WO2021201100A1 - ゲノム編集多能性幹細胞を用いた治療薬 - Google Patents

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cell
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戸田　正博
岡野　栄之
亮太 田村
瑞仁 佐藤
正博 楊
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Definitions

  • the present invention relates to a cell preparation for treating central nervous system diseases / injuries and a cell preparation for treating tumors.
  • This cell preparation is used to treat central nervous system disease disorders such as brain dysfunction, traumatic brain injury, spinal cord injury, neurodegenerative diseases, as well as brain tumors and other tumors.
  • central nervous system disease disorders such as brain dysfunction, traumatic brain injury, spinal cord injury, neurodegenerative diseases, as well as brain tumors and other tumors.
  • the cell preparation of the present invention kills cells by a suicide gene. It is a highly safe cell preparation because it can be used.
  • Cerebral contusion which is a traumatic brain injury, is mainly caused by falls and traffic injuries, so it still occurs widely and frequently in young people to elderly people. Physical damage causes necrosis of brain parenchymal cells such as nerve cells and various glial cells, destroying and damaging the neural network, causing serious neurological symptoms and, in the worst case, the outcome of unhappiness.
  • Treatment for cerebral contusions is for 48 hours after injury, especially for early massive edema that occurs in the first 24 hours, but is resistant to conservative treatments such as hyperosmotic diuretics. .. If consciousness disorder progresses even with conservative treatment, contusion and necrotic tissue are removed by craniotomy. Although surgery can be expected to improve the prognosis of life, the functional prognosis is still poor (Vella MA. Surg). Clin North Am. 2017).
  • Cerebrovascular accidents are diseases that should be called national diseases in Japan, and were once the leading cause of death in Japan. Cerebral infarction necroses cells in the brain parenchyma such as nerve cells and various glial cells due to impaired blood flow. It destroys and damages the neural network, causes severe neurological symptoms, and in the worst case, follows the outcome of unhappiness (Lindvall O. Stroke. 2011).
  • tPA tissue plasminogen activator
  • neurodegenerative diseases are higher brain dysfunction diseases caused by degeneration and shedding of nerve cells due to various causes, and many studies have been conducted on preventive and therapeutic methods, but degenerated and shed brain nerves. There is no cure to restore the system.
  • the current treatments for nerve dysfunction are prevention and prevention of deterioration, and although some functional recovery can be obtained by rehabilitation for dysfunction, the existing treatments have a neural network that is a characteristic of the central nervous system. It is difficult to repair the damage and obtain full functional recovery. Therefore, there is a need for a therapeutic method capable of complete neural network repair with the aim of functional recovery, especially recovery of higher brain function.
  • Stem cells are considered to be very useful as a carrier for reconstructing damaged neural networks.
  • the methods include (1) activation of endogenous neural stem cells existing in the subventricular zone and the lower layer of hippocampal granules and (2) stem cell transplantation.
  • the survival rate of the new nerve in (1) is extremely low, and it is impossible to reconstruct the neural network by this alone. Therefore, (2) is necessary as a means of reconstructing the damaged neural network.
  • Non-Patent Documents 1 to 6 functional improvement effects in brain contusion animal models using ES cell-derived neural stem cells (NSC) and mesenchymal stem cells (MSC) have been reported (Non-Patent Documents 1 to 6), and bone marrow-derived MSC in 2014. (SB623) has been transplanted to patients with chronic cerebral contusion (Non-Patent Document 7).
  • NSC ES cell-derived neural stem cells
  • MSC mesenchymal stem cells
  • Non-Patent Document 8 There were ethical and practical problems in using neural stem cells as donor cells, but human iPS cell-derived neural stem cells are ideal donor cells that can solve these problems.
  • iPS cells are also concerned about tumorigenicity, and a method for producing iPS cells that does not use c-Myc, which is one of the causes, has been studied, but it cannot be completely denied. Rather, it has been reported that the proliferative capacity of stem cells themselves is reduced and pluripotency is lost due to the excessive attempt to avoid tumorigenesis (Nakagawa M. Nat Biotechnol 2008; Stadtfeld M. Science. 2008). ..
  • a first object of the present invention is to provide a human iPS cell-derived neural stem cell that solves such a tumorigenicity problem.
  • a second object of the present invention is to provide a means for constitutively and stably expressing the suicide gene introduced into such human iPS cells.
  • a third object of the present invention is to provide a means for predicting the therapeutic effect of the above-mentioned cell preparation.
  • a fourth object of the present invention is to identify a molecule that brings such migration and directivity to a neural stem cell, to produce a neural stem cell with enhanced migration and directivity, and a neural stem cell with high migration and directivity. Is to provide an efficient sorting means.
  • a fifth object of the present invention is to provide a highly safe means for producing neural stem cells.
  • the present inventor has obtained the following findings as a result of repeated diligent studies to solve the above problems.
  • the suicide gene is introduced into the iPS cells in advance, and when the transplanted cells become tumorous, the transplanted cells are killed by administration of a prodrug. It was found that the above-mentioned tumorigenicity problem could be solved. It was also found that when a prodrug is administered after a certain period of time has passed since the transplantation of neural stem cells, undifferentiated cells at risk of tumorigenesis die, while the therapeutic effect of the transplanted cells continues.
  • Ephrin B and ephrin B receptor (EphB) ligand-receptor pair, and CXC motif chemokine 12 (CXCL12) and CXC motif chemokine receptor 4 (CXCR4) ligand-receptor pair They have been found to be involved in the migration and orientation of nerve stem cells to tumors.
  • neural stem cells differentiated from pluripotent stem cells exhibit tumors including brain tumors, injured brains, strong directivity and migratory properties.
  • the present invention has been completed based on the above findings. That is, the present invention provides the following [1] to [38].
  • [1] A cell preparation for treating central nervous system diseases / injuries which comprises neural stem cells differentiated from pluripotent stem cells into which a suicide gene has been introduced.
  • a sequence encoding a 2A peptide is linked to the 3'side immediately after the translation region of the ⁇ -actin gene of pluripotent stem cells, and a suicide gene is linked to the 3'side of the sequence encoding the 2A peptide.
  • the cell preparation for treating central nervous system diseases / injuries according to [7].
  • the neural stem cells are neural stem cells obtained by a method including the following steps (A) to (D).
  • B A step of selecting pluripotent stem cells in which a suicide gene has been inserted into the genome from the pluripotent stem cells obtained in step (A) by a selection marker gene.
  • C A step of removing a selection marker gene from the genome of pluripotent stem cells obtained in step (B) with a Cre protein.
  • D A step of differentiating the pluripotent stem cells obtained in step (C) into neural stem cells.
  • the target sequences of the two Cre proteins contained in the gene construct are a mutant loxP sequence having a mutation in the upstream repeat sequence and a mutant loxP sequence having a mutation in the downstream repeat sequence, and the gene construct has a mutation in the upstream repeat sequence.
  • the neural stem cells are neural stem cells obtained by a method including the following steps (a) to (d).
  • the step, which comprises a mutant loxP sequence having the above, and the selection marker gene is a gene construct sandwiched between the two mutant loxP sequences.
  • step (B) A step of selecting pluripotent stem cells in which a suicide gene has been inserted into the genome from the pluripotent stem cells obtained in step (a) by a selection marker gene.
  • step (C) A step of removing the selection marker gene from the genome of the pluripotent stem cell obtained in step (b) with a Cre protein and a homologous recombination vector and inserting the second gene into the genome.
  • the replacement vector contains a second gene, a mutant loxP sequence having a mutation in the repeat sequence, and a mutant loxP sequence having a mutation in the spacer sequence, and the second gene is a homologous recombinant vector sandwiched between the two mutant loxP sequences.
  • step (D) A step of differentiating the pluripotent stem cells obtained in step (c) into neural stem cells.
  • the neural stem cell is a neural stem cell having an increased expression level of at least one selected from the ephrin A receptor, the ephrin A, the ephrin B receptor, the ephrin B, and the CXC motif type chemokine receptor 4.
  • the neural stem cell is a neural stem cell in which the expression levels of ephrin A, ephrin A receptor, ephrin B receptor, ephrin B, and CXC motif type chemokine receptor 4 are increased [17].
  • the neural stem cell is a neural stem cell selected using at least one expression level selected from ephrin A, ephrin A receptor, ephrin B receptor, ephrin B, and CXC motif type chemokine receptor 4 as an index.
  • the neural stem cells are characterized by being selected using ephrin A, ephrin A receptor, ephrin B receptor, ephrin B, and CXC motif type chemokine receptor 4 as indicators [19].
  • a method for producing neural stem cells which comprises the following steps (1) and (2).
  • (1) A step of inserting a suicide gene into the 3'side immediately after the translation region of the ⁇ -actin gene of pluripotent stem cells by genome editing.
  • (2) A step of differentiating the pluripotent stem cells obtained in step (1) into neural stem cells.
  • step (1) the sequence encoding the 2A peptide is linked to the 3'side immediately after the translation region of the ⁇ -actin gene, and the suicide gene is linked to the 3'side of the sequence encoding the 2A peptide.
  • step (1) includes the following steps (1-A) to (1-C).
  • (1-A) A step of inserting a gene construct into the 3'side immediately after the translation region of the ⁇ -actin gene of a pluripotent stem cell by genome editing, wherein the gene construct is a suicide gene, a selection marker gene, And a step in which the selection marker gene is a gene construct sandwiched between the target sequences of the two Cre proteins, which comprises the target sequences of the two Cre proteins.
  • (1-B) A step of selecting pluripotent stem cells in which a suicide gene has been inserted into the genome from the pluripotent stem cells obtained in step (1-A) by a selection marker gene.
  • (1-C) A step of removing a selection marker gene from the genome of pluripotent stem cells obtained in step (1-B) with a Cre protein.
  • the target sequences of the two Cre proteins contained in the gene construct are a mutant loxP sequence having a mutation in the upstream repeat sequence and a mutant loxP sequence having a mutation in the downstream repeat sequence, and the gene construct has a mutation in the upstream repeat sequence.
  • step (1) includes the following steps (1-a) to (1-c).
  • step (1) includes the following steps (1-a) to (1-c).
  • step (1) includes the following steps (1-a) to (1-c).
  • step (1) includes the following steps (1-a) to (1-c).
  • step (1) A step of inserting a gene construct into the 3'side immediately after the translation region of the ⁇ -actin gene of a pluripotent stem cell by genome editing, wherein the gene construct is a suicide gene, a selection marker gene, A step in which a mutant loxP sequence having a mutation in a repeating sequence and a mutant loxP sequence having a mutation in a spacer sequence are included, and the selection marker gene is a gene construct sandwiched between the two mutant loxP sequences.
  • (1-b) A step of selecting pluripotent stem cells in which a suicide gene has been inserted into the genome from the pluripotent stem cells obtained in step (1-a) by a selection marker gene.
  • (1-c) A step of removing the selection marker gene from the genome of the pluripotent stem cell obtained in step (1-b) with a Cre protein and a homologous recombination vector and inserting the second gene into the genome.
  • the homologous recombinant vector contains a second gene, a mutant loxP sequence having a mutation in the repeat sequence, and a mutant loxP sequence having a mutation in the spacer sequence, and the second gene is homologous sandwiched between the two mutant loxP sequences.
  • a method comprising the step of measuring a quantity.
  • a method for selecting neural stem cells that are highly migratory and / or highly directional to a tumor or injured site, and is an ephrin A, ephrin A receptor, ephrin B receptor, ephrin B, and CXC motif type chemokine receptor.
  • a selection method characterized by selecting at least one expression level selected from 4 as an index.
  • the neural stem cell is a neural stem cell having an increased expression level of at least one selected from the ephrin A receptor, the ephrin A, the ephrin B receptor, the ephrin B, and the CXC motif type chemokine receptor 4.
  • the cell preparation for treating tumors according to [32] or [33].
  • the neural stem cell is a neural stem cell in which the expression levels of ephrin A, ephrin A receptor, ephrin B receptor, ephrin B, and CXC motif type chemokine receptor 4 are increased [34].
  • the neural stem cell is a neural stem cell selected using at least one expression level selected from ephrin A, ephrin A receptor, ephrin B receptor, ephrin B, and CXC motif type chemokine receptor 4 as an index.
  • the cell preparation for treating tumors according to [32] or [33].
