WO2021221447A1 - 암 치료를 위한 활성 안드로겐 수용체 길항제의 용도 - Google Patents

암 치료를 위한 활성 안드로겐 수용체 길항제의 용도 Download PDF

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WO2021221447A1
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cancer
androgen receptor
oil
oligonucleotide
seq
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PCT/KR2021/005341
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이경일
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Lee Kyung Il
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to the use of an active androgen receptor antagonist for the treatment of cancer, and more specifically, as an active androgen receptor antagonist for the treatment of cancer, to the androgen receptor and signal protein complex formed by the interaction between androgen receptor and signal factor to the use of the oligonucleotide KilGreene to form a functional double strand.
  • Androgen receptor belongs to the steroid receptor group, and has a function as a transcription factor.
  • a steroid such as androgen
  • LBD ligand binding domain
  • the androgen receptor is separated from Hsp90 and migrated to the nucleus.
  • the androgen receptor migrated into the nucleus binds to the androgen-responsive element (ARE) in the promoter and activates the transcription of the gene.
  • ARE androgen-responsive element
  • Prostate cancer the most common oncological disease in men and the second leading cause of cancer-related death in men, is mainly caused by the differentiation of luminal epithelial cells of the prostate, and androgen receptors are known to be involved in the differentiation of luminal epithelial cells of the prostate. . Androgen receptors control cell survival through mechanisms that have not yet been clearly defined. It has also been implicated in the pathogenesis of other cancers, including breast cancer, in addition to prostate cancer (Cato, A.C., et al. 1998. Trends Endocrinol Metab 9:150-154).
  • Cancerous prostate cells continue to express androgen receptors. The survival of these cells also depends on the presence of androgens, which makes androgen deficiency the treatment of choice for patients with advanced prostate cancer.
  • Anti-androgen treatment methods using, for example, the inhibitors flutamide and Casodex are generally effective initially, but complete cure is rare. Prostate cancer recurs in most patients treated with this treatment method, leading to androgen-independent, chemotherapy-resistant tumors with a poor prognosis.
  • Androgen-independent prostate cancer is usually characterized by increased androgen receptor activity due to activation of receptor tyrosine kinase or expression of androgen receptor mutations responsive to non-androgen ligands (Chen, Y., et al. 2008. Curr Opin Pharmacol 8:440-448).
  • androgen receptors are both androgen-dependent and androgen-independent cancers, and other androgen receptor positive cancer types such as "triple negative" (ER-, PR-, Her2-) breast cancer , represent a promising potential therapeutic target for bladder cancer and salivary gland cancer.
  • the androgen receptor antagonists enzalutamide and bicalutamide are being used to treat prostate cancer (Minyong Kang and Ja Hyeon Ku. 2017, Translational Cancer Research 6(Suppl 4): S702-S707; P Li., et al. 2017. Cancers (Basel) 9(2): E20; Khoo., et al. 2017. Oncotarget 5(44): 75893-75903; CM Chiu., et al. 2007.
  • androgen receptor antagonists inhibit the stimulation of cancer cells by disrupting or reducing the function of androgen receptors, including androgen receptor binding, transcriptional activity of androgen receptors, or cell transport of androgen receptors such as translocation from the cytoplasm to the nucleus. It is expected to be reduced.
  • the current treatment modality is quite ineffective for androgen receptor-positive cancer, and thus there is a steady demand for the development of new androgen receptor antagonists for the treatment of androgen receptor-positive cancer cells.
  • non small cell lung cancer is a disease that accounts for an important cause of malignant tumor-related deaths worldwide, and accounts for 75 to 88% of lung cancers.
  • EGFR Extramal Growth Factor Receptor
  • chemotherapeutic agents In order to obtain more satisfactory results, it is necessary to find a therapeutic target other than EGFR.
  • An androgen receptor has been proposed in such an attempt (Sean Brennan., et al. 2017. Cancer Res 77(13 Suppl); Abstract 4121).
  • the present inventors have made efforts to develop a cancer therapeutic agent that can be used in androgen receptor-positive cancers including androgen-dependent cancer and androgen-independent cancer.
  • the oligonucleotide KilGreene according to the present invention is an androgen receptor and interacts with the androgen receptor in non-small cell lung cancer cells. The effect of inhibiting the growth of cancer cells was confirmed by removing the complex of signal factors.
  • the oligonucleotide KilGreene according to the present invention can be usefully used as a gene therapy for androgen receptor signaling-related cancer treatment.
  • the interaction between the active androgen receptor and the signal protein has been recognized as a novel anticancer drug, and it is a small molecule that binds to the N-terminal site of the androgen receptor and is being attempted for the treatment of intractable prostate cancer.
  • An object of the present invention is to block androgen receptor signaling, which is a step of EGFR tyrosine kinase signaling in non-small cell carcinoma, by eliminating the interaction between the signal protein and androgen receptor through the oligonucleotide KilGreene according to the present invention.
  • the present invention contains an oligonucleotide in which the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 are complementary to each other to form a double strand as an active ingredient, It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 are complementary to each other to form a double-stranded oligonucleotide containing as an active ingredient a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer .
  • the present invention prevents cancer by administering to an individual an oligonucleotide in which the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 are complementary to each other to form a double-stranded or a composition containing the same as an active ingredient or a method of treatment.
  • the present invention also relates to: a) a transfection preparation containing a vegetable oil;
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 are complementary to each other to form a double-stranded oligonucleotide by administering to the subject a composition containing as an active ingredient to prevent or treat cancer provides a way to
  • the present invention provides an oligonucleotide in which the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 are complementary to each other to form a double-stranded oligonucleotide or a composition containing the same as an active ingredient for preventing or treating cancer to provide.
  • the present invention also relates to: a) a transfection preparation containing a vegetable oil;
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 are complementary to each other to form a double-stranded oligonucleotide as an active ingredient.
  • the oligonucleotide according to the present invention has an effect of inhibiting the growth of cancer cells by binding to a complex of androgen receptors and signaling proteins interacting therewith in non-small cell lung cancer cells. More specifically, the oligonucleotide according to the present invention interacts with androgen receptors that have migrated into the nucleus through androgen-independent signaling by EGFR in EGFR Tyrosine Kinase-positive non-small cell lung cancer cells, and binds to androgen receptors and signal protein complexes, and androgen receptors Since it has an effect of inhibiting the growth of cancer cells by blocking the transcriptional activity of , it can be usefully used as a gene therapy for androgen receptor signaling-related cancer treatment.
  • FIG. 1 is a diagram confirming the degree of cell death of each of six non-small cell lung cancer cell lines transfected with an oligonucleotide (KilGreene) prepared in an embodiment of the present invention:
  • Figure 2 is a diagram confirming the action of a signal factor in the Kil sequence contained in KilGreene and nucleoproteins extracted from 6 types of non-small cell lung cancer cell lines through EMSA:
  • Figure 3 is a diagram confirming the signal protein binding to the kil sequence in KilGreene and the androgen receptor binding to GRE by performing EMSA using a nuclear extract of the NCI-H1793 cell line and a reaction product of KilGreene:
  • FIG. 4 is a diagram illustrating the removal of androgen receptors in the nuclear protein extracted from the NCI-H1793 cell line by immunoprecipitation, and confirming the removed androgen receptors:
  • Figure 5a is a diagram confirming the change in tumor volume in the NCI-H1793 (KilGreene) transplanted mouse model transfected with the non-small cell lung cancer cell line NCI-H1793 (Control) or KilGreene.
  • Figure 5b is a diagram confirming the change in tumor volume in the NCI-H520 (KilGreene) transplanted mouse model transfected with the non-small cell lung cancer cell line NCI-H520 (Control) or KilGreene.
  • Figure 6 is a view confirming the stability in flaxseed oil (flaxseed oil) of KilGreene.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating intracellular beta-galactosidase expression after intracellular transfection of pCMB-LaZ beta galactosidase vector using flaxseed oil.
  • FIG. 8 is a view confirming the expression of luciferase in the crude after intravenous administration of a mixture of flaxseed oil and luciferase plasmid to rats.
  • FIG. 9 is a diagram confirming the transduction of KilGreene and the anticancer effect in lung tissue after intravenous administration of a mixture of flaxseed oil and KilGreene to an animal model inducing lung cancer.
  • 10 is a diagram schematically illustrating the mechanism of action of KilGreene.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising an oligonucleotide in which the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 are complementary to each other to form a double strand as an active ingredient do.
  • the oligonucleotide used in the present invention is a functional equivalent of a nucleic acid molecule constituting it, for example, even if some nucleotide sequences of the oligonucleotide are modified by deletion, substitution, or insertion, the oligonucleotide can have a functionally equivalent function. It is a concept that includes variants.
  • the oligonucleotide of the present invention may exhibit 80% or more homology with the nucleotide sequence of each corresponding SEQ ID NO: Specifically, it may include 90% or more, more specifically, 95% or more homology.
  • the oligonucleotide of the present invention is 80% or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.5% or more may include indicating.
  • Such homology can be readily determined by comparing the sequence of the nucleotides to the corresponding portion of the target gene using computer algorithms well known in the art, for example, the Align or BLAST algorithm.
  • oligonucleotides used in the present invention can be isolated or prepared using standard molecular biology techniques, for example, chemical synthesis methods or recombinant methods.
  • the oligonucleotide may be provided in a form captured by a carrier for introduction into a cell.
  • the carrier may be, for example, G-fectin, Mirus TrasIT-TKO lipophilic reagent, lipofectin, lipofectamine, cellfectin, cationic phospholipid nanoparticles, cationic polymer, cationic micelles, cationic emulsion or Liposomes may be mentioned, but are not limited thereto, and may be used without limitation as long as they function as a carrier.
  • a biocompatible polymer such as polyethylene glycol
  • vegetable oil containing a large amount of unsaturated fatty acids such as linolenic acid, linoleic acid and oleic acid is used as a carrier for introducing the oligonucleotide according to the present invention into a cell. It was confirmed that it is possible.
