WO2021221111A1 - Ｒｎａウイルス関連疾患の予防又は治療剤 - Google Patents

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WO2021221111A1
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rna virus
therapeutic agent
virus
related disease
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治久 井上
恵子 今村
二朗 安田
康晃 櫻井
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国立大学法人京都大学
国立大学法人長崎大学
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    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses

Definitions

  • the present invention relates to a prophylactic or therapeutic agent for RNA virus-related diseases.
  • This application applies to U.S. Patent Application No. 63 / 017,677, which was provisionally filed in the United States on April 30, 2020, and U.S. Patent Application No. 63 /, which was provisionally filed in the United States on December 11, 2020.
  • Priority is claimed under Specification 124,098 and their contents are incorporated herein by reference.
  • SARS-CoV-2 Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2
  • Coronavirus 2 poses a pandemic due to efficient human-to-human transmission and high pathogenicity, poses a public health threat (eg,).
  • Non-Patent Document 1 SARS-CoV-2 is a virus belonging to the family Coronaviridae and is an enveloped virus having a single-stranded positive sense RNA genome.
  • the causative virus of emerging viral diseases such as Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS) and Middle East Respiratory Syndrome (MERS) also belongs to the Coronaviridae family.
  • the causative viruses of Ebola virus disease and Marburg virus disease which have a high lethality rate, belong to the Filoviridae family, which is an enveloped virus having a single-stranded negative sense RNA genome.
  • An object of the present invention is to provide a prophylactic or therapeutic agent for RNA virus-related diseases.
  • the present invention includes the following aspects.
  • a prophylactic or therapeutic agent for RNA virus-related diseases which comprises at least one compound selected from the group consisting of these salts and pharmaceutically acceptable solvates thereof.
  • RNA virus-related disease [3] The prophylactic or therapeutic agent for an RNA virus-related disease according to [2], wherein the tamoxifen is in the form of tamoxifen citrate.
  • tamoxifen is in the form of tamoxifen citrate.
  • toremifene is in the form of toremifene citrate.
  • anti-tuberculosis drug is rifampicin.
  • CysLT1 receptor antagonist is pranlukast.
  • RNA virus-related diseases [7] The prophylactic or therapeutic agent for an RNA virus-related disease according to [1], wherein the PPAR ⁇ agonist is pioglitazone.
  • PPAR ⁇ agonist is pioglitazone.
  • 5-LOX inhibitor is dilton.
  • RNA virus is at least one virus belonging to a family selected from the group consisting of Coronaviridae, Filoviridae and Paramyxovirus.
  • RNA virus-related diseases wherein the RNA virus is at least one virus selected from the group consisting of SERS-CoV-2, Ebola virus and Sendai virus.
  • RNA virus-related diseases comprising the step of administering an effective amount of the prophylactic or therapeutic agent for RNA virus-related diseases according to any one of [1] to [13] to a subject in need thereof.
  • Method of treatment comprising the step of administering an effective amount of raloxifene and pioglitazone to a subject in need thereof.
  • RNA virus-related disease which comprises the step of administering an effective amount of raloxifene and remdesivir to a subject in need thereof.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the genomic structure of the Sendai virus (SeV) prepared in Experimental Example 1.
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of cariotype analysis of human induced pluripotent stem cells (iPSC) prepared in Experimental Example 1.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing a timeline of compound screening performed in Experimental Example 1.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing an outline of the compound screening performed in Experimental Example 1.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of the first screening in Experimental Example 1.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of the first screening in Experimental Example 1.
  • 7 (a) and 7 (b) are graphs showing the results of quantitative RT-PCR in Experimental Example 2.
  • FIG. 8 (a) to 8 (f) are graphs showing the dose dependence of each drug on SeV infection evaluated in Experimental Example 2.
  • 9 (a) to 9 (f) are graphs showing the dose dependence of each drug on Ebola virus-like particle (Ebola trVLP) infection evaluated in Experimental Example 3.
  • 10 (a) to 10 (f) are graphs showing the dose dependence of each drug on SARS-CoV-2 infection evaluated in Experimental Example 4.
  • FIG. 11 is a dose-response matrix and a three-dimensional synergy map for SARS-CoV-2 infection of the combined use of raloxifene and remdesivir evaluated in Experimental Example 4.
  • FIG. 11 is a dose-response matrix and a three-dimensional synergy map for SARS-CoV-2 infection of the combined use of raloxifene and remdesivir evaluated in Experimental Example 4.
  • FIG. 12 is a dose-response matrix and a three-dimensional synergy map for SARS-CoV-2 infection in combination with raloxifene and pioglitazone, evaluated in Experimental Example 4.
  • FIG. 13 is a dose-response matrix and a three-dimensional synergy map for SARS-CoV-2 infection with the combination of pioglitazone and remdesivir evaluated in Experimental Example 4.
  • 14 (a) to 14 (c) are graphs showing the dose dependence of tamoxifen, toremifene and clomifen on Ebola trVLP infection evaluated in Experimental Example 5, respectively.
  • FIG. 15 (a) to 15 (c) are graphs showing the dose dependence of tamoxifen, toremifene and clomifen on SARS-CoV-2 infection evaluated in Experimental Example 5, respectively.
  • FIG. 16 is a schematic view showing the structure of the pseudo-type vesicular mouth ulcer virus (VSV) prepared in Experimental Example 6.
  • 17 (a) to 17 (c) are graphs showing the dose dependence of raloxifene, toremifene and clomiphene on pseudotype VSV infection evaluated in Experimental Example 6, respectively.
  • FIG. 18 is a schematic diagram showing the mechanism (part) of the antiviral effect of the selective estrogen receptor modulator (SERM) shown in Experimental Example 6.
  • SERM selective estrogen receptor modulator
  • the invention is a selective estrogen receptor modulator, anti-tuberculous agent, CysLT1 receptor antagonist, PPAR ⁇ agonist, 5-LOX inhibitor, derivatives thereof, pharmaceutically acceptable salts thereof and pharmaceutically acceptable.
  • a prophylactic or therapeutic agent for an RNA virus-related disease which comprises at least one compound selected from the group consisting of these solvates that are permissible in the above as an active ingredient.
  • RNA virus-related diseases can prevent or treat RNA virus-related diseases by suppressing the infection of RNA virus into cells.
  • RNA virus-related diseases include diseases caused by RNA virus infection, specifically, new coronavirus infection (COVID-19), severe acute respiratory syndrome (SARS), and Middle East respiratory syndrome (MERS). ), Ordinary illness, Ebola hemorrhagic fever, Marburg disease, infant acute airway infection, mumps (epidemic parotid adenitis), infant acute airway infection, measles, subacute sclerosing panencephalitis, Hendravirus infection, nipavirus infection , Newcastle disease (conjunctivitis), infant upper airway infection (sensitivity), etc.
  • COVID-19 new coronavirus infection
  • SARS severe acute respiratory syndrome
  • MERS Middle East respiratory syndrome
  • RNA virus-related diseases include diseases caused by RNA virus infection, specifically, new coronavirus infection (COVID-19), severe acute respiratory syndrome (SARS), and Middle East respiratory syndrome (MER
  • the inventors have constructed a compound screening system using Sendai virus (SeV) and human induced pluripotent stem cells (iPSC) to create a US Food and Drug Administration (FDA) approved drug library. Screened.
  • SeV Sendai virus
  • iPSC human induced pluripotent stem cells
  • FDA US Food and Drug Administration
  • compounds belonging to selective estrogen receptor modulators, anti-tuberculosis drugs, CysLT1 receptor antagonists, PPAR ⁇ agonists, and 5-LOX inhibitors were identified as compounds that suppress SeV infection and have low cytotoxicity.
  • the antiviral effect of the selected hit compound was evaluated with Ebola virus (EBOV) and SARS-CoV-2 to complete the present invention.
  • EBOV Ebola virus
  • SARS-CoV-2 SARS-CoV-2
  • SeV is a single-stranded negative sense RNA virus belonging to the genus Respirovirus of the Paramyxoviridae subfamily Paramyxoviridae. SeV is a mouse parainfluenza virus type 1 found in Sendai, Japan, which naturally replicates in the respiratory mucosa. A recombinant attenuated form is produced by genetic engineering, and SeV having a target gene is used for gene therapy in humans.
  • Human iPSCs are widely used in disease models and drug discovery, and undifferentiated iPSCs themselves are also useful for compound screening. Human iPSCs carry the human gene and have the advantage of having a normal karyotype and infinite self-renewal ability.
  • the selective estrogen receptor modulators include raloxifene (CAS number: 84449-90-1), tamoxifen (CAS number: 10540-29-1), and toremifene (CAS number: 89778-). 26-7), clomifen (CAS number: 911-45-5) and the like can be mentioned.
  • Tamoxifen is preferably in the form of tamoxifen citrate (CAS No .: 54965-24-1).
  • the chemical formula of tamoxifen citrate is shown in the following formula (5).
  • Toremifene is preferably in the form of toremifene citrate (CAS No .: 89778-27-8).
  • the chemical formula of toremifene citrate is shown in the following formula (6).
  • RNA virus infection by inhibiting viral entry into host cells via a virus spike protein by a selective estrogen receptor modulator. Clarified.
  • the anti-tuberculosis drug includes rifampicin (CAS number: 13292-46-1).
  • the chemical formula of rifampicin is shown in the following formula (7).
  • the CysLT1 receptor antagonist includes pranlukast (CAS number: 103177-37-3).
  • the chemical formula of pranlukast is shown in the following formula (8).
  • examples of the PPAR ⁇ agonist include pioglitazone (CAS number: 111025-46-8).
  • the chemical formula of pioglitazone is shown in the following formula (9).
  • the 5-LOX inhibitor includes Gilton (CAS No .: 111406-87-2).
  • the chemical formula of Gilton is shown in the following formula (10).
  • the RNA virus includes at least one virus belonging to a family selected from the group consisting of the coronaviridae, filoviridae and paramyxoviridae.
  • viruses belonging to the coronaviridae family include severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SERS-CoV-2).
