WO2021208237A1 - 含庚糖链的寡糖化合物在制备幽门螺旋杆菌疫苗中的应用 - Google Patents

含庚糖链的寡糖化合物在制备幽门螺旋杆菌疫苗中的应用 Download PDF

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WO2021208237A1
WO2021208237A1 PCT/CN2020/097646 CN2020097646W WO2021208237A1 WO 2021208237 A1 WO2021208237 A1 WO 2021208237A1 CN 2020097646 W CN2020097646 W CN 2020097646W WO 2021208237 A1 WO2021208237 A1 WO 2021208237A1
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    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives

Definitions

  • the present invention overcomes the structural performance diversity and unpredictability of carbohydrate structures, obtains surface sugar antigen oligosaccharides based on chemical synthesis, and fixes synthetic oligosaccharides on the chip surface through amino link arms to prepare synthetic oligosaccharide chips, which are obtained through animal immunization
  • the polysaccharide-immunized antiserum was analyzed by synthetic oligosaccharide chip and its antibody composition and titer were analyzed, and its immune epitopes were analyzed at the molecular level, and the structure-activity relationship between various surface oligosaccharide chains and immune activity was explored. It provides synthetic sugar antigens for the preparation, development of vaccines for prevention and treatment of Helicobacter pylori infection.
  • the alkaline reagent in the step (1) is an organic base and/or an inorganic base.
  • the organic base includes sodium methoxide
  • the inorganic base includes any one or more of sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, and potassium carbonate.
  • the present invention completes the extraction and purification of heptose chain-containing oligosaccharide compounds of different sugar fragments for the first time, and the immunological activity of Helicobacter pylori O6 type chemically synthesized oligosaccharide fragments is explored through animal immune experiments.
  • the present invention also provides a vaccine for the prevention and treatment of Helicobacter pylori, which uses the heptose chain-containing oligosaccharide compound represented by formula (I) as a sugar antigen.
  • Figure 5 ELISA to detect the effective titer of antibodies in rabbit serum.
  • the Lewis structure should hinder the immune recognition of heptose by antibodies. Therefore, the ⁇ -(1 ⁇ 3)-heptose chain is an important immune epitope and can be used as an important antigenic substance for semi-synthetic sugar vaccines.

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Abstract

含庚糖链的寡糖化合物在制备幽门螺旋杆菌疫苗中的应用，属于医药领域。通过化学合成得到的不同抗原糖链片段，并固定于芯片表面制备得到合成寡糖芯片，结合动物免疫实验和合成寡糖芯片分析，利用抗血清中针对多糖产生的抗体进行检测，探究合成寡糖与免疫原性的关系。探究得到抗原中庚糖链为重要免疫表位，即含有α-(1→3)庚糖链的糖抗原片段具有优异的免疫活性，可用于制备、开发预防和治疗幽门螺旋杆菌感染的疫苗。