  • the unsaturated fatty acid changes the structure of the cell membrane to increase permeability and fluidity. These changes change the activity of receptors in the cell membrane of cancer cells, thereby facilitating the intracellular introduction of anticancer agents.
  • the oligonucleotide is an upstream (-204) to (-188) site based on the transcription start site (+1) of the mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter gene.
  • MMTV mouse mammary tumor virus
  • the oligonucleotide includes upstream (-186) to (-170) sites based on the transcription start site (+1) of the mouse mammary tumor virus promoter gene.
  • the upstream (-204) to (-188) region based on the transcription start site (+1) of the mouse mammary tumor virus promoter gene is known as the Kil sequence or Kil site, and the upstream ( The regions -186) to (-170) are known as distal glucocorticoid response elements (GREs).
  • the Kil sequence is known as an enhancer that acts on steroid hormone receptors that act on the distal GRE, such as glucocorticoid receptor (GR), progesterone receptor (PR), and estrogen receptor (ER) (EMBO Genebank x16475).
  • GR glucocorticoid receptor
  • PR progesterone receptor
  • ER estrogen receptor
  • the oligonucleotide binds to a steroid hormone receptor, specifically an androgen receptor and a signal factor interacting therewith, in the nucleus including the Kil sequence and the distal GRE. More specifically, the oligonucleotide binds to the androgen receptor and signal protein complex formed by the interaction between the activated androgen receptor and the signal protein, wherein the activated androgen receptor binds to the distal GRE, and the signal protein binds to the Kil sequence .
  • the androgen receptor is activated by several signaling pathways. For example, it is known that in some cancers androgen receptors are activated through two signaling pathways, specifically androgen-dependence signaling pathway and androgen-independence signaling pathway, to promote the growth of cancer cells. .
  • the androgen-dependent signaling pathway is a signaling pathway in which androgen receptors are activated by binding of androgen receptors with dihydrotestosterone produced by conversion of androgens by 5 ⁇ -reductase in cells.
  • the androgen-independent signaling pathway is a signaling pathway in which PI3K is activated by phosphorylation of receptor tyrosine kinase such as EGFR, and thereby Akt is activated to activate the androgen receptor.
  • Activated androgen receptors bind to signal proteins, such as androgen receptor elements, in the nucleus to promote gene expression (L. Gerratana., et al. 2018. Cancer treatment reviews 68: 102-110).
  • the oligonucleotide binds to a complex of an androgen receptor activated through an androgen-dependent or androgen-independent signaling pathway and a signal protein interacting therewith, thereby inhibiting the transcriptional activity of the androgen receptor. More specifically, the oligonucleotide inhibits the transcriptional activity of the androgen receptor, thereby inhibiting cancer cell growth.
  • the cancer is preferably androgen receptor-positive cancer.
  • the cancer may include, but is not limited to, non-small cell lung cancer, bladder cancer, breast cancer, liver cancer, prostate cancer, colorectal cancer, thyroid cancer, salivary gland cancer, glioblastoma or astrocytoma.
  • the cancer may include androgen receptor-positive non-small cell lung cancer, bladder cancer, breast cancer, liver cancer, prostate cancer, colorectal cancer, thyroid cancer, salivary gland cancer, glioblastoma or astrocytoma, but is not limited thereto.
  • the present inventors prepared an oligonucleotide according to the present invention using the MMTV promoter region, and named it "KilGreene”.
  • NSLC Non Small Lung Cancer
  • KilGreene binds to a complex of androgen receptor in the nucleus of an apoptosis-induced EGFR-positive non-small cell lung cancer cell line and a signal protein that interacts therewith, and specifically, EGFR-positive at the GRE site distal to KilGreene. It was confirmed that the activated androgen receptor in the nucleus of the non-small cell lung cancer cell line binds to the Kil sequence region and a signal protein interacting with the activated androgen receptor binds to inhibit the transcriptional activity of the androgen receptor, thereby inducing apoptosis.
  • cancer cell growth occurs by transcriptional action from EGFR in the cell membrane of EGFR-positive non-small cell lung cancer cells through the signaling pathway between the nuclear signal protein and the androgen receptor. It was confirmed that the cross-talking of the tyrosine kinase EGFR, which instructs the existing cell growth, was blocked.
  • the present inventors confirmed the effect that the oligonucleotide according to the present invention inhibits the growth of cancer cells by binding to androgen receptors activated in the nucleus and signaling proteins interacting therewith through the androgen-independent signaling pathway by EGFR in cancer cells.
  • the oligonucleotide according to the present invention can be usefully used as an active ingredient in a pharmaceutical composition for androgen receptor signaling-related cancer treatment as a gene therapy agent.
  • composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, and may be formulated together with the carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier refers to a carrier or diluent that does not stimulate the organism and does not inhibit the biological activity and properties of the administered compound.
  • acceptable pharmaceutical carriers for compositions formulated as liquid solutions include sterile and biocompatible, saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection, dextrose solution, maltodextrin solution, Glycerol, ethanol, and one or more of these components may be mixed and used, and other conventional additives such as antioxidants, buffers, and bacteriostats may be added as needed. It may also be formulated as a solution or suspension (eg, integrated with microparticles, liposomes, or cells).
  • composition of the present invention may be applied to any formulation containing it as an active ingredient, and may be prepared and administered as an oral or parenteral formulation.
  • Administration means introducing a composition of the present invention to a patient by any suitable method, including transplantation of cells expressing a nucleic acid molecule.
  • the administration route of the composition of the present invention may be administered through various routes, either oral or parenteral, as long as it can reach the target tissue.
  • oral administration, transdermal administration, topical administration, inhalation administration, intrapulmonary administration, intrathecal administration, intranasal administration, intravenous administration, intramuscular administration, intradermal administration, intraperitoneal administration or subcutaneous administration may be made, but Not limited.
  • composition and treatment method of the present invention are applicable to any animal capable of developing cancer, and the animal includes not only humans and primates, but also domestic animals such as cattle, pigs, sheep, horses, dogs and cats.
  • the effective amount of the composition of the present invention or a suitable total daily amount can be determined by a treating physician within the scope of sound medical judgment.
  • a specific therapeutically effective amount for a particular patient will depend on the type and extent of the response to be achieved, the specific composition, including whether other agents are used, if necessary, the patient's age, weight, general health, sex and diet, time of administration; It is preferable to apply differently depending on various factors including the route of administration and secretion rate of the composition, treatment period, and radiation dose to be irradiated and similar factors well known in the pharmaceutical field. For example, it may be used at 0.001 ⁇ g/kg-100 mg/kg (body weight) per day, but is not limited thereto.
  • the effective amount of the pharmaceutical composition suitable for the purpose of the present invention is preferably determined in consideration of the foregoing.
  • the present invention also provides a transfection preparation comprising a vegetable oil.
  • the vegetable oil is flaxseed oil, corn oil, borage oil, safflower oil, soybean oil, perilla oil, evening primrose oil, sunflower oil, blackcurrant oil (blackcurrant pip oil), malt oil (wheatgerm oil), hemp oil (hemp oil) or squash seed oil (marrow seed oil) may be, specifically, may be flaxseed oil, but is not limited thereto.
  • the vegetable oil may contain 70 to 99% by weight (w/w) of C 18 fatty acids based on the total weight of the oil , and examples of the C 18 fatty acids include linolenic acid, linoleic acid ) and oleic acid, but is not limited thereto.
  • the transfection agent can be used for in vitro or in vivo transfection through the following steps:
  • the transfection agent: oligonucleotide may be mixed in a weight ratio of 1 to 5: 1, specifically, may be mixed in a weight ratio of 1 to 3 : 1, and more specifically, 1 to 2 : 1 by weight. may be mixed, but is not limited thereto.
  • the stirring in step 1) may be specifically performed for 30 seconds to 120 seconds, more specifically 50 seconds to 90 seconds using a vortex device, but is not limited thereto.
  • the mixture in step 2) may be carried out for 30 seconds to 120 seconds, more specifically 50 seconds to 90 seconds, but is not limited thereto.
  • the present inventors confirmed that the oligonucleotide including the oligonucleotide according to the present invention was transfected into cells and tissues using flaxseed oil as a vegetable oil harmless to the human body, thereby exhibiting excellent transfection efficiency.
  • the present inventors confirmed that vegetable oil harmless to the human body can be used as a vehicle for in vitro or in vivo introduction of the oligonucleotide containing the oligonucleotide according to the present invention, so that the vegetable oil containing the oligonucleotide according to the present invention can be used. It can be usefully used as an active ingredient of a transfection agent for transfection of oligonucleotides in vitro or in vivo.
  • composition for preventing or treating cancer, containing as an active ingredient.
  • the types of the oligonucleotides and cancer are the same as those described in the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, containing the oligonucleotide as an active ingredient, and therefore, the detailed description will refer to the above contents and hereinafter, vegetable oils and oligonucleotides Only the specific composition of the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing nucleotides as an active ingredient will be described.
  • the pharmaceutical composition may be administered orally or parenterally.
  • oral administration, transdermal administration, topical administration, inhalation administration, intrapulmonary administration, intrathecal administration, intranasal administration, intravenous administration, intramuscular administration, intradermal administration or intraperitoneal administration may be administered.
  • inhalation it is possible to increase the efficiency of delivery of oligonucleotides to lung tissue.
  • the present inventors can introduce the oligonucleotide according to the present invention into cells and tissues using flaxseed oil as a vegetable oil harmless to the human body, and the present invention introduced into lung tissue using flaxseed oil It was confirmed that the oligonucleotide according to the present invention exhibits excellent anticancer effect.
  • the present inventors have confirmed that vegetable oil harmless to the human body can be used as a carrier for introducing the oligonucleotide according to the present invention into cells, so the oligonucleotide and vegetable oil according to the present invention can be used as a pharmaceutical for androgen receptor signaling-related cancer treatment. It can be usefully used as an active ingredient in the composition.
