WO2021221452A1 - 전이성 전립선 암의 진단 및 예후 예측을 위한 혈중종양세포 기반 바이오 마커 조성물 - Google Patents

전이성 전립선 암의 진단 및 예후 예측을 위한 혈중종양세포 기반 바이오 마커 조성물 Download PDF

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cell adhesion
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한기호
조형석
정재일
변석수
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서울대학교병원
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Definitions

  • the present invention relates to a biomarker composition for diagnosis and prognosis of prostate cancer.
  • Prostate cancer is a cancer that originates from the prostate, and although the majority are slow-growing, aggressive forms of prostate cancer have been reported in some patients. In aggressive prostate cancer, cancer cells from the prostate can spread to other parts of the body, particularly bones and lymph nodes, and symptoms such as pain and difficulty urinating can develop. Prostate cancer is rarely detected because it does not show any symptoms, and most patients die without treatment.
  • the degree of malignancy of cancer is largely divided into a localization stage, which exists only in the cancer site, and a metastasis stage, in which cancer cells are likely to metastasize to other parts.
  • the metastasis stage is hormone-sensitive prostate cancer and hormone It is classified as refractory prostate cancer (castration-resistant prostate cancer).
  • Prostate cancer has hormone-dependent characteristics, so in the case of patients in the early localization stage, the 10-year survival rate is known to be 70-85% when treated with surgical resection (removal of testicular androgens by surgical castration) and radiation therapy. It has been reported that in 40% of cases, recurrence occurs in the form of metastases within 7 to 10 years.
  • Metastatic prostate cancer is treated with androgen deprivation therapy (ADT), which deprives androgens, the male hormone, to induce cancer cell growth and apoptosis. Although there is a response rate, cancer cells that no longer respond to ADT develop in some patients after an average of 18 to 24 months, and patients die within 1 to 2 years. This is called hormone-refractory prostate cancer (castration-resistant prostate cancer).
  • prostate cancer has been known as a cancer that does not respond well to chemotherapy.
  • hormone-refractory prostate cancer the cancer continues to progress without the effects of male hormone interventions and drugs acting on male hormone receptors. It is not showing any effect. Therefore, in order to develop a better treatment strategy for hormone-refractory prostate cancer, it is very necessary to study the mechanism at the molecular level.
  • the present inventors in consideration of this point, in order to develop a biomarker that can accurately diagnose the degree of malignancy of prostate cancer patients, AR (androgen receptor, androgen receptor) in circulating tumor cells (CTC) isolated from cancer patients ), AR-V7 (androgen receptor variant 7, androgen receptor variant 7), EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule), KRT-19 (Cytokeratin 19, cytokeratin 19), PSA (Prostate specific antigen, prostate specific) Antigen) and PSMA (Prostate specific membrane antigen), by confirming that the level of the gene combination is related to the level of malignancy of prostate cancer, the present invention was completed.
  • the present invention relates to a biomarker composition for the diagnosis and prognosis of prostate cancer, and AR (Androgen receptor, androgen receptor), AR-V7 (Androgen receptor variant) in circulating tumor cells (CTC) isolated from a patient.
  • AR Androgen receptor, androgen receptor
  • AR-V7 Androgen receptor variant
  • CTC circulating tumor cells isolated from a patient.
  • 7 androgen receptor variant 7
  • EpCAM Epitophelial cell adhesion molecule
  • KRT-19 Cytokeratin 19, Cytokeratin 19
  • PSA Prostate specific antigen
  • PSMA Prostate specific membrane antigen
  • the present invention is AR (androgen receptor, androgen receptor), AR-V7 (Androgen receptor variant 7, androgen receptor variant 7), EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule, epithelial cell adhesion molecule), KRT-19 (Cytokeratin 19, cytokeratin 19 ), PSA (Prostate specific antigen, prostate specific antigen) and PSMA (Prostate specific membrane antigen, provides a biomarker composition for diagnosis of metastatic prostate cancer comprising a gene combination as an active ingredient).
  • the present invention is AR (androgen receptor, androgen receptor), AR-V7 (Androgen receptor variant 7, androgen receptor variant 7), EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule, epithelial cell adhesion molecule), KRT-19 (Cytokeratin 19, Metastatic containing as an active ingredient an agent capable of detecting the expression level of a gene combination consisting of keratin 19), PSA (Prostate specific antigen), and PSMA (Prostate specific membrane antigen)
  • a kit for diagnosing prostate cancer is provided.
  • the present invention comprises the steps of (a) isolating a blood tumor cell (circulating tumor cell, CTC) isolated from a biological sample; (b) extracting mRNA from the isolated circulating tumor cell (CTC); (c) using the extracted mRNA as a template, AR (androgen receptor, androgen receptor), AR-V7 (Androgen receptor variant 7, androgen receptor variant 7), EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule, epithelial cell adhesion molecule), KRT- Measuring the mRNA level of a gene combination consisting of 19 (Cytokeratin 19, cytokeratin 19), PSA (Prostate specific antigen) and PSMA (Prostate specific membrane antigen): and ( It provides a method for providing information for diagnosis of metastatic prostate cancer, including d) when the mRNA level of the genes is increased compared to a normal person, classifying it as prostate cancer.
  • the present invention is AR (androgen receptor, androgen receptor), AR-V7 (Androgen receptor variant 7, androgen receptor variant 7), EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule, epithelial cell adhesion molecule), KRT-19 (Cytokeratin 19, For prognostic prediction of metastatic potential for prostate cancer containing a gene combination consisting of keratin 19), PSA (Prostate specific antigen) and PSMA (Prostate specific membrane antigen) as an active ingredient A biomarker composition is provided.
  • the present invention is AR (androgen receptor, androgen receptor), AR-V7 (Androgen receptor variant 7, androgen receptor variant 7), EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule, epithelial cell adhesion molecule), KRT-19 (Cytokeratin 19, 19), PSA (Prostate specific antigen) and PSMA (Prostate specific membrane antigen, prostate specific membrane antigen) containing as an active ingredient a formulation that can detect the expression level of the Provided is a kit for predicting the prognosis of metastasis for prostate cancer.
  • the present invention comprises the steps of (a) isolating a blood tumor cell (circulating tumor cell, CTC) isolated from a biological sample; (b) extracting mRNA from the isolated blood tumor cells (CTCs); (c) using the extracted mRNA as a template, AR (androgen receptor, androgen receptor), AR-V7 (Androgen receptor variant 7, androgen receptor variant 7), EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule, epithelial cell adhesion molecule), KRT- Measuring the mRNA level of a gene combination consisting of 19 (Cytokeratin 19, cytokeratin 19), PSA (Prostate specific antigen) and PSMA (Prostate specific membrane antigen): and ( d) when the mRNA level of the genes is increased compared to normal people, classifying it as metastatic prostate cancer; provides an information providing method for predicting the prognosis of metastatic potential for prostate cancer, including.
  • the present invention provides AR (androgen receptor, androgen receptor), AR-V7 (androgen receptor variant 7, androgen receptor variant 7), EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule, epithelial cell adhesion molecule) in a biological sample isolated from a tissue of a subject.
  • KRT-19 (Cytokeratin 19, cytokeratin 19), PSA (Prostate specific antigen), and PSMA (Prostate specific membrane antigen) by measuring the expression level of the gene combination consisting of a first step of selecting a subject; And when the expression level of the gene combination after treatment with the test substance is reduced compared to the disease subject not treated with the test substance, a second step of determining the agent for the prevention or treatment of metastatic prostate cancer; Prevention of metastatic prostate cancer comprising a or a method for screening a therapeutic agent.
  • AR androgen receptor, androgen receptor
  • AR-V7 Androgen receptor variant 7, androgen receptor variant 7
  • EpCAM Epithelial cell adhesion molecule
  • CTC circulating tumor cells isolated from a patient
  • epithelial cell adhesion molecule KRT-19 (Cytokeratin 19, cytokeratin 19)
  • PSA Prostate specific antigen
  • PSMA Prostate specific membrane antigen
  • AR 1 is a cellular level of AR (androgen receptor, androgen receptor), AR-V7 (Androgen receptor variant 7, androgen receptor variant 7), EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule, EpCAM), KRT-19 (Cytokeratin 19, This is a photo showing the results of pre-amplification for analyzing cytokeratin 19), PSA (Prostate specific antigen) and PSMA (Prostate specific membrane antigen, prostate specific membrane antigen) genes.
  • (a) is a 30 cycle PCR result
  • (b) is a 45 cycle PCR result
  • GAPDH and ⁇ -actin are housekeeping genes
  • PTPRC is a white blood cell (WBC) specific gene.
  • Figure 2 is at the cellular level AR (androgen receptor, androgen receptor), AR-V7 (Androgen receptor variant 7, androgen receptor variant 7), EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule, EpCAM), KRT-19 (Cytokeratin 19, It is a graph showing the results of ddPCR for analyzing cytokeratin 19), PSA (Prostate specific antigen, Prostate specific antigen) and PSMA (Prostate specific membrane antigen, prostate specific membrane antigen) genes.
  • (a) is a graph confirming the target gene concentration of the LNCaP cell line for confirming the pre-amplification setup
  • (b) is a graph showing the threshold concentration of the target gene.
  • FIG. 3 is a diagram showing (a) the recovery rate and purification rate of the microfluidic device, (b) co-isolated leukocytes (WBC) and leukocyte depletion when the diagnosis and prognosis prediction method of prostate cancer according to the present invention is applied to a patient model.
  • WBC co-isolated leukocytes
  • This is a graph that analyzes the speed.
  • FIG. 4 is a confocal micrograph showing CTC cells and co-isolated leukocytes (WBCs) isolated from mCRPC patients from the localized stage T2.