Description

含庚糖链的寡糖化合物在制备幽门螺旋杆菌疫苗中的应用 技术领域
本发明涉及含庚糖链的寡糖化合物在制备幽门螺旋杆菌疫苗中的应用，属于医药领域。
背景技术
幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)是一种微需氧型的革兰氏阴性致病菌，作为最广泛的细菌病原体之一，在世界人口的感染率约为50％(J.G.Kusters et al.,Clin Microbiol Rev,2006,19:449)。研究表明，幽门螺旋杆菌是引发胃炎、胃萎缩、消化性和十二指肠溃疡等疾病的主要病因(B.Molnar et al.,Dig Dis,2010,28:604)。另外，由于幽门螺旋杆菌的感染与增加患胃癌的风险直接相关(L.E.Wroblewski et al.,Clin Microbiol Rev,2010,23:713；C.Prinz et al.,World J Gastroenterol,2006,12:5458)，所以在1994年，世界卫生组织(WHO)明确将其归类为I型人类致癌因子(Lyon:IARC,1994,61:177)。研究表明，幽门螺旋杆菌的感染使患胃癌的风险增加了2-8倍(Helicobacter and Cancer Collaborative Group,Gut,2001,49:347；F.Kamangar et al.,J Natl Cancer Inst,2006,98:1445)。
目前，针对幽门螺旋杆菌感染的治疗主要是以铋剂或质子泵抑制剂联合使用抗生素的三联或四联疗法。但是，基于抗生素(以克拉霉素为主)的治疗存在许多弊端，长期使用抗生素不仅导致了细菌耐药性的产生(G.Ayala et al.,World J gastroenterol,2014,20:1450；N.Vakil,Cancer J Gastroenterol,2003,17:30B)，而且基于抗生素的治疗并不能阻止幽门螺杆菌重复感染的风险，因此迫切需要开发新的疗法用于幽门螺杆菌的治疗。而幽门螺杆菌疫苗被认为是控制这一全球性感染疾病最有效的方法(M.Selgrad et al.,Curr Opin Pharmacol,2008,8:593)。虽然研究人员已经对抗幽门螺旋杆菌疫苗的研发做出了许多努力，例如2009年由尿素酶B亚基和不耐热肠毒素B亚基组成的融合蛋白疫苗在中国获得许可(M.Zeng et al.,Lancet,2015,386:1457)，但迄今为止，尚未有针对幽门螺杆菌感染的疫苗成功上市。脂多糖(LPS)O-抗原作为幽门螺杆菌细胞表面的主要成分，被认为是极具吸引力的疫苗候选物(S.Yu et al.,Infection and Immunity,2007,75:2974；D.Ren et al.,Vaccine,2011,29:4210)。研究表明发展糖类疫苗抵抗幽门螺旋杆菌的感染是非常合理的，以糖类为基础的缀合疫苗已经成功地用于防止系统性感染和抑制宿主定植(J.H.Passwell et al.,Infection and Immunity,2001,69:1351)。然而由于提取得到的脂多糖存在结构不够专一，并且容易附带结构类似杂质的特点，实验重复性差，限制了后续的疫苗治疗方面的应用。因此，开发一种结构专一且可明确化学合成，同时还能够具有优异的抑制幽门螺旋杆菌的效果的疫苗是具有迫切需求的。
发明内容
本发明克服糖类结构的结构性能多样性和难以预期性，基于化学合成的手段获得表面糖抗原寡糖，通过氨基连接臂将合成寡糖固定于芯片表面制备合成寡糖芯片，通过动物免疫获得多糖免疫的抗血清，通过合成寡糖芯片对其抗体组成和滴度进行分析，从分子水平分析其免疫表位，探究了各种表面寡糖链与免疫活性的构效关系。为制备、开发预防和治疗幽门螺旋杆菌感染的疫苗提供合成糖抗原。
本发明的第一个目的是提供式(I)所示的含庚糖链的寡糖化合物在制备幽门螺旋杆菌疫苗中的应用，
Figure PCTCN2020097646-appb-000001
其中，R为H或者
Figure PCTCN2020097646-appb-000002
*为连接位点；a＝1～100；b＝0～100；c＝0～100；连接臂Linker包括氨基连接臂-(CH 2) n-NH 2；n代表连接臂可以为不同的碳链长度，n＝2～40。
在本发明的一种实施方式中，所述含庚糖链的寡糖化合物包含α-(1→3)-庚糖链；且不含有Lewis抗原片段。
在本发明的一种实施方式中，a不可以为0；b和c可以同时为0。
在本发明的一种实施方式中，a进一步优选1-5。
在本发明的一种实施方式中，b进一步优选0-2。
在本发明的一种实施方式中，c进一步优选0-2。
在本发明的一种实施方式中，n进一步优选2-10。
在本发明的一种实施方式中，所述抗原具体包括如下结构的化合物：
Figure PCTCN2020097646-appb-000003
在本发明的一种实施方式中，所述含庚糖链的寡糖化合物的制备方法包括如下步骤：
Figure PCTCN2020097646-appb-000004
(1)将化合物I*或者化合物II*溶于有机溶剂中，加入碱试剂进行脱保护，反应完全后，即得中间体化合物；
(2)将步骤(1)所得中间体化合物溶于溶剂中，加入Pd/C还原剂，在氢气条件下进行还原反应，即得目标化合物I或II。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中有机溶剂为四氢呋喃、甲醇中任意一种或两种混合。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中有机溶剂优选四氢呋喃、甲醇的混合体系。其中，THF与MeOH的体积比为1:1。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中碱试剂为有机碱和/或无机碱。有机碱包括甲醇钠，无机碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾中任意一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)具体包括如下过程：