  • the oligonucleotide in which the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 are complementary to each other to form a double-stranded oligonucleotide or a composition containing the same as an active ingredient is administered to an individual to treat cancer
  • a method of preventing or treating is provided.
  • the subject refers to any animal, including humans, that has already or can develop a disease that can be prevented or treated through anticancer activity, and cancer disease by administering the oligonucleotide according to the present invention, or a composition containing the same, to the subject. can be effectively prevented and treated.
  • the present invention also relates to: a) a transfection preparation containing a vegetable oil;
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 are complementary to each other to form a double-stranded oligonucleotide by administering to the subject a composition containing as an active ingredient to prevent or treat cancer provides a way to
  • the present invention provides an oligonucleotide in which the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 are complementary to each other to form a double-stranded oligonucleotide or a composition containing the same as an active ingredient for preventing or treating cancer to provide.
  • the present invention also relates to: a) a transfection preparation containing a vegetable oil;
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 are complementary to each other to form a double-stranded oligonucleotide as an active ingredient.
  • treatment includes a partial cure, improvement and alleviation of cancer symptoms, as well as cure of cancer diseases as a result of applying the pharmaceutical composition of the present invention to cancer diseases, growth of cancer or metastasis to other organs, or cancer symptoms.
  • prevention means to prevent cancer from occurring in advance by applying the pharmaceutical composition of the present invention to inhibit or block the occurrence, growth, or metastasis of cancer to other organs.
  • active ingredient refers to a component that exhibits activity alone or together with a carrier that is not active by itself.
  • the oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (5'-AGCTTCCCAGGGTTTAAATAAGTTTAATGGTTACAAACTGTTCTTAAAACGCT-3') and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 (5'-AGGGTCCCAAATTTATTCAAATTACCAATGTTTGACAAGAATTTTGCGAGATC-3') Bioneer, Korea) was commissioned and synthesized.
  • each of the synthesized oligonucleotides was mixed in equal amounts, heated at 100° C., and then slowly left at room temperature, so that the oligonucleotide of SEQ ID NO: 1 and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 2 complementarily bind to each other to form a double strand. did. Thereafter, the double-stranded oligonucleotide was separated on a 7% SDS PAGE gel. In addition, the double-stranded oligonucleotide prepared above was named "KilGreene".
  • KilGreene is a Kil sequence (Kil sequence or Kil site) known as the mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter (promoter) gene transcription start site (+1) upstream (upstream) -204 to -188 site (SEQ ID NO: 3: 5'-GGGTTTAAATAAGTTTA-3') and -186 to -170 site (SEQ ID NO: 4: 5'-GGTTACAAACTGTTCT-3') known as distal glucocorticoid response element (GRE).
  • MMTV mouse mammary tumor virus
  • EGFR-positive epidermal growth factor receptor (EGFR)-positive Non Small Lung Cancer (NSCLC) various types of EGFR-positive or negative non-small cell lung cancer cells were treated with KilGreene and MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) was analyzed to determine the degree of cell death.
  • MTT 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
  • NCl-H596, Calu-3, SK-LU-1, SK-MES-1 and NCl-H1793, known as EGFR-positive non-small cell lung cancer cell lines, and NCI-H520, known as EGFR-negative non-small cell lung cancer cell lines, were used in the U.S. Cell Line Bank. (American tissue and cell collection) using 10% FBS-MEM medium or 10% FBS-RPMI1640 medium 5% CO 2 , cultured at 37 °C. Then, each of the cells was inoculated in a 60 mm culture dish with a number of 1 ⁇ 10 5 cells, and then 10 ⁇ l of 100 ⁇ g of KilGreene prepared in Example 1 was added to 10 ⁇ l of lipofectamine (Thermo Fisher Scientific). After transfection according to the manufacturer's procedure, cultured for 3 weeks.
  • FIG. 1 it was confirmed that a remarkably high apoptosis was observed in the case of EGFR-positive non-small cell lung cancer cell lines treated with KilGreene except for SK-MES-1.
  • apoptosis was insufficient.
  • the Kil sequence in KilGreene is known to act as a regulatory protein of steroid hormone receptors.
  • EMSA epidermal growth factor receptor
  • nucleoproteins were extracted from NCl-H596, Calu-3, SK-LU-1, NCl-H1793, SK-MES-1 and NCI-H520 of 1x10 9 cells.
  • the following solutions were used as nucleoprotein solutions: Buffer A (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM MgCl 2 , 3 mM NaCl, 0.2 mM Nonidet p-40, 0.5 mM PMSF) , 2 ug/ml leupeptin, 2 ug/ml aprotinin, buffer B (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 mM DTT, 0.5 mM PMSF), buffer C (10 mM Tris- HCl (pH 7.5), 2 mM MgCl 2 , 0.5 mM DTT, 0.1 mM PMSF), buffer D (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 80 mM NaCl, 3 mM
  • nucleoprotein was extracted from NCl-H1793 in 1x10 9 cells, an EGFR-positive non-small cell lung cancer cell line showing the best effect by KilGreene. .
  • KilGreene prepared in ⁇ Example 1> KI Lee., et al. (JBC 1995 270(41): 24502-24508), [ ⁇ - 32 P]dCTP was labeled by the same method.
  • immunoprecipitation was performed as follows. To 875 ul of the extracted nucleoprotein, 200 ug of rabbit anti-androgen receptor antibody (Sigma A4719) was added and reacted with stirring at 4° C. for 30 minutes. After the reaction, 100 ul of protein A-agarose beads were added and reacted in the same manner as above. After completion of the reaction, the beads and the supernatant were separated by centrifugation for 2 minutes.
  • beads were recovered and immunoprecipitation buffer (1% Tritonx-100, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA (pH) 8.0), protease inhibitor), and centrifuged at 4° C. for 2 minutes to separate beads and wash solution, and each was recovered. 50 ul of 0.1 M glycine (glycine, pH 2.5) was added to the recovered beads and mixed, followed by reaction at 4° C. for 10 minutes while stirring. next. The supernatant was obtained by centrifugation at 4° C. for 2 minutes. The obtained supernatant (immunoprecipitation product) and the recovered washing solution were electrophoresed on a 7% SDS PAGE gel (FIG. 4).
  • immunoprecipitation buffer 1% Tritonx-100, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM EDTA, 1 m
  • NCI-H1973, an EGFR-positive non-small cell lung cancer cell line showing the best effect by KilGreene, and NCI-H520, an EGFR-negative non-small cell lung cancer cell line with insufficient effect, were obtained with 2 ⁇ 10 6 cells. and 10 ⁇ l of 100 ⁇ g of KilGreene prepared in ⁇ Example 1> was transfected using 10 ⁇ l of Lipofectamine according to the manufacturer's procedure. Then, the KilGreene-transfected cells were injected subcutaneously into the lateral flank of 4-week-old BALB/C female nude mice obtained from Charles river Laboratories and given once a week for 6 weeks to measure the tumor volume using a caliper at the time. did. The tumor volume was calculated by measuring the length (a), width (b) and height (c) as follows: tumor volume tumor length (a) ⁇ tumor width (b) ⁇ tumor height (c)/2.
  • KilGreene can be transfected intracellularly or into tissues using a plant oil that is harmless to the human body, flaxseed oil rich in linolenic acid, linoleic acid and oleic acid as a vegetable oil (flaxseed oil) oil), the stability of KilGreene was confirmed.
  • flaxseed oil was used to determine the transfection efficiency of DNA in cells and tissues.
  • NIH 3T3 cells were treated and transfected. At this time, NIH 3T3 cells were cultured in a culture medium from which BSA was removed one day before transfection was used. Then, using a beta-galactosidase staining kit (beta galactosidase staining kit, abcam) according to the manufacturer's procedure, beta-galactosidase analysis was performed (FIG. 7).
  • F344/N rats were divided into a control group, a KilGreene untreated group and a KilGreene treated group, and in the KilGreene untreated group and KilGreene treated group, RR1022 cells, a rat sarcoma cell, were treated with 7 ⁇ 10 6 cells in PBS. After adding to 500 ul, it was injected into the tail vein to induce lung cancer for 7 days.
  • the oligonucleotide according to the present invention has an effect of inhibiting the growth of cancer cells by binding to a complex of androgen receptor and a signal protein interacting therewith in non-small cell lung cancer cells. More specifically, the oligonucleotide according to the present invention is EGFR Tyrosine Kinase-positive In non-small cell lung cancer cells, through androgen-independent signaling by EGFR, it binds to the androgen receptor and signal protein complex formed by interaction with the androgen receptor that has migrated into the nucleus, and has the effect of inhibiting the growth of cancer cells by blocking the transcriptional activity of androgen receptors. , it can be usefully used as a gene therapy for androgen receptor signaling related cancer treatment.

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Abstract

본 발명은 암 치료를 위한 활성 안드로겐 수용체 길항제의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 KilGreene은 Kil 서열(kil sequence)과 먼쪽 GRE(distal glucocorticoid response element)를 포함하고, 상기 GRE에 활성 안드로겐 수용체가 결합하고, 상기 Kil 서열에 상기 활성 안드로겐 수용체와 상호작용하는 신호 단백질이 결합하여 활성 안드로겐 수용체 및 이와 상호작용하는 신호 단백질의 복합체를 제거할 수 있다. 따라서 상기 KilGreene은 EGFR 양성 비소세포폐암 세포에서 EGFR에 의한 안드로겐 독립성 신호전달을 통해 핵 내로 이동한 활성 안드로겐 수용체를 제거하여 활성 안드로겐 수용체의 전사 활성을 막아 암세포의 성장을 억제하는 효과를 나타낸다. 이에 상기 KilGreene은 유전자 치료제로서 안드로겐 수용체 signaling 관련 암 치료의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

암 치료를 위한 활성 안드로겐 수용체 길항제의 용도
본 발명은 암 치료를 위한 활성 안드로겐 수용체 길항제의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 암 치료를 위한 활성 안드로겐 수용체 길항제로서, 안드로겐 수용체 및 신호 단백질(signal factor) 간 상호작용으로 형성된 안드로겐 수용체 및 신호 단백질 복합체에 작용하는 이중 가닥을 형성하는 올리고뉴클레오티드 KilGreene의 용도에 관한 것이다.
