. Системы экспрессии включают, например, бактериальные системы, дрожжевые клетки, насекомых, рыб, земноводных или клетки млекопитающих. Методы изготовления кассет экспрессии или систем для экспрессии желаемого продукта известны специалистам, квалифицированным в данной области. Клеточные линии, которые устойчиво экспрессируют люциферазу могут быть выбраны способами, известными в данной области (например, ко-трансфекция с селектируемым маркером, таким как dhfr, gpt, неомицин, гигромицин, что делает возможным выявление и выделение трансфицированных клеток, которые содержат ген, включенный в геном). Вышеописанные системы экспрессии могут использоваться в прокариотических или эукариотических хозяевах. Для получения белка могут использоваться клетки-хозяева, такие как Е. coii, В. subtilis, S. cerevisiae, клетки насекомого в комбинации с бакуловирусными векторами, или клетки высшего организма, такого как позвоночные, например, COS 7 клетки, НЕК 293, СНО, ооциты Xenopus и т.д.
Могут быть также экспрессированы функциональные мутанты природных белков. Как используется в настоящем описании, термин «функциональный» по отношению к люциферазе означает, что указанный белок способен использовать люциферины по изобретению, в частности (10Е,122)-9-гидропероксиоктадекад неновую кислоту, 1-гидрокси-З- (((2Р,ЗР,45,5Р,6Р)-3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2Н-пиран-2- ил)окси)пропан-2-ил(42,8Е,102)-7-гидропероксигексадека-4,8,10-триеноат, также называемую 7-гидропероксид 2-глицеролф-0-галактопиранозид (42,8Е,102)-гексадекатриеноата, или 2- гидрокси-3-(((2Р,ЗР,45,5Р,6Р)-3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2Н-пиран-2- ил)окси)пропил (42,8Е,102)-7-гидропероксигексадека-4,8,10-триеноат, также называемый 7- гидропероксид З-глицерол^-О-галактопиранозид (4Z,8E, 102)-гексадекатриеноата .
Ссылка на нуклеотидную последовательность, "кодирующую" полипептид означает, что с нуклеотидной последовательности в ходе трансляции и транскрипции мРНК продуцируется этот полипептид. При этом может быть указана как кодирующая цепь, идентичная мРНК и обычно используемая в списке последовательностей, так и комплементарная цепь, которая используется как матрица при транскрипции. Как очевидно для любого специалиста в данной области техники, термин также включает любые вырожденные нуклеотидные последовательности, кодирующие одинаковую аминокислотную последовательность. Нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид, включают последовательности, содержащие интроны.
Реактивы для выявления активности люциферазы
Методы настоящего изобретения основаны на использовании люциферинов и/или функциональных аналогов по изобретению для детекции активности люциферазы в биологических образцах.
Как используется в настоящем описании, (10Е,122)-9-гидропероксиоктадекадиеновая кислота представляет собой соединение, имеющее следующую структурную формулу:
Figure imgf000013_0001
Как используется в настоящем описании, люциферин 1-rnflpoKcn-3-(((2R,3R,4S,5R,6R)- 3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)окси)пропан-2-ил(42,8Е,107)- 7-гидропероксигексадека-4,8,10-триеноат, также называемый 7-гидропероксид 2-глицеролф- D-галактопиранозид (42,8Е,102)-гексадекатриеноата, имеющий следующую структурную формулу:
Figure imgf000014_0001
Как используется в настоящем описании, региоизомер вышеуказанного соединения 2- гидрокси-3-(((2Р,ЗР,45,5Р,6Р)-3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2Н-пиран-2- ил)окси)пропил (42,8Е,102)-7-гидропероксигексадека-4,8,10-триеноат, также называемый 7- гидропероксид З-глицеролф-Э-галактопиранозид (42,8Е,102)-гексадекатриеноата, имеющий следующую структурную формулу:
Figure imgf000014_0002
Эти новые выделенные авторами настоящего изобретения люциферины имеют уникальное строение, отличающее их от всех ранее описанных природных люциферинов. Так, основу молекулы люциферина червя Chaetopterus составляет пероксид полиненасыщенной жирной кислоты (ПНЖК) или пероксид полиненасыщенной жирной кислоты (ПНЖК) конденсированный с глицерил гликозидом. Такие структуры ранее не встречались в качестве субстратов биолюминесцентных реакций. Лиофильно высушенный субстрат хранится при - 20°С без снижения активности не менее 30 дней, чаще не менее 60 дней, обычно не менее года.
Авторами настоящего изобретения разработан путь синтеза неприродных полиненасыщенных жирных кислот на примере (42,72,102)-гексадека-4,7,10-триеновой кислоты - структурного фрагмента люциферина червя Chaetopterus variopedatus 1-гидрокси- 3-(((2Р,ЗР,45,5Р,6Р)-3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2Н-пиран-2- ил)окси)пропан-2-ил(42,8Е,102)-7-гидропероксигексадека-4,8,10-триеноат (схема 1). Рекомендованная схема синтеза указанного соединения включает 10 стадий и использует гептин-1 в качестве исходного вещества. Её достоинствами являются: мягкие условия проведения реакций на стадиях кросс-сочетания благодаря катализу солями меди и высокие выходы при получении соответствующих пропаргилбромидов в реакции Аппеля. Последующие конденсация (42,72,102)-гексадека-4,7,10-триеновой кислоты 8 с глицерил тетраацетилгликозидом, удаление ацетильных защитных групп и пероксидирование синглетным кислородом в присутствии метиленового голубого приводят к целевому продукту - люциферину червя Chaetopterus variopedatus.
Figure imgf000015_0001
11: R1 = Н, R2 = ПНЖК 12: R ~ ПНЖК, R2~ H
Схема 1. Синтез люциферина червя Chaetopterus - 1-rnflpoKcn-3-(((2R,3R,4S,5R,6R)- 3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)окси)пропан-2-ил(4 ,8Е,10 )- 7-гидропероксигексадека-4,8,10-триеноата и его региоизомера 2-гид рокси-3- (((2Р,ЗР,45,5Р,6Р)-3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2Н-пиран-2- ил)окси)пропил (4 ,8Е,10 )-7-гидропероксигексадека-4,8,10-триеноата.
Состав условий для развития биолюминесцентного сигнала
Формирование биолюминесценции зависит от количества и сохранности люциферазы в биологических образцах. Так же следует отметить воздействие светового излучения, особенно УФ части спектра, на люциферин, приводящее к его деградации и утрате функциональности. На формирование сигнала влияет pH реакционной смеси. Формирование биолюминесцентного сигнала происходит в диапазоне pH от 6.0 до 9.8, обычно в диапазоне pH от 6.5 до 9.0, преимущественно, в диапазоне от 7.0 до 8.0. Для обеспечения pH могут быть использованы любые стандартные буферные растворы для данного диапазона pH, включая фосфатный буфер, HEPES, Трис-HCI. В преимущественных воплощениях молярность буферного раствора не превышает 2, например, не превышает 1, чаще находится в диапазоне от 0.05 до 0.4, обычно от 0.1 до 0.2.
