WO2021246418A1 - ナノファイバーを有して成るシートおよびその製造方法 - Google Patents

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有亮 森田
皓輝 横田
健一郎 宅見
修一 中西
雅之 辻
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株式会社村田製作所
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    • D10B2331/041—Fibres made from polymers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polycondensation products polyesters, e.g. polyethylene terephthalate [PET] derived from hydroxy-carboxylic acids, e.g. lactones
    • D—TEXTILES; PAPER
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    • D10B—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBLASSES OF SECTION D, RELATING TO TEXTILES
    • D10B2401/00—Physical properties
    • D10B2401/16—Physical properties antistatic; conductive

Definitions

  • the present invention relates to a sheet having nanofibers and a method for producing the same. More specifically, the present invention relates to a sheet comprising nanofibers containing a polymer piezoelectric material such as a polylactic acid-based polymer and a method for producing the same.
  • a polymer piezoelectric material such as a polylactic acid-based polymer
  • Patent Documents 1 and 2 disclose scaffolding materials using a resin film.
  • Patent Document 3 discloses rod-shaped or plate-shaped materials that promote bone formation.
  • Patent Document 4 discloses a film for promoting bone formation.
  • Patent Document 5 discloses a cell culture sheet including a layer of an inorganic material having micropores.
  • Patent Document 6 discloses a sheet provided with a porous resin film.
  • Patent Document 7 discloses a scaffolding material composed of an aggregate of fibers mainly composed of a biocompatible polymer.
  • Patent Document 8 discloses a medical material in which coated fibers obtained by coating synthetic resin fibers with titanium or a titanium compound are accumulated.
  • Non-Patent Document 1 discloses a nanofiber scaffold to which inorganic nanoparticles (BaTIO 3 (BTO)) for promoting bone formation are added.
  • BTO inorganic nanoparticles
  • Japanese Unexamined Patent Publication No. 2019-115322 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2019-115323 Japanese Patent No. 3023471 Japanese Patent No. 3023472 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2014-147342 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2016-214210 International Publication (WO) 2007/10206 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2008-6276
  • the inventors of the present application realized that there are problems to be overcome in the materials such as scaffolding materials and scaffolds for culturing conventional cells, and found the necessity to take measures for them. Specifically, the inventors of the present application have found that there are the following problems.
  • a main object of the present invention is to provide a material capable of more actively or actively promoting cell proliferation and activation, and having improved physical properties such as flexibility.
  • the inventors of the present application tried to solve the above-mentioned problems by dealing with them in a new direction, instead of dealing with them as an extension of the conventional technology. Specifically, the inventors of the present application have focused on the fact that nanofibers containing a polymer piezoelectric material generate an electric potential (or electric charge) by receiving external energy (for example, tension, stress, etc.). We investigated if the electric potential could actively or actively promote cell proliferation and activation. As a result of diligent research based on this idea, the inventors of the present application control physical properties such as the crystallinity of the polymer piezoelectric material used in order to activate cells more appropriately, preferably crystallization. I found it important to increase the degree.
  • the inventors of the present application in the production of a sheet made of nanofibers containing a polymer piezoelectric material, particularly in the formation of nanofibers by an electrospinning method (hereinafter referred to as "electrospinning").
  • electrospinning a method that can control the crystallinity of a polymer piezoelectric material and significantly improve it, and can give the nanofiber sheet physical properties such as flexibility suitable for cell activation. More specifically, the crystallinity of the polymer piezoelectric material contained in the nanofibers can be controlled or improved by preheating the target plate for receiving and collecting the nanofibers during electrospinning.
  • a method for producing a sheet having nanofibers containing a polymer piezoelectric material wherein at least the following steps (a) to (c): (A) A step of dissolving a polymer piezoelectric material in a solvent to prepare a spinning liquid containing the polymer piezoelectric material. (B) A step of preheating a target plate for receiving the nanofibers before spinning the spinning solution by electrospinning to form nanofibers. (C) Manufacture of a sheet having the nanofibers, which comprises a step of receiving the nanofibers formed by electrospinning on the target plate and forming the nanofibers into a sheet on the target plate.
  • a method is provided (hereinafter, may be referred to as "the manufacturing method of the present disclosure").
  • the present invention provides a sheet having nanofibers produced by the above-mentioned production method (hereinafter, "sheet of the present disclosure” or “fiber sheet” or simply “sheet” or “sheet material”. Sometimes referred to as). More specifically, a sheet having nanofibers containing a polymer piezoelectric material, such as a sheet in which physical properties such as the crystallinity of the polymer piezoelectric material contained in the nanofibers are controlled, or nanofibers. A sheet or the like having a controlled fiber diameter or the like is provided.
  • nanofiber containing a material capable of more actively or actively promoting cell proliferation and activation and having improved physical properties such as flexibility, specifically, a polymer piezoelectric material.
  • a sheet is obtained.
  • FIG. 1 is a schematic diagram schematically showing the manufacturing method of the present disclosure.
  • FIG. 2 is a photograph of the surface of the sheet prepared in Example 1 observed with a scanning electron microscope (SEM).
  • FIG. 3 is a graph showing the measurement results of the PLLA nanofibers contained in the sheet produced in Example 1 by XRD.
  • FIG. 4 is a photograph showing a rubber heater.
  • FIG. 5 is a photograph showing a horizontal electrospinning device.
  • FIG. 6 shows an SEM of a fiber sheet prepared at a target temperature of 25 ° C., (B) 40 ° C., (C) 60 ° C., (D) 80 ° C., and (E) 100 ° C. with a BTEAC addition rate of 4 w / w%.
  • FIG. 7 shows an SEM of a fiber sheet prepared at a BTEAC addition rate of 5 w / w%, a target temperature of 25 ° C., (B) 40 ° C., (C) 60 ° C., (D) 80 ° C., and (E) 100 ° C.
  • the image is shown (2000 times).
  • FIG. 8 shows an SEM image of a fiber sheet produced at a BTEAC addition rate of 4 w / w% and a target temperature of 25 ° C. (without preheating) (5000 times).
  • FIG. 9 is a graph showing the crystallinity calculated from the DSC measurement results (BTEAC addition rate 4 w / w% and 5 w / w%).
  • FIG. 10 shows a DSC curve (BTEAC addition rate 4 w / w%).
  • FIG. 11 is a graph showing the crystallization temperature calculated from the DSC measurement results (BTEAC addition rate 4 w / w% and 5 w / w%).
  • FIG. 12 shows the FTIR measurement results at a BTEAC addition rate of 3 w / w% ((a) 25 ° C., (b) 40 ° C., (c) 60 ° C., (d) 80 ° C., (e) 100 ° C.).
  • FIG. 3 w / w% ((a) 25 ° C., (b) 40 ° C., (c) 60 ° C., (d) 80 ° C., (e) 100 ° C.).
  • FIG. 13 shows the FTIR measurement results at a BTEAC addition rate of 4 w / w% ((a) 25 ° C., (b) 40 ° C., (c) 60 ° C., (d) 80 ° C., (e) 100 ° C.).
  • FIG. 14 shows the FTIR measurement results at a BTEAC addition rate of 5 w / w% ((a) 25 ° C., (b) 40 ° C., (c) 60 ° C., (d) 80 ° C., (e) 100 ° C.).
  • FIG. 15 is a schematic view schematically showing a state in which a Kapton tape (insulating tape) is attached to an aluminum target plate.
  • FIG. 16 shows an SEM image of the oriented fiber sheet A (Example) (1000 times, Bar: 10 ⁇ m).
  • FIG. 17 shows an SEM image of the oriented fiber sheet B (comparative example) ( ⁇ 1000 times, Bar: 10 ⁇ m).
  • FIG. 18 is a schematic diagram schematically showing the minor axis (a) and the major axis (b) of the ellipse used in the ellipse approximation.
  • FIG. 19 is a schematic diagram schematically showing the production of a piezoelectric test piece.
  • FIG. 20 is a photograph showing a piezoelectric test piece.
  • FIG. 21 is a schematic diagram schematically showing the generation of electric potential in PLLA.
  • FIG. 22 is a photograph showing a piezoelectricity test apparatus.
  • FIG. 23 is a graph showing the potential measurement results for displacement when tension is applied in the direction of 45 ° with respect to the orientation fiber sheet fiber axis direction (BTEAC addition rate 3 w / w%, target temperature 86 ° C.).
  • FIG. 24 is a graph showing the potential measurement results for displacement when tension is applied in the 135 ° direction with respect to the oriented fiber sheet fiber axial direction (BTEAC addition rate 3 w / w%, target temperature 86 ° C.).
  • FIG. 25 is a graph showing the potential measurement results for displacement when tension is applied in the direction of 45 ° with respect to the oriented fiber sheet fiber axis direction (BTEAC addition rate 0 w / w%, target temperature 25 ° C. (no preheating). )).
  • FIG. 26 is a graph showing the potential measurement results for displacement when tension is applied to the epoxy resin (blank).
  • FIG. 27 is a graph showing the results of potential measurement for a load when a tension is applied in the direction of 45 ° with respect to the orientation fiber sheet fiber axis direction (BTEAC addition rate 3 w / w%, target temperature 86 ° C.).
  • FIG. 28 is a graph showing the potential measurement results for a load when a tension is applied in the 135 ° direction with respect to the fiber axis direction of the oriented fiber sheet (BTEAC addition rate 3 w / w%, target temperature 86 ° C.).
  • FIG. 29 is a graph showing the potential measurement results for a load when a tension is applied in the direction of 45 ° with respect to the orientation fiber sheet fiber axis direction (BTEAC addition rate 0 w / w%, target temperature 25 ° C. (no preheating). )).
  • FIG. 30 is a graph showing the potential measurement results for a load when a tension is applied to the epoxy resin (blank).
  • FIG. 31 shows an SEM image of a fiber sheet produced by a vertical electrospinning device (PLLA concentration: 12 w / v%, 2000 times).
  • FIG. 32 shows an SEM image of a fiber sheet produced by a vertical electrospinning device (PLLA concentration: 14 w / v%, 2000 times).
  • FIG. 33 shows an SEM image of a fiber sheet produced by a vertical electrospinning device (PLLA concentration: 16 w / v%, 2000 times).
  • FIG. 34 shows an SEM image of a fiber sheet produced by a vertical electrospinning device (BTEAC concentration: 1 to 3 w / w%, target temperature: 40 to 80 ° C., 2000 times).
  • the present invention provides nanofibers containing a material capable of more actively or actively promoting cell proliferation and activation and having improved physical properties such as flexibility, more specifically, a polymer piezoelectric material.
  • the present invention relates to a sheet having and a method for manufacturing such a sheet.
  • the sheet manufacturing method will be described first, and then the sheet of the present disclosure will be described in detail below.
  • nanofiber sheet a sheet having nanofibers containing a polymer piezoelectric material described in detail below (hereinafter, may be referred to as “nanofiber sheet” or “fiber sheet”), and more specifically, nanofibers.
  • the production method comprises at least the following steps (a) to (c), particularly the step (b) described in detail below. Is the main feature.
  • the sheet manufacturing method of the present disclosure is characterized by using electrospinning.
  • a positive (plus) voltage is applied to the spinning solution 1 (a solution prepared by dissolving a polymer piezoelectric material in an arbitrary solvent) using, for example, a voltage generator 6.
  • positive charges are collected on the droplets of the spinning solution 1 ejected from the tip of the nozzle 2 and repel each other to form a conical shape (enclosed by the broken line in FIGS. 1B and 1A). See (enlarged and outlined)).
  • the repulsive force of the electric charge exceeds the surface tension, the spinning liquid 1 is ejected linearly from the apex of the cone (see FIG.
  • the target plate 4 may be negatively (minus) charged using the voltage generator 6 or may be grounded (earthed).
  • the spinning liquid 1 becomes thinner as it is ejected toward the target plate 4, and the density of the surface charge increases accordingly, so that the spinning liquid 1 is further stretched and becomes thinner.
  • the solvent contained in the spinning liquid 1 can be volatilized to form ultrafine fibers having a diameter on the order of nanometers (nm), that is, nanofibers 3.
  • the target plate 4 receives the nanofibers 3, and the nanofibers 3 are collected on the surface facing the nozzle 2, so that a sheet-like material in which the nanofibers 3 can spread and extend two-dimensionally can be formed.
  • the sheet material made of an aggregate of nanofibers 3 which can be formed in this way is, in other words, a non-woven fabric which can be made of nanofibers 3.
  • nanofiber sheet such a sheet-like material is also referred to as a "nanofiber sheet” or a “fiber sheet” in the present disclosure.
  • the number of nanofibers 3 constituting the nanofiber sheet of the present disclosure is not particularly limited, and may be composed of not only one nanofiber but also two or more nanofibers. Further, since the above-mentioned electrospinning can usually be spun at room temperature or ambient temperature, it is possible to spin using various polymer materials.
  • the target plate 4 in electrospinning, which is generally performed at room temperature or ambient temperature, the target plate 4 is placed on the target plate 4 before the formation of nanofibers by spinning, for example, as shown in FIG. 1 (A).
  • the greatest feature is that it is “heated” in advance with 5 (more specifically, a rubber heater (see FIG. 4)) or the like (step (b)).
  • Such a "preheating” or “heating” process is an unexpected process that cannot be easily conceived from the viewpoint of cost for those skilled in the art who perform electrospinning at room temperature or ambient temperature.
  • the crystallinity of the polymer material that can be contained in the nanofibers, particularly the polymer piezoelectric material can be controlled, and the crystallinity of the polymer piezoelectric material is remarkably improved. be able to.
  • an external energy such as stress or tension
  • an electrical stimulus suitable for cell activation, proliferation or culture, especially an electric potential is generated.
  • the sheets of the present disclosure can be used to more actively or actively promote cell activation.
  • the fiber diameter of the nanofibers can be controlled, and the fiber diameter of the nanofibers can be made finer and more uniform.
  • the nanofiber sheet of the present disclosure physical properties such as bending strength, surface roughness and porosity can be controlled or improved, and by extension, physical properties such as flexibility can be improved or improved. can. Therefore, it is possible to further promote the activation of cells by further improving the adhesion to the cells.
  • the above-mentioned problems can be brilliantly solved by the step (b) mainly included in the manufacturing method of the present disclosure.
  • the temperature at which the target plate 4 is heated in the step (b) is preferably the temperature of the spinning liquid 1, for example, normal temperature or higher or the ambient temperature or higher, and the high temperature that can be contained in the spinning liquid 1. It is more preferable that the temperature is equal to or higher than the glass transition temperature of the molecular piezoelectric material.
  • the temperature at which the target plate 4 is heated is, for example, greater than 25 ° C and less than 100 ° C.
  • the "polymer piezoelectric material” means a material containing a polymer (or polymer or resin) having a piezoelectric effect or piezoelectricity (hereinafter, “polymer piezoelectric material”). Sometimes referred to).
  • the "piezoelectric effect” means a polarization phenomenon due to an external force.
  • piezoelectricity means a property of generating a voltage when a mechanical strain is applied, or conversely, generating a mechanical strain when a voltage is applied.
  • the polymer piezoelectric material is not particularly limited as long as it is a polymer material having the above-mentioned piezoelectric effect or piezoelectricity.
  • polylactic acid type polypeptide type (for example, poly ( ⁇ -benzyl glutarate), poly ( ⁇ -methyl glutarate), etc.), cellulose type (for example, cellulose acetate, cyanoethyl cellulose, etc.), polybutyric acid type (for example).
  • polymers having optical activity such as polypropylene oxide, and derivatives thereof.
  • polylactic acid-based polymer As the polymer piezoelectric material, it is preferable to use a "polylactic acid-based polymer” from the viewpoint of improving piezoelectricity and crystallinity.
  • polylactic acid-based polymer refers to "polylactic acid (a polymer consisting only of repeating units derived from a monomer selected from the group consisting of L-lactic acid and D-lactic acid)", "L-lactic acid or D”. -Lactic acid and a copolymer of this L-lactic acid or a compound copolymerizable with D-lactic acid "and a mixture thereof.
  • polylactic acid-based polymers “polylactic acid” is particularly preferable, and it is most preferable to use L-lactic acid homopolymer (PLLA) and D-lactic acid homopolymer (PDLA).
  • the optical purity of polylactic acid (PLA) is, for example, 90% by weight or more, preferably 95% by weight or more or 97% by weight or more, more preferably 98% by weight or more and 100% by weight or less in both D-form and L-form. Even more preferably, it is 99.0% by weight or more and 100% by weight or less, and particularly preferably 99.0% by weight or more and 99.8% by weight or less.
  • optical purity of polylactic acid (PLA) as a piezoelectric material is a value calculated by the following formula, which is synonymous with the enantiomeric excess (e.e.%).
  • the L-form and D-form of polylactic acid (PLA) for example, the values obtained by the method using high performance liquid chromatography (HPLC) can be used.
  • nanofibers means fibers having a fiber diameter or diameter on the order of nanometers (nm), and more specifically, ultrafine fibers having a fiber diameter of about 1 nm or more and 1000 nm or less. do.
  • Such nanofibers can be produced, for example, by “electrospinning” (also referred to as “electrospinning method") as shown in FIG.
  • the method for producing nanofibers is not limited to electrospinning, and a conjugated spinning method (for example, sea-island type, split fiber type, core-sheath type fibers, particularly composite fibers, etc. can be produced). Nanofibers may be manufactured by such means.