안드로겐 수용체(androgen receptor, AR)는 스테로이드 수용체 군에 속하는 것으로, 전사 인자로서의 기능을 갖는다. 안드로겐과 같은 스테로이드와 안드로겐 수용체의 리간드 결합 도메인(LBD)의 결합시, 안드로겐 수용체는 Hsp90으로부터 떨어져 나와 핵으로 이동하게 된다. 핵 내로 이동한 안드로겐 수용체는 프로모터 내의 안드로겐 반응성 요소(ARE)와 결합하여 유전자의 전사를 활성화한다.
남성에서 가장 많이 발생하는 종양 질환이자 남성의 암 관련 사망 중 두번째 주요 원인인 전립선암은 주로 전립선 내강 상피 세포의 분화에 의해 유발되는데, 안드로겐 수용체가 이러한 전립선 내강 상피 세포의 분화에 관여하는 것으로 알려져 있다. 안드로겐 수용체는 아직 명확히 규정되어 있지 않은 기작을 통해서 세포의 생존을 제어한다. 또한, 전립선암 이외에도, 유방암을 포함한 다른 암의 병인론과 관련되어 있다(Cato, A.C., et al. 1998. Trends Endocrinol Metab 9:150-154).
암성 전립선 세포는 계속해서 안드로겐 수용체를 발현한다. 또한 이 세포의 생존은 안드로겐의 존재에 따라 달라지는데, 이는 안드로겐 결핍을 전립선암이 진행된 환자에 대한 선택된 치료 방법으로 만든다. 예컨대 억제제인 플루타미드와 카소덱스를 사용하는 항-안드로겐 치료 방법은 일반적으로 초기에는 효과적이지만, 완전히 치유하는 것은 드물다. 이와 같은 치료 방법으로 치료를 받은 환자들 대부분에서는 전립선암이 재발하고, 이는 예후가 좋지 않은 안드로겐 독립성(androgen-independence)인 화학 요법 내성 종양으로 이어진다.
안드로겐 독립성 전립선암은 통상적으로 수용체 타이로신 키나아제(receptor tyrosine kinase)의 활성화 또는 비-안드로겐 리간드에 반응성인 안드로겐 수용체 돌연변이의 발현으로 인한 안드로겐 수용체 활성의 증가를 특징으로 한다(Chen, Y., et al. 2008. Curr Opin Pharmacol 8:440-448).
이는 안드로겐 수용체가 안드로겐 의존성(androgen-dependence) 암과 안드로겐 독립성 암 둘 다, 및 기타 안드로겐 수용체 양성 암 유형, 예를 들어 "3중 음성(triple negative)" (ER-, PR-, Her2-) 유방암, 방광암, 침샘암에 대한 유망한 잠재적 치료 표적이라는 것을 나타낸다. 일예로 안드로겐 수용체 길항제인 엔잘루타마이드(enzalutamide) 및 비칼루타마이드(Bicalutamide)가 전립선암 치료에 사용되고 있다(Minyong Kang and Ja Hyeon Ku. 2017, Translational Cancer Research 6(Suppl 4): S702-S707; P Li., et al. 2017. Cancers(Basel) 9(2): E20; Khoo., et al. 2017. Oncotarget 5(44): 75893-75903; CM Chiu., et al. 2007. PNAS 104(8):2571-2578; L. Gerratana., et al. 2018. Cancer treatment reviews 68: 102-110).
이러한 안드로겐 수용체 길항제는 안드로겐과 안드로겐 수용체 결합, 안드로겐 수용체의 전사 활성, 또는 세포질로부터 핵으로의 전좌 (translocation) 등과 같은 안드로겐 수용체의 세포 수송을 비롯하여, 안드로겐 수용체의 기능을 교란 혹은 감소시킴으로써 암세포의 자극을 저감할 수 있을 것으로 기대되고 있다. 그러나, 현재의 치료 양상은 안드로겐 수용체 양성 암에 대하여 상당히 비효과적이며, 이에 안드로겐 수용체 양성 암 세포의 치료에 대한 새로운 안드로겐 수용체 길항제 개발이 꾸준히 요구되고 있는 실정이다.
한편, 비소세포 폐암(non small cell lung cancer, NSCLC)은 전 세계적으로 악성 종양 관련 사망의 중요한 원인을 차지하고 있는 질환으로, 폐암 중 75 내지 88%를 차지하고 있는 암이다. 다수의 비소세포 폐암 세포에서는 수용체 타이로신 키나아제로서 암세포의 증식과 분화에 관여하는 EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)이 발현된다. 최근, EGFR를 표적으로 하는 항체를 이용한 비소세포 폐암 치료가 시도되고 있으나, 대부분 화학 요법제와 병용으로 이용되고 있다. 이에 보다 만족할 만한 결과를 얻기 위해 EGFR 이외에 치료 표적을 찾는 것이 필요하다. 이러한 시도로 안드로겐 수용체가 제시되고 있다(Sean Brennan., et al. 2017. Cancer Res 77(13 Suppl); Abstract 4121).
이에, 본 발명자들은 안드로겐 의존성 암과 안드로겐 독립성 암을 포함한 안드로겐 수용체 양성 암에서 사용 가능한 암 치료제를 개발하기 위해 노력한 결과, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 KilGreene이 비소세포폐암 세포에서 안드로겐 수용체 및 이와 상호작용하는 신호 단백질(signal factor)의 복합체를 제거하여 암세포의 성장을 억제하는 효과를 확인하였다. 특히 EGFR 양성 비소세포폐암 세포에서 암세포 분열을 지시하는 Tyrosine Kinase EGFR에 의한 안드로겐 독립성 신호전달을 통해 핵 내로 이동한 활성 안드로겐 수용체 및 이와 상호작용하는 신호 단백질의 복합체를 제거하여, 활성 안드로겐 수용체의 전사 활성을 막아 암세포의 성장을 억제하는 효과를 나타냄을 확인하였다.
이에 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 KilGreene는 유전자 치료제로서 안드로겐 수용체 signaling 관련 암 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
비소세포폐암의 Epidermal Growth Factor Receptor(EGFR) 수용체의 Tyrosine kinase을 차단하여 암세포 성장을 억제하는 무수한 시도가 이루어지고 있다. 그러나 세포막 단계에서 EGFR을 항체 혹은 small molecule로서 차단하려는 무수한 시도는 성공적이지 못하다. 비소세포폐암 세포에서 암세포 성장을 개시하게 하는 EGFR의 tyrosine kinase의 작용은 신호전달(signal pathway) 단계를 거처 핵 내 안드로겐 수용체에 이른다.
활성 안드로겐 수용체와 신호 단백질과의 상호작용이 새로운 개념의 항암제로 인식되어 안드로겐 수용체의 N-말단 부위에 결합하는 small molecule로서 난치성 전립선암 치료에 시도되고 있다.
본 발명의 목적은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 KilGreene을 통하여 신호 단백질과 안드로겐 수용체의 상호작용을 제거함으로써, 비소세포암의 EGFR tyrosine Kinase 신호전달 단계인 안드로겐 수용체 signaling을 차단하는 유전자 치료제로서 안드로젠 수용체 signaling 관련 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하는 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은
a) 식물성 오일을 함유하는 형질감염 제제; 및
b) 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하는 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하는 올리고뉴클레오티드 또는 이를 유효성분으로 함유하는 조성물을 개체에 투여하여 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 a) 식물성 오일을 함유하는 형질감염 제제; 및
b) 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하는 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 조성물을 개체에 투여하여 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은, 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하는 올리고뉴클레오티드 또는 이를 유효성분으로 함유하는 조성물의 암 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 a) 식물성 오일을 함유하는 형질감염 제제; 및
b) 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하는 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 조성물의 암 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 비소세포폐암 세포에서 안드로겐 수용체 및 이와 상호작용하는 신호 단백질의 복합체와 결합하여 암세포의 성장을 억제하는 효과가 있다. 보다 구체적으로 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 EGFR Tyrosine Kinase 양성 비소세포폐암 세포에서 EGFR에 의한 안드로겐 독립성 신호전달을 통해 핵 내로 이동한 안드로겐 수용체과 상호작용하여 형성된 안드로겐 수용체 및 신호 단백질 복합체와 결합하고, 안드로겐 수용체의 전사 활성을 막아 암세포의 성장을 억제하는 효과가 있으므로, 유전자 치료제로서 안드로겐 수용체 signaling 관련 암 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 제작한 올리고뉴클레오티드(KilGreene)를 형질감염(transfection)한 6종의 비소세포폐암 세포주 각각의 세포사멸(cell death) 정도를 확인한 도이다:
1: NCI-H596 세포;
2: Calu-3 세포;
3: SK-MES-1 세포;
4: NCI-H520 세포;
5: SK-LU-1 세포; 및
6: NCI-H1793 세포.
도 2는 EMSA를 통해 KilGreene에 포함된 Kil 서열과 6종의 비소세포폐암 세포주에서 추출한 핵단백질 내 신호 단백질(signal factor)의 작용을 확인한 도이다:
1: NCI-H596 세포;
2: Calu-3 세포;
3: SK-MES-1 세포;
4: NCI-H520 세포;
5: SK-LU-1 세포; 및
6: NCI-H1793 세포.
도 3은 NCI-H1793 세포주 핵추출물과 KilGreene의 반응물을 이용하여 EMSA를 수행한 것으로, KilGreene 내 kil 서열에 결합하는 신호 단백질과 GRE에 결합하는 안드로겐 수용체를 확인한 도이다:
1: 핵단백질 및 KilGreene의 반응물; 및
2: 면역침강으로 안드로겐 수용체가 제거된 핵단백질 및 KilGreene의 반응물.