Реакционные смеси для нужд настоящего изобретения могут также содержать ингибиторы протеаз, например, фенилуксусную кислоту или щавелевую кислоту в стандартно используемых концентрациях.
Для нужд настоящего изобретения люциферин согласно настоящему изобретению и/или его функциональные аналоги по изобретению добавляют к биологическому образцу до конечной концентрации 0.03 - 300 мкМ, чаще 1 - 5 мкМ.
В некоторых вариантах воплощения изобретения к образцу добавляют смесь реагентов, включающих буферный раствор, компоненты, стабилизирующие и защищающие ферменты биолюминесцентной системы от деградации протеазами и раствор FeSCU. В других воплощениях к биологическому образцу сперва добавляют буферный раствор, компоненты, защищающие ферменты от деградации протеазами, а затем раствор люциферина согласно настоящему изобретению и/или его функциональных аналогов и раствор FeSCU.
В зависимости от растворителя, использованного для приготовления раствора люциферина согласно настоящему изобретению и/или его функциональных аналогов, реакционная смесь может содержать небольшие количества использованных растворителей.
Развитие биолюминесцентного сигнала происходит в широком диапазоне температур - от 4 до 40°С, оптимально при 20-25°С.
Формирование люминесцентного сигнала начинается сразу после инициации реакции при добавлении ключевых реактивов для выявления активности люциферазы, указанных выше.
Максимальная интенсивность люминесценции наблюдается в момент инициации реакции. Далее идет спад, скорость которого определяется активностью ферментов и начальными концентрациями субстратов. При определенных условиях (субстратов много, активность ферментов мала, температура реакции снижена) реакция может наблюдаться в течение 30 и более минут (фигура 1).
Детекция биолюминесценции
Методы настоящего изобретения включают детекцию биолюминесценции, возникающей в биологическом образце, содержащем люциферазу, при появлении в нем люциферина.
Биолюминесценция может быть обнаружена с помощью методов, известных специалистам в данной области, в частности, с помощью визуального скрининга или с использованием люминометра, фотометра, флуориметра, цифровой фотокамеры, с помощью светочувствительной фотопленки. В качестве количественной характеристики может быть использована максимальная интенсивность люминесценции, которая достигается через 1-5 сек после инициации биолюминесцентной реакции или скорость нарастания люминесценции в интервале до 30 мин после инициации биолюминесцентной реакции, например, в течение 1, 5, 10, 20, 30, 60 сек после инициации реакции или дольше.
В преимущественных воплощениях измеряемая люминесценция представляет собой, световые вспышки скорее, чем длительное свечение. В преимущественных воплощениях интенсивность люминесценции зависит от активности ферментов биолюминесцентной системы, присутствующих в образце, начальных концентраций субстратов и температуры реакционной смеси и обычно колеблется в пределах от 10 кв/сек до 10 млн кв/сек, чаще 100 - 100000 кв/сек.
Реакция длится не менее 5 мин после инициации, чаще 10-15 мин, иногда (в зависимости от условий) 30 и более минут.
Испускаемый при окислении люциферина согласно настоящему изобретению и/или его функциональных аналогов свет находится в диапазоне от 440 до 510 нм, чаще в диапазоне от 450 до 475 нм, с максимумом эмиссии при 455-461 нм.
Способы применения
Методы и реактивы настоящего изобретения могут быть использованы в широком спектре биолюминесцентных анализов in vivo и in vitro.
В частности, методы и реактивы настоящего изобретения могут быть использованы для выявления активных компонентов биолюминесцентных системы полихет Chaetopterus variopedatus в процессе их очистки.
Также методы и реактивы настоящего изобретения могут быть использованы для выявления функциональных аналогов ферментов биолюминесцентной системы полихет Chaetopterus variopedatus в биологических образцах.
Также методы и реактивы настоящего изобретения могут быть использованы для выявления активности рекомбинантной люциферазы в клетках-хозяевах.
В некоторых вариантах воплощения изобретения для осуществления применения должна быть получена нуклеиновая кислота, кодирующая люциферазу. Полученная нуклеиновая кислота должна быть встроена в кассету экспрессии, обеспечивающую временную или постоянную экспрессию этой нуклеиновой кислоты в клетках-хозяевах, например под интересующими исследователя промоторами. Кассета экспрессии может содержать элементы, обеспечивающие адресную доставку конструкции в интересующие клетки или клеточные компартменты, или находится в составе частиц, обеспечивающих адресную доставку. После трансфекции клеток кассетой экспрессии (например, в составе экспрессионного вектора) и по истечении времени, необходимого для наработки в клетках продукта экспрессии, может быть осуществлено выявление активности люциферазы внутри клеток или в клеточном лизате.
Наборы
Также обеспечиваются в соответствии с настоящим изобретением наборы для использования при осуществлении вышеописанных применений.
В некоторых воплощениях наборы обычно включают люциферин согласно настоящему изобретению и/или его функциональный аналог, предпочтительно с буферным раствором для растворения указанного субстрата и/или его добавления к биологическим образцам. Люциферин согласно настоящему изобретению и/или его функциональный аналог могут присутствовать в растворенном виде в соответствующей среде для хранения, такой как водный или буферный раствор, обычно в соответствующей емкости. Альтернативно, люциферин согласно настоящему изобретению и/или его функциональный аналог могут присутствовать в наборе в лиофилизованном виде.
В дополнение к описанным выше компонентам, заявленные наборы могут дополнительно включать инструкции для осуществления заявленных способов. Эти инструкции могут присутствовать в заявленных наборах в различных формах (например, в печатном варианте или на электронном носителе в виде текстового и/или графического файла) в количестве одна или более.
Биолюминисцентные композиции
Также обеспечиваются в соответствии с настоящим изобретением биолюминисцентные композиции для использования при осуществлении вышеописанных применений.
В некоторых воплощениях композиции обычно включают люциферин согласно настоящему изобретению и/или его функциональный аналог, предпочтительно с буферным раствором для растворения указанного субстрата и/или его добавления к биологическим образцам. Люциферин согласно настоящему изобретению и/или его функциональный аналог могут присутствовать в растворенном виде в соответствующей среде для хранения, такой как водный или буферный раствор. Альтернативно, люциферин согласно настоящему изобретению и/или его функциональный аналог могут присутствовать в композиции в лиофилизованном виде.
В дополнение к описанным выше компонентам, заявленные композиции могут дополнительно включать вспомогательные вещества, в частности, адъюванты, растворители и/или наполнители, такие, которые совместимы с соединениями, составляющими суть данного изобретения, и которые не разрушают биологической активности этих соединений.
Следующие примеры предлагаются в качестве иллюстративных, но не ограничивающих. Примеры
Получение образцов нативной люциферазы
Образцы люциферазы для измерения люминесцентной активности и экспериментов по конверсии in vitro были получены согласно следующей процедуре.