  • electrospinning means a method of forming fibers by spinning by applying a voltage to a “spinning solution”.
  • the "spinning liquid” means a liquid in which a polymer piezoelectric material is dissolved in an arbitrary solvent.
  • the manufacturing method of the present disclosure does not exclude the use of a liquid in which the polymer piezoelectric material is melted as the spinning liquid.
  • the spinning liquid may contain other components (for example, a surfactant, a conductivity-imparting agent, etc.), if necessary.
  • the "solvent" contained in the spinning liquid means a liquid capable of dissolving at least a part of the polymer piezoelectric material.
  • the solvent is not particularly limited as long as it can dissolve at least a part of the polymer piezoelectric material, and a conventionally known organic solvent can be appropriately selected and used.
  • the "surfactant" contained in the spinning solution in the present disclosure is not particularly limited, and is, for example, an alcohol-based agent such as 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP).
  • HFIP 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol
  • surfactants can be used. By adding such a surfactant, it is possible to obtain effects such as improving the compatibility with the polymer piezoelectric material and the solvent, and improving the stability of spinning.
  • the "conductivity-imparting agent" contained in the spinning liquid is not particularly limited, and an ammonium-based conductivity-imparting agent such as benzyltriethylammonium chloride (BTEAC) can be used.
  • BTEAC benzyltriethylammonium chloride
  • the conductivity and conductivity of the spinning liquid are improved to promote electrospinning, crystallinity is improved, and the fiber diameter and its standard deviation (SD), It is possible to reduce the value of the coefficient of variation (CV) and the like, improve the degree of crystallinity, and improve the crystallinity.
  • the term "sheet” means a material that can be composed of nanofibers and can spread and extend two-dimensionally or three-dimensionally (hereinafter, referred to as “nanofiber sheet” or “fiber sheet”). In some cases).
  • the nanofiber sheet may be an aggregate (or an aggregate) that can be composed of one or more nanofibers.
  • the nanofiber sheet may be cloth-like.
  • the nanofiber sheet may be a non-woven fabric which may be composed of one or a plurality of nanofibers.
  • the thickness of the sheet is not particularly limited, and is, for example, 500 ⁇ m or less, preferably 100 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less, and more preferably 200 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less.
  • the "target plate” is provided to receive nanofibers 3 that can be formed by electrospinning from the spinning liquid 1, for example, as indicated by reference numeral 4 (target plate 4) in FIG. It means a plate-shaped or plate-shaped member.
  • the target plate 4 may be grounded.
  • the target plate 4 may have a polarity opposite to that of the spinning liquid, or may be charged to a polarity opposite to the polarity of the voltage applied to the spinning liquid 1 (see FIG. 1).
  • the material constituting the target plate is not particularly limited, and for example, a metal plate such as stainless steel or aluminum is preferable.
  • the thickness of the target plate is not particularly limited, and is, for example, 3 mm or more, preferably 5 mm or more and 30 mm or less.
  • the step (a) that can be included in the manufacturing method of the present disclosure is a step of dissolving a polymer piezoelectric material in a solvent to prepare a spinning liquid containing such a polymer piezoelectric material.
  • the solvent contained in the spinning liquid prepared in the step (a) is not particularly limited, but is compatible with the polymer piezoelectric material, and is particularly preferable as the polymer piezoelectric material.
  • Polylactic acid (PLA) -based polymer (among others).
  • PLA polylactic acid
  • 1,3-dioxolane from the viewpoint of compatibility with PLLA and PDLA).
  • the amount of the polymer piezoelectric material contained in the spinning liquid is not particularly limited, and is contained in an amount of, for example, 5 w / v% or more, preferably 10 w / v%, based on the total volume of the spinning liquid.
  • the polymer piezoelectric material is contained in the spinning liquid in the range of 20 w / v% or more, more preferably 10 w / v% or more and 16 w / v% or less.
  • the spinning solution or solvent may contain a surfactant, if necessary. It is preferable to use an alcohol-based surfactant such as 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) as the surfactant.
  • HFIP 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol
  • the amount of the surfactant contained in the "spinning liquid” is not particularly limited, and may be contained in an amount of, for example, 50v / v% or less with respect to the total volume (total volume) of the "spinning liquid", 10v. It is preferable that the "spinning liquid" contains a surfactant in the range of / v% or more and 30 v / v% or less.
  • the amount of the surfactant contained in the “solvent” is not particularly limited and may be contained in an amount of, for example, 50 v / v% or less with respect to the volume of the "solvent", which is 10 v / v% or more and 30 v. It is preferable that the "solvent" contains a surfactant within the range of / v% or less.
  • the spinning liquid may contain a conductivity-imparting agent, if necessary. It is preferable to use an ammonium-based conductivity-imparting agent such as benzyltriethylammonium chloride (BTEAC) as the conductivity-imparting agent.
  • BTEAC benzyltriethylammonium chloride
  • the amount of the conductivity-imparting agent contained in the spinning liquid is not particularly limited, and may be contained in an amount of, for example, 5 w / w% or less with respect to the total weight of the polymer piezoelectric material, and may be contained in an amount of 1 w / w% or more and 4 w. It is preferable that the spinning liquid contains the conductivity-imparting agent in the range of / w% or less or 1 w / w% or more and 3 w / w% or less. It is more preferable that the conductivity-imparting agent is contained in the spinning liquid in the range of 2 w / w% or more and 3 w / w% or less.
  • BTEAC is, for example, 5 w / w% or less, preferably 4 w / w% or less, more preferably 3 w / w% or less, based on the total weight of the polymer piezoelectric material. Is preferably contained in the spinning liquid.
  • 1,3-dioxolane is used as a solvent in particular, and further used in combination with HFIP as a surfactant.
  • physical properties such as crystallinity, crystallinity, and crystallinity of PLA-based polymers preferable as polymer piezoelectric materials, particularly PLLA and PDLA, are controlled during the subsequent electrospinning in the step (c).
  • these physical properties can be remarkably improved.
  • the mechanism is not bound by a specific theory, but is considered to be due to, for example, the stretching effect on nanofibers by improving the ejection speed of the spinning liquid.
  • Step (b) The step (b) that can be included in the manufacturing method of the present disclosure is a step of preheating the target plate for receiving the nanofibers before spinning the spinning solution by electrospinning to form nanofibers (FIG. 1). See (A)).
  • the step (b) can significantly improve the physical properties such as the crystallinity, the crystal orientation, and the crystallinity of the nanofibers during the subsequent step (c).
  • the fiber diameter of the nanofibers can be controlled, and by extension, the sheet can be given physical properties such as significantly improved flexibility.
  • the crystallinity of the polymer piezoelectric material is, for example, 5 in the nanofibers as compared with the case where the target plate is not heated, particularly during the subsequent step (c). Improve by% or more.
  • the temperature at which the target plate is heated in the step (b) is equal to or higher than the temperature of the spinning liquid.
  • spinning is usually performed at room temperature or ambient temperature, so that the target plate is not heated above the temperature of the spinning liquid at all in the conventional spinning process. ..
  • the physical properties such as the crystallinity, the crystal orientation, and the crystallinity of the formed nanofibers were improved by heating the target plate.
  • the temperature at which the target plate is heated in the step (b) is equal to or higher than the glass transition temperature of the polymer piezoelectric material contained in the spinning liquid.
  • the temperature at which the target plate is heated is equal to or higher than the glass transition temperature of the polymer piezoelectric material, the physical properties such as crystallinity, crystallinity, and crystallinity of the nanofibers are further significantly improved.
  • the temperature for heating the target plate in the step (b) (hereinafter, may be referred to as “target temperature”) is, for example, a temperature larger than 25 ° C. and lower than 100 ° C., preferably 30 ° C. or higher and lower than 100 ° C. , More preferably 40 ° C or higher and lower than 100 ° C or 80 ° C or higher and lower than 100 ° C, still more preferably 40 ° C or higher and 90 ° C or lower or 80 ° C or higher and 90 ° C or lower, particularly preferably 60 ° C or higher and 90 ° C or lower or 80 ° C.
  • the temperature is 90 ° C. or lower.
  • the target temperature is particularly preferably 60 ° C. or higher and 80 ° C. or lower.
  • the target temperature may be measured by measuring the temperature of the heated target plate directly or in contact or non-contact with a temperature sensor or the like.
  • the set temperature of a temperature controller or the like may be used as the target temperature.
  • Step (c) included in the manufacturing method of the present disclosure is a step of receiving nanofibers that can be formed by electrospinning on the target plate and forming or forming the nanofibers in a sheet shape on the target plate (the step). See FIG. 1 (A)).
  • the spinning liquid 1 is positively charged by applying a positive voltage to the spinning liquid 1, and then the nanofibers are spun by electrospinning and positively charged. It is preferable to collect the nanofibers 3 on the target plate 4 to form or form a sheet-like material by, for example, grounding the target plate 4 while forming the 3.
  • the target plate 4 may be negatively charged, for example, as shown in FIG. 1 (A).
  • the preheated target plate 4 controls physical properties such as the crystallinity of the polymer piezoelectric material contained in the nanofibers 3 during electrospinning, and is preferably significantly improved. be able to.
  • the heating of the target plate 4 is provided, for example, on the back surface of the target plate 4 (that is, the surface of the target plate 4 opposite to the surface facing the nozzle 2), preferably the central portion, as shown in FIG. 1 (A). It can be done by the heater 5.
  • the target plate 4 can be heated as the heater 5.
  • the temperature of the target plate 4 can be adjusted by using, for example, a temperature sensor and a temperature controller.
  • the discharge amount of the spinning liquid is, for example, 20 ⁇ l / min to 60 ⁇ l / min.
  • the discharge amount of the spinning liquid is preferably 40 ⁇ l / min to 60 ⁇ l / min, and more preferably 50 ⁇ l / min.
  • the discharge temperature of the spinning liquid is, for example, 20 ° C to 30 ° C, preferably about 25 ° C.
  • the discharge temperature of the spinning liquid may be the same as the temperature of the spinning liquid.
  • the spinning liquid may be ejected horizontally as shown (see FIGS. 1 and 5), but may be ejected vertically (perpendicular to the horizontal direction). For example, the spinning liquid may be ejected downward, in other words, to the ground side.
  • the concentration of the polymer piezoelectric material that can be contained in the spinning liquid is, for example, 20 w / v% or less, preferably 15 w / v% or less, and more preferably 14 w / v%.
  • the distance (or spinning distance) to the target plate 4 is, for example, 100 mm or less, preferably 80 mm or less, and more preferably 75 mm.
  • the formed nanofibers 3 can be received and collected in a sheet shape.
  • the collected nanofibers 3, that is, the aggregates of the nanofibers 3, may be molded or formed as a sheet-like material, for example, as a non-woven fabric.
  • the sheet of the present disclosure may be subjected to a heat treatment called "annealing" after the step (c).
  • Annealing can be performed, for example, by heating the sheets of the present disclosure inside any furnace.
  • the heat treatment temperature in annealing is not particularly limited, and is, for example, a temperature larger than 25 ° C. and lower than 100 ° C., preferably 30 ° C. or higher and lower than 100 ° C., and more preferably 40 ° C. or higher and lower than 100 ° C. or 80 ° C. or higher.
  • the temperature is less than 100 ° C., more preferably 40 ° C. or higher and 90 ° C. or lower, or 80 ° C. or higher and 90 ° C. or lower, and particularly preferably 60 ° C.
  • Such annealing may further improve the physical characteristics such as the crystallinity of the nanofibers contained in the sheet of the present disclosure.
  • the heat treatment temperature for annealing is particularly preferably 60 ° C. or higher and 80 ° C. or lower.
  • the sheet of the present disclosure can be obtained by the manufacturing method described above.
  • the sheet of the present disclosure is a sheet having nanofibers containing a polymer piezoelectric material (hereinafter, the sheet of the present disclosure is referred to as a "nanofiber sheet” or a "fiber sheet”).
  • the nanofiber sheet is preferably an aggregate of nanofibers.
  • the nanofiber sheet is more preferably a non-woven fabric that can be composed by collecting nanofibers. In the case of a non-woven fabric, the intersections of the fibers may or may not be physically or chemically bonded.
  • the nanofiber sheet since the nanofiber contains a polymer piezoelectric material having physical properties such as the crystallinity controlled as described above, external energy such as tension and stress due to its deformation, bending and strain is applied. This makes it possible to generate more controlled field strength (eg 1-600 mV / mm) on the surface of the sheet. For example, an electric field strength of 10 to 20 mV / mm in early embryonic development, 40 to 50 mV / mm in a corneal wound site, and 100 to 150 mV / mm in a skin wound site can be applied. Therefore, since the nanofiber sheet of the present disclosure can promote cell activation by such an electric field and / or potential, it is used for active or active cell activation or cell proliferation or culture. Can be done.
  • the sheet of the present disclosure contains nanofibers having a controlled fiber diameter that can be formed by the above electrospinning as ultrafine fibers, it is fluffy and soft, that is, there is no crispness or crunchiness.
  • the physical properties such as the crystallinity of the polymer piezoelectric material contained in the nanofibers are increased by the above step (b), it is possible to more actively or actively promote cell activation, proliferation or culture. can.
  • nanofiber sheets when used as an alternative to, for example, bandages, gauze or adhesive plasters that cover wounds, they can generate potentials in response to body movements, thus making cells more than before. It can be activated and proliferated faster to heal wounds.
  • the crystallinity of the polymer piezoelectric material contained in the nanofibers is, for example, 20% or more, preferably 30% or more, more preferably 40% or more, still more preferably 50% or more, and particularly preferably 55. It is characterized by being% or more.
  • the crystallinity can be determined by, for example, a measuring method such as a differential scanning calorimetry (DSC) or an X-ray diffraction method (XRD). By controlling the crystallinity within the above range, the electric field and / or potential required for cell activation can be controlled.
  • the sheet of the present disclosure is characterized in that the fiber diameter of the nanofibers is uniform.
  • the fiber diameter of nanofibers is, for example, 800 nm or less.
  • the fiber diameter of the nanofiber is preferably 400 nm or more and 600 nm or less, more preferably 400 nm or more and 550 nm or less, and particularly preferably about 500 nm.
  • the cross-sectional shape of the nanofiber is not particularly limited, and may be, for example, substantially circular, substantially rectangular, or irregular.
  • the fiber diameter of the nanofiber means the maximum dimension in the cross section in the direction perpendicular to the axial direction of the nanofiber. For example, if the nanofiber has a substantially circular cross-sectional shape, the fiber diameter means the maximum diameter of the circle.
  • uniform fiber diameter of nanofiber means that the fiber diameter in the length direction is uniform in one nanofiber, and the fiber is among a plurality of nanofibers contained in a sheet.
  • the diameter is uniform, the fiber diameter in the length direction of one nanofiber is uniform before and after the temperature change (for example, heat treatment by annealing), or the temperature change (for example, heat treatment by annealing). It means that the fiber diameter is uniform among a plurality of nanofibers contained in the sheet before and after. In other words, in the nanofibers of the present disclosure, it means that shrinkage is suppressed even when heat is applied, and the fiber diameter is almost constant.
  • the fiber diameter of the nanofibers contained in the sheet is "uniform" as described above, it is possible to give the sheet appropriate bending strength, surface roughness, porosity, etc., and by extension, a fluffy texture (crispness).
  • a sheet having excellent flexibility such as a soft texture without a crunchy feeling) can be provided. Due to such flexibility, the adhesion between the sheet surface and the cells is further improved, so that the cells can be further activated and the cells can be further proliferated.
  • the average fiber diameter of the nanofibers contained in the sheet can be mentioned.
  • the average fiber diameter of the nanofibers is, for example, 400 nm or more and 700 nm or less, preferably 400 nm or more and 550 nm or less, and more preferably 450 nm or more and 550 nm or less.
  • the average fiber diameter of the nanofibers can be obtained by calculation from a fiber cross-sectional photograph or the like by a scanning electron microscope (SEM).
  • the standard deviation (SD) of the fiber diameter of the nanofiber contained in the sheet can be mentioned.
  • the SD value of the fiber diameter of the nanofiber is, for example, 10 or more and 150 or less.
  • the SD value of the fiber diameter of the nanofiber may be the standard deviation of the value of the fiber diameter measured at a plurality of points of one fiber, and the fiber diameter measured at a plurality of points in the plurality of fibers may be used. It may be the standard deviation of the value. Similarly, it may be the standard deviation of the value of the fiber diameter of one or more nanofibers measured before and after the temperature change (for example, the heat treatment by the above annealing).
  • the fiber diameter of the nanofibers is "uniform” is, for example, the coefficient of variation (CV) (standard deviation divided by the average value) of the fiber diameter of the nanofibers contained in the sheet. ..
  • the CV value of the fiber diameter of the nanofiber is, for example, 5% or more and 20% or less.
  • the CV value of the fiber diameter of the nanofiber may be a coefficient of variation of the value of the fiber diameter measured at a plurality of points of one fiber, and the fiber diameter measured at a plurality of points in a plurality of fibers may be used. It may be a coefficient of variation of the value. Similarly, it may be a coefficient of variation of the value of the fiber diameter of one or a plurality of nanofibers measured before and after the temperature change (for example, the heat treatment by the above annealing).
  • the physical characteristics such as the crystallinity of the polymer piezoelectric material that can substantially constitute the nanofibers contained in the sheet of the present disclosure, and the physical properties such as the flexibility of the sheet due to the fiber diameter of the nanofibers are the same.
