WO2022010386A1 - Применение кофактора f o и его аналогов в качестве компонента биолюминесцентной реакции - Google Patents

Применение кофактора f o и его аналогов в качестве компонента биолюминесцентной реакции Download PDF

Info

Publication number
WO2022010386A1
WO2022010386A1 PCT/RU2021/050207 RU2021050207W WO2022010386A1 WO 2022010386 A1 WO2022010386 A1 WO 2022010386A1 RU 2021050207 W RU2021050207 W RU 2021050207W WO 2022010386 A1 WO2022010386 A1 WO 2022010386A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
luciferase
henlea
compound
biological sample
hydroxy
Prior art date
Application number
PCT/RU2021/050207
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Илья Викторович ЯМПОЛЬСКИЙ
Original Assignee
Илья Викторович ЯМПОЛЬСКИЙ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Илья Викторович ЯМПОЛЬСКИЙ filed Critical Илья Викторович ЯМПОЛЬСКИЙ
Publication of WO2022010386A1 publication Critical patent/WO2022010386A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D471/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase

Definitions

  • the present invention relates to biology, chemistry and biotechnology, namely to the bioluminescent system of worms of the genus Henlea (N. petushkovi, N. rodionovae).
  • Bioluminescence is the process of light emission by living organisms during a biochemical reaction in which chemical energy is converted into light energy. The ability to bioluminescence is determined by the presence of a specific luciferase protein or photoprotein. Luciferases are enzymes that catalyze the oxidation of low molecular weight compounds - luciferins, converting them into oxyluciferins. Oxidation is accompanied by the release of light and the release of oxyluciferin. Several types of bioluminescent systems have been described.
  • halistaurin mitrocomin
  • phiallidin clytin
  • Henlea petushkovi are found in the vicinity of Krasnoyarsk, and Henlea rodionovae live in the Irkutsk region. These enchitreids differ in a number of morphological and anatomical features (Rota E., et al. Org. Divers. Evol. 2018, 18 (3), 291-312) and have a bioluminescent system that includes four main components: luciferase, luciferin, calcium ion and oxygen (Petushkov VN et al. DAN, 2002, 385 (3), 416-418).
  • bioluminescent systems luciferases, photoproteins, luciferins, etc.
  • proteins of the aequorin family are widely used to study the release and binding of Ca 2+ in biological systems, for example, during muscle contraction.
  • bioluminescent systems is described in detail in, for example, Cormier, ML et al., Photochem. & Photobiol. 49/4, 509-512 (1989), Smith, D.F. et al. in "Bioluminescence and Chemiluminescence: Current Status (P. Stanley & L. Krick, eds.), John Wiley and Sons, Chichester, UK 1991, 529-532.
  • bioluminescent systems used today, there is still a need to expand the range of luciferin-luciferase pairs with new properties. Deciphering new components of bioluminescent systems expands the range of available assays and applications for use.
  • the objective of the present invention is to identify the components of the bioluminescent system of the Henlea sp. Henlea sp.
  • the technical result consists in expanding the arsenal of technical means in the field of application of bioluminescent systems and is achieved by identifying molecules of cofactors (activators) of the bioluminescent reaction of Henlea sp. and their use as components of a bioluminescent reaction, the introduction of which into the luciferin-luciferase reaction is accompanied by an increase in the intensity of the emitted light and, as a result, provides a decrease in the detection threshold of luciferase and bioluminescence in a biological sample.
  • These components of the bioluminescent system of Henlea sp. are promising for use as reagents for a variety of assays, including diagnostic systems, quality control systems, drug testing systems, etc.
  • the present invention provides molecules that are components of the bioluminescent reaction of Henlea sp, namely 8-rnflpoKcn-10-((2R,3R,4S)-2,3,4,5-tetrahydroxypentyl)pyrimido[4,5-b]quinoline-2 ,4(3H,10H)-dione and/or its sulfated analogue (2S,3R,4R)-1 ,2,4-trihydroxy-5-(8-hydroxy-2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimido[ 4,5-b]quinolin-10(2H)-yl)pentan-3-ylhydrosulfate or its tautomer, stereoisomer or enantiomer, pharmaceutically acceptable salt, solvate or hydrate, characterized by the following general formula I: formula I, where R represents hydrogen or a sulfo group.
  • the present invention also includes a kit for detecting luciferase in a biological sample, comprising a compound of general formula I according to the invention as a component of a bioluminescent reaction.
  • the kit further comprises a buffer, a detergent, a reducing agent and/or glycerin.
  • kit components are contained in acceptable amounts.
  • the present invention also includes a bioluminescent composition comprising a luciferase, a luciferin, at least one compound of the common formula I of the present invention as a component of the bioluminescent reaction.
  • the luciferase is recombinant.
  • the luciferase is Henlea sp.
  • the worm is a species of Henlea petushkovi and/or Henlea rodionovae.
  • the present invention also provides a method for detecting (detecting) luciferase in a biological sample, including luciferase, luciferin, and at least one compound of the invention as a component of a bioluminescent reaction.
  • the luciferase is Henlea sp.
  • the luciferase is a recombinant luciferase.
  • the biological sample is a tissue and/or a cell.
  • the biological sample is characterized by a pH value in the range from 7 to 8.
  • the method for detecting luciferase includes the following steps: a) adding a compound of the invention to a biological sample to obtain a reaction mixture; b) incubating the reaction mixture under conditions suitable for the occurrence of bioluminescence; c) detection of bioluminescence in the reaction mixture.
  • the concentration of the compound of general formula I according to the invention is 0.03 - 300 ⁇ M.
  • the luciferase is a recombinant luciferase.
  • the luciferase is Henlea sp.
  • the worm is a species of Henlea petushkovi and/or Henlea rodionovae.
  • the biological sample is a tissue and/or a cell.
  • the biological sample is characterized by a pH value in the range from 7 to 8.
  • the method for detecting bioluminescence includes the following steps: a) expression of the luciferase gene in a biological sample; b) addition of luciferin; c) adding a compound of the invention to a biological sample; d) detection of bioluminescence.
  • the concentration of the compound of the invention is 0.03 - 300 ⁇ M.
  • the present invention also provides reagents and reagent kits for implementing the methods of the present invention.
  • the present invention also includes the preparation of the compounds of the invention.
  • Figure 1 pH-dependence of the intensity of the bioluminescent reaction of Henlea sp. in vitro. Reaction mixture of 20 mM bis-tris-propane buffer, 10 ⁇ l of luciferase preparation, 2 ⁇ l of luciferin preparation, 4 ⁇ l of 0.1 M Ca 2+ .
  • FIG. 4 Chromatographic profile of the cell-free extract of H. petushkovi and H. rodionovae worms based on the results of gel filtration on a Superdex 200 10/300 GL column (GE Healthcare, USA). The solid line is the absorption signal at a wavelength of 280 nm. Activity profiles of luciferase and luciferin in H. petushkovi and H. rodionovae worms in rel. units luminescence.
  • Figure 7 Excitation spectra of the ActH component (a), its emission (b) and bioluminescence spectra of Henlea sp. in vivo (c).
  • Figure 8. The structures of the components of the bioluminescent system of the worms Henlea sp., isolated from biomass, established using NMR spectroscopy and HPLC-MS.
  • Figure 9 Typical result of detection of luciferase in biological samples. Luminescence dynamics of the reaction mixture of 100 ⁇ l of 16 mM MOPS (pH 7.0) and 1 mM CaCl containing 2 ⁇ l of thermally activated luciferin and 5 ⁇ l of a protein preparation (luciferase fraction). Observed flash in response to the addition of 1 ⁇ l of 0.1 mM ActH (30 sec).
  • Figure 11 Typical result of bioluminescence detection in biological samples. Luminescence dynamics of the reaction mixture of 100 ⁇ l of 16 mM MOPS (pH 7.0) and 1 mM CaCl containing 2 ⁇ l of highly purified Henlea sp. luciferin. and 2 ⁇ l of cell-free extract (luciferase fraction). The observed flash in response to the addition of 1 ⁇ l of 0.1 mM ActH (31 sec).
  • Figure 12 Typical result of detection of luciferase in biological samples. Luminescence dynamics of the reaction mixture of 100 ⁇ l of 16 mM MOPS (pH 7.0) and 1 mM CaCl containing 2 ⁇ l of thermally activated luciferin and 5 ⁇ l of a protein preparation (luciferase fraction). Observed flash in response to the addition of 1 ⁇ l of 0.1 mM Acts (27 sec).
  • Figure 13 Typical result of bioluminescence detection in biological samples. Luminescence dynamics of the reaction mixture of 100 ⁇ l of 16 mM MOPS (pH 7.0) and 1 mM CaCl containing 2 ⁇ l of highly purified Henlea sp. luciferin. and 2 ⁇ l of cell-free extract (luciferase fraction). Observed flash in response to the addition of 1 ⁇ l of 0.1 mM Acts (28 sec).
  • bioluminescence or “luminescence” as used herein means a process of light emission resulting from a reaction between an enzyme and a substrate that generates light.
  • precursor of luciferin in this document means a compound capable of being converted into luciferin spontaneously or by the action of enzymes.
  • luciferin as used herein means a compound that is a substrate for luciferase enzymes.
  • luciferase means a protein that has the ability to oxidize luciferin, where the oxidation reaction is accompanied by the release of light (luminescence) and the release of oxidized luciferin occurs.
  • the "Luciferase Reaction Mix” contains the luciferase enzyme and materials that will allow the luciferase enzyme to generate a light signal.
  • the materials needed and the specific concentrations and/or amounts of materials needed to generate a luminescent signal vary depending on the luciferase enzyme used, as well as the type of luciferase-based assay being performed.
  • these materials may include: a buffer to maintain the reaction at the correct pH, Henlea sp. luciferase enzyme. or recombinant luciferase, and luciferin.
  • bovine serum albumin to maintain luciferase activity
  • reducing agents to maintain luciferase activity
  • detergents to maintain luciferase activity
  • glycerol to maintain luciferase activity
  • amino acids such as D-cysteine, etc.
  • a typical luciferase reaction mixture may contain Henlea worm luciferase sp., 50 mM MOPS buffer pH 7.0, 5% glycerol.
  • the "Luciferase Detection Mix” contains materials that will allow the detection of the luciferase enzyme.
  • the materials needed and the specific concentrations and/or amounts of materials needed to generate a luminescent signal may vary depending on the luciferase enzyme used, as well as the type of luciferase-based assay being performed.
  • these materials may include: reducing agents, detergents, salts, in particular sodium chloride, sodium acetate, sodium citrate, glycerol, amino acids, luciferase substrate - luciferin.
  • a buffer to maintain the reaction at the correct pH
  • bovine serum albumin BSA
  • a typical luciferase detection mixture may contain a luciferase substrate, Henlea sp. luciferin, 50 mM MOPS buffer pH 7.0.
  • isolated means a molecule or cell that is in an environment different from the environment in which the molecule or cell is in natural conditions. For example, these components may be in substantially purified form. Essentially, a purified form means that the proteins are at least about 20% pure, often at least 30% pure, usually 50% pure, or at least 90% pure.
  • a lysate or cold extract can be prepared from the original source and purified using HPLC, size exclusion chromatography, gel electrophoresis, affinity chromatography, and the like. Protein preparations can be tested for the presence of active luciferase or a complex of luciferase and luciferin using the methods of the present invention.
  • mutant refers to a protein (in particular, to luciferase) disclosed in the present invention, in which one or more amino acids are added and/or substituted and/or removed (deleted) and/or inserted (inserted) at the N-terminus and/or C-terminus, and/or within the native amino acid sequences of the proteins of the present invention.
  • mutant refers to a nucleic acid molecule that encodes a mutant protein.
  • mutant refers to any variant that is shorter or longer than a protein or nucleic acid.
  • misdirected PCR including misdirected PCR, permutation, oligonucleotide site-directed mutagenesis, coupled-molecule PCR mutagenesis, in vivo mutagenesis, cassette mutagenesis, recursive concerted mutagenesis, exponential concerted mutagenesis, site-directed mutagenesis, random mutagenesis, gene reassembly, gene site rich mutagenesis (GSSM), ligation synthesis reassembly (SLR), or a combination thereof.
  • GSSM gene site rich mutagenesis
  • SLR ligation synthesis reassembly
  • modifications, additions or deletions can also be inserted in a manner including recombination, recursive sequence recombination, DNA mutagenesis by phosphothioate modification, uracil-containing template inclusion mutagenesis, gap-containing duplex mutagenesis, point mismatch repair mutagenesis, mutagenesis using a repair-deficient host strain, chemical mutagenesis, radiogenic mutagenesis, deletion mutagenesis, mutagenesis with using restriction on selection, mutagenesis using restriction on purification, artificial gene synthesis, concerted mutagenesis, creation of a chimeric nucleic acid multimer, or a combination thereof.
  • the term “functional” means that the nucleotide or amino acid sequence can function for the specified test or task.
  • the term “functional” used to describe luciferases means that the protein has the ability to produce an oxidation reaction of luciferin accompanied by luminescence.
  • cognate means an organic or inorganic low molecular weight compound of a non-peptide nature, which is necessary for the manifestation or modulation of the activity of the enzyme.
  • the implementation of the methods of the present invention ensures the occurrence of luminescence in a reaction mixture containing a biological sample, if the specified sample contains a luciferase using luciferin as a substrate and the compound 8-rnflpoKCH-10-((2R,3R,4S)-2,3 as a component of the bioluminescent reaction ,4,5-tetrahydroxypentyl)pyrimido[4,5-b]quinoline-2,4(3H,10H)-dione and/or its sulfated analogue (2S,3R,4R)-1,2,4-trihydroxy-5 -(8-hydroxy-2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimido[4,5-b]quinolin-10(2H)-yl)pentan-3-ylhydrosulfate.
  • a luciferase is contained, for example, in bioluminescent marine enchitreids Henlea sp
  • Bio samples can be obtained using various technologies known in biology, and include tissue samples, cells, extracts, homogenates, protein mixtures of varying degrees of purification, etc.
  • biological samples can be obtained from Henlea sp.
  • Biological samples may also contain isolated components (luciferase or luciferase and luciferin or preluciferin) of bioluminescent systems of Henlea sp.
  • Bio samples may also express recombinant luciferase or its functional mutants.
  • Nucleic acid sequences for the expression of these proteins can be obtained from natural sources (eg, from Henlea sp. enchitraids) or synthesized.
  • an expression library can be prepared in suitable host cells and tested for luciferase activity.
  • the isolation of the protein from the cold extract can be carried out, its partial amino acid sequence and the corresponding cDNA was cloned from a cDNA sample from Henlea sp.
  • the nucleic acid sequences must be inserted into the expression cassette.
  • the expression cassette may exist as an extrachromosomal element or may be incorporated into the cell's genome by introducing said expression cassette into the cell.
  • a nucleic acid encoding a protein is operably linked to a regulatory sequence that may include promoters, enhancers, terminators, operators, repressors, and inducers. After the expression cassette is introduced into the cell, a functional protein can be formed in it.
  • Expression systems include, for example, bacterial systems, yeast cells, insects, fish, amphibians or mammalian cells. Methods for making expression cassettes or systems for expressing the desired product are known to those skilled in the art. Cell lines that stably express luciferase can be selected by methods known in the art (e.g., co-transfection with a selectable marker such as dhfr, gpt, neomycin, hygromycin, which makes it possible to identify and isolate transfected cells that contain the gene included into the genome). The expression systems described above can be used in prokaryotic or eukaryotic hosts. Host cells such as E. coH, B. subtilis, S.
  • insect cells in combination with baculovirus vectors, or cells of a higher organism such as vertebrates, such as COS 7 cells, HEK 293, CHO can be used to produce the protein.
  • a higher organism such as vertebrates, such as COS 7 cells, HEK 293, CHO
  • COS 7 cells, HEK 293, CHO can be used to produce the protein.