  • the neural stem cells are characterized by being selected using ephrin A, ephrin A receptor, ephrin B receptor, ephrin B, and CXC motif type chemokine receptor 4 as indicators [34].
  • the present invention provides a novel tumor therapeutic preparation and a cell preparation for treating central nervous system diseases and injuries.
  • cell preparations for the treatment of traumatic brain damage including cerebral contusion, brain dysfunction such as cerebral infarction, or neurodegenerative diseases resulting from neurodegeneration caused by neurodegeneration cell tumorigenesis is a problem.
  • the cell preparation of the present invention is a highly safe cell preparation because cells can be killed by a suicide gene.
  • FIG. 1 shows the establishment of suicide gene expression / therapeutic neural stem cells (NSC).
  • Figure on establishment of suicide gene expression / therapeutic NSC (2).
  • Figure on establishment of suicide gene expression / therapeutic NSC (3).
  • Figure on establishment of suicide gene expression / therapeutic NSC (4).
  • FIG. 6 shows the antitumor effect of therapeutic NSC (yCD-NSC) on malignant glioma model mice (1).
  • FIG. 2 shows the antitumor effect of therapeutic NSC (yCD-NSC) on malignant glioma model mice.
  • FIG. 3 shows the antitumor effect of therapeutic NSC (yCD-NSC) on malignant glioma model mice.
  • FIG. 6 shows the antitumor effect of therapeutic NSC (yCD-NSC) on malignant glioma model mice (4).
  • the figure (1) about the cerebral protective effect of therapeutic NSC (yCD-NSC) against cerebral contusion.
  • the figure (2) about the cerebral protective effect of therapeutic NSC (yCD-NSC) against cerebral contusion.
  • the figure (3) about the cerebral protective effect of therapeutic NSC (yCD-NSC) against cerebral contusion.
  • the figure (4) about the cerebral protective effect of therapeutic NSC (yCD-NSC) against cerebral contusion.
  • FIG. 6 (5) on the brain protective effect of therapeutic NSC (yCD-NSC) on cerebral contusion.
  • FIG. 6 is a diagram relating to the cerebral protective effect of therapeutic NSC (yCD-NSC) on cerebral contusion.
  • the figure (2) about the safety (differentiated cell) of the therapeutic NSC (yCD-NSC).
  • the figure (3) about the safety (differentiated cell) of the therapeutic NSC (yCD-NSC).
  • the figure (3) about the safety (model mouse) of the therapeutic NSC (yCD-NSC).
  • the figure (4) about the safety (model mouse) of the therapeutic NSC (yCD-NSC).
  • the figure (5) about the safety (model mouse) of the therapeutic NSC (yCD-NSC).
  • the figure (2) about the biomarker of the antitumor effect by yCD-NSC.
  • the figure (4) about the biomarker of the antitumor effect by yCD-NSC.
  • the figure which shows the outline of the ligand-receptor pairing analysis Photographs of neural stem cells (NSC) and mesenchymal stem cells (MSC) transplanted into the brain. Heat map by interaction between autocrine cells.
  • NSC neural stem cells
  • MSC mesenchymal stem cells
  • Heat map by interaction between autocrine cells The figure which shows the NSC and GSC specific autocrine ligand-receptor pair suggested by enrichment analysis. Heat map by EphB / ephrinB gene expression. Heat map by interaction between para-secretory cells.
  • FIG. The figure which represented the production method of the former therapeutic stem cell schematically.
  • FIG. The figure which represented the method of removing the Puromycin gene and Venus gene in Example 3 schematically.
  • Micrographs of iPS cells (upper row), embryoid bodies (lower row left), and neural stem cells (lower row right) used in Example 3.
  • Photographs (left) and figures (right) showing the antitumor effect of the neural stem cells used in Example 3 in the presence or absence of 5-FC.
  • FIG. 6 regarding a drug resistance / fluorescent gene deletion method (1).
  • the figure (2) about the drug resistance / fluorescent gene deletion method.
  • the figure (1) about the 2nd gene insertion method.
  • FIG. 2 regarding the second gene insertion method.
  • FIG. 3 regarding the second gene insertion method.
  • the figure which shows the response to 5-FC and Puromycin of the iPS cell and the neural stem cell established by the drug resistance / fluorescent gene deletion method The figure which shows the response to 5-FC and Puromycin of the iPS cell and the neural stem cell established by the 2nd gene insertion method.
  • the tumor treatment preparation and the cell preparation for the treatment of central nervous system diseases / damages of the present invention are characterized by containing neural stem cells differentiated from pluripotent stem cells into which a suicide gene has been introduced. ..
  • Suicide genes include simple herpesvirus thymidine kinase gene (HSVtk), carboxylesterase, deoxycytidine kinase gene and cytosine arabinoside, cytosine deaminase (CD) gene and uracilphosphoribosyl transferase (UPRT).
  • HSVtk simple herpesvirus thymidine kinase gene
  • CD cytosine deaminase
  • UPRT uracilphosphoribosyl transferase
  • the "cell preparation for treating central nervous system diseases / injuries" in the present invention means a cell preparation for treating central nervous system diseases and central nervous system injuries, and more specifically, the central nervous system (for example, the brain and the like).
  • the disease or injury to be treated is not particularly limited, and examples thereof include brain tumor, neurodegenerative disease, brain dysfunction, and spinal cord injury, and brain tumor or brain dysfunction is preferable.
  • the brain dysfunction to be treated is not particularly limited, and examples thereof include dysfunction due to physical injury, for example, dysfunction due to cerebral contusion, cerebrovascular disorder (eg, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, subarachnoid hemorrhage), and the like. be able to.
  • the neurodegenerative disease is a disease caused by the loss of nerve cells due to neurodegeneration, and specific examples thereof include Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Huntington's disease, and frontotemporal lobar degeneration.
  • brain tumors include glioma (glioma), medulloblastoma, neuroblastoma, meningioma, pituitary adenoma, schwannoma, primary central nervous system lymphoma, sarcoma, and spinal cord tumor. can.
  • any of these brain tumors can be treated, but glioma is preferably treated.
  • the "treatment" includes not only killing the tumor cells but also reducing the tumor cells and inhibiting the growth of the tumor cells.
  • the "cell preparation for tumor treatment” in the present invention means a cell preparation used for treating a tumor.
  • the cell preparation of the present invention causes a suicide gene to act on a tumor tissue by utilizing the characteristics of neural stem cells to migrate and direct to the tumor tissue.
  • treatment includes not only killing tumor cells, but also reducing tumor cells and inhibiting the growth of tumor cells.
  • the tumor not only the brain tumor and pancreatic cancer mentioned in the examples but also many tumors such as breast cancer, stomach cancer, lung cancer and the like are targeted because of the characteristics of the neural stem cells.
  • pluripotent stem cell in the present invention can be interpreted as a meaning usually used by those skilled in the art, and includes, for example, iPS cells and ES cells.
  • ES cells can be used, but iPS cells are preferably used.
  • the iPS cells used can be differentiated into neural stem cells, their origin, reprogramming factor to be introduced, method of introducing the reprogramming factor, etc. are not particularly limited, but the cell preparation of the present invention is mainly human. Since it is used to treat diseases and injuries in the brain, it is preferable to use human-derived iPS cells in such cases.
  • iPS cells iPS cells derived from a patient to which the cell preparation is administered may be used, or iPS cells derived from a human other than the patient may be used.
  • the iPS cells to be used may be prepared according to a known method, but they can also be obtained from research institutions such as the Center for iPS Cell Research and Application (CiRA), Kyoto University.
  • neural stem cell in the present invention refers to a stem cell having the ability to supply cells that differentiate into neurons and glial cells.
  • the cell preparation of the present invention contains these neural stem cells, but may contain cells other than neural stem cells as long as it does not have a significant adverse effect on the therapeutic effect of brain damage or brain disease.
  • neural stem cells are produced from iPS cells according to the method described in Sugai K. Mol Brain 2016, which will be described later, not only neural stem cells but also neural progenitor cells are produced. Therefore, the cell preparation of the present invention may contain both neural stem cells and neural progenitor cells.
  • neural stem cells The higher the migration and directivity of neural stem cells to tumors, the more neural stem cells can be accumulated at the diseased or damaged site, and a higher therapeutic effect can be expected. Therefore, among the above-mentioned pair of ligands and receptors involved in migration and tropism in neural stem cells, those expressed in neural stem cells, specifically, ephrin A, ephrin A receptor, ephrin B, ephrin B It is preferable to increase the expression level of the receptor, CXC motif type chemokine receptor 4.
  • ephrin A For ephrin A, ephrin A receptor, ephrin B, ephrin B receptor, and CXC motif chemokine receptor 4, it is preferable to increase the expression levels of all five of these, but ephrin B and ephrin B receptor , And CXC motif type chemokine receptor 4 may only increase the present level of only three, or at least one selected from the above-mentioned three may only increase the expression level.
  • the expression level of these ligands and receptors can be increased according to a known method.
  • a method of introducing the genes of these ligands and receptors into neural stem cells may be introduced together with a control region that increases the expression level of genes such as a strong expression promoter), and of these ligands and receptors. This can be done by a method using a substance having an action of increasing the expression level.
  • neural stem cells selected by the selection method of the present invention described later are used as neural stem cells. You may.
  • Carboxylesterase converts CPT-11 to highly toxic 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin and strongly suppresses topoisomerase I. Cytosine arabinoside is phosphorylated by the deoxycytidine kinase gene and exerts an antitumor effect.
  • the CD gene and UPRT gene are suicide genes using 5-fluorocytosine (5-FC) and 5-fluorouracil (5-FU) as prodrugs, respectively. Vectors expressing these suicide genes are commercially available, and such vectors can be used to prepare pluripotent stem cells and neural stem cells expressing these suicide genes.
  • the CD gene and UPRT gene each have an antitumor effect by themselves, but by introducing these two genes into cells, it is possible to obtain about 100 times the antitumor effect when the CD gene is introduced alone. Are known.
  • the introduction of the suicide gene into pluripotent stem cells may be performed using a viral vector, but preferably using genome editing. This is because when a suicide gene is inserted into the genome of a pluripotent stem cell using a viral vector such as a lentiviral vector, the suicide gene is randomly inserted into the chromosome, resulting in gene mutation at the insertion site or activation of peripheral genes. This is because there is concern about inactivation of the suicide gene due to the position effect. It is considered that such a problem can be avoided by using genome editing instead of viral vector.
  • Genome editing can be performed using ZFN, TALEN, CRISPR / Cas9, CRISPR / Cas3, Cre / loxP, etc.
  • CRISPR / Cas9 and CRISPR / Cas3 are preferably used, and CRISPR / It is especially preferable to use Cas3. Since CRISPR / Cas3 has a longer recognition target sequence than CRISPR / Cas9, the frequency of off-target effects is low, and more safe neural stem cells can be produced.
  • Genome editing allows the suicide gene to be inserted into the housekeeping gene region of pluripotent stem cells and the safe harbor region AAVS1.
  • the housekeeping gene examples include ⁇ -actin gene, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene, cyclophilin gene, ⁇ -tubulin gene and the like.
  • GPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • cyclophilin gene ⁇ -tubulin gene and the like.
  • the suicide gene it is preferable to insert the suicide gene on the 3'side immediately after the translation region of the ⁇ -actin gene.
  • the sequence encoding the 2A peptide is linked to the 3'side immediately after the translation region of the ⁇ -actin gene
  • the suicide gene is linked to the 3'side of the sequence encoding the 2A peptide. It is preferable to insert it on the 3'side immediately after the translation region of the ⁇ -actin gene.
  • a selection marker gene such as a foreign drug resistance gene or a fluorescent gene is also introduced for cell selection.
  • a foreign gene such as a selection marker gene remains in the genome of a neural stem cell differentiated from a pluripotent stem cell. Therefore, it is preferable to remove the selection marker gene.
  • the means for removing the selection marker gene is not particularly limited, but it is preferable to use a combination of the Cre protein and the target sequence of the Cre protein such as the Cre / loxP system.
  • the "target sequence of Cre protein” refers to a loxP sequence (SEQ ID NO: 1), a loxP sequence having a mutation (mutated loxP sequence), and the like.
  • the loxP sequence consists of an upstream repeat sequence, a spacer sequence, and a downstream repeat sequence, and the mutation in the mutant loxP sequence may be present in any of these sequences.