도 4는 NCI-H1793 세포주에서 추출한 핵단백질 내 안드로겐 수용체를 면역침강(immunoprecipitation)으로 제거하고, 제거된 안드로겐 수용체를 확인한 도이다:
1: 면역침강 후 획득한 단백질 A-아가로오스 비드(protein A-agarose bead) 세척액; 및
2: 면역침강 후 획득한 단백질 A-아가로오스 비드 세척 후 획득한 면역침강 생성물.
도 5a는 비소세포폐암 세포주 NCI-H1793(Control) 또는 KilGreene을 형질감염한 NCI-H1793(KilGreene) 이식 마우스 모델에서 종양 부피 변화를 확인한 도이다.
도 5b는 비소세포폐암 세포주 NCI-H520(Control) 또는 KilGreene을 형질감염한 NCI-H520(KilGreene) 이식 마우스 모델에서 종양 부피 변화를 확인한 도이다.
도 6은 KilGreene의 아마씨 오일(flaxseed oil)에서의 안정성을 확인한 도이다.
도 7은 아마씨 오일을 이용하여 pCMB-LaZ beta galactosidase 벡터를 세포 내 형질감염한 후 세포 내 베타-갈락토시타아제(beta-galactosidase) 발현을 확인한 도이다.
도 8은 랫트에 아마씨 오일 및 루시퍼라아제 플라스미드(luciferase plasmid) 혼합물을 정맥 투여한 후 조질 내 루시퍼라아제 발현을 확인한 도이다.
도 9는 폐암을 유도한 동물모델에 아마씨 오일 및 KilGreene 혼합물을 정맥 투여한 후 폐 조직에서 KilGreene 형질도입 여부 및 항암 효과를 확인한 도이다.
도 10은 KilGreene의 작용 기전을 모식화한 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하는 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 올리고뉴클레오티드는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 일부 염기서열이 결실, 치환 또는 삽입에 의해 변형되더라도 상기 올리고뉴클레오티드와 기능적으로 동등한 작용을 할 수 있는 변이체를 포함하는 개념이다. 예를 들어, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 각 해당 서열번호의 염기서열과 80% 이상의 상동성을 나타낼 수 있으며, 구체적으로 90%, 보다 구체적으로 95% 이상의 상동성을 나타내는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 각 해당 서열번호의 염기서열과 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상의 상동성을 나타내는 것을 포함할 수 있다. 이러한 상동성은 당 분야에 널리 공지된 컴퓨터 알고리즘, 예를 들어 Align 또는 BLAST 알고리즘을 이용하여 뉴클레오티드의 서열을 표적 유전자의 상응하는 부분과 비교하여 용이하게 결정할 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용되는 올리고뉴클레오티드는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 분리 또는 제조할 수 있다.
본 발명에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 세포 내로 도입하기 위한 전달체에 포획된 형태로 제공될 수 있다. 상기 전달체는 예를 들어 G-fectin, Mirus TrasIT-TKO 지질친화성 시약, 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴(cellfectin), 양이온성 인지질 나노입자, 양이온성 고분자, 양이온성 미셀, 양이온성 에멀젼 또는 리포좀을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 전달체로서의 기능을 하는 것이면 제한없이 사용할 수 있다. 또한, 폴리에틸렌글리콜과 같은 생체적합성 고분자를 접합하여 세포 내 흡수를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드를 세포 내에 도입하기 위한 전달체로 리놀렌산(linolenic acid), 리놀레산(linoleic acid) 및 올레산(oleic acid)과 같은 불포화지방산을 다량 함유하는 식물성 오일을 이용할 수 있음을 확인하였다. 상기 불포화지방산은 세포막의 구조를 변화시켜 투과성(permeability)과 유동성(fluidity)을 증가시킨다. 이러한 변화는 암세포 세포막 내 수용체들의 활성을 변화하여 항암제의 세포내 도입을 용이하게 한다.
본 발명에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 생쥐유방종양바이러스(Mouse mammary tumor virus; MMTV) 프로모터(promoter) 유전자의 전사 시작부위(+1)를 기준으로 업스트림(upstream) (-204) 내지 (-188) 부위를 포함한다.
또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 생쥐유방종양바이러스 프로모터 유전자의 전사 시작부위(+1)를 기준으로 업스트림 (-186) 내지 (-170) 부위를 포함한다.
상기 생쥐유방종양바이러스 프로모터 유전자의 전사 시작부위(+1)를 기준으로 업스트림 (-204) 내지 (-188) 부위는 Kil 서열(Kil sequence) 또는 Kil 부위(Kil site)로 알려져 있고, 상기 업스트림 (-186) 내지 (-170) 부위는 먼쪽 GRE(distal glucocorticoid response element)로 알려져 있다. 특히, Kil 서열은 먼쪽 GRE에 작용하는 스테로이드 호르몬 수용체, 예컨대 GR(glucocorticoid receptor), PR(progesterone receptor), ER(estrogen receptor)의 조절 단백질이 작용하는 인핸서(enhancer)로 알려져 있다 (EMBO Genebank x16475). 이는 핵추출물과 MMTV LTR 유전자를 Foot printing 반응으로 확인되었다. whole cell extract와의 반응에서는 확인되지 않았다. 이를 통해 세포질 내에는 존재하지 않고 핵 내에만 존재하는 단백질이 작용하는 것이 확인되었고. 상기 단백질로 NF kappa B, Oct-1, Sp-1, SW1, STAT3 등의 전사인자들을 들 수 있다.
또한, 이들 부위가 스테로이드 호르몬 반응에 의해 반응하는 세포 인자들과 결합하여 인핸서(enhancer)로 작용하는 것이 알려져 있다(KI Lee., et al. 1995. JBC 270(41): 24502-24508).
본 발명에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 Kil 서열과 먼쪽 GRE를 포함하여 핵 내에서 스테로이드 호르몬 수용체, 구체적으로 안드로겐 수용체(androgen receptor)과 이와 상호작용하는 신호 단백질(signal factor)과 결합한다. 보다 구체적으로 상기 올리고뉴클레오티드는 활성화된 안드로겐 수용체 및 신호 단백질 간 상호작용으로 형성된 안드로겐 수용체 및 신호 단백질 복합체와 결합하고, 이때 활성화된 안드로겐 수용체는 먼쪽 GRE에 결합하고, 상기 신호 단백질은 Kil 서열에 결합한다.
상기 안드로겐 수용체는 여러 신호전달 경로에 의해 활성화되는 것이 알려져 있다. 예컨대, 일부 암에서 안드로겐 수용체는 2가지 신호전달 경로, 구체적으로 안드로겐 의존성(androgen-dependence) 신호전달 경로 및 안드로겐 독립성(androgen-independence) 신호전달 경로를 통해 활성화되어 암세포의 성장을 촉진하는 것이 알려져 있다. 상기 안드로겐 의존성 신호전달 경로는 안드로겐이 세포 내에서 5알파-환원효소(5α-reductase)에 의해 전환되어 생성된 디히드로테스토스테론(dihydrotestosterone)과 안드로겐 수용체가 결합함으로써 안드로겐 수용체가 활성화되는 신호전달 경로이다. 상기 안드로겐 독립성 신호전달 경로는 EGFR과 같은 수용체 타이로신 카이네이즈(receptor tyrosine kinase)의 인산화로 PI3K가 활성화되고, 이로 인해 Akt가 활성화되어 안드로겐 수용체가 활성화되는 신호전달 경로이다. 활성화된 안드로겐 수용체는 핵 내에서 신호 단백질, 예컨대 안드로겐 수용체 요소(androgen receptor element)와 결합하여 유전자의 발현을 촉진한다(L. Gerratana., et al. 2018. Cancer treatment reviews 68: 102-110).
이에, 상기 올리고뉴클레오티드는 안드로겐 의존성 또는 안드로겐 독립성 신호전달 경로를 통해 활성화된 안드로겐 수용체 및 이와 상호작용하는 신호 단백질의 복합체와 결합하여 안드로겐 수용체의 전사 활성을 억제한다. 보다 구체적으로 상기 올리고뉴클레오티드는 안드로겐 수용체의 전사 활성을 억제하여 암세포 성장을 억제한다.
본 발명에서, 상기 암은 안드로겐 수용체 양성 암인 것이 바람직하다. 상기 암은 예컨대 비소세포폐암, 방광암, 유방암, 간암, 전립선암, 대장암, 갑상샘암, 침샘암, 교아세포종 또는 성상 세포종을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로, 상기 암은 안드로겐 수용체 양성의 비소세포폐암, 방광암, 유방암, 간암, 전립선암, 대장암, 갑상샘암, 침샘암, 교아세포종 또는 성상 세포종을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 MMTV 프로모터 부위를 이용하여 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드를 제조하고, 이를 "KilGreene"이라 명명하였다.
또한, 본 발명자들은 상기 KilGreene을 형질도입한 대부분의 EGFR 양성 비소세포폐암(Non Small Lung Cancer; NSLC) 세포주에서 세포사멸이 유도되는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 상기 KilGreene이 세포사멸이 유도된 EGFR 양성 비소세포폐암 세포주의 핵 내 안드로겐 수용체 및 이와 상호작용하는 신호 단백질의 복합체와 결합하는 것을 확인하였고, 구체적으로 KilGreene의 먼쪽 GRE 부위에 EGFR 양성 비소세포폐암 세포주의 핵 내 활성화된 안드로겐 수용체가 결합하고 Kil 서열 부위에 상기 활성화된 안드로겐 수용체와 상호작용하는 신호 단백질이 결합하여 안드로겐 수용체의 전사활성을 억제함으로써, 세포사멸을 유도하는 것을 확인하였다.