  • the term "functional" in relation to luciferase means that the specified protein is able to use the luciferin of Henlea sp. as a substrate for the bioluminescent reaction and dione and/or its sulfated analogue (2S,3R,4R)-1,2,4-trihydroxy-5-(8-hydroxy-2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimido[4,5-b]quinoline- 10(2H)-yl)pentan-3-ylhydrosulfate as cofactors in the bioluminescence reaction.
  • the methods of the present invention are based on the use of 8-rnflpoKcn-10-((2R,3R,4S)-2,3,4,5-tetrahydroxypentyl)pyrimido[4,5-b]quinoline-2,4(3H, 10H)- dione and/or its sulfated analog (2S,3R,4R)-1,2,4-trihydroxy-5-(8-hydroxy-2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimido[4,5-b]quinoline- 10(2H)-yl)pentan-3-ylhydrosulfate or its tautomer, stereoisomer or enantiomer, pharmaceutically acceptable salt, solvate or hydrate as a component of the bioluminescent reaction, in particular for the detection of bioluminescence in biological samples.
  • 8-rnflpoKCH-10-((2R,3R,4S)-2,3,4,5-tetrahydroxypentyl)pyrimido[4,5-b]quinoline-2,4(3H,10H)- dione and/or its sulfated analogue (2S,3R,4R)-1,2,4-trihydroxy-5-(8-hydroxy-2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimido[4,5-b]quinoline- 10(2H)-yl)pentan-3-ylhydrosulfate or a tautomer, stereoisomer or enantiomer, pharmaceutically acceptable salt, solvate or hydrate thereof, having the following structural formula: Acts R S0 3 H
  • the basis of the molecule of cofactors of the bioluminescent reaction of the worm Henlea sp. is a condensed heterocycle - 5-deazaflavin, consisting of two six-membered nitrogen-containing cycles and one benzene cycle.
  • ActH an absorption spectra of the activator H
  • Fo coenzyme Fo.
  • the Fo cofactor is involved in redox reactions in methane producers and, in its deprotonated form, is the coenzyme of DNA photolyases found in prokaryotes, some eukaryotes, and archaea (Glasa A. F.
  • Freeze-dried activators according to the invention are stored at -20°C without loss of activity for at least 30 days, more often at least 60 days, usually at least a year.
  • bioluminescence depends on the amount and retention of luciferase in biological samples. It should also be noted the effect of light radiation, especially the UV part of the spectrum, on luciferin, leading to its degradation and loss of functionality, which was confirmed experimentally.
  • Temperature optimum of Henlea sp. equal to 20°C. It should be noted that, although the luciferase of Henlea sp. sensitive to temperature increase after the optimum, enzyme inactivation is completely reversible upon short-term heating. For example, when the luminescence is reduced by 90% at 37°C, a quick return to T opt restores the luminescence to the maximum level.
  • any standard buffer solutions for this pH range can be used to maintain pH, including MOPS, HEPES, Tris-HCI, Bis-Tris-propane.
  • the molarity of the buffer solution does not exceed 2, for example, does not exceed 1, more often in the range from 0.05 to 0.4, usually from 0.1 to 0.2.
  • reaction mixtures for the needs of the present invention may also contain components that stabilize and protect the enzymes of the bioluminescent system from the inhibitory effect of trace amounts of heavy metal ions and from degradation by proteases.
  • the reaction mixture may contain dithiothreitol (hereinafter referred to as DTT) at a concentration of not more than 20 mM, more often at a concentration of 0.1 to 8 mM, preferably at a concentration of 0.1-4 mM.
  • DTT dithiothreitol
  • the reaction mixture may also contain beta-mercaptoethanol and/or ethylenediaminetetraacetic acid (hereinafter - EDTA) in a final concentration of 0 to 1 mm.
  • - EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • the reaction mixture may contain 0.1 - 2 mm DTT and 0.1 - 1 mm EDTA.
  • reaction mixture may contain protease inhibitors, such as phenylacetic acid or oxalic acid, at commonly used concentrations.
  • 8-rnflpoKcn-10-((2R,3R,4S)-2,3,4,5-tetrahydroxypentyl)pyrimido[4,5-b]quinoline-2,4(3H,10H)-dione and /or its sulfated analog (2S,3R,4R)-1,2,4-trihydroxy-5-(8-hydroxy-2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimido[4,5-b]quinoline-10( 2H)-yl)pentan-3-ylhydrosulfate is added to the biological sample to a final concentration of 0.03 - 300 ⁇ M, more often 1 - 5 ⁇ M.
  • a mixture of reagents is added to the sample, including a buffer solution, components that stabilize and protect the enzymes of the bioluminescent system from the inhibitory effect of trace amounts of heavy metal ions and from degradation by proteases, luciferin.
  • a buffer solution is first added to the biological sample, components that stabilize and protect the enzymes of the bioluminescent system from the inhibitory effect of trace amounts of heavy metal ions and from degradation by proteases, luciferin, and then a solution of 8-rnflpoKcn-10-((2R,3R,4S )-2,3,4,5-tetrahydroxypentyl)pyrimido[4,5-b]quinoline-2,4(3H, 10H)-dione and/or its sulfated analog of (2S,3R,4R)-1,2,4-trihydroxy-5-(8-hydroxy-2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimido[4,5-b]quinoline-10(2 ⁇ )- yl)pentan-3-yl hydrogen sulfate.
  • the reaction mixture may contain small amounts of used solvents.
  • the reaction mixture may contain detergents such as Triton X100 or nonylphenoxypolyethoxyethanol.
  • concentration of detergents in the reaction mixture does not exceed 0.2%, more often does not exceed 0.1%, optimally does not exceed 0.06%.
  • the reaction mixture may contain bovine serum albumin (BSA) or other proteins at a concentration not exceeding 2%, more often not exceeding 1%, optimally not exceeding 0.5%.
  • BSA bovine serum albumin
  • BSA is used when the concentration of the biological sample is extremely low, then BSA plays the role of a protein stabilizer.
  • bioluminescent signal occurs in a wide temperature range - from 4 to 40°C, optimally at 20°C.
  • the maximum luminescence intensity is observed at the moment of initiation of the reaction. Then there is a decline, the rate of which is determined by the activity of enzymes and the initial concentrations of substrates. Under certain conditions (a lot of substrates, enzyme activity is low, the reaction temperature is lowered), the reaction can be observed for one or more hours (figure 3).
  • the methods of the present invention include the detection of bioluminescence that occurs in a biological sample containing luciferase and luciferin when the activators of the invention appear in it.
  • Bioluminescence can be detected using methods known to those skilled in the art, in particular visual screening or using a luminometer, photometer, fluorimeter, digital camera, photosensitive film.
  • the maximum luminescence intensity can be used, which is achieved 5-30 minutes after the initiation of the bioluminescent reaction or the rate of increase in the luminescence in the range up to 30 minutes after the initiation of the bioluminescent reaction, for example, within 1, 2, 5, 10, 20 minutes after the initiation of the reaction or longer.
  • the measured luminescence is a continuous glow rather than flashes of light.
  • the intensity of luminescence depends on the activity of enzymes of the bioluminescent system present in the sample, the initial concentrations of substrates, and the temperature of the reaction mixture, and usually ranges from 10 kV/sec to 10 million kV/sec, more often 100–100,000 kV/sec.
  • the reaction lasts at least 5 minutes after initiation, more often 10-15 minutes, sometimes (depending on conditions) 30 minutes or more.
  • the light emitted during the oxidation of luciferin, with the participation of at least one compound according to the present invention and / or its functional analogue, the light is in the range from 430 to 500 nm, more often in the range from 450 to 475 nm, with an emission maximum at 464 nm.
  • the methods and reagents of the present invention can be used in a wide range of bioluminescent assays in vivo and in vitro.
  • the methods and reagents of the present invention can be used to detect the active components of the bioluminescent system of Henlea sp. during their cleaning.
  • the methods and reagents of the present invention can be used to identify functional analogues of the enzymes of the bioluminescent system of Henlea sp. in biological samples.
  • the methods and reagents of the present invention can be used to detect recombinant luciferase activity in host cells.
  • a nucleic acid encoding a luciferase must be obtained for implementation of the application.
  • the resulting nucleic acid must be inserted into an expression cassette that allows transient or permanent expression of the nucleic acid in host cells, eg under promoters of interest to the researcher.
  • the expression cassette may contain elements that provide targeted delivery of the construct to cells or cellular compartments of interest, or be contained in particles that provide targeted delivery.
  • kits for use in carrying out the above applications typically include. At least one compound according to the invention, preferably with a buffer solution for dissolving said compound and/or adding it to biological samples.
  • the compounds of the invention may be present in dissolved form in an appropriate storage medium such as an aqueous or buffered detergent solution, usually in an appropriate container.
  • the compounds of the invention may be present in the kit in lyophilized form.
  • the claimed kits may further include instructions for carrying out the claimed methods. These instructions may be present in the claimed kits in various forms (for example, in printed form or on electronic media in the form of a text and/or graphic file) in the amount of one or more.
  • bioluminescent compositions for use in carrying out the above applications.
  • the compositions typically include at least one compound of the invention, preferably with a buffer solution for dissolving said compound and/or adding it to biological samples.
  • the compounds of the invention may be present in dissolved form in an appropriate storage medium such as an aqueous or buffer solution with detergent.
  • the compounds of the invention may be present in the composition in lyophilized form.
  • compositions typically include dione and/or its sulfated analog (2S,3R,4R)-1,2,4-trihydroxy-5-(8-hydroxy-2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimido[4,5-b]quinoline- 10(2H)-yl)pentan-3-ylhydrosulfate, preferably with a buffer solution for dissolving said compound and/or adding it to biological samples.
  • 8-rnflpoKcn-10-((2R,3R,4S)-2,3,4,5-tetrahydroxypentyl)pyrimido[4,5-b]quinoline-2,4(3H,10H)-dione and/or its sulfated analogue of (2S,3R,4R)-1,2,4-trihydroxy-5-(8-hydroxy-2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimido[4,5-b]quinolin-10(2H)-yl )pentan-3-ylhydrosulfate may be present in dissolved form in an appropriate storage medium such as an aqueous or buffered detergent solution.
  • 8-rnflpoKcn-10-((2R,3R,4S)-2,3,4,5-tetrahydroxypentyl)pyrimido[4,5-b]quinoline-2,4(3H,10H)-dione and/or its sulfated analogue (2S,3R,4R)-1,2,4-trihydroxy-5-(8-hydroxy-2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimido[4,5-b]quinoline-10(2H) -yl)pentan-3-ylhydrosulfate may be present in the composition in lyophilized form.
  • the claimed compositions may further include excipients, in particular adjuvants, solvents and/or excipients, such as are compatible with the compounds of the present invention and which do not interfere with the biological activity of these compounds.
  • the worms H. petushkovi and H. rodionovae selected from the soil were washed and frozen, accumulating in portions of 1000 individuals for experiments.
  • Cell-free extracts were prepared using aqueous homogenates of frozen worms (1 g/5 ml, H2O, 0°C). Cells were additionally disrupted by sonication for 10 min in an ice bath using a Sonics Vibra-Cell disintegrator (Sonics & Materials, Inc., United States, probe diameter 13 mm, amplitude 60 ⁇ m). The resulting lysates were centrifuged at 4°C (XPN-100 centrifuge with Ti 50.2 angle rotor, Beckman Coulter, USA, 140000 g, 5 min). The supernatant was separated and used for further chromatography.
  • a sample of 1-40 ⁇ l of the supernatant was placed in a lumenometer cuvette, adjusted to 200 ⁇ l with 20 mM Tris-HCI pH 7.0.
  • the luminescent reaction was initiated by adding a fraction of luciferin 1-4 ⁇ l.
  • the resulting cell-free supernatant initially contained all components of the luminescent system of Henlea sp. and glowed for 20-60 minutes, gradually fading away. Assuming that complete enzymatic “burning out” of luciferin occurs, fresh luciferin extract was added to reproduce the luminescent signal in vitro.
  • a Superdex 200 10/300 GL column (GE Healthcare, United States) was loaded with 100 ⁇ l of the supernatant in each case. Gel filtration was performed in 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 100 mM NaCI at a rate of 0.7 ml/min at room temperature. The column was calibrated using substances with a known molecular weight: ferritin, aldolase, catalase, bovine serum albumin, ovalbumin, myoglobin, ribonuclease, cytochrome c, riboflavin.
  • Luciferin was obtained from the homogenate of worms using organic solvents such as acetone, alcohol, ethyl acetate (in this case, luciferase, along with other proteins, precipitated). 0.5 ml of chilled acetone was added to 5-10 frozen worms, homogenized, kept for 60 minutes at 0°C, then centrifuged (16000 d, 3 min). The obtained supernatant does not have luminescent activity, but its addition to the protein preparation resulted in the emission of light. The luciferin-containing fraction is stored in the dark at -20°C to avoid inactivation.
  • organic solvents such as acetone, alcohol, ethyl acetate (in this case, luciferase, along with other proteins, precipitated).
  • Frozen worms were homogenized in water at 0°C and centrifuged (16000 d, 3 min). The supernatant proteins were denatured by adding hydrochloric acid to a final concentration of 0.3 mM. The precipitate that formed was removed by centrifugation (10000 g, 20 min). The supernatant containing luciferin fluoresced brightly under UV irradiation.
  • the supernatant was applied to a 1-mL C16 column. After washing the column with 0.1% formic acid, the target fraction was eluted with 3 ml of 75% acetonitrile in water and brought to a minimum volume on a rotary evaporator.
  • NMR spectra were taken: 1 H 1 D (37 minutes per spectrum, 8 spectra to control sample stability), 13 C-HSQC (21 hours), DQF COZY (8.5 hours), ROESY (21 hours), 13 C- NMVS (22 hours 50 minutes, 5 spectra with subsequent summation to increase the signal-to-noise ratio).
  • the resolution in the indirect direction was 1024 valid points (COSY, ROESY) and 2048 points (HSQC, HMBC).
  • Triphenylphosphine (5.53 g, 21.1 mmol) and iodine (5.36 g, 21.1 mmol) were dissolved in 75 ml DCM in an ice bath. Benzoic acid (1.71 g, 14.0 mmol) and 3-nitrophenol (2.13 g, 15.3 mmol) were added to the solution. The reaction was warmed to room temperature, after which it was stirred for 20 minutes. The product was isolated by column chromatography (silica gel, EIOAc/Hex (30:70)). 3.02 g of compound 6 (81%) was obtained.
  • Camphorsulfonic acid 50 mg was added to a solution of compound 8 (1.1 g, 4.58 mmol) and trimethyl orthobenzoate (1.25 ml, 6.87 mmol) in DCM (20 ml). The mixture was stirred at 20° C. for 10 minutes, triethylamine (0.1 ml) was added, evaporated to dryness in vacuo and the residue was dissolved in pyridine (7 ml). To the resulting solution were added benzoyl chloride (0.8 ml, 6.87 mmol) and dimethylaminopyridine (10 mg) and the mixture was stirred at 40°C for 30 minutes.
  • the mixture was decomposed by adding methanol (0.5 ml), co-evaporated in vacuo with toluene, and the residue was dissolved in methylene chloride (10 ml). To the resulting solution was added 90% aqueous trifluoroacetic acid (1 ml) and the mixture was stirred at 20°C for 30 minutes, diluted with methylene chloride (30 ml) and washed with saturated aqueous NaHCO3 (3x10 ml). The organic phase was passed through a pad of silica gel (EJAc/toluene 1:5).
  • Thermally activated luciferin was obtained as described above in the section "Procedure for the extraction of luciferin”. Chromatographically purified on a Superdex 200 column, a protein preparation from the biomass of the worms Henlea sp, obtained as described above in the section “Purification of samples of native luciferase samples”, was used as samples. 8-hydroxy-10-((2H,3H,45)-2,3,4,5-tetrahydroxypentyl)pyrimido[4,5-b]quinoline-2,4(3H,10H)-dione was prepared as described above in the section “Synthesis of a component of the bioluminescent system of Henlea sp. Activator H"
  • the bioluminescent reaction was activated by adding various amounts of a solution of 8-hydroxy-10-((2P,3P,45)-2,3,4,5-tetrahydroxypentyl)pyrimido[4,5-b]quinoline-2,4(3H,10H) -dione.
  • the dependence of the luminescence on the concentration of NADPH is shown in figure 10.
  • Thermally activated luciferin was obtained as described above in the section "Procedure for the extraction of luciferin”. Chromatographically purified on a Superdex 200 column, a protein preparation from the biomass of the worms Henlea sp, obtained as described above in the section “Purification of samples of native luciferase samples”, was used as samples.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