  • Specific examples of the mutant loxP sequence having a mutation in the upstream repeat sequence include lox71 (SEQ ID NO: 2), and specific example of the mutant loxP sequence having a mutation in the spacer sequence is lox2272 (SEQ ID NO: 4).
  • Specific examples of the mutant loxP sequence having a mutation in the downstream repeat sequence include lox66 (SEQ ID NO: 3).
  • a method of removing a selection marker gene using the Cre / loxP system includes a suicide gene, a selection marker gene, and two loxP sequences, and the selection marker gene prepares a gene construct sandwiched between the two loxP sequences.
  • a method of inserting this into the genome of a pluripotent stem cell and then removing the selection marker gene from the pluripotent stem cell genome with a Cre protein can be exemplified. However, this method leaves one loxP sequence in the genome of pluripotent stem cells, which risks reacting with the Cre protein.
  • the loxP sequence contained in the gene construct is replaced with a mutant loxP sequence, and to replace the loxP sequence remaining in the genome with a mutant loxP sequence that does not easily react with Cre protein.
  • the two loxP sequences contained in the gene construct are replaced with a mutant loxP sequence having a mutation in the upstream repeat sequence and a mutant loxP sequence having a mutation in the downstream repeat sequence, and a mutant loxP sequence having a mutation in the upstream repeat sequence.
  • the gene construct contains a suicide gene, a selection marker gene, a mutant loxP sequence having a mutation in the repeat sequence, and a mutant loxP sequence having a mutation in the spacer sequence, and the selection marker gene is sandwiched between the two mutant loxP sequences.
  • the homologous recombination vector contains a second gene, a mutant loxP sequence having a mutation in the repeat sequence, and a mutant loxP sequence having a mutation in the spacer sequence, and the second gene is sandwiched between the two mutant loxP sequences.
  • a homologous recombination vector is used.
  • the second gene a gene involved in treatment other than the suicide gene can be used.
  • the position of the mutant loxP sequence in the gene construct is not particularly limited, and as shown in FIG. 22C, the mutant loxP sequence having a mutation in the repeating sequence is located upstream of the selection marker gene, and the mutant loxP sequence having a mutation in the spacer sequence is located. It may be located downstream of the selection marker gene and vice versa. However, when the mutant loxP sequence having a mutation in the repeat sequence is located upstream of the selection marker gene, the mutant loxP sequence preferably has a mutation in the upstream repeat sequence, and conversely, the mutant loxP sequence having a mutation in the repeat sequence. When is located downstream of the selection marker gene, the mutant loxP sequence preferably has a mutation in the downstream repeat sequence. This leaves the mutant loxP sequence in the genome.
  • the position of the mutant loxP sequence in the homologous recombination vector should be the same as the position of the mutant loxP sequence in the gene construct. That is, in the gene construct, when the mutant loxP sequence having a mutation in the repeat sequence is located upstream of the selection marker gene and the mutant loxP sequence having a mutation in the spacer sequence is located downstream of the selection marker gene, in the homologous recombination vector. Makes the mutant loxP sequence having a mutation in the repeat sequence located upstream of the second gene and the mutant loxP sequence having a mutation in the spacer sequence located downstream of the second gene. If the position of the mutant loxP sequence in the gene construct is reversed, the position of the mutant loxP sequence in the homologous recombination vector should be reversed.
  • Cre protein and the above homologous recombination vector are allowed to act on the genome into which the above gene construct has been inserted, homologous recombination occurs, the selection marker gene is removed from the genome, and at the same time, the second gene is inserted into the genome. ..
  • a gene encoding the Cre protein may be inserted into the homologous recombination vector so that the Cre protein and the homologous recombination vector can act simultaneously.
  • Differentiation from pluripotent stem cells to neural stem cells may be carried out according to an embryoid body-mediated method, an embryoid body-free method, or a known method.
  • it can be carried out according to the method described in Stem Cell Reports. 2017 Nov 14; 9 (5): 1675-1691.
  • the formation of embryoid bodies from iPS cells can be performed using known embryoid body forming media, which are TGF ⁇ family inhibitors (eg, SB431542) and BMP. It contains an inhibitor (eg, LDN-193189).
  • TGF ⁇ family inhibitors eg, SB431542
  • BMP eg, BMP. It contains an inhibitor (eg, LDN-193189).
  • Differentiation from embryoid bodies to neural stem cells can be performed using known neurosphere media.
  • neurosphere medium contains epidermal growth factor, fibroblast growth factor-2, leukemia inhibitory factor, B-27 supplement, and the like.
  • neurosphere medium By culturing the embryoid body in neurosphere medium, a cell mass containing neural stem cells called neurosphere is formed.
  • Neurospheres are formed again by collecting the formed neurospheres, dispersing them in a single cell, and culturing them in a neurosphere medium.
  • Neural stem cells can be obtained by collecting neurospheres after repeating such an operation several times.
  • the "object” called “neural stem cell” is specified not by the structure or characteristic but by the manufacturing method, because the cell is a part of the living body. , Its structure and characteristics are extremely complex, and performing the task of identifying them requires significantly excessive economic expenditure and time.
  • the cell preparation of the present invention may contain other components permitted in the preparation in addition to the neural stem cells.
  • other components include carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspensions, soothing agents, stabilizers, preservatives, preservatives, saline and the like.
  • dimethylsulfoxide, serum albumin, or the like may be contained to protect cells during cryopreservation, and antibiotics or the like may be contained to prevent bacterial contamination or proliferation.
  • the number of neural stem cells contained in the cell preparation of the present invention is determined by the disease such as tumor, the type of brain disease or brain damage, and the sex of the subject so that the desired effect can be obtained in the treatment of tumor, brain disease or brain damage. , Age, weight, condition of affected area, condition of cells to be used, etc. can be appropriately determined.
  • the cell preparation of the present invention is used multiple times (for example, 2 to 10 times) and at intervals (for example, twice a day, once a day, twice a week, once a week, once every two weeks. It may be administered after each dose.
  • the dose can be appropriately determined in consideration of the type of disease or injury, the sex of the subject, age, body weight, condition of the affected area, condition of cells used, etc., but 1 ⁇ 10 stem cells per individual (human) 6 to 1 x 10 10 doses, preferably 1 to 10 doses.
  • the administration site and administration method of the cell preparation of the present invention are not particularly limited. Examples of the administration method include local administration to the brain or tumor tissue, intracarotid administration, and intravenous administration.
  • the cell preparation of the present invention may be used together with a prodrug activated by a suicide gene.
  • the prodrug can be determined by the type of suicide gene, for example, if the CD-UPRT gene is used as the suicide gene, use a prodrug (eg, 5-FC) that is converted to 5-fluorouracil by cytosine deaminase. Can be done. By using such a prodrug, cell death can be induced in cells carrying the suicide gene. Whether or not to use a prodrug can be decided according to the disease or injury to be treated. For example, when treating brain dysfunction, the induction of cell death by the use of prodrugs is not directly related to the therapeutic effect, but aims at the death of tumor cells or the death of cells that may become tumors. Prodrugs do not have to be used because they are things. On the other hand, when treating brain tumors, the use of prodrugs is essential because the induction of cell death by the use of prodrugs is directly related to the therapeutic effect.
  • the administration site and administration method of the prodrug are not particularly limited. Examples of the administration method include oral administration, local administration to the brain or tissue, intracarotid administration, intravenous administration, and intraperitoneal administration.
  • the timing of administration of the prodrug can be determined according to the disease or injury to be treated. For example, when brain damage is to be treated, it may be administered at the time when tumor cells are generated, and in order to prevent the development of tumor cells, it is administered after a lapse of a certain period of time from the administration of the cell preparation of the present invention. May be started.
  • the start time of such prophylactic administration is not particularly limited as long as it does not lose the therapeutic effect of neural stem cells and can kill undifferentiated cells at risk of tumorigenesis. It may be 3 to 60 days after the administration of the cell preparation of the present invention, or 5 to 20 days after the administration.
  • a brain tumor is to be treated, it may be administered before, after, or after the administration of the cell preparation of the present invention, but it is usually administered in a plurality of times after the administration of the cell preparation. .. The same is true for other tumors.
  • the dose of prodrug can be appropriately determined in consideration of the type of prodrug to be used, the type of disease or injury, the sex, age, weight, condition of the affected area, etc., but when 5-FC is administered. If so, it is preferable to administer 50-200 mg / kg per individual (human) 4 times a day.
  • step (1) the suicide gene is inserted into the 3'side immediately after the translation region of the ⁇ -actin gene of pluripotent stem cells by genome editing. This step can be carried out in the same manner as the introduction of the suicide gene into pluripotent stem cells described in "(A) Cell preparation”.
  • step (2) the pluripotent stem cells obtained in step (1) are differentiated into neural stem cells.
  • This step can be performed in the same manner as the differentiation of pluripotent stem cells into neural stem cells described in "(A) Cell preparation".
  • the method for estimating the antitumor effect of the present invention is the method for estimating the antitumor effect on brain tumor cells of the above-mentioned cell preparation for treating central nervous system diseases / injuries of the present invention. It is characterized by including a step of measuring the expression levels of the thymidylate synthase gene and the dihydropyrimidine dehydrogenase gene in the brain tumor cells.
  • the gene expression level can be measured by a known method, for example, the RT-qPCR method.
  • the expression levels of the thymidylate synthase gene and the dihydropyrimidine dehydrogenase gene are high, it can be estimated that the antitumor effect of the cell preparation for treating central nervous system disease / injury of the present invention on the brain tumor cells to be measured is low.
  • the expression level of the gene is low, it can be estimated that the antitumor effect of the cell preparation for treating central nervous system diseases / damages of the present invention on the brain tumor cells to be measured is high.
  • the selection method of the present invention is a method for selecting neural stem cells with high migration and / or directional to a tumor or injured site, and is an ephrin A, ephrin. It is characterized in that at least one expression level selected from A receptor, ephrin B receptor, ephrin B, and CXC motif type chemokine receptor 4 is used as an index for selection.
  • Ephrin A, Ephrin A receptor, Ephrin B, Ephrin B receptor, and CXC motif type chemokine receptor 4 are preferably selected using the expression levels of all of these five as indicators, but Ephrin B and Ephrin B are selected.
  • the current level of only the receptor and the CXC motif type chemokine receptor 4 may be selected as an index, or at least one expression level selected from the above-mentioned three may be used as an index.
  • a method including the following steps (1) and (2) can be exemplified.
  • (1) A step of measuring the expression level of at least one selected from ephrin A, ephrin A receptor, ephrin B receptor, ephrin B, and CXC motif type chemokine receptor 4.
  • (2) A step of selecting the neural stem cells as "neural stem cells having high migration and / or directivity to a tumor or an injured site" when the expression level measured in the step (1) is higher than the reference value.
  • the reference value used for selection is not particularly limited, and for example, commonly used neural stem cells (for example, commercially available neural stem cells) are ephrin A, ephrin A receptor, ephrin B receptor, and ephrin B.
  • the expression level of the CXC motif type chemokine receptor 4 may be measured in advance and used as a reference value.
  • NSC usually means "NS / PCs (Neural stem / Progenitor cells)".
  • Example 1 (A) Method ⁇ Human iPS cells> The human iPS cells used (1210B2) were obtained from the Center for iPS Cell Research and Application (CiRA), Kyoto University. 1210B2 is a method of introducing a reprogramming factor into human peripheral blood mononuclear cells using an episomal vector (Okita K, Yamakawa T, Matsumura Y, Sato Y, Amano N, Watanabe A, Goshima N, Yamanaka S. An efficient. It was established by nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 2013 Mar; 31 (3): 458-66.).
  • Human iPS cells are seeded in a plastic culture dish coated with iMatrix-511 (Nippi) and used in Stem Fit AK03 or AK03N medium (Ajinomoto) using a known feeder-free method (Nakagawa M. Sci Rep). . 2014) was maintained and cultured.
  • NSC neural stem / progenitor cells
  • EB embryonic stem cell formation medium
  • 10 ⁇ M ROCK inhibitor Y276352 10 ⁇ M SB431542, 100 nM LDN-193189 added to Stem Fit medium without C solution.
  • 10 ⁇ M ROCK inhibitor Y276352 10 ⁇ M SB431542, 100 nM LDN-193189 added to Stem Fit medium without C solution.
  • 75 ⁇ l of EB-forming medium was added, and thereafter, half the amount of EB-forming medium was replaced every day, and EB was obtained by culturing for 13 to 14 days.