  • SERS-CoV-2 severe acute respiratory syndrome coronavirus 2
  • viruses belonging to the family Filoviridae include Ebola virus.
  • viruses belonging to the family Paramyxoviridae include Sendai virus.
  • the prophylactic or therapeutic agent of the present embodiment may contain raloxifene as an active ingredient.
  • the prophylactic or therapeutic agent of the present embodiment may further contain pioglitazone or remdesivir as an active ingredient in addition to raloxifene.
  • the prophylactic or therapeutic agent of the present embodiment may contain raloxifene and pioglitazone as active ingredients. As described below in the Examples, the inventors have shown that the combination of raloxifene and pioglitazone synergistically suppresses RNA virus infection.
  • the prophylactic or therapeutic agent of the present embodiment may contain raloxifene and remdesivir as active ingredients.
  • raloxifene and remdesivir as active ingredients.
  • the chemical formula of remdesivir (CAS number: 1809249-37-3) is shown in the following formula (11).
  • the prophylactic or therapeutic agent of the present embodiment may contain pioglitazone and remdesivir as active ingredients. As described below in the Examples, the inventors have shown that the combination of pioglitazone and remdesivir synergistically suppresses RNA virus infection.
  • an active ingredient means that it is contained as a main active ingredient, and that it is contained to the extent that it exerts an effect.
  • the "effect” as used herein refers to a preventive or therapeutic effect on a target RNA virus-related disease, and in some embodiments, may be an infection-suppressing effect on the target virus.
  • pharmaceutically acceptable salts include, for example, inorganic acid salts, alkali metal salts, alkaline earth metal salts, metal salts, ammonium salts, organic amine addition salts, amino acid addition salts. And so on. More specifically, for example, inorganic acid salts such as hydrochlorides, sulfates, hydrobromates, nitrates, phosphates; acetates, mesylates, succinates, maleates, fumarates, etc.
  • inorganic acid salts such as hydrochlorides, sulfates, hydrobromates, nitrates, phosphates; acetates, mesylates, succinates, maleates, fumarates, etc.
  • Organic acid salts such as citrate and tartrate; alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as magnesium salt and calcium salt; metal salts such as aluminum salt and zinc salt; ammonium salt and tetra Ammonium salts such as methylammonium salt; organic amine addition salts such as morpholin and piperidine; amino acid addition salts such as glycine, phenylalanine, lysine, aspartic acid and glutamic acid can be mentioned.
  • Examples of pharmaceutically acceptable solvates include hydrates and organic solvates.
  • the prophylactic or therapeutic agent of the present embodiment is preferably formulated as a pharmaceutical composition containing the above-mentioned compound and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition can be administered orally in the form of, for example, liquids, powders, granules, tablets, capsules, etc., or parenterally in the form of injections, suppositories, external preparations for skin, etc. .. More specific examples of the external preparation for skin include dosage forms such as ointments and patches.
  • binders such as gelatin, cornstarch, tragant gum, and gum arabic
  • excipients such as starch and crystalline cellulose
  • swelling agents such as alginic acid
  • solvents for injections such as water, ethanol, and glycerin
  • adhesives such as rubber-based adhesives and silicone-based adhesives.
  • the pharmaceutical composition may contain additives.
  • Additives include lubricants such as calcium stearate and magnesium stearate; sweeteners such as sucrose, lactose, saccharin and martitol; flavors such as peppermint and red mono oil; stabilizers such as benzyl alcohol and phenol; phosphoric acid. Buffering agents such as salts and sodium acetate; solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol; antioxidants such as ascorbic acid; preservatives such as paraoxybenzoic acid esters (paraben), benzalconium chloride, chlorobutanol, cresol, etc. Agents and the like can be mentioned.
  • the dose of the pharmaceutical composition varies depending on the patient's symptoms, body weight, age, gender, etc. and cannot be unconditionally determined, but in the case of oral administration, for example, 0.1 to 100 mg / kg body weight per administration unit form.
  • the active ingredient (the above-mentioned compound) may be administered once a day or in 2 to 4 divided doses. In the case of an injection, for example, 0.01 to 50 mg of the active ingredient may be administered per administration unit form.
  • the present invention provides a method for preventing or treating an RNA virus-related disease, which comprises the step of administering an effective amount of the above-mentioned prophylactic or therapeutic agent for the RNA virus-related disease to a subject in need thereof. ..
  • the "effective amount" of a prophylactic or therapeutic agent can be said to be an agent containing an active ingredient (compound) in an effective amount.
  • the "effective amount” of the agent or compound refers to the amount of the agent or compound required to bring about a preventive or therapeutic effect on the treated subject, and more specifically, the target RNA virus. The amount may be sufficient to prevent, delay, or minimize at least one or more symptoms associated with the associated disease.
  • the "effective amount" of a compound is the prevention, delay, or minimal of one or more symptoms associated with the RNA virus-related disease of interest, either alone or in combination with other compounds or other treatments. It may be sufficient to limit.
  • Effective amounts of agents or compounds may vary depending on the RNA virus-related disease of interest, the route of administration, the use of excipients, and the combination with other therapeutic treatments, as will be appreciated by those skilled in the art.
  • the prophylactic or therapeutic method of the present embodiment may include a step of administering an effective amount of raloxifene and pioglitazone to a subject who needs it.
  • the prophylactic or therapeutic method of the present embodiment may include a step of administering an effective amount of raloxifene and remdesivir to a subject in need thereof.
  • the prophylactic or therapeutic method of the present embodiment may include a step of administering an effective amount of pioglitazone and remdesivir to a subject in need thereof.
  • the invention comprises selective estrogen receptor modulators, anti-tuberculans, CysLT1 receptor antagonists, PPAR ⁇ agonists, 5-LOX inhibitors, derivatives thereof, for the prevention or treatment of RNA virus-related disorders.
  • the invention comprises selective estrogen receptor modulators, anti-tuberculans, CysLT1 receptor antagonists, PPAR ⁇ agonists, 5-LOX inhibitors, derivatives thereof, for the prevention or treatment of RNA virus-related disorders.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating an RNA virus-related disease, which contains raloxifene and pioglitazone as active ingredients.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating an RNA virus-related disease, which contains raloxifene and remdesivir as active ingredients.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating an RNA virus-related disease, which contains pioglitazone and remdesivir as active ingredients.
  • the invention comprises selective estrogen receptor modulators, anti-tuberculans, CysLT1 receptor antagonists, PPAR ⁇ agonists, 5-LOX inhibitors, for the manufacture of prophylactic or therapeutic agents for RNA virus-related disorders.
  • the present invention provides the use of raloxifene and pioglitazone for the production of prophylactic or therapeutic agents for RNA virus-related diseases.
  • the present invention provides the use of raloxifene and remdesivir for the production of prophylactic or therapeutic agents for RNA virus-related diseases.
  • the present invention provides the use of pioglitazone and remdesivir for the production of prophylactic or therapeutic agents for RNA virus-related diseases.
  • iPSCs Human iPSCs are prepared from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) using previously reported episomal vectors (Sox2, Klf4, Oct3 / 4, L-Myc, Lin28, p53-SHRNA), and StemFit (Ajinomoto Co., Inc.) medium is used. The cells were cultured in the feeder-free culture system used. The iPSC cariotype analysis was performed by LSI Jurce Corporation.
  • RNA quantification assay A US Food and Drug Administration (FDA) approved drug library (Enzo Life Sciences) was used for high-throughput screening.
  • FDA US Food and Drug Administration
  • the compounds used in the RNA quantification assay were purchased from Selleck Chemicals.
  • PCR primers for detecting viral genomic RNA were designed between the NP and P genes. The base sequence of the primers used is shown in Table 1 below.
  • Cell line 293T cells, Huh7 cells and Vero E6 cells (provided by Dr. Ayato Takada, Hokkaido University) were maintained in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin / streptomycin solution. ..
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin / streptomycin solution . fetal bovine serum
  • Ebola trVLP production and infection assay To assess the anti-Ebola virus activity of the compounds, Ebola trVLP expressing a GFP reporter was made using 293T cells (T. Hoenen, et. Al., Modeling the lifecycle of Ebola virus under biosafety level 2 conditions with). virus-like particles containing tetracistronic minigenomes. J Vis Exp, 52381, 2014.).
  • the pCAGGS expression plasmid encoding EBOV-NP, EBOV-VP35, EBOV-VP30, EBOV-L, T7-polymerizer, and the trVLP tetracistronic encoding the EBOV-GP, EBOV-VP40, EBOV-VP24, GFP reporter genes.
  • the minigenome expression plasmid was transfected into 293T cells using the calcium phosphate method. One day after transfection, the culture supernatant was replaced with fresh medium. After another 3 days, the supernatant was collected and clarified by centrifugation at 2,000 xg for 15 minutes to obtain Ebola trVLP. The Ebola trVLP was stored at ⁇ 80 ° C.
  • the Ebola trVLP was subcultured 2-3 times as follows. 293T cells were transfected with a pCAGGS expression plasmid encoding EBOV-NP, EBOV-VP35, EBOV-VP30, EBOV-L and the host factor Tim-1 using the calcium phosphate method. One day after transfection, the cells were exposed to trVLP for 1 day, cultured for another 3 days, and then the culture supernatant was collected to obtain a high titer Ebola trVLP. In the experimental example of the present application, the high titer Ebola trVLP was used.
  • SARS-CoV-2 proliferation and infection assay The SARS-CoV-2 strain (accession number: EPI-ISL-481251, GISAID) isolated from a Japanese patient was grown on Vero E6 cells. Culture supernatants were collected 4 days after infection, clarified by centrifugation at 2,000 xg for 15 minutes and stored at ⁇ 80 ° C. until use.
  • Vero E6 cells were seeded on 96-well plates and incubated for 1 hour in the presence of appropriate concentrations of each compound. The cells were then exposed to SARS-CoV-2 with MOI 0.002 and incubated at 37 ° C. in the presence of the compound. Two days later, it was fixed overnight with 4% PFA.
  • SARS-CoV-2 infection rate %.
  • SynergyFinder https://synergyfinder.fimm.fi/
  • the inhibition rate was calculated.