  • Green is Pan-cytokeratin positive, indicating CTC, and red is anti-CD45 positive, indicating white blood cells (WBC).
  • CTC isolated circulating tumor cells
  • WBC leukocytes
  • It is a graph measured according to the steps.
  • HD denotes a healthy donor
  • Localized stage denotes a localized stage of cancer
  • mHSPCsm metastatic hormone-sensitive prostate cancer stage
  • mCRPC metastatic castration-resistant prostate cancer stage.
  • FIG. 6 is a graph measuring the detection rate (%) and concentration (copy/ ⁇ l) of cancer-related genes in isolated CTCs according to the clinical stage of cancer.
  • AR androgen receptor, androgen receptor
  • AR-V7 Androgen receptor variant 7, androgen receptor variant 7
  • EpCAM EpCAM
  • KRT -19 Cytokeratin 19, cytokeratin 19
  • PSA Prostate specific antigen, prostate-specific antigen
  • PSMA Prostate specific membrane antigen, prostate-specific membrane antigen
  • HD represents a normal donor
  • Localized stage represents a localized stage of cancer
  • mHSPC represents a metastatic hormone-sensitive prostate cancer stage
  • mCRPC represents a metastatic castration-resistant prostate cancer stage
  • AR Androgen receptor
  • AR-V7 Androgen receptor variant 7, Androgen receptor variant 7
  • EpCAM EpCAM
  • KRT-19 Cytokeratin 19, Cytokeratin 19
  • PSA Prostate specific antigen, prostate specific antigen
  • PSMA Prostate specific membrane antigen, prostate specific membrane antigen
  • the present invention is AR (androgen receptor, androgen receptor), AR-V7 (Androgen receptor variant 7, androgen receptor variant 7), EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule, epithelial cell adhesion molecule), KRT-19 (Cytokeratin 19, cytokeratin 19 ), PSA (Prostate specific antigen, prostate specific antigen) and PSMA (Prostate specific membrane antigen, provides a biomarker composition for diagnosis of metastatic prostate cancer comprising a gene combination as an active ingredient).
  • the metastatic prostate cancer may be metastatic castration-resistant prostate cancer or metastatic hormone-sensitive prostate cancer, and the hormone-sensitive prostate cancer is hormone sensitive stage I to IV.
  • prostate cancer hormone sensitive recurrent prostate cancer, or hormone sensitive metastatic prostate cancer.
  • testosterone blockade therapy is administered as a palliative method. Most patients respond with a decrease in PSA, but eventually the apoptosis process is lost within 2 years and hormone refractory that does not respond to testosterone blockade therapy. progresses to prostate cancer.
  • Hormone refractory prostate cancer refers to a stage in which the testosterone in the blood is reduced to the level of castration, but the prostate cancer progresses biochemically or clinically. In general, it is known that the average time from diagnosis to death of metastatic hormone refractory prostate cancer is 12-18 months.
  • the present invention is AR (androgen receptor, androgen receptor), AR-V7 (Androgen receptor variant 7, androgen receptor variant 7), EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule, epithelial cell adhesion molecule), KRT-19 (Cytokeratin 19, Metastatic containing as an active ingredient an agent capable of detecting the expression level of a gene combination consisting of keratin 19), PSA (Prostate specific antigen), and PSMA (Prostate specific membrane antigen)
  • a kit for diagnosing prostate cancer is provided.
  • the agent capable of measuring the expression level of the gene may be a primer or probe that specifically binds to the gene, but is not limited thereto.
  • the 'expression level of the gene' can be measured using an antisense oligonucleotide, primer pair or probe that specifically binds to the mRNA of the gene, and the agent for measuring the expression of the mRNA is an antisense oligonucleotide specific for the gene.
  • nucleotides, primer pairs, probes, and combinations thereof may be performed by an amplification reaction using one or more oligonucleotide primers hybridized to a nucleic acid molecule encoding a gene or a complement of the nucleic acid molecule, but is not limited thereto.
  • detection of mRNA using a primer may be performed by amplifying a gene sequence using an amplification method such as PCR and then confirming whether amplification is performed by a method known in the art, RT-PCR, competitive RT-PCR, quantitative It may be measured by RT-PCR, RNase protection assay, Northern blot, or DNA chip, but is not limited thereto.
  • the "probe” refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA corresponding to several bases to several hundred bases as long as possible to specifically bind to other than mRNA, and is labeled to check the presence or absence of a specific mRNA and the amount of expression.
  • the probe may be manufactured in the form of an oligonucleotide probe, a single-stranded DNA probe, a double-stranded DNA probe, an RNA probe, or the like. Suitable probe selection and hybridization conditions can be appropriately selected according to techniques known in the art.
  • the "primer” is a nucleic acid sequence having a short free 3' hydroxyl group, a short nucleic acid sequence capable of base pairing with a complementary template and serving as a starting point for template strand copying.
  • the primer is capable of initiating DNA synthesis in the presence of a reagent for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) and four different nucleoside triphosphates in an appropriate buffer and temperature.
  • a reagent for polymerization ie, DNA polymerase or reverse transcriptase
  • PCR conditions and lengths of sense and antisense primers may be appropriately selected according to techniques known in the art.
  • the present invention comprises the steps of (a) isolating a blood tumor cell (circulating tumor cell, CTC) isolated from a biological sample; (b) extracting mRNA from the isolated circulating tumor cell (CTC); (c) using the extracted mRNA as a template, AR (androgen receptor, androgen receptor), AR-V7 (Androgen receptor variant 7, androgen receptor variant 7), EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule, epithelial cell adhesion molecule), KRT- Measuring the mRNA level of a gene combination consisting of 19 (Cytokeratin 19, cytokeratin 19), PSA (Prostate specific antigen) and PSMA (Prostate specific membrane antigen): and ( It provides a method for providing information for diagnosis of metastatic prostate cancer, comprising d) classifying the gene as prostate cancer when the mRNA level of the genes is increased compared to that of a normal person.
  • Separating the blood tumor cells may be separated into an antibody specifically binding to the circulating tumor cells (CTC) and magnetic beads binding to the antibody, and the blood
  • the antibody that specifically binds to a circulating tumor cell may be anti-EpCAM (anti-Epithelial Cell Adhesion Molecule).
  • the present invention is AR (androgen receptor, androgen receptor), AR-V7 (Androgen receptor variant 7, androgen receptor variant 7), EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule, epithelial cell adhesion molecule), KRT-19 (Cytokeratin 19, For prognostic prediction of metastatic potential for prostate cancer containing a gene combination consisting of keratin 19), PSA (Prostate specific antigen) and PSMA (Prostate specific membrane antigen) as an active ingredient A biomarker composition is provided.
  • the present invention is AR (androgen receptor, androgen receptor), AR-V7 (Androgen receptor variant 7, androgen receptor variant 7), EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule, epithelial cell adhesion molecule), KRT-19 (Cytokeratin 19, 19), PSA (Prostate specific antigen) and PSMA (Prostate specific membrane antigen, prostate specific membrane antigen) containing as an active ingredient a formulation that can detect the expression level of the Provided is a kit for predicting the prognosis of metastasis for prostate cancer.
  • the present invention comprises the steps of (a) isolating a blood tumor cell (circulating tumor cell, CTC) isolated from a biological sample; (b) extracting mRNA from the isolated blood tumor cells (CTCs); (c) using the extracted mRNA as a template, AR (androgen receptor, androgen receptor), AR-V7 (Androgen receptor variant 7, androgen receptor variant 7), EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule, epithelial cell adhesion molecule), KRT- Measuring the mRNA level of a gene combination consisting of 19 (Cytokeratin 19, cytokeratin 19), PSA (Prostate specific antigen) and PSMA (Prostate specific membrane antigen): and ( d) when the mRNA level of the genes is increased compared to normal people, classifying it as metastatic prostate cancer; provides an information providing method for predicting the prognosis of metastatic potential for prostate cancer, including.
  • Separating the blood tumor cells may be separated into an antibody specifically binding to the circulating tumor cells (CTC) and magnetic beads binding to the antibody, and the blood
  • the antibody that specifically binds to a circulating tumor cell may be anti-EpCAM (anti-Epithelial Cell Adhesion Molecule).
  • the step of isolating a circulating tumor cell is an antibody and magnetic beads that specifically bind to a circulating tumor cell (CTC) by injecting a biological sample separated from the subject into one device.
  • CTC circulating tumor cell
  • the device may be a disposable device, but is not limited thereto.
  • the biological sample isolated from the subject is specifically a cell line separated from the subject, a histological slide, a biopsy, formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue, body fluid, feces, urine , plasma, serum, whole blood, isolated blood cells or blood, and more specifically, blood, but is not limited thereto.
  • FFPE formalin-fixed paraffin embedded
  • the present invention provides AR (androgen receptor, androgen receptor), AR-V7 (androgen receptor variant 7, androgen receptor variant 7), EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule, epithelial cell adhesion molecule) in a biological sample isolated from a tissue of a subject.
  • KRT-19 (Cytokeratin 19, cytokeratin 19), PSA (Prostate specific antigen), and PSMA (Prostate specific membrane antigen) by measuring the expression level of the gene combination consisting of a first step of selecting a subject; And when the expression level of the gene combination after treatment with the test substance is reduced compared to the disease subject not treated with the test substance, a second step of determining the agent for the prevention or treatment of metastatic prostate cancer; Prevention of metastatic prostate cancer comprising a or a method for screening a therapeutic agent.