  • it can also be controlled by adding benzyltriethylammonium chloride (BTEAC), which is a conductivity-imparting agent, to the spinning liquid, and by extension, these physical characteristics can be improved.
  • BTEAC benzyltriethylammonium chloride
  • the sheet of the present disclosure contains elements derived from BTEAC or BTEAC (for example, elements such as nitrogen (N) and chlorine (Cl)) to improve the physical properties such as the crystallinity of nanofibers and the flexibility of the sheet. It can be controlled and, by extension, these physical properties can be significantly improved.
  • the sheets of the present disclosure may be characterized by containing at least one element selected from the group consisting of nitrogen and chlorine. That is, it may be characterized in that such elements such as nitrogen and chlorine are derived from benzyltriethylammonium chloride (BTEAC).
  • BTEAC benzyltriethylammonium chloride
  • the sheet of the present disclosure is in the range of an angle (2 ⁇ ) of 15 ° or more and 20 ° or less, preferably 16 ° or more and 18 ° or less by X-ray diffraction method (XRD), and particularly preferably an angle of 16.5 ° (16.5 °).
  • the intensity is characterized by having a peak of 20,000 or more, preferably 30,000 or more (see, for example, FIG. 3).
  • Such a sheet can have the above-mentioned physical properties such as flexibility as well as the significantly improved crystallinity and crystallinity. In other words, it is possible to obtain a sheet having significantly improved physical properties such as crystallinity and crystallinity without sacrificing the flexibility of the sheet.
  • the polymer piezoelectric material is a polylactic acid-based polymer. Since the sheet of the present disclosure contains a polylactic acid-based polymer, it is possible to achieve a good balance between the physical properties of nanofibers such as crystallinity, crystal orientation, and crystallinity and the physical properties of the sheet such as flexibility. Sheets suitable for activation and / or growth or culture can be obtained.
  • the sheet of the present disclosure may have orientation.
  • the "orientation" of a sheet means that the nanofibers contained in the sheet are preferentially arranged in a specific direction.
  • an insulating tape (Kapton tape) is arranged in a stripe shape on a target plate (for example, a target plate made of aluminum) and spun by electrospinning to distribute nanofibers to the left and right (horizontal direction).
  • a target plate for example, a target plate made of aluminum
  • electrospinning to distribute nanofibers to the left and right (horizontal direction).
  • orientation of nanofibers can be defined as "alignment angle” and "degree of orientation” by, for example, elliptical approximation.
  • ellipse approximation see Enomae, T., et al., Nordic Pulp and Paper Research Journal, (2006), Vol. 21 (2), pp. 253-259.
  • the "orientation angle” means the angle in the minor axis direction (see FIG. 18).
  • the "degree of orientation” can be expressed by the ratio of b (major axis) / a (minor axis) (see FIG. 18).
  • the orientation angle is, for example, ⁇ 90 ° or less, preferably ⁇ 45 ° or less.
  • orientation angle is within the above range, a more appropriate potential can be generated when a displacement or load is applied to the alignment sheet.
  • Example 1 A nanofiber sheet was produced using the electrospinning apparatus shown in FIG.
  • the electrospinning apparatus used for producing the nanofiber sheet is not limited to the one shown in FIG.
  • the morphology of the surface of the nanofiber sheet prepared above was observed with a scanning electron microscope (SEM). The results are shown in the photograph of FIG. 2 (560 ⁇ 70 nm).
  • the fiber diameter, average fiber diameter, standard deviation (SD) and coefficient of variation (CV) of the PLLA nanofibers contained in the nanofiber sheet were as follows.
  • Fiber diameter 460nm-600nm Average fiber diameter: 560 nm Standard deviation (SD): 70 Coefficient of variation (CV): 13%
  • the crystallinity of the PLLA nanofibers was measured with a differential scanning calorimeter (DSC)
  • the crystallinity was about 52%.
  • the crystallization temperature of the PLLA nanofiber was measured by DSC, the crystallization temperature was about 81 ° C.
  • the "crystallization temperature” is measured as an index of the "crystal orientation” (Lee, J., K., et al, Structure development and biodegradability of uniaxially stretched poly (L-lactide), European Polymer Journal, Vol. 37, No 5, (2001), pp. 907-914.).
  • the XRD measurement results of the PLLA nanofibers contained in the sheet are shown in the graph of FIG. 3 (intensity showed a peak of 30,000 or more at an angle (2 ⁇ ) of 16.5 °). Crystallinity can be evaluated from the peak intensity and full width at half maximum of XRD.
  • the sheet obtained in Example 1 was soft, fluffy and soft to the touch, and had no crispness or crunchiness.
  • Example 2 The nanofiber sheet prepared in Example 1 was placed in a furnace and annealed at 80 ° C. for 10 minutes. The evaluation results were as follows. Fiber diameter: 460 nm to 570 nm Average fiber diameter: 520 nm Standard deviation (SD): 50 Coefficient of variation (CV): 12% Crystallinity: Approximately 50% Crystallization temperature: 82.7 ° C
  • the sheet obtained in Example 2 had almost no shrinkage of fibers (or a low shrinkage rate) even after annealing, was fluffy and soft to the touch, was soft, and had no crispness or crunchiness.
  • Example 1 A nanofiber sheet was prepared in the same manner as in Example 1 except that the target plate was not preheated (target plate temperature: about 25 ° C.). The evaluation results were as follows. Fiber diameter: 470nm-560nm Average fiber diameter: 510 nm Standard deviation (SD): 50 Coefficient of variation (CV): 10% Crystallinity: 43% Crystallization temperature: 77.1 ° C
  • Comparative Example 2 The nanofiber sheet prepared in Comparative Example 1 was placed in a furnace and annealed at 80 ° C. for 10 minutes. The evaluation results were as follows. Fiber diameter: 450nm-730nm Average fiber diameter: 610 nm Standard deviation (SD): 140 Coefficient of variation (CV): 23% Crystallinity: Unknown Crystallinity temperature: Unknown In the sheets produced in Comparative Examples 1 and 2, the intensity peaked at 30,000 or more within the range of an angle (2 ⁇ ) of 15 ° or more and 20 ° or less in XRD. Was not detected.
  • the sheets obtained in Comparative Examples 1 and 2 especially the sheets of Comparative Example 2, have a non-uniform fiber diameter, so that they are not soft to the touch and have a crisp and crunchy feeling as compared with the sheets of Examples 1 and 2. rice field.
  • Example 3 A nanofiber sheet was prepared in the same manner as in Example 1 except that the target plate was not preheated and BTEAC was not added (target plate temperature: about 25 ° C., BTEAC: 0 w / w%). ..
  • the evaluation results were as follows. Fiber diameter: 450nm-640nm Average fiber diameter: 550 nm Standard deviation (SD): 80 Coefficient of variation (CV): 15% Crystallinity: 36% Crystallization temperature: 81.4 ° C
  • Comparative Example 4 The nanofiber sheet prepared in Comparative Example 3 was placed in a furnace and annealed at 80 ° C. for 10 minutes. The evaluation results were as follows. Fiber diameter: 490 nm to 730 nm Average fiber diameter: 640 nm Standard deviation (SD): 170 Coefficient of variation (CV): 27% Crystallinity: Unknown Crystallinity temperature: Unknown In the sheets produced in Comparative Examples 3 and 4, the intensity peaked at 30,000 or more within the range of an angle (2 ⁇ ) of 15 ° or more and 20 ° or less in XRD. Was not detected.
  • the sheets obtained in Comparative Examples 3 and 4 especially the sheets of Comparative Example 4, have a non-uniform fiber diameter, so that they are not soft to the touch and have a crisp and crunchy feeling as compared with the sheets of Examples 1 and 2. rice field.
  • Comparative Example 5 A nanofiber sheet was produced in the same manner as in Example 1 except that the target plate was heated to 100 ° C. (target plate temperature: 100 ° C.). As a result, an increase in the diameter of the nanofibers and a curvature of the nanofibers were observed.
  • Nanofibers with a diameter of about 500 nm were produced by SEM observation under all conditions, but an increase in the diameter of the nanofibers and bending of the fibers were observed at a target temperature of 100 ° C. regardless of the BTEAC addition rate (Comparative Example 5). From this, it was shown that the target temperature should be less than 100 ° C. in order to avoid the influence of heat shrinkage. Under the conditions of the target temperature of 25 ° C. (without preheating) and the BTEAC addition rate of 0 w / w%, the crystallinity and crystallization temperature of the nanofibers were 36% and 81.4 ° C., and no XRD peak was confirmed (comparison). Example 3).
  • the crystallinity increased as the BTEAC addition rate increased.
  • the crystallinity increased at any BTEAC addition rate due to the increase in the target temperature the higher the BTEAC addition rate, the smaller the rate of change in the crystallinity with the increase in the target temperature.
  • the peak intensity at the target temperature of 80 ° C. increased about 40 times and the half width decreased by about 60% as compared with the target temperature of 60 ° C.
  • an increase in peak intensity and a slight decrease in full width at half maximum were observed as the BTEAC addition rate increased.
  • the increase in crystal size and the crystallization of the amorphous part were promoted as the target temperature increased.
  • the crystallinity is about 52%
  • the crystallization temperature is about 81 ° C.
  • the XRD peak is the highest (Fig. 3)
  • the produced nanofibers have high piezoelectricity. It was suggested (Example 1).
  • Example 1 From the results of Example 1 as described above, it was suggested that a nanofiber sheet having high piezoelectricity can be produced at a target temperature of 80 ° C. and a BTEAC addition rate of 3 w / w%.
  • the nanofiber sheet produced in the example Since the diameter of the collagen fiber, which is the main component of the extracellular matrix, is 50 to 500 nm, it was found that the nanofiber sheet produced in the example has excellent affinity with the living body. It was also found that the nanofiber sheet produced in the examples can contribute to cell activity and metabolism by electrical stimulation as in the case of a tissue having piezoelectricity such as bone. Therefore, it was found that the nanofiber sheet such as polylactic acid (PLLA) having excellent biocompatibility and piezoelectricity produced in the examples is an excellent material for tissue regeneration and healing.
  • PLLA polylactic acid
  • electrospinning is generally used for producing nanofibers, but the problem is that the degree of crystallinity and the degree of crystal orientation are lower than those of conventional films and fibers for which a piezoelectric effect has been reported. there were.
  • problems such as non-uniformity of the spun nanofibers due to heat shrinkage and an increase or variation in the fiber diameter (Comparative Example 2). 4, 5).
  • problems of shrinkage and non-uniformity can be solved.
  • the fiber sheet of "Experimental Example H” corresponds to the fiber sheet of "Example 1" because the target temperature is 80 ° C. Since the fiber sheet of "Experimental Example G” has a target temperature of 80 ° C., it is referred to as the fiber sheet of "Example 3".
  • the fiber sheets of "Experimental Examples A to F” do not fall under the present invention because the target temperature is 25 ° C. (without preheating the target plate). Is.
  • the fiber sheet of "Experimental Example A” corresponds to the fiber sheet of "Comparative Example 3"
  • the fiber sheet of "Experimental Example D” corresponds to the fiber sheet of "Comparative Example 1”.
  • the fiber sheet of "Experimental Example I” corresponds to the fiber sheet of "Comparative Example 5".
  • the value of Cl element was below the detection limit because the spider net was formed by splitting the fibers.
  • a PLLA solution was prepared by dissolving PLLA in 1,3-dioxolane (DOL) and 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP). ..
  • the solution concentration of PLLA was 14 w / v%, and the DOL / HFIP mixing ratio was 70/30.
  • the temperature of the target plate was 25 ° C. (without preheating of the target plate), 40 ° C., 60 ° C., 80 ° C. and 100 ° C. using a rubber heater (see FIG. 4).
  • the distance to the target plate was set to 50 mm.
  • FIGS. 6 and 7 SEM images of each target temperature at BTEAC addition rates of 4 w / w% and 5 w / w% are shown in FIGS. 6 and 7, respectively (2000 times).
  • the fibers were found to be remarkably curved at both the BTEAC addition rates of 4 w / w% and 5 w / w% (see FIGS. 6 (E) and 7 (E)).
  • FIGS. 6 (E) and 7 (E) it was observed that the fibers were broken at the target temperature of 25 ° C. (without preheating) at both the BTEAC addition rate of 4 w / w% and 5 w / w% (FIGS. 6 (A) and 7 (A)). reference).
  • FIG. 6 (A) and 7 (A) SEM images of each target temperature at BTEAC addition rates of 4 w / w% and 5 w / w% are shown in FIGS. 6 and 7, respectively (2000 times).
  • the fibers were found to be
  • FIG. 8 shows an SEM image of 5000 times that of the fiber produced at a BTEAC addition rate of 4 w / w% and a target temperature of 25 ° C. (without preheating).
  • the fiber was broken into a spider web shape. In other words, the fibers were split to form a spider net. It was found that when the BTEAC addition rate was 3 w / w% or less, such fiber collapse was not observed over the range where the target temperature was higher than 25 ° C and less than 100 ° C (Example 1 and). See Figure 2).
  • the BTEAC addition rate is preferably 5 w / w% or less or less than 5 w / w%, particularly preferably 4 w / w% or less or 3 w / w% or less, and the target temperature is larger than 25 ° C. and 100 ° C. It was found that less than was more preferable.
  • Crystallinity The crystallinity calculated from the DSC measurement result is shown in FIG. From the results shown in FIG. 9, it was found that the crystallinity also increased as the BTEAC addition rate increased. Under the condition of BTEAC 4w / w% or more, a peak derived from BTEAC was observed near the peak of the amount of heat of crystal melting derived from PLLA, especially in both 4w / w% and 5w / w% (see FIG. 10).
  • the crystallization temperature calculated from the DSC curve is shown in FIG.
  • the crystallization temperature tended to increase as the target temperature increased. It was found that at a BTEAC addition rate of 5 w / w%, the crystallization temperature was around 82 ° C. at any target temperature. From the results shown in FIG. 11, it was found that the crystal orientation increases as the BTEAC addition rate increases until the BTEAC addition rate is about 5 w / w%.
  • FTIR measurement FTIR measurement results with a BTEAC addition rate of 3 w / w% are shown in FIG. 12 (target temperature (a) 25 ° C., (b) 40 ° C., (c) 60 ° C., (d) 80 ° C., (e) 100 ° C.), BTEAC addition.
  • the FTIR measurement results at a rate of 4 w / w% are shown in FIG. 13 (target temperature (a) 25 ° C., (b) 40 ° C., (c) 60 ° C., (d) 80 ° C., (e) 100 ° C.), BTEAC addition rate 5 w.
  • the FTIR measurement result of / w% is shown in FIG.
  • target temperature (a) 25 ° C., (b) 40 ° C., (c) 60 ° C., (d) 80 ° C., (e) 100 ° C.).
  • BTEAC addition was observed on the FTIR waveform.
  • a peak near 923 cm -1 which is a peak derived from ⁇ crystals, was observed under the conditions of target temperatures of 80 ° C. and 100 ° C. From the results shown in FIGS. 12 to 14, it was found that the proportion of ⁇ crystals tended to increase as the target temperature increased, in other words, the crystals grew more. It was found that a target temperature of 80 ° C. or higher, particularly around 80 ° C., is particularly effective.
  • Electrospinning was performed in the same manner as in Example 1 except that an insulating tape (Kapton tape) having a width of 15 mm was attached in a stripe shape to an aluminum target plate (see FIG. 15) and the temperature of the target plate was set to 86 ° C.
  • An oriented fiber sheet A was produced by spinning with (BTEAC addition rate 3 w / w%). Since the electric attraction can be weakened by attaching the insulating tape (Kapton tape) to the target plate, the fibers can be distributed laterally (or left and right) on the insulator and oriented.
  • Orientation fiber sheet B A 15 mm wide insulating tape (Kapton tape) was attached in stripes to the aluminum target plate (see Fig. 15), the temperature of the target plate was set to 25 ° C (without preheating), and BTEAC was not added.
  • An oriented fiber sheet B was produced by spinning by electrospinning in the same manner as in Example 1 (BTEAC addition rate 0 w / w%).
  • FIG. 16 shows an SEM image of the oriented fiber sheet A (Example) (1000 times, Bar: 10 ⁇ m). From FIG. 16, it was confirmed that the fibers were oriented in the left-right direction (horizontal direction) of the SEM image in the oriented fiber sheet A.
  • FIG. 17 shows an SEM image of the oriented fiber sheet B (comparative example) (1000 times, Bar: 10 ⁇ m). From FIG. 17, it was confirmed that the fibers were oriented in the left-right direction (horizontal direction) of the SEM image also in the oriented fiber sheet B.
  • orientation angle means the angle in the minor axis direction.
  • degree of orientation can be expressed by the ratio of b (major axis) / a (minor axis).
  • the orientation angle was 5.6 ° and the orientation degree was 2.7.
  • the orientation angle was 2.8 ° and the orientation degree was 2.6.
  • non-oriented fiber sheets (nonwoven fabric) A'and B' were prepared and compared with each other.
  • the non-oriented fiber sheets (nonwoven fabric) A'and B' are produced in the same manner as the above-mentioned oriented fiber sheets A and B without using an insulating tape (Kapton tape), and the above-mentioned oriented fiber sheets A are produced.
  • B were compared with each other.
  • the table below shows the results of crystal evaluation comparing "crystallinity”, “crystallization temperature”, “crystal type and crystal growth evaluation", and the like.