将化合物I*或者化合物II*溶于THF/MeOH(1:1,v/v,2.0mL)，加入CH 3ONa，室温下搅拌0.5h，然后加入NaOH(aq,1M,200μL)，反应在室温下搅拌12h。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)包括：反应完全后，加入Amerlite IR 120(H +)树脂中和反应液pH小于7，溶液过滤并浓缩，经硅胶柱层析进行分离纯化。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中溶剂为由MeOH、THF、H 2O、AcOH组成的混合体系。其中MeOH、THF、H 2O与AcOH的体积比为10:5:4:1。
本发明涉及提取纯化幽门螺旋杆菌O6型脂多糖免疫新西兰兔，得到抗血清，得到了化学合成幽门螺旋杆菌O6型寡糖片段的免疫原性结果。
本发明首次完成了提取提纯的不同糖片段的含庚糖链的寡糖化合物，经过动物免疫实验对幽门螺旋杆菌O6型化学合成寡糖片段的免疫活性探究。
本发明还提供了一种用于制备幽门螺旋杆菌疫苗的寡糖芯片，其特征在于，所述寡糖芯片是将式(I)所示的含庚糖链的寡糖化合物基于其氨基连接臂固定于芯片表面。
本发明通过氨基连接臂将合成寡糖固定于芯片表面，并利用抗血清中抗体筛选检测寡糖芯片中寡糖片段与免疫原性的关系。结果揭示O-抗原中庚糖链为重要免疫表位，如含有庚糖链的五糖化合物3、五糖化合物4和八糖化合物6，可被兔血清抗体识别，但Lewis抗原可能对该免疫识别作用有阻断作用，如含有Lewis抗原的十三糖化合物7不能被抗体识别，其中庚糖链可作为糖抗原片段用于制备、开发预防和治疗幽门螺旋杆菌的疫苗。
本发明还提供了一种预防和治疗幽门螺旋杆菌的疫苗，所述疫苗是利用式(I)所示的含庚糖链的寡糖化合物作为糖抗原。
有益效果：
本发明通过化学方法合成分别得到二糖化合物，三糖化合物、五糖化合物、八糖化合物化合物、十三糖化合物。合成得到的抗原糖链片段的还原端均组装有氨基连接臂，合成寡糖固定于芯片表面制备得到合成寡糖芯片。结合动物免疫实验和合成寡糖芯片分析，利用抗血清中针对多糖产生的抗体进行检测，探究合成寡糖与免疫原性的关系。结果揭示抗原中庚糖链为重要免疫表位，如含有庚糖链的五糖3、五糖4和八糖6，可被兔血清抗体识别，但Lewis抗原可能对该免疫识别作用有阻断作用，如含有Lewis抗原的十三糖7不能被抗体识别，其中庚糖链可作为糖抗原片段用于制备、开发预防和治疗幽门螺旋杆菌的疫苗。
附图说明
图1：不同抗原寡糖的结构式。
图2：全保护的抗原寡糖前体1*、2*、3*、4*、5*、6*和7*的结构式。
图3：提取的幽门螺旋杆菌O6型脂多糖H 1核磁图。
图4：提取幽门螺旋杆菌O6型脂多糖银染图。
图5：ELISA检测兔血清中抗体有效效价。
图6：糖芯片检测兔血清：(a)使用抗兔IgG的标记FITC的二抗检测。糖芯片点样模式如右图所示。1：三糖1，点样浓度为1mM；2：四糖2，点样浓度为1mM；3：含庚糖链的五糖3，点样浓度为1mM；4：含庚糖链的五糖4，点样浓度为1mM；5：只含有Lewis O-抗原的五糖4，点样浓度为1mM；6：含庚糖链的八糖6，点样浓度为1mM；7：含Lewis O-抗原的十三糖7，点样浓度为1mM；8：幽门螺旋杆菌O6型脂多糖，点样浓度为1mg/mL；(b)定量检测脂多糖免疫组新西兰兔的平均荧光强度。误差线为来自两个不同检测区的4个不同点的标准差。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购得的常规产品。
实施例1 抗原寡糖化合物的合成：
抗原寡糖化合物如图1所示。
化合物1、2、3、4、5、6和7的合成，以相应的全保护化合物1*、2*、3*、4*、5*、6*和7*为起始原料(这些化合物可参见专利CN201910156533.1、CN109776632A制备得到)，在碱性条件下脱除所有的酰基，纯化后利用10％的Pd/C和氢气的作用脱去所有的苄基和苄氧羰基得到全脱保护的目标分子1、2、3、4、5、6和7。
具体试验操作和步骤：
化合物1：
Figure PCTCN2020097646-appb-000005
将化合物1*(28mg,0.0143mmol)溶于THF/MeOH(1:1,v/v,2.0mL)中，加入CH 3ONa(20mg)，室温下搅拌0.5h，然后加入NaOH(aq,1M,100μL)，反应在室温下搅拌12h，TLC检测反应完全后，加入Amerlite IR 120(H +)树脂中和反应液pH小于7，溶液过滤并减压浓缩，经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇:50/1)分离纯化得到中间产物。将上述脱酰基化合物溶于MeOH/THF/H 2O/AcOH(10:5:4:1,v/v/v/v,2mL)中，加入10％Pd/C(50mg)，反应混合物在氢气(1bar)条件下搅拌48h，经飞行时间质谱检测反应完成后，溶液过滤并浓缩，真空干燥，后经Sephadex LH-20凝胶柱分离纯化后得到化合物1(8mg,86％for two steps)。 1H NMR(700MHz,Deuterium Oxide)δ5.22(d,J＝2.0Hz,1H,1-H),5.05(d,J＝1.9Hz,1H,1-H),4.93(d,J＝1.8Hz,1H,1-H),4.00–3.93(m,5H),3.85(dd,J＝3.3,1.8Hz,1H),3.82–3.74(m,5H),3.73(dd,J＝5.6,3.0Hz,1H),3.72–3.66(m,5H),3.66–3.62(m,3H),3.59(dd,J＝10.0,2.9Hz,1H),3.57–3.49(m,2H),3.12–3.00(m,2H,CH 2),1.92(dddd,J＝15.0,12.0,6.1,3.8Hz,2H,CH 2). 13C NMR(176MHz,Deuterium Oxide)δ102.3,100.5,98.0,78.8,78.6,74.0,73.6,73.3,71.8,71.5,71.4,70.7,70.3,70.1,69.8,67.5,67.4,67.2,65.0,61.7,61.7,61.6,61.5,37.5,26.6.HRMS(ESI)m/z calcd for C 24H 46O 19N[M+H] +652.2659,found 652.2700.