  • CTCs circulating tumor cells
  • CTCs circulating tumor cells
  • Peripheral blood samples obtained from patients and healthy donors were stored in Vacutainer tubes (10 ml volume, 367525, BD Vacutainer ® ) at 4°C with the addition of the anticoagulant EDTA (K2E, 18.0 mg), and the experiment was performed within 12 hours after collection. was used for The blood sample was first treated with 1.119 g ml Ficoll solution (Histopaque-1119, Sigma-Aldrich), and then subjected to density gradient centrifugation at 700 x g for 30 minutes to remove red blood cells (RBCs). It was transferred to a 50 mL conical tube, and 10 ml ice-cold PBS containing 0.2% BSA was added, followed by washing at 200 x g condition for 10 minutes.
  • Vacutainer tubes 10 ml volume, 367525, BD Vacutainer ®
  • K2E anticoagulant EDTA
  • prostate cancer cell line LNCaP cells (clone FGC, ATCC® CRL-1740) were stained with a membrane-permeable green fluorescent nucleic acid dye (SYTO 13, Invitrogen), and blood nuclear cells were stained with a red fluorescent nucleic acid dye (SYTO). 64, Invitrogne).
  • a disposable microfluidic device was used to separate circulating tumor cells (CTCs) from the sample.
  • the device setup was first, by placing a reusable substrate on two stacked neodymium-iron-boron (Nd-Fe-B) permanent magnets, and by placing a disposable microfluidic superstrate at -50 using a vacuum air jet system.
  • the reused substrates were attached to align with a kPa pressure.
  • CTC circulating tumor cells
  • the prefabricated disposable CTC- ⁇ Chip consists of a disposable superstrate and a reusable functional substrate.
  • the disposable superstrate has two inlets, two outlets and a vacuum trench surrounding the microchannel.
  • the reusable substrate contains a magnetic wire that creates a strong magnetic field in the microchannel, a key function of the CTC isolation mechanism. Disposable superstrate and reusable substrates can be simply assembled and disassembled using vacuum applications.
  • a blood sample and phosphate-buffered saline (PBS) containing 0.2% bovine serum albumin (BSA) were injected into two inlets (inlet #1 for sample and inlet #2 for PBS solution).
  • PBS phosphate-buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • CTCs were counted through image analysis.
  • the isolated CTCs were fixed with 100 ⁇ l of 4% paraformaldehyde and stained with a membrane-permeable nucleic acid fluorescent dye (DAPI, Invitrogen) and anti-CD45-Alexa 647 (Biolegend) antibody for 30 minutes. Then, 100 ⁇ l of 0.2% Triton X-100 (AMRESCO) was treated for 10 minutes, and anti-pan-cytokeratin-Alexa 488 (eBioscience) antibody was treated for 30 minutes.
  • fluorescently stained samples were observed with a confocal microscope (LSM800; Carl Zeiss).
  • CTC confirmed the stained area and morphological characteristics such as nuclear size and cytoplasmic region. If there is anti-pan-cytokeratin staining and has a round shape and a nucleus larger than a leukocyte, it was selected by CTC. Pan-cytokeratin-positive cells were considered CTCs even if the size of the nucleus was the same as or smaller than that of normal cells. In addition, green fluorescence staining, nuclei with a size of ⁇ 9 ⁇ m and cell diameters with a size of ⁇ 15 ⁇ m were considered CTCs. Lobes with CD45 red fluorescence and multiple nuclei were considered leukocytes. Even if they were not stained with CD45, they were judged by their nuclear morphology and cell size. In particular, cells with double positive staining were considered leukocytes.
  • mRNA was synthesized with AccuPower CycleScript RT PreMix (dT20) (Bioneer) in which 10 ⁇ l of 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC) was dissolved. After adding mRNA to the RT premix solution, the reaction mixture was incubated in a thermal cycle at 42° C. for 90 minutes, followed by an RNase inactivation step at 95° C. for 5 minutes.
  • dT20 AccuPower CycleScript RT PreMix
  • DEPC diethylpyrocarbonate
  • An mRNA-based-cancer-associated target gene was designed for genomic analysis of gene expression levels in patients with prostate cancer.
  • AR and AR-V7 associated with androgen hormones were selected to validate males and variants.
  • Endpoint PCR and multiplex PCR were used to evaluate each gene.
  • a pre-amplification primer set was designed to analyze selected AR, AR-V7, EpCAM, KRT-19, PSA and PSMA genes to identify prostate cancer patients.
  • the primer sets used for pre-amplification are shown in Table 2 below.
  • cDNA was synthesized in 2000 LNCaP cells. White blood cells segregated together were measured using a specific marker gene, PTPRC (CD-45). Two templates and a single PCR master mix (AccuPower HotStart PCR PreMix; Bioneer) were mixed with each gene primer set (10 pmol/ ⁇ l) at the same ratio to make a final 100 nM, and the gene was evaluated according to the manufacturer's protocol. . In the case of multiplex PCR, the same amount of primer set was added to the multiplex PCR premix (AccuPower Multiplex PCR PreMix; Bioneer) and the cDNA template, and then the gene was evaluated according to the manufacturer's protocol (Fig. 1).
  • NC negative control
  • WBC leukocytes
  • GPDH housekeeping genes
  • ⁇ -actin housekeeping genes
  • PTPRC PTPRC
  • the cDNA template of 2000 LNCaP cells was multiplexed pre-amplified with 18 cycles.
  • the ⁇ -actin and GAPDH genes were used as housekeeping genes, the PTPRC gene was used to select a negative control (leukocyte), and 6 genes (AR, AR-V7, EpCAM, KRT-19, PSA, PSMA) were was used to evaluate the samples.
  • the 10-fold serially diluted pre-amplification samples were amplified by PCR Super Mix (QX200 ddPCR EvaGreen Supermix, BioRad) together with the target gene primer sets of Table 3 above.
  • PCR mixtures were placed in a droplet generating cartridge (DG8 Cartridges for QX100/QX200 Droplet Generator, Bio-Rad) with 70 ⁇ l of Droplet Generation Oil (Droplet Generation Oil for EvaGreen, Bio-Rad). It was loaded and reacted with a droplet generator (QX200® Droplet Generator, Bio-Rad). Before PCR run, the resulting droplet was transferred to a 96-well PCR plate and sealed using a thermal sealer (PX1 PCR Plate Sealer, Bio-Rad) to prevent evaporation.
  • DG8 Cartridges for QX100/QX200 Droplet Generator, Bio-Rad Droplet Generation Oil for EvaGreen, Bio-Rad
  • QX200® Droplet Generator Bio-Rad
  • the resulting droplet was transferred to a 96-well PCR plate and sealed using a thermal sealer (PX1 PCR Plate Sealer, Bio-Rad) to prevent evaporation.
  • the threshold value of the AR gene is 14500
  • the threshold value of the AR-V7 gene is 15345
  • the threshold value of the EpCAM gene is 16000 - 19000
  • the threshold value of the KRT-19 gene is 11000 - 14000
  • the threshold value of the PSA gene is 14000 - 18000
  • the threshold for the PSMA gene is 16000 - 19000.
  • the original copy number concentrations were 74.3 ⁇ l in AR, 0.62 ⁇ l in AR-V7, 87.3 ⁇ l in EpCAM, 19.2 ⁇ l in KRT-19, 1128 ⁇ l in PSA, 284 ⁇ l in PSMA, and 1657 ⁇ l in GAPDH. It was shown that the pre-amplified copy number exceeded the original copy number, and saturated at 1/100 dilution samples in PSA, PSMA, GAPDH where the original copy number exceeded 100. All 1/1000 dilution samples showed a linear decrease.
  • the threshold copy number is 0.13 copies/ ⁇ l for AR, 0.28 copies/ ⁇ l for AR-V7, 0.17 copies/ ⁇ l for EpCAM, 0.11 copies/ ⁇ l for KRT-19, 0.01 copies/ ⁇ l for PSA, 0.23 copies/ ⁇ l for PSMA. ⁇ l.
  • the pre-amplified cDNA template was diluted 1/2, 1/5, 1/10, and 2.5 ⁇ l of each gene was used for the primer set of the target gene shown in Table 3 above (forward). 5 pmole/ ⁇ l of primer and 5 pmole/ ⁇ l of reverse primer) were added to the supermix (QX200 ddPCR EvaGreen Supermix, Bio-Rad), followed by ddPCR.
  • the AR gene was found to decrease in proportion to the dilution factor from 14206 to 17000, the AR-V7 gene was shown to be 17645 at a high concentration, and the EpCAM gene was found to be 16008 to 16662 positive in all samples. It expressed a signal and was shown to decrease linearly with the dilution factor, the KRT-19 gene showed a linear decrease with concentration only in mCRPC patients with 11751 - 15898, and the PSA gene was 14370 - 16553 with the concentration only in mCRPC patients. was shown to decrease linearly according to Thresholds of the detected amplitude cutoff values were applied to all patient samples.
  • the performance and optimized detachable conditions of the disposable microfluidic device were evaluated.
  • As a cancer patient model approximately 100 LNCaP cell lines were inoculated into 5 mL of healthy blood.
  • a disposable microfluidic device was prepared on a stack of two neodymium permanent magnets generating an external magnetic flux of 0.2 T and applied in the horizontal direction of the microfluidic channel. During isolation, LNCaP cells were dissociated by CTC outlet and counted using fluorescence microscopy to evaluate recovery.
  • the collected samples were counted for LNCaP cells and co-isolated white blood cells (WBC) under a fluorescence microscope to determine the purity and consumption rate.
  • WBC white blood cells
  • Various samples were evaluated in 3 replicates at 1, 2 and 4 ml/h flow rates to determine the optimal flow rate for the sample.
  • the recovery rate was 95.13 ⁇ 1.20% at 1 ml/h, 93.6 ⁇ 0.79% at 2 ml/h, and 84 ⁇ 7.00% at 4 ml/h, showing an average of 90.91%. Because the white blood cells killed during sample preparation non-specifically bind to the immunomagnetic beads and aggregate, the white blood cells co-separate from the CTCs, and the number of white blood cells per 5 ml blood sample ranged from 238 to 786 cells.