이를 통해 도 10의 모식도와 같이 EGFR 양성 비소세포폐암 세포의 세포막 내 EGFR로부터 신호 경로를 통하여 핵 내 신호 단백질과 안드로겐 수용체의 작용으로 전사작용에 의한 암세포 성장이 일어나며, 상기 KilGreene이 안드로젠 수용체와 세포막 내 존재하는 세포성장을 지시하는 tyrosine kinase EGFR의 Cross Talking을 차단하는 것을 확인하였다.
또한, 상기 세포사멸 효과가 나타나는 비소세포폐암 세포에 KilGreene을 형질도입한 후 마우스에 이식한 결과, 종양 성장이 억제되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명자들은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드가 암세포에서 EGFR에 의한 안드로겐 독립성 신호전달 경로를 통해 핵 내에서 활성화된 안드로겐 수용체 및 이와 상호작용하는 신호 단백질과 결합하여 암세포의 성장을 억제하는 효과를 확인하였으므로, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 유전자 치료제로서 안드로겐 수용체 signaling 관련 암 치료용 약학 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다.
상기 약학적으로 허용가능한 담체란, 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 예를 들어, 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 용액 또는 현탁액(예를 들어, 마이크로입자, 리포솜, 또는 세포와 통합된) 형태로 제제화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조되어 투여될 수 있다. 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 핵산 분자를 발현하는 세포의 이식을 포함한다. 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여, 경피 투여, 국소 투여, 흡입 투여, 폐내 투여, 경막 내 투여, 비강내 투여, 정맥내 투여, 근육 내 투여, 피내 투여, 복강내 투여 또는 피하 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 조성물 및 치료 방법은 암이 발생할 수 있는 임의의 동물에 적용가능하며, 동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.
본 발명의 조성물의 유효량의 범위 또는 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 및 조사되는 방사선량을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 1일 당 0.001 ㎍/kg-100 mg/kg(체중)으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 목적에 적합한 약학 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 식물성 오일을 포함하는 형질감염 제제를 제공한다.
본 발명에서, 상기 식물성 오일은 아마씨 오일(flaxseed oil), 옥수수 오일, 보라고 오일(borage oil), 잇꽃 오일(safflower oil), 콩기름, 들기름, 달맞이꽃 오일(evening primrose oil), 해바라기 오일, 까막까치밥 오일(blackcurrant pip oil), 맥아 오일(wheatgerm oil), 삼 오일(hemp oil) 또는 서양호박씨 오일(marrow seed oil)일 수 있고, 구체적으로 아마씨 오일일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 식물성 오일은 오일 총 중량 기준으로 C 18의 지방산을 70 내지 99중량% (w/w)로 포함할 수 있고, 상기 C 18의 지방산의 예로는 리놀렌산(linolenic acid), 리놀레산(linoleic acid) 및 올레산(oleic acid)을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 형질감염 제제는 하기의 단계를 거쳐 시험관 내( in vitro) 또는 생체 내( in vivo) 형질감염에 이용될 수 있다:
1) 형질감염 제제 및 올리고뉴클레오티드를 혼합하고 교반하는 단계;
2) 교반한 혼합물을 상온에서 방치하는 단계;
3) 상기 방치한 혼합물을 시험관 내 또는 생체 내 형질감염하는 단계.
본 발명에서, 상기 형질감염제제 : 올리고뉴클레오티드는 1 내지 5 : 1의 중량비로 혼합될 수 있고, 구체적으로 1 내지 3 : 1의 중량비로 혼합될 수 있으며, 보다 구체적으로 1 내지 2 : 1의 중량비로 혼합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 단계 1)에서 교반은 구체적으로 vortex 기기를 이용하여 30초 내지 120초간, 보다 구체적으로 50초 내지 90초간 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 단계 2)에서 혼합물을 30초 내지 120초간, 보다 구체적으로 50초 내지 90초간 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 인체에 무해한 식물성 오일로 아마씨 오일을 이용하여 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드를 포함한 올리고뉴클레오티드를 세포 및 조직 내 형질감염하여 우수한 형질감염 효율을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 본 발명자들은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드를 포함한 올리고뉴클레오티드를 시험관 내 또는 생체 내 도입하기 위한 전달체로서 인체에 무해한 식물성 오일을 이용할 수 있음을 확인하였으므로, 식물성 오일을 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드를 포함한 올리고뉴클레오티드를 시험관 내 또는 생체 내 형질감염하기 위한 형질감염 제제의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있다.
아울러, 본 발명은
a) 상기 식물성 오일을 포함하는 형질감염 제제; 및
b) 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하는 올리고뉴클레오티드
를 유효성분으로 함유하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 올리고뉴클레오티드 및 암의 종류는 상기 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 기재된 내용과 동일하므로, 구체적인 설명은 상기 내용을 원용하고 이하에서는 식물성 오일 및 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물의 특유한 구성에 대해서만 설명하도록 한다.
본 발명에서, 상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 구체적으로 경구 투여, 경피 투여, 국소 투여, 흡입 투여, 폐내 투여, 경막 내 투여, 비강내 투여, 정맥내 투여, 근육 내 투여, 피내 투여 또는 복강내 투여할 수 있다. 특히, 흡입 투여할 경우 폐 조직으로 올리고뉴클레오티드의 전달 효율을 높일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 인체에 무해한 식물성 오일로 아마씨 오일을 이용하여 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드를 세포 및 조직 내 도입할 수 있고, 아마씨 오일을 이용하여 폐 조직 내로 도입된 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드가 우수한 항암 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명자들은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드를 세포 내 도입하기 위한 전달체로서 인체에 무해한 식물성 오일을 이용할 수 있음을 확인하였으므로, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 및 식물성 오일을 안드로겐 수용체 signaling 관련 암 치료용 약학 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명에서는 또한 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하는 올리고뉴클레오티드 또는 이를 유효성분으로 함유하는 조성물을 개체에 투여하여 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
여기에서 개체는 항암 활성을 통해 예방 또는 치료할 수 있는 질환이 이미 발병되었거나, 발병될 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드, 이를 함유하는 조성물을 개체에 투여함으로써 암 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.
본 발명은 또한 a) 식물성 오일을 함유하는 형질감염 제제; 및
b) 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하는 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 조성물을 개체에 투여하여 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은, 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하는 올리고뉴클레오티드 또는 이를 유효성분으로 함유하는 조성물의 암 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 a) 식물성 오일을 함유하는 형질감염 제제; 및
b) 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하는 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 조성물의 암 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명에서 “치료”는 본 발명의 약학적 조성물을 암 질환에 적용한 결과로서 암 질환의 완치는 물론 암의 성장 또는 다른 기관으로의 전이, 또는 암 증세의 부분적 완치, 호전 및 경감을 포함한다.
본 발명에서 “예방”은 본 발명의 약학적 조성물을 적용하여 암의 발생, 성장 또는 다른 기관으로의 전이 등을 억제 또는 차단함으로써, 암이 사전에 발생되지 않도록 하는 것을 의미한다.
또한 본 발명에 있어서, “유효성분”이란 단독으로 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체(carrier)와 함께 활성을 나타내는 성분을 의미한다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> KilGreene의 제조
서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-AGCTTCCCAGGGTTTAAATAAGTTTAATGGTTACAAACTGTTCTTAAAACGCT-3')로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-AGGGTCCCAAATTTATTCAAATTACCAATGTTTGACAAGAATTTTGCGAGATC-3')로 이루어진 올리고뉴클레오티드 각각을 올리고뉴클레오티드 합성 업체(바이오니아, 한국)에 의뢰하여 합성하였다. 그 다음, 상기 합성한 올리고뉴클레오티드 각각을 동량으로 혼합하고 100℃에서 가열 후 서서히 상온으로 방치하여, 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하도록 하였다. 이후 상기 이중가닥을 형성한 올리고뉴클레오티드를 7% SDS PAGE 겔 상에서 분리하였다. 또한, 상기에서 제조한 이중가닥의 올리고뉴클레오티드는 "KilGreene"이라 명명하였다.
이때, KilGreene은 Kil 서열(Kil sequence 또는 Kil site)로 알려진 생쥐유방종양바이러스(Mouse mammary tumor virus; MMTV) 프로모터(promoter) 유전자의 전사 시작부위(+1)를 기준으로 업스트림(upstream) -204 내지 -188 부위 (서열번호 3: 5'-GGGTTTAAATAAGTTTA-3') 및 먼쪽 GRE(distal glucocorticoid response element)로 알려진 -186 내지 -170 부위(서열번호 4: 5'-GGTTACAAACTGTTCT-3')를 포함한다.
<실험예 1> 비소세포폐암(Non Small Lung Cancer) 세포에서 KilGreene의 항암 효과 확인
KilGreene이 EGFR(epidermal growth factor receptor) 양성 비소세포폐암(Non Small Lung Cancer; NSCLC)에 미치는 영향을 알아보기 위하여, EGFR 양성 또는 음성인 다양한 종류의 비소세포폐암 세포에 KilGreene을 처리하고 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석을 수행하여 세포사멸(cell death) 정도를 확인하였다.
구체적으로, EGFR 양성 비소세포폐암 세포주로 알려진 NCl-H596, Calu-3, SK-LU-1, SK-MES-1 및 NCl-H1793, EGFR 음성 비소세포폐암 세포주로 알려진 NCI-H520를 미국세포주은행(American tissue and cell collection)으로부터 획득하여 10% FBS-MEM 배지 또는 10% FBS-RPMI1640 배지를 사용하여 5% CO 2, 37℃에서 배양하였다. 그 다음 상기 세포 각각을 1×10 5 세포수로 60 mm 배양 디쉬에 접종한 후 상기 <실시예 1>에서 제조한 100 ug의 KilGreene 10 ㎕을 리포펙타민(lipofectamine, Thermo Fisher Scientific) 10 ㎕를 이용하여 제조사의 절차에 따라 형질감염(transfection)한 후 3주간 배양하였다.