  • Synergy scores for compound combinations were calculated using the Zero Interaction Potency (ZIP) model. If the synergy score is less than (i) -10, the interaction between the two drugs is likely to be antagonistic, and if (ii) -10 to 10, the interaction between the two drugs is additive. If it is likely to be targeted and greater than (iii) 10, it is determined that the interaction between the two agents is likely to be synergistic.
  • VSV production and infection assay To analyze the mechanism of action of the drug, a vesicular stomatitis virus that has been mimicked with SARS-CoV-2 spike protein or SARS-CoV spike protein and in which the VSV-G gene has been replaced with a firefly luciferase reporter gene ( VSV) (sometimes referred to as VSV ⁇ G-SARS2-S and VSV ⁇ G-SARS-S, respectively) were prepared.
  • VSV firefly luciferase reporter gene
  • a codon-optimized SARS-CoV-2 S gene with a C-terminal deletion of 19 amino acid residues and a codon-optimized SARS-CoV S gene with a C-terminal deletion of 19 amino acid residues were synthesized and In-Fusion HD. It was inserted into a pCAGGS expression plasmid using (Clontech). The pCAGGS plasmid encoding the SARS-CoV-2 S gene or the SARS-CoV-S gene was transfected into 293T cells by the calcium phosphate method.
  • VSV ⁇ G-VSV-G recombinant VSV
  • VSV ⁇ G-VSV-G recombinant VSV
  • the supernatant was collected and centrifuged at 2,000 ⁇ g for 15 minutes for clarification to obtain VSV ⁇ G-SARS2-S or VSV ⁇ G-SARS-S. Stored at -80 ° C until use.
  • VSV having VSV glycoprotein (G) on the envelope (hereinafter, may be referred to as VSV-G) was produced.
  • the pCAGGS plasmid encoding the G gene was transfected into 293T cells, exposed to VSV ⁇ G-VSV-G for 1 hour, and one day later, the culture supernatant was collected to obtain VSV-G.
  • Vero E6 cells were seeded on 96-well plates and incubated for 1 hour in the presence of appropriate concentrations of each compound. Cells were subsequently exposed to each pseudotype VSV and incubated at 37 ° C. in the presence of the compound. After 20 hours, the cells were lysed and the luciferase activity was measured using a SpectraMax iD5 microplate reader (Molecular Device).
  • the SeV genome contains a 3'leader sequence and a 5'trailer sequence, in the order of nucleocapsid (N), phosphoprotein (P), matrix (M), fusion (F), hemagglutinin-neuraminidase (HN), large polymerase (L). It encodes six genes that are transcribed.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the genomic structure of the prepared SeV.
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of the cariotype analysis of the prepared iPSC.
  • An assay system was constructed to measure viral replication by infecting this iPSC with SeV and measuring the number of EGFP-positive iPSCs.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing a timeline of compound screening.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing an outline of compound screening.
  • the iPSC was seeded on a 96-well plate, and after 24 hours, 10 ⁇ M of the compound was added, incubated for 3 hours, and then exposed to SeV.
  • the number of EGFP-positive cells was quantified 48 hours after the virus infection, and the compounds that resulted in a decrease in the number of EGFP-positive cells compared to the negative subject (without compound addition) were extracted.
  • the number of DAPI-positive cells total number of cells was also quantified, and compounds that resulted in a significant decrease compared to the negative subjects were excluded as having strong cytotoxicity. Then, the top 30 compounds having a small number of EGFP-positive cells were designated as hit compounds.
  • FIGS. 5 and 6 are graphs showing the results of the first screening. About 500 compounds were evaluated. In FIGS. 5 and 6, white squares indicate negative control (DMSO). White circles indicate raloxifene, rifampicin, pranlukast, dilton, and pioglitazone among the hit compounds. Table 2 below shows a list of hit compounds. In Table 2, the score indicates the number of EGFP-positive cells (correction value between batches).
  • iPSC was seeded on a 24-well plate, incubated with each compound of 10 ⁇ M for 3 hours, and then infected with SeV. Twenty-four hours after viral infection, RNA was extracted from iPSC and the amount of EGFP mRNA was quantified using quantitative RT-PCR.
  • the measurement results of cells (1 ⁇ M, n 3) supplemented with remdesivir, which is an RNA-dependent RNA polymerase inhibitor, are shown.
  • “vehicle” shows the result in the presence of DMSO, which is a negative control.
  • the graph shows the mean ⁇ standard error, and “*” indicates that there is a significant difference at p ⁇ 0.005.
  • EGFP mRNA was substantially not detected in the cells to which remdesivir was added. This indicates that the assay system using iPSC and SeV can detect the effect of the drug on RNA-dependent RNA polymerase with high sensitivity.
  • the amount of EGFP mRNA was significantly and significantly reduced by the addition of raloxifene, rifampin, pranlukast, pioglitazone or dilton. This result indicates that these hit compounds can inhibit the viral RNA synthesis activity or the steps of the viral life cycle upstream thereof.
  • 8 (a) to 8 (f) are graphs showing the dose dependence of remdesivir, raloxifene, rifampin, pranlukast, pioglitazone and dilton, respectively.
  • Remudeshibiru reduced the infection rate of SeV with IC 50 values 0.077MyuM.
  • Huh7 cells derived from human liver were exposed to Evola trVLP expressing a GFP reporter, and the number of infected cells and cell viability were measured.
  • 9 (a) to 9 (f) are graphs showing the dose dependence of remdesivir, raloxifene, rifampin, pranlukast, pioglitazone and dilton, respectively.
  • remdesivir a nucleotide analog developed as a therapeutic agent for Ebola virus infection, strongly inhibited Ebola trVLP infection, and the IC 50 value was 0.12 ⁇ M, demonstrating the validity of this assay system. ..
  • raloxifene also lowers the rate of infection Ebola trVLP in a dose-dependent manner, IC 50 value was 0.88MyuM. Furthermore, a significant discrepancy between infection inhibitory activity and cytotoxicity was observed, indicating that it has a specific antiviral effect. In contrast, rifampicin, pranlukast, pioglitazone, and zilton did not show significant antiviral activity.
  • raloxifene can be a prophylactic or therapeutic drug for Ebola virus infection.
  • 10 (a) to 10 (f) are graphs showing the dose dependence of remdesivir, raloxifene, rifampin, pranlukast, pioglitazone and dilton, respectively.
  • Remudeshibiru the application to COVID-19 has been approved by the FDA reduced the infection rate of SARS-CoV-2 with IC 50 values 0.89MyuM.
  • raloxifene has an infection rate of SARS-CoV-2 decreased in a dose-dependent manner with IC 50 values of 7.1 ⁇ M.
  • pioglitazone partially suppressed viral infection at high concentrations.
  • rifampicin and pranlukast tended to reduce the infection rate of SARS-CoV-2 but were not significant, and Zilton did not show significant antiviral activity.
  • raloxifene and pioglitazone can be prophylactic or therapeutic agents for SARS-CoV-2 infection.
  • SynergyFinder the combined effects of raloxifene and remdesivir, raloxifene and pioglitazone, and pioglitazone and remdesivir were examined (Ianevski A, Giri AK and Aittokallio T (2020) Synergy Finder 2.0: visual . Nucleic Acids Res 48, W488-W493, 2020.).
  • Vero E6 cells were exposed to wild SARS-CoV-2 in the presence of various concentrations of each of the two compound combinations of laroxyphene and remdesivir, laroxyphene and pioglycazone, and pioglitazone and remdesivir. Then, the number of infected cells was quantified using an immunostaining method, the cell viability was determined, and the combined effect was examined.
  • FIG. 11 is a dose-response matrix and a three-dimensional synergy map for the combined use of raloxifene and remdesivir. If the synergy score is less than (i) -10, the interaction between the two drugs is likely to be antagonistic, and if (ii) -10 to 10, the interaction between the two drugs is additive. If it is likely to be targeted and greater than (iii) 10, it indicates that the interaction between the two agents is likely to be synergistic.
  • FIG. 12 is a dose-response matrix and a three-dimensional synergy map for the combined use of raloxifene and pioglitazone. As a result, it was revealed that raloxifene and pioglitazone also show synergistic antiviral effects at specific concentrations. The ZIP synergy score was 4.49 and the highest synergy score was 12.42.
  • FIG. 13 is a dose-response matrix and a three-dimensional synergy map for the combined use of pioglitazone and remdesivir. As a result, it was revealed that pioglitazone and remdesivir also show synergistic antiviral effects at specific concentrations. The ZIP synergy score was 8.85 and the highest synergy score was 30.42.
  • 15 (a) to 15 (c) are graphs showing the dose dependence of tamoxifen, toremifene, and clomifen, respectively. Consequently, tamoxifen, toremifene, clomiphene, were respectively 10.9MyuM, 10.0, with IC 50 values 6.7MyuM, and shown to exhibit the effect of suppressing the SARS-CoV-2 infection in Vero E6 cells ..
  • raloxifene, tamoxifen, toremifene, and clomifen can all be prophylactic or therapeutic agents for SARS-CoV-2 infection. Furthermore, it was strongly suggested that SERM could be a prophylactic or therapeutic agent for SARS-CoV-2 infection.
  • VSV ⁇ G-SARS2-S pseudo-type vesicular stomatitis virus having a luciferase gene and further having a peaplomer of SARS-CoV-2 or a pseudo-type vesicular stomatitis having a spike protein of SARS-CoV.
  • a virus (VSV ⁇ G-SARS-S) was prepared (FIG. 16) and it was examined whether SERM inhibits the invasion of the pseudotype VSV into host cells. For comparison, a similar study was performed using a vesicular stomatitis virus (VSV-G) having a luciferase gene and a VSV glycoprotein (G) on the envelope.
  • 17 (a) to 17 (c) show the results of incubating Vero E6 cells in the presence of raloxifene, toremifene or clomiphene for 1 hour, exposing them to the pseudotype VSV, and measuring the luciferase activity after cytolysis. show.
  • the horizontal axis represents the treatment concentration of each drug, and the vertical axis represents the relative value with respect to the luciferase activity obtained in the drug-untreated group.