  • Crystal type and crystal growth evaluation (specifically, “peak intensity” and “peak strength” from the comparison between the oriented fiber sheet A and the non-oriented fiber sheet A'and the contrast between the oriented fiber sheet B and the non-oriented fiber sheet B'. It was found that there was no significant difference in the "half price range”). From these crystal evaluations, it was found that the crystal states of the oriented fiber sheet (A, B) and the non-aligned fiber sheet (A', B') were equivalent to each other.
  • Piezoelectricity Test Piece As shown in FIG. 19, 30 mg of the oriented fiber sheet (A or B) was measured and epoxy-embedded in a size of 20 mm ⁇ 20 mm ⁇ 0.15 mm. Then, the epoxy resin was used again to prepare a test piece having a size of 40 mm ⁇ 40 mm ⁇ 0.2 mm in which the oriented fiber sheet (A or B) was arranged in the center. At this time, it was processed by sandwiching it with a polyacetal resin, and the thickness was adjusted with a filler gauge. Then, 25 mm ⁇ 25 mm electrodes and conductors were attached to both sides and insulated and embedded with insulating tape (Kapton tape) (see FIG. 20).
  • the differential amplifier circuit (10 times amplification) (op amp (OP-AMP NJM2082)) has a positive feedback type secondary low-pass filter that differs the potential of one side from one side of the test piece and passes 10 Hz or less, and a notch filter that removes the vicinity of 60 Hz.
  • the mechanism is such that the measured waveform can be amplified 10 times.
  • FIG. 23 shows the potential measurement result for the displacement when tension is applied in the direction of 45 ° with respect to the orientation fiber sheet fiber axis direction (thick line indicates voltage).
  • FIG. 24 shows the potential measurement results for the displacement when tension is applied in the 135 ° direction with respect to the fiber axis direction of the oriented fiber sheet (thick line indicates voltage).
  • a response in which the positive and negative potentials are reversed with respect to the displacement can be obtained. It was confirmed that the electric potential was generated due to the piezoelectricity of the sheet.
  • Fig. 25 shows the potential measurement result for the displacement when tension is applied in the direction of 45 ° with respect to the orientation fiber sheet fiber axis direction (thick line indicates voltage). It was found that in the test piece B, the generated potential was significantly reduced. It is considered that this is due to the fact that the preheating was not performed.
  • the target plate was preheated and BTEAC was added, so that an average potential of about 7 times that of the test piece B could be obtained.
  • FIG. 27 shows the potential measurement result for the load when tension is applied in the direction of 45 ° with respect to the fiber axis direction (thick line indicates voltage).
  • FIG. 28 shows the potential measurement results for the load when tension is applied in the 135 ° direction with respect to the fiber axis direction (thick line indicates voltage).
  • the test piece A according to the comparison between the 45 ° direction (FIG. 27) and the 135 ° direction (FIG. 28), the positive and negative potentials are reversed with respect to the load, so that the piezoelectric nanofibers contained in the test piece A. It was confirmed that the electric potential was generated from the sheet.
  • Fig. 29 shows the potential measurement result for the load when tension is applied in the direction of 45 ° with respect to the fiber axis direction (thick line indicates voltage). It was found that in the test piece B, the generated potential was significantly reduced. It is considered that this is due to the fact that the preheating was not performed.
  • FIG. 31 SEM images of the fiber sheet produced by the vertical electrospinning device are shown in FIG. 31 (PLLA concentration: 12 w / v%, 2000 times), FIG. 32 (PLLA concentration: 14 w / v%, 2000 times) and FIG. 33 (PLLA concentration: 16w / v%, 2000 times).
  • the fiber diameter is around 500 nm at a PLLA concentration of 14 w / v%, a discharge rate of 50 ⁇ l / min, and a spinning distance of 75 mm.
  • a sheet having a fiber form could be obtained (see FIG. 32).
  • the target plate was heated so that the target temperature did not fall below 25 ° C.
  • the present invention it is possible to provide a sheet-like material suitable for cell activation, proliferation or culture.
  • the material obtained by the present invention can be used, for example, as a scaffold material for growing or culturing cells, a scaffold, a container, or the like. Further, the material obtained by the present invention can be widely used in fields such as regenerative medicine related to regeneration of living tissue, wound healing, and surgery. More specifically, by covering the wound as a substitute for bandages and gauze, or as an adhesive plaster, cells can be activated more actively or actively to heal the wound.

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Abstract

高分子圧電材料を含むナノファイバーを有して成るシートを製造するための方法であって、少なくとも以下の工程（ａ）～（ｃ）： （ａ）高分子圧電材料を溶媒に溶解して該高分子圧電材料を含む紡糸液を調製する工程、 （ｂ）前記紡糸液をエレクトロスピニングにより紡糸してナノファイバーを形成する前に、該ナノファイバーを受けるためのターゲット板を予め加熱する工程、 （ｃ）エレクトロスピニングにより形成されるナノファイバーを前記ターゲット板上で受けて該ナノファイバーを該ターゲット板上でシート状に成形する工程 を含んで成る、前記ナノファイバーを有して成るシートの製造方法および当該製造方法により製造されるシートが提供される。

Description

ナノファイバーを有して成るシートおよびその製造方法
　本発明はナノファイバーを有して成るシートおよびその製造方法に関する。より具体的には、本発明は、ポリ乳酸系高分子などの高分子圧電材料を含むナノファイバーを有して成るシートおよびその製造方法に関する。
　近年、生体組織の再生などに関連して、in vivo，in vitroでの細胞培養に用いられる足場材料やスキャホールドに関して、数多くの研究が行われており、様々な形態のものが開発されている。
　例えば、特許文献１および２には樹脂膜を利用した足場材料が開示されている。特許文献３には骨の形成を促進するロッド状やプレート状の材料が開示されている。特許文献４には骨形成促進用フィルムが開示されている。特許文献５には微小孔を有する無機材料の層を備える細胞培養シートが開示されている。特許文献６には多孔質樹脂膜を備えるシートが開示されている。特許文献７には主として生体適合性ポリマーからなる繊維の集合体からなる足場材料が開示されている。特許文献８には合成樹脂繊維にチタンやチタン化合物が被覆されてなる被覆繊維が集積されている医療材料が開示されている。非特許文献１には骨形成を促進するための無機ナノ粒子（ＢａＴｉＯ3（ＢＴＯ））を添加したナノファイバースキャホールドが開示されている。
特開２０１９－１１５３２２号公報 特開２０１９－１１５３２３号公報 特許第３０２３４７１号公報 特許第３０２３４７２号公報 特開２０１４－１４７３４２号公報 特開２０１６－２１４２１０号公報 国際公開（ＷＯ）第２００７／１０２６０６号公報 特開２００８－　　６２７６号公報
骨軟骨再生のための圧電粒子添加ナノファイバースキャホールドの開発（科学研究費助成事業　研究成果報告書　平成２７年６月６日）（https://kaken.nii.ac.jp/ja/file/KAKENHI-PROJECT-24560114/24560114seika.pdf）
　本願発明者らは、従前の細胞を培養するための足場材料やスキャホールドなどの材料には克服すべき課題があることに気付き、そのための対策を取る必要性を見出した。具体的には以下の課題があることを本願発明者らは見出した。
　従前の足場材料やスキャホールドなどの材料は、上述の通り、フィルムや多孔質シートなど様々な形態を有しており、それらにより細胞の培養や増殖は可能であるが、細胞の活性化は十分でなく、さらなる改良の余地があった。
　特に、再生治療や創傷治療の分野では、より積極的または能動的に細胞の活性化を促すことができる材料の開発が求められていた。また、細胞の増殖や活性化には、細胞とスキャホールドなどの材料との高い密着性が求められることから、このような材料における柔軟性などの物性のさらなる改良も求められていた。
　本発明はかかる課題に鑑みて為されたものである。即ち、本発明の主たる目的は、より積極的または能動的に細胞の増殖や活性化を促進することができ、なおかつ柔軟性などの物性が改善された材料を提供することである。
　本願発明者らは、従来技術の延長線上で対応するのではなく、新たな方向で対処することによる上記課題の解決を試みた。具体的に本願発明者らは、高分子圧電材料を含むナノファイバーが外部からのエネルギー（例えば、張力、応力など）を受けることで電位（又は電荷）を発生させることに着目し、このような電位が細胞の増殖や活性化を積極的または能動的に促進させることができるのではないかと考えた。このような考えに基づいて鋭意研究した結果、本願発明者らは細胞をより適切に活性化するためには使用する高分子圧電材料の結晶化度などの物性を制御すること、望ましくは結晶化度などを増加させることが重要であることをつきとめた。このような知見に基づき、本願発明者らは、高分子圧電材料を含むナノファイバーからなるシートの製造において、特に電界紡糸法（以下、「エレクトロスピニング」と称する）によるナノファイバーの形成の際に、高分子圧電材料の結晶化度などを制御して顕著に向上させることができ、なおかつ細胞の活性化に適した柔軟性などの物性をナノファイバーシートに与えることができる方法を見出した。より具体的には、エレクトロスピニングの際にナノファイバーを受けて集めるためのターゲット板を予め加熱することによりナノファイバーに含まれる高分子圧電材料の結晶化度などを制御または向上させることができ、なおかつ細胞の活性化に適した柔軟性などの物性をこのようなナノファイバーから構成されるシートに与えることができることを見出した。その結果、上記主たる目的が達成されたナノファイバーを有して成るシート状の材料の製造方法および細胞の活性化に適したシート材料の発明に至った。
　本発明によると、高分子圧電材料を含むナノファイバーを有して成るシートを製造するための方法であって、少なくとも以下の工程（ａ）～（ｃ）：
（ａ）高分子圧電材料を溶媒に溶解して該高分子圧電材料を含む紡糸液を調製する工程、
（ｂ）前記紡糸液をエレクトロスピニングにより紡糸してナノファイバーを形成する前に、該ナノファイバーを受けるためのターゲット板を予め加熱する工程、
（ｃ）エレクトロスピニングにより形成されるナノファイバーを前記ターゲット板上で受けて該ナノファイバーを該ターゲット板上でシート状に成形する工程
を含んで成る、前記ナノファイバーを有して成るシートの製造方法が提供される（以下、「本開示の製造方法」と称する場合もある）。
　また、本発明により、上記の製造方法により製造されたナノファイバーを有して成るシートが提供される（以下、「本開示のシート」あるいは「ファイバーシート」または単に「シート」または「シート材料」と称する場合もある）。より具体的には、高分子圧電材料を含むナノファイバーを有して成るシートであって、ナノファイバーに含まれる高分子圧電材料の結晶化度などの物性が制御されたシートや、ナノファイバーの繊維径などが制御されたシートなどが提供される。