化合物2：
Figure PCTCN2020097646-appb-000006
将化合物2*(30mg,0.0119mmol)溶于THF/MeOH(1:1,v/v,3.0mL)中，加入CH 3ONa(20mg)，室温下搅拌0.5h，然后加入NaOH(aq,1M,200μL)，反应在室温下搅拌12h，TLC检测反应完全后，加入Amerlite IR 120(H +)树脂中和反应液pH小于7，溶液过滤并减压浓缩，经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇:50/1)分离纯化得到半脱保护中间产物。将上述脱酰基化合物溶于MeOH/THF/H 2O/AcOH(10:5:4:1,v/v/v/v,3mL)中，加入10％的Pd/C(60mg)，反应混合物在氢气(1bar)条件下搅拌48h，经飞行时间质谱检测反应完成后，溶液过滤并浓缩，真空干燥，后经Sephadex LH-20凝胶柱分离纯化后得到化合物2(8.3mg,83％for two steps)。 1H NMR(700MHz,Deuterium Oxide)δ5.17(d,J＝1.7Hz,1H,1-H),5.04(d,J＝1.9Hz,1H,1-H),4.99(d,J＝1.7Hz,1H,1-H),4.92(d,J＝1.9Hz,1H,1-H),4.06–3.99(m,2H),3.99–3.90(m,5H),3.88–3.82(m,2H),3.83–3.74(m,7H),3.74–3.69(m,4H),3.69–3.65(m,3H),3.65–3.60(m,1H),3.58(dd,J＝10.1,2.9Hz,1H),3.06(dddd,J＝20.3,15.1,12.8,7.8Hz,2H,CH 2),1.92(dq,J＝14.1,7.4,7.0Hz,2H,CH 2). 13C NMR(176MHz,Deuterium Oxide)δ102.7,100.6,98.2,98.0,79.8,78.6,76.4,74.0,73.3,72.7,72.3,72.1,71.5,71.1,70.6,70.6,70.4,70.3,70.0,69.7,67.6,67.5,67.4,66.7,64.9,62.1,61.7,61.4,60.8,37.5,26.7.HRMS(ESI)m/z calcd for C 31H 58O 25N[M+H] +844.3292,found 844.3335.
化合物3：
Figure PCTCN2020097646-appb-000007
将化合物3*(25mg,0.0081mmol)溶于THF/MeOH(1:1,v/v,2.0mL)中，加入CH 3ONa(20mg)，室温下搅拌0.5h，然后加入NaOH(aq,1M,200μL)，反应在室温下搅拌12h，TLC检测反应完全后，加入Amerlite IR 120(H +)树脂中和反应液pH小于7，溶液过滤并减压浓缩，经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇:50/1)分离纯化得到半脱保护中间产物。将上述脱酰基化合物溶于MeOH/THF/H 2O/AcOH(10:5:4:1,v/v/v/v,2mL)中，加入10％的Pd/C(50mg)，反应混合物在氢气(1bar)条件下搅拌48h，经飞行时间质谱检测反应完成后，溶液过滤并浓缩，真空干燥，后经Sephadex LH-20凝胶柱分离纯化后得到化合物3(7.4mg,88％for two steps)。 1H NMR(700MHz,Deuterium Oxide)δ5.14–5.11(m,1H,1-H),5.09–5.08(m,1H,1-H),5.07–5.06(m,1H,1-H),5.04–5.00(m,1H,1-H),4.95–4.93(m,1H,1-H),4.12(t,J＝2.4Hz,1H),4.03–3.95(m,12H),3.92(dd,J＝9.3,3.3Hz,1H),3.90–3.87(m,2H),3.84(d,J＝9.7Hz,1H),3.83–3.79(m,3H),3.79–3.68(m,12H),3.68–3.60(m,5H),3.59(dd,J＝10.0,2.8Hz,1H),3.57–3.49(m,3H),3.05(tq,J＝12.9,7.4,6.6Hz,2H,CH 2),1.98–1.86(m,2H,CH 2). 13C NMR(176MHz,Deuterium Oxide)δ102.1,102.0,100.5,99.1,98.1,78.7,78.4,78.2,77.4,74.0,73.6,73.3,73.1,72.3,72.1,71.6,71.4,70.7,70.6,70.4,70.1,69.9,69.6,69.6,67.5,67.5,67.4,66.8,66.5,64.9,62.0,62.0,61.7,61.6,61.5,37.5,26.7.HRMS(ESI)m/z calcd for C 38H 70O 31N[M+H] +1036.3926,found 1036.3958.
化合物4：
Figure PCTCN2020097646-appb-000008
将化合物4*(20mg,0.0062mmol)溶于THF/MeOH(1:1,v/v,2.0mL)中，加入CH 3ONa(15mg)，室温下搅拌0.5h，然后加入NaOH(aq,1M,100μL)，反应在室温下搅拌12h， TLC检测反应完全后，加入Amerlite IR 120(H +)树脂中和反应液pH小于7，溶液过滤并减压浓缩，经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇:50/1)分离纯化得到半脱保护中间产物。将上述脱酰基化合物溶于MeOH/THF/H 2O/AcOH(10:5:4:1,v/v/v/v,2mL)中，加入10％的Pd/C(40mg)，反应混合物在氢气(1bar)条件下搅拌48h，经飞行时间质谱检测反应完成后，溶液过滤并浓缩，真空干燥，后经Sephadex LH-20凝胶柱分离纯化后得到化合物4(5.9mg,85％for two steps)。 1H NMR(700MHz,Deuterium Oxide)δ5.05(s,1H,1-H),5.03(s,2H,1-H),5.02(s,1H,1-H),4.77(s,1H,1-H),4.17(d,J＝3.6Hz,2H),4.04(s,1H),3.99(qd,J＝7.1,3.5Hz,5H),3.93–3.87(m,3H),3.86–3.71(m,13H),3.71–3.61(m,7H),3.59–3.50(m,2H),3.14–2.98(m,2H,CH 2),1.92(q,J＝7.6Hz,2H,CH 2). 13C NMR(176MHz,Deuterium Oxide)δ102.2,102.1,102.1,102.0,99.6,78.1,77.9,77.9,77.8,73.9(d,J＝2.0Hz),73.8,73.8,73.1,71.5,71.4,71.3,70.6,69.9,69.4,69.4,67.4,66.8,66.7,66.7,64.9,61.6,61.5,37.5,26.6.HRMS(ESI)m/z calcd for C 38H 70O 31N[M+H] +1036.3926,found 1036.3911.