  • the endoplasmic reticulum stomatitis virus does not originally suppress the invasion of host cells by any of laroxifene, tremiphen, and clomiphene, but when the spike protein of SARS-CoV-2 or SARS-CoV-2 is expressed on the envelope, It has been shown that the drug effectively suppresses invasion into host cells.
  • FIG. 18 is a schematic diagram showing a (partial) mechanism of the antiviral effect of SERM. It is possible that SERM disrupts ion homeostasis in endosomes containing viral particles and inhibits membrane fusion to release the viral core into the cytoplasm of the host cell.
  • Table 3 summarizes the effects of each compound on viruses.
  • “+” indicates that virus infection was suppressed, "-” did not suppress virus infection, and "NS” showed a tendency to suppress infection, but it was not significant (" Not Significant) and “ND” indicate that they have not been tested (Not Determined), respectively.
  • RNA virus-related diseases it is possible to provide a prophylactic or therapeutic agent for RNA virus-related diseases.

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Abstract

選択的エストロゲン受容体モジュレーター、抗結核薬、ＣｙｓＬＴ１受容体アンタゴニスト、Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　γ（ＰＰＡＲγ）アゴニスト、Ａｒａｃｈｉｄｏｎａｔｅ　５－ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ（５－ＬＯＸ）阻害剤、これらの誘導体、薬学的に許容されるこれらの塩及び薬学的に許容されるこれらの溶媒和物からなる群より選択される少なくとも一種の化合物を有効成分とする、ＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤。

Description

ＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤
　本発明は、ＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤に関する。本願は、２０２０年４月３０日に米国に仮出願された米国特許出願第６３／０１７，６７７号明細書、及び、２０２０年１２月１１日に米国に仮出願された米国特許出願第６３／１２４，０９８号明細書に基づき優先権を主張し、それらの内容をここに援用する。
　重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の出現は、ヒトからヒトへの効率的な感染と高い病原性のためにパンデミックを引き起こし、公衆衛生上の脅威となっている（例えば、非特許文献１を参照。）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、コロナウイルス科に属するウイルスであり、一本鎖のポジティブセンスＲＮＡゲノムを持つエンベロープウイルスである。
　重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）や中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）等の新興ウイルス疾患の原因ウイルスもコロナウイルス科に属する。また、致死率の高いエボラウイルス病やマールブルグウイルス病の原因ウイルスは、一本鎖のネガティブセンスＲＮＡゲノムを持つエンベロープウイルスであるフィロウイルス科に属している。
R. T. Gandhi, et al., Mild or Moderate Covid-19, N Engl J Med, 383, 1757-1766, 2020.
　コロナウイルスやフィロウイルスの他にも、多くのＲＮＡウイルスが新興・再興感染症の脅威となっており、ＲＮＡウイルス関連疾患の予防薬又は治療薬を見つけることは非常に重要である。本発明は、ＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療薬を提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］選択的エストロゲン受容体モジュレーター、抗結核薬、ＣｙｓＬＴ１受容体アンタゴニスト、Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　γ（ＰＰＡＲγ）アゴニスト、Ａｒａｃｈｉｄｏｎａｔｅ　５－ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ（５－ＬＯＸ）阻害剤、これらの誘導体、薬学的に許容されるこれらの塩及び薬学的に許容されるこれらの溶媒和物からなる群より選択される少なくとも一種の化合物を有効成分とする、ＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤。
［２］前記選択的エストロゲン受容体モジュレーターが、ラロキシフェン、タモキシフェン、トレミフェン又はクロミフェンである、［１］に記載のＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤。
［３］前記タモキシフェンが、タモキシフェンクエン酸塩の形態である、［２］に記載のＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤。
［４］前記トレミフェンが、トレミフェンクエン酸塩の形態である、［２］に記載のＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤。
［５］前記抗結核薬が、リファンピンである、［１］に記載のＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤。
［６］前記ＣｙｓＬＴ１受容体アンタゴニストが、プランルカストである、［１］に記載のＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤。
［７］前記ＰＰＡＲγアゴニストが、ピオグリタゾンである、［１］に記載のＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤。
［８］前記５－ＬＯＸ阻害剤が、ジルトンである、［１］に記載のＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤。
［９］前記ＲＮＡウイルスが、コロナウイルス科、フィロウイルス科及びパラミクソウイルス科からなる群より選択される科に属する少なくとも１種のウイルスである、［１］～［８］のいずれかに記載のＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤。
［１０］前記ＲＮＡウイルスが、ＳＥＲＳ－ＣｏＶ－２、エボラウイルス及びセンダイウイルスからなる群より選択される少なくとも１種のウイルスである、［９］に記載のＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤。
［１１］ラロキシフェン及びピオグリタゾンを有効成分とする、［１］～［１０］のいずれかに記載のＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤。
［１２］レムデシビルを更に含み、ラロキシフェン及びレムデシビルを有効成分とする、［１］～［１０］のいずれかに記載のＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤。
［１３］レムデシビルを更に含み、ピオグリタゾン及びレムデシビルを有効成分とする、［１］～［１０］のいずれかに記載のＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤。
［１４］［１］～［１３］のいずれかに記載のＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤の有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、ＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療方法。
［１５］ラロキシフェン及びピオグリタゾンの有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、［１４］に記載のＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療方法。
［１６］ラロキシフェン及びレムデシビルの有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、［１４］に記載のＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療方法。
［１７］ピオグリタゾン及びレムデシビルの有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、［１４］に記載のＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療方法。
　本発明によれは、ＲＮＡウイルスに対する広域スペクトル薬を提供することができる。
図１は、実験例１で作製したセンダイウイルス（ＳｅＶ）のゲノム構造を示す模式図である。 図２は、実験例１で作製したヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のカリオタイプ解析の結果を示す写真である。 図３は、実験例１で行った化合物スクリーニングのタイムラインを示す模式図である。 図４は、実験例１で行った化合物スクリーニングの概要を示す模式図である。 図５は、実験例１における第一回目のスクリーニング結果を示すグラフである。 図６は、実験例１における第一回目のスクリーニング結果を示すグラフである。 図７（ａ）及び（ｂ）は、実験例２における定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示すグラフである。 図８（ａ）～（ｆ）は、実験例２において評価した、各薬剤のＳｅＶ感染に対する用量依存性を示すグラフである。 図９（ａ）～（ｆ）は、実験例３において評価した、各薬剤のエボラウイルス様粒子（エボラｔｒＶＬＰ）感染に対する用量依存性を示すグラフである。 図１０（ａ）～（ｆ）は、実験例４において評価した、各薬剤のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する用量依存性を示すグラフである。 図１１は、実験例４において評価した、ラロキシフェンとレムデシビルの併用のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する用量反応マトリクスと３次元シナジーマップである。 図１２は、実験例４において評価した、ラロキシフェンとピオグリタゾンの併用のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する用量反応マトリクスと３次元シナジーマップである。 図１３は、実験例４において評価した、ピオグリタゾンとレムデシビルの併用のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する用量反応マトリクスと３次元シナジーマップである。 図１４（ａ）～（ｃ）は、それぞれ、実験例５において評価した、タモキシフェン、トレミフェン及びクロミフェンのエボラｔｒＶＬＰ感染に対する用量依存性を示すグラフである。 図１５（ａ）～（ｃ）は、それぞれ、実験例５において評価した、タモキシフェン、トレミフェン及びクロミフェンのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する用量依存性を示すグラフである。 図１６は、実験例６で作製したシュードタイプ小胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の構造を示す模式図である。 図１７（ａ）～（ｃ）は、それぞれ、実験例６において評価した、ラロキシフェン、トレミフェン及びクロミフェンのシュードタイプＶＳＶ感染に対する用量依存性を示すグラフである。 図１８は、実験例６で示された、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）の抗ウイルス効果のメカニズム（一部）を示す模式図である。
［ＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤］
　１実施形態において、本発明は、選択的エストロゲン受容体モジュレーター、抗結核薬、ＣｙｓＬＴ１受容体アンタゴニスト、ＰＰＡＲγアゴニスト、５－ＬＯＸ阻害剤、これらの誘導体、薬学的に許容されるこれらの塩及び薬学的に許容されるこれらの溶媒和物からなる群より選択される少なくとも一種の化合物を有効成分とする、ＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤を提供する。
　本実施形態の予防又は治療剤は、ＲＮＡウイルスの細胞への感染を抑制することにより、ＲＮＡウイルス関連疾患を予防又は治療することができる。ＲＮＡウイルス関連疾患としては、ＲＮＡウイルスの感染に起因する疾患が挙げられ、具体的には、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、普通感冒、エボラ出血熱、マールブルグ病、幼児急性気道感染症、ムンプス（流行性耳下腺炎）、幼児急性気道感染症、麻疹、亜急性硬化性全脳炎、ヘンドラウイルス感染症、ニパウイルス感染症、ニューカッスル病（結膜炎）、乳幼児上気道感染症（感冒）等が挙げられる。
　実施例において後述するように、発明者らは、センダイウイルス（ＳｅＶ）とヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を用いた化合物スクリーニングシステムを構築し、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）承認薬物ライブラリーをスクリーニングした。その結果、ＳｅＶの感染を抑制し、細胞毒性の低い化合物として、選択的エストロゲン受容体モジュレーター、抗結核薬、ＣｙｓＬＴ１受容体アンタゴニスト、ＰＰＡＲγアゴニスト、５－ＬＯＸ阻害剤に属する化合物を特定した。さらに、選択したヒット化合物の抗ウイルス効果をエボラウイルス（ＥＢＯＶ）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で評価し、本発明を完成させた。
　ＳｅＶは、パラミクソウイルス科パラミクソウイルス亜科のレスピロウイルス属に属する一本鎖のネガティブセンスＲＮＡウイルスである。ＳｅＶは、日本の仙台で発見されたマウスパラインフルエンザウイルス１型で、自然に呼吸器粘膜で複製される。遺伝子操作により組換え弱毒型が作られており、標的遺伝子を持つＳｅＶはヒトの遺伝子治療に用いられている。
　ヒトｉＰＳＣは疾患モデルや創薬に広く用いられており、未分化なｉＰＳＣ自体も化合物スクリーニングに有用である。ヒトｉＰＳＣは、ヒト遺伝子を保有し、正常な核型と無限の自己再生能力を持つという利点を有する。
　本実施形態の予防又は治療剤において、選択的エストロゲン受容体モジュレーターとしては、ラロキシフェン（ＣＡＳ番号：８４４４９－９０－１）、タモキシフェン（ＣＡＳ番号：１０５４０－２９－１）、トレミフェン（ＣＡＳ番号：８９７７８－２６－７）、クロミフェン（ＣＡＳ番号：９１１－４５－５）等が挙げられる。
　ラロキシフェンの化学式を下記式（１）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　タモキシフェンの化学式を下記式（２）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　トレミフェンの化学式を下記式（３）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　クロミフェンの化学式を下記式（４）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　タモキシフェンは、タモキシフェンクエン酸塩（ＣＡＳ番号：５４９６５－２４－１）の形態であることが好ましい。タモキシフェンクエン酸塩の化学式を下記式（５）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　トレミフェンは、トレミフェンクエン酸塩（ＣＡＳ番号：８９７７８－２７－８）の形態であることが好ましい。トレミフェンクエン酸塩の化学式を下記式（６）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　実施例において後述するように、発明者らは、選択的エストロゲン受容体モジュレーターが、ネガティブセンスＲＮＡウイルスとポジティブセンスＲＮＡウイルスの両方にまたがる非常に異なるファミリーに属するＳｅＶ、ＥＢＯＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染を阻害することを見出した。したがって、選択的エストロゲン受容体モジュレーターは、広域的なＲＮＡウイルス阻害剤の一例である。また、実施例において後述するように、発明者らは、選択的エストロゲン受容体モジュレーターが、ウイルスのスパイクタンパク質を介した宿主細胞へのウイルス侵入を阻害することで、ＲＮＡウイルスの感染を抑制することを明らかにした。
　本実施形態の予防又は治療剤において、抗結核薬としては、リファンピン（ＣＡＳ番号：１３２９２－４６－１）が挙げられる。リファンピンの化学式を下記式（７）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　本実施形態の予防又は治療剤において、ＣｙｓＬＴ１受容体アンタゴニストとしては、プランルカスト（ＣＡＳ番号：１０３１７７－３７－３）が挙げられる。プランルカストの化学式を下記式（８）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　本実施形態の予防又は治療剤において、ＰＰＡＲγアゴニストとしては、ピオグリタゾン（ＣＡＳ番号：１１１０２５－４６－８）が挙げられる。ピオグリタゾンの化学式を下記式（９）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　本実施形態の予防又は治療剤において、５－ＬＯＸ阻害剤としては、ジルトン（ＣＡＳ番号：１１１４０６－８７－２）が挙げられる。ジルトンの化学式を下記式（１０）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　本実施形態の予防又は治療剤において、ＲＮＡウイルスとしては、コロナウイルス科、フィロウイルス科及びパラミクソウイルス科からなる群より選択される科に属する少なくとも１種のウイルスが挙げられる。
　コロナウイルス科に属するウイルスとしては重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＥＲＳ－ＣｏＶ－２）が挙げられる。フィロウイルス科に属するウイルスとしては、エボラウイルスが挙げられる。パラミクソウイルス科に属するウイルスとしては、センダイウイルスが挙げられる。
　本実施形態の予防又は治療剤は、ラロキシフェンを有効成分として含むものであってもよい。また、本実施形態の予防又は治療剤は、ラロキシフェンに加え、ピオグリタゾン又はレムデシビルを更に有効成分として含むものであってもよい。
　すなわち、本実施形態の予防又は治療剤は、ラロキシフェン及びピオグリタゾンを有効成分とするものであってもよい。実施例において後述するように、発明者らは、ラロキシフェン及びピオグリタゾンの併用が、相乗的にＲＮＡウイルス感染を抑制することを明らかにした。
　あるいは、本実施形態の予防又は治療剤は、ラロキシフェン及びレムデシビルを有効成分とするものであってもよい。実施例において後述するように、発明者らは、ラロキシフェン及びレムデシビルの併用が、相乗的にＲＮＡウイルス感染を抑制することを明らかにした。レムデシビル（ＣＡＳ番号：１８０９２４９－３７－３）の化学式を下記式（１１）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　また、本実施形態の予防又は治療剤は、ピオグリタゾン及びレムデシビルを有効成分として含むものであってもよい。実施例において後述するように、発明者らは、ピオグリタゾン及びレムデシビルの併用が、相乗的にＲＮＡウイルス感染を抑制することを明らかにした。
　本明細書において、「有効成分として含む」とは、主要な活性成分として含むという意味であり、効果を奏する程度に含有するという意味である。ここでいう「効果」とは、対象とするＲＮＡウイルス関連疾患に対する予防又は治療効果を指し、ある態様においては、対象とするウイルスに対する感染抑制効果であってもよい。
　本実施形態の予防又は治療剤において、薬学的に許容される塩としては、例えば、無機酸塩、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等が挙げられる。より具体的には、例えば、塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、メシル酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩等の有機酸塩；ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、亜鉛塩等の金属塩；アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等のアンモニウム塩；モルホリン、ピペリジン等の有機アミン付加塩；グリシン、フェニルアラニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸付加塩等が挙げられる。また、薬学的に許容される溶媒和物としては、例えば、水和物、有機溶媒和物等が挙げられる。
　本実施形態の予防又は治療剤は、上述した化合物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物として製剤化されていることが好ましい。医薬組成物は、例えば、液剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の形態で経口的に、あるいは、注射剤、坐剤、皮膚外用剤等の形態で非経口的に投与することができる。皮膚外用剤としては、より具体的には、軟膏剤、貼付剤等の剤型が挙げられる。
　薬学的に許容される担体としては、通常医薬組成物の製剤に用いられるものを特に制限なく用いることができる。より具体的には、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤；デンプン、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤；水、エタノール、グリセリン等の注射剤用溶剤；ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等の粘着剤等が挙げられる。
　医薬組成物は添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン、マルチトール等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノール等の安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；アスコルビン酸等の酸化防止剤；パラオキシ安息香酸エステル類（パラベン）、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、クレゾール等の防腐剤等が挙げられる。
　医薬組成物の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、経口投与の場合には、例えば、投与単位形態あたり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の有効成分（上述した化合物）を１日１回又は２～４回程度に分けて投与すればよい。また、注射剤の場合には、例えば、投与単位形態あたり０．０１～５０ｍｇの有効成分を投与すればよい。
［ＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療方法］
　１実施形態において、本発明は、上述したＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤の有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、ＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療方法を提供する。
　本明細書において、「有効量」の予防又は治療剤とは、有効成分（化合物）を有効量含む剤ということができる。ここで、剤又は化合物の「有効量」とは、処置された対象に予防又は治療効果をもたらすのに必要とされる剤又は化合物の量を指し、より具体的には、対象とするＲＮＡウイルス関連疾患に関連する少なくとも１つ以上の症状を阻止、遅延、又は最小限にするために十分な量であってよい。
　ある態様において化合物の「有効量」とは、化合物単独で、又は他の化合物ないしは他の処置を組み合わせて、対象とするＲＮＡウイルス関連疾患に関連する１つ以上の症状を阻止、遅延、又は最小限にするために十分な量であってよい。
　剤又は化合物の有効量は、当業者によって認識されるように、対象とするＲＮＡウイルス関連疾患、投与経路、賦形剤の使用、及び他の治療処置との併用に応じて変化し得る。