Очищенные образцы люциферазы С. variopedatus были получены в результате последовательной очистки водного экстракта замороженных червей: 100 г замороженной биомассы С. variopedatus гомогенизировали в 300 мл 10 мМ фосфатного буфера с pH 7.5, затем подвергали ультразвуковой обработке и центрифугированию (25000 g х 20 мин) при 4°С на центрифуге Avanti® J-E (Beck-man Coulter, USA). Супернатант ступенчато насыщали сульфатом аммония до концентрации 30%, а затем 60%, с повторным центрифугированием в тех же условиях после каждой стадии. Итоговый осадок разводили в 35 мл 10 мМ фосфатного буфера с pH 6, и диализовали 1 ч при 4°С. Полученный образец центрифугировали 25000 g х 20 мин при 4°С, супернатант пропускали через колонку 30 х 100 мм с Cellulose DEAE-32 (Serva), уравновешенную 10 мМ фосфатным буфером с pH 6. К итоговым 100 мл образца добавляли 500 мкл 2 М фосфатного буфера с pH 9 и наносили на колонку 16 х 200 мм с Sepharose DEAE FF (GE Sweden), уравновешенную 10 мМ фосфатным буфером с pH 7.5. После промывки колонки 10 мМ фосфатным буфером с pH 7.5, проводили элюцию линейным градиентом 160 мл того же буфера, но с 0.5 М NaCI, со скоростью 4 мл/мин. Итоговые активные фракции объединяли, добавили к ним сульфат аммония до концентрации 60%, затем центрифугировали 25000 g х 20 мин при 4°С. Полученный осадок разводили в 10 мл 10 мМ фосфатного буфера с pH 7.5 и наносили на колонку 30 х 1000 мм с Sephacryl S-200, уравновешенную 100 мМ фосфатным буфером с pH 7.5. Элюцию проводили со скоростью 1.5 мл/мин. Активные фракции объединяли, разводили водой до конечной концентрации буфера 25 мМ и наносили со скоростью 2 мл/мин на колонку 10 х 500 мм с Sepharose DEAE FF, уравновешенную 10 мМ фосфатного буфера с pH 7.5. После промывки колонки элюцию образцов проводили линейным градиентом 300 мл 0.5 М NaCI в фосфатном буфере, со скоростью 4 мл/мин. Активные фракции объединяли и концентрировали до объёма 200 мкл на центрифужных фильтрах 30 кДа Ultracel-30 (Amicon, Ireland), после чего наносили со скоростью 0.5 мл/мин на колонку Superdex200, уравновешенную 100 мМ фосфатным буфером (pH 7.5). Результат этой хроматографии показан на фигуре 2.
Экстракция, разделение и очистка субстратов люциферазы Chaetopterus.
Получение препарата люциферина.
Люциферин экстрагировали из Юг замороженной биомассы С. variopedatus 20 мл 70% этанола в течение 1 часа при 0°С, после чего центрифугировали 25000 g х 20 мин при 4°С. Полученный супернатант разводили равным объёмом дистиллированной воды и наносили на концентрирующий патрон С16М (Биохиммак, Москва). После промывки 50% этанолом, образец элюировали 2 мл 96% этанола и доводили его объём до 100 мкл на вакуумном концентраторе «Eppendorf 5301». Полученный препарат люциферина далее использовали в качестве субстрата в проводимых реакциях.
Методика выделения субстрата (аналога) С. variopedatus из водоросли Chaetomorpha Нпит.
Извлекали из аквариума 10 г водоросли С. Нпит, промывали в дистиллированной воде от остатков морской воды. Гомогенизировали в 100 мл дистиллированной воды с помощью механического гомогенизатора. К гомогенату добавляли этилового спирта до 60% конечной концентрации. Центрифугировали 25000д х 20мин на центрифуге Avanti® J-E (Beck-man Coulter, USA). Осадок отбросили, супернатант развели в 2 раза 10 мМ фосфатным буфером pH 9.0. Получившийся экстракт пропустили через колонку 30x100 мм, содержащую сорбент Cellulose DEAE 32 (хроматограф BioLogic Duo-Flow). Фильтрат нанесли на колонку 20x100 мм, содержащую сорбент Диасорб-60-С16Т (Биохиммак, Москва). Колонку промывали раствором 50% этанола-вода. Искомое вещество элюировали с сорбента 96% этанолом в условиях изократики. Активные пробы были объединены, всего получилось 10 мл. Получившийся образец высушили на испарителе и развели в 400 мкл 96% этанола и очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. Использовали полупрепаративную колонку (9,4 х 250 мм), ZORBAX Eclipse XDB-C18 (Agilent Technologies), соединенную с хроматографом Agilent 1260 Infinity LC. Элюирование проводили с использованием программы градиентного элюирования: растворитель А представлял собой 0,1% муравьиную кислоту, а растворитель В представлял собой ацетонитрил. Стандартная градиентная программа составляла 5-40% В в течение 25 мин. И колонку, и растворители поддерживали при комнатной температуре со скоростью потока 3 мл/мин. Поглощение контролировали при 210, 230, 250, 270, 290, 310, 330 и 360 нм. Фракции проявляющие активность, соответствующие пикам 1-3, собирали отдельно (Фигура 3). В результате были получены 3 активных пика. Пики рехроматографировали по отдельности на той же колонке. Полученные активные фракции пиков высушили на роторном испарителе Eppendorf concentrator 5301 при комнатной температуре и развели в 100 мкл 96% этанола. После чего, провели гельфильтрационную хроматографию, этих практически гомогенных веществ, на колонке Superdex Peptide 10/300 GL в смеси 0,1% муравьиной кислоты и 50% ацетонитрила. Фракции, содержащие активность, объединили и высушили на роторном испарителе.
ЯМР-спектроскопия и масс-спектрометрия.
ЯМР-спектроскопия
Структуры субстратов биолюминесцентной реакции Chaetopterus variopedatus (люциферинов) (10Е,127)-9-гидропероксиоктадекадиеновой кислоты, 1-гидрокси-З- (((2Р,ЗР,48,5Р,6Р)-3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2Н-пиран-2- ил)окси)пропан-2-ил(42,8Е,102)-7-гидропероксигексадека-4,8,10-триеноата и его региоизомера 2-гидрокси-3-(((2Я,ЗЯ,48,5Я,6Я)-3,4,5-тригидрокси-6-
(гидроксиметил)тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)окси)пропил (4 ,8Е,10 )-7-гидропероксигексадека- 4,8,10-триеноата подтверждены совокупностью данных ЯМР-спектроскопии (см. табл. 1-3).
Для определения структуры люминесцентных соединений, полученных из водоросли Chaetomorpha Нпит, был использован традиционный подход, основанный на ЯМР, включающий анализ 1D 1Н и 13С, 2D DQF-COSY, 2D 1Н-13С HSQC и 2D 1Н-13С НМВС и 2D 1Н- 13С HSQC -TOCSY спектров, зарегистрированных в ДМСО-бб. В первую очередь была определена структура соединения peak #3 (фигура 4). Это соединение характеризовалось массой молекулярного иона [М-Н]-, равной 311.222, и дополнительным пиком в МС с m/z 293.212. Согласно ЯМР-спектрам (10Е,122)-9-гидропероксиоктадекадиеновая кислота (таблица 1) представляет собой линейную молекулу, содержащую карбоксильную группу (13С 174.89 м.д. и уширенный протонный синглет при 12 м.д.), две двойные связи и гидропероксидную группу (синглетный протон при 11.27 м.д. и третичный углерод при 85.08 м.д.). Структура peak #3 (фигура 4) соответствует (10 Е, 122)-9-гидропероксиоктадека-10,12- диеновой кислоте. Конфигурация двойных связей была определена на основе значений констант спин-спинового взаимодействия (КССВ), которые были равны 15 Гц для связи 10-11 и 11 Гц для связи 12-13. Структура идеально соответствует массе молекулярного иона 311 .222, дополнительный мажорный пик 293.212 в масс-спектре - это продукт восстановления пероксида с карбонильной группой в положении 9.