　本発明では、より積極的または能動的に細胞の増殖や活性化を促進することができ、なおかつ柔軟性などの物性が改善された材料、具体的には高分子圧電材料を含むナノファイバーを有して成るシートが得られる。尚、本明細書に記載された効果はあくまで例示であって限定されるものでなく、また、付加的な効果があってもよい。
図１は、本開示の製造方法を概略的に示す模式図である。 図２は、実施例１で作製したシートを走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察したシート表面の写真である。 図３は、実施例１で作製したシートに含まれるＰＬＬＡナノファイバーのＸＲＤによる測定結果を示すグラフである。 図４は、ラバーヒーターを示す写真である。 図５は、水平型のエレクトロスピニング装置を示す写真である。 図６は、ＢＴＥＡＣ添加率４ｗ／ｗ％でターゲット温度（Ａ）２５℃、（Ｂ）４０℃、（Ｃ）６０℃、（Ｄ）８０℃、（Ｅ）１００℃で作製したファイバーシートのＳＥＭ画像を示す（２０００倍）。 図７は、ＢＴＥＡＣ添加率５ｗ／ｗ％、ターゲット温度（Ａ）２５℃、（Ｂ）４０℃、（Ｃ）６０℃、（Ｄ）８０℃、（Ｅ）１００℃で作製したファイバーシートのＳＥＭ画像を示す（２０００倍）。 図８は、ＢＴＥＡＣ添加率４ｗ／ｗ％、ターゲット温度２５℃（予備加熱なし）で作製したファイバーシートのＳＥＭ画像を示す（５０００倍）。 図９は、ＤＳＣ測定結果から算出した結晶化度を示すグラフである（ＢＴＥＡＣ添加率４ｗ／ｗ％および５ｗ／ｗ％）。 図１０は、ＤＳＣ曲線を示す（ＢＴＥＡＣ添加率４ｗ／ｗ％）。 図１１は、ＤＳＣ測定結果から算出した結晶化温度を示すグラフである（ＢＴＥＡＣ添加率４ｗ／ｗ％および５ｗ／ｗ％）。 図１２は、ＢＴＥＡＣ添加率３ｗ／ｗ％でのＦＴＩＲ測定結果を示す（（ａ）２５℃、（ｂ）４０℃、（ｃ）６０℃、（ｄ）８０℃、（ｅ）１００℃）。 図１３は、ＢＴＥＡＣ添加率４ｗ／ｗ％でのＦＴＩＲ測定結果を示す（（ａ）２５℃、（ｂ）４０℃、（ｃ）６０℃、（ｄ）８０℃、（ｅ）１００℃）。 図１４は、ＢＴＥＡＣ添加率５ｗ／ｗ％でのＦＴＩＲ測定結果を示す（（ａ）２５℃、（ｂ）４０℃、（ｃ）６０℃、（ｄ）８０℃、（ｅ）１００℃）。 図１５は、アルミニウム製のターゲット板にカプトン・テープ（絶縁テープ）を貼り付けた状態を模式的に示す概略図である。 図１６は、配向ファイバーシートＡ（実施例）のＳＥＭ画像を示す（１０００倍、Ｂａｒ：１０μｍ）。 図１７は、配向ファイバーシートＢ（比較例）のＳＥＭ画像を示す（×１０００倍、Ｂａｒ：１０μｍ）。 図１８は、楕円近似で使用する楕円の短軸（ａ）および長軸（ｂ）を模式的に示す概略図である。 図１９は、圧電性試験片の作製を模式的に示す概略図である。 図２０は、圧電性試験片を示す写真である。 図２１は、ＰＬＬＡにおける電位の発生を模式的に示す概略図である。 図２２は、圧電性試験装置を示す写真である。 図２３は、配向ファイバーシート繊維軸方向に対して４５°方向に引張を負荷したときの変位に対する電位測定結果を示すグラフである（ＢＴＥＡＣ添加率３ｗ／ｗ％、ターゲット温度８６℃）。 図２４は、配向ファイバーシート繊維軸方向に対して１３５°方向に引張を負荷したときの変位に対する電位測定結果を示すグラフである（ＢＴＥＡＣ添加率３ｗ／ｗ％、ターゲット温度８６℃）。 図２５は、配向ファイバーシート繊維軸方向に対して４５°方向に引張を負荷したときの変位に対する電位測定結果を示すグラフである（ＢＴＥＡＣ添加率０ｗ／ｗ％、ターゲット温度２５℃（予備加熱なし））。 図２６は、エポキシ樹脂に引張を負荷したときの変位に対する電位測定結果を示すグラフである（ブランク）。 図２７は、配向ファイバーシート繊維軸方向に対して４５°方向に引張を負荷したときの荷重に対する電位測定結果を示すグラフである（ＢＴＥＡＣ添加率３ｗ／ｗ％、ターゲット温度８６℃）。 図２８は、配向ファイバーシート繊維軸方向に対して１３５°方向に引張を負荷したときの荷重に対する電位測定結果を示すグラフである（ＢＴＥＡＣ添加率３ｗ／ｗ％、ターゲット温度８６℃）。 図２９は、配向ファイバーシート繊維軸方向に対して４５°方向に引張を負荷したときの荷重に対する電位測定結果を示すグラフである（ＢＴＥＡＣ添加率０ｗ／ｗ％、ターゲット温度２５℃（予備加熱なし））。 図３０は、エポキシ樹脂に引張を負荷したときの荷重に対する電位測定結果を示すグラフである（ブランク）。 図３１は、垂直型エレクトロスピニング装置で作製したファイバーシートのＳＥＭ画像を示す（ＰＬＬＡ濃度：１２ｗ／ｖ％、２０００倍）。 図３２は、垂直型エレクトロスピニング装置で作製したファイバーシートのＳＥＭ画像を示す（ＰＬＬＡ濃度：１４ｗ／ｖ％、２０００倍）。 図３３は、垂直型エレクトロスピニング装置で作製したファイバーシートのＳＥＭ画像を示す（ＰＬＬＡ濃度：１６ｗ／ｖ％、２０００倍）。 図３４は、垂直型エレクトロスピニング装置で作製したファイバーシートのＳＥＭ画像を示す（ＢＴＥＡＣ濃度：１～３ｗ／ｗ％、ターゲット温度：４０～８０℃、２０００倍）。
　本発明は、より積極的または能動的に細胞の増殖や活性化を促進することができ、なおかつ柔軟性などの物性が改善された材料、より具体的には高分子圧電材料を含むナノファイバーを有して成るシートおよびそのようなシートの製造方法に関する。以下、シートの製造方法を先に説明したうえで、本開示のシートについて、以下にて詳しく説明する。
　［シートの製造方法］
　本開示は、以下にて詳しく説明する高分子圧電材料を含むナノファイバーを有して成るシート（以下、「ナノファイバーシート」または「ファイバーシート」と称する場合もある）、より具体的にナノファイバーの集合体から構成され得るシートを製造するための方法に関し、当該製造方法は、少なくとも以下の工程（ａ）～（ｃ）、特に以下にて詳細に説明する工程（ｂ）を含んで成ることを主たる特徴として有する。
　工程（ａ）：高分子圧電材料を溶媒に溶解して該高分子圧電材料を含む紡糸液を調製する工程、
　工程（ｂ）：前記紡糸液をエレクトロスピニングにより紡糸してナノファイバーを形成する前に、該ナノファイバーを受けるためのターゲット板を予め加熱する工程、および
　工程（ｃ）：エレクトロスピニングにより形成されるナノファイバーを前記ターゲット板上で受けて該ナノファイバーを該ターゲット板上でシート状に成形する工程。
　ここで各工程を詳細に説明する前に図１を参照しながら本開示のシートの製造方法を簡単に説明する。
　本開示のシートの製造方法では、エレクトロスピニングを利用することを特徴とする。例えば図１（Ａ）に示す通り、紡糸液１（高分子圧電材料を任意の溶媒に溶解させることにより調製した溶液）に、例えば電圧発生器６を用いて、例えば正（プラス）の電圧を印加すると、ノズル２の先端部から出た紡糸液１の液滴には正の電荷が集まって互いに反発して円錐形となる（図１（Ｂ）（図１（Ａ）の破線で囲まれた部分を拡大して概略的に示す）を参照のこと）。電荷の反発力が表面張力を超えると、紡糸液１がその円錐形の頂点から直線的に射出されて（図１（Ｂ）参照）、ターゲット板４に向けて弧を描きながら螺旋状に進む（図１（Ａ）参照）。このときターゲット板４は、図１（Ａ）に示すように、電圧発生器６を用いて例えば負（マイナス）に帯電していてもよいし、接地（アース）されていてもよい。
　紡糸液１は、ターゲット板４に向けて射出されるにつれて細くなり、それにともなって表面電荷の密度が大きくなることから紡糸液１はさらに引き伸ばされて細くなる。このとき紡糸液１に含まれる溶媒が揮発して径がナノメートル（ｎｍ）オーダーの極細繊維、すなわちナノファイバー３が形成され得る。その後、ターゲット板４はナノファイバー３を受け、ノズル２に対向する表面上にナノファイバー３が集められ、二次元的にナノファイバー３が広がって延在し得るシート状の材料が形成され得る。このようにして形成され得るナノファイバー３の集合体から成るシート材料は、換言するとナノファイバー３から構成され得る不織布であるとも言える。また、このようなシート状の材料は本開示において「ナノファイバーシート」または「ファイバーシート」とも呼ばれる。
　尚、本開示のナノファイバーシートを構成するナノファイバー３の本数に特に制限はなく、１本だけでなく、２本以上のナノファイバーから構成されていてもよい。また、上述のようなエレクトロスピニングは、通常、常温または周囲温度での紡糸が可能であることから、様々な高分子材料を使用した紡糸が可能となる。
　本開示のシートの製造方法では、常温または周囲温度で行うことを技術常識とするエレクトロスピニングにおいて、ナノファイバーの紡糸による形成の前にターゲット板４を、例えば図１（Ａ）に示すようなヒーター５（より具体的にはラバーヒーター（図４参照））などで予め「加熱」することを最大の特徴とする（工程（ｂ））。このような「予備加熱」または「加熱」の工程は、常温または周囲温度でエレクトロスピニングを行う当該分野の当業者にとってはコストの観点からも容易に想到し得ない予想外の工程である。このような工程（ｂ）により、ナノファイバーに含まれ得る高分子材料、特に高分子圧電材料の結晶化度などを制御することができ、ひいては高分子圧電材料の結晶化度を顕著に向上させることができる。その結果、驚くべきことに、本開示のナノファイバーシートにおいて、応力や張力などの外部からのエネルギーを加えると、細胞の活性化や増殖もしくは培養などに適した電気的な刺激、特に電位を発生させることができる。その結果、本開示のシートを使用することで、より積極的または能動的に細胞の活性化を促進させることができる。
　また、このような工程（ｂ）により、ナノファイバーの繊維径などもコントロールすることができ、ひいてはナノファイバーの繊維径をより細く均一にすることができる。その結果、驚くべきことに、本開示のナノファイバーシートにおいて、曲げ強度や表面粗さ、空隙率などの物性を制御または改善することができ、ひいては柔軟性などの物性を改善または向上させることができる。そのため、細胞との密着性をさらに向上させることにより細胞の活性化をさらに促進させることもできる。
　このように本発明では、主として本開示の製造方法に含まれる工程（ｂ）により、上記の課題を見事に解決することができる。
　以下にて詳しく説明するが、工程（ｂ）においてターゲット板４を加熱する温度は、紡糸液１の温度以上、例えば常温以上または周囲温度以上であることが好ましく、紡糸液１に含まれ得る高分子圧電材料のガラス転移温度以上であることがより好ましい。ターゲット板４を加熱する温度は、例えば２５℃よりも大きく１００℃未満である。このような温度範囲でターゲット板４を予め加熱すると、シートに含まれるナノファイバー３の結晶化度や結晶の配向性、結晶性などの物性を顕著に向上させることができる。また、ナノファイバー３の繊維径などもコントロールすることができ、ひいてはシートの柔軟性などの物性をさらに改善することができる。
　以下、本開示の製造方法に含まれる各工程で使用する用語を説明した上で工程（ａ）～（ｃ）についてさらに詳しく説明する。
　（定義）
・高分子圧電材料
　本開示において「高分子圧電材料」とは、圧電効果または圧電性を有する高分子（又はポリマー又は樹脂）を含んで成る材料を意味する（以下、「高分子圧電体」と称する場合もある）。本開示において「圧電効果」とは、外力による分極現象を意味する。また、「圧電性」とは、機械的ひずみを与えたときに電圧を発生する、あるいは逆に電圧を加えると機械的ひずみを発生する性質を意味する。
　高分子圧電材料として、上記の圧電効果または圧電性を有する高分子材料であれば特に制限はない。例えば、ポリ乳酸系、ポリペプチド系（例えば、ポリ（グルタル酸γ－ベンジル）、ポリ（グルタル酸γ－メチル）等）、セルロース系（例えば、酢酸セルロース、シアノエチルセルロース等）、ポリ酪酸系（例えば、ポリ（β－ヒドロキシ酪酸）等）、ポリプロピレンオキシド系などの光学活性を有する高分子およびその誘導体などが挙げられる。高分子圧電材料として、圧電性や結晶化度を向上させる観点から「ポリ乳酸系高分子」を使用することが好ましい。
　本開示において「ポリ乳酸系高分子」とは、「ポリ乳酸（Ｌ－乳酸およびＤ－乳酸から成る群から選択されるモノマー由来の繰り返し単位のみからなる高分子）」、「Ｌ－乳酸またはＤ－乳酸と、このＬ－乳酸またはＤ－乳酸と共重合可能な化合物とのコポリマー」およびそれらの混合物を意味する。ポリ乳酸系高分子のなかでも特に「ポリ乳酸」が好ましく、Ｌ－乳酸のホモポリマー（ＰＬＬＡ）およびＤ－乳酸のホモポリマー（ＰＤＬＡ）を使用することが最も好ましい。
　ポリ乳酸（ＰＬＡ）の光学純度は、例えば、Ｄ体およびＬ体のいずれにおいても、９０重量％以上、好ましくは９５重量％以上または９７重量％以上、より好ましくは９８重量％以上１００重量％以下、さらにより好ましくは９９．０重量％以上１００重量％以下、特に好ましくは９９．０重量％以上９９．８重量％以下である。
　圧電材料としてポリ乳酸（ＰＬＡ）の光学純度は、エナンチオマー過剰率（ｅ．ｅ．％）と同義として、下記式にて算出した値である。
　光学純度（％）＝エナンチオマー過剰率（ｅ．ｅ．％）＝｛｜Ｌ体量－Ｄ体量｜／（Ｌ体量＋Ｄ体量）｝×１００
　ポリ乳酸（ＰＬＡ）のＬ体量とＤ体量は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた方法により得られる値を用いることができる。
・ナノファイバー
　本開示において「ナノファイバー」とは、ナノメートル（ｎｍ）オーダーの繊維径または直径を有する繊維を意味し、より具体的には、繊維径が約１ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の極細繊維を意味する。このようなナノファイバーは、例えば図１に示すような「エレクトロスピニング」（「電界紡糸法」とも称される）により製造することができる。ただし、ナノファイバーの製造方法は、エレクトロスピニングに限定されるものではなく、コンジュゲート紡糸法（例えば、海島型、割繊型、芯鞘型の繊維、特に複合繊維などを製造することができる）などでナノファイバーを製造してもよい。
・エレクトロスピニング
　本開示において「エレクトロスピニング」とは、「紡糸液」に電圧を印加することで紡糸して繊維を形成する方法を意味する。
・紡糸液
　本開示において「紡糸液」とは、任意の溶媒に高分子圧電材料を溶解させた液体を意味する。ただし、本開示の製造方法では、高分子圧電材料が溶融した状態の液体を紡糸液として使用することを排除するものではない。また、紡糸液は必要に応じて他の成分（例えば界面活性剤や導電性付与剤など）を含んでいてもよい。
・溶媒
　本開示において紡糸液に含まれる「溶媒」とは、高分子圧電材料の少なくとも一部を溶解させることができる液体を意味する。本開示の製造方法において、溶媒は、高分子圧電材料の少なくとも一部を溶解させることができるものであれば特に制限はなく、従来公知の有機溶媒を適宜選択して使用することができる。
・界面活性剤
　本開示において紡糸液に含まれる「界面活性剤」として特に制限はなく、例えば１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）などのアルコール系の界面活性剤を使用することができる。このような界面活性剤を添加することで高分子圧電材料や溶媒との相溶性を向上させる、紡糸の安定性を向上させるなどの効果を奏することができる。
・導電性付与剤
　本開示において紡糸液に含まれる「導電性付与剤」として特に制限はなく、例えばベンジルトリエチルアンモニウムクロリド（ＢＴＥＡＣ）などのアンモニウム系の導電性付与剤を使用することができる。このような導電性付与剤を添加することで紡糸液の導電性や導電率を向上させることでエレクトロスピニングを促進したり、結晶化度を向上させたり、繊維径やその標準偏差（ＳＤ）、変動係数（ＣＶ）などの値をより小さくしたり、結晶配向度の向上、結晶性の向上などの効果を奏することができる。
・シート
　本開示において「シート」とは、ナノファイバーから構成され得る二次元的または三次元的に広がって延在し得る材料を意味する（以下、「ナノファイバーシート」または「ファイバーシート」と称する場合もある）。ナノファイバーシートは、１本または複数本のナノファイバーから構成され得る集合体（又は集合物）であってよい。ナノファイバーシートは布状であってもよい。ナノファイバーシートは１本または複数本のナノファイバーから構成され得る不織布であってよい。シートの厚みに特に制限はなく、例えば５００μｍ以下、好ましくは１００μｍ以上３００μｍ以下、より好ましくは２００μｍ以上３００μｍ以下である。
・ターゲット板
　本開示において「ターゲット板」とは、例えば図１において符号４（ターゲット板４）で示されるように、紡糸液１からエレクトロスピニングにより形成され得るナノファイバー３を受けるために設けられた板状またはプレート状の部材を意味する。ターゲット板４は、接地（アース）されていてもよい。ターゲット板４は、紡糸液とは反対の極性でもよく、紡糸液１に印加される電圧の極性とは反対の極性に帯電していてもよい（図１参照）。
　ターゲット板を構成する材料に特に制限はなく、例えば、ステンレス、アルミニウムなどの金属板であることが好ましい。ターゲット板の厚みに特に制限はなく、例えば３ｍｍ以上、好ましくは５ｍｍ以上３０ｍｍ以下である。
　（各工程について）
・工程（ａ）
　本開示の製造方法に含まれ得る工程（ａ）は、高分子圧電材料を溶媒に溶解して、このような高分子圧電材料を含む紡糸液を調製する工程である。
　工程（ａ）において調製される紡糸液に含まれる溶媒には、特に制限はないが、高分子圧電材料との相溶性、特に高分子圧電材料として好ましいポリ乳酸（ＰＬＡ）系高分子（なかでも特にＰＬＬＡ、ＰＤＬＡ）との相溶性の観点から１，３－ジオキソランを使用することが好ましい。