배양 후 배양액을 제거하고, 새 배양액 100 μl을 가한 후, 0.2 N NaCl이 포함된 75% 아이소프로판놀(isopropanol)에 용해한 MTT를 가한 후 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이후 반응정지용액인 SDS-HCl 용액(1 g SDS/10 ml 0.01 M HCl) 100 μl을 가하고 4시간 동안 37℃에서 배양하고, microplate leader를 사용하여 570 nM에서 OD를 측정하였다. KilGreene을 형질감염하지 않은 대조군 세포의 OD와 비교하여 % cell death을 계산하였다. 대조군으로는 NIH 3T3 세포주를 사용하여 상기에 기재된 방법과 동일한 방법으로 MTT 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, SK-MES-1을 제외하고 KilGreene을 처리한 EGFR 양성 비소세포폐암 세포주의 경우 현저하게 높은 세포사멸이 나타나는 것을 확인하였다. 또한, KilGreene을 처리한 EGFR 음성 비소세포폐암 세포주의 경우 세포사멸이 미비함을 확인하였다.
<실험예 2> KilGreen 내 Kil 서열에 작용하는 신호 단백질 및 비소세포폐암 세포사멸 작용 확인
KilGreene 내 Kil 서열은 스테로이드 호르몬 수용체의 조절 단백질이 작용하는 것으로 알려져 있는바, KilGreene에 의한 EGFR 양성 암세포의 세포사멸과 스테로이드 호르몬 수용체와 상호작용하는 인자, 즉 신호 단백질(signal factor)와의 연관성을 알아보기 위하여, EGFR(epidermal growth factor receptor) 양성 또는 음성인 다양한 종류의 비소세포폐암 세포에서 추출한 핵단백질과 KilGreene의 Kil 서열을 이용하여 EMSA(electrophoretic mobility shift assay) 분석을 수행하였다.
구체적으로, 1x10 9 세포수의 NCl-H596, Calu-3, SK-LU-1, NCl-H1793, SK-MES-1 및 NCI-H520으로부터 핵단백질을 추출하였다. 핵단백질 용액으로 다음의 용액을 사용하였다: 버퍼 A(10 mM Tris-HCl(pH 7.5), 2 mM MgCl 2, 3 mM NaCl, 0.2 mM 노니뎃 p-40(Nonidet p-40), 0.5 mM PMSF, 2 ug/ml 류펩틴(leupeptin), 2 ug/ml 아프로티닌(aprotinin), 버퍼 B(10 mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.5 mM DTT, 0.5 mM PMSF), buffer C(10 mM Tris-HCl(pH 7.5), 2 mM MgCl 2, 0.5 mM DTT, 0.1 mM PMSF), buffer D(10 mM Tris-HCl(pH 7.5), 80 mM NaCl, 3 mM MgCl 2, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10% 글리세롤). 또한, KI Lee., et al. (JBC 1995 270(41): 24502-24508)에 개시된 방법과 동일한 방법으로 [α- 32P]dCTP 표지된 Kil 서열을 획득하였다.
그 다음, 상기 추출한 핵단백질 2 ug과 상기 [α- 32P]dCTP 표지된 Kil 서열을 1 ug poly(dI-dC)를 포함하는 30 ul 결합 버퍼(10 mM Tris-HCl(pH 7.5), 80 mM NaCl. 3 mM MgCl 2, 0.1 mM EDTA, 1mM PMSF, 5% 글리세롤)에 혼합하고 상온에서 1시간 동안 반응한 후 DNA-단백질 반응물을 6% 폴리아크릴라마이드 겔(polyacrylamide gel) 상에서 전기영동을 통해 분리하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, NCI-H596, Calu-3, SK-LU-1 및 NCI-H1793 세포에서는 Kil 서열에 결합하는 신호 단백질을 확인하였다. 반면, SK-MES-1 및 NCI-H520 세포에서는 Kil 서열에 결합하는 신호 단백질이 확인되지 않았다. 또한, 세포사멸 정도와 Kil 서열에 결합하는 신호 단백질의 양이 비례함을 확인하였다.
상기 결과를 통해 KilGreene의 항암 작용은 Kil 서열에 작용하는 신호 단백질의 정도에 의존함을 알 수 있다.
<실험예 3> KilGreene에 작용하는 신호 단백질과 안드로겐 수용체 확인
비소세포폐암에서 안드로겐 수용체의 발현이 생존율에 악영향을 미치는 것으로 알려져 있다(L. Grant., et al. 2018. Horm Cancer 9(4): 288-294). 이에, KilGreene에 작용하는 신호 단백질과 안드로겐 수용체와의 연관성을 알아보기 위하여, KilGreene 처리에 의한 세포 사멸 효과가 가장 우수한 EGFR 양성 비소세포폐암 세포에서 추출한 핵단백질과 KilGreene의 Kil 서열을 이용하여 EMSA(electrophoretic mobility shift assay) 분석을 수행하였다.
구체적으로 상기 <실험예 2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 도 1에 나타낸 바와 같이 KilGreene에 의한 가장 우수한 효과를 나타내는 EGFR 양성 비소세포폐암 세포주인 1x10 9 세포수의 NCl-H1793으로부터 핵단백질을 추출하였다. 또한, 상기 <실시예 1>에서 제조한 KilGreene에 KI Lee., et al. (JBC 1995 270(41): 24502-24508)에 개시된 방법과 동일한 방법으로 [α- 32P]dCTP를 표지하였다.
그 다음, 상기 추출한 핵단백질 내 안드로겐 수용체를 제거하기 위하여 면역침강(immunoprecipitation)을 다음과 같이 수행하였다. 상기 추출한 핵단백질 875 ul에 래빗 항-안드로겐 수용체 항체(Sigma A4719) 200 ug을 첨가하고 30분간 4℃에서 교반하면서 반응하였다. 반응 후 100 ul의 단백질 A-아가로오스 비드(protein A-Agarose bead)를 첨가하고 상기와 동일한 방법으로 재반응하였다. 반응을 완료한 후 2분간 원심분리하여 비드와 상층액을 분리하였다. 상기 상층액 2 ug과 상기 [α- 32P]dCTP 표지된 KilGreene을 1 ug poly(dI-dC)를 포함하는 30 ul 결합 버퍼(10 mM Tris-HCl(pH 7.5), 80 mM NaCl. 3 mM MgCl 2, 0.1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 5% 글리세롤)에 혼합하고 상온에서 1시간 동안 반응한 후 DNA-단백질 반응물을 6% 폴리아크릴라마이드 겔(polyacrylamide gel) 상에서 전기영동을 통해 분리하였다. 대조군으로 상기 추출한 핵단백질을 사용하여 상기에 기재된 방법과 동일한 방법으로 EMSA 분석을 수행하였다(도 3).
또한, 상층액 내 안드로겐 수용체가 제거되었는지 확인하기 위하여 비드를 회수하고 면역침강 버퍼(1% Tritonx-100, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl(pH 7.4), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA(pH 8.0), 프로테아제 억제제)로 세척한 후 4℃에서 2분간 원심분리하여 비드와 세척액으로 분리하고 각각을 회수하였다. 회수한 비드에 50 ul의 0.1 M 글리신(glycine, pH 2.5)을 첨가하여 혼합한 후 4℃에서 10분간 교반하면서 반응하였다. 그 다음. 4℃에서 2분간 원심분리하여 상층액을 획득하였다. 상기 획득한 상층액(면역침강 생성물) 및 상기 회수한 세척액은 7% SDS PAGE 겔 상에서 전기영동하였다(도 4).
상기 방법을 통해 핵추출물과 안드로겐 수용체가 제거된 핵추출물을 획득하였고, EMSA 분석 및 전기영동을 수행하여 KilGreene에 작용하는 신호 단백질과 안드로겐 수용체를 확인하였다.
그 결과, 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 도 3의 1에서 강하게 나타난 위 밴드 반응물은 도 4의 2에서 면역침강을 통하여 안드로겐 수용체를 제거를 확인한 핵추출물과의 반응에서는 극적으로 감소하였다. 이로써 위 밴드에는 안드로겐 수용체가 존재함을 확인하였다. 반면, 도 4의 2에서 안드로겐 수용체를 항체로 제거하였을 때 Kil 서열에 작용하는 신호 단백질의 작용이 증가하는 것을 확인하였다.
이를 통해, 도 3의 1에서 강하게 반응하는 위 밴드 반응물이 도 3의 2의 안드로겐 수용체 제거 핵추출물과의 반응에서 급격히 감소하므로, 위 밴드 반응물은 먼쪽 GRE에 결합하는 안드로겐 수용체이며, 오히려 증가된 반응을 보이는 아래 밴드 반응물은 kil 서열에 결합하는 신호 단백질임을 확인하였다.
상기 결과를 통해 도 10에 나타낸 바와 같이 안드로겐 수용체 및 EGFR 양성 비소세포폐암 세포에서 KilGreene이 EGFR에 의한 안드로겐 독립성 신호전달을 통해 핵 내에서 활성화된 안드로겐 수용체 및 이와 상호작용하는 신호 단백질과 결합하여 안드로겐 수용체의 전사활성을 억제함을 알 수 있다. 또한, 안드로겐 수용체의 전사활성이 억제되어 암세포의 성장이 억제됨을 알 수 있다.
<실험예 4> 비소세포폐암 세포 이식 마우스 모델에서 KilGreene의 항암 효과 확인
비소세포폐암 세포 이식 마우스 모델에서 KilGreene의 항암 효과를 확인하였다.