Таблица 1. Химические сдвиги и данные ЯМР для (10E,12Z)-9- гидропероксиоктадекадиеновой кислоты.
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
Для соединений peak #1 и peak #2 (фигура 4) (1-rnflpoKCH-3-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5- тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)окси)пропан-2-ил(42,8Е,1С^)-7- гидропероксигексадека-4,8,10-триеноат и 2-rHflpoKCH-3-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-TpnrHflpoKCH- 6-(гидроксиметил)тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)окси)пропил (4Z.8E, 10Z)-7- гидропероксигексадека-4,8,10-триеноата соответственно) наблюдались практически идентичные паттерны фрагментации в масс-спектрах высокого разрешения с основными пиками при m/z 483.263, 501.269 и 536.314 в режиме регистрации положительных ионов. Анализ спектров ЯМР показал, что оба соединения содержат три идентичных остатка с различными типами сочленения: гексапиранозу, глицерин и модифицированную полиненасыщенную жирную кислоту. В peak #1 жирная кислота связана со вторым углеродом глицерина, в то время как для peak #2 глицерин замещен в положениях 1 и 3. Анализ гексапиранозного фрагмента позволил однозначно установить его как b-галактозу на основе химических сдвигов 13С (с использованием программного обеспечения CASPER (Lundborg M , Widmalm G., Methods Mol Biol. 2015, 1273, 29-40.) и величин констант спин спинового взаимодействия в спектрах 1Н. КССВ Н1-Н2 равна 7 Гц, что предполагает b-конфигурацию аномерного углерода; и небольшая КССВ (менее 2 Гц) наблюдается между протонами Н4 и Н5, что подразумевает галактозную конфигурацию гексапиранозы. В отличие от peak #3, жирная кислота peak #1 и peak #2 насчитывала 16 атомов углерода и содержала 3 двойные связи в положениях 4 (Z), 8 (£) и 10 (Z), с гидропероксидной группой в положении 7 ((4 Z, 8 Е, 102)-7-гидропероксигексадека-4,8,10-триеновая кислота). Согласно данным ЯМР, расчетная молекулярная масса соединения равна 518.27, что не соответствует ни одному из пиков наблюдаемых в спектре ВЭЖХ-МС, однако молекулярный ион [М+Н]+ с m/z = 501.296 соответствует М-Н20+Н+, m/z 483.26 соответствует M-2Ή2O+I-G, тогда как m/z 536.31 может соответствовать M+NhV. Можно предположить, что гидропероксиды peak #1 и peak #2 не выдерживают ионизацию протонами и превращаются в кетоны. Структуры соединений peak #1 и peak #2 и химические сдвиги ЯМР показаны на фигуре 4 и в таблицах 2 и 3. Таблица 2. Химические сдвиги и данные ЯМР 1-rnflpoKcn-3-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5- тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)окси)пропан-2-ил(4 ,8Е,10 )-7- гид ропероксигексадека-4,8, 10-триеноата
Figure imgf000023_0001
dDR - КССВ замеренный в эксперименте двойного резонанса
Таблица 3. Химические сдвиги и данные ЯМР для 2-rnflpoKcn-3-(((2R,3R,4S,5R,6R)- 3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)окси)пропил (4Z.8E, 10Z)-7- гид ропероксигексадека-4,8, 10-триеноата.
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
Общая методика получения пероксидов ПНЖК с помощью липоксигеназ LOX
К 10 мл боратного буфера (рН=9) добавляли ПНЖК (0,3 ммоль), перемешивали полчаса для получения однородной эмульсии. Смесь охлаждали до 0°С и добавляли 5 мг соевой липоксигеназы LOX-1 (Sigma Aldrich, type-IB, > 50000 units/mg). Продували кислород через получившуюся смесь, поддерживая температуру в пределах от 0°С до 5°С в ходе реакции. За полнотой протекания реакции следили по ТСХ (СНС1з:1РА 20:1). Реакционную смесь разбавляли 30 мл насыщенного раствора NH4CI и экстрагировали эфиром (3 x 15 мл). Органическую фазу сушили над безводным Na2S04, растворитель упаривали. Продукт выделяли с помощью флеш-хроматографии на картридже PF50SIHC-F0012, (Г ексан:/РЮН=95:5).
Общая методика получения пероксидов ПНЖК окислением синглетным кислородом в присутствии метиленового голубого
Для получения пероксидов методом фотоокисления, ПНЖК и их производные (0,1 ммоль) растворяли в 1 мл метанола и помещали полученный раствор в ампулу. Добавляли раствор 0.1 мг/мл метиленового голубого (0.13 ммоль) в метаноле. Лампу (Nova II, 150 Ватт) помещали на расстоянии 15-20 см перед ампулой и пробулькивали кислород через реакционную смесь в течение 4-6 ч, до тех пор, пока ТСХ не демонстрировало полного превращения исходных ПНЖК и их производных в более полярные продукты. Затем реакционную смесь упаривали, растворяли в 3 мл дихлорметана и промывали водой (2 x 1 мл) и насыщенным раствором NaCI (1 x 1 мл). ДХМ упаривали, полученную смесь очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (элюент А -вода, элюент В - ацетонитрил, скорость потока 5 мл/мин, линейный градиент от 30-100% В за 25 мин). Фракции, содержащие целевое вещество, лиофилизировали и анализировали с помощью ОФ-ВЭЖХ.
Использование (10E,12Z)-9-гидpopepokcиoktaдeka-10,12-диeнoвoй кислоты для выявления люциферазы в биологических образцах.
Люциферин ((10Е,122)-9-гидропероксиоктадека-10,12-диеновая кислота) был получен, как описано выше в разделе «Экстракция, разделение и очистка субстратов люциферазы Chaetopterus». В качестве образцов использовали хроматографически очищенный на колонке Superdex 200 белковый препарат из биомассы червя Chaetopterus variopedatus. Данный препарат был получены как описано выше в разделе «Получение частично очищенной люциферазы». 1 мкл 0,3 мкМ раствора субстрата (10Е,12г)-9-гидропероксиоктадека-10,12-диеновая кислота в метаноле, 1 мкл 100 мкМ FeSCU.
В ходе эксперимента в каждом случае сначала измеряли фоновую люминесценцию люциферазной фракции, затем добавляли аликвоты раствора (10E,12Z)-9- гидропероксиоктадека-10,12-диеновой кислоты. Биолюминесцентную реакцию инициировали впрыском в измерительную кювету 1 мкл 100 мкМ раствора сульфата железа (Fe2+). Во всех случаях была выявлена люминесценция биологических образцов.