化合物5：
Figure PCTCN2020097646-appb-000009
将化合物5*(12mg,0.0049mmol)溶于Ac 2O(1mL)中，加入新活化的锌粉(50mg)，反应在室温下搅拌15h，TLC检测原料消失后，溶液过滤并减压浓缩，真空干燥得到NAc中间产物。将上述中间产物溶于THF/MeOH(1:1,v/v,1mL)中，加入CH 3ONa(10mg)，室温下搅拌0.5h，然后加入NaOH(aq,1M,100μL)，反应在室温下搅拌12h，TLC检测反应完全后，加入Amerlite IR 120(H +)树脂中和反应液pH小于7，溶液过滤并减压浓缩，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇:50/1)分离纯化得到中间产物。将上述脱酰基化合物溶于MeOH/THF/H 2O/AcOH(10:5:4:1,1mL)中，加入10％的Pd/C(40mg)，反应混合物在氢气(1bar)条件下搅拌48h，经飞行时间质谱检测反应完成后，溶液过滤并浓缩，真空干燥，后经Sephadex LH-20凝胶柱分离纯化后得到化合物5(3.6mg,81％for three steps)。 1H NMR(700MHz,Deuterium Oxide)δ5.20(d,J＝3.5Hz,1H,1-H),5.04(d,J＝4.0Hz,1H,1-H),4.80(q,J＝6.8Hz,1H),4.65(d,J＝8.4Hz,1H,CH 2),4.44(d,J＝7.8Hz,1H,CH 2),4.33(d,J＝8.0Hz,1H,CH 2),4.18(q,J＝6.7Hz,1H),4.09–4.04(m,1H),3.97(dt,J＝11.3,6.4Hz,1H),3.93(d,J＝11.9Hz,1H),3.91–3.83(m,3H),3.79(dq,J＝12.5,6.0,4.6Hz,3H),3.76–3.68(m,6H),3.67–3.58(m, 5H),3.58–3.51(m,4H),3.49(t,J＝8.8Hz,1H),3.38(d,J＝9.6Hz,1H),3.08(h,J＝6.2Hz,2H,CH 2),1.95(s,3H,CH 3CO),1.92(dt,J＝13.2,6.6Hz,2H,CH 2),1.19(d,J＝6.6Hz,3H,Fucose-CH 3),1.16(d,J＝6.6Hz,3H,Fucose-CH 3). 13C NMR(176MHz,Deuterium Oxide)δ174.7,102.9,102.4,100.2,99.4,98.6,82.3,76.4,75.4,74.8,74.7,74.7,73.5,73.0,71.9,71.7,69.7,69.7,69.1,68.7,68.3,68.2,67.9,67.7,66.9,66.8,61.5,61.4,60.9,59.8,37.6,26.8,22.3,15.4(d,J＝2.4Hz).HRMS(ESI)m/z calcd for C 35H 63O 24N 2[M+H] +895.3765,found 895.3766.
化合物6：
Figure PCTCN2020097646-appb-000010
将化合物6*(20mg,4.2μmol)溶于THF/MeOH(1:1，2mL)中，加入MeONa(50mg)，室温下搅拌0.5h，然后加入NaOH(aq,1M,100μL)，反应在室温下搅拌12h，TLC检测反应完全后，加入Amerlite IR 120(H +)树脂中和反应液pH小于7，溶液过滤并减压浓缩，经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇:50/1)分离纯化得到中间产物。将上述脱酰基化合物溶于MeOH/THF/H 2O/AcOH(10:5:4:1,v/v/v/v,2mL)中，加入10％的Pd/C(40mg)，反应混合物在氢气(1bar)条件下搅拌48h，经飞行时间质谱检测反应完成后，溶液过滤并浓缩，真空干燥，后经Sephadex LH20凝胶柱分离纯化后得到化合物6(5.4mg,80％for two steps)。 1H NMR(700MHz,Deuterium Oxide)δ5.13(s,1H,1-H),5.09(s,1H,1-H),5.04(d,J＝2.0Hz,2H,1-H),5.03(s,3H,1-H),5.02(s,1H,1-H),4.94(d,J＝1.8Hz,1H,1-H),4.17(p,J＝1.9Hz,4H),4.12(t,J＝2.5Hz,1H),3.98(dt,J＝10.2,3.5Hz,16H),3.90(ddd,J＝13.9,8.9,2.9Hz,8H),3.85–3.72(m,23H),3.72–3.68(m,3H),3.68–3.61(m,8H),3.60(dd,J＝9.6,6.7Hz,1H),3.58–3.56(m,1H),3.56–3.50(m,3H),3.03(ddt,J＝14.7,12.7,6.5Hz,2H,CH 2),1.96–1.86(m,2H,CH 2). 13C NMR(176MHz,Deuterium Oxide)δ102.2,102.1,100.5,98.1,78.6,78.2,78.0,77.8,77.7,73.9,73.8,73.7,73.3,73.2,72.4,72.1,71.6,71.4,71.3,70.7,70.6,70.4,70.2,69.9,69.6,69.5,68.1,67.5,67.4,66.8,66.7,65.0,62.0,61.7,61.6,61.5,61.4,37.5,26.9,25.3.HRMS(ESI)m/z calcd for C 59H 106O 49N[M+H] +1612.5828,found 1612.5831.