　本実施形態の予防又は治療方法は、ラロキシフェン及びピオグリタゾンの有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含むものであってもよい。
　あるいは、本実施形態の予防又は治療方法は、ラロキシフェン及びレムデシビルの有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含むものであってもよい。
　あるいは、本実施形態の予防又は治療方法は、ピオグリタゾン及びレムデシビルの有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含むものであってもよい。
［その他の実施形態］
　１実施形態において、本発明は、ＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療のための、選択的エストロゲン受容体モジュレーター、抗結核薬、ＣｙｓＬＴ１受容体アンタゴニスト、ＰＰＡＲγアゴニスト、５－ＬＯＸ阻害剤、これらの誘導体、薬学的に許容されるこれらの塩及び薬学的に許容されるこれらの溶媒和物からなる群より選択される少なくとも一種の化合物を提供する。
　選択的エストロゲン受容体モジュレーター、抗結核薬、ＣｙｓＬＴ１受容体アンタゴニスト、ＰＰＡＲγアゴニスト、５－ＬＯＸ阻害剤、これらの誘導体、薬学的に許容されるこれらの塩及び薬学的に許容されるこれらの溶媒和物については、上述したものと同様である。
　１実施形態において、本発明は、ＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療のための医薬組成物であって、ラロキシフェン及びピオグリタゾンを有効成分として含有する医薬組成物を提供する。
　１実施形態において、本発明は、ＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療のための医薬組成物であって、ラロキシフェン及びレムデシビルを有効成分として含有する医薬組成物を提供する。
　１実施形態において、本発明は、ＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療のための医薬組成物であって、ピオグリタゾン及びレムデシビルを有効成分として含有する医薬組成物を提供する。
　１実施形態において、本発明は、ＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤の製造のための、選択的エストロゲン受容体モジュレーター、抗結核薬、ＣｙｓＬＴ１受容体アンタゴニスト、ＰＰＡＲγアゴニスト、５－ＬＯＸ阻害剤、これらの誘導体、薬学的に許容されるこれらの塩及び薬学的に許容されるこれらの溶媒和物からなる群より選択される少なくとも一種の化合物の使用を提供する。
　１実施形態において、本発明は、ＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤の製造のための、ラロキシフェン及びピオグリタゾンの使用を提供する。
　１実施形態において、本発明は、ＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤の製造のための、ラロキシフェン及びレムデシビルの使用を提供する。
　１実施形態において、本発明は、ＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤の製造のための、ピオグリタゾン及びレムデシビルの使用を提供する。
　次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［材料及び方法］
（ｉＰＳ細胞の作製）
　ヒトｉＰＳＣは、既報のエピソーマルベクター（Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ３／４、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、ｐ５３－ｓｈＲＮＡ）を用いて末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から作製し、ＳｔｅｍＦｉｔ（味の素社）培地を用いたフィーダーフリー培養系で培養した。ｉＰＳＣのカリオタイプ解析はＬＳＩメディエンス社で行った。
（化合物）
　ハイスループットスクリーニングには、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）承認薬物ライブラリー（エンゾライフサイエンス社）を使用した。ＲＮＡ定量アッセイに使用した化合物はＳｅｌｌｅｃｋ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社より購入した。
（センダイウイルスとヒトｉＰＳ細胞を使用した化合物スクリーニング）
　ハイスループット化合物スクリーニングのために、ヒトｉＰＳＣをＴｒｙｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で単細胞に解離し、１０μＭ　Ｙ－２７６３２（ナカライテスク社）を含有するＳｔｅｍＦｉｔを用いてｉＭａｔｒｉｘでコーティングした９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、培地を、化合物を含む新鮮なＳｔｅｍＦｉｔに交換し、３時間インキュベートした。続いて、ｉＰＳＣを、ＥＧＦＰ遺伝子を有するセンダイウイルス（ＳｅＶ）に暴露した。感染の多重度（ＭＯＩ）は１と推定した。
　４８時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中、室温で１０分間固定した。４’６－ジアミノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を核の標識に使用した。細胞画像は、ＩＮ　ＣＥＬＬ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　６０００（ＧＥヘルスケア社）又はＩＮ　ＣＥＬＬ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　２０００（ＧＥヘルスケア社）を用いて取得し、ＥＧＦＰ陽性細胞数をＩＮ　ＣＥＬＬ　Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒツールボックスソフトウェア１．９２　（ＧＥヘルスケア社）を用いて定量化した。
（定量的ＲＴ－ＰＣＲ）
　ヒトｉＰＳＣをＳｔｅｍＦｉｔ（味の素社）中でｉＭａｔｒｉｘコートした２４ウェルプレートに播種し、ＳｅＶに暴露した。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、培養したヒトｉＰＳＣの全ＲＮＡをｍｉＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉキット（キアゲン社）を用いて抽出した。続いて、５００ｎｇのＲＮＡをＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ（東洋紡社）を用いて逆転写した。オリゴｄＴを用いた逆転写によりｍＲＮＡレベルを測定し、ランダムプライマーを用いた逆転写によりウイルスゲノムＲＮＡレベルを測定した。定量ＰＣＲ解析は、ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ　ＩＩ（タカラバイオ社）とＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて行った。ウイルスゲノムＲＮＡを検出するためのＰＣＲプライマーは、ＮＰ遺伝子とＰ遺伝子の間に設計した。使用したプライマーの塩基配列を下記表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
（細胞株）
　２９３Ｔ細胞、Ｈｕｈ７細胞及びＶｅｒｏ　Ｅ６細胞（北海道大学、高田礼人博士より提供）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。
（エボラｔｒＶＬＰの産生と感染アッセイ）
　化合物の抗エボラウイルス活性を評価するために、ＧＦＰレポーターを発現するエボラｔｒＶＬＰを、２９３Ｔ細胞を用いて作製した（T. Hoenen, et. al., Modeling the lifecycle of Ebola virus under biosafety level 2 conditions with virus-like particles containing tetracistronic minigenomes. J Vis Exp, 52381, 2014.）。ＥＢＯＶ－ＮＰ、ＥＢＯＶ－ＶＰ３５、ＥＢＯＶ－ＶＰ３０、ＥＢＯＶ－Ｌ、Ｔ７－ポリメラーゼをコードするｐＣＡＧＧＳ発現プラスミド、及び、ＥＢＯＶ－ＧＰ、ＥＢＯＶ－ＶＰ４０、ＥＢＯＶ－ＶＰ２４、ＧＦＰレポーター遺伝子をコードするｔｒＶＬＰテトラシストロニックミニゲノムの発現プラスミドを、リン酸カルシウム法を用いて２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの１日後、培養上清を新鮮な培地と交換した。さらに３日後、上清を回収し、２，０００×ｇで１５分間遠心分離により清澄化して、エボラｔｒＶＬＰを得た。当該エボラｔｒＶＬＰは－８０℃で保存した。
　前記エボラｔｒＶＬＰの力価を増加させるために、エボラｔｒＶＬＰを以下のように２～３回継代した。ＥＢＯＶ－ＮＰ、ＥＢＯＶ－ＶＰ３５、ＥＢＯＶ－ＶＰ３０、ＥＢＯＶ－Ｌ及び宿主因子Ｔｉｍ－１をコードするｐＣＡＧＧＳ発現プラスミドを、２９３Ｔ細胞にリン酸カルシウム法を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの１日後、前記細胞にｔｒＶＬＰを１日間暴露し、さらに３日間培養した後、培養上清を回収して高力価エボラｔｒＶＬＰを得た。本願実験例では、当該高力価エボラｔｒＶＬＰを使用した。
　化合物の抗ウイルス活性を評価するために、ＴｒａｎｓＩＴ　ＬＴ１トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ社）を用いて、ＥＢＯＶ－ＮＰ、ＥＢＯＶ－ＶＰ３５、ＥＢＯＶ－ＶＰ３０及びＥＢＯＶ－ＬをコードするｐＣＡＧＧＳ発現プラスミドをＨｕｈ７細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの２日後に、細胞を適当な濃度の各化合物で前処理し、継代したｔｒＶＬＰに暴露して、化合物の存在下で２日間インキュベートした。
　続いて、ｔｒＶＬＰに暴露した細胞を１０％ホルマリンで一晩固定した後、核染色のためにＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２色素で染色し、４×レンズを備えたＣｙｔａｔｉｏｎ　５イメージングプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）で画像化した。細胞核及び感染細胞の計数は、Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｆｉｌｅｒ画像解析ソフトウェア（米国Ｂｒｏａｄ研究所）及びカスタマイズされた解析パイプラインを用いて行った。
（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖及び感染アッセイ）
　日本人患者から分離したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株（アクセッション番号：ＥＰＩ－ＩＳＬ－４８１２５１、ＧＩＳＡＩＤ）をＶｅｒｏ　Ｅ６細胞で増殖させた。感染から４日後に培養上清を回収し、２，０００×ｇ、１５分間の遠心分離により清澄化し、使用するまで－８０℃で保存した。
　化合物の抗ウイルス活性を評価するために、Ｖｅｒｏ　Ｅ６細胞を９６ウェルプレートに播種し、適切な濃度の各化合物の存在下で１時間インキュベートした。次いで、細胞にＭＯＩ　０．００２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を暴露し、化合物の存在下、３７℃でインキュベートした。２日後、４％ＰＦＡを用いて一晩固定した。
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した細胞は、一次抗体としてウサギ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ　Ｎ抗体、二次抗体としてＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を用いた蛍光免疫染色により検出した。総細胞数の検出は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２色素を用いた核染色により行った。総細胞数（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２陽性細胞数）に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞数（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８陽性細胞数）の割合を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染率（％）として算出した。
　細胞は、４×レンズを備えたＣｙｔａｔｉｏｎ５イメージングプレートリーダーで画像化した。細胞核及び感染細胞のカウントは、Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｆｆｉｌｅｒ画像解析ソフトウェア及びカスタマイズされた解析パイプラインを用いて行った。複製能力のあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を用いたすべての実験は、長崎大学のバイオセーフティーレベル３（ＢＳＬ３）の研究室で行った。