Компоненты биолюминесцентных систем - широко используемые реагенты для множества анализов, включая диагностические системы, системы контроля качества, системы тестирования лекарственных препаратов и т.д. Настоящая группа изобретений раскрывает компоненты биолюминесцентной системы червей Henlea petushkovi и Henlea rodionovae (Henlea sp.), в частности молекул кофакторов (активаторов) биолюминесцентной реакции. Кроме того, настоящая группа изобретений раскрывает метод выявления люциферазы в биологических образцах с использованием молекул кофакторов (активаторов) биолюминесцентной реакции червей Henlea petushkovi и Henlea rodionovae (Henlea sp.), а также способ детекции биолюминесценции в биологическом образце.

Description

Применение кофактора Fo и его аналогов в качестве компонента биолюминесцентной реакции
Область техники
Настоящее изобретение относится к биологии, химии и биотехнологии, а именно к биолюминесцентной системе червей рода Henlea (Н. petushkovi, Н. rodionovae).
Уровень техники
Биолюминесценция - процесс излучения света живыми организмами в ходе биохимической реакции, в которой химическая энергия превращается в световую. Способность к биолюминесценции определяется наличием специфического белка люциферазы или фотопротеина. Люциферазы — это ферменты, которые катализируют окисление низкомолекулярных соединений - люциферинов, превращая их в оксилюциферины. Окисление сопровождается выделением света и высвобождением оксилюциферина. Описано несколько типов биолюминесцентных систем.
Например, у ряда морских кишечнополостных описаны системы, включающие белки семейства экворина (Prasher, et al., Biochem. 1987, 26, 1326-1332; Tsuji et al., Photochem Photobiol, 1995, 62(4), 657-661). Семейство экворина (aequorin) включает также обелин (obelin), халистаурин или митрокомин (halistaurin = mitrocomin), фиалидин или клитин (phiallidin = clytin) и т.д. Это фотопротеины, содержащие ковалентно связанный с ними люциферин, который в присутствии ионов Са2+ подвергается химическим превращениям с образованием продукта в возбужденном электронном состоянии.
Для светящихся Henlea sp. недавно были установлены два близкородственных вида: Henlea petushkovi встречаются в окрестностях Красноярска, a Henlea rodionovae обитают в Иркутской области. Эти энхитреиды различаются рядом морфологических и анатомических особенностей (Rota Е., et al. Org. Divers. Evol. 2018, 18 (3), 291-312) и имеют биолюминесцентную систему, включающую четыре основных компонента: люциферазу, люциферин, ион кальция и кислород (Петушков ВН, и др. ДАН, 2002, 385 (3), 416-418). Ещё два низкомолекулярных компонента, обладающих флуоресцентными свойствами и способных активировать люминесценцию реакционной смеси in vitro. Предполагается, что именно они, а не люциферин являются эмиттерами в люминесцентной реакции этих червей (Петушков ВН, Родионова НС ДАН, 2018, 481 (4), 451-454).
Компоненты биолюминесцентных систем (люциферазы, фотопротеины, люциферины и т.д.) - широко используемые реагенты для множества анализов, включая диагностические системы, системы контроля качества и т.д. Например, белки семейства экворина широко используются для исследований высвобождения и связывания Са2+ в биологических системах, например, во время мышечного сокращения. Использование биолюминесцентных систем в подробностях описано, например, в Cormier, M.L. et al., Photochem. & Photobiol. 49/4, 509-512 (1989), Smith, D.F. et al. in "Bioluminescence and Chemiluminescence: Current Status (P. Stanley & L. Krick, eds.), John Wiley and Sons, Chichester, U.K. 1991, 529-532.
Несмотря на большое количество биолюминесцентных систем, используемых на сегодняшний день, сохраняется потребность в расширении линейки люциферин- люциферазных пар, обладающих новыми свойствами. Расшифровка новых компонентов биолюминесцентных систем позволяет расширить спектр доступных анализов и приложений для использования.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является установление компонентов биолюминесцентной системы червей Henlea sp., в частности идентификация молекул кофакторов (активаторов) биолюминесцентной реакции, а также разработка способа выявления биолюминесценции в биологическом образце с помощью компонентов биолюминесцентной системы червей Henlea sp., в частности, кофакторов биолюминесцентной реакции червя Henlea sp.
Технический результат состоит в расширении арсенала технических средств в области применения биолюминесцентных систем и достигается за счет идентификации молекул кофакторов (активаторов) биолюминесцентной реакции Henlea sp. и их применения в качестве компонентов биолюминесцентной реакции, введение которых в люциферин-люциферазную реакцию сопровождается увеличением интенсивности испускаемого света и как результат обеспечивает снижение порога детектируемости люциферазы и биолюминесценции в биологическом образце. Указанные компоненты биолюминесцентной системы червей Henlea sp. являются перспективными для применения в качестве реагентов для множества анализов, включая диагностические системы, системы контроля качества, системы тестирования лекарственных препаратов и т.д.
Настоящее изобретение обеспечивает молекулы, являющиеся компонентами биолюминесцентной реакции Henlea sp, а именно 8-rnflpoKcn-10-((2R,3R,4S)-2,3,4,5- тетрагидроксипентил)пиримидо[4,5-Ь]хинолин-2,4(ЗН,10Н)-дион и/или его сульфатированный аналог (2S,3R,4R)-1 ,2,4-тригидрокси-5-(8-гидрокси-2,4-диоксо-3,4-дигидропиримидо[4,5- Ь]хинолин-10(2Н)-ил)пентан-3-илгидросульфат или его таутомера, стереоизомера или энантиомера, фармацевтически приемлемой соли, сольвата или гидрата, характеризующиеся следующей общей формулой I:
Figure imgf000004_0001
формула I, где R представляет собой водород или сульфогруппу.
Указанный технический результат достигается путем применения соединения 8- rHflpoKCH-10-((2R,3R,4S)-2,3, 4, 5-тетрагидроксипентил)пиримидо[4,5-Ь]хинолин-2, 4(314,1 ОН)- диона и/или его сульфатированного аналога (2S,3R,4R)-1 ,2,4-тригидрокси-5-(8-гидрокси-2,4- диоксо-3,4-дигидропиримидо[4,5-Ь]хинолин-10(2Н)-ил)пентан-3-илгидросульфата или его таутомера, стереоизомера или энантиомера, фармацевтически приемлемой соли, сольвата или гидрата, характеризующегося следующей общей формулой I:
Figure imgf000004_0002
формула I, где R представляет собой водород или сульфогруппу, в качестве в качестве компонента биолюминесцентной реакции, в частности, биолюминесцентной реакции Henlea sp., причем введение которых в люциферин- люциферазную реакцию сопровождается увеличением интенсивности испускаемого света.
Настоящее изобретение также включает набор для детекции люциферазы в биологическом образце, включающий соединение общей формулой I по изобретению в качестве компонента биолюминесцентной реакции.
В частных вариантах воплощения изобретения набор дополнительно включает буфер, детергент, восстановительный агент и/или глицерин.
В частных вариантах воплощения изобретения указанные компоненты набора содержатся в допустимых количествах.
Настоящее изобретение также включает биолюминесцентную композицию, включающую люциферазу, люциферини, по меньшей мере, одно соединение общей формулой I по настоящему изобретению в качестве компонента биолюминесцентной реакции. В частных вариантах воплощения изобретения люцифераза является рекомбинантной. В частных вариантах воплощения изобретения люцифераза представляет собой люциферазу червя Henlea sp. В более конкретных вариантах воплощения изобретения червь представляет собой вид Henlea petushkovi и/или Henlea rodionovae.
Кроме того, настоящее изобретение также обеспечивает способ выявления (детекции) люциферазы в биологическом образце, включающем люциферазу, люциферин и, по меньшей мере, одно соединение по изобретению в качестве компонента биолюминесцентной реакции. В частных вариантах воплощения изобретения люцифераза представляет собой люциферазу червей Henlea sp. В частных вариантах воплощения изобретения люцифераза представляет собой рекомбинантную люциферазу. В частных вариантах воплощения изобретения биологический образец представляет собой ткань и/или клетку. В частных вариантах воплощения изобретения биологический образец характеризуется значением pH в диапазоне от 7 до 8.
В частных вариантах воплощения изобретения способ выявления люциферазы включает следующие этапы: а) добавление соединения по изобретению к биологическому образцу для получения реакционной смеси; б) инкубирование реакционной смеси в условиях, подходящих для возникновения биолюминесценции; в) детектирование биолюминесценции в реакционной смеси.
В частных вариантах воплощения изобретения концентрация соединения общей формулой I по изобретению составляет 0.03 - 300 мкМ.
Кроме того, обеспечивается способ детекции биолюминесценции в биологическом образце, включающем люциферазу и, по меньше мере, одно соединение по изобретению в качестве компонента биолюминесцентной реакции. В частных вариантах воплощения изобретения люцифераза представляет собой рекомбинантную люциферазу. В частных вариантах воплощения изобретения люцифераза представляет собой люциферазу червя Henlea sp. В более конкретных вариантах воплощения изобретения червь представляет собой вид Henlea petushkovi и/или Henlea rodionovae. В частных вариантах воплощения изобретения биологический образец представляет собой ткань и/или клетку. В частных вариантах воплощения изобретения биологически образец характеризуется значением pH в диапазоне от 7 до 8.
В частных вариантах воплощения изобретения способ детекции биолюминесценции включает следующие этапы: а) экспрессию гена люциферазы в биологическом образце; б) добавление люциферина; в) добавление соединения по изобретению к биологическому образцу; г) детектирование биолюминесценции.
В частных вариантах воплощения изобретения концентрация соединения по изобретению составляет 0.03 - 300 мкМ.
Также настоящее изобретение обеспечивает реактивы и наборы реактивов для реализации методов настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также включает получение соединений по изобретению.
Для более полного раскрытия вышеперечисленных характеристик настоящего изобретения ниже предлагается детальное описание изобретения, кратко сформулированного выше, в виде ссылок на воплощения, некоторые из которых проиллюстрированы дополнительными фигурами. При этом следует отметить, что прилагаемые фигуры иллюстрируют лишь типичные воплощения настоящего изобретения и, следовательно, не должны быть восприняты в качестве ограничения объема изобретения, которое может допускать другие, в равной степени эффективные, воплощения.
Подробное раскрытие изобретения
Краткое описание чертежей
Фигура 1. pH-зависимость интенсивности биолюминесцентной реакции энхитреид Henlea sp. in vitro. Реакционная смесь 20мМ бис-трис-пропанового буфера, 10 мкл препарата люциферазы, 2 мкл препарата люциферина, 4мкл 0.1М Са2+.
Фигура 2. Температурная зависимость интенсивности биолюминесцентной реакции энхитреид Henlea sp. in vitro. Реакционная смесь 180 мкл 20мМ трис-HCI буфера pH 7.25, 10 мкл препарата люциферазы, 2 мкл препарата люциферина, 4мкл 0.1М Са2+.
Фигура 3. Результат измерения биолюминесценции червей Henlea sp. во времени.
Фигура 4. Хроматографический профиль бесклеточного экстракта червей Н. petushkovi и Н. rodionovae на основании результатов гель-фильтрации на колонке Superdex 200 10/300 GL (“GE Healthcare”, США). Сплошная линия - сигнал поглощения при длине волны 280 нм. Профили активности люциферазы и люциферина червей Н. petushkovi и Н. rodionovae в отн. ед. люминесценции.
Фигура 5. УФ-спектры поглощения пиков компонентов (активаторов по изобретению) биолюминесцентной реакции, схожих с люциферином Henlea по спектральным и хроматографическим свойствам.
Фигура 6. Флуоресценция компонента ActH.
Фигура 7. Спектры возбуждения компонента ActH (а), его эмиссии (б) и биолюминесценции Henlea sp. in vivo (в). Фигура 8. Структуры компонентов биолюминесцентной системы червей Henlea sp., выделенных из биомассы, установленные с использованием методов ЯМР-спектроскопии и ВЭЖХ-МС.
Фигура 9. Типичный результат выявления люциферазы в биологических образцах. Динаминка люминесценции реакционной смеси 100 мкл 16мМ МОПС (pH 7.0) и 1 мМ СаСЬ, содержащей 2 мкл термоактивированного люциферина и 5 мкл белкового препарата (люциферазная фракция). Наблюдаемая вспышка в ответ на добавление 1 мкл 0.1 мМ ActH (30 сек).
Фигура 10. Зависимость интенсивности биолюминесценции от количества 8-гидрокси- 10-((2Р,ЗР,45)-2,3,4,5-тетрагидроксипентил)пиримидо[4,5-Ь]хинолин-2,4(ЗН,10Н)-диона.
Фигура 11. Типичный результат детекции биолюминесценции в биологических образцах. Динаминка люминесценции реакционной смеси 100 мкл 16мМ МОПС (pH 7.0) и 1 мМ СаСЬ, содержащей 2 мкл высокоочищенного люциферина Henlea sp. и 2 мкл бесклеточного экстракта (люциферазная фракция). Наблюдаемая вспышка в ответ на добавление 1 мкл 0.1 мМ ActH (31 сек).
Фигура 12. Типичный результат выявления люциферазы в биологических образцах. Динаминка люминесценции реакционной смеси 100 мкл 16мМ МОПС (pH 7.0) и 1 мМ СаСЬ, содержащей 2 мкл термоактивированного люциферина и 5 мкл белкового препарата (люциферазная фракция). Наблюдаемая вспышка в ответ на добавление 1 мкл 0.1 мМ Acts (27 сек).
Фигура 13. Типичный результат детекции биолюминесценции в биологических образцах. Динаминка люминесценции реакционной смеси 100 мкл 16мМ МОПС (pH 7.0) и 1 мМ СаСЬ, содержащей 2 мкл высокоочищенного люциферина Henlea sp. и 2 мкл бесклеточного экстракта (люциферазная фракция). Наблюдаемая вспышка в ответ на добавление 1 мкл 0.1 мМ Acts (28 сек).
Определения и термины
Различные термины, относящиеся к объектам настоящего изобретения, используются выше и также в описании и в формуле изобретения. Если иное не оговаривается, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же самое значение, которое понятно для специалистов в данной области. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из». Термин «биолюминесценция» или «люминесценция» в настоящем документе означает процесс излучения света, получаемый в результате реакции между ферментом и субстратом, который генерирует свет.
Термин «предшественник люциферина (предлюциферин)» в настоящем документе означает соединение, способное превращаться в люциферин самопроизвольно или под действием ферментов.
Термин «люциферин» в настоящем документе означает соединение, являющееся субстратом для ферментов люцифераз.
Как здесь используется, термин «люцифераза» означает белок, который обладает способностью к окислению люциферина, где реакция окисления сопровождается выделением света (люминесценцией) и происходит освобождение окисленного люциферина.
«Реакционная смесь люциферазы» содержит фермент люциферазу и материалы, которые позволят ферменту люциферазе генерировать световой сигнал. Необходимые материалы и конкретные концентрации и/или количества материалов, необходимых для генерации люминесцентного сигнала, варьируются в зависимости от используемого фермента люциферазы, а также от типа выполняемого анализа на основе люциферазы. Как правило, для люциферазы червя Henlea sp., эти материалы могут включать: буфер для поддержания реакции при правильном pH, фермент люцифераза червя Henlea sp. или рекомбинантную люциферазу, и люциферин. Часто к раствору могут добавляться другие материалы, в том числе: бычий сывороточный альбумин (BSA), чтобы поддерживать активность люциферазы, восстановители, детергенты, соли, глицерин, аминокислоты, например D-цистеин и др. Типичная реакционная смесь люциферазы может содержать люциферазу червя Henlea sp., 50 мМ MOPS буфер pH 7.0, 5% глицерин.
«Смесь для обнаружения люциферазы» содержит материалы, которые позволят обнаружить фермент люциферазу. Необходимые материалы и конкретные концентрации и/или количества материалов, необходимых для генерации люминесцентного сигнала, могут варьируются в зависимости от используемого фермента люциферазы, а также от типа выполняемого анализа на основе люциферазы. В общем, для люциферазы червя Henlea sp. или рекомбинантной люциферазы эти материалы могут включать в себя: восстановители, детергенты, соли, в частности, хлорид натрия, ацетат натрия, цитрат натрия, глицерин, аминокислоты, субстрат люциферазы - люциферин. Часто к раствору могут добавляться другие материалы, в том числе: буфер для поддержания реакции при правильном pH, бычий сывороточный альбумин (BSA), чтобы поддерживать активность люциферазы, восстановители, детергенты, соли, глицерин, аминокислоты, например D-цистеин и т. д. Типичная смесь для обнаружения люциферазы может содержать субстрат люциферазы - люциферин червя Henlea sp., 50 мМ MOPS буфер pH 7.0. Как здесь используется, термин "выделенный" означает молекулу или клетку, которые находятся в среде, отличной от среды, в которой молекула или клетка находятся в естественных условиях. Например, указанные компоненты могут находиться по существу в очищенной форме. По существу, очищенная форма означает, что белки являются, по меньшей мере, приблизительно на 20% чистыми, часто, по меньшей мере, на 30% чистыми, обычно на 50% чистыми, или, по меньшей мере, на 90% чистыми.