化合物7：
将化合物7*(9mg,0.0014mmol)溶于AcOH(1mL)中，加入新活化的锌粉(50mg)，反应在室温下搅拌12h，TLC检测原料消失后，溶液过滤并减压浓缩，然后加入适量的DCM稀释，饱和NaHCO 3洗涤，无水Na 2SO 4干燥，溶液过滤后减压浓缩，真空干燥得到NAc中间产物。将上述中间产物溶于THF/MeOH(1:1,1mL)中，加入MeONa(10mg)，室温下搅拌15min，然后加入NaOH(aq,1M,100μL)，反应在室温下搅拌12h，TLC检测反应完全后，加入Amerlite IR 120(H +)树脂中和反应液pH达到7，溶液过滤并减压浓缩，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇:50/1)分离纯化得到中间产物。将上述脱酰基化合物溶于MeOH/THF/H 2O/AcOH(10:5:4:1,1mL)中，加入10％Pd/C(40mg)，反应混合物在氢气(1bar)条件下搅拌24h，经飞行时间质谱检测反应完成后，溶液过滤并浓缩，真空干燥，后经Sephadex LH20凝胶柱分离纯化后得到化合物7(3mg,82％for three steps)。 1H NMR(700MHz,D 2O)δ＝5.20(d,J＝2.8Hz,1H,anomeric H),5.13(s,1H,anomeric H),5.10(s,1H,anomeric H),5.09(s,1H,anomeric H),5.06-5.01(m,5H,anomeric H),4.95(s,1H,anomeric H),4.82-4.78(m,1H),4.65(d,J＝8.6Hz,1H,anomeric H),4.44(dd,J＝7.8,4.1Hz,2H),4.21-4.14(m,6H),4.12(s,1H),4.06(s,1H),3.99(t,J＝9.7Hz,10H),3.95-3.86(m,8H),3.86-3.68(m,37H),3.64(dt,J＝21.4,9.9Hz,14H),3.60-3.50(m,5H),3.41-3.36(m,1H),3.11-3.01(m,2H,CH 2),1.95(s,3H,CH 3CO),1.94-1.89(m,2H,CH 2),1.19(d,J＝6.5Hz,3H,Fucose-CH 3),1.16(d,J＝6.5Hz,3H,Fucose-CH 3). 13C NMR(176MHz,D 2O)δ＝158.8,102.6(anomeric),102.1(anomeric),102.04(anomeric),101.99(anomeric),101.9(anomeric),101.7(anomeric),101.2(anomeric),100.5(anomeric),100.2(anomeric),99.4(anomeric),99.2(anomeric),98.5(anomeric),98.1(anomeric),82.1,79.7,79.0,78.6,78.6,78.2,77.9,77.8,76.3,75.4,74.8,74.8,74.0,73.9,73.8,73.7,73.5,73.2,73.1,72.1,71.9,71.7,71.5,71.39,71.36,71.3,70.6,70.4,70.1,69.9,69.7,69.5,69.45,69.44,69.41,69.1,68.7,68.4,68.3,67.75,67.68,67.5,67.46,66.9,66.81,66.77,66.7,66.68,66.67,66.0,65.9,65.7,64.9,62.05,62.0,61.73,61.69,61.6,61.5,61.47,61.46,61.0,59.8,37.5,26.6,22.3,15.4.HR-ESI-MS(m/z):calcd for C 91H 160O 72N 2[M+2H] 2+1216.4455,found 1216.4287；C 91H 160O 72N 2K[M+2H+K] 3+823.9514,found 823.9442.