Измерение зависимости интенсивности биолюминесценции от количества субстрата
Для измерения зависимости интенсивности свечения от количества препарата люциферина в реакционную смесь, содержащую 200 мкл 0.2 М фосфатного буфера с pH 7.5 и 5 мкл хроматографически очищенной люциферазы, вносили 0,5 мкл препарата люциферина ((10Е,127)-9-гидропероксиоктадека-10,12-диеновой кислоты), предварительно разводя его в метаноле для получения разной концентрации. Биолюминесцентную реакцию инициировали впрыском в измерительную кювету 10 мкл 25 мкМ раствора сульфата железа (Fe2+). Полученная зависимость близка к линейной: при варьировании количества люциферина интенсивность биолюминесценции меняется более чем в 100 раз (Фигура 5).
Использование (10E,12Z)-9-гидpopepokcиoktaдeka-10,12-диeнoвoй кислоты для детекции биолюминесценции в биологических образцах.
Люциферин ((10E,12Z)-9-rnflponepoKCHOKTafleKa-10,12-flneHOBan кислота) был получен, как описано выше в разделе «Экстракция, разделение и очистка субстратов люциферазы Chaetopterus». В качестве биологических образцов использовали осветленные лизаты тканей Chaetopterus variopedatus. Лизаты тканей были получены как описано выше в разделе «Получение частично очищенной люциферазы».
1 мкл 0,3 мкМ раствора субстрата (10Е,12г)-9-гидропероксиоктадека-10,12-диеновая кислота в метаноле, 1 мкл 100 мкМ FeSCU.
В ходе эксперимента в каждом случае сначала измеряли фоновую люминесценцию лизата, затем добавляли аликвоты раствора (10E,12Z)-9-rnflponepoKcnoKTafleKa-10,12- диеновой кислоты. Биолюминесцентную реакцию инициировали впрыском в измерительную кювету 1 мкл 100 мкМ раствора сульфата железа (Fe2+). Во всех случаях была выявлена люминесценция биологических образцов.
Использование 1-mflpoKcn-3-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-TpnmflpoKcn-6-
(гидроксиметил)тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)окси)пропан-2-ил(4 ,8Е,10г)-7- гидропероксигексадека-4,8,10-триеноата и/или 2-mflpoKCH-3-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5- тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)окси)пропил (4Z,8E,10Z)-7- гидропероксигексадека-4,8,10-триеноата для детекции биолюминесценции в биологических образцах.
Люциферин 1-гидрокси-3-(((2Р,ЗР,48,5Р,6Р)-3,4,5-тригидрокси-6-
(гидроксиметил)тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)окси)пропан-2-ил(4 ,8Е,10 )-7- гидропероксигексадека-4,8,10-триеноата и/или 2-rnflpoKCH-3-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5- тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)окси)пропил (4Z.8E, 10Z)-7- гидропероксигексадека-4,8,10-триеноата был получен, как описано выше в разделе «Порядок экстракции предлюциферина». В качестве биологических образцов использовали осветленные лизаты тканей Chaetopterus variopedatus. Лизаты тканей были получены как описано выше в разделе «Получение частично очищенной люциферазы»
1 мкл 0,3 мкМ раствора субстрата 1-rHflpoKCH-3-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-TpnrHflpoKCH-6- (rnflpoKcnMeTnn)TeTparnflpo-2H-nnpaH-2-nn)OKcn)nponaH-2-nn(4Z,8E,10Z)-7- гидропероксигексадека-4,8,10-триеноата и/или 2-rnflpoKCH-3-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5- тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)окси)пропил (4Z.8E, 10Z)-7- гидропероксигексадека-4,8,10-триеноата в метаноле, 1 мкл 100 мкМ FeSCU.
В ходе эксперимента в каждом случае сначала измеряли фоновую люминесценцию лизата, затем добавляли аликвоты раствора 1-rnflpoKCH-3-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-
TpnrnflpoKcn-6-(rnflpoKcnMeTnn)TeTparnflpo-2H-nnpaH-2-nn)OKcn)nponaH-2-nn(4Z,8E,10Z)-7- гидропероксигексадека-4,8,10-триеноата и/или 2-rnflpoKCH-3-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5- тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)окси)пропил (4Z.8E, 10Z)-7- гидропероксигексадека-4,8,10-триеноата. Биолюминесцентную реакцию инициировали впрыском в измерительную кювету 1 мкл 100 мкМ раствора сульфата железа (Fe2+). Во всех случаях была выявлена люминесценция биологических образцов.
Использование гидропероксидов полиненасыщенных жирных кислот для выявления люциферазы в биологических образцах.
Г идропероксиды полиненасыщенных жирных кислот были получены, как описано выше в разделах «Общая методика получения пероксидов ПНЖК с помощью липоксигеназ LOX» и «Общая методика получения пероксидов ПНЖК окислением синглетным кислородом в присутствии метиленового голубого». В качестве образцов использовали хроматографически очищенный на колонке Superdex 200 белковый препарат из биомассы червя Chaetopterus variopedatus. Данный препарат был получены как описано выше в разделе «Получение частично очищенной люциферазы».
1 мкл 0,3 мкМ раствора субстрата гидропероксида ПНЖК в метаноле, 1 мкл 100 мкМ
FeSC
В ходе эксперимента в каждом случае сначала измеряли фоновую люминесценцию люциферазной фракции, затем добавляли аликвоты раствора функционального аналога люциферина. Биолюминесцентную реакцию инициировали впрыском в измерительную кювету 1 мкл 100 мкМ раствора сульфата железа (Fe2+). Во всех случаях была выявлена люминесценция биологических образцов. (Фигура 6)
В качестве модельных субстратов использовали: пероксиды линолевой кислоты.
LOX: 9-гидропероксид (10Е,122)-октадекад неновой (линолевой) кислоты.
Синглетный кислород (1Ог): 9-,10-,12- и 13-гидропероксиды октадекадиеновой (линолевой) кислоты, и пероксиды линоленовой кислоты.
LOX: 9- и 13-гидропероксиды октадекатриеновой (линоленовой) кислоты.
Синглетный кислород (1Ог): 9-,10-,12-, 13-, 15- и 16-гидропероксиды октадекатриеновой (линоленовой) кислоты.
Использование гидропероксидов гликолипидов, содержащих диольный линкер для выявления люциферазы в биологических образцах.
Гидропероксиды гликолипидов были получены, как описано выше в разделе «Общая методика получения пероксидов ПНЖК окислением синглетным кислородом в присутствии метиленового голубого». В качестве биологических образцов использовали хроматографически очищенный на колонке Superdex 200 белковый препарат из биомассы червя Chaetopterus variopedatus. Данный препарат был получены как описано выше в разделе «Получение частично очищенной люциферазы».