Для выделения белков могут быть использованы любые общеизвестные и общепринятые методики очистки белка, описанные, например, в Guide to Protein Purification, (Deuthser ed.) (Academic Press, 1990). Например, из исходного источника может быть приготовлен лизат или холодный экстракт и очищен с использованием ВЭЖХ, эксклюзионной хроматографии, гель-электрофореза, аффинной хроматографии и т.п. Белковые препараты могут быть протестированы на наличие активной люциферазы или комплекса люциферазы и люциферина с помощью методов настоящего изобретения.
Как здесь используется, термин "мутант" или "производное" относятся к белку (в частности, к люциферазе), раскрытому в настоящем изобретении, в котором одна или более аминокислот добавлены и/или замещены и/или удалены (делетированы) и/или вставлены (инсертированы) в N-конец и/или С-конец, и/или в пределах нативных аминокислотных последовательностей белков настоящего изобретения. Как здесь используется, термин "мутант" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует мутантный белок. Кроме того, термин "мутант" здесь относится к любому варианту, который короче или длиннее белка или нуклеиновой кислоты.
Модификации, а также добавки или делеции могут быть встроены любым методом, известным в данной области (см., например, Gustin et al., Biotechniques (1992) 14: 22; Barany, Gene (1985) 37: 11-123; и Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 199:537-539), Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), CSH Press, pp. 15.3-15.108), включая ошибочно- направленную ПЦР, перестановку, сайт-направленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов, мутагенез с использованием ПЦР на основе спаренных молекул, мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, рекурсивный согласованный мутагенез, экспоненциальный согласованный мутагенез, сайт-направленный мутагенез, случайный мутагенез, генную повторную сборку, генный сайт-насыщенный мутагенез (GSSM), повторную сборку при проведении синтеза лигированием (SLR), или их сочетание. Указанные модификации, добавления или делеции могут быть также встроены способом, включающим рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательности, мутагенез ДНК путем фосфотиоатной модификации, мутагенез на основе включения матрицы, содержащей урацил, мутагенез на основе дуплекса, содержащего бреши, репарационный мутагенез с точечными ошибочными спариваниями, мутагенез с использованием штамма-хозяина, дефицитного по репарации, химический мутагенез, радиогенный мутагенез, делеционный мутагенез, мутагенез с использованием ограничения по селекции, мутагенез с использованием ограничения по очистке, искусственный синтез гена, согласованный мутагенез, создание химерного мультимера нуклеиновой кислоты или их сочетание.
Как здесь используется, термин "функциональный" означает, что нуклеотидная или аминокислотная последовательность может функционировать для указанного испытания или задачи. Термин "функциональный", используемый для описания люцифераз, означает, что белок обладает способностью производить сопровождающуюся люминесценцией реакцию окисления люциферина.
Как здесь используется, термин «кофактор» («активатор») означает органическое или неорганическое низкомолекулярное соединение непептидной природы, которое необходимо для проявления или модулирования активности фермента.
Биологические образцы
Реализация методов настоящего изобретения обеспечивает возникновение люминесценции реакционной смеси, содержащей биологический образец, если указанный образец содержит люциферазу, использующую в качестве субстрата люциферин и в качестве компонента биолюминесцентной реакции соединение 8-rnflpoKCH-10-((2R,3R,4S)-2,3,4,5- тетрагидроксипентил)пиримидо[4,5-Ь]хинолин-2,4(ЗН,10Н)-дион и/или его сульфатированный аналог (2S,3R,4R)-1 ,2,4-тригидрокси-5-(8-гидрокси-2,4-диоксо-3,4-дигидропиримидо[4,5- Ь]хинолин-10(2Н)-ил)пентан-3-илгидросульфат. Такую люциферазу содержат, например, способные к биолюминесценции морские энхитреиды Henlea sp.
Биологические образцы могут быть получены с помощью различных технологий, известных в биологии, и включают образцы тканей, клеток, экстракты, гомогенаты, белковые смеси различной степени очистки и т.д. Например, биологические образцы могут быть получены из энхитреид Henlea sp.
Биологические образцы могут также содержать выделенные компоненты (люциферазу или люциферазу и люциферин или предлюциферин) биолюмнесцентных систем энхитреид Henlea sp.
Биологические образцы могут также экспрессировать рекомбинантную люциферазу или её функциональные мутанты. Последовательности нуклеиновых кислот для экспрессии указанных белков могут быть получены из природных источников (например, из энхитреид Henlea sp.) или синтезированы. В настоящее время известно множество методов для клонирования генов, кодирующих белки, обладающие известной активностью. Частично такие методы описаны в Maniatis, Т., et а\. (Molecular Cloning-A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1982) и Newman и Campagnoni (Neuromethods, v. 16, 1990, pp 13-48). Например, может быть приготовлена экспрессионная библиотека в подходящих клетках-хозяевах и протестирована на активность люциферазы. Или может быть осуществлено выделение белка из холодного экстракта, определена его частичная аминокислотная последовательность и осуществлено клонирование соответствующей кДНК из образца кДНК из энхитреид Henlea sp. Последовательности нуклеиновых кислот должны быть встроены в кассету экспрессии. Кассета экспрессии может существовать как внехромосомный элемент или может быть включена в геном клетки в результате введения указанной кассеты экспрессии в клетку. В кассете экспрессии нуклеиновая кислота, кодирующая белок, является функционально связанной с регуляторной последовательностью, которая может включить промоторы, энхансеры, терминаторы, операторы, репрессоры и индукторы. После введения кассеты экспрессии в клетку в ней может образовываться функциональный белок. Системы экспрессии включают, например, бактериальные системы, дрожжевые клетки, насекомых, рыб, земноводных или клетки млекопитающих. Методы изготовления кассет экспрессии или систем для экспрессии желаемого продукта известны специалистам, квалифицированным в данной области. Клеточные линии, которые устойчиво экспрессируют люциферазу могут быть выбраны способами, известными в данной области (например, ко-трансфекция с селектируемым маркером, таким как dhfr, gpt, неомицин, гигромицин, что делает возможным выявление и выделение трансфицированных клеток, которые содержат ген, включенный в геном). Вышеописанные системы экспрессии могут использоваться в прокариотических или эукариотических хозяевах. Для получения белка могут использоваться клетки-хозяева, такие как Е. соН, В. subtilis, S. cerevisiae, клетки насекомого в комбинации с бакуловирусными векторами, или клетки высшего организма, такого как позвоночные, например, COS 7 клетки, НЕК 293, СНО, ооциты Xenopus и т.д.
Могут быть также экспрессированы функциональные мутанты природных белков. Как используется в настоящем описании, термин «функциональный» по отношению к люциферазе означает, что указанный белок способен использовать люциферин Henlea sp. в качестве субстрата биолюминесцентной реакции и 8-rnflpoKcn-10-((2R,3R,4S)-2,3,4,5- тетрагидроксипентил)пиримидо[4,5-Ь]хинолин-2,4(ЗН,10Н)-дион и/или его сульфатированный аналог (2S,3R,4R)-1 ,2,4-тригидрокси-5-(8-гидрокси-2,4-диоксо-3,4-дигидропиримидо[4,5- Ь]хинолин-10(2Н)-ил)пентан-3-илгидросульфат в качестве кофакторов реакции биолюминесценции.
Реактивы для детекции биолюминесценции
Методы настоящего изобретения основаны на применении 8-rnflpoKcn-10-((2R,3R,4S)- 2,3,4,5-тетрагидроксипентил)пиримидо[4,5-Ь]хинолин-2,4(ЗН, 10Н)-диона и/или его сульфатированного аналога (2S,3R,4R)-1 ,2,4-тригидрокси-5-(8-гидрокси-2,4-диоксо-3,4- дигидропиримидо[4,5-Ь]хинолин-10(2Н)-ил)пентан-3-илгидросульфата или его таутомера, стереоизомера или энантиомера, фармацевтически приемлемой соли, сольвата или гидрата в качестве компонента биолюминесцентной реакции, в частности для детекции биолюминесценции в биологических образцах.
Как используется в настоящем описании, 8-rnflpoKCH-10-((2R,3R,4S)-2,3,4,5- тетрагидроксипентил)пиримидо[4,5-Ь]хинолин-2,4(ЗН,10Н)-дион и/или его сульфатированный аналог (2S,3R,4R)-1 ,2,4-тригидрокси-5-(8-гидрокси-2,4-диоксо-3,4-дигидропиримидо[4,5- Ь]хинолин-10(2Н)-ил)пентан-3-илгидросульфат или его таутомер, стереоизомер или энантиомер, фармацевтически приемлемая соль, сольват или гидрат, имеющие следующую структурную формулу:
Figure imgf000012_0001
Acts R = S03H
Основу молекулы кофакторов биолюминесцентной реакции червя Henlea sp. составляет конденсированный гетероцикл - 5-деазафлавин, состоящий из двух шестичленных азотсодержащих циклов и одного бензольного цикла. Анализ спектров поглощения активатора Н (ActH) и исследование литературных данных показало, что ActH является 5-деаза-8- гидрокси аналогом рибофлавина, называемого кофермент Fo. Кофактор Fo участвует в окислительно-восстановительных реакциях у продуцентов метана и в депротонированной форме является коферментом ДНК-фотолиаз, найденных у прокариот, некоторых эукариот и архей (Glasa A. F. et а\. PNAS, 2009, 106 (28), 11540-11545). Лиофильно высушенные активаторы по изобретению хранятся при -20°С без снижения активности не менее 30 дней, чаще не менее 60 дней, обычно не менее года.
Состав условий для развития биолюминесцентного сигнала
Формирование биолюминесценции зависит от количества и сохранности люциферазы в биологических образцах. Также следует отметить воздействие светового излучения, особенно УФ части спектра, на люциферин, приводящее к его деградации и утрате функциональности, что было подтверждено экспериментально.
Изменение скорости реакции люциферазы Henlea sp. от pH и температуры в каждом случае выражается колоколообразной кривой с одним максимумом (фигуры 1 и 2). Сделана аппроксимация экспериментальных зависимостей нормальных распределений с параметрами рНопт и стандартным отклонением распределения о. pH варьировали 20мМ бис-трис- пропановым буфером при постоянных количествах люциферазы, люциферина и других компонентов в оптимальных концентрациях. рНопт для Henlea sp. - 7.25 при о = 0.9. Интервал значений pH для оптимальной скорости реакции Henlea sp. достаточно широк.
Температурный оптимум Henlea sp. равен 20°С. При этом стоит отметить, что, хотя люцифераза Henlea sp. чувствительна к повышению температуры после оптимума, инактивация фермента является полностью обратимой при кратковременном нагревании. Например, при снижении люминесценции на 90% при 37°С быстрый возврат к Топт восстанавливает люминесценцию до максимального уровня.
Для обеспечения pH могут быть использованы любые стандартные буферные растворы для данного диапазона pH, включая MOPS, HEPES, Трис-HCI, Бис-Трис-пропан. В преимущественных воплощениях молярность буферного раствора не превышает 2, например, не превышает 1 , чаще находится в диапазоне от 0.05 до 0.4, обычно от 0.1 до 0.2.
Реакционные смеси для нужд настоящего изобретения могут также содержать компоненты, стабилизирующие и защищающие ферменты биолюминесцентной системы от ингибирующего воздействия следовых количеств ионов тяжелых металлов и от деградации протеазами.
Например, реакционная смесь может содержать дитиотреитол (далее - ДТТ) в концентрации не более 20 мМ, чаще в концентрации от 0.1 до 8 мМ, преимущественно в концентрации 0.1- 4 мМ.
Реакционная смесь может также содержать бета-меркаптоэтанол и/или этилендиаминтетрауксусную кислоту (далее - ЭДТА) в конечной концентрации от 0 до 1 мМ.
Например, реакционная смесь может содержать 0.1 - 2 мМ ДТТ и 0.1 - 1 мМ ЭДТА.
Также реакционная смесь может содержать ингибиторы протеаз, например, фенилуксусную кислоту или щавелевую кислоту в стандартно используемых концентрациях.
Для нужд настоящего изобретения 8-rnflpoKcn-10-((2R,3R,4S)-2,3,4,5- тетрагидроксипентил)пиримидо[4,5-Ь]хинолин-2,4(ЗН,10Н)-дион и/или его сульфатированный аналог (2S,3R,4R)-1 ,2,4-тригидрокси-5-(8-гидрокси-2,4-диоксо-3,4-дигидропиримидо[4,5- Ь]хинолин-10(2Н)-ил)пентан-3-илгидросульфат добавляют к биологическому образцу до конечной концентрации 0.03 - 300 мкМ, чаще 1 - 5 мкМ.
В некоторых вариантах воплощения изобретения к образцу добавляют смесь реагентов, включающих буферный раствор, компоненты, стабилизирующие и защищающие ферменты биолюминесцентной системы от ингибирующего воздействия следовых количеств ионов тяжелых металлов и от деградации протеазами, люциферин. В других воплощениях к биологическому образцу сперва добавляют буферный раствор, компоненты, стабилизирующие и защищающие ферменты биолюминесцентной системы от ингибирующего воздействия следовых количеств ионов тяжелых металлов и от деградации протеазами, люциферин, а затем раствор 8-rnflpoKcn-10-((2R,3R,4S)-2,3,4,5- тетрагидроксипентил)пиримидо[4,5-Ь]хинолин-2,4(ЗН, 10Н)-диона и/или его сульфатированного аналога (2S,3R,4R)-1 ,2,4-тригидрокси-5-(8-гидрокси-2,4-диоксо-3,4- дигидропиримидо[4,5-Ь]хинолин-10(2Н)-ил)пентан-3-ил гидросульфата.
В зависимости от растворителя, использованного для приготовления раствора кофактора (активатора) по изобретению, реакционная смесь может содержать небольшие количества использованных растворителей.
Также реакционная смесь может содержать детергенты, такие как Triton Х100 или нонилфеноксиполиэтоксиэтанол. В некоторых вариантах воплощения изобретения концентрация детергентов в реакционной смеси не превышает 0,2 %, чаще не превышает 0,1%, оптимально не превышает 0,06%.
Также реакционная смесь может содержать бычий сывороточный альбумин (БСА) или другие белки в концентрации, не превышающей 2%, чаще не превышающей 1%, оптимально не превышающей 0,5%. БСА используется, когда концентрация биологического образца крайне мала, тогда БСА играет роль стабилизатора белков.
Развитие биолюминесцентного сигнала происходит в широком диапазоне температур - от 4 до 40°С, оптимально при 20°С.
Формирование люминесцентного сигнала начинается сразу после инициации реакции при добавлении ключевых реактивов для выявления активности люциферазы, указанных выше.
Максимальная интенсивность люминесценции наблюдается в момент инициации реакции. Далее идет спад, скорость которого определяется активностью ферментов и начальными концентрациями субстратов. При определенных условиях (субстратов много, активность ферментов мала, температура реакции снижена) реакция может наблюдаться в течение одного и более часов (фигура 3).
Детекция биолюминесценции
Методы настоящего изобретения включают детекцию биолюминесценции, возникающей в биологическом образце, содержащем люциферазу и люциферин при появлении в нем активаторов по изобретению.
Биолюминесценция может быть обнаружена с помощью методов, известных специалистам в данной области, в частности, с помощью визуального скрининга или с использованием люминометра, фотометра, флуориметра, цифровой фотокамеры, с помощью светочувствительной фотопленки. В качестве количественной характеристики может быть использована максимальная интенсивность люминесценции, которая достигается через 5-30 мин после инициации биолюминесцентной реакции или скорость нарастания люминесценции в интервале до 30 мин после инициации биолюминесцентной реакции, например, в течение 1 , 2, 5, 10, 20 мин после инициации реакции или дольше.
В преимущественных воплощениях измеряемая люминесценция представляет собой длительное свечение, скорее, чем световые вспышки. В преимущественных воплощениях интенсивность люминесценции зависит от активности ферментов биолюминесцентной системы, присутствующих в образце, начальных концентраций субстратов и температуры реакционной смеси и обычно колеблется в пределах от 10 кв/сек до 10 млн кв/сек, чаще 100 — 100000 кв/сек.
Реакция длится не менее 5 мин после инициации, чаще 10-15 мин, иногда (в зависимости от условий) 30 и более минут.
Испускаемый при окислении люциферина, при участии по меньшей мере, одного соединения согласно настоящему изобретению и/или его функционального аналога свет находится в диапазоне от 430 до 500 нм, чаще в диапазоне от 450 до 475 нм, с максимумом эмиссии при 464 нм.
Способы применения
Методы и реактивы настоящего изобретения могут быть использованы в широком спектре биолюминесцентных анализов in vivo и in vitro.
В частности, методы и реактивы настоящего изобретения могут быть использованы для выявления активных компонентов биолюминесцентных системы энхитреид Henlea sp. в процессе их очистки.
Также методы и реактивы настоящего изобретения могут быть использованы для выявления функциональных аналогов ферментов биолюминесцентной системы энхитреид Henlea sp. в биологических образцах.
Также методы и реактивы настоящего изобретения могут быть использованы для выявления активности рекомбинантной люциферазы в клетках-хозяевах.