  • the mean number of contamination of leukocytes was 660 cells/5ml at 1 ml/h, 667 cells/5ml at 2 ml/h, and 374.33 cells/5ml at 4 ml/h, and the mean number of leukocytes was 567.11 cells/5ml. (113.42 cells/ml). That is, the average leukocyte depletion rate is measured to be 44083.16-fold (4.64 log), assuming that 5 ⁇ 10 6 leukocyte cells exist per ml of blood.
  • the number of co-separated leukocytes decreases, 13.09% at 1 ml/h, 13.93% at 2 ml/h, and 19.77% at 4 ml/h, with an average of 15.60%.
  • mHSPC metalhydroxy-sensitive prostate cancer
  • mCRPC metal castration-resistant prostate cancer
  • Samples and buffers were introduced at a flow rate of 2 ml/h, which is the optimized condition of the process.
  • CTC isolation the collected samples were subjected to immunostaining. Thereafter, CTCs and leukocytes were distinguished by analyzing fluorescence and morphological specificity ( FIG. 4 ). In order to quantify the isolated CTC and remaining cells, each enumerated cell number was divided by the isolated blood volume, and finally counted to a volume of 1 mL for analysis.
  • the average number of CTCs and leukocytes in healthy donors (HD) was 0.94 CTCs/mL and 602.23 WBCs/mL.
  • the mean numbers of isolated CTCs and leukocytes in the localization phase were 6.58 CTCs/mL and 514.41 WBCs/mL.
  • the mean numbers of CTCs and leukocytes were 16.77 CTCs/mL and 717.64 WBCs/mL in the mHSPC stage and 31.02 CTCs/mL and 627.62 WBCs/mL in the mCRPC stage.
  • the average number of CTCs in the metastatic stage was 27.55 CTCs/mL, which was 4.17 times higher than that in the localization stage.
  • the level of PSA protein in the blood increased as the cancer progressed to malignancy.
  • Purity rate is calculated in the process of isolating CTCs and leukocytes and is defined as the ratio of cytokeratin-positive cells to CD45-positive cells. As shown in FIG. 5 , the purification rate was 0.17% in healthy donors (HD), 2.09% in the localization stage, 3.79% in the mHSPC stage, and 6.71% in the mCRPC stage. It was found that the purification rate also increases as the number of CTCs increases as the cancer progresses at each stage.
  • the number of isolated white blood cells was 5.25 times higher in the patient's blood than in the blood of a healthy donor, and the purification rate was 3.53 times lower.
  • the detection rate of AR a gene related to androgen hormone treatment
  • HD healthy donors
  • 76% in the localization stage 76% in the mHSPC stage
  • 100% in the mCRPC stage was detected as The expression level of AR increased as the advanced stage of cancer became malignant.
  • the detection rate of AR-V7 (androgen receptor variant 7, androgen receptor variant 7) was 11.1% in the mHSPC stage and 28.57% in the mCRPC stage, and the expression level was 7.19 times higher in the mCRPC stage than in the mHSPC stage.
  • EpCAM epithelial cell adhesion molecule
  • KRT-19 Cytokeratin 19, cytokeratin 19
  • AR androgen receptor, androgen receptor
  • AR-V7 androgen receptor variant 7, androgen receptor variant 7
  • EpCAM Epidermal cell adhesion molecule, epithelial cell adhesion molecule
  • KRT-19 Cytokeratin 19, cytokeratin 19
  • PSA Prostate Specific Antigen
  • PSMA Prostate Specific Membrane Antigen
  • AR androgen receptor, androgen receptor
  • AR-V7 Androgen receptor variant 7, androgen receptor variant 7
  • EpCAM Epidermal cell adhesion molecule, epithelial cell adhesion molecule
  • KRT-19 Cytokeratin 19, cytokeratin 19
  • PSA Prostate specific antigen
  • PSMA Prostate specific membrane antigen
  • Blood PSA protein is used as a diagnostic and prognostic marker for prostate cancer in the blood circulation system.
  • the PSA protein is highly expressed in the localized prostate tumor stage and is an indicator of the patient's prognosis in the overall cancer stage.
  • the PSA gene concentration of CTC and the clinical blood PSA concentration in the patient were shown as a linear plot at the low serum level of the patient.
  • PSA concentrations and gene levels were lower than at risk levels.
  • the blood PSA level increased with risk and was found to be related.

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Abstract

본 발명은 전립선 암의 진단 및 예후 예측을 위한 바이오 마커 조성물에 관한 것으로, 환자로부터 분리된 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)에서 AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원)로 구성되는 유전자 조합의 검출율 및 발현 수준이 전립선 암의 악성화 수준과 관련성이 있다는 것을 확인함으로써, 상기 유전자 조합을 전립선 암 진단용 바이오 마커 및 전립선 암의 예후예측용 바이오 마커로 제공한다.

Description

전이성 전립선 암의 진단 및 예후 예측을 위한 혈중종양세포 기반 바이오 마커 조성물
본 발명은 전립선 암의 진단 및 예후 예측을 위한 바이오 마커 조성물에 관한 것이다.
전립선 암은 전립선에서 발생하는 암으로 대다수는 느리게 성장하지만, 일부 환자에게서 공격적인 형태의 전립선 암이 보고되었다. 공격적인 전립선 암은 전립선으로부터 암세포가 신체의 다른 부분, 특히 골 및 림프절로 전이할 수 있으며, 통증, 배뇨의 어려움 등의 증상이 발병할 수 있다. 전립선 암은 증상이 나타나지 않아 검출되는 경우는 매우 드물며, 대부분의 환자는 치료를 받지 못하고 사망하는 경우가 많다.
전립선 암을 관리하는 방법은 암이 진행되는 악성화 정도에 따라 결정된다. 암의 악성화 정도는 크게는 암이 발병한 부분에만 존재하는 국소화 단계와 암세포가 다른 부분으로 전이할 가능성이 있는 전이 단계로 구분되며, 전이 단계는 호르몬 민감성 전립선 암(hormone-sensitive prostate cancer) 및 호르몬 불응성 전립선 암(castration-resistant prostate cancer)으로 구분된다.
전립선 암은 호르몬 의존적인 특징을 가지고 있어서 초기 국소화 단계의 환자의 경우, 외과적 절제술(removal of testicular androgens by surgical castration) 및 방사선 요법으로 치료시 10년 생존율이 70~85% 정도로 알려져 있지만, 10~40%에서 7~10년 이내에 전이 형태로 재발이 일어나는 것으로 보고되었다. 전이성 전립선암은 남성호르몬인 안드로겐을 박탈하여 암세포의 성장저하 및 세포사멸을 유도하는 남성호르몬 박탈요법(androgen deprivation therapy, ADT)으로 치료하는데, 이 때 대부분의 환자가 초기에는 80~90%의 높은 반응률을 보이지만 평균 18 내지 24개월 후에는 일부 환자에서 더 이상 ADT에 반응하지 않는 암 세포가 발생하게 되며 환자는 1~2년 이내에 사망하는 것으로 나타났다. 이를 호르몬 불응성 전립선암(castration-resistant prostate cancer)이라 일컫는다.
역사적으로 전립선암은 항암화학요법(chemotherapy)에 잘 반응하지 않는 암으로 알려져 있다. 특히, 호르몬 불응성 전립선암에서는 더 이상 남성호르몬 중재와 남성호르몬 수용체에 작용하는 약제들의 효과가 없이 암이 계속 진행을 하기 때문에, 많은 항암화학요법을 전립선암 치료에 이용하고자 하는 노력에도 불구하고 뚜렷한 효과를 보이지 못하고 있는 상태이다. 따라서 호르몬 불응성 전립선암의 더 나은 치료전략을 개발하기 위해선 분자 수준에서의 기전 연구가 매우 필요한 상황이다.
본 발명자들은 이와 같은 점을 감안하여 전립선 암 환자의 악성화 정도를 정확하게 진단할 수 있는 바이오 마커를 개발하고자, 암 환자로부터 분리된 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)에서 AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원)로 구성되는 유전자 조합이 수준이 전립선 암의 악성화 수준과 관련성이 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 전립선 암의 진단 및 예후 예측을 위한 바이오 마커 조성물에 관한 것으로, 환자로부터 분리된 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)에서 AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원)로 구성되는 유전자 조합의 검출율 및 발현 수준이 전립선 암의 악성화 수준과 관련성이 있다는 것을 확인함으로써, 상기 유전자 조합을 전립선 암 진단용 바이오 마커 및 전립선 암의 예후예측용 바이오 마커로 제공하는 것이다.
본 발명은 AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원)로 구성되는 유전자 조합을 유효성분으로 포함하는 전이성 전립선 암의 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원)로 구성되는 유전자 조합의 발현 수준을 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 함유하는 전이성 전립선 암의 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 생물학적 시료로부터 분리된 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)로부터 mRNA를 추출하는 단계; (c) 상기 추출된 mRNA를 주형으로 하여 AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원)로 구성되는 유전자 조합의 mRNA 수준을 측정하는 단계: 및 (d) 상기 유전자들의 mRNA 수준이 정상인에 비하여 증가되어 있을 때, 전립선 암으로 분류하는 단계;를 포함하는 전이성 전립선 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원)로 구성되는 유전자 조합을 유효성분으로 포함하는 전립선 암에 대한 전이 가능성의 예후예측용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원)로 구성되는 유전자 조합을의 발현 수준을 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 함유하는 전립선 암에 대한 전이 가능성의 예후예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 생물학적 시료로부터 분리된 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 혈중 종양 세포(CTC)로부터 mRNA를 추출하는 단계; (c) 상기 추출된 mRNA를 주형으로 하여 AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원)로 구성되는 유전자 조합의 mRNA 수준을 측정하는 단계: 및 (d) 상기 유전자들의 mRNA 수준이 정상인에 비하여 증가되어 있을 때, 전이성 전립선 암으로 분류하는 단계;를 포함하는, 전립선 암에 대한 전이 가능성의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 대상체의 조직에서 분리된 생물학적 시료에서 AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원)로 구성되는 유전자 조합의 발현 수준을 측정하여 질환 대상체를 선별하는 제1단계; 및 시험물질을 처리한 후 상기 유전자 조합의 발현 수준이 시험물질을 처리하지 않은 질환 대상체에 비해 감소하면 전이성 전립선 암의 예방 또는 치료용 제제로 판단하는 제2단계;를 포함하는 전이성 전립선 암의 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 환자로부터 분리된 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)에서 AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원)로 구성되는 유전자 조합의 검출율 및 발현 수준이 전립선 암의 악성화 수준과 관련성이 있다는 것을 확인함으로써, 상기 유전자 조합을 전립선 암 진단용 바이오 마커 및 전립선 암의 예후예측용 바이오 마커로 제공할 수 있다.