实施例2：幽门螺旋杆菌O6型的培养、灭活和脂多糖的提取
进行幽门螺旋杆菌O6型的培养时，幽门螺旋杆菌O6型先在37℃，气体环境为7％CO 2的条件下在血琼脂平板上培养72小时，再转移到布鲁氏肉汤培养基(ELITE-MEDIA)中在37℃，气体环境为7％CO 2的条件下培养72小时，得到菌液。
进行幽门螺旋杆菌O6型的灭活时，在1.7×10 11CFU/mL,50mL的菌液中加入5mL 4％的多聚甲醛使得终浓度为0.4％，37℃下孵育72小时。离心收集菌体，并用PBS(pH 7.4)洗涤两次，最后用PBS(pH 7.4)稀释为5×10 12CFU/mL，保存在4℃。
幽门螺旋杆菌O6型脂多糖使用酚水法提取：离心收集菌体，用磷酸缓冲液(PBS，pH 7.4)洗涤菌体两次，沉淀称取湿重。用菌体湿重的3倍质量的无菌水重悬，得到菌悬液，将菌悬液在反复冻融5次。与等体积90％苯酚混合，恒温水浴震荡后，将混合液冷却至4℃，离心吸取上层水相，再加入等体积无菌水，恒温水浴震荡后，冷却至4℃，离心吸取上清。合并两次上清用蒸馏水透析，至氯化铁检验无紫色，冻干保存。
冻干LPS粉末溶于Tris-HCl(100mmol,pH 8.0)加入终浓度为100μg/ml DNase I和50μg/ml RNase A，37℃过夜消化后加入100μg/ml蛋白酶K，作用2h后，100℃沸水煮10min使酶失活，冷却至4℃，离心收集上清。在上清中加入水饱和酚混匀，再次离心取上清液进行透析，冻干。在冻干粉中加入无水乙醇至终浓度为85％，-20℃过夜沉淀，离心后弃掉上清，沉淀冻干称重。得到的冻干粉末经过H 1核磁检测(图2)，有碳链上多糖的特征峰，在化学位移1.95处，有氮乙酰葡糖胺(GlcNAc)的特征峰，在化学位移1.18处，有岩藻糖(Fucose-CH 3)的特征峰。提取的脂多糖经SDS-PAGE电泳、银染(图3和4)可见纯度较好，得到脂多糖的平均分子量多数分布在29KDa以下。
幽门螺旋杆菌O:6血清型脂多糖的免疫实验：
1.8-2.2kg的新西兰兔分为两组，3只实验组，3只对照组。第0天，实验组一新西兰兔经皮下多点免疫注射500μL脂多糖与弗式完全佐剂1：1混合乳液；对照组小鼠注射500μL PBS与弗式完全佐剂1：1混合乳液。第14，28天，使用弗式不完全佐剂代替弗式完全佐剂进行加强免疫。实验组一新西兰兔每只每次注射抗原量相当于400μg脂多糖抗原。取第35天新西兰兔血清进行ELISA检测。
幽门螺旋杆菌O:6血清型脂多糖抗血清的ELISA检测：
用0.05M CBS缓冲液(pH 9.6)将LPS稀释成20μg/mL后包被ELISA孔板，100μL/孔,4℃包被24h，使用PBST(含0.1％tween-20的PBS)洗涤三次，拍干。在包被好的ELISA孔板中按照300μL/孔加入封闭液(含5％脱脂牛奶的PBST)，封板膜封板，25℃封闭6h；弃封闭液，PBST洗涤三次，拍干。将100μL/孔用1％BSA-PBS(w/v)稀释的不同梯度的兔血清加入到已包被好的孔板中。37℃孵育2h，PBST洗涤四次，拍干。分别以1:50000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，100μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗涤四次，拍干。37℃下用200μL/孔的TMB显色液避光孵育，显色后立即用50μL/孔的2M H 2SO 4终止。测 定450nm处吸光度。得到如图5中的抗体效价。选取抗体效价最高的兔血清用于糖芯片筛选。在ELISA检测中，我们发现注射了幽门螺旋杆菌O6型LPS的新西兰兔的血清，能够与提取的LPS结合，并且血清中抗体有效效价达到1:10000。
实施例3：寡糖化合物在制备幽门螺旋杆菌疫苗中应用
寡糖化合物与CRM-197的糖蛋白缀合物的制备：
在双(己二酸对硝基苯酯)(PNP,26.33mg,67.8μmol)的DMSO/吡啶溶液(1:1,25mL：0.25mL)中加入三乙胺(12μL,86μmol)室温搅拌5分钟。滴加溶于DMSO/吡啶(1/1,0.1mL:0.1mL)的寡糖化合物(1.6mg,2.26μmol)，室温搅拌反应7小时，TLC检测显示原料完全反应，sugar stain(0.1％(v/v)3-甲氧基苯酚,2.5％(v/v)硫酸-乙醇)显示有产物。冻干反应混合物。冻干固体使用氯仿(1mL)洗6次，得到寡糖-PNP酯。CRM 197蛋白(1mg,0.017μmol)在超滤管中使用灭菌水(400μL)洗3次，再使用磷酸盐溶液(pH 8.0,400μL)洗1次。清洗后的CRM 197蛋白加入寡糖-PNP酯中，室温搅拌24小时，反应后混合物使用灭菌水和磷酸盐溶液清洗，得到糖蛋白缀合物。使用MALDI-TOF/TOF-MS和SDS-PAGE鉴定得到的糖蛋白缀合物。
糖缀合物免疫实验：8只六周大的Balb/c小鼠分为两组，5只实验组，3只对照组。第0天，实验组小鼠经皮下免疫注射100μL糖缀合物与弗式完全佐剂1:1混合乳液；对照组小鼠注射100μL PBS与弗式完全佐剂1:1混合乳液。第14、28天，使用弗式不完全佐剂代替弗式完全佐剂进行加强免疫。实验组小鼠每只每次注射抗原量相当于4μg糖抗原。取第0，7，14，21，35天小鼠血清进行芯片检测。