  • EB was collected from each well and placed in NS (neurosphere) medium (D-MEM / Ham's F-12 medium (containing HEPES) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at 20 ng / ml Recombinant human epidermal growth factor (manufactured by PeproTech).
  • NS neurosphere
  • HEPES horse's F-12 medium
  • PeproTech Recombinant human epidermal growth factor
  • the cells were seeded in a low-adhesion flask (manufactured by Corning) at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / ml, the medium was changed every 3 to 4 days, and the cells were cultured for 10 days to obtain a primary NSC.
  • the primary NSC is collected by centrifugation, dispersed into single cells using TrypLE Select, suspended in NS medium, seeded in a low-adhesion flask at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / ml, and 3 to The medium was changed every 4 days, and the cells were cultured for 7 to 10 days to obtain secondary, tertiary, quaternary, and fifth NSCs.
  • the DNA construct for genome editing incorporates yCD-UPRT into the GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) gene region, so GAPDH, yCD-UPRT, and Bsd (blasticidin resistance gene) are inserted in a linked form with a 2A peptide sequence.
  • GAPDH glycosydehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • Bsd blasticidin resistance gene
  • ⁇ -actin a gRNA expression vector targeting the vicinity of the stop codon of ⁇ -actin was constructed in the same manner as GAPDH, and the construct for homologous recombination was also ⁇ -actin, yCD-UPRT, and Bsd with 2A peptide sequences. It was constructed so that it could be inserted in a form connected by ( ⁇ -actin-2A-yCD-UPRT-2A-Bsd).
  • the homologous recombination construct of the AAVS1 region was expressed in the form of expressing yCD-UPRT-2A-Bsd under the EF-1 promoter, and insulator sequences were added at both ends.
  • These genes, yCD-UPRT, and Bsd were inserted in a linked form with a 2A peptide sequence.
  • constructs were introduced into a human iPS cell line (1210B2) by electroporation, cultured in the presence of blasticidin S, and cloned.
  • the homologous recombinant iPS cell line was confirmed by confirming the nucleotide sequence of each clone by genomic PCR and genomic sequencing.
  • yCD-NSC yCD-UPRT-expressing NSC
  • differentiation induction was performed into NSCs to obtain secondary to 5th-order NSCs (yCD-NSC).
  • Blasticidin S 1 ⁇ g / ml was constantly added to the medium for culturing. It was confirmed that yCD-UPRT-expressing NSC induces cell death by adding 5-FC 1-5 ⁇ g / ml to the medium.
  • yCD-NSC (labeled with hKO1) was transplanted 1 mm above the tumor mass by human glioma cell line U87 (ffLuc), and its migration was cultured in brain sections. Quantitatively evaluated using (Tamura R. Mol Brain. 2019). Adipose tissue-derived and bone marrow-derived human mesenchymal stem cell lines (labeled with hKO1) were used for comparison. The migration in the brain was quantitatively evaluated by creating Rose Diagram Maps (Angular histograms) with the direction and the distance traveled as parameters. The antitumor effect of yCD-NSC was evaluated by transplanting yCD-NSC into U87 glioma model mice and administering 5-FC.
  • Rose Diagram Maps Angular histograms
  • yCD-NSC 5 ⁇ 10 5 yCD-NSC (ffLuc) were transplanted into the right striatum of the normal brain in the same manner as above, and 5-FC was administered for 2 weeks from 7 days later.
  • a 5-FC non-administered group was also prepared as a control. After 150 days, the head was decapitated and the brain tissue was evaluated.
  • 5-FU converted from 5-FC is theoretically thought to have no effect on the cells in the brain occupied by terminally differentiated cells, but neural progenitor cells and vascular endothelium existing near the ventricles.
  • vascular endothelial cell marker CD31
  • neural stem cell / progenitor cell marker Nestin
  • TS thymidylate synthase
  • DPD Dihydropyrimidine dehydrogenase
  • yCD-UPRT-expressing NSC Differentiation of yCD-UPRT-expressing NSC into neurons and 5-FU-sensitive yCD-UPRT-expressing NSC of differentiated cells were differentiated into neurons in vitro. Differentiation was confirmed by the expression and morphology of ⁇ III tubulin and NeuN. The residual undifferentiated proliferating cells were confirmed by the expression of Ki-67, PCNA, and Nestin. Cell death was assessed by expression of Cleaved caspase 3. 5-FC was added, and changes in these differentiated and undifferentiated cells due to 5-FU released by the introduced yCD-UPRT were evaluated.
  • Rotarod UGO BASILE
  • MK-380Si Meromachi Kikai
  • Rotarod was performed once before surgery to familiarize the mice with the instruments.
  • Rotarod increased the number of revolutions from 2r.p.m to 20r.p.m over 300 seconds, and measured the time until the mouse fell from the rod or became unable to walk stably.
  • Rotarod was performed 3 times on each measurement day, and the average time was measured. This method is in line with the previous report (Tabuse J Clin Neurosci. 2010).
  • a plastic cover was placed on the net attached to the measuring instrument to limit the area of the net that can be gripped, making it possible to measure the grip strength of only one limb. Grip strength was measured for all four limbs, and when the net was gripped with five fingers, the tail was pulled horizontally and the peak value until the limbs separated from the net was measured. Each limb was measured 7 times, and the average value of 5 times excluding the maximum value and the minimum value was compared (Alamri FF. Behav Brain Res. 2018).
  • the present inventor also introduced yCD-UPRT with CRISPR / Cas9 into other housekeeping genes GAPDH and safe harbor region AAVS1 in order to optimize the insertion site of the suicide gene.
  • the AAVS1 region was silenced in the same manner as the viral vector, and the GAPDH region was less than half as sensitive to the prodrug 5-FC as the ⁇ actin region (Fig. 1D). Therefore, the present inventor has determined ⁇ actin as the optimal gene transfer region for yCD-UPRT.
  • the susceptibility to 5-FC was quantitatively analyzed by CCK-8 assay.
  • the present inventor has constructed a unique method for quantitatively evaluating the directivity by photographing the migration of iPS cell-derived NSCs to tumors in the brain in real time (see FIG. 2A Rose diagram map).
  • iPS cell-derived NSCs showed better orientation and migration in the brain than other adipose-derived (AMSC) and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSC) that may be used as transplant cell therapy.
  • the usefulness as a Cellular delivery vehicle was shown (Fig. 2A).
  • the therapeutic NSC (yCD-NSC) established by the method shown in FIG.
  • FIG. 2B a glioma model mouse
  • U87 glioma model mouse
  • yCD-NSC ⁇ Cerebral protective effect of therapeutic NSC (yCD-NSC) against cerebral contusion
  • the present inventor has established and reported a brain contusion model using a cooling device. By creating a cerebral contusion in the left anterior brain, it is possible to stably create a model exhibiting right insufficiency lower limb paralysis (Fig. 3A).
  • the yCD-NSC was infected with a ffLuc (fusion gene of Venus fluorescent protein and Luc2 firefly luciferase) expression lentiviral vector so that the transplanted yCD-NSC could be identified by IVIS (Fig. 3B). In the method shown in FIG. 2, the glioma cell line was infected and the therapeutic effect was evaluated.
  • yCD-NSC showed remarkable migration ability not only in tumor cells but also in injured brain (cerebral contusion). In less than two weeks, yCD-NSC transplanted to the contralateral side of the brain contusion began to show a signal at the site of the brain contusion (Fig. 3C).
  • the treatment group transplanted with yCD-NSC showed a significant improvement in motor function (grip strength) compared to the control group (Fig. 3E). Furthermore, as a result of visualizing the brain damage site with a pigment (Evans blue), in the brain tissue 14 days after the brain contusion, a marked reduction in the brain damage site was observed in the brain transplanted with yCD-NSC (Fig. 3F). This means the cerebral protective effect of yCD-NSC on acutely injured brain. In addition, when yCD-NSC was transplanted 1 mm below the contusion and the brain tissue was evaluated 42 days later, migration and collection were significantly observed at the contusion site (Fig. 3G).
  • the present inventor investigated whether there is a decrease in brain function by killing NSCs that exerted a brain-protecting effect in the acute phase that remained in an undifferentiated state (at risk of tumorigenesis) by administration of 5-FC. confirmed.
  • NSC is transplanted in the hyperacute phase on the day of contusion preparation (Day 0), a brain protective effect is exerted in the acute phase up to Day 7, and then 5-FC is administered for 2 weeks in the subacute phase (Fig. 4A).
  • Fig. 4A As a result, even if 5-FC was administered from Day 7, the same functional recovery as in the 5-FC non-administered group was obtained without deterioration of motor function (Fig. 4B).
  • it showed a significant functional improvement effect as compared with the NSC non-transplant control (Fig. 4B).
  • yCD-NSC differentiated cells
  • yCD-NSC ⁇ Safety of therapeutic NSC (yCD-NSC) (model mouse)>
  • 5-FC is theoretically thought to have no effect on the cells in the brain occupied by terminally differentiated cells, but on neural progenitor cells near the ventricles and cells with slight division such as vascular endothelium. Can also affect. Therefore, as a result of transplanting yCD-NSC into a normal brain and administering 5-FC this time, it is clear to the neural progenitor cells (Fig. 6B) and vascular endothelial cells (Fig. 6C) of the ventricular wall near the transplant site. No apoptotic cells were found. Since yCD-NSC collects in tumors and injured brains, it is suggested that it does not dare to show directivity in the vicinity of these tissues.
  • FIG. 6E A, B, and C in the brain tissue image of FIG. 6E correspond to the sites of the fluorescent tissue images FIGS. 6A, B, and C, respectively.
  • ⁇ Biomarker of antitumor effect by yCD-NSC> FdUMP the active metabolite of 5-FU, inhibits the enzymatic activity of the DNA de novo enzyme thymidylate synthase (TS) (Fig. 7A). In this way, the de novo synthesis system of DNA is suppressed, and DNA damage occurs in a time-dependent manner.
  • 5-FU normally taken up in tumors is degraded by the degrading enzyme Dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD) (Fig. 7A).
  • DPD Dihydropyrimidine dehydrogenase
  • TS and DPD would be a biomarker of the antitumor effect of yCD-NSC of the present inventor.
  • the susceptibility of each glioma cell line to 5-FU was evaluated by the CCK-8 assay. As a result, the susceptibility was (good) GL261, TSG, hG008, U87, U251 (poor) (Fig. 7B).
  • ACTB yCD-NSC
  • ACTB region evaluated by the present inventor corresponds to this.
  • the fact that NSC is not highly sensitive to 5-FU is also a result suggesting "safety" that is unlikely to affect endogenous neural stem cells.
  • NSCs Neural stem cells
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • CDVs Cellular delivery vehicles
  • References 1 and 2 NSC can be collected from fetal-derived tissues, etc., but it is not easy to use due to its low proliferative problems and ethical aspects.
  • the present inventor solved the problem by inducing differentiation of NSC from human induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • NSC cytosine deaminase-uracil phosphoribosyl transferase: CD-UPRT
  • CD-UPRT cytosine deaminase-uracil phosphoribosyl transferase
  • the present inventor used brain section culture (Tamura R. Mol Brain. 2019 [Japanese Patent Application No. 2019-052704]) to treat NSC and MSC (adipose tissue, bone marrow-derived) gliuloblastoma cells transplanted into the brain.
  • NSC neurosthelial cells
  • MSC adipose tissue, bone marrow-derived gliuloblastoma cells transplanted into the brain.
  • GSCs Glioma stem cells
  • GCs Glioma cells
  • RNA is extracted by QIAcube (QIAGEN) automation system using miRNeasy Serum / Plasma kit (QIAGEN). bottom. RNA-seq analysis was performed by contract analysis by Macrogen Inc.
  • Ligand-receptor pairing analysis For ligand-receptor pairing, refer to the previously reported database (Reference 5). 2552 ligand-receptor pairs were carefully selected (Reference 6), and when expression of both ligand and receptor was observed between cells, they were selected as matched pairs (see FIG. 8).
  • Enrichment analysis (analysis to determine the presence or absence of a correlation between a specific gene set and expression ratio) suggested that these pairs were related to Eph / ephrin repulsion signaling.
  • EphB / ehrinB was up-regulated by NSC compared to MSC.