도 1은 세포 수준에서 AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원) 유전자를 분석하기 위한 사전 증폭(pre-amplification) 결과를 나타내는 사진이다. (a)는 30 사이클 PCR 결과이고, (b)는 45 사이클 PCR 결과이고, GAPDH 및 β-actin은 하우스 키핑 유전자이고, PTPRC는 백혈구(WBC) 특이적 유전자이다.
도 2는 세포 수준에서 AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원) 유전자를 분석하기 위한 ddPCR의 결과를 나타내는 그래프이다. (a)는 사전 증폭(pre-amplification) 셋업을 확인하기 위한 LNCaP 세포주의 표적 유전자 농도를 확인한 그래프이고, (b)는 표적 유전자의 역치 농도를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 전립선 암의 진단 및 예후 예측 방법을 환자 모델에 적용하였을 때, (a) 미세 유체 장치의 회복 속도 및 정제율, (b) 공-분리된 백혈구(WBC) 및 백혈구 고갈 속도를 분석한 그래프이다.
도 4는 국소화 단계(localized stage) T2 부터 mCRPC 환자로부터 분리된 CTC 세포 및 공-분리된 백혈구(WBC)를 확인하 공 초점 현미경 사진이다. 녹색은 Pan-cytokeratin 양성으로, CTC를 나타내며, 적색은 anti-CD45 양성으로 백혈구(WBC)를 나타낸다.
도 5은 환자 혈액 mL당 분리된 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC) 및 백혈구(WBC)의 수, 혈중 PSA 농도(ng/mL), 환자 혈액 mL당 분리된 CTC의 정제율을 암의 임상 단계에 따라 측정한 그래프이다. HD는 건강한 기증자, Localized stage는 암의 국소화 단계, mHSPCsms 전이성 호르몬 민감성 전립선 암(metastatic hormone-sensitive prostate cancer) 단계, mCRPC는 전이성 호르몬 불응성 전립선 암(metastatic castration-resistant prostate cancer) 단계를 나타낸다.
도 6은 분리된 CTC에서 암 관련 유전자의 검출율(%) 및 농도(카피/μl)를 암의 임상 단계에 따라 측정한 그래프이다. (a) AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), (b) AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), (c) EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), (d) KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), (e) PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 (f) PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원)를 나타낸다. HD는 건강한 기증자(n=5), Localized stage는 암의 국소화 단계(n=25), mHSPC는 전이성 호르몬 민감성 전립선 암(metastatic hormone-sensitive prostate cancer) 단계(n=9), mCRPC는 전이성 호르몬 불응성 전립선 암(metastatic castration-resistant prostate cancer) 단계(n=28)를 나타낸다.
도 7은 정상 기증자 및 전립선 암 환자에서 암 관련 유전자의 발현 수준(카피/농도)을 측정한 그래프이다. HD는 정상 기증자, Localized stage는 암의 국소화 단계, mHSPC는 전이성 호르몬 민감성 전립선 암(metastatic hormone-sensitive prostate cancer) 단계, mCRPC는 전이성 호르몬 불응성 전립선 암(metastatic castration-resistant prostate cancer) 단계를 나타내며, AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원) 유전자의 발현 수준을 측정하였다.
도 8은 혈중 PSA 수준(ng/μl) 및 mRNA 농도(카피/μl)를 암의 임상 단계에 따라 측정한 그래프이다. (a) Localized stage는 암의 국소화 단계(n=7, serum PSA (R2=0.79 및 ρ=0.91), PSA gene (R2=-0.17 및 ρ=-0.16), (b) mHSPC는 전이성 호르몬 민감성 전립선 암(metastatic hormone-sensitive prostate cancer) 단계(n=5, serum PSA (R2=0.83 및 ρ=0.93), PSA gene (R2=0.56 및 ρ=0.82), (c) mCRPC는 전이성 호르몬 불응성 전립선 암(metastatic castration-resistant prostate cancer) 단계(n=25, serum PSA (R2=0.91 및 ρ=0.96), PSA gene (R2=0.53 및 ρ=0.74))를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원)로 구성되는 유전자 조합을 유효성분으로 포함하는 전이성 전립선 암의 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
상기 전이성 전립선 암은 전이성 호르몬 불응성 전립선 암(metastatic castration-resistant prostate cancer) 또는 전이성 호르몬 민감성 전립선 암(metastatic hormone-sensitive prostate cancer)일 수 있고, 상기 호르몬 민감성 전립선 암은 호르몬 민감성 단계 I 내지 IV의 전립선 암, 호르몬 민감성 재발성 전립선 암, 또는 호르몬 민감성 전이성 전립선 암일 수 있다. 전이성 전립선암의 경우 고식적인 방법으로 남성호르몬 차단 요법을 시행하는데 대부분의 환자들에서 PSA가 감소하면서 반응을 보이지만 결국 2년 내에 세포고사 과정의 상실이 생기고 남성 호르몬 차단요법에 반응하지 않는 호르몬 불응성 전립선암으로 진행하게 된다. 호르몬 불응성 전립선 암은 혈중 테스토스테론이 거세 수준으로 감소되어 있으나 전립선암이 생화학적 혹은 임상적으로 진행하는 단계를 말하는데, PSA의 증가가 나타나는 생화학적 재발이 골 전이 등의 임상적 진행보다 수개월 선행되어 나타나며, 일반적으로 전이성 호르몬 불응성 전립선 암의 진단으로부터 사망까지는 평균 12-18개월로 알려져 있다.
또한, 본 발명은 AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원)로 구성되는 유전자 조합의 발현 수준을 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 함유하는 전이성 전립선 암의 진단용 키트를 제공한다.
상기 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 '유전자의 발현 수준'은 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브를 이용하여 측정할 수 있으며, 상기 mRNA의 발현 여부를 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍, 프로브 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 즉, 핵산의 검출은 유전자를 암호화하는 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자의 상보물에 하이브리드화되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 증폭반응에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예컨대, 프라이머를 이용한 mRNA의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 유전자 서열을 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 증폭 여부를 확인함으로써 수행될 수 있으며, RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 정량적 RT-PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블롯, 또는 DNA 칩에 의해 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 "프로브"는 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
상기 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 생물학적 시료로부터 분리된 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)로부터 mRNA를 추출하는 단계; (c) 상기 추출된 mRNA를 주형으로 하여 AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원)로 구성되는 유전자 조합의 mRNA 수준을 측정하는 단계: 및 (d) 상기 유전자들의 mRNA 수준이 정상인에 비하여 증가되어 있을 때, 전립선 암으로 분류하는 단계;를 포함하는 전이성 전립선 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 을 제공한다.
상기 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)를 분리하는 단계는 상기 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)에 특이적으로 결합하는 항체 및 상기 항체에 결합되는 자성 비드로 분리할 수 있으며, 상기 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)에 특이적으로 결합하는 항체는 anti-EpCAM(anti-Epithelial Cell Adhesion Molecule)일 수 있다.
또한, 본 발명은 AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원)로 구성되는 유전자 조합을 유효성분으로 포함하는 전립선 암에 대한 전이 가능성의 예후예측용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원)로 구성되는 유전자 조합을의 발현 수준을 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 함유하는 전립선 암에 대한 전이 가능성의 예후예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 생물학적 시료로부터 분리된 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 혈중 종양 세포(CTC)로부터 mRNA를 추출하는 단계; (c) 상기 추출된 mRNA를 주형으로 하여 AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원)로 구성되는 유전자 조합의 mRNA 수준을 측정하는 단계: 및 (d) 상기 유전자들의 mRNA 수준이 정상인에 비하여 증가되어 있을 때, 전이성 전립선 암으로 분류하는 단계;를 포함하는, 전립선 암에 대한 전이 가능성의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
상기 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)를 분리하는 단계는 상기 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)에 특이적으로 결합하는 항체 및 상기 항체에 결합되는 자성 비드로 분리할 수 있으며, 상기 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)에 특이적으로 결합하는 항체는 anti-EpCAM(anti-Epithelial Cell Adhesion Molecule)일 수 있다.