1 мкл 0,06 мкМ раствора субстрата гидропероксида гликолипида в метаноле, 1 мкл 100 мкМ FeSCU
В ходе эксперимента в каждом случае сначала измеряли фоновую люминесценцию люциферазной фракции, затем добавляли аликвоты раствора функционального аналога люциферина. Биолюминесцентную реакцию инициировали впрыском в измерительную кювету 1 мкл 100 мкМ раствора сульфата железа (Fe2+). Во всех случаях была выявлена люминесценция биологических образцов. (Фигура 7)
В качестве модельных субстратов использовали смесь 9-, 10-, 12- и 13-гидропероксидов 1 -оксопропил^-О-галактопиранозид (9Z, 127)-октадекад иеноата:
Использование гидропероксидов гликолипидов, содержащих триольный линкер для выявления люциферазы в биологических образцах.
Гидропероксиды гликолипидов были получены, как описано выше в разделе «Общая методика получения пероксидов ПНЖК окислением синглетным кислородом в присутствии метиленового голубого». В качестве биологических образцов использовали хроматографически очищенный на колонке Superdex 200 белковый препарат из биомассы червя Chaetopterus variopedatus. Данный препарат был получены как описано выше в разделе «Получение частично очищенной люциферазы». 1 мкл 0,3 мкМ раствора субстрата гидропероксида гликолипида в метаноле, 1 мкл 100 мкМ FeSCU
В ходе эксперимента в каждом случае сначала измеряли фоновую люминесценцию люциферазной фракции, затем добавляли аликвоты раствора функционального аналога люциферина. Биолюминесцентную реакцию инициировали впрыском в измерительную кювету 1 мкл 100 мкМ раствора сульфата железа (Fe2+). Во всех случаях была выявлена люминесценция биологических образцов. (Фигура 8)
В качестве модельных субстратов использовали смесь 9-, 10-, 12- и 13-гидропероксидов 2- и 3-глицеролф-0-галактопиранозид-(97,127)-октадекадиеноата
Использование гидропероксидов ПНЖК сопряженных с флуоресцентными красителями для выявления люциферазы в биологических образцах.
Гидропероксиды ПНЖК сопряженных с флуоресцентными красителями были получены, как описано выше в разделе «Общая методика получения пероксидов ПНЖК окислением синглетным кислородом в присутствии метиленового голубого». В качестве биологических образцов использовали хроматографически очищенный на колонке Superdex 200 белковый препарат из биомассы червя Chaetopterus variopedatus. Данный препарат был получены как описано выше в разделе «Получение частично очищенной люциферазы».
1 мкл 0,3 мкМ раствора субстрата гидропероксида гликолипида в метаноле, 1 мкл 100 мкМ FeSCU
В ходе эксперимента в каждом случае сначала измеряли фоновую люминесценцию люциферазной фракции, затем добавляли аликвоты раствора функционального аналога люциферина. Биолюминесцентную реакцию инициировали впрыском в измерительную кювету 1 мкл 100 мкМ раствора сульфата железа (Fe2+). Во всех случаях была выявлена люминесценция биологических образцов. (Фигура 9).
В качестве модельных субстратов использовали смесь 9-, 10-, 12- и 13-гидропероксидов линолевой кислоты, сопряженной с флуоресцеином (9,10,12,13-гидропероксиды 2-(6- (((9 ,127)-октадека-9,12-диеноил)окси)-3-оксо-ЗН-ксантен-9-ил) бензойной кислоты) и смесь 9-,10-,12- и 13-гидропероксидов линолевой кислоты, сопряженной с эозином (9,10,12,13- гидропероксиды 2-(2,4,5,7-тетрабромо-6-(((9 ,127)-9-гидропероксиоктадека-9,12- диеноил)окси)-3-оксо-ЗН-ксантен-9-ил) бензойной кислоты).
Использование полиненасыщенных жирных кислот для выявления люциферазы в биологических образцах.
В качестве биологических образцов использовали хроматографически очищенный на колонке Superdex 200 белковый препарат из биомассы червя Chaetopterus variopedatus. Данный препарат был получены как описано выше в разделе «Получение частично очищенной люциферазы». 1 мкл 1 мМ раствора субстрата линолевой кислоты в метаноле, 1 мкл соевой липоксигеназы LOX-1 (Sigma Aldrich, type-IB, > 50000 units/mg) в фосфатном буфере pH 7.4. В ходе эксперимента описанную реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем добавляли 1 мкл люциферазной фракции 1 мг/мл, биолюминесцентную реакцию инициировали впрыском в измерительную кювету 1 мкл 100 мкМ раствора сульфата железа (Fe2+). Во всех случаях была выявлена люминесценция биологических образцов.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Соединение общей формулы (I) или общей формулы (II):
Figure imgf000031_0002
формула ( ), или его таутомер, стереоизомер или энантиомер, фармацевтически приемлемая соль, сольват или гидрат, где: п выбирается независимо и представляет собой 0-3; х выбирается независимо и представляет собой 1-5; m выбирается независимо и представляет собой 1-6; у выбирается независимо и представляет собой 0-7;
R выбирается независимо и представляет собой -Смо-алкил, замещенный или незамещенный моно, ди, три или тетрациклический Сб-го-арил, необязательно содержащий гетероатом, выбранный из 0-3 атомов О, 0-6 атомов N, 0-3 атомов S, 0-2 атомов Si, где указанный моно, ди, три или тетрациклический Сб-го-арил может быть замещен 1-6 заместителями, выбранными из галогена, -С=0, фенила, фенил- СООН.
2. Соединение по п.1, которое характеризуется следующей структурной формулой:
Figure imgf000031_0001
3. Применение соединения по п.1 в качестве люциферина.
4. Соединение общей формулы (III):
Gly-Polyol-Acyl формула (III), или его таутомер, стереоизомер или энантиомер, фармацевтически приемлемая соль, сольват или гидрат, где Gly представляет собой углеводный фрагмент моносахарида,
Polyol выбирается независимо и представляет собой многоатомный спирт;
Acyl выбирается независимо и представляет собой гидропероксид полиненасыщенной жирной кислоты, который характеризуется следующей структурной формулой:
Figure imgf000032_0001
где п выбирается независимо и представляет собой 0-3; х выбирается независимо и представляет собой 1-5; m выбирается независимо и представляет собой 1-6; у выбирается независимо и представляет собой 0-7.
5. Соединение по п.4, в котором многоатомный спирт выбирается независимо и представляет собой диол или триол.
6. Соединение по п.4, в котором углеводный фрагмент представляет собой альдопентозу, альдогексозу, кетопентозу, кетогексозу.
7. Соединение по п.6, в котором углеводный фрагмент представляет собой рибозу, ксилозу, маннозу, галактозу, глюкозу, аллозу, рибулозу, ксилулозу, фруктозу или сорбозу.
8. Соединение по п.4, выбранное из группы:
Figure imgf000032_0002
9. Применение соединения по п.4 в качестве люциферина.
10. Соединение общей формулы (IV):
Figure imgf000032_0003
формула (IV), или его таутомер, стереоизомер или энантиомер, фармацевтически приемлемая соль, сольват или гидрат, где: n выбирается независимо и представляет собой 2-8; х выбирается независимо и представляет собой 1-7; m выбирается независимо и представляет собой 1-6.