В некоторых вариантах воплощения изобретения для осуществления применения должна быть получена нуклеиновая кислота, кодирующая люциферазу. Полученная нуклеиновая кислота должна быть встроена в кассету экспрессии, обеспечивающую временную или постоянную экспрессию этой нуклеиновой кислоты в клетках-хозяевах, например под интересующими исследователя промоторами. Кассета экспрессии может содержать элементы, обеспечивающие адресную доставку конструкции в интересующие клетки или клеточные компартменты, или находится в составе частиц, обеспечивающих адресную доставку. После трансфекции клеток кассетой экспрессии (например, в составе экспрессионного вектора) и по истечении времени, необходимого для наработки в клетках продукта экспрессии, может быть осуществлено выявление активности люциферазы внутри клеток или в клеточном лизате.
Наборы
Также обеспечиваются в соответствии с настоящим изобретением наборы для использования при осуществлении вышеописанных применений. В некоторых воплощениях наборы обычно включают. По меньшей мере, одно соединение по изобретению, предпочтительно с буферным раствором для растворения указанного соединения и/или его добавления к биологическим образцам. Соединения по изобретению могут присутствовать в растворенном виде в соответствующей среде для хранения, такой как водный или буферный раствор с детергентом, обычно в соответствующей емкости. Альтернативно, соединения по изобретению могут присутствовать в наборе в лиофилизованном виде.
В дополнение к описанным выше компонентам, заявленные наборы могут дополнительно включать инструкции для осуществления заявленных способов. Эти инструкции могут присутствовать в заявленных наборах в различных формах (например, в печатном варианте или на электронном носителе в виде текстового и/или графического файла) в количестве одна или более.
Биолюминисцентные композиции
Также обеспечиваются в соответствии с настоящим изобретением биолюминисцентные композиции для использования при осуществлении вышеописанных применений.
В некоторых воплощениях композиции обычно включают, по меньшей мере, одно соединение по изоретению, предпочтительно с буферным раствором для растворения указанного соединения и/или его добавления к биологическим образцам. Соединения по изобретению могут присутствовать в растворенном виде в соответствующей среде для хранения, такой как водный или буферный раствор с детергентом. Альтернативно, соединения по изобретению могут присутствовать в композиции в лиофилизованном виде.
В некоторых воплощениях композиции обычно включают 8-rnflpoKcn-10-((2R,3R,4S)- 2,3,4,5-тетрагидроксипентил)пиримидо[4,5-Ь]хинолин-2,4(ЗН, 10Н)-дион и/или его сульфатированный аналог (2S,3R,4R)-1 ,2,4-тригидрокси-5-(8-гидрокси-2,4-диоксо-3,4- дигидропиримидо[4,5-Ь]хинолин-10(2Н)-ил)пентан-3-илгидросульфат, предпочтительно с буферным раствором для растворения указанного соединения и/или его добавления к биологическим образцам. 8-rnflpoKcn-10-((2R,3R,4S)-2,3,4,5- тетрагидроксипентил)пиримидо[4,5-Ь]хинолин-2,4(ЗН,10Н)-дион и/или его сульфатированный аналог (2S,3R,4R)-1 ,2,4-тригидрокси-5-(8-гидрокси-2,4-диоксо-3,4-дигидропиримидо[4,5- Ь]хинолин-10(2Н)-ил)пентан-3-илгидросульфат может присутствовать в растворенном виде в соответствующей среде для хранения, такой как водный или буферный раствор с детергентом. Альтернативно, 8-rnflpoKcn-10-((2R,3R,4S)-2,3,4,5- тетрагидроксипентил)пиримидо[4,5-Ь]хинолин-2,4(ЗН,10Н)-дион и/или его сульфатированный аналог (2S,3R,4R)-1 ,2,4-тригидрокси-5-(8-гидрокси-2,4-диоксо-3,4-дигидропиримидо[4,5- Ь]хинолин-10(2Н)-ил)пентан-3-илгидросульфат может присутствовать в композиции в лиофилизованном виде. В дополнение к описанным выше компонентам, заявленные композиции могут дополнительно включать вспомогательные вещества, в частности, адъюванты, растворители и/или наполнители, такие, которые совместимы с соединениями, составляющими суть данного изобретения, и которые не разрушают биологической активности этих соединений.
Следующие примеры предлагаются в качестве иллюстративных, но не ограничивающих.
Примеры
Получение бесклеточных экстрактов червей Henlea sp.
Выбранных из почвы червей Н. petushkovi и Н. rodionovae промывали и замораживали, накапливая порциями по 1000 особей для экспериментов. Для приготовления бесклеточных экстрактов использовали водные гомогенаты замороженных червей (1 г/5 мл, НгО, 0°С). Клетки дополнительно разрушали ультразвуком в течение 10 мин на ледяной бане, применяя дезинтегратор Sonics Vibra-Cell (“Sonics & Materials, Inc.”, США, диаметр зонда 13 мм, амплитуда 60 мкм). Полученные лизаты центрифугировали при 4 °С (центрифуга XPN-100 с угловым ротором Ti 50.2, “Beckman Coulter”, США, 140 000 g, 5 мин). Супернатант отделяли и использовали для дальнейшего хроматографирования.
Пробу 1-40 мкл супернатанта помещали в кювету люменометра, доводили до 200 мкп 20мМ Трис-HCI pH 7.0. Люминесцентную реакцию инициировали добавлением фракции люциферина 1-4 мкл. Полученный бесклеточный супернатант изначально содержал все компоненты люминесцентной системы Henlea sp. и светился в течение 20-60 мин, постепенно угасая. Полагая, что при этом происходит полное ферментативное “выжигание” люциферина, для воспроизведения люминесцентного сигнала in vitro добавляли свежий люцифериновый экстракт.
Очистка проб образцов нативной люциферазы
На колонку Superdex 200 10/300 GL (“GE Healthcare”, США) в каждом случае наносили 100 мкл супернатанта. Гель-фильтрацию проводили в 10 мМ фосфатном буфере (pH 7.0), содержащем 100 мМ NaCI, со скоростью 0.7 мл/мин при комнатной температуре. Колонку калибровали, используя вещества с известной молекулярной массой: ферритин, альдолаза, каталаза, бычий сывороточный альбумин, овальбумин, миоглобин, рибонуклеаза, цитохром с, рибофлавин. Для определения пиков с люциферазной активностью полученные фракции тестировали в реакциях с высокоочищенным препаратом нативного люциферина энхитреид Henlea sp. Для тестирования активности люциферазы брали по 5 мкл фракции и по 2 мкл люциферина (фигура 4).
Порядок экстракции люциферина
Люциферин получали из гомогената червей с помощью органических растворителей, таких как ацетон, спирт, этилацетат (при этом люцифераза вместе с другими белками выпадала в осадок). 0.5 мл охлажденного ацетона добавляли к 5-10 замороженным червям, гомогенизировали, выдерживали в течение 60 минут при 0°С, затем центрифугировали (16000 д, 3 мин). Полученный супернатант не обладает люминесцентной активностью, однако добавление его к белковому препарату приводило к испусканию света. Люциферин- содержащую фракцию хранят в темноте при -20°С во избежание инактивации. Вспышку света при добавлении действительно наблюдали, однако раз от раза эффект стимуляции снижался по причине быстрого инактивирования люциферина в такой смеси. После многочисленных экспериментов было установлено, что свечение погасшего супернатанта можно восстановить добавкой порции этого же экстракта после кратковременного нагрева до 100°С. Таким образом, кажущееся исчезновение люциферина в действительности оказалось его переходом в неактивное, но обратимое состояние. Выяснилось, что люциферин в неактивном состоянии достаточно стабилен, выдерживает концентрирование под вакуумом на роторном испарителе, последующую лиофилизацию и долгие хроматографические процедуры при комнатной температуре. Найденный приём термоактивации люциферина Henlea sp. далее применялся для его тестирования в пробах на всех этапах очистки. Тестирование проводили в 16 мМ буфере MOPS с pH 7,0, содержащем 1 мМ СаС12, а в качестве люциферазы использовали первичный бесклеточный супернатант Henlea sp. Такой грубый препарат кроме люциферазы содержал неактивный люциферин и различные примеси.
Экстракция, разделение и очистка люциферина и низкомолекулярных компонентов
Замороженных червей гомогенизировали в воде при 0°С и центрифугировали (16000 д, 3 мин). Проводили денатурацию белков супернатанта добавлением соляной кислоты до конечной концентрации 0,3 мМ. Выпавший осадок удаляли центрифугированием (10000 д, 20 мин). Супернатант, содержащий люциферин, при УФ-облучении ярко флуоресцировал.
Для концентрирования и отделения люцифериновой фракции методом твёрдофазной экстракции супернатант наносили на колонку С16 объёмом 1 мл. После промывки колонки 0,1% муравьиной кислотой целевую фракцию элюировали 3 мл 75% ацетонитрила в воде и доводили её до минимального объёма на роторном испарителе. Далее проводили многоэтапную очистку люциферина на высокоэффективном жидкостном хроматографе Agilent 1260 Infinity (“Agilent Technology”, США) с детектором DAD, используя разные колонки (“Agilent Technology”): обратнофазная ZORBAX Eclipse XDB-C18 (9,4 А~ 250 мм) с градиентом ацетонитрила в воде от 5 до 40% в течение 24 мин со скоростью 3 мл/мин; ZORBAX Eclipse XDB-C18 (3 А~ 150 мм) с градиентом ацетонитрила в 0,1% формиата от 1 до 40% в течение 10 мин со скоростью 1 мл/мин; анионообменная ZORBAX SAX (4,6 А~ 150 мм) с элюированием целевых фракций 0,1 М раствором КН2РО4 (pH 4,6) со скоростью 1 мл/мин. Финальную гель- фильтрацию проводили на колонке Superdex Peptide 10/300 GL (“GE Health Care Life Sciences”, США) с элюированием фракций 50 мМ формиата аммония (pH 4,6) со скоростью 0,8 мл/мин.
В процессе хроматографической очистки люциферина было зарегистрировано неоправданно резкое снижение его суммарной активности. Предположив, что происходит потеря некоего компонента, необходимого для люминесцентной реакции, авторы настоящего изобретения стали отслеживать распределение не только самого люциферина, но и тех фракций, которые при перекрестном тестировании повышали его активность. Таким образом, на первом хроматографическом этапе авторы настоящего изобретения выявили два пика, способных многократно усиливать биолюминесценцию реакционной смеси. Эти низкомолекулярные компоненты, названные “Активатор Н” и “Активатор S”, фракционировали и далее рехроматографировали отдельно. В таблице 1 приведены значения времени удерживания на колонках всех трёх целевых низкомолекулярных компонентов биолюминесцентной системы Henlea sp.
Таблица 1. Хроматографические параметры высокоочищенных компонентов на разных хроматографических колонках.
Figure imgf000020_0001
Анализ низкомолекулярных компонентов биолюминесцентной системы Henlea
SQ.
УФ-спектры компонентов биолюминесцентной реакции, проявляющих активирующую испускание света активность, а именно фракций 31,1 и 38,6 мин (табл. 1), нормированные при максимуме 395 нм, практически совпадают (фигура 5). Активаторы флуоресцируют голубым светом с максимумом флуоресценции 464 нм (фигура 6), который совпадает с максимумом биолюминесценции Henlea sp. in vivo (фигура 7). Интересно, что спектр возбуждения (фигура 7) хорошо коррелирует со спектром поглощения (фигура 5) активаторов. Значительный стоксов сдвиг (70 нм) объясняется переносом энергии возбуждённого состояния люминофора, находящегося в сильно полярной среде (вода). При этом длина волны возбуждения не влияла на спектр испускания.
Структурные исследования активатора люциферина Henlea.
В результате многоэтапной хроматографической очистки получено 0.3 оптические единицы Активатора Н для снятия MS/MSn и ЯМР спектров. Чистота образца по ЯМР >95%.
Анализ очищенного из биомассы червя природного Активатора Н выявил ион [М-Н]- с m/z = 362.0986, что соответствует брутто-формуле C16H16N3O7- Характерные паттерны фрагментации показали, что молекула состоит из двух фрагментов, один из которых углеводный, что было подтверждено ЯМР-спектроскопией. Анализ очищенного природного Активатора S выявил молекулярный ион [М-Н]- с m/z = 442.0589, что соответствует формуле C16H16N3O10S- Как видно, из брутто-формулы, молекула Acts отличается от молекулы ActH на фрагмент SO3. Паттерны фрагментации масс-спектра показали, что первым отцепляется от молекулы именно этот фрагмент, после чего полностью повторяется фрагментация ActH. Это дало основание полагать, что молекулы двух активаторов практически идентичны, с той разницей, что у Acts вместо одной из гидроксильных групп - сульфоэфирная. Спектры ЯМР компонентов ActH зарегистрированы в двух растворителях: D O и MeOD. Спектры ActH в D O (pH 3.46, 10°С) сняты на ЯМР-спектрометре Bruker Avance III 600MHz, оборудованном криодатчиком CPTXI 1H/13C/15N Z-Grad. Были сняты следующие спектры ЯМР: 1Н 1D (37 минут на спектр, 8 спектров в целях контроля стабильности образца), 13C-HSQC (21 час), DQF COSY (8.5 часов), ROESY (21 час), 13С-НМВС (22 часа 50 минут, 5 спектров с последующим суммированием для увеличения соотношения сигнал/шум). Разрешение по непрямому направлению составляло 1024 действительные точки (COSY, ROESY) и 2048 точек (HSQC, НМВС).
После регистрации спектров в D O образец компонента ActH был высушен, растворен в сЦ-MeOD. Спектры Acts в D O (pH 2.60, 10°С) и b и ActH в MeOD (10°С) зарегистрированы на ЯМР спектрометре Bruker Avance III 800 MHz, оборудованном криогенно-охлажденным датчиком CPTCI 1H/13C/15N Z-Grad. Сняты следующие спектры: 1Н 1D (45 минут на спектр, 6 спектров в целях контроля стабильности образца), 13C-HSQC (21 час, 3 спектра с последующим суммированием в целях улучшения соотношения сигнал/шум), DQF COSY (20,5 часов), TOCSY (27 часов). Структуры компонентов ActH и Acts и химические сдвиги ЯМР показаны на фигуре 8 и в таблице 2.
Наибольший слабопольный сдвиг 0.748 м.д. в спектре 1Н-ЯМР Acts наблюдался для протона Н-13 (С-3’ фрагмента рибозы), что позволило однозначно установить положение сульфоэфирной группы при третьем атоме углерода рибозы.
Таблица 2. Значения химических сдвигов в спектрах ЯМР компонентов биолюминесценцентной системы Henlea sp. ActH и Acts. Значения химических сдвигов углерода взяты из спектров HSQC и/или НМВС.
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
Литературный поиск среди известных природных соединений позволяет найти хромофор Fo (McCormick, Morton, JACS 1982, 104, 4014-4015; Kuo et al. J Antibiot (Tokyo) 1989, 42, 475-478; Hossain et al. Org Biomol Chem 2015, 13, 5082-5085; Bender et al. Beilstein J Org Chem 2016, 12, 912-917) в качестве возможной химической структуры Активатора Н. Приведенные в литературе данные ЯМР не противоречат такому предположению.
Синтез компонента биолюминесцентной системы Henlea sp. Активатора Н по изобретению.
Figure imgf000023_0002
Figure imgf000023_0003
, 25°C, 44% кипячение, 30%
4
Figure imgf000023_0001
1 Активатор H О Кофактор F0
3-((/77-бутилдифенилсилил)окси)анилин (2):
Навески имидазола (2.50 г, 36.65 ммоль) и 3-аминофенола 2 (2.00 г, 18.33 ммоль) растворили в абсолютном тетрагидрофуране (далее - ТГФ). Перемешивали при комнатной температуре 30 мин. Далее по каплям добавили дифенил-т-бутилхлорсилан (7.56 г, 27.49 ммоль). Выпал мелкий осадок. Перемешивали при комнатной температуре в инертной атмосфере в течение ночи. При достижении полной конверсии реакционную массу разбавили 100 мл воды, экстагировали эфиром (4x100 мл). За ходом реакции следили по ТСХ (силикагель, хлороформ-этанол 9:1 , Rf 0.8). Продукт был выделен методом колоночной хроматографии (Нех/ЕЮАс=70:30). Получено светло-жёлтое масло 2 (5.50 г, 86%).
1 Н NMR (700 MHz, Chloroform-d) d 7.92 - 7.79 (m, 4H), 7.56 - 7.49 (m, 2H), 7.48 - 7.37 (m, 4H), 6.94 (t, J = 8.0 Hz, 1 H), 6.29 (ddd, J = 7.9, 2.2, 0.9 Hz, 1 H), 6.27 (ddd, J = 8.1 , 2.3, 0.9 Hz, 1 H), 6.25 (t, J = 2.2 Hz, 1 H), 1.19 (s, 9H).
2-((3-((/Т7ре/Г7-бутилдифенилсилил)окси)фенил)амино)тетрагидро-2Н-пиран-3,4,5- триол (3):
Навески соединения 2 (2.66 г, 7.57 ммоль) и d-(-)-pn6o3bi (1.24 г, 8.17 ммоль) растворили в 26 мл МеОН. Раствор нагрели до кипения в инертной атмосфере. Перемешивали до полного прохождения реакции. За ходом реакции следили по ТСХ (силикагель, хлороформ-этанол 9:1, Rf 0.25). Растворитель отогнали в вакууме, после чего остаток перерастворили в 26 мл дихлорметана. Раствор промывали насыщенным раствором хлорида натрия (5x20 мл). Раствор сушили над безводным сульфатом натрия, после чего дихлорметан отогнали в вакууме. Получили 2,42 г (67%) белого стекловидного вещества (3).
1 Н NMR (700 MHz, Chloroform-d) d 7.80 (ddd, J = 8.1, 4.6, 1.4 Hz, 4H), 7.62 - 7.46 (m, 2H), 7.46 - 7.36 (m, 4H), 7.33 (s, 1 H), 6.98 (t, J = 8.1 Hz, 1 H), 6.46 - 6.30 (m, 2H), 6.25 (t, J = 2.3 Hz, 1 H), 5.11 (d, J = 10.1 Hz, 1 H), 4.40 (d, J = 9.9 Hz, 1 H), 3.94 (dd, J = 12.9, 2.5 Hz, 1 H), 3.91 - 3.84 (m, 2H), 3.64 (dd, J = 7.5, 3.9 Hz, OH), 3.35 (dd, J = 12.9, 1.4 Hz, 1 H), 3.26 (dd, J = 21.6, 8.5 Hz, 2H), 2.94 (d, J = 5.9 Hz, 1 H), 1.16 (s, 9H).
2-((3-((/Т7ре/Г7-бутилдифенилсилил)окси)фенил)амино)пентан-1 ,2,3,4-тетраол (4):
Тетрагидроборат натрия (1.53 г, 39.96 ммоль) порционно присыпали к раствору соединения 3 (2.42 г, 4.99 ммоль) в сухом метаноле (26 мл), охлаждённому на ледяной бане. После добавления, смесь нагрели до 50°С и перемешивали 16 ч. За ходом реакции следили по ТСХ (силикагель, хлороформ-этанол 9:1, Rf 0.2). После реакционную смесь смешали с 150 мл насыщенного раствора хлористого аммония, после чего её промыли дихпорметаном (далее - ДХМ) (5x50 мл). Органические слои были объединены, растворитель был отогнан в вакууме, а осадок был очищен методом колоночной хроматографии (ДХМ/метанол=90:10). Было получено белое стеклообразное вещество (4) (1.07 г, 44%).