寡糖芯片的构建与测试：
将化学合成的寡糖抗原通过氨基连接臂固定在芯片表面，将抗血清与寡糖芯片孵育，再与二抗孵育。
在芯片扫描仪下，可得到寡糖片段与抗体结合的荧光。通过该方式，能够定量寡糖片段与血清中抗体结合的强弱，节约化学合成的寡糖的量和抗血清，并能清楚的反应结果。
以寡糖芯片应用于免疫原性研究中的抗血清中抗体的检测过程：
具体包括以下步骤：
(1)将活化的氨基玻片使用生物芯片点样仪进行点样。点样完成后在26℃,55％湿度的条件下孵育过夜。
(2)随后将玻片浸泡在溶液B(50nM Na 2HPO 4,100nM乙醇胺的水溶液)中，50℃， 1小时。玻片使用超纯水洗3次，离心除去残留的水。
(3)使用3％BSA(w/v)的PBS溶液，4℃封闭过夜。使用PBST(含0.1％tween的PBS)清洗1次，PBS清洗两次，离心甩干。
(4)玻片装入16孔孵育器中(ProPlate)。每孔加入1：50稀释于1％BSA(w/v)的PBS溶液的小鼠血清样品120μL，37℃湿盒中避光孵育1小时。移除样品，使用150μL PBST洗3次。
(5)加入1：400稀释于1％BSA(w/v)的PBS溶液的二抗，在湿盒中，37℃避光孵育45分钟。移除二抗溶液，使用150μL PBST洗3次。拆除16孔孵育器，使用超纯水清洗，再使用超纯水清洗15分钟。离心去除残余的水。使用芯片扫描仪扫描。
幽门螺旋杆菌O:6血清型合成寡糖片段的免疫原性检测：
将NHS玻片(SurModics,DN01-0025)使用生物芯片点样仪(江苏瑞明生物科技有限公司)进行点样。点样完成后在26℃,55％湿度的条件下孵育过夜。随后将玻片浸泡在溶液B(50nM Na 2HPO 4,100nM乙醇胺的水溶液)中，50℃，1小时。玻片使用超纯水洗3次，离心除去残留的水。使用3％BSA(w/v)的PBS溶液，4℃封闭过夜。使用PBST(含0.1％tween的PBS)清洗1次，PBS清洗两次，离心甩干。玻片装入16孔孵育器中(ProPlate)。每孔加入1：50稀释于1％BSA(w/v)的PBS溶液的小鼠血清样品120μL，37℃湿盒中避光孵育1小时。移除样品，使用150μL PBST洗3次，加入1：400稀释于1％BSA(w/v)的PBS溶液的二抗，在湿盒中，37℃避光孵育45分钟。移除二抗溶液，使用150μL PBST洗3次。拆除16孔孵育器，使用超纯水清洗，再使用超纯水清洗15分钟。离心去除残余的水。使用芯片扫描仪扫描。得到如图6结果：五糖3、五糖4和八糖6的荧光强度较强。根据该结果可知，针对幽门螺旋杆菌O:6血清型提纯的多糖产生的血清抗体对含有α-(1→3)-庚糖链的片段(五糖3、五糖4、八糖6)有明显强烈的识别和结合，但是却不识别Lewis结构5和同样含有α-(1→3)-庚糖链的十三糖7，可见Lewis结构应当会阻碍抗体对庚糖的免疫识别。因此α-(1→3)-庚糖链是重要的免疫表位，可作为半合成糖疫苗的重要抗原物质。

Claims (10)

  1. 通式(I)所示的含庚糖链的寡糖化合物在制备幽门螺旋杆菌疫苗中的应用，
    Figure PCTCN2020097646-appb-100001
    其中，R为H或者
    Figure PCTCN2020097646-appb-100002
    *为连接位点；a＝1～100；b＝0～100；c＝0～100；连接臂Linker包括氨基连接臂-(CH 2) n-NH 2；n代表连接臂可以为不同的碳链长度，n＝2～40。
  2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，a为1-5。
  3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，b为0-2。
  4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，c为0-2。
  5. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，n为2-10。
  6. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述含庚糖链的寡糖化合物包含α-(1→3)-庚糖链。
  7. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述含庚糖链的寡糖化合物具体包括如下结构所示的化合物：
    Figure PCTCN2020097646-appb-100003
  8. 根据权利要求1-7任一所述的应用，其特征在于，所述含庚糖链的寡糖化合物的合成过程如下所示：
    Figure PCTCN2020097646-appb-100004
  9. 一种用于制备幽门螺旋杆菌疫苗的寡糖芯片，其特征在于，所述寡糖芯片是将权利要求1-7任一项中定义的含庚糖链的寡糖化合物通过结构中的氨基连接臂固定于芯片表面。
  10. 一种用于预防和治疗幽门螺旋杆菌感染的疫苗，所述疫苗是利用权利要求1-7任一项中定义的含庚糖链的寡糖化合物作为糖抗原。
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