11 . Применение соединения по п.10 в качестве предшественника люциферина.
12. Набор для детекции люциферазы в биологическом образце, включающий соединение по п.1 и/или по п.4.
13. Набор по п.12, который дополнительно включает буфер, глицерин и соли железа (II).
14. Набор по п.13, в котором указанные компоненты содержатся в допустимых количествах.
15. Биолюминесцентная композиция, включающая соединение по п.1 и/или по п.4 и/или по п.10 и люциферазу.
16. Композиция по п.15, в котором люцифераза является рекомбинантной.
17. Композиция по п.15, в которой люцифераза представляет собой люциферазу червя Chaetopterus variopedatus.
18. Способ детекции люциферазы в биологическом образце, включающем люциферазу и/или липоксигеназу, а также соединение по п.1 и/или по п.4 и/или по п.10.
19. Способ по п.18, в котором люцифераза представляет собой люциферазу червя Chaetopterus variopedatus.
20. Способ по п.18, в котором люцифераза представляет собой рекомбинантную люциферазу.
21. Способ по п.18, в котором биологический образец представляет собой ткань и/или клетку.
22. Способ по п.18, в котором биологический образец характеризуется значением pH в диапазоне от 7 до 8.
23. Способ по п.18, в котором липоксигеназа представляет собой рекомбинантную липоксигеназу.
24. Способ по.18, включающий следующие этапы: а) добавление соединения по п.1 и/или по п.4 и/или по п.10 к биологическому образцу для получения реакционной смеси; б) инкубирование реакционной смеси в условиях, подходящих для возникновения биолюминесценции; в) детектирование биолюминесценции в реакционной смеси.
25. Способ по п.23, в котором концентрация соединения составляет 0.03 - 300 мкМ.
26. Способ детекции биолюминесценции в биологическом образце, включающем люциферазу и/или липоксигеназу, а также соединение по п.1 и/или по п.4 и/или по п.10.
27. Способ по п.26, в котором люцифераза представляет собой рекомбинантную люциферазу.
28. Способ по п.26, в котором люцифераза представляет собой люциферазу червя Chaetopterus variopedatus.
29. Способ по п.26, в котором биологический образец представляет собой ткань и/или клетку.
30. Способ по п.26, в котором биологически образец характеризуется значением pH в диапазоне от 7 до 8.
31 . Способ по п.26, в котором липоксигеназа представляет собой рекомбинантную липоксигеназу.
32. Способ по п.26, включающий следующие этапы: а) экспрессию гена люциферазы в биологическом образце; б) добавление соединения по п.1 и/или по п.4 и/или по п.10 к биологическому образцу; в) детектированию биолюминесценции.
33. Способ по п.32, в котором концентрация соединения составляет 0.03 - 300 мкМ.
PCT/RU2021/050186 2020-06-26 2021-06-28 Метод и реактивы для детекции активности люциферазы WO2021262043A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020121381 2020-06-26
RU2020121381A RU2826202C2 (ru) 2020-06-26 Метод и реактивы для детекции активности люциферазы

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021262043A1 true WO2021262043A1 (ru) 2021-12-30

Family

ID=79281600

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2021/050186 WO2021262043A1 (ru) 2020-06-26 2021-06-28 Метод и реактивы для детекции активности люциферазы

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2021262043A1 (ru)

Non-Patent Citations (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AKAKABE YOSHIHIKO, KENJI MATSUI, TADAHIKO KAJIWARA: "2,4-Decadienals are Produced via (R)-1 1-HPITE from Arachidonic Acid in Marine Green Alga Ulva conglobata", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 11, no. 17, 15 August 2003 (2003-08-15), pages 3607 - 3609, XP055896508, DOI: 10.1016/s0968-0896(03)00364-x *
AKAKABE YOSHIHIKO, KENJI MATSUI, TADAHIKO KAJIWARA: "Enantioselective Formation of (R)-9-HPODE and (R)- 9-HPOTrE in Marine Green Alga Ulva conglobata", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 10, no. 10, 31 October 2002 (2002-10-31), pages 3171 - 3173, XP055896509, DOI: 10.1016/S0968-0896(02)00212-2 *
COLIN M, MORITZ S, SCHNEIDER H, CAPEAU J, COUTELLE C, BRAHIMI-HORN MC: "Haemoglobin interferes with the ex vivo luciferase luminescence assay: consequence for detection of luciferase reporter gene expression in vivo", GENE THERAPY, NATURE PUBLISHING GROUP, LONDON, GB, vol. 7, no. 15, 1 August 2000 (2000-08-01), GB , pages 1333 - 1336, XP055896512, ISSN: 0969-7128, DOI: 10.1038/sj.gt.3301248 *
DATABASE REGISTRY 11 August 1989 (1989-08-11), ANONYMOUS : "10,12-Octadecadienoic acid, 9-hydroperoxy-, (9S,10E,12E)- (CA INDEX NAME)", XP055896644, retrieved from STN Database accession no. 122046-44-0 *
DATABASE REGISTRY 15 December 1985 (1985-12-15), ANONYMOUS : " .beta.-D-Galactopyranoside, 2-[(12-hydroperoxy-1-oxo-9,13,15- octadecatrienyl)oxy]-3-[(1-oxo-9,12,15-octadecatrienyl)oxy]propyl (9CI) (CA INDEX NAME)", XP055896648, retrieved from STN Database accession no. 99389-38-5 *
DATABASE REGISTRY 15 December 1985 (1985-12-15), ANONYMOUS : " .beta.-D-Galactopyranoside, 3-[(12-hydroperoxy-1-oxo-9,13,15- octadecatrienyl)oxy]-2-[(1-oxo-9,12,15-octadecatrienyl)oxy]propyl (9CI) (CA INDEX NAME)", XP055896647, retrieved from STN Database accession no. 99389-41-0 *
DATABASE REGISTRY 15 June 2015 (2015-06-15), ANONYMOUS : "6,8,11,14-Eicosatetraenoic acid, 5-hydroperoxy-, methyl ester, (5R,6E,8Z,11Z,14Z)- (CA INDEX NAME)", XP055896633, retrieved from STN Database accession no. 1781265-66-4 *
DATABASE REGISTRY 15 May 2015 (2015-05-15), ANONYMOUS : " 9,11-Octadecadienoic acid, 8-hydroperoxy- (CA INDEX NAME) ", XP055896638, retrieved from STN Database accession no. 1705616-11-0 *
DATABASE REGISTRY 16 November 2017 (2017-11-16), ANONYMOUS : "10,12-Heptadecadienoic acid, 9-hydroperoxy-, (10E,12Z)- (CA INDEX NAME)", XP055896628, retrieved from STN Database accession no. 2143573-21-9 *