（薬剤の組み合わせ分析）
　薬剤併用の有効性を調べるために、ＳｙｎｅｒｇｙＦｉｎｄｅｒ（https://synergyfinder.fimm.fi/）を用いて、ラロキシフェンと、レムデシビル又はピオグリタゾンの各用量の組み合わせについて、各薬剤単独と比較してウイルス感染に対する阻害率（％）を算出した。化合物の組み合わせに対するシナジースコアは、Ｚｅｒｏ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　Ｐｏｔｅｎｃｙ（ＺＩＰ）モデルを用いて算出した。シナジースコアが（ｉ）－１０未満の場合、２つの薬剤間の相互作用は拮抗的である可能性が高く、（ｉｉ）－１０から１０までの場合、２つの薬剤間の相互作用は相加的である可能性が高く、（ｉｉｉ）１０より大きい場合、２つの薬剤間の相互作用は相乗的である可能性が高い、と判断される。
（シュードタイプＶＳＶの産生と感染アッセイ）
　薬剤の作用機序を解析するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質又はＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイク蛋白質で擬型化され、且つ、ＶＳＶ－Ｇ遺伝子がホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子で置換された小胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）（それぞれ、ＶＳＶΔＧ－ＳＡＲＳ２－Ｓ、ＶＳＶΔＧ－ＳＡＲＳ－Ｓと呼ぶ場合がある）を作製した。
　Ｃ末端を１９アミノ酸残基欠失させたコドン最適化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓ遺伝子と、Ｃ末端を１９アミノ酸残基欠失させたコドン最適化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ　Ｓ遺伝子を合成し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ（クロンテック社）を用いてｐＣＡＧＧＳ発現プラスミドに挿入した。前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓ遺伝子又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－Ｓ遺伝子をコードするｐＣＡＧＧＳプラスミドを、２９３Ｔ細胞にリン酸カルシウム法でトランスフェクションした。トランスフェクションの１日後、ＶＳＶ－Ｇ遺伝子をホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子で置換した組換えＶＳＶ（以降、ＶＳＶΔＧ－ＶＳＶ－Ｇと呼ぶ場合がある）を前記細胞に１時間感染させた。感染１日後に上清を採取し、２，０００×ｇで１５分間遠心分離して清澄化して、ＶＳＶΔＧ－ＳＡＲＳ２－Ｓ又はＶＳＶΔＧ－ＳＡＲＳ－Ｓを得た。使用するまで－８０℃で保存した。
　感染させたウイルスのコンタミネーションに対するコントロールとして、エンベローブ上にＶＳＶ糖タンパク質（Ｇ）を有するＶＳＶ（以降、ＶＳＶ－Ｇと呼ぶ場合がある）を製造した。Ｇ遺伝子をコードするｐＣＡＧＧＳプラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、ＶＳＶΔＧ－ＶＳＶ－Ｇに１時間暴露し、その１日後に培養上清を採取してＶＳＶ－Ｇを得た。
　シュードタイプＶＳＶ感染に対する化合物の効果を評価するために、Ｖｅｒｏ　Ｅ６細胞を９６ウェルプレートに播種し、適切な濃度の各化合物の存在下で１時間インキュベートした。続いて、細胞を各シュードタイプＶＳＶに暴露し、化合物の存在下、３７℃でインキュベートした。２０時間後、細胞を溶解し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ　ｉＤ５マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス社）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
（統計解析）
　結果は、統計的有意性を決定するために、ダネットのポストホック検定に続いて、一方向ＡＮＯＶＡを用いて分析された。ｐ＜０．０５の差を有意とみなした。解析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ用のＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン８．０（ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を使用して行った。
［実験例１］
（ヒトｉＰＳ細胞とＳｅＶを用いた抗ＲＮＡウイルス薬のスクリーニング）
　ＲＮＡウイルスに対する治療薬を同定するための化合物スクリーニングを、センダイウイルス（ＳｅＶ）及びヒトｉＰＳＣを用いて実施した。
　ＳｅＶゲノムは３’リーダー配列と５’トレーラー配列を含み、ヌクレオカプシド（Ｎ）、ホスホプロテイン（Ｐ）、マトリックス（Ｍ）、融合（Ｆ）、ヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）、ラージポリメラーゼ（Ｌ）の順に転写される６つの遺伝子をコードしている。
　他の細胞に感染し得る子孫ウイルスを産生する能力を排除するために、Ｆ遺伝子を除去し、ウイルスゲノムＲＮＡの３’領域にＥＧＦＰ遺伝子を有するＳｅＶを作製した。図１は、作製したＳｅＶのゲノム構造を示す模式図である。
　また、健常者からヒトｉＰＳＣを作製した。図２は、作製したｉＰＳＣのカリオタイプ解析の結果を示す写真である。このｉＰＳＣにＳｅＶを感染させ、ＥＧＦＰ陽性ｉＰＳＣの数を測定することでウイルスの複製を測定するアッセイ系を構築した。
　図３は化合物スクリーニングのタイムラインを示す模式図である。図４は化合物スクリーニングの概要を示す模式図である。９６ウェルプレートにｉＰＳＣを播種し、２４時間後に１０μＭの化合物を添加して３時間インキュベートした後、ＳｅＶに暴露した。ウイルス感染から４８時間後にＥＧＦＰ陽性細胞数を定量し、陰性対象（化合物非添加）よりもＥＧＦＰ陽性細胞数が減少する結果となった化合物を抽出した。また、ＤＡＰＩ陽性細胞数（総細胞数）も定量し、陰性対象よりも大幅に減少する結果となった化合物は細胞毒性が強いものとして除外した。そして、ＥＧＦＰ陽性細胞数の少ない上位３０化合物をヒット化合物とした。
　図５、図６は、第一回目のスクリーニング結果を示すグラフである。約５００種類の化合物を評価した。図５、図６中、白四角はネガティブコントロール（ＤＭＳＯ）を示す。白丸はヒット化合物のうち、ラロキシフェン、リファンピン、プランルカスト、ジルトン、ピオグリタゾンを示す。下記表２にヒット化合物のリストを示す。表２中、スコアはＥＧＦＰ陽性細胞数（バッチ間での補正値）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
［実験例２］
（ＦＤＡ承認薬によるウイルス複製の阻害）
　ヒット化合物の中から、心血管循環や中枢神経系への影響が少ない薬剤を選択し、次の解析に向けて、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）であるラロキシフェン、抗結核薬であるリファンピン、ＣｙｓＬＴ１アンタゴニストであるプランルカスト、ＰＰＡＲγアゴニストであるピオグリタゾン、５－ＬＯＸ阻害剤であるジルトンのターゲットの異なる５つの薬剤に焦点を当てた。
　２４ウェルプレートにｉＰＳＣを播種し、１０μＭの各化合物で３時間インキュベートした後、ＳｅＶを感染させた。ウイルス感染から２４時間後、ｉＰＳＣからＲＮＡを抽出し、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法を用いてＥＧＦＰのｍＲＮＡ量を定量した。
　図７（ａ）に、ラロキシフェン、リファンピン、プランルカスト、ピオグリタゾン又はジルトンを添加した細胞（いずれも１０μＭ、ｎ＝３）、図７（ｂ）に、ＣＯＶＩＤ－１９への適用がＦＤＡに承認されたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤であるレムデシビルを添加した細胞（１μＭ、ｎ＝３）の測定結果を示す。図７（ａ）及び（ｂ）中、「ベヒクル」はネガティブコントロールであるＤＭＳＯの存在下における結果を示す。また、グラフは平均±標準誤差を示し、「＊」はｐ＜０．００５で有意差が存在することを示す。
　まず、図７（ｂ）に示されるように、レムデシビルを添加した細胞では、ＥＧＦＰのｍＲＮＡは実質的に検出されなかった。これにより、前記ｉＰＳＣとＳｅＶを用いたアッセイ系では、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対する薬剤の影響が感度よく検出できることが示された。次に、図７（ａ）より、ラロキシフェン、リファンピン、プランルカスト、ピオグリタゾン又はジルトンの添加によっても、ＥＧＦＰのｍＲＮＡ量が有意且つ大幅に減少した。この結果は、これらのヒット化合物がウイルスのＲＮＡ合成活性又はその上流のウイルスライフサイクルのステップを阻害し得ることを示すものである。
　続いて、これらの薬剤のＳｅＶ感染に対する用量依存性を評価した。図８（ａ）～（ｆ）は、それぞれ、レムデシビル、ラロキシフェン、リファンピン、プランルカスト、ピオグリタゾン及びジルトンの用量依存性を示すグラフである。
　その結果、レムデシビルは、ＩＣ５０値０．０７７μＭでＳｅＶの感染率を低下させた。これにより、本アッセイ系が薬剤のＲＮＡウイルス感染抑制効果の評価系として有用であることが示された。また、ラロキシフェン、リファンピン、プランルカスト、ピオグリタゾン、ジルトンは、それぞれ、４．３μＭ、３．９μＭ、５．０μＭ、４．９μＭ、４．５μＭのＩＣ５０値を示し、用量依存的にＳｅＶの感染率を低下させることが明らかとなった。
　よって、レムデシビルと同様にラロキシフェン、リファンピン、プランルカスト、ピオグリタゾン、ジルトンも、ＲＮＡウイルスの１種であるセンダイウイルスの細胞への感染を効果的に抑制できることが示された。
［実験例３］
（エボラウイルスライフサイクルモデリングシステムを用いた化合物の評価）
　選択した化合物の抗ウイルス活性を評価するために、野生型ウイルスとは異なり、バイオセーフティーレベル４（ＢＳＬ４）実験室を必要としない、転写及び複製能力のあるウイルス様粒子（ｔｒＶＬＰ）システムを用いて抗エボラウイルス活性を評価した。
　様々な濃度の各化合物の存在下で、ヒト肝臓由来のＨｕｈ７細胞を、ＧＦＰレポーターを発現するエボラｔｒＶＬＰに暴露し、感染細胞数及び細胞生存率を測定した。
　図９（ａ）～（ｆ）は、それぞれ、レムデシビル、ラロキシフェン、リファンピン、プランルカスト、ピオグリタゾン及びジルトンの用量依存性を示すグラフである。その結果、エボラウイルス感染症の治療薬として開発されたヌクレオチドアナログであるレムデシビルは、エボラｔｒＶＬＰ感染を強力に阻害し、ＩＣ５０値は０．１２μＭであり、本アッセイ系の妥当性が示された。
　また、ラロキシフェンもエボラｔｒＶＬＰの感染率を用量依存的に低下させ、ＩＣ５０値は０．８８μＭであった。さらに、感染阻害活性と細胞毒性の間に有意な乖離が認められたことから、特異的な抗ウイルス効果があることが示された。これに対し、リファンピン、プランルカスト、ピオグリタゾン、ジルトンは、有意な抗ウイルス活性を示さなかった。
　以上の結果より、ラロキシフェンがエボラウイルス感染症の予防または治療薬になり得ることが示された。
［実験例４］
（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する化合物の評価）
　選択した化合物の抗ウイルス活性をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を用いて評価した。様々な濃度の各化合物の存在下で、Ｖｅｒｏ　Ｅ６細胞を野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に暴露し、その後、免疫染色法を用いて感染細胞数を定量し、細胞生存率を決定した。
　図１０（ａ）～（ｆ）は、それぞれ、レムデシビル、ラロキシフェン、リファンピン、プランルカスト、ピオグリタゾン及びジルトンの用量依存性を示すグラフである。その結果、ＣＯＶＩＤ－１９への適用がＦＤＡに承認されたレムデシビルは０．８９μＭのＩＣ５０値でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染率を減少させた。
　図１０（ｂ）に示される通り、ラロキシフェンは、７．１μＭのＩＣ５０値でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染率を用量依存的に低下させた。また、ピオグリタゾンは、高濃度でウイルス感染を部分的に抑制した。これに対し、リファンピン及びプランルカストは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染率を低下させる傾向が認められたが有意性はなく、ジルトンは有意な抗ウイルス活性を示さなかった。
　以上の結果より、ラロキシフェン及びピオグリタゾンが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防または治療薬になり得ることが示された。