1 Н NMR (700 MHz, Chloroform-d) d 7.79 (m, 4H), 7.61 - 7.38 (m, 2H), 6.94 (t, J = 8.0 Hz, 1 H), 6.26 (m, 3H), 3.96 - 3.57 (m, 3H), 3.23 (m, 2H), 1.16 (s, 9H).
8-гидрокси-10-(2,3,4,5-тетрагидроксипентил)пиримидо[4,5-Ь]-хинолин-2,4(ЗН, 10Н)дион (1):
Навески соединения 4 (0.1 г, 0.21 ммоль), параформальдегида (0.006 г, 0.21 ммоль) и барбитуровой кислоты (0.03 г, 0.21 ммоль) растворили в 2 мл смеси N,N-Диметилформамид (далее - ДМФА)/уксусная кислота (1 :1). Раствор нагрели до кипения в инертной атмосфере и перемешивали 40 минут. За ходом реакции следили по ТСХ (силикагель, хлороформ-этанол 7:3, Rf 0.4). После этого уксусную кислота была отогнана в вакууме, продукт был выделен методом колоночной хроматографии (НСС1з/ЕЮН=90:10 => ЕЮН). Было получено 0.02 г (31%) тёмно-жёлтого порошка 1.
1 Н NMR (700 MHz, DMSO-d6) d 8.74 (s, 1 H), 7.91 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 7.20 (s, 1 H), 6.91 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 4.21 (br, 1 H), 3.72 - 3.63 (m, 2H), 3.59 (t, J = 5.7 Hz, 1 H), 3.47 (dd, J = 10.9, 6.0 Hz, 2H).
Синтез компонента биолюминесцентной системы Henlea sp. Активатора S по изобретению.
Figure imgf000025_0003
сн2о,
BzG
Figure imgf000025_0004
1) Py*SG3
2) K2C03, метанол
75% после 2-х стадий
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000025_0002
5 Активатор S
3-нитрофенилбензоат (6)
Трифенилфосфин (5.53 г, 21.1 ммоль) и иод (5.36 г, 21.1 ммоль) растворили в 75 мл ДХМ на ледяной бане. К раствору добавили бензойную кислоту (1.71 г, 14,0 ммоль) и 3- нитрофенол (2.13 г, 15,3 ммоль). Реакцию нагрели до комнатной температуры, после чего перемешивали 20 минут. Продукт был выделен методом колоночной хроматографии (силикагель, ЕЮАс/Нех (30:70)). Получено 3.02 г соединения 6 (81%).
1Н NMR (300 MHz, DMSO-cfe) d 7.69 - 7.59 (m, 1 H), 7.56 (t, J = 7.5 Hz, 1 H), 7.53 - 7.45 (m, 2H), 7.42 (dt, J= 7.5, 1.5 Hz, 1 H).
3-аминофенилбензоат (7)
3-нитрофенилбензоат (2.71 г, 11.14 ммоль) и дигидрат дихлорида олова (12.56 г, 55.72 ммоль) растворили в 60 мл ЕЮН и перемешивали при 100 °С в течение часа. Реакционную массу остудили до комнатной температуры и оттитровали насыщенным раствором карбоната калия до рН~8. Раствор был промыт ДХМ (3X50 мл), после чего органические слои были объединены и просушены над ЫагБС , после чего растворитель был отогнан в вакууме. В результате было получено 2.33 г соединения 7 с выходом, близким к количественному.
1 H-NMR (CDCh, 400 MHz): 8.1 (dd, 2Н), 7.63 (td, 1 Н), 7.50 (t, 2Н), 7.18 (t, 1 Н), 6.59 (m, ЗН), 3.45 (s, 2Н)
13C-NMR (CDCIs, 100 MHz): 165.15, 151.95, 147.56, 133.47, 130.12, 139.69, 128.51 , 112.75, 111.59, 108.48
3-(((ЗВ,48,5В)-3,4-дигидрокси-5-(гидроксиметил)тетрагидрофуран-2- ил)амино)фенилбензоат (8)
Навески 3-аминофенилбензоата 7 (3,34 г, 15,7 ммоль) и d-(-)-pn6o3bi (2,57 г, 17,1 ммоль) были растворены в 60 мл сухого метанола, после чего смесь нагрели до кипения и перемешивали 6 часов в атмосфере аргона. За ходом реакции следили по ТСХ (силикагель, хлороформ-этанол 9:1, Rf 0.3). После прохождения реакции метанол был отогнан в вакууме и жёлтый порошок был подвергнут очистке методом колоночной хроматографии (ДХМ/МеОН=9:1). В результате был получен светло-жёлтый порошок 8 (4,12 г, 76%).
1 Н NMR (700 MHz, CD3OD) d 8.14 - 7.99 (m, 1 Н), 7.63 (ddt, J = 8.0, 6.8, 1 .5 Hz, 1 H), 7.56 - 7.44 (m, 1 H) 7.00 (td, J = 8.0, 3.7 Hz, 1 H), 6.40 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 6.31 (dt, J = 13.1 , 2.0 Hz, 1 H), 6.23 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 4.83 (d, J = 7.9 Hz, 1 H), 4.11 (br, 1 H), 3.95 - 3.44 (m, 5H)
((2В,ЗВ,4В)-4-(бензоилокси)-5-((3-(бензоилокси)фенил)амино)-3- гидрокситетрагидрофуран-2-ил)метилбензоат (9).
К раствору соединения 8 (1.1 г, 4.58 ммоль) и триметилортобензоата (1.25 мл, 6.87 ммоль) в 20 мл ДХМ добавили камфоросульфокислоту (50 мг). Смесь перемешивали при 20°С в течение 10 минут, добавили триэтиламин (0.1 мл), упаривали досуха в вакууме и остаток растворяли в пиридине (7 мл). К полученному раствору прибавляли бензоил хлорид (0.8 мл, 6.87 ммоль) и диметиламинопиридин (10 мг) и смесь перемешивали при 40°С в течение 30 минут. Смесь разлагали добавлением метанола (0.5 мл), соупаривали в вакууме с толуолом и остаток растворяли в хлористом метилене (10 мл). К полученному раствору прибавляли 90% водный раствор трифторуксусной кислоты (1 мл), и смесь перемешивали при 20°С в течение 30 минут, разбавляли хлористым метиленом (30 мл) и промывали насыщенным водным раствором ЫаНСОз (3x10 мл). Органическую фазу пропускали через слой силикагеля (ЕЮАс/толуол 1:5). Сырой продукт растворяли в толуоле (50 мл), добавляли триэтиламин (0.1 мл) и смесь оставляли кристаллизоваться при 4°С на 12 часов. Выпавшие кристаллы отфильтровывали, промывали смесью толуол/гексан (1:1, 30 мл), высушивали в вакууме и получали 1.56 г (76%) кристаллы дибензоата 9.
((2В,ЗВ,4В)-4-(бензоилокси)-5-((3-(бензоилокси)фенил)амино)-3-((/Т7ре/Т7- бутилдиметилсилил)окси)тетрагидрофуран-2-ил)метилбензоат (10)
Навески имидазола (0.25 г, 3.61 ммоль) и соединения 9 (1.00 г, 1.81 ммоль) растворили в сухом ТГФ. Перемешивали при комнатной температуре 30 мин. Далее порционно добавили диметил-т-бутилхлорсилан (0,41 г, 2,7 ммоль). Выпал мелкий осадок. Перемешивали при комнатной температуре в инертной атмосфере в течение ночи. За ходом реакции следили по ТСХ (силикагель, хлороформ-этанол 9:1, Rf 0.85). При достижении полной конверсии реакционную массу разбавили 100 мл воды, проэкстагировали эфиром (4x100 мл). Продукт был выделен методом колоночной хроматографии (Нех/ЕЮАс=70:30). Получено светло- жёлтое стекловидное вещество 10 (0,95 г, 79%).
1Н NMR (300 MHz, DMSO-cfe) d 8.16 - 8.07 (m, 1 H), 8.07 - 7.94 (m, 2H), 7.64 - 7.51 (m, 2H), 7.50 - 7.38 (m, ЗН), 7.25 (t, J= 7.5 Hz, OH), 7.15 (d, J= 10.1 Hz, OH), 6.96 (dt, J= 7.5, 1.5 Hz, OH), 6.77 (dt, J= 7.5, 1.5 Hz, OH), 6.53 (t, J= 1.5 Hz, OH), 5.27 (dd, J= 10.0, 7.0 Hz, OH), 4.79 (td, J = 7.0, 0.9 Hz, OH), 4.54 - 4.31 (m, 2H), 4.25 (qd, J = 6.9, 0.8 Hz, 1 H), 0.85 (s, 5H), 0.02 (s, 3H).
(2Р,38,48)-5-((3-(бензоилокси)фенил)амино)-3-((трет- бутилдиметилсилил)окси)пентан-1 ,2,4-триилтрибензоат (11)
Тетрагидроборат натрия (0.215 г, 5.69 ммоль) порционно присыпали к раствору соединения 10 (0.95 г, 1.42 ммоль) в сухом метаноле (6 мл), охлаждённому на ледяной бане. После добавления, смесь нагрели до комнатной температуры и перемешивали 16 ч. За ходом реакции следили по ТСХ (силикагель, хлороформ-этанол 9:1, Rf 0.2). После реакционную смесь смешали с 150 мл насыщенного раствора хлористого аммония, после чего её промыли ДХМ (5x50 мл). Органические слои были объединены и посушены над сульфатом натрия, растворитель был отогнан в вакууме, а осадок был перерастворён в 6 мл ТГФ. К полученному раствору добавили имидазол (0.096 г, 1.42 ммоль), перемешивали при комнатной температуре полчаса. После этого к реакционной смеси по каплям добавили бензоилхлорид (0.096 г, 161 мкл, 1.39 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре до полной конверсии (за ходом реакции следили по ТСХ: силикагель, хлороформ-этанол 9:1). Продукт был очищен методом колоночной хроматографии (ДХМ/метанол=90:10). Было получено белое стеклообразное вещество 11 (0.779 г, 71%).
1Н NMR (300 MHz, DMSO-cfe) d 8.19 - 8.09 (m, 1 H), 8.07 - 7.96 (m, ЗН), 7.68 - 7.55 (m, 2H), 7.54 - 7.41 (m, 4H), 7.21 (t, J = 7.5 Hz, OH), 7.10 (t, J = 7.1 Hz, OH), 6.91 (d, J = 7.0 Hz, OH), 6.87 (dt, J = 7.5, 1 .4 Hz, OH), 6.65 (dt, J = 7.5, 1 .5 Hz, OH), 6.41 (t, J = 1 .5 Hz, 1 H), 4.83 (q, J = 6.9 Hz, 1 H), 4.71 (t, J = 7.0 Hz, OH), 3.86 - 3.53 (m, 1 H), 0.84 (s, 5H), 0.01 (s, 3H).
(28,ЗР,4Р)-5-(8-(бензоилокси)-2,4-диоксо-3,4-дигидропиримидо[4,5-Ь]хинолин- 10(2Н)-ил)-3-гидроксипентан-1 ,2,4-триилтрибензоат (12)
Навески соединения 11 (0.75 г, 0.97 ммоль), параформальдегида (0.029 г, 0.97 ммоль) и барбитуровой кислоты (0.124 г, 0.97 ммоль) растворили в 9 мл смеси ДМФА/уксусная кислота (1 :1). Раствор нагрели до кипения в инертной атмосфере и перемешивали 40 минут. За ходом реакции следили по ТСХ (силикагель, хлороформ-этанол 8:2, Rf 0.7). После этого уксусную кислота была отогнана в вакууме, продукт был выделен методом колоночной хроматографии (НСС1з/ЕЮН=90:10 => ЕЮН). Было получено 0.217 г (29%) тёмно-жёлтого порошка 12. 1 H NMR (700 MHz, DMSO-cfe) d 8.17 - 8.08 (m, 2H), 8.74 (s, 1 H), 8.01 (ddt, J= 7.6, 2.9, 1 .4 Hz, 6H), 7.91 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 7.54 - 7.42 (m, 8H), 7.20 (s, 1 H), 6.91 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 4.89 - 4.67 (m, 4H), 4.61 - 4.44 (m, 2H), 4.33 (dddd, J = 8.5, 7.0, 6.2, 0.7 Hz, 1 H), 4.20 (dd, J = 12.3, 7.0 Hz, 1 H).
(28,ЗР,4Р)-1,2,4-тригидрокси-5-(8-гидрокси-2,4-диоксо-3,4-дигидропиримидо[4,5- Ь]хинолин-10(2Н)-ил)пентан-3-илгидросульфат (5)
К раствору соединения 12 (217 мг, 0.28 ммоль) в 1 мл ДМФА по каплям добавили раствор комплекса пиридин-триоксида серы (44 мг, 0.27 ммоль) в 1 мл ДМФА, после чего перемешивали при комнатной температуры 3 часа. После этого, к раствору добавили 5 мл, диэтилового эфира, выпавший жёлтый осадок отфильтровали и перерастворили в 1 мл метанола. К реакционной массе добавили 0.5 мл водного раствора карбоната калия (153 мг, 1.11 ммоль), реакционную массу перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Продукт был выделен методом препаративной обращённо-фазной хроматографии (MeCN- НгО С18). Было получено 573 мг (75 %) жёлтого порошка 5.
1Н NMR (800 MHz, D20) d 9.1 (s, 1Н), 8.12 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 7.3 (s, 1 H), 7.17 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 4.69 (m, J = 8.2 Hz, 1 H), 4.59 (dd, J = 6.2, 3.9 Hz, 1 H), 4.23 (t, J = 5.1 Hz, 1 H), 3.81 (dd, J = 12.1 , 3.3 Hz, 1 H), 3.72 (dd, J = 12.2, 11.8, 6.8 Hz, 1 H).
Использование _ 8-mflpoKCH-10-((2R,3R,4S)-2,3A5- тетрагидроксипентил)пиримидоГ4,5-Ь1хинолин-2,4(ЗН,10Н)-диона для выявления люциферазы в биологических образцах.
Термоактивированный люциферин был получен, как описано выше в разделе «Порядок экстракции люциферина». В качестве образцов использовали хроматографически очищенный на колонке Superdex 200 белковый препарат из биомассы червей Henlea sp, полученный как описано выше в разделе «Очистка проб образцов нативной люциферазы». 8-гидрокси-10- ((2Н,ЗН,45)-2,3,4,5-тетрагидроксипентил)пиримидо[4,5-Ь]хинолин-2,4(ЗН,10Н)-дион был получен, как описано выше в разделе «Синтез компонента биолюминесцентной системы Henlea sp. Активатора Н»
2 мкл высокоочищенного люциферина Henlea sp. в 100 мкл 16 мМ MOPS (pH 7.0), содержащем 1мМ СаСЬ помещали в кипящую воду на 1 мин, переносили в термостат на 1 мин при 20°С. Добавляли 5 мкл белкового препарата, добавляли 1 мкл 0.1 мМ 8-гид рокси- 10- ((2R,3R,4S)-2, 3,4, 5-тетрагид роксипентил)пиримидо[4,5-Ь]хинолин-2,4(ЗН,10Н)-диона.
В ходе эксперимента в каждом случае сначала измеряли фоновую люминесценцию экстракта люциферазы, а затем добавляли аликвоты раствора 8-rnflpoKcn-10-((2R,3R,4S)- 2,3,4,5-тетрагидроксипентил)пиримидо[4,5-Ь]хинолин-2,4(ЗН,10Н)-диона (фигура 9).
Во всех случаях была выявлена люминесценция биологических образцов. Измерение зависимости интенсивности биолюминесценции от количества компонента _ 8-гидрокси-10-( -2,3,4,5-тетрагидроксипентил)пиримидоГ4,5-
Figure imgf000029_0001
Ь1хинолин-2,4(ЗН,10Н)-диона.
Термоактивированный люциферин был получен, как описано выше в разделе «Порядок экстракции люциферина». В качестве образцов использовали первичный бесклеточный супернатант из биомассы червей Henlea sp, полученный как описано выше в разделе «Получение образцов нативной люциферазы». 8-rnflpoKCH-10-((2R,3R,4S)-2,3,4,5- тетрагидроксипентил)пиримидо[4,5-Ь]хинолин-2,4(ЗН,10Н)-дион был получен, как описано выше в разделе «Синтез компонента биолюминесцентной системы Henlea sp. Активатора Н»
2 мкл высокоочищенного люциферина Henlea sp. в 100 мкл 16 мМ MOPS (pH 7.0), содержащем 1мМ СаСЬ помещали в кипящую воду на 1 мин, переносили в термостат на 1 мин при 20°С. Добавляли 2мкл частично очищенной люциферазы.
Биолюминесцентную реакцию активировали добавлением различных количеств раствора 8-гидрокси-10-((2П,ЗП,45)-2,3,4,5-тетрагидроксипентил)пиримидо[4,5-Ь]хинолин- 2,4(ЗН,10Н)-диона. Зависимость люминесценции от концентрации НАДФН показана на фигуре 10. Оптимальная концентрация раствора 8-rnflpoKCH-10-((2R,3R,4S)-2,3,4,5- тетрагидроксипентил)пиримидо[4,5-Ь]хинолин-2,4(ЗН,10Н)-диона в реакционной смеси, при которой наблюдалась максимальная биолюминесценция, составила 2.3 мкМ .
Использование _ 8-rwipoKCH-10-((2R.3R.4S)-2.3.4.5- тетрагидроксипентил)пиримидоГ4,5-Ь1хинолин-2,4(ЗН,10Н)-диона для детекции биолюминесценции в биологических образцах.
Термоактивированный люциферин был получен, как описано выше в разделе «Порядок экстракции люциферина». В качестве биологических образцов использовали экстракты червей Henlea sp, полученный как описано выше в разделе «Получение бесклеточных экстрактов червей Henlea sp.». 8-rnflpoKCH-10-((2R,3R,4S)-2,3,4,5- тетрагидроксипентил)пиримидо[4,5-Ь]хинолин-2,4(ЗН,10Н)-дион был получен, как описано выше в разделе «Синтез компонента биолюминесцентной системы Henlea sp. Активатора Н»
2 мкл высокоочищенного люциферина Henlea sp. в 100 мкл 16 мМ MOPS (pH 7.0), содержащем 1мМ СаСЬ помещали в кипящую воду на 1 мин, переносили в термостат на 1 мин при 20°С. Добавляли 2 мкл бесклеточного экстракта, добавляли 1 мкл 0.1 мМ 8-гидрокси-10- ((2R,3R,4S)-2, 3,4, 5-тетрагид роксипентил)пиримидо[4,5-Ь]хинолин-2,4(ЗН,10Н)-диона.
В ходе эксперимента в каждом случае сначала измеряли фоновую люминесценцию экстракта биомассы, а затем добавляли аликвоты раствора 8-rnflpoKcn-10-((2R,3R,4S)-2,3,4,5- тетрагидроксипентил)пиримидо[4,5-Ь]хинолин-2,4(ЗН,10Н)-диона (фигура 11).
Во всех случаях была выявлена люминесценция биологических образцов. Использование (25,ЗЯ,4Ж-1,2,4-тригидрокси-5-(8-гидрокси-2,4-диоксо-3,4- дигидропиримидоГ4,5-Ь1хинолин-10(2Н)-ил)пентан-3-илгидросульфата для выявления люциферазы в биологических образцах.
Термоактивированный люциферин был получен, как описано выше в разделе «Порядок экстракции люциферина». В качестве образцов использовали хроматографически очищенный на колонке Superdex 200 белковый препарат из биомассы червей Henlea sp, полученный как описано выше в разделе «Очистка проб образцов нативной люциферазы». (2S,3R,4R)-1 ,2,4- тригидрокси-5-(8-гидрокси-2,4-диоксо-3,4-дигидропиримидо[4,5-Ь]хинолин-10(2Н)-ил)пентан- 3- ил гидросульфат был получен, как описано выше в разделе «Синтез компонента биолюминесцентной системы Henlea sp. Активатора S»
2 мкл высокоочищенного люциферина Henlea sp. в 100 мкл 16 мМ MOPS (pH 7.0), содержащем 1мМ СаСЬ помещали в кипящую воду на 1 мин, переносили в термостат на 1 мин при 20°С. Добавляли 5 мкл белкового препарата, добавляли 1 мкл 0.1мМ (2S,3R,4R)-1 ,2,4- тригидрокси-5-(8-гидрокси-2, 4-диоксо-3, 4-дигид ропиримидо[4,5-Ь]хинолин-10(2Н)-ил)пентан- 3- ил гид росу л ьфата.
В ходе эксперимента в каждом случае сначала измеряли фоновую люминесценцию экстракта люциферазы, а затем добавляли аликвоты раствора (2S,3R,4R)-1 ,2,4-TpnrnflpoKcn- 5-(8-гидрокси-2, 4-диоксо-3, 4-дигид ропиримидо[4,5-Ь]хинолин-10(2Н)-ил)пентан-3- ил гидросульфата (фигура 12).
Во всех случаях была выявлена люминесценция биологических образцов.
Использование _ -1.2.4-тригидрокси-5-(8-гидрокси-2.4-диоксо-3.4-
Figure imgf000030_0001
дигидропиримидоГ4,5-Ь1хинолин-10(2Н)-ил)пентан-3-илгидросульфата для детекции биолюминесценции в биологических образцах.
Термоактивированный люциферин был получен, как описано выше в разделе «Порядок экстракции люциферина». В качестве биологических образцов использовали экстракты червей Henlea sp, полученный как описано выше в разделе «Получение бесклеточных экстрактов червей Henlea sp.». (2S,3R,4R)-1 ,2,4-тригидрокси-5-(8-гидрокси-2,4-диоксо-3,4- дигидропиримидо[4,5-Ь]хинолин-10(2Н)-ил)пентан-3-илгидросульфат был получен, как описано выше в разделе «Синтез компонента биолюминесцентной системы Henlea sp. Активатора S»
2 мкл высокоочищенного люциферина Henlea sp. в 100 мкл 16 мМ MOPS (pH 7.0), содержащем 1мМ СаСЬ помещали в кипящую воду на 1 мин, переносили в термостат на 1 мин при 20°С. Добавляли 2 мкл бесклеточного экстракта, затем добавляли 1 мкл 0.1 мМ (2S,3R,4R)- 1 ,2,4-тригидрокси-5-(8-гидрокси-2,4-диоксо-3,4-дигидропиримидо[4,5-Ь]хинолин-10(2Н)- ил)пентан-3-илгидросульфата.
В ходе эксперимента в каждом случае сначала измеряли фоновую люминесценцию экстракта биомассы, а затем добавляли аликвоты раствора (2S,3R,4R)-1 ,2,4-тригидрокси-5-(8- гидрокси-2,4-диоксо-3,4-дигидропиримидо[4,5-Ь]хинолин-10(2Н)-ил)пентан-3- ил гидросульфата (фигура 13).
Во всех случаях была выявлена люминесценция биологических образцов.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Claims