　紡糸液中に含まれる高分子圧電材料の量に特に制限はなく、紡糸液の総体積（トータル・ボリューム）に対して、例えば５ｗ／ｖ％以上の量で含まれ、好ましくは１０ｗ／ｖ％以上２０ｗ／ｖ％以下、より好ましくは１０ｗ／ｖ％以上１６ｗ／ｖ％以下の範囲内で高分子圧電材料が紡糸液中に含まれている。
　紡糸液又は溶媒は、必要に応じて、界面活性剤を含んでいてもよい。界面活性剤として１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）などのアルコール系の界面活性剤を使用することが好ましい。
　「紡糸液」に含まれる界面活性剤の量に特に制限はなく、「紡糸液」の総体積（トータル・ボリューム）に対して、例えば５０ｖ／ｖ％以下の量で含まれていてよく、１０ｖ／ｖ％以上３０ｖ／ｖ％以下の範囲内で界面活性剤が「紡糸液」に含まれていることが好ましい。
　「溶媒」に含まれる界面活性剤の量に特に制限はなく、「溶媒」の体積（ボリューム）に対して、例えば５０ｖ／ｖ％以下の量で含まれていてよく、１０ｖ／ｖ％以上３０ｖ／ｖ％以下の範囲内で界面活性剤が「溶媒」に含まれていることが好ましい。
　紡糸液は、必要に応じて、導電性付与剤を含んでいてもよい。導電性付与剤としてベンジルトリエチルアンモニウムクロリド（ＢＴＥＡＣ）などのアンモニウム系の導電性付与剤を使用することが好ましい。
　紡糸液中に含まれる導電性付与剤の量に特に制限はなく、高分子圧電材料の総重量に対して、例えば５ｗ／ｗ％以下の量で含まれていてよく、１ｗ／ｗ％以上４ｗ／ｗ％以下または１ｗ／ｗ％以上３ｗ／ｗ％以下の範囲内で導電性付与剤が紡糸液中に含まれていることが好ましい。２ｗ／ｗ％以上３ｗ／ｗ％以下の範囲内で導電性付与剤が紡糸液中に含まれていることがより好ましい。
　特に導電性付与剤がＢＴＥＡＣである場合、高分子圧電材料の総重量に対して、例えば５ｗ／ｗ％以下、好ましくは４ｗ／ｗ％以下、より好ましくは３ｗ／ｗ％以下の範囲内でＢＴＥＡＣが紡糸液中に含まれていることが好ましい。
　驚くべきことに、導電性付与剤としてＢＴＥＡＣが上記の量で紡糸液中に含まれていることによって、特に溶媒として１，３－ジオキソランを使用し、さらに界面活性剤としてＨＦＩＰと組み合わせて使用することによって、高分子圧電材料として好ましいＰＬＡ系高分子、なかでも特にＰＬＬＡおよびＰＤＬＡの結晶化度、結晶配向度、結晶性などの物性を後続の工程（ｃ）のエレクトロスピニングの間に制御することができ、ひいてはこれらの物性を顕著に向上させることができる。そのメカニズムは、特定の理論に拘泥されるものでなく、例えば、紡糸液吐出速度向上によるナノファイバーへの延伸効果などによるものと考えられる。
・工程（ｂ）
　本開示の製造方法に含まれ得る工程（ｂ）は、紡糸液をエレクトロスピニングにより紡糸してナノファイバーを形成する前に、ナノファイバーを受けるためのターゲット板を予め加熱する工程である（図１（Ａ）参照）。
　工程（ｂ）によって後続の工程（ｃ）の間にナノファイバーの結晶化度、結晶配向度、結晶性などの物性を顕著に向上させることができる。また、ナノファイバーの繊維径なども制御することができ、ひいてはシートに顕著に改善された柔軟性などの物性を与えることができる。
　例えば、工程（ｂ）においてターゲット板を加熱することで特に後続の工程（ｃ）の間において、高分子圧電材料の結晶化度が、ナノファイバーにおいて、ターゲット板を加熱しない場合と比べて例えば５％以上向上する。
　工程（ｂ）においてターゲット板を加熱する温度が紡糸液の温度以上であることが好ましい。ここで、紡糸液を用いたエレクトロスピニングでは、通常、紡糸が常温または周囲温度で行われることから、従前の紡糸工程ではターゲット板を紡糸液の温度以上に加熱することは全く行われていなかった。また、ターゲット板を加熱することで、形成されるナノファイバーの結晶化度、結晶配向度、結晶性などの物性が向上することは当業者にとって驚くべきことであり予想外の効果であった。
　工程（ｂ）においてターゲット板を加熱する温度が紡糸液に含まれる高分子圧電材料のガラス転移温度以上であることが好ましい。ターゲット板を加熱する温度が高分子圧電材料のガラス転移温度以上であることによってナノファイバーの結晶化度、結晶配向度、結晶性などの物性がさらに顕著に向上する。
　工程（ｂ）においてターゲット板を加熱する温度（以下、「ターゲット温度」と称する場合もある）は、例えば２５℃よりも大きく１００℃未満の温度であり、好ましくは３０℃以上１００℃未満であり、より好ましくは４０℃以上１００℃未満または８０℃以上１００℃未満であり、さらにより好ましくは４０℃以上９０℃以下または８０℃以上９０℃以下、特に好ましくは６０℃以上９０℃以下または８０℃以上９０℃以下の温度である。ターゲット温度は６０℃以上８０℃以下が特に好ましい。
　ターゲット温度は加熱したターゲット板の温度を温度センサなどで直接または接触あるいは非接触で測定してよい。あるいは温調器などの設定温度をターゲット温度としてよい。
・工程（ｃ）
　本開示の製造方法に含まれる工程（ｃ）は、エレクトロスピニングにより形成され得るナノファイバーを前記ターゲット板上で受けて該ナノファイバーを該ターゲット板上でシート状に成形または形成する工程である（図１（Ａ）参照）。
　工程（ｃ）において、例えば図１（Ｂ）に示すように紡糸液１に正の電圧を印加することで紡糸液１を正に帯電させた後にエレクトロスピニングにより紡糸して正に帯電したナノファイバー３を形成しつつ、例えばターゲット板４を接地させることにより、ナノファイバー３をターゲット板４上に集めてシート状の材料を成形または形成することが好ましい。尚、ターゲット板４は、例えば図１（Ａ）に示すように負に帯電していてもよい。
　このような工程（ｃ）において、予め加熱されたターゲット板４によって、エレクトロスピニングの間にナノファイバー３に含まれる高分子圧電材料の結晶化度などの物性を制御し、好ましくは顕著に向上させることができる。
　ターゲット板４の加熱は、例えば図１（Ａ）に示す通り、ターゲット板４の裏面（すなわちターゲット板４のノズル２と対向する面とは反対側の面）、好ましくは中央部分に設けられたヒーター５によって行うことができる。
　ヒーター５として、ターゲット板４を加熱することができれば特に制限はない。例えばラバーヒーターなどのヒーターおよび必要に応じて温度センサおよび／または温調器などを使用してターゲット板４を加熱することが好ましい。ここで、ターゲット板４の温度は、例えば、温度センサおよび温調器などを用いて調節することができる。
　電圧発生器６として紡糸液１に電圧を印加することができれば特に制限はない。
　紡糸液の吐出量は、例えば２０μｌ／ｍｉｎ～６０μｌ／ｍｉｎである。紡糸液の吐出量は、好ましくは４０μｌ／ｍｉｎ～６０μｌ／ｍｉｎであり、より好ましくは５０μｌ／ｍｉｎである。
　紡糸液の吐出温度は、例えば２０℃～３０℃であり、好ましくは約２５℃である。紡糸液の吐出温度は紡糸液の温度と同じであってもよい。
　紡糸液は図示するように水平方向に射出してもよいが（図１および図５参照）、垂直方向（水平方向に対して垂直方向）に射出してよい。例えば、紡糸液は下方、換言すると地面側に射出してよい。
　紡糸液に含まれ得る高分子圧電材料の濃度は、例えば２０ｗ／ｖ％以下であり、好ましくは１５ｗ／ｖ％以下であり、より好ましくは１４ｗ／ｖ％である。
　ターゲット板４までの距離（又は紡糸距離）は、例えば１００ｍｍ以下であり、好ましくは８０ｍｍ以下であり、より好ましくは７５ｍｍである。
　例えば図１（Ａ）に示す通り、ターゲット板４の表面（すなわちターゲット板４のノズル２と対向する面）では、形成されたナノファイバー３を受けてシート状に集めることができる。集められたナノファイバー３、つまりナノファイバー３の集合体は、シート状の材料として、例えば不織布として成形または形成されていてもよい。
　本開示のシートは、工程（ｃ）の後、「アニール」と呼ばれる加熱処理に供されてもよい。アニールは、例えば、任意の炉の内部において、本開示のシートを加熱することで行われ得る。アニールでの加熱処理温度に特に制限はなく、例えば２５℃よりも大きく１００℃未満の温度であり、好ましくは３０℃以上１００℃未満であり、より好ましくは４０℃以上１００℃未満または８０℃以上１００℃未満であり、さらにより好ましくは４０℃以上９０℃以下または８０℃以上９０℃以下、特に好ましくは６０℃以上９０℃以下または８０℃以上９０℃以下の温度である。このようなアニールにより本開示のシートに含まれるナノファイバーの結晶化度などの物性をさらに向上させてもよい。アニールでの加熱処理温度は６０℃以上８０℃以下が特に好ましい。
　以下、本開示のシートについて詳しく説明する。
　［シート］
　本開示のシートは上記で説明した製造方法により得ることができる。本開示のシートは、上述の通り、高分子圧電材料を含むナノファイバーを有して成るシートである（以下、本開示のシートを「ナノファイバーシート」または「ファイバーシート」と称する）。ナノファイバーシートは、ナノファイバーの集合体であることが好ましい。ナノファイバーシートは、ナノファイバーを集めて構成され得る不織布であることがより好ましい。不織布の場合、繊維の交点は物理的または化学的に結合していてもよいし、結合していなくてもよい。
　ナノファイバーシートでは、ナノファイバーが上記のように制御された結晶化度などの物性を有する高分子圧電材料を含むことから、その変形や曲げや歪みによる張力や応力などの外部からのエネルギーが加わることで、そのシートの表面において、より制御された電界強度（例えば１～６００ｍＶ／ｍｍ）を発生させることができる。例えば、初期胚発生において１０～２０ｍＶ／ｍｍ、角膜創傷部位において４０～５０ｍＶ／ｍｍ、皮膚創傷部位において１００～１５０ｍＶ／ｍｍの電界強度を与えることができる。
　従って、本開示のナノファイバーシートは、このような電界および／または電位により細胞の活性化を促すことができるので、積極的または能動的な細胞の活性化または細胞の増殖もしくは培養などに用いることができる。
　本開示のシートは、上記エレクトロスピニングにより形成され得る制御された繊維径を有するナノファイバーを極細繊維として含むことから、フワフワで柔らかく、つまりパリパリ感やバリバリ感がない。また、上記の工程（ｂ）によってナノファイバーに含まれる高分子圧電材料の結晶化度などの物性が増すことから、より積極的または能動的に細胞の活性化または増殖もしくは培養を促進することができる。
　より具体的には、このようなナノファイバーシートを例えば創傷を被覆する包帯やガーゼあるいは絆創膏の代替として使用した場合、身体の運動にあわせて電位を発生させることができるので、細胞を従前よりも活性化してより速く増殖させて創傷を治癒することができる。
　本開示のシートは、ナノファイバーに含まれる高分子圧電材料の結晶化度が例えば２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、さらにより好ましくは５０％以上、特に好ましくは５５％以上であることを特徴とする。結晶化度は、例えば示差走査熱量計（ＤＳＣ：Differential Scanning Calorimetry）、Ｘ線回折法（ＸＲＤ：X-ray diffraction）などの測定方法により決定することができる。上記の範囲で結晶化度を制御することで細胞活性化に必要な電界および／または電位を制御することができる。
　さらに、本開示のシートはナノファイバーの繊維径が均一であることを特徴とする。
　ナノファイバーの繊維径は、例えば８００ｎｍ以下である。ナノファイバーの繊維径は、好ましくは４００ｎｍ以上６００ｎｍ以下であり、より好ましくは４００ｎｍ以上５５０ｎｍ以下であり、特に好ましくは約５００ｎｍである。ナノファイバーの断面形状に特に制限はなく、例えば、略円形であっても、略矩形であっても、異形であってもよい。本開示においてナノファイバーの繊維径は、ナノファイバーの軸方向に垂直な方向での断面における最大の寸法を意味する。例えばナノファイバーが略円形の断面形状を有する場合、繊維径はその円形の最大の直径を意味する。
　本開示においてナノファイバーの繊維径が「均一」であるとは、１本のナノファイバーにおいて、その長さ方向の繊維径が均一であること、シートに含まれる複数本のナノファイバーの間で繊維径が均一であること、温度変化（例えば上記アニールによる加熱処理）の前後において、１本のナノファイバーの長さ方向の繊維径が均一であること、あるいは温度変化（例えば上記アニールによる加熱処理）の前後において、シートに含まれる複数本のナノファイバーの間で繊維径が均一であることなどを意味する。換言すると、本開示のナノファイバーにおいて、熱を加えた場合であっても収縮が抑制され、繊維径がほぼ一定であることなどを意味する。
　シートに含まれるナノファイバーの繊維径が上述のように「均一」であることによって、シートに適切な曲げ強度や、表面粗さ、空隙率など与えることができ、ひいてはフワフワとした風合い（パリパリ感、バリバリ感のない肌触りのよい風合い）など優れた柔軟性を有するシートを提供することができる。このような柔軟性により、シート表面と細胞との密着性がさらに向上するため、細胞をさらに活性化して、細胞をより増殖させることができる。
　ナノファイバーの繊維径が「均一」であることを示す指標として、例えば、シートに含まれるナノファイバーの平均繊維径が挙げられる。ナノファイバーの平均繊維径は、例えば４００ｎｍ以上７００ｎｍ以下、好ましくは４００ｎｍ以上５５０ｎｍ以下、より好ましくは４５０ｎｍ以上５５０ｎｍ以下である。ここで、ナノファイバーの平均繊維径は走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による繊維断面写真などから計算により求めることができる。
　また、ナノファイバーの繊維径が「均一」であることを示す指標として、シートに含まれるナノファイバーの繊維径の標準偏差（ＳＤ）が挙げられる。ナノファイバーの繊維径のＳＤ値は、例えば１０以上１５０以下である。ここで、ナノファイバーの繊維径のＳＤ値は、１本の繊維の複数の箇所で測定した繊維径の値の標準偏差であってもよく、複数の繊維において複数の箇所で測定した繊維径の値の標準偏差であってもよい。同様に温度変化（例えば上記アニールによる加熱処理）の前後において測定した１本または複数本のナノファイバーの繊維径の値の標準偏差であってもよい。
　ナノファイバーの繊維径が「均一」であることを示す別の指標として、例えば、シートに含まれるナノファイバーの繊維径の変動係数（ＣＶ）（標準偏差を平均値で割った値）が挙げられる。ナノファイバーの繊維径のＣＶ値は、例えば５％以上２０％以下である。ここで、ナノファイバーの繊維径のＣＶ値は、１本の繊維の複数の箇所で測定した繊維径の値の変動係数であってもよく、複数の繊維において複数の箇所で測定した繊維径の値の変動係数であってもよい。同様に温度変化（例えば上記アニールによる加熱処理）の前後において測定した１本または複数本のナノファイバーの繊維径の値の変動係数であってもよい。
　ここで、本開示のシートに含まれるナノファイバーを実質的に構成し得る高分子圧電材料の結晶化度などの物性や、ナノファイバーの繊維径に起因するシートの柔軟性などの物性は、その製造過程において、導電性付与剤であるベンジルトリエチルアンモニウムクロリド（ＢＴＥＡＣ）を紡糸液に添加することによっても制御することができ、ひいてはこれらの物性を向上させることができる。換言すると、本開示のシートがＢＴＥＡＣまたＢＴＥＡＣに由来する元素（例えば、窒素（Ｎ）、塩素（Ｃｌ）などの元素）を含むことでナノファイバーの結晶化度やシートの柔軟性などの物性を制御することができ、ひいてはこれらの物性を顕著に向上させることができる。
　このような観点から、本開示のシートは、窒素および塩素からなる群から選択される元素を少なくとも１つ含むことを特徴としていてよい。つまり、このような窒素、塩素などの元素がベンジルトリエチルアンモニウムクロリド（ＢＴＥＡＣ）に由来することを特徴としてよい。
　また、本開示のシートは、Ｘ線回折法（ＸＲＤ）による１５°以上２０°以下、好ましくは１６°以上１８°以下の角度（２θ）の範囲内、特に好ましくは１６．５°の角度（２θ）において、強度（Intensity）が２００００以上、好ましくは３００００以上のピークを有することを特徴とする（例えば図３参照）。このようなシートは、顕著に向上した結晶化度や結晶性とともに、上述の柔軟性などの物性をも有することができる。換言すると、シートの柔軟性を犠牲にすることなく、顕著に向上した結晶化度や結晶性などの物性を有するシートを得ることができる。
　本開示のシートにおいて高分子圧電材料がポリ乳酸系高分子であることが好ましい。本開示のシートがポリ乳酸系高分子を含むことで、結晶化度、結晶配向度、結晶性などのナノファイバーの物性と柔軟性などのシートの物性とをバランスよく奏することができ、細胞の活性化および／または増殖もしくは培養に適したシートを得ることができる。
　本開示のシートは配向性を有していてもよい。シートの「配向性」とはシートに含まれるナノファイバーが特定の方向に優先的に配列している状態を意味する。
　例えば図１５に示すようにターゲット板（例えばアルミニウム製のターゲット板）に絶縁テープ（カプトン・テープ）をストライプ状に配置してエレクトロスピニングにより紡糸することでナノファイバーを左右（横方向）に振り分けて配向させることができる。
　ナノファイバーの配向は、例えば楕円近似によって「配向角度」および「配向度」として規定することができる。楕円近似については、Enomae, T., et al., Nordic Pulp and Paper Research Journal, (2006), Vol. 21(2), pp. 253-259 を参照のこと。