DATABASE REGISTRY 18 May 2015 (2015-05-18), ANONYMOUS : " 8,10,13,16,19-Docosapentaenoic acid, 7-hydroperoxy-, 2,3-dihydroxypropyl ester, (8E,10Z,13Z,16Z,19Z)- (CA INDEX NAME) ", XP055896636, retrieved from STN Database accession no. 1706571-79-0 *
DATABASE REGISTRY 18 October 1986 (1986-10-18), ANONYMOUS : "10,12-Octadecadienoic acid, 9-hydroperoxy-, (9R,10E,12E)- (CA INDEX NAME)", XP055896646, retrieved from STN Database accession no. 104759-96-8 *
DATABASE REGISTRY 19 November 2014 (2014-11-19), ANONYMOUS : "5,9,11,14-Eicosatetraenoic acid, 8-hydroperoxy-, ion(1-), (5Z,8R,9E,11Z,14Z)- (CA INDEX NAME)", XP055896640, retrieved from STN Database accession no. 1635396-23-4 *
DATABASE REGISTRY 21 December 2017 (2017-12-21), ANONYMOUS : " INDEX NAME NOT YET ASSIGNED", XP055896623, retrieved from STN Database accession no. 2162946-61-2 *
DATABASE REGISTRY 26 January 2017 (2017-01-26), ANONYMOUS : " 9,11-Octadecadienoic acid, 8-hydroperoxy-, (9Z,11E)- (CA INDEX NAME)", XP055896629, retrieved from STN Database accession no. 2059919-04-7 *
DATABASE REGISTRY 27 August 2015 (2015-08-27), ANONYMOUS : "INDEX NAME NOT YET ASSIGNED", XP055896631, retrieved from STN Database accession no. 1802727-88-3 *
DATABASE REGISTRY 3 December 2012 (2012-12-03), ANONYMOUS : "10,12-Octadecadienoic acid, 9-hydroperoxy-, (9S,10Z,12Z)- (CA INDEX NAME)", XP055896642, retrieved from STN Database accession no. 1409954-84-2 *
DATABASE REGISTRY 9 December 1988 (1988-12-09), ANONYMOUS : "9,11-Octadecadienoic acid, 13-hydroperoxy-, (E,Z)-, mixt. with (E,Z)-9-hydroperoxy-10,12-octadecadienoic acid (9CI) (CA INDEX NAME)", XP055896645, retrieved from STN Database accession no. 117914-65-5 *
ISMAILOV A.D.: "Bakterialnaia bioliuminestsentsiia: mekhanizmy obrazovaniia i vzaimodeistviia s liutsiferazoi aldegidnykh i flavinovykh substratov [Bacterial bioluminescence: mechanisms of formation and interaction with luciferase of aldehyde and flavin substrates]", ABSTRACT OF THE DISSERTATION FOR THE DEGREE OF DOCTOR OF BIOLOGICAL SCIENCES, 30 November 1994 (1994-11-30), RU, pages 1 - 53, XP009534244 *
POHNERT GEORG: "Phospholipase A2 Activity Triggers the Wound-Activated Chemical Defense in the Diatom Thalassiosira rotula", PLANT PHYSIOLOGY, AMERICAN SOCIETY OF PLANT PHYSIOLOGISTS, ROCKVILLE, MD, USA, vol. 129, no. 1, 1 May 2002 (2002-05-01), Rockville, Md, USA , pages 103 - 111, XP055896510, ISSN: 0032-0889, DOI: 10.1104/pp.010974 *
RODIONOVA N.S.: "Bioliuminestsentnye sistemy pochvennykh enkhitreid (Annelida: clitellata: oligochaeta: enchytraeidae) [BIOLUMINESCENT SYSTEMS OF SOIL ENCHITREIDS (ANNEL1DA:CLITELLATA:OLIGOCHAETA:ENCHYTRAEIDAE)]", AVTOREFERAT DISSERTATSII NA SOISK. UCH. ST. K.B.N. KRASNOYARSK [ABSTRACT OF THE DISSERTATION FOR THE DEGREE OF CANDIDATE OF BIOLOGICAL SCIENCES, 2004, Krasnoyarsk, RU, pages 1 - 24, XP009534245 *
SHUBINA LARISA, MAKARIEVA TATYANA, DENISENKO VLADIMIR, DMITRENOK PAVEL, DYSHLOVOY SERGEY, VON AMSBERG GUNHILD, GLAZUNOV VALERY, SI: "Absolute Configuration and Body Part Distribution of the Alkaloid 6-epi-Monanchorin from the Marine Polychaete Chaetopterus variopedatu", NATURAL PRODUCT COMMUNICATIONS, vol. 11, no. 9, 1 September 2016 (2016-09-01), pages 1253 - 1257, XP009533946, ISSN: 1934-578X, DOI: 10.1177/1934578X1601100915 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2020121381A (ru) 2021-12-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Shang et al. Fluorogenic protein labeling using a genetically encoded unstrained alkene
EP2804872B1 (en) Norbornene modified peptides and their labelling with tetrazine compounds
US9868956B2 (en) Methods
CN111747869B (zh) 一种遗传编码的甲醛反应性非天然氨基酸、制备方法及其应用
Plougastel et al. Sydnone-based turn-on fluorogenic probes for no-wash protein labeling and in-cell imaging
US20240018566A1 (en) Method and agents for detecting luciferase activity
Smith et al. Synthesis of bicyclic organo-peptide hybrids via oxime/intein-mediated macrocyclization followed by disulfide bond formation
Höfle et al. Isolation and biosynthesis of aurachin P and 5-nitroresorcinol from Stigmatella erecta
RU2826202C2 (ru) Метод и реактивы для детекции активности люциферазы
WO2021262043A1 (ru) Метод и реактивы для детекции активности люциферазы
CN106164263B (zh) 环丙烯氨基酸以及方法
Lee et al. Fungal metabolites, sorbicillinoid polyketides and their effects on the activation of peroxisome proliferator-activated receptor γ
WO2011105627A1 (en) Firefly luciferase
RU2744869C2 (ru) Метод и реактивы для детекции активности люциферазы
To et al. V., Schmitt, FJ, Budisa, N. & Friedrich, T. Residue-specific exchange of proline by proline analogs in fluorescent proteins: How" Molecular Surgery" of the backbone affects folding and stability
EP2311947A1 (en) Protein synthesis via click chemistry
AU767483B2 (en) Pholasin
WO2022010386A1 (ru) Применение кофактора f o и его аналогов в качестве компонента биолюминесцентной реакции
Humpf et al. Absolute stereochemistry of natural 3, 4-dihydroxy-β-ionone glycosides by the CD exciton chirality method
JP3937007B2 (ja) モノアシルジグリコシルモノアシルグリセロール誘導体及びその製造方法並びに該誘導体からなる界面活性剤
JP3937014B2 (ja) モノアシルトリグリコシルジアシルグリセロール誘導体及び該誘導体からなる界面活性剤
JP6441534B2 (ja) 発光酵素タンパク質
JP3861133B2 (ja) グルコシルフォスファチジルグリセロール誘導体の製造方法
Tsukatani et al. Genes for the type-I reaction center and galactolipid synthesis are required for chlorophyll a accumulation in a purple photosynthetic bacterium
Borrmann Expanding and exploring the bioconjugation toolbox

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21829359

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21829359

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

32PN Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established

Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC (EPO FORM 1205A DATED 20/06/2023)

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21829359

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1