Формула изобретения
1. Применение соединения 8-гид рокси-10-((2R,3R,4S)-2, 3,4, 5- тетрагидроксипентил)пиримидо[4,5-Ь]хинолин-2,4(ЗН,10Н)-диона и/или его сульфатированного аналога (2S,3R,4R)-1 ,2,4-тригидрокси-5-(8-гидрокси-2,4-диоксо-3,4- дигидропиримидо[4,5-Ь]хинолин-10(2Н)-ил)пентан-3-илгидросульфата или его таутомера, стереоизомера или энантиомера, фармацевтически приемлемой соли, сольвата или гидрата, характеризующегося следующей общей формулой I:
Figure imgf000032_0001
формула I, где R представляет собой водород Н или сульфогруппу -SO3H, в качестве компонента биолюминесцентной реакции.
2. Набор для детекции люциферазы в биологическом образце, включающий соединение 8-гидрокси-10-((2Н,ЗН,48)-2,3,4,5-тетрагидроксипентил)пиримидо[4,5-Ь]хинолин- 2,4(ЗН,10Н)-дион и/или его сульфатированный аналог (2S,3R,4R)-1 ,2,4-тригидрокси-5-(8- гидрокси-2, 4-диоксо-3, 4-дигид ропиримидо[4,5-Ь]хинолин-10(2Н)-ил)пентан-3-ил гидросульфат или его таутомер, стереоизомер или энантиомер, фармацевтически приемлемую соль, сольват или гидрат, характеризующийся следующей структурной формулой:
Figure imgf000032_0002
формула I, где R представляет собой водород Н или сульфогруппу -SO3H; в качестве компонента биолюминесцентной реакции.
3. Набор по п.2, который дополнительно включает буфер, детергент, восстановительный агент и/или глицерин.
4. Набор по п.З, в котором указанные компоненты содержаться в допустимых количествах.
5. Биолюминесцентная композиция, включающая соединение 8-гидрокси-10- ((2Н,ЗН,45)-2,3,4,5-тетрагидроксипентил)пиримидо[4,5-Ь]хинолин-2,4(ЗН,10Н)-дион и/или его сульфатированный аналог (2S,3R,4R)-1 ,2,4-тригидрокси-5-(8-гидрокси-2,4-диоксо-3,4- дигидропиримидо[4,5-Ь]хинолин-10(2Н)-ил)пентан-3-илгидросульфат или его таутомер, стереоизомер или энантиомер, фармацевтически приемлемую соль, сольват или гидрат, характеризующийся следующей общей формулой I:
Figure imgf000033_0001
формула I, где R представляет собой водород Н или сульфогруппу -S03H, в качестве компонента биолюминесцентной реакции, люциферин и люциферазу.
6. Композиция по п.5, в которой люцифераза является рекомбинантной.
7. Композиция по п.5, в которой люцифераза представляет собой люциферазу червя Henlea sp.
8. Композиция по п.7, в котором червь представляет собой вид Henlea petushkovi и/или Henlea rodionovae.
9. Способ детекции люциферазы в биологическом образце, включающем люциферазу, люциферин и соединение 8-rnflpoKcn-10-((2R,3R,4S)-2,3,4,5- тетрагидроксипентил)пиримидо[4,5-Ь]хинолин-2,4(ЗН,10Н)-дион и/или его сульфатированный аналог (2S,3R,4R)-1 ,2,4-тригидрокси-5-(8-гидрокси-2,4-диоксо-3,4-дигидропиримидо[4,5- Ь]хинолин-10(2Н)-ил)пентан-3-илгидросульфат или его таутомер, стереоизомер или энантиомер, фармацевтически приемлемую соль, сольват или гидрат, характеризующийся следующей общей формулой I:
Figure imgf000033_0002
формула I, где R представляет собой водород Н или сульфогруппу -SO3H; в качестве компонента биолюминесцентной реакции.
10. Способ по п.9, в котором люцифераза представляет собой люциферазу червя Henlea sp.
11. Способ по п.9, в котором люцифераза представляет собой рекомбинантную люциферазу.
12. Способ по п.9, в котором биологический образец представляет собой ткань и/или клетку.
13. Способ по п.9, в котором биологический образец характеризуется значением pH в диапазоне от 7 до 8.
14. Способ по.9, включающий следующие этапы: а) добавление соединения общей формулы I к биологическому образцу для получения реакционной смеси; б) инкубирование реакционной смеси в условиях, подходящих для возникновения биолюминесценции; в) детектирование биолюминесценции в реакционной смеси.
15. Способ по п.14, в котором концентрация соединения общей формулы I составляет 0.03 - 300 мкМ.
16. Способ детекции биолюминесценции в биологическом образце, включающем люциферазу и соединение 8-rnflpoKcn-10-((2R,3R,4S)-2,3,4,5- тетрагидроксипентил)пиримидо[4,5-Ь]хинолин-2,4(ЗН,10Н)-дион и/или его сульфатированный аналог (2S,3R,4R)-1 ,2,4-тригидрокси-5-(8-гидрокси-2,4-диоксо-3,4-дигидропиримидо[4,5- Ь]хинолин-10(2Н)-ил)пентан-3-илгидросульфат или его таутомер, стереоизомер или энантиомер, фармацевтически приемлемую соль, сольват или гидрат, характеризующийся следующей общей формулой I:
Figure imgf000034_0001
формула где R представляет собой водород Н или сульфогруппу -SO3H; в качестве компонента биолюминесцентной реакции.
17. Способ по п.16, в котором люцифераза представляет собой рекомбинантную люциферазу.
18. Способ по п.16, в котором люцифераза представляет собой люциферазу червя Henlea sp.
19. Способ по п.18, в котором червь представляет собой вид Henlea petushkovi и/или Hen lea rodio novae.
20. Способ по п.16, в котором биологический образец представляет собой ткань и/или клетку.
21. Способ по п.16, в котором биологически образец характеризуется значением pH в диапазоне от 7 до 8.
22. Способ по п.16, включающий следующие этапы: а) экспрессию гена люциферазы в биологическом образце; б) добавление люциферина; в) добавление соединения структурной формулы I к биологическому образцу; г) детектирование биолюминесценции.
23. Способ по п.22, в котором концентрация соединения общей формулы I составляет 0.03 - 300 мкМ.
PCT/RU2021/050207 2020-07-08 2021-07-08 Применение кофактора f o и его аналогов в качестве компонента биолюминесцентной реакции WO2022010386A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020122667A RU2020122667A (ru) 2020-07-08 2020-07-08 Применение кофактора FO и его аналогов в качестве компонента биолюминесцентной реакции
RU2020122667 2020-07-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022010386A1 true WO2022010386A1 (ru) 2022-01-13