  • EphB / ephrinB is actually involved in GSC infiltration (Reference 8). Therefore, it was suggested that EphB / ephrinB in particular causes self-repulsion between NSCs and is related to diffuse engraftment.
  • CXCL12 a tumor-infiltrating macrophage in the brain, may also produce a directivity for NSCs that express CXCR4 (MSCs are not expressed).
  • NSC neural stem / progenitor cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • UPRT yeast cytosine deaminase
  • yCD-UPRT yeast cytosine deaminase -uracil phosphoribosyl transferase fusion gene
  • ACTB housekeeping locus
  • iPS cells in which the yCD-UPRT fusion gene, drug resistance gene, and fluorescent gene are inserted into the housekeeping locus (ACTB) using the genome editing technology CRISPR / Cas3 are prepared. After fluorescence / drug selection, foreign genes (drug resistance genes / fluorescence genes) are removed using the Cre / loxP system. In addition, cells into which a suicide gene (a gene encoding an enzyme that metabolizes a prodrug to convert it into a tumor-killing substance) is killed by administration of prodrug [Tamura R. Neurosurgical review. 2019].
  • a suicide gene a gene encoding an enzyme that metabolizes a prodrug to convert it into a tumor-killing substance
  • the human iPS cells used (1210B2) were obtained from the Center for iPS Cell Research and Application (CiRA), Kyoto University. 1210B2 is a method of introducing a reprogramming factor into human peripheral blood mononuclear cells using an episomal vector (Okita K, Yamakawa T, Matsumura Y, Sato Y, Amano N, Watanabe A, Goshima N, Yamanaka S. An efficient. It was established by nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 2013 Mar; 31 (3): 458-66.).
  • Human iPS cells are seeded on a plastic culture dish coated with iMatrix-511 (Nippi) and used in Stem Fit AK03 or AK03N medium (Ajinomoto) using a known feeder-free method (Nakagawa M, Taniguchi Y).
  • a known feeder-free method (Nakagawa M, Taniguchi Y).
  • Senda S Takizawa N, Ichisaka T, Asano K, Morizane A, Doi D, Takahashi J, Nishizawa M, Yoshida Y, Toyoda T, Osafune K, Sekiguchi K, Yamanaka S.
  • a novel efficient feeder-free culture system for the Derivation of human induced pluripotent stem cells Sci Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594.).
  • NSC neural stem / progenitor cells
  • Induction of differentiation of human iPS cells into NSC is known by known methods (Sugai K, Fukuzawa R, Shofuda T, Fukusumi H, Kawabata S, Nishiyama Y, Higuchi Y, Kawai K, Isoda M, Kanematsu D, Hashimoto-Tamaoki T, Kohyama J, Iwanami A, Suemizu H, Ikeda E, Matsumoto M, Kanemura Y, Nakamura M, Okano H. Pathological classification of human iPSC-derived neural stem / progenitor cells towards safety assessment of transplantation therapy for CNS diseases.
  • a 10 ⁇ M ROCK inhibitor Y276352 (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the medium of iPS cells, incubated for 1 to 3 hours, washed with PBS, and simply used with TrypLE Select (manufactured by Life Technologies). Dispersed into one cell. Human iPS cells dispersed in a single cell were added to EB (embryoid body) formation medium (10 ⁇ M SB431542, 100 nM LDN-193189 added to Stem Fit medium without C solution) supplemented with 10 ⁇ M ROCK inhibitor Y276352.
  • EB epioid body formation medium
  • EB was collected from each well and placed in NS (neurosphere) medium (D-MEM / Ham's F-12 medium (containing HEPES) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at 20 ng / ml Recombinant human epidermal growth factor (manufactured by PeproTech).
  • NS neurosphere
  • HEPES horse's F-12 medium
  • PeproTech Recombinant human epidermal growth factor
  • the cells were seeded in a low-adhesion flask (manufactured by Corning) at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / ml, the medium was changed every 3 to 4 days, and the cells were cultured for 10 days to obtain a primary NSC.
  • the primary NSC is collected by centrifugation, dispersed into single cells using TrypLE Select, suspended in NS medium, seeded in a low-adhesion flask at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / ml, and 3 to The medium was changed every 4 days, and the cells were cultured for 7 to 10 days to obtain secondary, tertiary, quaternary, and fifth NSCs.
  • ACTB and yCD-UPRT are linked by a 2A peptide sequence, and the IRES sequence sandwiched between loxP sequences downstream thereof.
  • Puromycin resistance gene, 2A peptide, and fluorescent protein Venus were inserted into a construct (HR-ACTB-2A-yCD-UPRT-loxP-IRES-Puromycin-2A-Venus-loxP).
  • a construct (Cas3-crRNA-All-in) expressing crRNA targeting the vicinity of the stop codon of ACTB and a series of Cas3-related proteins was prepared.
  • constructs were electroporated into a human iPS cell line (1210B2), cultured in the presence of Puromycin S, and cloned by colony pickup.
  • the homologous recombinant iPS cell line (TiPS1) was confirmed by confirming the nucleotide sequence of each clone by genomic PCR and genomic sequencing.
  • a construct EF-mCherry-IRES-Cre-hCGpolyA in which the fluorescent protein mCherry, IRES sequence, Cre protein, and human growth hormone polyadenylation signal were linked downstream of the EF promoter was prepared.
  • TiPS2 This construct was electroporated into TiPS1 and cells that had mCherry fluorescence and Venus fluorescence disappeared were cloned by sorting (FIGS. 15 and 16).
  • the selection marker-removed iPS cell line (TiPS2) was confirmed by confirming the nucleotide sequence of each clone by genomic PCR and genomic sequencing.
  • TSC1 is a therapeutic NSC in which the selection marker sequence induced to differentiate from TiPS1 remains
  • TSC2 is a therapeutic NSC in which the selection marker sequence induced to differentiate from TiPS2 has been removed (Fig. 17).
  • TSC1 was cultured as a comparison target in order to show that there was no change in cell proliferation, CD expression level, etc. even when the selection marker was removed (TSC2).
  • Puromycin S 1 ⁇ g / ml was constantly added to the TSC1 medium for culturing. For TSC1 and 2, it was confirmed that cell death was induced by adding 1-7 ⁇ g / ml of 5-Fluorocytosine (5-FC) to the medium. Cell death was assessed using the Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japan), a cell proliferation / cytotoxicity assay kit.
  • CCK-8 Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japan), a cell proliferation / cytotoxicity assay kit.
  • TSC1, 2 Using a low-adhesion 96-well culture plate (Prime Surface 96V, manufactured by Sumitomo Bakelite), the glioma cell line U87 (1 x 10 4 ) or the glioma stem cell line hG008 (1 x 10 4 ) and TSC1 or TSC2 (5 x) 10 3 cells) were co-cultured for 1 day, then 5-FC was added (2 ⁇ g / ml), and after 5 days, cells were used using the Cell Counting Kit-8 (CCK-8), which is a cell proliferation / cell toxicity assay kit. Evaluated death.
  • CCK-8 Cell Counting Kit-8
  • TSC1 ⁇ Resistance of TSC1 and 2 to Puromycin>
  • the TSC1 was able to be selected by the Puromycin resistance gene, and the cells could be selected without any problem by adding Puromycin.
  • TSC2 was immediately killed by Puromycin, and the Cre / loxP system confirmed that the Puromycin resistance gene was missing as planned (Fig. 18).
  • TSC1 and 2 were co-cultured with the glioma cell line U87 and the glioma stem cell hG008 cell line, and 5-FC (2 ⁇ g / ml) was administered. Cell death was evaluated by CCK-8 assay, and both caused significant tumor cell death after administration of the prodrug (Fig. 20). Administration of 5-FC to U87 and hG008 alone did not cause any particular tumor cell death (Fig. 20).
  • Example 4 Outline of mutant loxP sequence As shown in FIG. 21A, the lox sequence consists of an upstream repeat sequence, a spacer sequence, and a downstream repeat sequence. A mutant lox sequence containing a mutation at each site has already been developed (the underline in FIG. 21A is the mutation site).
  • lox71 and lox66 When lox71 and lox66 are recombined, one becomes lox71 / 66 and the other becomes loxP (Fig. 21B). Since lox71 / 66 has mutations at both ends, it is difficult for Cre to recognize it. Therefore, safety can be enhanced by leaving lox71 / 66 in the genome. In addition, lox2272 with a mutation in the spacer sequence can only be recombined with the same lox2272 (Fig. 21C).
  • the Cre / loxP system can delete the DNA sequence (drug resistance gene, etc.) sandwiched between loxP by expressing the Cre protein, but in the end, one loxP sequence remains, so it reacts with Cre by any chance. There is a risk. Therefore, in order to reduce the risk, we have developed a method of sandwiching the DNA sequence to be deleted (drug resistance gene, etc.) between loxPs (lox71 and lox66) having mutations in the sequence repeatedly. Lox71, which is a mutant sequence of loxP, has a mutation incorporated in the upstream repeat sequence portion, and lox66 has a mutation incorporated in the downstream repeat sequence portion. As a result, the lox71 / 66 fusion sequence that remains after deleting the sandwiched gene has mutations at both ends, so the risk of reacting with Cre is extremely low, and safer gene therapy becomes possible (Fig. 22B).
  • the mutant lox2272 Since the mutant lox2272 has a mutation in the spacer sequence, it has the property of reacting with the same mutant lox sequence by Cre. Utilizing this property, homologous recombination of the target gene using the spacer sequence mutation loxP (in the example, recombination of the region sandwiched between lox71-lox2272 and the region sandwiched between lox66-lox2272) is possible. .. As a result, it becomes possible to insert another therapeutic gene (second gene) in addition to the suicide gene and delete the drug gene.
  • the Cre / mutant lox system is safer than genome editing technologies such as Cas3, with higher introduction efficiency and extremely few off-target problems (Fig. 22C).
  • glioma stem cell line hG008 (6 ⁇ 10 3 ) and (1) or (2) using a low-adhesion 96-well culture plate (Prime Surface 96V, manufactured by Sumitomo Bakelite).
  • NS / PCs (3 x 10 3 ) were co-cultured for 1 day, then 5-FC was added (5 ⁇ g / ml), and after 5 days, the cell proliferation / cell toxicity assay kit Cell Counting Kit-8 (CCK-8) The assay was performed.
  • pancreatic cancer Effect on tumors other than brain tumors
  • pancreatic cancer in particular ranked fifth in the number of cancer deaths in men (17060 cases) and third in the number of cancer deaths in women (16415 cases) in 2016, and women.
  • the number of deaths from gastric cancer is higher than that of gastric cancer [see National Cancer Center Cancer Information Service].
  • the 5-year relative survival rate for pancreatic cancer is 7.9% for men and 7.5% for women, which is the worst prognosis compared to other organ cancers [10-year relative survival rate by clinical stage by site of all cancer cooperatives].
  • 5-FU is used as one of the main chemotherapeutic agents for pancreatic cancer, and the suicide gene-introduced iPS cell-derived NS / PCs established by the present inventor show orientation and migration to malignant tumors.
  • High concentration anticancer drug 5-FU can be administered locally to the tumor.
  • NS / PCs have ffLuc (fusion gene of Venus fluorescent protein and Luc2 firefly luciferase) expression wrench viral vector (CSII-EF-ffLuc) (Takahashi Y, Tsuji O, Kumagai G, Hara CM, Okano HJ, Miyawaki A, Toyama) Y, Okano H, Nakamura M. Comparative study of methods for membrane neural stem / protein cells to treat spinal cord injury in mice. Cell Transplant. 2011; 20 (5): 727-39.) Infects and stabilizes ffLuc. Highly expressed NS / PCs were obtained. Time-dependent changes in NS / PCs of the same individual were observed with the IVIS in vivo imaging system.
  • CSII-EF-ffLuc expression wrench viral vector
  • VivoGlo TM Luciferin 30 mg / ml was intraperitoneally administered under Isoflurane inhalation anesthesia, and imaging was performed 10 minutes after the peak was reached (Figs. 33A and B).
  • the present invention can be used in industries such as pharmaceutical manufacturing.