구체적으로 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)를 분리하는 단계는 대상체로부터 분리된 생물학적 시료를 하나의 장치에 투입하여 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)에 특이적으로 결합하는 항체와 자성 비드를 순차적으로 반응시켜 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)를 분리할 수 있으며, 상기 장치는 일회용성 장치일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 대상체로부터 분리된 생물학적 시료는 구체적으로 대상체로부터 분리되는 세포주, 조직학적 슬라이드, 생검체, 포르말린-고정된 파라핀-포매(formalin fixed paraffin embedded, FFPE) 조직, 신체 유체 (body fluid), 대변, 소변, 혈장, 혈청, 전혈, 단리된 혈액 세포 또는 혈액일 수 있으며, 보다 더 구체적으로는 혈액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 대상체의 조직에서 분리된 생물학적 시료에서 AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원)로 구성되는 유전자 조합의 발현 수준을 측정하여 질환 대상체를 선별하는 제1단계; 및 시험물질을 처리한 후 상기 유전자 조합의 발현 수준이 시험물질을 처리하지 않은 질환 대상체에 비해 감소하면 전이성 전립선 암의 예방 또는 치료용 제제로 판단하는 제2단계;를 포함하는 전이성 전립선 암의 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실험예 및 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실험예 및 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실험예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실험예 및 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예> 실험 재료 및 방법
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 실험 설계
본 발명에 따른 유전자 조합이 전립선 암의 진단 및 예후 예측을 위한 바이오 마커인지를 확인하기 위해 다음 3 단계로 실험을 설계하였다.
1) 샘플 혈액을 밀도 구배 원심 분리를 이용하여 적혈구(red blood cells, RBC)를 제거하고, 항-EpCAM(epithelial cell adhesion molecule) 항체로 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)를 표적한 후, 나노 입자 크기의 자성 비드를 상기 항-EpCAM(epithelial cell adhesion molecule) 항체와 결합시키는 단계;
2) 일회용 미세 유체 장치(disposable microfluidic device)를 이용하여 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)를 분리하는 단계; 및
3) 면역 염색 방법으로 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)를 정렬하고, droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR)을 이용하여 암 관련 유전자를 검출하는 단계.
2. 환자
2018년 3월부터 2019년 5월(14개월 동안) 사이에 전립선 암 환자 56명 건강한 기증자 5명을 모집하였으며, 암의 국소화 단계(localized stage) 25개, mHSPC 단계(전이성 호르몬 불응성 전립선 암, metastatic castration-resistant prostate cancer) 9개, 및 mCRPC 단계(전이성 호르몬 민감성 전립선 암, metastatic hormone-sensitive prostate cancer) 28개를 포함하는 말초 혈액 샘플 62개를 수집하였다. 모든 샘플은 해운대백병원(Haeundae-Paik Hospital, HPIRB 2018-01-005-004) 및 부산백병원(Busan-Paik Hospital, 180142)으로부터 기관심사위원의 승인을 받았으며, 특성 및 임상 정보는 하기 표 1과 같다.
Figure PCTKR2021005355-appb-T000001
3. 샘플 준비
환자 및 건강한 기증자로부터 수득한 말초 혈액 샘플은 항응고제 EDTA (K2E, 18.0 mg)를 첨가하여 4℃ 조건으로 Vacutainer tubes (10 ml volume, 367525, BD Vacutainer®)에 보관하였으며, 수집된 후 12 시간 이내에 실험에 사용되었다. 혈액 샘플은 먼저 1.119 g ml Ficoll 용액(Histopaque-1119, Sigma-Aldrich)을 처리한 후, 700 xg 조건으로 30분 동안 밀도 구배 원심분리하여 적혈구(Red blood cell, RBC)를 제거하였다. 50 mL 코니칼 튜브에 옮기고 0.2% BSA가 함유된 10 ml ice-cold PBS를 첨가하여 200 xg 조건으로 10분 동안 세척하였다. 1.5ml microcentrifuge 튜브에 옮긴 후, 0.2% BSA가 함유된 1 ml ice-cold PBS로 세척하고, 200 μl 0.2% BSA가 함유된 1 ml ice-cold PBS로 재현탁하였다. 재조사의 지침(STEMCELL Technologies)에 따라 얼음 위에서 -항-EpCAM(epithelial cell adhesion molecule) 항체와 60분 동안 반응시키고, 나노 입자 크기의 자성 비드와 90분 동안 반응시켰다. 이후, 샘플을 0.2% BSA가 함유된 ice-cold PBS 800 μl (4 배 부피)로 희석하였다. 분석 실험을 위해, 전립선 암 세포주인 LNCaP 세포(clone FGC, ATCC® CRL-1740쪠)는 막-투과성 녹색 형광 핵산 염료(SYTO 13, Invitrogen)로 염색하고, 혈액 핵 세포는 적색 형광 핵산 염료(SYTO 64, Invitrogne)로 염색하였다.
4. 장치 제작 및 설정
상기 샘플로부터 이용하여 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)를 분리하기 위해서 일회용 미세 유체 장치(disposable microfluidic device)를 사용하였다. 장치 세팅은 먼저, 재사용 가능한 기판을 두 개의 적층된 네오디뮴 철 붕소(neodymium-iron-boron, Nd-Fe-B) 영구자석에 배치하고, 일회용 미세유체 슈퍼스트레이트를 진공 공기 분사 시스템을 이용하여 -50 kPa 압력으로 재사용한 기판이 정렬되도록 부착하였다.
5. 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC) 분리
조립형 일회용 CTC-μChip은 일회용 슈퍼스트레이트 및 재사용 가능한 기능성 기판으로 구성된다. 일회용 슈퍼스트레이트는 마이크로 채널를 둘러싼 2개의 입구, 2개의 콘센트 및 진공 트렌치를 갖는다. 재사용 가능한 기판은 CTC 절연 메커니즘의 주요 기능인 마이크로채널에 강한 자기장을 생성하는 자성 와이어를 포함한다. 일회용 슈퍼스트레이트 및 재사용 가능한 기판은 진공 응용 프로그램을 사용하여 간단히 조립 및 분해할 수 있다.
장치를 조립한 후, 혈액 샘플과 0.2% BSA(bovine serum albumin) 함유한 PBS(phosphate-buffered saline, PBS)을 각각 두 개의 입구(입구 #1에는 샘플, 입구 #2에는 PBS 용액)에 주입하였다. 균일한 외부 자기장이 강자성선에 적용될 때, 높은 밀도의 자기장이 마이크로 채널의 전체 영역을 통해 생성된다. 이어서 CTC는 경사진 강자성 와이어를 따라 CTC 출구(출구 #2)에 따라 분리되고, 남은 결합되지 않은 세포 핵은은 폐기물 출구(출구 #1)로 분리된다. 결국 면역 자성 나노 비드에 결합된 CTC는 측면으로 배열되고, 게놈 분석을 위한 출구로 배출되고, 남은 정상 세포 핵은 폐기물 배출구로 배출된다.
6. 면역염색 및 검출
이미지 분석을 통해 CTC를 계수하였다. 분리된 CTC를 100 μl의 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정하고, 막 투과성 핵산 형광 염료(DAPI, Invitrogen) 및 항-CD45- Alexa 647 (Biolegend) 항체로 30분동안 염색하였다. 이후 100 μl의 0.2% Triton X-100 (AMRESCO)을 10분 동안 처리하고, 항-pan-cytokeratin-Alexa 488 (eBioscience) 항체를 30분 동안 처리하였다. CTC 및 정상 혈액 세포를 계수하기 위해, 형광 염색된 샘플을 공초점 현미경 (LSM800; Carl Zeiss)으로 관측하였다.
CTC는 염색된 부분과 핵 크기 및 세포질 영역과 같은 형태학적 특성을 확인하였다. 항-pan-cytokeratin 염색이 있으며, 둥근 형태에 백혈구 보다 큰 핵을 갖으면 CTC로 선별하였다. 핵의 크기가 정상 세포의 핵과 동일 또는 더 작은 경우라도 pan-cytokeratin 양성 세포는 CTC로 간주하였다. 또한, 녹생 형광 염색, ≥9 μm 크기의 핵 및 ≥15 μm 크기의 세포 직경인 경우, CTC로 간주하였다. CD45 적색 형광을 띄는 로브 및 다중 핵을 갖는 경우는 백혈구로 간주하였다.CD45로 염색되지 않아도 핵 형태와 세포 크기로 판단하였다. 특히 이중 양성 염색 세포는 백혈구로 간주하였다.
실시예 1: 타겟 유전자 선정
CTC 존재 확인하고 환자 샘플을 수집하여 암 특이적 유전자의 mRNA 기반 유전자 발현 수준을 확인하였고, 각 암 화자는 임상 암 단계에 따라 구분하여 유전자 발현 다양성을 비교하였다. CTC 분리 후, mRNA를 추축하고, cDNA로 합성하였다.
CTC 분리 후, 300 μl의 용해/결합 완충액(Dynabeads mRNA Direct Kit; Invitrogen)에 세포를 용해하였다. 샘플에 2.8 μm 직경의 자성 비드(Dynabeads Oligo(dT)25; Invitrogen)를 20 μl 농도로 첨가하고, 10 분 동안 혼합하여 mRNA의 폴리-A 꼬리에 특이적으로 결합하였다. 이후, 샘플을 자석 위에 2 분 동안 올려 놓아 mRNA가 결합된 올리고-dT 비드를 수집하였다. 완충액으로 세척한 후, 제조사의 프로토콜에 따라 용리 완충액(10 mM Tris-HCL pH 7.5) 10 μl를 추가하여 75℃에 2 분 동안 반응하여 mRNA를 분리하였다. 분리된 mRNA는 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC) 10 μl가 용해된 AccuPower CycleScript RT PreMix (dT20) (Bioneer)로 합성하였다. RT 프리믹스 용액에 mRNA를 첨가한 후, 반응 혼합물을 42℃ 90분 조건의 열 사이클에 배양하고, 95℃ 5분 조건의 RNase 불활성화 단계로 종결하였다.
mRNA 기반-암 관련 표적 유전자는 전립선 암 환자에서 유전자 발현 수준의 게놈 분석을 위해 설계되었다. 안드로겐 호르몬과 관련된 AR 및 AR-V7는 남성 및 변형을 검증하기 위해 선정되었다. 상피세포 특이적 유전자인 EpCAM 및 KRT-19는 분리된 샘플에 CTC 존재를 확인하기 위해 선정되었다. 전립선 특이적 유전자인 PSA 및 PSMA는 전립선 암 환자를 확인하기 위해 선정되었다.