Family

ID=79553550

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2021/050207 WO2022010386A1 (ru) 2020-07-08 2021-07-08 Применение кофактора f o и его аналогов в качестве компонента биолюминесцентной реакции

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2020122667A (ru)
WO (1) WO2022010386A1 (ru)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2596398C1 (ru) * 2015-02-25 2016-09-10 Закрытое акционерное общество "ЕВРОГЕН" Метод и реактивы для детекции активности люциферазы
US20180273536A1 (en) * 2016-10-21 2018-09-27 Oregon Health & Science University Small molecules that bind mr1

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2596398C1 (ru) * 2015-02-25 2016-09-10 Закрытое акционерное общество "ЕВРОГЕН" Метод и реактивы для детекции активности люциферазы
US20180273536A1 (en) * 2016-10-21 2018-09-27 Oregon Health & Science University Small molecules that bind mr1

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BENDER MATTHIAS, MOURITSEN HENRIK, CHRISTOFFERS JENS: "A robust synthesis of 7,8-didemethyl-8-hydroxy-5-deazariboflavin", BEILSTEIN JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY, vol. 12, 1 January 2016 (2016-01-01), pages 912 - 917, XP055898617, DOI: 10.3762/bjoc.12.89 *
PETUSHKOV V. N. ET AL.: "New types of luminescent systems of soil enchytraeids (Annelida: Clitellata: Oligochaeta: Enchytraeidae", DOKLADY BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS, vol. 401, 2005, pages 115 - 118, XP019295649, DOI: 10.1007/s10628-005-0047-1 *
XIN XING, XI LEI, TU SHIAO-CHUN: "Probing the Vibrio harveyi Luciferase 0 Subunit Functionality and the Intersubunit Domain by Site-Directed Mutagenesis", BIOCHEMISTRY, 1 January 1994 (1994-01-01), pages 12194 - 12201, XP055898634, Retrieved from the Internet <URL:https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/bi00206a023> [retrieved on 20220308], DOI: 10.1021/bi00206a023 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2020122667A (ru) 2022-01-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6539689B2 (ja) オキヒオドシエビ属由来ルシフェラーゼ、新規セレンテラジン基質、及び使用法
JP4958388B2 (ja) 発光性化合物に関する組成物、方法並びにキット
US8765921B2 (en) Coelenterazine analogs and manufacturing method thereof
Albarracín et al. First characterisation of a CPD-class I photolyase from a UV-resistant extremophile isolated from High-Altitude Andean Lakes
Talukder et al. Tryptophan-based fluorophores for studying protein conformational changes
US20240018566A1 (en) Method and agents for detecting luciferase activity
Kim et al. Bioluminescent imaging systems for assay developments
Brodl et al. The impact of LuxF on light intensity in bacterial bioluminescence
WO2022010386A1 (ru) Применение кофактора f o и его аналогов в качестве компонента биолюминесцентной реакции
RU2744869C2 (ru) Метод и реактивы для детекции активности люциферазы
Watanabe et al. Studies on Luciferase from Photobacterium phosphoreum XI. Interaction of 8-Substituted FMNH 2 with Luciferase
Petushkov et al. Low-Molecular-Weight Components of Luminescent Reaction of the Siberian Enchytraeid Henlea sp.
Joshi et al. Specific incorporation of molybdopterin in xanthine dehydrogenase of Pseudomonas aeruginosa
WO2021262043A1 (ru) Метод и реактивы для детекции активности люциферазы
WO2024089297A1 (en) Novel fluorescent and bioluminescent proteins and reporter systems for ratiometric measurement of luminescence
Minges Engineering of Halogenases towards Synthetic Applications

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21838432

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21838432

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1