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Abstract

脳機能障害、脳疾患、又は腫瘍を治療するため、自殺遺伝子が導入された多能性幹細胞から分化させた神経幹細胞を含むことを特徴とする細胞製剤を提供する。

Description

ゲノム編集多能性幹細胞を用いた治療薬
　本発明は、中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤及び腫瘍治療用細胞製剤に関する。この細胞製剤は、中枢神経系疾患損傷、例えば、脳機能障害、外傷性脳損傷、脊髄損傷、神経変性疾患、並びに脳腫瘍及びその他の腫瘍の治療に用いられる。細胞製剤を治療用細胞製剤として用いる際には、特に中枢神経系疾患損傷の治療に用いる場合は、細胞の腫瘍化が問題になるが、本発明の細胞製剤は、自殺遺伝子によって細胞を死滅させることができるので、安全性の高い細胞製剤である。
　外傷性脳損傷である脳挫傷は主に転落・交通外傷により生じるため、依然として若年者から高齢者に幅広く高頻度で発症する。物理的損傷により神経細胞、各種膠細胞など脳実質の細胞を壊死させ、神経回路網を破壊・損傷し、重篤な神経症状を来し最悪の場合不幸の転帰をたどる。脳挫傷に対する治療は受傷から48時間、特に最初の24時間に発生してくる挫傷性浮腫（early massive edema）に対して行うが、高浸透圧利尿剤などの保存的治療には抵抗性である。保存的治療によっても意識障害が進行する場合は開頭術により、挫傷壊死組織を摘出するが、手術を行っても生命予後の改善は期待できるが、機能予後は依然として不良である（Vella MA. Surg Clin North Am. 2017）。
　脳血管障害（脳梗塞、脳出血、くも膜下出血）は我が国の国民病とも言うべき疾患であり、かつては本邦死亡原因の第1 位であった。脳梗塞は、血流障害により神経細胞、各種膠細胞など脳実質の細胞を壊死させる。神経回路網を破壊・損傷し、重篤な神経症状を来し最悪の場合不幸の転帰をたどる（Lindvall O. Stroke. 2011）。脳梗塞超急性期に対する組織プラスミノーゲンアクティベーター(tPA)投与等の新しい治療・危険因子の管理などの予防医学の進歩・公衆衛生の改善により、脳血管障害の死亡者数は現在第3位に減少したが、依然として死亡率の高い疾患である。
　一方、神経変性疾患は、神経細胞が種々の原因によって変性し脱落することによって生じる高次脳機能損傷疾患であり、予防、治療方法について多くの研究が行われているが、変性し脱落した脳神経系を回復させる治療薬はない。
　いずれも、神経機能損傷に対する現在の治療法は予防と悪化防止であり、機能障害に対応したリハビリテーションなどで多少の機能回復は得られるものの、既存の治療法では中枢神経の特徴である神経回路網の損傷を修復し完全な機能回復を得るのは困難である。よって、機能回復、殊に高次脳機能の回復を目指して完全な神経回路網修復をなし得る治療方法が求められる。損傷した神経回路網を再構築する担い手として、幹細胞は非常に有用と考えられている。その方法としては(1)側脳室下帯や海馬顆粒下層に存在する内在性神経幹細胞の賦活化及び(2)幹細胞移植がある。しかし、(1)の新生神経の生存率は極めて低く、これのみで神経回路網再構築は不可能である。この為、(2)が損傷神経回路網の再構築の手段として必要である。
　幹細胞移植においては、どのような移植ドナー細胞を使用するかが重要である。移植ドナー細胞の候補としてこれまで色々な細胞が提案されてきた。現在までにES細胞由来神経幹細胞(NSC)や間葉系幹細胞(MSC)を用いた脳挫傷動物モデルでの機能改善効果が報告され（非特許文献１～６）、2014年には骨髄由来MSC（SB623）が慢性期脳挫傷患者に対して移植されている（非特許文献７）。現在on goingの臨床研究も含め、MSCを用いたものが大多数である（NCT02210624）。しかし、MSCの来す作用は、厳密な意味で回路網再構築を目指したものではなく、移植細胞が神経栄養・保護作用や血管新生促進作用を有する液性因子を分泌し、間接的に再生を促進するという理論に基づくものである。
　一方で、神経分化能の高さから神経上皮型幹細胞が移植ドナー細胞として優れるとした報告を認める（非特許文献８）。神経幹細胞をドナー細胞とする上では、倫理的・実用的問題があったが、ヒトiPS 細胞由来神経幹細胞はそれらを解決しうる理想的なドナー細胞である。iPS細胞にもその他の移植細胞療法と同様に造腫瘍性の問題が懸念されるため、その一因であるc-Myc等を用いない作製法も研究されているが、完全には否定できず、むしろ腫瘍化を避けようとするあまり、幹細胞自身の増殖能が低下してしまうことや多分化能が失われることも報告されている（Nakagawa M. Nat Biotechnol 2008; Stadtfeld M. Science. 2008）。
　腫瘍の治療薬は、種々の標的分子に対する様々なメカニズムによる化学化合物が開発されているが、化学物質であるが故の副作用の問題が常に存在し、安全な腫瘍治療剤は依然として喫緊の課題である。
Riess P. J Neurotrauma. 2007 Tajiri N. Front Syst. Neurosci. 2014 Tian C. Exp Clin Transplant. 2013 Qi L. J Craniofac Surg. 2018 Zanier ER. Crit Care Med. 2011 Turtzo LC. PLoS One. 2015 Steinberg GK. Stroke. 2016 Uchida K. Neurosci Res. 2005
　臨床応用を考えた場合、倫理的・実用的問題を解決しうるヒトiPS細胞由来神経幹細胞はドナー細胞として理想的である。しかし、上述したように、iPS細胞にもその他の移植細胞療法と同様に造腫瘍性の問題がある。本発明の第一の目的は、このような造腫瘍性の問題を解決したヒトiPS細胞由来神経幹細胞を提供することである。
　また、本発明者は、自殺遺伝子（プロドラッグを、細胞毒性を有する物質に変換する酵素をコードする遺伝子）をヒトiPS細胞に導入し、その後、神経幹細胞に誘導することで、脳腫瘍治療用細胞製剤の作製に成功している（WO2018/207808及びWO2019/098361）。本発明の第二の目的は、このようなヒトiPS細胞に導入された自殺遺伝子を恒常的に安定して発現させる手段を提供することである。
　更に、上記の細胞製剤の治療効果を事前に予測できれば、無駄な治療を防ぎ、効率的な治療が可能になる。本発明の第三の目的は、上記の細胞製剤の治療効果を予測する手段を提供することである。
　更に、神経幹細胞は腫瘍に対して遊走性及び指向性を示すが、それがどのような分子によって生じるのか明らかになっていない。これを明らかにすることができれば、腫瘍に対する遊走性及び指向性を強化した神経幹細胞の作製や遊走性及び指向性の高い神経幹細胞の効率的な選別が可能になる。本発明の第四の目的は、このような遊走性や指向性を神経幹細胞にもたらす分子を特定し、遊走性及び指向性を強化した神経幹細胞の作製手段及び遊走性及び指向性の高い神経幹細胞の効率的な選別手段を提供することにある。
　更に、細胞製剤に用いられる神経幹細胞は安全性の高いものでなければならない。しかし、自殺遺伝子の導入の際に使用するCRISPR/Cas9などのゲノム編集技術は、意図していない場所に変異が導入されるオフターゲット効果の問題がある。また、自殺遺伝子を有する神経幹細胞の作製に当たっては、細胞の選抜のため自殺遺伝子と共に薬剤耐性遺伝子などのセレクションマーカー遺伝子を挿入するが、安全性の観点からは、このような外来遺伝子は除去されることが望ましい。本発明の第五の目的は、安全性の高い神経幹細胞の作製手段を提供することである。
　本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、以下の知見を得た。
１）移植ドナー細胞としてiPS 細胞由来神経幹細胞を使用する際、予めiPS 細胞に自殺遺伝子を導入しておくことにより、移植細胞が腫瘍化した場合にはプロドラッグの投与により移植細胞を死滅させることができ、前述した造腫瘍性の問題を解決できることを見出した。また、神経幹細胞の移植から一定期間経過後にプロドラッグを投与した場合、腫瘍化リスクのある未分化な細胞が死滅する一方、移植細胞による治療効果が継続することも見出した。
２）自殺遺伝子をiPS細胞のβ-アクチン遺伝子の翻訳領域直後の3'側に挿入することにより、自殺遺伝子のプロドラッグに対する感受性が増大することを見出した。
３）腫瘍細胞におけるチミジレートシンターゼ遺伝子及びジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量を測定することにより、その腫瘍細胞に対する自殺遺伝子を導入した治療用幹細胞の抗腫瘍効果を推定できることを見出した。
４）エフリンB（ephrinB）とエフリンB受容体（EphB）のリガンドとレセプターのペア、及びCXCモチーフ型ケモカイン12（CXCL12）とCXCモチーフ型ケモカイン受容体4（CXCR4）のリガンドとレセプターのペアが、神経幹細胞の腫瘍に対する遊走性及び指向性に関与することを見出した。
５）ゲノム編集技術としてCRISPR/Cas9の代わりにオフターゲット効果の頻度の低いCRISPR/Cas3を用い、挿入されたセレクションマーカー遺伝子をCre/loxPシステムを用いて除去することにより、安全性の高い神経幹細胞を作製できることを見出し、また、このようにして作製された神経幹細胞は、従来の方法で作製された神経幹細胞と同様の治療効果を有することも見出した。更に、Cre/loxPシステムにおけるloxP配列を、変異を有するloxP配列に置き換えることにより、神経幹細胞の安全性をより高めることができることを見出し、また、この変異を有するloxP配列を使用したCre/loxPシステムと相同組換えベクターを組み合わせることにより、セレクションマーカー遺伝子を除去できるだけでなく、多能性幹細胞のゲノムに第２遺伝子を挿入できることも見出した。
６）多能性幹細胞から分化させた神経幹細胞が、脳腫瘍を含む腫瘍や損傷脳、強い指向性及び遊走性を示すことを見出した。
　本発明は、以上の知見に基づき、完成されたものである。
　即ち、本発明は、以下の〔１〕～〔３８〕を提供するものである。
〔１〕自殺遺伝子が導入された多能性幹細胞から分化させた神経幹細胞を含むことを特徴とする中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
〔２〕脳機能障害の治療に用いられることを特徴とする〔１〕に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
〔３〕外傷性脳損傷の治療に用いられることを特徴とする〔１〕に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
〔４〕脊髄損傷の治療に用いられることを特徴とする〔１〕に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
〔５〕神経変性疾患の治療に用いられることを特徴とする〔１〕に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
〔６〕脳腫瘍の治療に用いられることを特徴とする〔１〕に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
〔７〕自殺遺伝子が、多能性幹細胞のβ-アクチン遺伝子の翻訳領域直後の3’側に挿入されていることを特徴とする〔１〕～〔６〕に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
〔８〕多能性幹細胞のβ-アクチン遺伝子の翻訳領域直後の3’側に2Aペプチドをコードする配列が連結し、その2Aペプチドをコードする配列の3'側に自殺遺伝子が連結していることを特徴とする〔７〕に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
〔９〕神経幹細胞が、そのゲノム中にセレクションマーカー遺伝子を含まない神経幹細胞であることを特徴とする〔１〕～〔８〕に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
〔１０〕神経幹細胞が、以下の工程（Ａ）～（Ｄ）を含む方法によって得られる神経幹細胞であることを特徴とする〔９〕に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤、
（Ａ）ゲノム編集により多能性幹細胞のゲノムに遺伝子コンストラクトを挿入する工程であって、前記遺伝子コンストラクトは、自殺遺伝子、セレクションマーカー遺伝子、及び二つのCreタンパク質の標的配列を含み、セレクションマーカー遺伝子は二つのCreタンパク質の標的配列に挟まれている遺伝子コンストラクトである工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた多能性幹細胞の中から自殺遺伝子がゲノムに挿入された多能性幹細胞を、セレクションマーカー遺伝子によって選抜する工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた多能性幹細胞のゲノムからCreタンパク質によりセレクションマーカー遺伝子を除去する工程、
（Ｄ）工程（Ｃ）で得られた多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させる工程。
〔１１〕Creタンパク質の標的配列が、loxP配列であることを特徴とする〔１０〕に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