구체적으로, 도 1에 나타낸 바와 같이 KilGreene에 의한 가장 우수한 효과를 나타내는 EGFR 양성 비소세포폐암 세포주인 NCI-H1973와 효과가 미비한 EGFR 음성 비소세포폐암 세포주인 NCI-H520를 2×10 6 세포수로 획득하고, 상기 <실시예 1>에서 제조한 100 ug의 KilGreene 10 ㎕을 리포펙타민 10 ㎕를 이용하여 제조사의 절차에 따라 형질감염하였다. 그 다음, 상기 KilGreene이 형질감염된 세포를 Charles river Laboratories에서 입수한 4주령 BALB/C 암컷 누드 마우스의 측면 옆구리에 피하 주사하고 6주간 매주 한번씩 주시어 시간에 캘리퍼(caliper)를 이용하여 종양의 부피를 측정하였다. 종양의 부피는 길이(a), 넓이(b) 및 높이(c)를 측정하여 다음과 같이 계산하였다: 종양 부피 = 종양 길이(a)×종양 넒이(b)×종양 높이(c)/2.
대조군으로 KilGreene을 형질감염하지 않은 세포를 이용하여 상기에서 기재된 방법과 동일한 방법으로 누드 마우스에 피하 주사한 후 종양의 부피를 측정하였다.
그 결과, 도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, KilGreene이 형질감염된 NCI-H1793을 이식한 마우스군에서만 대조군에 비해 종양 부피가 감소하는 것을 확인하였다.
<실험예 5> 식물성 오일을 이용한 KilGreene 형질감염 효율 확인
<5-1> 식물성 오일 내 KilGreene 안정성 확인
인체에 무해한 식물성 오일을 이용하여 KilGreene을 세포 내 또는 조직 내로 형질감염할 수 있는지 알아 보기 위하여, 식물성 오일로 리놀렌산(linolenic acid), 리놀레산(linoleic acid) 및 올레산(oleic acid)이 풍부한 아마씨 오일(flaxseed oil)에서 KilGreene의 안정성을 확인하였다.
구체적으로, PBS 100 ul와 아마씨 오일 100 ul를 혼합하고 vortex 기기로 잘 섞은 후 상기 <실시예 1>에서 제조한 KilGreene 50 ul (50 ug)을 첨가하고 vortex 기기로 잘 섞어 주었다. 그 다음 상온에서 7일, 14일, 21일, 28일 35일, 42일 및 49일 동안 방치한 후 상기 <실험예 3>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 전기영동을 수행하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, KilGreene이 아마씨 오일 내에서 약 40일 간 분해되지 않고 안정적으로 유지됨을 확인하였다.
<5-2> 세포 및 조직 내에서 식물성 오일을 이용한 DNA 형질감염 효율 확인
식물성 오일을 이용하여 KilGreene을 세포 내 또는 조직 내로 형질감염할 수 있는지 알아 보기 위하여, 아마씨 오일을 이용하여 세포 및 조직 내 DNA의 형질감염 효율을 확인하였다.
구체적으로, 세포 내 DNA의 형질감염을 확인하기 위하여 PBS 50 ul와 아마씨 오일 50 ul를 혼합하고 vortex 기기로 잘 섞은 후 pCMV-LacZ 벡터 5 ul를 첨가하고 vortex 기기로 잘 섞어 주었다. 그 다음 상온에서 1분간 방치한 후 NIH 3T3 세포에 처리하여 형질감염하였다. 이때 NIH 3T3 세포는 형질감염 하루 전 BSA가 제거된 배양배지에서 배양한 것을 사용하였다. 그 다음, 베타-갈락토시다아제 염색 키트(beta galactosidase staining kit, abcam)를 이용하여 제조사의 절차에 따라 베타-갈락토시다아제 분석을 수행하였다(도 7).
또한, 조직 내 DNA의 형질감염을 확인하기 위하여 PBS 500 ul와 아마씨 오일 500 ul를 혼합하고 vortex 기기로 잘 섞은 후 루시퍼라아제 플라스미드(luciferase plasmid) 500 ul를 첨가하고 vortex 기기로 잘 섞어 주었다. 그 다음 상온에서 1분간 방치한 후 F344/N 랫트의 꼬리 정맥에 주사하고 24시간 후 루시퍼라아제 분석 키트(Promega)를 이용하여 제조사의 절차에 따라 조직 내 루시퍼라아제 발현을 측정하였다(도 8).
그 결과, 도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 아마씨 오일을 이용하여 세포 및 조직 내 DNA을 형질감염할 수 있음을 확인하였다. 또한, 아마씨 오일을 이용한 DNA 형질감염은 조직 중 폐에서 가장 우수하게 나타남을 확인하였다.
<5-3> 조직 내에서 식물성 오일을 이용한 KilGreene 형질감염 효율 확인
식물성 오일을 이용하여 KilGreene의 조직 내 형질감염을 확인하였다.
구체적으로, F344/N 랫트를 대조군, KilGreene 무처리군 및 KilGreene 처리군으로 나누고, KilGreene 무처리군 및 KilGreene 처리군에는 랫트 육종 세포주(rat sarcoma cell)인 RR1022 세포를 7×10 6 세포수로 PBS 500 ul에 첨가한 후 꼬리 정맥에 주사하여 7일 동안 폐암을 유도하였다.
또한, PBS 200 ul와 아마씨 오일 200 ul를 혼합하고 vortex 기기로 잘 섞은 후 상기 <실시예 1>에서 제조한 KilGreene 100 ul (2 mg)을 첨가하고 vortex 기기로 잘 섞어 주어 KilGreene 형질감염 제제를 제조하였다. 그 다음, KilGreene 처리군에 7일 후부터 상기 KilGreene 형질감염 제제를 2주에 1번씩 6주간 3번 꼬리 정맥에 주사하였다. 6주 후 폐 조직을 적출하고 Indian ink로 염색한 후 육안 관찰하였다. KilGreene 무처리군에는 PBS 500 ul를 꼬리 정맥에 주사하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, KilGreene 처리군의 폐 조직의 경우 KilGreene 무처리군과 달리 대조군의 정상 폐 조직이 유사한 염색 패턴을 나타내는 것을 확인하였다.
상기의 결과를 통해 임상에서 인체에 무해한 식물성 오일을 이용하여 KilGreene을 투여할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 비소세포폐암 세포에서 안드로겐 수용체 및 이와 상호작용하는 신호 단백질의 복합체와 결합하여 암세포의 성장을 억제하는 효과가 있으며, 보다 구체적으로 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 EGFR Tyrosine Kinase 양성 비소세포폐암 세포에서 EGFR에 의한 안드로겐 독립성 신호전달을 통해 핵 내로 이동한 안드로겐 수용체과 상호작용하여 형성된 안드로겐 수용체 및 신호 단백질 복합체와 결합하고, 안드로겐 수용체의 전사 활성을 막아 암세포의 성장을 억제하는 효과가 있으므로, 유전자 치료제로서 안드로겐 수용체 signaling 관련 암 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 1
agcttcccag ggtttaaata agtttaatgg ttacaaactg ttcttaaaac gct 53
<210> 2
<211> 53
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 2
agggtcccaa atttattcaa attaccaatg tttgacaaga attttgcgag atc 53
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<400> 3
gggtttaaat aagttta 17
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> Mouse mammary tumor virus

Claims (18)

  1. 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하는 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 생쥐유방종양바이러스(Mouse mammary tumor virus; MMTV) 프로모터(promoter) 유전자의 전사 시작부위(+1)를 기준으로부터 업스트림(upstream) (-204) 내지 (-188) 부위(Kil 서열: Kil sequence) 및 업스트림 (-186) 내지 (-170) 부위(먼쪽 GRE: distal glucocorticoid response element)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 활성화된 안드로겐 수용체 및 신호 단백질(signal factor) 간 상호작용으로 형성된 안드로겐 수용체 및 신호 단백질의 복합체와 결합하는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 활성화된 안드로겐 수용체는 먼쪽 GRE에 결합하고, 상기 신호 단백질은 Kil 서열에 결합하는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 안드로겐 의존성(androgen-dependence) 또는 안드로겐 독립성(androgen-indepdence) 신호전달 경로를 통해 활성화된 안드로겐 수용체 및 신호 단백질의 복합체와 결합하여 활성화된 안드로겐 수용체의 전사 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 안드로겐 수용체의 전사 활성을 억제하여 암세포 성장을 억제하는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 암은 안드로겐 수용체 양성 암인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 암은 비소세포폐암, 방광암, 유방암, 간암, 전립선암, 대장암, 갑상샘암, 침샘암, 교아세포종 및 성상 세포종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 식물성 오일을 함유하는 형질감염 제제.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 식물성 오일은 아마씨 오일(flaxseed oil), 옥수수 오일, 보라고 오일(borage oil), 잇꽃 오일(safflower oil), 콩기름, 들기름, 달맞이꽃 오일(evening primrose oil), 해바라기 오일, 까막까치밥 오일(blackcurrant pip oil), 맥아 오일(wheatgerm oil), 삼 오일(hemp oil) 및 서양호박씨 오일(marrow seed oil)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 형질감염 제제.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 식물성 오일은 오일 총 중량 기준으로 C 18의 지방산을 70 내지 99중량% (w/w)로 포함하는 것을 특징으로 하는, 형질감염 제제.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 C 18의 지방산은 리놀렌산(linolenic acid), 리놀레산(linoleic acid) 및 올레산(oleic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 형질감염 제제.
  13. a) 제 9항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 형질감염 제제; 및
    b) 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하는 올리고뉴클레오티드
    를 유효성분으로 함유하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 약학 조성물은 경구 투여, 경피 투여, 국소 투여, 흡입 투여, 폐내 투여, 경막 내 투여, 비강내 투여, 정맥내 투여, 근육 내 투여, 피내 투여, 복강내 투여로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 투여 방법으로 투여되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  15. 약학적으로 유효한 양의, 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하는 올리고뉴클레오티드, 또는 이를 유효성분으로 함유하는 조성물을, 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 예방 또는 치료방법.
  16. 약학적으로 유효한 양의, a) 식물성 오일을 함유하는 형질감염 제제; 및 b) 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하는 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 조성물을, 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 예방 또는 치료방법.
  17. 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한, 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하는 올리고뉴클레오티드의 용도.
  18. 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한, a) 식물성 오일을 함유하는 형질감염 제제; 및 b) 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하는 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 조성물의 용도.
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