실시예 2: 사전 증폭(pre-amplification)
각 유전자들을 평가하기 위해 엔드 포인트 PCR(Endpoint PCR) 및 멀티 플렉스 PCR(multiplex PCR)을 사용하였다. 전립선 암 환자를 확인하기 위해 선정된 AR, AR-V7, EpCAM, KRT-19, PSA 및 PSMA 유전자를 분석하기 위해 사전 증폭(pre-amplification) 프라이머 세트를 설계하였다. 사전 증폭(pre-amplification)에 사용된 프라이머 세트는 하기 표 2와 같다.
Figure PCTKR2021005355-appb-T000002
2000 LNCaP 세포에서 cDNA를 합성하였다. 특이적인 마커 유전자인 PTPRC(CD-45)를 사용하여 함께 분리되는 백혈구 세포를 측정하였다. 두 주형과 단일 PCR 마스터 믹스(AccuPower HotStart PCR PreMix; Bioneer)를 각각의 유전자 프라이머 세트 (10 pmol/μl)와 함께 동일한 비율로 혼합하여 최종 100 nM로 제조하고, 제조사의 프로토콜에 따라 유전자를 평가하였다. 멀티 플렉스 PCR(multiplex PCR)의 경우, 멀티 플렉스 PCR 프리믹스 (AccuPower Multiplex PCR PreMix; Bioneer)와 cDNA 주형에 동일한 양의 프라이머 세트를 추가한 후 제조사의 프로토콜에 따라 유전자를 평가하였다(도 1).
도 1에 나타난 바와 같이, 백혈구(WBC)만 있는 음성 대조군(NC)에서는 하우스키핑 유전자(GAPDH, β-actin) 및 PTPRC 유전자의 밴드만 나타났으나, LNCaP 세포가 혼합된 샘플에서는 AR, AR-V7, EpCAM, KRT-19, PSA 및 PSMA 유전자의 밴드가 나타났다.
실시예 3: ddPCR을 이용한 표적 유전자 평가
각 유전자에 대해 특이적인 표적 유전자 프라이머를 평가하기 위해, 오리지날 주형과 연속 희석된 사전 증폭 주형을 ddPCR 방법을 사용하여 측정하였다. 사용된 프라이머 세트는 하기 표 3과 같다.
Figure PCTKR2021005355-appb-T000003
2000 LNCaP 세포의 cDNA 주형을 18 사이클로 멀티플렉스 사전 증폭하였다. 하우스 키핑 유전자로 β-actin 및 GAPDH 유전자사 사용되고, 음성 대조군(백혈구) 선별을 위해 PTPRC 유전자가 사용되었고, 6 개의 유전자(AR, AR-V7, EpCAM, KRT-19, PSA, PSMA)는 환자의 샘플을 평가하기 위해 사용되었다. 10 배씩 연속적으로 희석한 사전 증폭 샘플을 상기 표 3의 표적 유전자 프라이머 세트와 함께 PCR 슈퍼 믹스(QX200 ddPCR EvaGreen Supermix, BioRad)로 증폭하였다. Droplet를 생성하기 위해, 모든 PCR 혼합물을 droplet 생성 카트리지(DG8쪠 Cartridges for QX100쪠/QX200쪠 Droplet Generator, Bio-Rad)에 70 μl의 droplet 생성 오일(Droplet Generation Oil for EvaGreen, Bio-Rad)과 함께 로딩하고, droplet 생성기(QX200쪠 Droplet Generator, Bio-Rad)로 반응시켰다. PCR 실행 전에 생성된 droplet을 96 well PCR 플레이트로 옮기고, 증발을 방지하기 위해 thermal sealer (PX1쪠 PCR Plate Sealer, Bio-Rad)를 사용하여 밀봉하였다. 밀봉된 PCR 플레이트를 PCR 기계(GeneAmp® PCR System 9700, Applied Biosystems)로 반응시킨 후, droplet 리더기(QX200쪠 Droplet Reader, Bio-Rad)로 결과물을 확인하였다(도 2).
모든 유전자는 잘 분리된 양성 신호 및 음성 신호를 보여주고, 컷 오프 임계 값 진폭은 미세 분리점에 따라 분석되었다. 임계 값은 프라이머 품질 및 표적 유전자 서열에 대한 특이성에 따라 상이하였다. AR 유전자의 임계 값은 14500 이고, AR-V7 유전자의 임계 값은 15345이고, EpCAM 유전자의 임계 값은 16000 - 19000 이고, KRT-19 유전자의 임계 값은 11000 - 14000 이고, PSA 유전자의 임계 값은 14000 - 18000이고, PSMA 유전자의 임계 값은 16000 - 19000이다. 오리지날 카피 수 농도는 AR에서 74.3 μl, AR-V7에서 0.62 μl, EpCAM에서 87.3 μl, KRT-19에서 19.2 μl, PSA에서 1128 μl, PSMA에서 284 μl, GAPDH에서 1657 μl이다. 사전 증폭된 카피수는 오리지날 카피수를 초과하고, 오리지날 카피수가 100을 초과하는 PSA, PSMA, GAPDH에서 1/100 희석 샘플에서는 포화되는 것을 나타났다. 1/1000 희석 샘플은 모두 선형으로 감소하는 것으로 나타났다. 임계 값의 카피수는 AR은 0.13 카피/μl, AR-V7은 0.28 카피/μl, EpCAM은 0.17 카피/μl, KRT-19는 0.11 카피/μl, PSA는 0.01 카피/μl, PSMA는 0.23 카피/μl로 나타났다.
실시예 4: 환자 샘플 농도 평가
전립선 암 환자인 국소화 단계(N=2), mHSPC 단계(N=2), mCRPC 단계(N=3) 샘플을 주형 농도 평가에 사용하였다. 사전 증폭된 주형을 사용하였을 때는 높은 농도로 인한 모든 신호는 양으로 측정되었다. 주형 농도를 최적화하기 위해, 사전 증폭된 cDNA 주형을 1/2, 1/5, 1/10으로 희석하고, 각각의 유전자를 2.5 μl씩 사용하여 상기 표 3으로 표시되는 표적 유전자의 프라이머 세트 (forward primer 5 pmole/μl 및 reverse primer 5 pmole/μl)를 첨가한 슈퍼믹스(QX200 ddPCR EvaGreen Supermix, Bio-Rad)에 첨가하고, ddPCR를 실시하였다.
amplitude 컷오프 값을 측정한 결과, AR 유전자는 14206 - 17000로 희석 계수에 비례하여 감소하는 것으로 나타났고, AR-V7 유전자는 고농도에서 17645로 나타났고, EpCAM 유전자는 16008 - 16662로 전체 샘플에서 모두 양성 신호를 발현하며 희석 계수에 따라 선형으로 감소하는 것으로 나타났고, KRT-19 유전자는 11751 - 15898로 mCRPC 환자에서만 농도에 따라 선형으로 감소하는 것으로 나타났고, PSA 유전자는 14370 - 16553로 mCRPC 환자에서만 농도에 따라 선형으로 감소하는 것으로 나타났고, PSMA 유전자는 16062 - 17427로 농도에 따라 선형으로 감소하는 것으로 나타났다. 검출된 amplitude 컷오프 값의 역치는 모든 환자 샘플에 적용하였다.
실시예 5: CTC 모델 분석 평가
본 발명에 따라 전립선 암의 진단 및 예후 예측 방법을 검증하기 위해, 일회용 미세 유체 장치의 성능 및 최적화된 분리 가능한 조건을 평가하였다. 암 환자 모델로서 대략 100개로 계수된 LNCaP cell 세포주를 5 mL의 건강한 혈액에 접종하였다. 일회용 미세 유체 장치는 0.2 T의 외부 자속을 생성하는 2 개의 네오디뮴 영구 자석의 스택 상에 준비되었으며, 미세 유동 채널의 수평 방향으로 적용되었다. 분리하는 동안, LNCaP 세포를 CTC 배출구로 분리하고, 회수율 평가를 위해 형광 현미경을 사용하여 계수하였다. 수집된 샘플을 형광 현미경 하에서 LNCaP 세포 및 함께 분리된 백혈구(WBC)를 계수하여 순도 및 소모율을 측정하였다. 샘플에 대한 최적의 유속을 확인하기 위해 1, 2 및 4 ml/h 유속으로 3 반복하여 다양한 샘플을 평가하였다.
분석 평가에 따르면, 회수율은 1 ml/h에서 95.13±1.20%, 2 ml/h에서 93.6±0.79%, 4 ml/h에서 84±7.00%로 평균 90.91%로 나타났다. 샘플을 제조하는 동안 사멸된 백혈구들이 면역 자성 비드에 비특이적으로 결합하고 응집되기 때문에, 백혈구가 CTC와 공-분리되며, 5 ml 혈액 샘플 당 백혈구 수는 238 - 786 세포 범위로 나타났다. 백혈구의 평균 오염 수는 유속이 1 ml/h에서 660 cells/5ml, 2 ml/h에서 667 cells/5ml, 4 ml/h에서 374.33 cells/5ml로 나타났으며, 백혈구의 평균은 567.11 cells/5ml (113.42 cells/ml)로 나타났다. 즉, 평균 백혈구의 고갈률은 혈액 1 ml당 5Х106의 백혈구 세포가 존재한다고 가정할 때, 44083.16-fold (4.64 log)로 측정된다. 유속이 증가함에 따라, 공-분리된 백혈구는 감소하며, 1 ml/h에서는 13.09%, 2 ml/h에서는 13.93%, 4 ml/h에서는 19.77%로 평균 15.60%로 나타난다.