〔１２〕遺伝子コンストラクトに含まれる二つのCreタンパク質の標的配列が、上流繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列と下流繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列であり、遺伝子コンストラクトにおいて上流繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列はセレクションマーカー遺伝子の上流に位置し、下流繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列はセレクションマーカー遺伝子の下流に位置することを特徴とする〔１０〕に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
〔１３〕神経幹細胞が、以下の工程（ａ）～（ｄ）を含む方法によって得られる神経幹細胞であることを特徴とする〔９〕に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤、
（ａ）ゲノム編集により多能性幹細胞のゲノムに遺伝子コンストラクトを挿入する工程であって、前記遺伝子コンストラクトは、自殺遺伝子、セレクションマーカー遺伝子、繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列、及びスペーサー配列に変異を有する変異loxP配列を含み、セレクションマーカー遺伝子は前記二つの変異loxP配列に挟まれている遺伝子コンストラクトである工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた多能性幹細胞の中から自殺遺伝子がゲノムに挿入された多能性幹細胞を、セレクションマーカー遺伝子によって選抜する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた多能性幹細胞のゲノムからCreタンパク質及び相同組換えベクターによりセレクションマーカー遺伝子を除去すると共に、ゲノムに第２遺伝子を挿入する工程であって、前記相同組換えベクターは第２遺伝子、繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列、及びスペーサー配列に変異を有する変異loxP配列を含み、第２遺伝子は前記二つの変異loxP配列に挟まれている相同組換えベクターである工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させる工程。
〔１４〕ゲノム編集が、CRISPR/Cas3を用いたゲノム編集であることを特徴とする〔１０〕～〔１３〕に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
〔１５〕自殺遺伝子が、シトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする〔１〕～〔１４〕に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
〔１６〕シトシンデアミナーゼによって5-フルオロウラシルに変換されるプロドラッグとともに使用されることを特徴とする〔１５〕に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
〔１７〕神経幹細胞が、エフリンA受容体、エフリンA、エフリンB受容体、エフリンB、及びCXCモチーフ型ケモカイン受容体4から選ばれる少なくとも一つの発現量を増加させた神経幹細胞であることを特徴とする〔１〕～〔１６〕に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
〔１８〕神経幹細胞が、エフリンA、エフリンA受容体、エフリンB受容体、エフリンB、及びCXCモチーフ型ケモカイン受容体4の発現量を増加させた神経幹細胞であることを特徴とする〔１７〕に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
〔１９〕神経幹細胞が、エフリンA、エフリンA受容体、エフリンB受容体、エフリンB、及びCXCモチーフ型ケモカイン受容体4から選ばれる少なくとも一つの発現量を指標として選別された神経幹細胞であることを特徴とする〔１〕～〔１６〕に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
〔２０〕神経幹細胞が、エフリンA、エフリンA受容体、エフリンB受容体、エフリンB、及びCXCモチーフ型ケモカイン受容体4を指標として選別された神経幹細胞であることを特徴とする〔１９〕に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
〔２１〕以下の工程（１）及び（２）を含むことを特徴とする神経幹細胞の製造方法、
（１）ゲノム編集により、多能性幹細胞のβ-アクチン遺伝子の翻訳領域直後の3’側に、自殺遺伝子を挿入する工程、
（２）工程（１）で得られた多能性幹細胞を神経幹細胞へ分化させる工程。
〔２２〕工程（１）において、β-アクチン遺伝子の翻訳領域直後の3’側に2Aペプチドをコードする配列が連結し、その2Aペプチドをコードする配列の3'側に自殺遺伝子が連結するように、自殺遺伝子を多能性幹細胞のβ-アクチン遺伝子の翻訳領域直後の3’側に挿入することを特徴とする〔２１〕に記載の神経幹細胞の製造方法。
〔２３〕工程（１）が、以下の工程（１－Ａ）～（１－Ｃ）を含むことを特徴とする〔２１〕又は〔２２〕に記載の神経幹細胞の製造方法、
（１－Ａ）ゲノム編集により、多能性幹細胞のβ-アクチン遺伝子の翻訳領域直後の3’側に、遺伝子コンストラクトを挿入する工程であって、前記遺伝子コンストラクトは、自殺遺伝子、セレクションマーカー遺伝子、及び二つのCreタンパク質の標的配列を含み、セレクションマーカー遺伝子は二つのCreタンパク質の標的配列に挟まれている遺伝子コンストラクトである工程、
（１－Ｂ）工程（１－Ａ）で得られた多能性幹細胞の中から自殺遺伝子がゲノムに挿入された多能性幹細胞を、セレクションマーカー遺伝子によって選抜する工程、
（１－Ｃ）工程（１－Ｂ）で得られた多能性幹細胞のゲノムからCreタンパク質によりセレクションマーカー遺伝子を除去する工程。
〔２４〕Creタンパク質の標的配列が、loxP配列であることを特徴とする〔２３〕に記載の神経幹細胞の製造方法。
〔２５〕遺伝子コンストラクトに含まれる二つのCreタンパク質の標的配列が、上流繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列と下流繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列であり、遺伝子コンストラクトにおいて上流繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列はセレクションマーカー遺伝子の上流に位置し、下流繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列はセレクションマーカー遺伝子の下流に位置することを特徴とする〔２３〕に記載の神経幹細胞の製造方法。
〔２６〕工程（１）が、以下の工程（１－ａ）～（１－ｃ）を含むことを特徴とする〔２１〕又は〔２２〕に記載の神経幹細胞の製造方法、
（１－ａ）ゲノム編集により、多能性幹細胞のβ-アクチン遺伝子の翻訳領域直後の3’側に、遺伝子コンストラクトを挿入する工程であって、前記遺伝子コンストラクトは、自殺遺伝子、セレクションマーカー遺伝子、繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列、及びスペーサー配列に変異を有する変異loxP配列を含み、セレクションマーカー遺伝子は前記二つの変異loxP配列に挟まれている遺伝子コンストラクトである工程、
（１－ｂ）工程（１－ａ）で得られた多能性幹細胞の中から自殺遺伝子がゲノムに挿入された多能性幹細胞を、セレクションマーカー遺伝子によって選抜する工程、
（１－ｃ）工程（１－ｂ）で得られた多能性幹細胞のゲノムからCreタンパク質及び相同組換えベクターによりセレクションマーカー遺伝子を除去すると共に、ゲノムに第２遺伝子を挿入する工程であって、前記相同組換えベクターは第２遺伝子、繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列、及びスペーサー配列に変異を有する変異loxP配列を含み、第２遺伝子は前記二つの変異loxP配列に挟まれている相同組換えベクターである工程。
〔２７〕ゲノム編集が、CRISPR/Cas3を用いたゲノム編集であることを特徴とする〔２３〕～〔２６〕に記載の神経幹細胞の製造方法。
〔２８〕自殺遺伝子が、シトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする〔２１〕～〔２７〕に記載の神経幹細胞の製造方法。
〔２９〕〔１５〕に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤の脳腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を推定する方法であって、前記脳腫瘍細胞のチミジレートシンターゼ遺伝子及びジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量を測定する工程を含むことを特徴とする方法。
〔３０〕腫瘍又は損傷部位に対する遊走性及び／又は指向性の高い神経幹細胞を選別する方法であって、エフリンA、エフリンA受容体、エフリンB受容体、エフリンB、及びCXCモチーフ型ケモカイン受容体4から選ばれる少なくとも一つの発現量を指標として選別することを特徴とする選別方法。
〔３１〕エフリンA、エフリンA受容体、エフリンB受容体、エフリンB、及びCXCモチーフ型ケモカイン受容体4の発現量を指標として選別することを特徴とする〔３０〕に記載の選別方法。
〔３２〕〔２１〕～〔２８〕に記載の方法によって製造される神経幹細胞であって、自殺遺伝子が導入された多能性幹細胞から分化させた神経幹細胞を含むことを特徴とする腫瘍治療用細胞製剤。
〔３３〕神経幹細胞が、そのゲノム中にセレクションマーカー遺伝子を含まない神経幹細胞であることを特徴とする〔３２〕に記載の腫瘍治療用細胞製剤。
〔３４〕神経幹細胞が、エフリンA受容体、エフリンA、エフリンB受容体、エフリンB、及びCXCモチーフ型ケモカイン受容体4から選ばれる少なくとも一つの発現量を増加させた神経幹細胞であることを特徴とする〔３２〕又は〔３３〕に記載の腫瘍治療用細胞製剤。
〔３５〕神経幹細胞が、エフリンA、エフリンA受容体、エフリンB受容体、エフリンB、及びCXCモチーフ型ケモカイン受容体4の発現量を増加させた神経幹細胞であることを特徴とする〔３４〕に記載の腫瘍治療用細胞製剤。
〔３６〕神経幹細胞が、エフリンA、エフリンA受容体、エフリンB受容体、エフリンB、及びCXCモチーフ型ケモカイン受容体4から選ばれる少なくとも一つの発現量を指標として選別された神経幹細胞であることを特徴とする〔３２〕又は〔３３〕に記載の腫瘍治療用細胞製剤。
〔３７〕神経幹細胞が、エフリンA、エフリンA受容体、エフリンB受容体、エフリンB、及びCXCモチーフ型ケモカイン受容体4を指標として選別された神経幹細胞であることを特徴とする〔３４〕に記載の腫瘍治療用細胞製剤。
〔３８〕腫瘍が、膵癌であることを特徴とする〔３２〕～〔３７〕に記載の腫瘍治療用細胞製剤。
　明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2020-063477、特願2020-165847、特願2020-219455の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明は、新規な腫瘍治療製剤、中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤を提供する。特に、脳挫傷を含む外傷性脳損傷や脳梗塞などの脳機能障害の治療または神経変性によって生じる神経細胞脱落の結果として生じる神経変性疾患の治療に細胞製剤を用いる場合、細胞の腫瘍化が問題になるが、本発明の細胞製剤は、自殺遺伝子によって細胞を死滅させることができるので、安全性の高い細胞製剤である。