　楕円近似において、「配向角度」は、短軸方向の角度を意味する（図１８参照）。
　楕円近似において、「配向度」は、ｂ（長軸）／ａ（短軸）の比で表すことができる（図１８参照）。
　配向角度は、例えば±９０°以下であり、好ましくは±４５°以下である。
　配向角度が上記の範囲内であると、配向シートに変位または荷重が加わったときにより適切な電位を発生させることができる。
　以下、実施例を挙げて本開示のシートおよびその製造方法をさらに詳しく説明する。
　実施例１
　図１に示すエレクトロスピニング装置を用いてナノファイバーシートを作製した。尚、本開示において、ナノファイバーシートを作製するのに使用するエレクトロスピニング装置は、図１に示すものに限定されるものではない。
　（Ａ）紡糸液の調製
　ナノファイバーの材料としてポリ－Ｌ－乳酸（ＰＬＬＡ）、溶媒として使用する１，３－ジオキソランおよび溶液の導電性を向上させる導電性付与剤としてベンジルトリエチルアンモニウムクロリド（ＢＴＥＡＣ）を撹拌・脱泡装置を用いて撹拌した。その後、界面活性剤として１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）を加え、撹拌したＰＬＬＡ溶液を脱泡することで紡糸液を調製した。ここで、ＰＬＬＡの濃度を１４ｗ／ｖ％とし、ＢＴＥＡＣの濃度をＰＬＬＡ基準で３ｗ／ｗ％とし、ＨＦＩＰの濃度を溶媒基準で３０ｖ／ｖ％とした。
　（Ｂ）ターゲット板の予備加熱
　図１に示すエレクトロスピニング装置１０において、ターゲット板４としてアルミニウム板（厚さ：１０ｍｍ）を用いた。ターゲット板４の裏面（ノズル２に対向する面の反対側の面）の中央部分にヒーター５としてラバーヒーターを設置した。エレクトロスピニングによる紡糸の前にターゲット板４を８０℃に予備加熱した。
　（Ｃ）エレクトロスピニング
　図１に示す装置１０を用いたエレクトロスピニングによって、以下に示す紡糸条件に従って８０℃に予め加熱したターゲット板４上にシート状のＰＬＬＡナノファイバーシートを作製した。
　紡糸条件
　ノズル１：針先を平らに研磨した２１Ｇ注射針
　紡糸液の吐出量：４０μｌ／ｍｉｎ
　印加電圧：７～１１ｋＶ
　紡糸時間：１分間
　紡糸環境温度：約２５℃
　目標ナノファイバー直径：５００ｎｍ
　評価
　上記で作製したナノファイバーシートの表面の形態を走査電子顕微鏡（ＳＥＭ：Scanning Electron Microscope）により観察した。結果を図２の写真に示す（５６０±７０ｎｍ）。ナノファイバーシートに含まれるＰＬＬＡナノファイバーの繊維径、平均繊維径、標準偏差（ＳＤ）および変動係数（ＣＶ）は、以下の通りであった。
　繊維径：４６０ｎｍ～６００ｎｍ
　平均繊維径：５６０ｎｍ
　標準偏差（ＳＤ）：７０
　変動係数（ＣＶ）：１３％
　ＰＬＬＡナノファイバーの結晶化度を示差走査熱量計（ＤＳＣ）で測定したところ、結晶化度は、約５２％であった。
　また、ＰＬＬＡナノファイバーの結晶化温度をＤＳＣで測定したところ、結晶化温度は約８１℃であった。ここで、結晶が一方向に配向するほど結晶化温度が低下することが報告されていることから、「結晶配向度」の指標として「結晶化温度」を測定している（Lee, J., K., et al, Structure development and biodegradability of uniaxially stretched poly(L-lactide), European Polymer Journal, Vol. 37, No 5, (2001), pp. 907-914.）。
　シートに含まれるＰＬＬＡナノファイバーのＸＲＤによる測定結果を図３のグラフに示す（１６．５°の角度（２θ）において、強度（Intensity）が３００００以上のピークを有することを示した）。尚、ＸＲＤのピーク強度および半値幅から結晶性を評価することができる。
　実施例１で得られたシートは、柔らかく、フワフワで肌触りがよく、パリパリ感やバリバリ感がないものであった。
　実施例２
　実施例１で作製したナノファイバーシートを炉に入れて８０℃で１０分間にわたってアニールした。評価結果は、以下の通りであった。
　繊維径：４６０ｎｍ～５７０ｎｍ
　平均繊維径：５２０ｎｍ
　標準偏差（ＳＤ）：５０
　変動係数（ＣＶ）：１２％
　結晶化度：約５０％
　結晶化温度：８２．７℃
　実施例２で得られたシートは、アニール後であっても繊維がほとんど収縮せず（又は収縮率が低く）、フワフワで肌触りがよく、柔らかく、パリパリ感やバリバリ感がないものであった。
　比較例１
　ターゲット板を予備加熱しなかったことを除いて実施例１と同様にナノファイバーシートを作製した（ターゲット板の温度：約２５℃）。評価結果は、以下の通りであった。
　繊維径：４７０ｎｍ～５６０ｎｍ
　平均繊維径：５１０ｎｍ
　標準偏差（ＳＤ）：５０
　変動係数（ＣＶ）：１０％
　結晶化度：４３％
　結晶化温度：７７．１℃
　比較例２
　比較例１で作製したナノファイバーシートを炉に入れて８０℃で１０分間にわたってアニールした。評価結果は、以下の通りであった。
　繊維径：４５０ｎｍ～７３０ｎｍ
　平均繊維径：６１０ｎｍ
　標準偏差（ＳＤ）：１４０
　変動係数（ＣＶ）：２３％
　結晶化度：不明
　結晶化温度：不明
　尚、比較例１、２で作製したシートでは、ＸＲＤにおいて１５°以上２０°以下の角度（２θ）の範囲内において、強度（Intensity）が３００００以上のピークは検出されなかった。
　また、比較例１、２、特に比較例２で得られたシートは、実施例１、２のシートと比べると、繊維径が不均一であることから肌触りが悪く、パリパリ感やバリバリ感があった。
　比較例３
　ターゲット板を予備加熱しなかったことおよびＢＴＥＡＣを添加しなかったことを除いて、実施例１と同様にナノファイバーシートを作製した（ターゲット板の温度：約２５℃、ＢＴＥＡＣ：０ｗ／ｗ％）。評価結果は、以下の通りであった。
　繊維径：４５０ｎｍ～６４０ｎｍ
　平均繊維径：５５０ｎｍ
　標準偏差（ＳＤ）：８０
　変動係数（ＣＶ）：１５％
　結晶化度：３６％
　結晶化温度：８１．４℃
　比較例４
　比較例３で作製したナノファイバーシートを炉に入れて８０℃で１０分間にわたってアニールした。評価結果は、以下の通りであった。
　繊維径：４９０ｎｍ～７３０ｎｍ
　平均繊維径：６４０ｎｍ
　標準偏差（ＳＤ）：１７０
　変動係数（ＣＶ）：２７％
　結晶化度：不明
　結晶化温度：不明
　尚、比較例３、４で作製したシートでは、ＸＲＤにおいて１５°以上２０°以下の角度（２θ）の範囲内において、強度（Intensity）が３００００以上のピークは検出されなかった。
　また、比較例３、４、特に比較例４で得られたシートは、実施例１、２のシートと比べると、繊維径が不均一であることから肌触りが悪く、パリパリ感やバリバリ感があった。
　比較例５
　ターゲット板を１００℃に加熱したことを除いて実施例１と同様にナノファイバーシートを作製した（ターゲット板の温度：１００℃）。その結果、ナノファイバーの直径の増加とナノファイバーの湾曲が見られた。
　ＳＥＭ観察により全ての条件で直径５００ｎｍ程度のナノファイバーが作製されたが、ＢＴＥＡＣ添加率に関わらずターゲット温度１００℃においてナノファイバーの直径の増加とファイバーの湾曲が見られた（比較例５）。これより、熱収縮の影響を避けるためにはターゲット温度を１００℃未満とする必要があることが示された。ターゲット温度２５℃（予備加熱なし）およびＢＴＥＡＣ添加率０ｗ／ｗ％の条件において、ナノファイバーの結晶化度と結晶化温度は３６％および８１．４℃となり、ＸＲＤピークは確認されなかった（比較例３）。ターゲット温度２５℃（予備加熱なし）において結晶化度は低下した（比較例１）。ＢＴＥＡＣ添加率の増加に伴い結晶化度が増加した。また、ターゲット温度の上昇によりいずれのＢＴＥＡＣ添加率においても結晶化度は上昇するものの、ＢＴＥＡＣ添加率が高いほどターゲット温度の上昇に伴う結晶化度の変化割合は小さくなった。ターゲット温度６０℃と比べ、ターゲット温度８０℃におけるピーク強度は４０倍程度に増加し、半値幅は６割程度減少した。また、ターゲット温度６０℃以上においてＢＴＥＡＣ添加率の増加に伴いピーク強度の増加と半値幅の減少がわずかに見られた。ターゲット温度の上昇に伴い結晶サイズの増加と非結晶部分の結晶化が促進されたと考えられる。ターゲット温度８０℃およびＢＴＥＡＣ添加率３ｗ/ｗ％において結晶化度は約５２％、結晶化温度は約８１℃、ＸＲＤピークは最も高くなり（図３）、作製したナノファイバーは高い圧電性を有することが示唆された（実施例１）。
　このような実施例１の結果から、ターゲット温度８０℃およびＢＴＥＡＣ添加率３ｗ／ｗ％において、高い圧電性を有するナノファイバーシートの作製が可能であることが示唆された。
　細胞外基質の主成分であるコラーゲン線維の直径が５０～５００ｎｍであることから、実施例で作製したナノファイバーシートが生体との親和性に優れていることがわかった。また、実施例で作製したナノファイバーシートは、骨のように圧電性を有する組織と同様に電気的刺激により細胞活性や代謝に寄与し得ることもわかった。従って、実施例で作製した生体親和性に優れ圧電性を有するポリ乳酸（ＰＬＬＡ）などのナノファイバーシートは組織再生や治癒に対して優れた材料となることがわかった。
　ここで、一般的にナノファイバーの作製にはエレクトロスピニングが用いられるが、その結晶化度や結晶配向度などは、圧電効果が報告されている従前のフィルムやファイバーに比べて低いことが問題であった。また、紡糸後のアニール処理によりナノファイバーの圧電性を高めることは可能であるが、熱収縮による紡糸したナノファイバーの不均一化や繊維径の増加やばらつきなどが問題であった（比較例２、４、５）。しかし、本発明の実施例１、２によると、このような収縮や不均一の問題も解決することができている。
　上記の実施例は本開示のシートおよびその製造方法を単に例示するに過ぎず、本開示のシートおよび製造方法は実施例に示す実施形態に限定されるものではない。
　ファイバーシートのエネルギー分散型Ｘ線分析
　ファイバーシートにＢＴＥＡＣが添加されているかを確認するためにエネルギー分散型Ｘ線分析（Energy dispersive X-ray spectroscopy（ＥＤＳまたはＥＤＸ））を行った。
（実験例Ａ～Ｉ）
　ターゲット温度２５℃（ターゲット板の予備加熱なし）およびＢＴＥＡＣ添加率０，１，２，３，４および５ｗ／ｗ％（実験例Ａ～Ｆ）、ターゲット温度８０℃およびＢＴＥＡＣ添加率０ｗ／ｗ％および３ｗ／ｗ％（実験例Ｇ，Ｈ）、ターゲット温度１００℃およびＢＴＥＡＣ添加率３ｗ／ｗ％（実験例Ｉ）の条件で実施例１と同様に作製したファイバーシートをＥＤＳにより元素分析した。
　分析を行った元素はＰＬＬＡおよび溶媒に含まれる炭素（Ｃ）元素およびフッ素（Ｆ）元素ならびにＰＬＬＡおよび溶媒に含まれずＢＴＥＡＣのみに含まれれる塩素（Ｃｌ）元素であった。結果を以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１の結果から、ＢＴＥＡＣ添加率が０ｗ／ｗ％である実験例ＡおよびＧのファイバーシートではＢＴＥＡＣに由来する塩素（Ｃｌ）元素は検出限界以下であり実質的に検出されないことがわかった。
　ＢＴＥＡＣを添加した実験例Ｂ～ＦおよびＨのナノファイバーシートではＢＴＥＡＣに由来する塩素（Ｃｌ）元素が検出された。尚、Ｃｌ元素はＢＴＥＡＣの存在および誘電率などに関係する。ＢＴＥＡＣを添加した実験例Ｂ～ＦおよびＨのナノファイバーシートについては同様にＢＴＥＡＣに由来する窒素（Ｎ）元素の存在も確認することができた。
　表１に示す実験例Ａ～Ｉのファイバーシートのうち「実験例Ｈ」のファイバーシートはターゲット温度を８０℃としていることから「実施例１」のファイバーシートに対応する。
　「実験例Ｇ」のファイバーシートはターゲット温度を８０℃としていることから「実施例３」のファイバーシートと称する。
　表１に示す実験例Ａ～Ｉのファイバーシートのうち「実験例Ａ～Ｆ」のファイバーシートはターゲット温度が２５℃（ターゲット板の予備加熱なし）であることから、本願発明には該当しないものである。
　「実験例Ａ」のファイバーシートは「比較例３」のファイバーシートに対応し、「実験例Ｄ」のファイバーシートは「比較例１」のファイバーシートに対応する。「実験例Ｉ」のファイバーシートは「比較例５」のファイバーシートに対応する。
　「実験例Ｉ」のファイバーシートでは繊維がスプリットすることでスパイダーネットが形成されていたためＣｌ元素の値が検出限界以下であった。
　ＢＴＥＡＣ添加率およびターゲット温度の評価
　１，３－ジオキソラン（ＤＯＬ）および１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）にＰＬＬＡを溶解させることでＰＬＬＡ溶液を調製した。ＰＬＬＡの溶液濃度を１４ｗ／ｖ％とし、ＤＯＬ／ＨＦＩＰ混合比率は７０／３０とした。ターゲット板の温度（ターゲット温度）は、ラバーヒーターを用いて（図４参照）、２５℃（ターゲット板の予備加熱なし），４０℃，６０℃，８０℃および１００℃とした。ターゲット板までの距離（紡糸間距離）は５０ｍｍとした。また、吐出量を４０μｌ／ｍｉｎ、印加電圧を７．２～１０．７ｋＶとして１分間紡糸した（図５参照）。紡糸後、ＳＥＭによるファイバーの形態観察および示差走査熱量計（ＤＳＣ：Differential Scanning Calorimetry）による結晶化度の評価を行った。
（紡糸条件）
・溶液条件
　　ＰＬＬＡ濃度：１４ｗ／ｖ％
　　溶媒：ＤＯＬ／ＨＦＩＰ（７０／３０）
　　ＢＴＥＡＣ濃度：４ｗ／ｗ％または５ｗ／ｗ％
　・エレクトロスピニング紡糸条件
　　ターゲット温度：２５（予備加熱なし），４０，６０，８０または１００℃
　　ノズルの先端からターゲット板までの距離：５０ｍｍ
　　印加電圧：７．２～１０．７ｋＶ
　　吐出量（フロー・レート）：４０μｌ／ｍｉｎ
　　紡糸温度：約２５℃
　　湿度：７～１６％
　ＢＴＥＡＣ添加率４ｗ／ｗ％および５ｗ／ｗ％における各ターゲット温度のＳＥＭ画像をそれぞれ図６および図７に示す（２０００倍）。
　ＢＴＥＡＣ添加率４ｗ／ｗ％および５ｗ／ｗ％のいずれにおいてもターゲット温度１００℃では、ファイバーが顕著に湾曲している様子が見られた（図６（Ｅ）および図７（Ｅ）参照）。
　また、ＢＴＥＡＣ添加率４ｗ／ｗ％および５ｗ／ｗ％のいずれにおいてもターゲット温度２５℃（予備加熱なし）ではファイバーが崩れている様子が見られた（図６（Ａ）および図７（Ａ）参照）。特にＢＴＥＡＣ添加率４ｗ／ｗ％、ターゲット温度２５℃（予備加熱なし）で作製したファイバーの５０００倍のＳＥＭ画像を図８に示す。図８ではファイバーがクモの巣状に崩れていた。換言すると繊維がスプリットしてスパイダーネットが形成されていた。尚、ＢＴＥＡＣ添加率が３ｗ／ｗ％以下の場合には、ターゲット温度が２５℃よりも大きく１００℃未満の範囲にわたって、このようなファイバーの崩れは見られないことがわかった（実施例１および図２参照）。
　以上のことから、ＢＴＥＡＣ添加率は５ｗ／ｗ％以下または５ｗ／ｗ％未満、特に４ｗ／ｗ％以下または３ｗ／ｗ％以下であることが好ましく、なおかつターゲット温度が２５℃よりも大きく１００℃未満であることがより好ましいことがわかった。
　（結晶化度）
　ＤＳＣ測定結果から算出した結晶化度を図９に示す。図９に示す結果から、ＢＴＥＡＣ添加率の上昇に伴い、結晶化度も増加することがわかった。尚、ＢＴＥＡＣ４ｗ／ｗ％以上の条件では、特に４ｗ／ｗ％，５ｗ／ｗ％のいずれにおいてもＰＬＬＡ由来の結晶融解熱量のピーク付近にＢＴＥＡＣ由来のピークが見られた（図１０参照）。
　ＤＳＣ曲線から算出した結晶化温度を図１１に示す。ＢＴＥＡＣ添加率４ｗ／ｗ％では、ターゲット温度の上昇に伴い、結晶化温度が上昇する傾向が見られた。
　ＢＴＥＡＣ添加率５ｗ／ｗ％では、どのターゲット温度においても、結晶化温度は８２℃付近であることがわかった。
　図１１に示す結果から、ＢＴＥＡＣ添加率が５ｗ／ｗ％程度まではＢＴＥＡＣ添加率の上昇に伴って結晶配向性は増加することがわかった。
　（ＦＴＩＲ測定）
　ＢＴＥＡＣ添加率３ｗ／ｗ％のＦＴＩＲ測定結果を図１２（ターゲット温度（ａ）２５℃、（ｂ）４０℃、（ｃ）６０℃、（ｄ）８０℃、（ｅ）１００℃）、ＢＴＥＡＣ添加率４ｗ／ｗ％のＦＴＩＲ測定結果を図１３（ターゲット温度（ａ）２５℃、（ｂ）４０℃、（ｃ）６０℃、（ｄ）８０℃、（ｅ）１００℃）、ＢＴＥＡＣ添加率５ｗ／ｗ％のＦＴＩＲ測定結果を図１４（ターゲット温度（ａ）２５℃、（ｂ）４０℃、（ｃ）６０℃、（ｄ）８０℃、（ｅ）１００℃）に示す。
　ＦＴＩＲの波形にＢＴＥＡＣ添加による影響は見られなかった。尚、ターゲット温度８０℃および１００℃の条件でα晶由来のピークである９２３ｃｍ-1付近のピークが見られた。
　図１２～図１４に示す結果から、ターゲット温度が上昇するに従ってα晶の割合が増加する傾向にあること、換言すると結晶がより成長していることがわかった。特に８０℃以上、特に８０℃付近のターゲット温度が有効であることがわかった。
　配向ファイバーシートの作製
　圧電性評価用試料として配向ファイバーシートを作製した。
　（配向ファイバーシートＡ）
　アルミニウム製のターゲット板に幅１５ｍｍの絶縁テープ（カプトン・テープ）をストライプ状に貼り付け（図１５参照）、ターゲット板の温度を８６℃に設定したこと以外は実施例１と同様にしてエレクトロスピニングによって紡糸することで配向ファイバーシートＡを製造した（ＢＴＥＡＣ添加率３ｗ／ｗ％）。
　絶縁テープ（カプトン・テープ）をターゲット板に貼り付けることによって電気引力を弱めることができるのでファイバーを絶縁体上で横方向（又は左右）に振り分けて配向させることができる。
　（配向ファイバーシートＢ）