마이크로 채널에서 높은 경사의 자속에 의해 생성되는 CTC 인력은 유체의 역학적 항력보다 낮기 때문에, 유량이 증가함에 따라 회수율이 감소하였다. 4 ml/h 유속에서 회수율은 약간 감소하였으나, 백혈구 수가 크게 감소하여 순도가 증가하는 것으로 나타나고, 1 ml/h 유속에서는 가장 높은 회수율을 보였으나, 오랜 처리로 낮은 순도를 나타냈다. 종합적으로 93.60% 회수율, 합리적인 13.93% 순도 및 백혈구 고갈률이 4.57 log로 측정된 2 ml/h 유속이 최적화된 샘플 유속으로 적합하였다.
실시예 6: CTC 검출
암의 국소화 단계(n=25), 전이 단계(n=37)인 환자와 건강한 기증자(n=5)로부터 말초 혈액 3-5 mL를 수집하였다. 전이 단계의 모집된 샘플은 mHSPC(전이성 호르몬 민감성 전립선 암, metastatic hormone-sensitive prostate cancer)는 1 반복하고, mCRPC(전이성 호르몬 불응성 전립선 암, metastatic castration-resistant prostate cancer)는 5 반복하였다. 샘플 및 완충액은 공정의 최적화된 조건인 2 ml/h의 유속으로 투입되었다. CTC를 분리한 후, 수집된 샘플은 면역 염색을 적용하였다. 이후, 형광 및 형태학적 특이성을 분석하여 CTC 및 백혈구를 구분하였다 (도 4). 분리된 CTC 및 남은 세포를 정량하기 위해, 열거한 각 세포수를 분리한 혈액의 부피로 나누고, 최종적으로 1 mL 부피로 계수하여 분석하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 건강한 기증자(HD)에서 CTC와 백혈구의 평균수는 0.94 CTCs/mL 및 602.23 WBCs/mL로 나타났다. 국소화 단계에서 분리된 CTC와 백혈구의 평균수는 6.58 CTCs/mL 및 514.41 WBCs/mL로 나타났다. 전이성 단계에서, CTC와 백혈구의 평균수는 mHSPC 단계에서 16.77 CTCs/mL 및 717.64 WBCs/mL로, mCRPC 단계에서 31.02 CTCs/mL 및 627.62 WBCs/mL로 나타났다. 즉, 전이성 단계의 평균 CTC 수는 27.55 CTCs/mL로 국소화 단계 보다 4.17배 높게 나타났다. 또한, 암의 진행 정도가 악성화됨에 따라 혈중 PSA 단백질의 수준이 증가하는 것으로 나타났다.
정제율(purity rate)은 CTC 및 백혈구를 분리하는 과정에서 계산되며, 사이토케라틴 양성 세포대 CD45 양성 세포 비율로 정의된다. 도 5에 나타난 바와 같이, 정제율은 건강한 기증자(HD)에서 0.17%, 국소화 단계에서 2.09%, mHSPC에서 3.79%, mCRPC 단계에서 6.71%로 나타났다. 정제율은 각 단계에서 암의 진행이 악화될수록 CTC의 수가 증가하기 때문에 정제율도 함께 증가하는 것으로 나타났다.
또한, 건강한 기증자의 혈액 대비 환자의 혈액에서는 점성이 끈적하여 분리된 백혈구 수가 5.25배 더 높게 나타났고, 정제율이 3.53배 낮게 나타났다.
실시예 7: 암 관련 유전자 분석
mRNA에서 암 관련 유전자를 검출하기 위해서 ddPCR을 사용하여 전체 환자의 샘플을 분석하였다. 유전자 검출율은 각 단계에서 검출된 유전자 백분율로 분석되었고, 카피 수 농도로 상기 유전자 발현 수준을 측정하였다.
Figure PCTKR2021005355-appb-T000004
표 4, 도 6 및 7에 나타난 바와 같이, 안드로겐 호르몬 치료와 관련된 유전자인 AR의 검출율은 건강한 기증자(HD)에서는 40%, 국소화 단계에서는 76%, mHSPC 단계에서는 76%, mCRPC 단계에서는 100%로 검출되었다. AR의 발현 수준이 암의 진행 단계가 악성화가 됨에 따라 증가하였다. AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7)의 검출율은 mHSPC 단계에서는 11.1%, mCRPC 단계에서는 28.57%로 나타났고, 발현 수준은 mHSPC 단계 대비 mCRPC 단계에서 7.19배 높게 나타났다.
EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자)의 검출율은 모든 환자에서 높게 나타났으며, KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19)의 검출율은 mHSPC 단계 및 mCRPC 단계에서 높게 나타났다. PSA 유전자 및 PSMA 유전자는 암 환자에서 모두 검출되었으며, 암의 악성화가 진행됨에 따라 유전자의 발현 수준이 증가하였다.
즉, AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원) 유전자는 암의 진행 단계가, 국소화 단계, mHSPC 단계, mCRPC 단계로 진행됨에 따라 검출율이 증가하고, 발현 수준도 증가하는 것으로 나타났다.
상기 결과는 AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원)의 유전자 조합은 전립선 암을 진단하는 유전자 마커로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 검출율 및 발현 수준을 측정하여 암의 악성화 정도를 진단 또는 예후 예측할 수 있는 마커로 사용될 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 8: 혈중 PSA 수준
혈중 PSA 단백질은 혈액 순환 시스템에서 전립선 암의 진단 및 예후 마커로 사용된다. 전립선 암 초기 단계에서는 PSA 단백질이 국소화 전립선 종양 단계에서 높게 발현되고, 전체 암 단계에서 환자의 예후를 보여주는 지표라고 알려진 바 있다.
도 8에 나타난 바와 같이, 환자에서 CTC의 PSA 유전자 농도와 임상 혈중 PSA 농도는 환자의 낮은 혈청 수준에서 선형 프롯으로 나타났다. 국소화 단계에서는 PSA 농도와 유전자 수준이 위험 수준보다는 낮게 나타났다. mHSPC 단계 및 mCRPC 단계에서는 혈중 PSA 수준이 위험도에 따라 증가하여 관련성이 있는 것으로 나타났다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims (12)

  1. AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원)로 구성되는 유전자 조합을 유효성분으로 포함하는 전이성 전립선 암의 진단용 바이오 마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 전이성 전립선 암은 전이성 호르몬 불응성 전립선 암(metastatic castration-resistant prostate cancer) 또는 전이성 호르몬 민감성 전립선 암(metastatic hormone-sensitive prostate cancer)인 것을 특징으로 하는 전이성 전립선 암의 진단용 바이오 마커 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 호르몬 민감성 전립선 암은 호르몬 민감성 단계 I 내지 IV의 전립선 암, 호르몬 민감성 재발성 전립선 암, 또는 호르몬 민감성 전이성 전립선 암인 것을 특징으로 하는 전이성 전립선 암의 진단용 바이오 마커 조성물.
  4. AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원)로 구성되는 유전자 조합의 발현 수준을 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 함유하는 전이성 전립선 암의 진단용 키트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 전이성 전립선 암의 진단용 키트.
  6. (a) 생물학적 시료로부터 분리된 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)를 분리하는 단계;
    (b) 상기 분리된 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)로부터 mRNA를 추출하는 단계;
    (c) 상기 추출된 mRNA를 주형으로 하여 AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원)로 구성되는 유전자 조합의 mRNA 수준을 측정하는 단계: 및
    (d) 상기 유전자들의 mRNA 수준이 정상인에 비하여 증가되어 있을 때, 전립선 암으로 분류하는 단계;를 포함하는 전이성 전립선 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)를 분리하는 단계는 상기 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)에 특이적으로 결합하는 항체 및 상기 항체에 결합되는 자성 비드로 분리하는 것을 특징으로 하는 전이성 전립선 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)에 특이적으로 결합하는 항체는 anti-EpCAM(anti-Epithelial Cell Adhesion Molecule)인 것을 특징으로 하는 전이성 전립선 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  9. AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원)로 구성되는 유전자 조합을 유효성분으로 포함하는 전립선 암에 대한 전이 가능성의 예후예측용 바이오 마커 조성물.
  10. AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원)로 구성되는 유전자 조합의 발현 수준을 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 함유하는 전립선 암에 대한 전이 가능성의 예후예측용 키트.
  11. (a) 생물학적 시료로부터 분리된 혈중 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)를 분리하는 단계;
    (b) 상기 분리된 혈중 종양 세포(CTC)로부터 mRNA를 추출하는 단계;
    (c) 상기 추출된 mRNA를 주형으로 하여 AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원)로 구성되는 유전자 조합의 mRNA 수준을 측정하는 단계: 및
    (d) 상기 유전자들의 mRNA 수준이 정상인에 비하여 증가되어 있을 때, 전이성 전립선 암으로 분류하는 단계;를 포함하는, 전립선 암에 대한 전이 가능성의 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  12. 대상체의 조직에서 분리된 생물학적 시료에서 AR(Androgen receptor, 안드로겐 수용체), AR-V7(Androgen receptor variant 7, 안드로겐 수용체 변이체 7), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule, 상피 세포 접착 분자), KRT-19(Cytokeratin 19, 시토케라틴 19), PSA(Prostate specific antigen, 전립선 특이적 항원) 및 PSMA(Prostate specific membrane antigen, 전립선 특이적 막 항원)로 구성되는 유전자 조합의 발현 수준을 측정하여 질환 대상체를 선별하는 제1단계; 및
    시험물질을 처리한 후 상기 유전자 조합의 발현 수준이 시험물질을 처리하지 않은 질환 대상체에 비해 감소하면 전이성 전립선 암의 예방 또는 치료용 제제로 판단하는 제2단계;를 포함하는 전이성 전립선 암의 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법.
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