　続いて、ＳｙｎｅｒｇｙＦｉｎｄｅｒを用いて、ラロキシフェンとレムデシビル、ラロキシフェンとピオグリタゾン、及び、ピオグリタゾンとレムデシビルの併用効果を検討した（Ianevski A, Giri AK and Aittokallio T (2020) SynergyFinder 2.0: visual analytics of multi-drug combination synergies. Nucleic Acids Res 48, W488-W493, 2020.）。
　ラロキシフェンとレムデシビル、ラロキシフェンとピオグリタゾン、ピオグリタゾンとレムデシビルの、２種類ずつの化合物の組み合わせのそれぞれについて、様々な濃度の各化合物の存在下で、Ｖｅｒｏ　Ｅ６細胞を野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に暴露し、その後、免疫染色法を用いて感染細胞数を定量し、細胞生存率を決定し併用効果を検討した。
　図１１はラロキシフェンとレムデシビルの併用についての用量反応マトリクスと３次元シナジーマップである。シナジースコアが（ｉ）－１０未満の場合、２つの薬剤間の相互作用は拮抗的である可能性が高く、（ｉｉ）－１０から１０までの場合、２つの薬剤間の相互作用は相加的である可能性が高く、（ｉｉｉ）１０より大きい場合、２つの薬剤間の相互作用は相乗的である可能性が高いことを表す。
　その結果、ラロキシフェンとレムデシビルは特定濃度で相乗的な抗ウイルス効果を示すことが明らかとなった。ＺＩＰシナジースコアは６．９１であり、最も高いシナジースコアは３０．０９であった。
　図１２はラロキシフェンとピオグリタゾンの併用についての用量反応マトリクスと３次元シナジーマップである。その結果、ラロキシフェンとピオグリタゾンもまた、特定濃度において相乗的な抗ウイルス効果を示すことが明らかとなった。ＺＩＰシナジースコアは４．４９であり、最も高いシナジースコアは１２．４２であった。
　図１３はピオグリタゾンとレムデシビルの併用についての用量反応マトリクスと３次元シナジーマップである。その結果、ピオグリタゾンとレムデシビルもまた、特定濃度において相乗的な抗ウイルス効果を示すことが明らかとなった。ＺＩＰシナジースコアは８．８５であり、最も高いシナジースコアは３０．４２であった。
　以上の結果より、ラロキシフェンとレムデシビル、ラロキシフェンとピオグリタゾン、ピオグリタゾンとレムデシビルを、それぞれ併用すると、相乗効果が生じて非常に高い抗ウイルス効果を発揮することが強く示唆された。
［実験例５］
（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対するＳＥＲＭの効果）
　前述した通り、前記選択した化合物の中で、ラロキシフェンはエボラウイルスとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の両方に対して抗ウイルス活性を示した。ラロキシフェンは、ＦＤＡが承認した癌治療薬の一種であり、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）の一種である。
　そこで、まず、ｔｒＶＬＰシステムを用いて、ラロキシフェン以外のＳＥＲＭである、タモキシフェン、トレミフェン、クロミフェンがエボラｔｒＶＬＰ感染を阻害するか否かを検討した。様々な濃度の各化合物の存在下で、ヒト肝臓由来のＨｕｈ７細胞を、ＧＦＰレポーターを発現するエボラｔｒＶＬＰに暴露し、感染細胞数及び細胞生存率を測定した。図１４（ａ）～（ｃ）は、それぞれ、タモキシフェン、トレミフェン、クロミフェンの用量依存性を示すグラフである。その結果、タモキシフェン、トレミフェン、クロミフェンはいずれも、エボラｔｒＶＬＰ感染を阻害することが確認された。
　続いて、タモキシフェン、トレミフェン、クロミフェンの抗ウイルス活性をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を用いて評価した。様々な濃度の各化合物の存在下で、Ｖｅｒｏ　Ｅ６細胞を野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に暴露し、その後、免疫染色法を用いて感染細胞数を定量し、細胞生存率を決定した。
　図１５（ａ）～（ｃ）は、それぞれ、タモキシフェン、トレミフェン、クロミフェンの用量依存性を示すグラフである。その結果、タモキシフェン、トレミフェン、クロミフェンは、それぞれ１０．９μＭ、１０．０μＭ、６．７μＭのＩＣ５０値で、Ｖｅｒｏ　Ｅ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を抑制する効果を示すことが明らかとなった。
　以上の結果より、ラロキシフェン、タモキシフェン、トレミフェン、クロミフェンはいずれも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療薬になり得ることが示された。さらに、ＳＥＲＭがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療薬になり得ることが強く示唆された。
［実験例６］
（ＳＥＲＭの抗ウイルス効果のメカニズムの解析）
　ＳＥＲＭの抗ウイルス効果のメカニズムを解析した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２等のコロナウイルスは、脂質二重層と外膜タンパク質からなるエンベロープ（外膜）で、ウイルスゲノムＲＮＡを含むウイルスコアが囲まれている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、前記外膜タンパク質の１種であるスパイクタンパク質が宿主細胞の細胞膜上の受容体に結合し、１）エンドサイトーシスにより細胞内に侵入した後、エンベロープとエンドソーム膜が融合してウイルスゲノムが細胞内に放出、又は、２）スパイクタンパク質が細胞膜上に存在する宿主プロテアーゼにより活性化され、エンベロープと細胞膜が融合することで、ウイルスゲノムが細胞内に放出されて、感染が成立する。
　そこで、ルシフェラーゼ遺伝子を有し、さらにスパイクタンパク質として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質を有するシュードタイプ小胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶΔＧ－ＳＡＲＳ２－Ｓ）又はＳＡＲＳ－ＣｏＶのスパイクタンパク質を有するシュードタイプ小胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶΔＧ－ＳＡＲＳ－Ｓ）を作製し（図１６）、ＳＥＲＭが前記シュードタイプＶＳＶの宿主細胞への侵入を阻害するかどうかを検討した。また、比較のために、ルシフェラーゼ遺伝子を有し、エンベローブ上にＶＳＶ糖タンパク質（Ｇ）を有する小胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）を用いて同様の検討を行った。
　図１７（ａ）～（ｃ）は、Ｖｅｒｏ　Ｅ６細胞を、ラロキシフェン、トレミフェン又はクロミフェンの存在下で1時間インキュベートした後、前記シュードタイプＶＳＶに暴露し、細胞溶解後のルシフェラーゼ活性を測定した結果を表す。横軸は各薬剤の処理濃度、縦軸は薬剤非処理群で得られたルシフェラーゼ活性に対する相対値をそれぞれ表している。図１７（ａ）～（ｃ）に示される通り、ラロキシフェン、トレミフェン、クロミフェンは、ＶＳＶΔＧ－ＳＡＲＳ２－Ｓの感染をそれぞれ、３．９μＭ、５．３μＭ、４．４μＭのＩＣ５０値で阻害した。また、ラロキシフェン、トレミフェン、クロミフェンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－Ｓ）を有するシュードタイプＶＳＶの感染を、それぞれ、４．１μＭ、７．３μＭ、５．８μＭのＩＣ５０値で阻害した。しかしながら、ＶＳＶ－Ｇに対しては感染阻害効果が認められなかった。
　よって、小胞性口内炎ウイルスは本来、ラロキシフェン、トレミフェン、クロミフェンのいずれによっても宿主細胞への侵入が抑制されないが、当該エンベローブ上にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパクが発現すると、前記薬剤によって宿主細胞への侵入が効果的に抑制されるようになることが示された。
　以上の結果から、ＳＥＲＭは病原性コロナウイルスのウイルススパイクタンパク質を介した宿主細胞への侵入を抑制することで、抗ウイルス効果を発揮していることが示唆された。図１８はＳＥＲＭの抗ウイルス効果のメカニズム（一部）を示す模式図である。ＳＥＲＭは、ウイルス粒子を含むエンドソーム内のイオン恒常性を破壊し、ウイルスコアを宿主細胞の細胞質に放出するための膜融合を阻害する可能性が考えられる。
　下記表３は、各化合物のウイルスへの効果をまとめたものである。表３中、「＋」はウイルス感染を抑制したこと、「－」はウイルス感染を抑制しなかったこと、「Ｎ．Ｓ．」は感染抑制傾向が見られたが有意性はなかったこと（Ｎｏｔ　Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）、「Ｎ．Ｄ．」は試験していないこと（Ｎｏｔ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）をそれぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　本発明によれば、ＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療薬を提供することができる。

Claims (13)

  1. 　選択的エストロゲン受容体モジュレーター、抗結核薬、ＣｙｓＬＴ１受容体アンタゴニスト、Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　γ（ＰＰＡＲγ）アゴニスト、Ａｒａｃｈｉｄｏｎａｔｅ　５－ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ（５－ＬＯＸ）阻害剤、これらの誘導体、薬学的に許容されるこれらの塩及び薬学的に許容されるこれらの溶媒和物からなる群より選択される少なくとも一種の化合物を有効成分とする、ＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤。
  2. 　前記選択的エストロゲン受容体モジュレーターが、ラロキシフェン、タモキシフェン、トレミフェン又はクロミフェンである、請求項１に記載のＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤。
  3. 　前記タモキシフェンが、タモキシフェンクエン酸塩の形態である、請求項２に記載のＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤。
  4. 　前記トレミフェンが、トレミフェンクエン酸塩の形態である、請求項２に記載のＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤。
  5. 　前記抗結核薬が、リファンピンである、請求項１に記載のＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤。
  6. 　前記ＣｙｓＬＴ１受容体アンタゴニストが、プランルカストである、請求項１に記載のＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤。
  7. 　前記ＰＰＡＲγアゴニストが、ピオグリタゾンである、請求項１に記載のＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤。
  8. 　前記５－ＬＯＸ阻害剤が、ジルトンである、請求項１に記載のＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤。
  9. 　前記ＲＮＡウイルスが、コロナウイルス科、フィロウイルス科及びパラミクソウイルス科からなる群より選択される科に属する少なくとも１種のウイルスである、請求項１～８のいずれか一項に記載のＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤。
  10. 　前記ＲＮＡウイルスが、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＥＲＳ－ＣｏＶ－２）、エボラウイルス及びセンダイウイルスからなる群より選択される少なくとも１種のウイルスである、請求項９に記載のＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤。
  11. 　ラロキシフェン及びピオグリタゾンを有効成分とする、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤。
  12. 　レムデシビルを更に含み、ラロキシフェン及びレムデシビルを有効成分とする、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤。
  13. 　レムデシビルを更に含み、ピオグリタゾン及びレムデシビルを有効成分とする、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＲＮＡウイルス関連疾患の予防又は治療剤。
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