　アルミニウム製のターゲット板に幅１５ｍｍの絶縁テープ（カプトン・テープ）をストライプ状に貼り付け（図１５参照）、ターゲット板の温度を２５℃（予備加熱なし）に設定し、ＢＴＥＡＣを添加しなかったこと以外は実施例１と同様にしてエレクトロスピニングによって紡糸することで配向ファイバーシートＢを製造した（ＢＴＥＡＣ添加率０ｗ／ｗ％）。
　図１６に配向ファイバーシートＡ（実施例）のＳＥＭ画像を示す（１０００倍、Ｂａｒ：１０μｍ）。図１６から配向ファイバーシートＡにおいてＳＥＭ画像の左右方向（横方向）に繊維が配向していることを確認した。
　図１７に配向ファイバーシートＢ（比較例）のＳＥＭ画像を示す（１０００倍、Ｂａｒ：１０μｍ）。図１７から配向ファイバーシートＢにおいてもＳＥＭ画像の左右方向（横方向）に繊維が配向していることを確認した。
　図１６および図１７のＳＥＭ画像をそれぞれ２値化してＦＦＴ処理した後、角度毎のパワースペクトルを算出した。その後、楕円近似により「配向角度」および「配向度」を算出した。楕円近似については、Enomae, T., et al., Nordic Pulp and Paper Research Journal, (2006), Vol. 21(2), pp. 253-259 を参照のこと。
　楕円近似において、「配向角度」は、短軸方向の角度を意味する。
　楕円近似において、「配向度」は、ｂ（長軸）／ａ（短軸）の比で表すことができる。
　図１６に示す配向ファイバーシートＡでは、配向角度５．６°、配向度２．７であった。
　図１７に示す配向ファイバーシートＢでは、配向角度２．８°、配向度２．６であった。
　このようにして、配向度が同程度であり、配向角度の異なる配向ファイバーシートＡ（実施例）およびＢ（比較例）を作製することができた。
　配向ファイバーシートＡおよびＢについて、それぞれ配向していない非配向ファイバーシート（不織布）Ａ’およびＢ’を作製して互いに比較した。
　具体的には絶縁テープ（カプトン・テープ）を使用することなく上記の配向ファイバーシートＡおよびＢと同様にして非配向ファイバーシート（不織布）Ａ’およびＢ’を作製して上記の配向ファイバーシートＡおよびＢとそれぞれ比較した。「結晶化度」、「結晶化温度」、「結晶の種類および結晶成長評価」などについて比較した結晶評価の結果を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　配向ファイバーシートＡと非配向ファイバーシートＡ’との対比および配向ファイバーシートＢと非配向ファイバーシートＢ’との対比から「結晶化度」において有意な差はなく同程度であることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　配向ファイバーシートＡと非配向ファイバーシートＡ’との対比および配向ファイバーシートＢと非配向ファイバーシートＢ’との対比から「結晶化温度」において有意な差はなく同程度であることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　配向ファイバーシートＡと非配向ファイバーシートＡ’との対比および配向ファイバーシートＢと非配向ファイバーシートＢ’との対比から「結晶の種類および結晶成長評価」（具体的には「ピーク強度」および「半値幅」）において有意な差はないことがわかった。
　これらの結晶評価から、配向ファイバーシート（Ａ，Ｂ）および非配向ファイバーシート（Ａ’，Ｂ’）において結晶状態はそれぞれ同等であることがわかった。
　圧電性試験片の作製
　図１９に示す通り、配向ファイバーシート（ＡまたはＢ）を３０ｍｇ測り、２０ｍｍ×２０ｍｍ×０．１５ｍｍの大きさでエポキシ包埋した。その後、再びエポキシ樹脂を用いて中央に配向ファイバーシート（ＡまたはＢ）を配置した４０ｍｍ×４０ｍｍ×０．２ｍｍの大きさの試験片を作製した。このとき、ポリアセタール樹脂で挟むことにより加工し、フィラーゲージにより厚さの調節を行った。その後、両面に２５ｍｍ×２５ｍｍの電極および導線を貼り付け、絶縁テープ（カプトン・テープ）により絶縁包埋した（図２０参照）。
　圧電性評価
　ＥＺｇｒａｐｈを用いて各試験片に変位０．５ｍｍ（ひずみ２．５％）を負荷し、差動増幅回路を介してオシロスコープにより電位を測定した。差動増幅回路（１０倍増幅）（オペアンプ（ＯＰ-ＡＭＰ ＮＪＭ２０８２））は試験片の片面から片面の電位を差分し、１０Ｈｚ以下を通す正帰還形２次ローパスフィルタおよび６０Ｈｚ付近を取り除くノッチフィルタを経由し、測定波形を１０倍に増幅可能な機構とした。
　また、ＰＬＬＡの圧電性は分子鎖軸方向に対してせん断応力が生じた際にそのせん断面に対して、垂直な方向に分極することが知られている（図２１）。そのため、繊維軸方向にせん断応力を負荷する必要があり、本実験では繊維軸方向に対して４５°および１３５°の方向に引張を負荷した（図２２参照）。
・引張試験条件
　　４５°方向および１３５°方向に引張負荷
　　変位：０．５ｍｍ（ひずみ：２．５％）、２Ｈｚ周期
　　試験機：ＥＺｇｒａｐｈ
　　測定機器：オシロスコープ
・圧電性試験片
　　試験片Ａ：配向ファイバーシートＡ（ターゲット温度：８６℃、ＢＴＥＡＣ添加率：３ｗ／ｗ％）
　　試験片Ｂ：配向ファイバーシートＢ（ターゲット温度：２５℃（予備加熱なし）、ＢＴＥＡＣ添加率０：ｗ／ｗ％）
（変位に対する電位の測定）
・試験片Ａの測定結果
　図２３に配向ファイバーシート繊維軸方向に対して４５°方向に引張を負荷したときの変位に対する電位測定結果を示す（太線は電圧を示す）。
　図２４に配向ファイバーシート繊維軸方向に対して１３５°方向に引張を負荷したときの変位に対する電位測定結果を示す（太線は電圧を示す）。
　試験片Ａでは、４５°方向（図２３）と１３５°方向（図２４）との対比によると、変位に対して電位の正負が反転した応答が得られることから、試験片に含まれるナノファイバーシートの圧電性に由来して電位が発生したことが確認できた。
・試験片Ｂの測定結果
　図２５に配向ファイバーシート繊維軸方向に対して４５°方向に引張を負荷したときの変位に対する電位測定結果を示す（太線は電圧を示す）。
　試験片Ｂでは、発生する電位が顕著に低下することがわかった。これは予備加熱を行わなかったことに起因するものと考えられる。
・ブランク（エポキシ樹脂）の測定結果
　図２６に示すようにブランクとしてのエポキシ樹脂の変位に対する電位測定結果を示す（太線は電圧を示す）。
　エポキシ樹脂の電位を測定したが、変位に合わせて電位は全く発生しないことを確認した。
　図２３～図２６に記載の結果から、ターゲット板を予備加熱せずにＢＴＥＡＣも添加しない場合には発生電位が顕著に低下することがわかった（図２５参照）。
　試験片Ａおよび試験片Ｂについて上記と同様にして４５°および１３５°の引張方向で測定した電位の平均を以下に示す（ｎ＝１８）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　試験片Ａでは、ターゲット板を予備加熱し、なおかつＢＴＥＡＣを添加したことから、試験片Ｂと比較して約７倍の平均電位を得ることができた。
（荷重に対する電位の測定）
・試験片Ａの測定結果
　図２７に繊維軸方向に対して４５°方向に引張を負荷したときの荷重に対する電位測定結果を示す（太線は電圧を示す）。
　図２８に繊維軸方向に対して１３５°方向に引張を負荷したときの荷重に対する電位測定結果を示す（太線は電圧を示す）。
　試験片Ａでは、４５°方向（図２７）と１３５°方向（図２８）との対比によると、荷重に対して電位の正負が反転していることから、試験片に含まれる圧電性ナノファイバーシートに由来して電位が発生したことが確認できた。
・試験片Ｂの測定結果
　図２９に繊維軸方向に対して４５°方向に引張を負荷したときの荷重に対する電位測定結果を示す（太線は電圧を示す）。
　試験片Ｂでは、発生する電位が顕著に低下することがわかった。これは予備加熱を行わなかったことに起因するものと考えられる。
・ブランク（エポキシ樹脂）の測定結果
　図３０に示すようにブランクとしてのエポキシ樹脂への荷重に対する電位測定結果を示す（太線は電圧を示す）。
　エポキシ樹脂の電位を測定したが、荷重に合わせて電位が全く発生しないことを確認した。
　図２７～図３０に記載の結果から、ＢＴＥＡＣ添加率が０ｗ／ｗ％でターゲット板を予備加熱しない場合には、発生電位が顕著に低下することがわかった（図２９参照）。
　（垂直型エレクトロスピニング装置）
　上記の実験例では水平型のエレクトロスピニング装置（図１および図５参照）を使用していたが、本実験例では垂直型エレクトロスピニング装置（メック製、NANON-04型番）を使用して以下の条件で目標とする繊維径５００ｎｍのファイバーシートを作製した。
（紡糸条件）
・溶液条件
　　ＰＬＬＡ濃度：１２，１４，１６ｗ／ｖ％
　　溶媒：ＤＯＬ／ＨＦＩＰ（７０／３０）
　　ＢＴＥＡＣ添加率：３ｗ／ｗ％
　・エレクトロスピニング紡糸条件
　　吐出量（フロー・レート）：３０，４０，５０μｌ／ｍｉｎ
　　紡糸間距離：５０，７５，１００ｍｍ
　　印加電圧：１４～２２ｋＶ
　　紡糸温度：約２５℃
　　湿度：７～１６％
　垂直型エレクトロスピニング装置で作製したファイバーシートのＳＥＭ画像を図３１（ＰＬＬＡ濃度：１２ｗ／ｖ％、２０００倍）、図３２（ＰＬＬＡ濃度：１４ｗ／ｖ％、２０００倍）および図３３（ＰＬＬＡ濃度：１６ｗ／ｖ％、２０００倍）に示す。
　図３１～図３３に示すＳＥＭ画像から、ＰＬＬＡ濃度１４ｗ／ｖ％、吐出量５０μｌ／ｍｉｎ、紡糸間距離７５ｍｍにおいて、繊維径が５００ｎｍ付近であり、バラツキが少なく、スプリット等が見られない良好なファイバー形態を有するシートを得ることができた（図３２参照）。尚、上記の実験ではターゲット温度が２５℃以下にならないようにターゲット板を加熱した。
　（最良の紡糸条件の検討）
　上記の結果（ＰＬＬＡ濃度１４ｗ／ｖ％、吐出量５０μｌ／ｍｉｎ、紡糸間距離７５ｍｍ）から良好なファイバー形態を有するシートが得られることがわかったので、ＢＴＥＡＣの濃度を１～３ｗ／ｗ％に調整し、ターゲット温度を４０℃～８０℃の範囲内で調節し、上記と同様にファイバーシートを作製した。
・溶液条件
　　ＰＬＬＡ濃度：１４ｗ／ｖ％
　　溶媒：ＤＯＬ／ＨＦＩＰ（７０／３０）
　　ＢＴＥＡＣ添加率：１，２，３ｗ／ｗ％
　・エレクトロスピニング紡糸条件
　　吐出量（フロー・レート）：５０μｌ／ｍｉｎ
　　紡糸間距離：７５ｍｍ
　　印加電圧：１７．５～１９ｋＶ
　　ターゲット温度：４０，６０，８０℃
　上記の実施例１と同様に繊維径（ｎｍ）、変動係数（％）、結晶化度（％）、結晶化温度（℃）を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　上記の結果からＢＴＥＡＣ添加率が３ｗ／ｗ％以下、特に２ｗ／ｗ％で、ターゲット温度が６０℃～８０℃の範囲内であると、より良好な結果が得られることがわかった。
　また、上記の実験で製造したファイバーシートの電子顕微鏡写真（ＳＥＭ画像）を図３４に示す。
　上記の実験例はいずれも本発明をより詳細に説明するための例として示されたものであり、本発明は上記の実験例に限定して解釈されるべきではない。
　本発明により細胞の活性化あるいは増殖または培養に適したシート状の材料を提供することができる。本発明により得られる材料は、例えば、細胞を増殖または培養させるための足場材料、スキャホールドや容器などとして使用することができる。また、本発明により得られる材料は、生体組織の再生などに関する再生医療や創傷治癒、外科手術などの分野においても幅広く使用することができる。より具体的には、包帯やガーゼの代替として、あるいは絆創膏などとして傷口を覆うことで、より積極的または能動的に細胞を活性化させて傷口を治癒することができる。
　　１　　紡糸液
　　２　　ノズル
　　３　　ナノファイバー
　　４　　ターゲット板
　　５　　ヒーター
　　６　　電圧発生器
　　１０　エレクトロスピニング装置（又は電界紡糸装置）

Claims (33)

  1. 　高分子圧電材料を含むナノファイバーを有して成るシートを製造するための方法であって、少なくとも以下の工程（ａ）～（ｃ）：
    （ａ）高分子圧電材料を溶媒に溶解して該高分子圧電材料を含む紡糸液を調製する工程、
    （ｂ）前記紡糸液をエレクトロスピニングにより紡糸してナノファイバーを形成する前に、該ナノファイバーを受けるためのターゲット板を予め加熱する工程、
    （ｃ）エレクトロスピニングにより形成されるナノファイバーを前記ターゲット板上で受けて該ナノファイバーを該ターゲット板上でシート状に成形する工程
    を含んで成る、前記ナノファイバーを有して成るシートの製造方法。
  2. 　前記工程（ｂ）において前記ターゲット板を加熱する温度が前記紡糸液の温度以上である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記ターゲット板を加熱する温度が前記紡糸液に含まれる高分子圧電材料のガラス転移温度以上である、請求項２に記載の製造方法。
  4. 　前記ターゲット板を加熱する温度が２５℃よりも大きく１００℃未満である、請求項２または３に記載の製造方法。
  5. 　前記工程（ａ）において調製される紡糸液に含まれる溶媒が１，３－ジオキソランである、請求項１～４のいずれかに記載の製造方法。
  6. 　前記紡糸液がさらに界面活性剤を含み、該界面活性剤が１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）である、請求項１～５のいずれかに記載の製造方法。
  7. 　前記紡糸液がさらに導電性付与剤を含み、該導電性付与剤がベンジルトリエチルアンモニウムクロリド（ＢＴＥＡＣ）である、請求項１～６のいずれかに記載の製造方法。
  8. 　前記ＢＴＥＡＣが前記高分子圧電材料の総重量に対して５ｗ／ｗ％以下の量で前記紡糸液中に含まれている、請求項７に記載の製造方法。
  9. 　前記ＢＴＥＡＣが前記高分子圧電材料の総重量に対して４ｗ／ｗ％以下の量で前記紡糸液中に含まれている、請求項７に記載の製造方法。
  10. 　前記ＢＴＥＡＣが前記高分子圧電材料の総重量に対して３ｗ／ｗ％以下の量で前記紡糸液中に含まれている、請求項７に記載の製造方法。
  11. 　前記ターゲット板を加熱することで前記高分子圧電材料の結晶化度が、前記ナノファイバーにおいて、前記ターゲット板を加熱しない場合と比べて５％以上向上する、請求項１～１０のいずれかに記載の製造方法。
  12. 　前記工程（ｃ）において前記紡糸液に正の電圧を印加することで該紡糸液を正に帯電させた後にエレクトロスピニングにより紡糸して正に帯電したナノファイバーを形成しつつ、前記ターゲット板を接地させて、該ナノファイバーを該ターゲット板上に集めて前記シートを形成する、請求項１～１１のいずれかに記載の製造方法。
  13. 　前記紡糸液を水平方向または該水平方向に対して垂直方向に射出する、請求項１～１２のいずれかに記載の製造方法。
  14. 　前記紡糸液に含まれる前記高分子圧電材料の濃度が２０ｗ／ｖ％以下である、請求項１～１３のいずれかに記載の製造方法。
  15. 　前記紡糸液の吐出量が２０μｌ／ｍｉｎ以上６０μｌ／ｍｉｎ以下である、請求項１～１４のいずれかに記載の製造方法。
  16. 　前記ターゲット板までの距離が１００ｍｍ以下である、請求項１～１５のいずれかに記載の製造方法。
  17. 　前記シートが前記ナノファイバーの集合体である、請求項１～１６のいずれかに記載の製造方法。
  18. 　前記高分子圧電材料がポリ乳酸系高分子である、請求項１～１７のいずれかに記載の製造方法。
  19. 　請求項１～１８のいずれかに記載の方法により製造されたシート。
  20. 　高分子圧電材料を含むナノファイバーを有して成るシートであって、該ナノファイバーに含まれる高分子圧電材料の結晶化度が２０％以上である、該ナノファイバーを有して成るシート。
  21. 　高分子圧電材料を含むナノファイバーを有して成るシートであって、該シートに含まれるナノファイバーの繊維径が均一である、該ナノファイバーを有して成るシート。
  22. 　前記ナノファイバーの繊維径が８００ｎｍ以下である、請求項２１に記載のシート。
  23. 　前記ナノファイバーの繊維径が４００ｎｍ以上６００ｎｍ以下である、請求項２１に記載のシート。
  24. 　前記シートに含まれるナノファイバーの繊維径の標準偏差（ＳＤ）が１０以上１５０以下である、請求項２１～２３のいずれかに記載のシート。
  25. 　前記シートに含まれるナノファイバーの繊維径の変動係数（ＣＶ）が５％以上２０％以下である、請求項２１～２４のいずれかに記載のシート。
  26. 　高分子圧電材料を含むナノファイバーを有して成るシートであって、該シートが窒素および塩素からなる群から選択される元素を少なくとも１つ含む、該ナノファイバーを有して成るシート。
  27. 　前記元素がベンジルトリエチルアンモニウムクロリド（ＢＴＥＡＣ）に由来する、請求項２６に記載のシート。
  28. 　高分子圧電材料を含むナノファイバーを有して成るシートであって、Ｘ線回折法（ＸＲＤ）による１５°以上２０°以下の角度（２θ）の範囲内において強度（Intensity）が３００００以上のピークを有する、該ナノファイバーを有して成るシート。
  29. 　前記高分子圧電材料がポリ乳酸系高分子である、請求項２０～２８のいずれかに記載のシート。
  30. 　前記シートが前記ナノファイバーの集合体である、請求項２０～２９のいずれかに記載のシート。
  31. 　前記シートが配向性を有する、請求項２０～３０のいずれかに記載のシート。
  32. 　前記シートが変位または荷重を受けたときに電位を発生する、請求項２０～３１のいずれかに記載のシート。
  33. 　前記シートが細胞の活性化または増殖もしくは培養に用いられる、請求項２０～３２のいずれかに記載のシート。
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