自殺遺伝子発現・治療用神経幹細胞（NSC）の樹立に関する図（１）。 自殺遺伝子発現・治療用NSCの樹立に関する図（２）。 自殺遺伝子発現・治療用NSCの樹立に関する図（３）。 自殺遺伝子発現・治療用NSCの樹立に関する図（４）。 治療用NSC（酵母シトシンデアミナーゼ（yCD）-NSC)の悪性グリオーマに対する遊走性に関する図。 治療用NSC(yCD-NSC)の悪性グリオーマモデルマウスに対する抗腫瘍効果に関する図（１）。 治療用NSC(yCD-NSC)の悪性グリオーマモデルマウスに対する抗腫瘍効果に関する図（２）。 治療用NSC(yCD-NSC)の悪性グリオーマモデルマウスに対する抗腫瘍効果に関する図（３）。 治療用NSC(yCD-NSC)の悪性グリオーマモデルマウスに対する抗腫瘍効果に関する図（４）。 治療用NSC(yCD-NSC)の脳挫傷に対する脳保護作用に関する図（１）。 治療用NSC(yCD-NSC)の脳挫傷に対する脳保護作用に関する図（２）。 治療用NSC(yCD-NSC)の脳挫傷に対する脳保護作用に関する図（３）。 治療用NSC(yCD-NSC)の脳挫傷に対する脳保護作用に関する図（４）。 治療用NSC(yCD-NSC)の脳挫傷に対する脳保護作用に関する図（５）。 治療用NSC(yCD-NSC)の脳挫傷に対する脳保護作用に関する図（６）。 治療用NSC(yCD-NSC)の脳挫傷に対する脳保護作用に関する図（７）。 5-FU放出の運動機能への影響に関する図（１）。 5-FU放出の運動機能への影響に関する図（２）。 治療用NSC(yCD-NSC)の安全性（分化細胞）に関する図（１）。 治療用NSC(yCD-NSC)の安全性（分化細胞）に関する図（２）。 治療用NSC(yCD-NSC)の安全性（分化細胞）に関する図（３）。 治療用NSC(yCD-NSC)の安全性（モデルマウス）に関する図（１）。 治療用NSC(yCD-NSC)の安全性（モデルマウス）に関する図（２）。 治療用NSC(yCD-NSC)の安全性（モデルマウス）に関する図（３）。 治療用NSC(yCD-NSC)の安全性（モデルマウス）に関する図（４）。 治療用NSC(yCD-NSC)の安全性（モデルマウス）に関する図（５）。 yCD-NSCによる抗腫瘍効果のバイオマーカーに関する図（１）。 yCD-NSCによる抗腫瘍効果のバイオマーカーに関する図（２）。 yCD-NSCによる抗腫瘍効果のバイオマーカーに関する図（３）。 yCD-NSCによる抗腫瘍効果のバイオマーカーに関する図（４）。 リガンド-レセプターペアリング解析の概要を示す図。 脳内に移植された神経幹細胞（NSC）及び間葉系幹細胞（MSC）の写真。 自己分泌細胞間の相互作用によるヒートマップ。 エンリッチメント解析により示唆されたNSC及びGSC特異的な自己分泌リガンド-レセプターペアを示す図。 EphB/ephrinB遺伝子発現によるヒートマップ。 パラ分泌細胞間の相互作用によるヒートマップ。 既報の切除神経膠芽腫のsingle-cell RNA-seqを用いたt-SNE plot（単一細胞の遺伝子発現を網羅的に解析し、細胞の類似性を二次元プロット上に可視化することができる解析法）を示す図。 以前の治療用幹細胞の作製方法を模式的に表した図。 Cre/loxPによるセレクションマーカー遺伝子の除去方法を模式的に表した図。 実施例３において使用した各種ベクターの構造を表した図。 実施例３におけるPuromycin遺伝子及びVenus遺伝子の除去方法を模式的に表した図。 実施例３におけるクローニングの手順を模式的に表した図。 実施例３におけるgenomic PCRの結果を示す図（１）。 実施例３におけるgenomic PCRの結果を示す図（２）。 実施例３におけるgenomic PCRの結果を示す図（３）。 実施例３におけるgenomic PCRの結果を示す図（４）。 自殺遺伝子による脳腫瘍治療方法を模式的に表した図。 実施例３で使用したiPS細胞（上段）、胚様体（下段左）、及び神経幹細胞（下段右）の顕微鏡写真。 実施例３で使用した細胞株の遺伝子発現量を示す図。各棒グラフは左から、GAPDH、yCD、Puromycin、Venusの発現量を示す。 実施例３で使用した神経幹細胞のPuromycin存在又は非存在下における顕微鏡写真。 実施例３で使用した神経幹細胞の各種5-FC濃度における顕微鏡写真（上段）及び細胞生存率を示す図（下段）。 実施例３で使用した神経幹細胞の5-FC存在又は非存在下における抗腫瘍効果を表す写真（左）及び図（右）。 loxP配列及び変異lox配列の塩基配列を示す図。 Cre/変異loxシステムを用いた抗生剤耐性遺伝子の除去法及びCre/変異loxシステムを用いた第２遺伝子挿入方法を模式的に表した図。 実施例４で使用したベクターの構造を示す図。 薬剤耐性・蛍光遺伝子削除法に関する図（１）。 薬剤耐性・蛍光遺伝子削除法に関する図（２）。 薬剤耐性・蛍光遺伝子削除法に関する図（３）。 薬剤耐性・蛍光遺伝子削除法に関する図（４）。 第２遺伝子挿入法に関する図（１）。 第２遺伝子挿入法に関する図（２）。 第２遺伝子挿入法に関する図（３）。 第２遺伝子挿入法に関する図（４）。 薬剤耐性・蛍光遺伝子削除法によって樹立されたiPS細胞及び神経幹細胞における各種遺伝子の発現を示す図。 薬剤耐性・蛍光遺伝子削除法によって樹立されたiPS細胞及び神経幹細胞の5-FC及びPuromycinに対する応答を示す図。 第２遺伝子挿入法によって樹立されたiPS細胞及び神経幹細胞の5-FC及びPuromycinに対する応答を示す図。 薬剤耐性・蛍光遺伝子削除法又は第２遺伝子挿入法によって樹立された神経幹細胞の抗腫瘍効果を示す図。 実施例５の実験方法の概要を示す図。 神経幹細胞の膵癌に対する指向性及び遊走性を示す図（１）。 神経幹細胞の膵癌に対する指向性及び遊走性を示す図（２）。
　以下、本発明を詳細に説明する。
（Ａ）細胞製剤
　本発明の腫瘍治療製剤、中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤は、自殺遺伝子が導入された多能性幹細胞から分化させた神経幹細胞を含むことを特徴とするものである。
　自殺遺伝子としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（HSVtk）、カルボキシルエステラーゼ（carboxylesterase）、デオキシシチジンキナーゼ遺伝子及びシトシン　アラビノシド（deoxycytidine kinase ／ cytosine arabinoside）、シトシンデアミナーゼ（CD）遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（UPRT）遺伝子（CD-UPRT遺伝子）を挙げることができる。本発明では、シトシンデアミナーゼ（CD）遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（UPRT）遺伝子（CD-UPRT遺伝子）を好適な例として挙げることができる。
　本発明における「中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤」とは、中枢神経系疾患及び中枢神経系損傷に対する治療用細胞製剤を意味し、より具体的には、中枢神経系（例えば、脳や脊髄など）における疾患や損傷を治療するために用いられる細胞製剤をいう。治療の対象とする疾患や損傷は特に限定されず、例えば、脳腫瘍、神経変性疾患、脳機能障害、脊髄損傷などを挙げることができ、好適には脳腫瘍又は脳機能障害である。治療の対象とする脳機能障害は特に限定されず、物理的損傷による機能障害、例えば、脳挫傷による機能障害、脳血管障害（例えば、脳梗塞、脳出血、くも膜下出血）による機能障害などを挙げることができる。神経変性疾患とは、神経変性による神経細胞の脱落を原因とする疾患であり、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、前頭側頭葉変性症などを具体例として挙げることができる。脳腫瘍としては、例えば、グリオーマ（神経膠腫）、髄芽腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、下垂体腺腫、神経鞘腫、原発性中枢神経系リンパ腫、肉腫、脊髄腫瘍などを挙げることができる。本発明においては、これらのいずれの脳腫瘍も治療対象とすることができるが、グリオーマを治療対象とすることが好ましい。なお、本発明の細胞製剤を脳腫瘍の治療に用いる場合、「治療」には、腫瘍細胞を死滅させることだけでなく、腫瘍細胞を減少させることや腫瘍細胞の増殖を阻害することも含まれる。
　本発明における「腫瘍治療用細胞製剤」とは、腫瘍の治療に用いられる細胞製剤を意味する。本発明の細胞製剤は、神経幹細胞の腫瘍組織への遊走性、指向性という特性を利用して自殺遺伝子を腫瘍組織に作用させるものである。ここでいう「治療」には、腫瘍細胞を死滅させることだけでなく、腫瘍細胞を減少させることや腫瘍細胞の増殖を阻害することも含まれる。腫瘍としては、前記神経幹細胞の特性から、実施例に挙げる脳腫瘍、膵癌だけでなく多くの腫瘍、例えば、乳がん、胃がん、肺がん等、が対象となる。
　本発明における「多能性幹細胞」とは、当業者が通常用いる意味に解釈することができ、例えば、iPS細胞やES細胞が含まれる。多能性幹細胞としては、ES細胞を使用することもできるが、iPS細胞を使用することが好ましい。使用するiPS細胞は、神経幹細胞へ分化させることのできるものであれば、その由来、導入する再プログラミング因子、再プログラミング因子の導入方法などは特に限定されないが、本発明の細胞製剤は主としてヒトの脳における疾患や損傷を治療するために用いられるので、このような場合にはヒト由来のiPS細胞を用いることが好ましい。この場合、iPS細胞は、細胞製剤を投与する患者由来のiPS細胞を用いてもよく、患者以外のヒト由来のiPS細胞を用いてもよい。使用するiPS細胞は、公知の方法に従って作製してもよいが、京都大学iPS細胞研究所（CiRA）などの研究機関から入手することも可能である。
　本発明における「神経幹細胞」とは、ニューロン及びグリア細胞へ分化する細胞を供給する能力を持つ幹細胞をいう。本発明の細胞製剤は、この神経幹細胞を含むが、脳損傷や脳疾患の治療効果に大きな悪影響を及ぼさない限り、神経幹細胞以外の細胞を含んでいてもよい。後述するSugai K. Mol Brain 2016記載の方法に従ってiPS細胞から神経幹細胞を作製すると、神経幹細胞だけでなく、神経前駆細胞も生じる。このため、本発明の細胞製剤は、神経幹細胞と神経前駆細胞の両方を含む場合がある。
　神経幹細胞の腫瘍に対する遊走性や指向性が高いほど、多くの神経幹細胞を疾患や損傷部位に集積でき、高い治療効果が期待できる。従って、神経幹細胞において、上述した遊走性及び指向性に関与するリガンドとレセプターのペアのうち、神経幹細胞内で発現するもの、具体的には、エフリンA、エフリンA受容体、エフリンB、エフリンB受容体、CXCモチーフ型ケモカイン受容体4の発現量を増加させることが好ましい。エフリンA、エフリンA受容体、エフリンB、エフリンB受容体、及びCXCモチーフ型ケモカイン受容体4については、これら五者のすべての発現量を増加させることが好ましいが、エフリンB、エフリンB受容体、及びCXCモチーフ型ケモカイン受容体4の三者だけの現量を増加させるだけでもよく、前記した三者から選ばれる少なくとも一つの発現量を増加させるだけでもよい。これらのリガンド及びレセプターの発現量の増加は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、これらのリガンド及びレセプターの遺伝子を神経幹細胞に導入する方法（必要に応じて、強発現プロモーターなど遺伝子の発現量を増加させる制御領域と共に導入してもよい。）、これらのリガンド及びレセプターの発現量を増加させる作用を持つ物質を使用する方法などによって行うことができる。
　また、腫瘍に対する遊走性や指向性が元々高い神経幹細胞を使用することによっても、高い治療効果が期待できるので、神経幹細胞としては、後述する本発明の選別方法によって選別された神経幹細胞を使用してもよい。
　カルボキシルエステラーゼ（carboxylesterase）はCPT-11 を毒性の高い 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin に変換し、topoisomerase Iを強力に抑制する。シトシン　アラビノシドはデオキシシチジンキナーゼ遺伝子によりリン酸化され抗腫瘍効果を発揮する。CD遺伝子及びUPRT遺伝子は、それぞれ5-フルオロシトシン（5-FC）及び5-フルオロウラシル（5-FU）をプロドラッグとする自殺遺伝子である。これらの自殺遺伝子を発現するベクターは市販されており、そのようなベクターを利用して、これらの自殺遺伝子を発現する多能性幹細胞や神経幹細胞を作製することができる。CD遺伝子及びUPRT遺伝子は、それぞれ単独でも抗腫瘍効果を有するが、これら二つの遺伝子を細胞に導入することにより、CD遺伝子を単独で導入した場合の約100倍の抗腫瘍効果が得られることが知られている。
　自殺遺伝子の多能性幹細胞への導入は、ウイルスベクターを使用して行ってもよいが、好ましくは、ゲノム編集を用いて行う。これは、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いて自殺遺伝子を多能性幹細胞のゲノムに挿入した場合、自殺遺伝子は染色体にランダムに挿入されるため、挿入部位の遺伝子変異や周辺遺伝子の活性化、位置効果による自殺遺伝子の不活性化が懸念されるからである。ウイルスベクターではなく、ゲノム編集を用いることにより、このような問題を回避できると考えられる。
　ゲノム編集は、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas3、Cre/loxPなどを用いて行うことができ、これらの中では、CRISPR/Cas9やCRISPR/Cas3を用いて行うことが好ましく、CRISPR/Cas3を用いて行うことが特に好ましい。CRISPR/Cas3は、CRISPR/Cas9より認識標的配列が長いため、オフターゲット効果の頻度が低く、より安全性の高い神経幹細胞を作製できる。ゲノム編集により、自殺遺伝子を多能性幹細胞のハウスキーピング遺伝子の領域やセーフ・ハーバー領域AAVS1に挿入することができる。ハウスキーピング遺伝子としては、例えば、β-アクチン遺伝子、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）遺伝子、シクロフィリン遺伝子、α-チューブリン遺伝子などを挙げることができる。本発明においては、自殺遺伝子をβ-アクチン遺伝子の翻訳領域直後の3'側に挿入することが好ましい。また、このとき、自殺遺伝子を、β-アクチン遺伝子の翻訳領域直後の3'側に2Aペプチドをコードする配列が連結し、その2Aペプチドをコードする配列の3'側に自殺遺伝子が連結するように、β-アクチン遺伝子の翻訳領域直後の3'側に挿入することが好ましい。
　自殺遺伝子を多能性幹細胞に導入する際、細胞の選抜のため、通常、外来の薬剤耐性遺伝子や蛍光遺伝子などのセレクションマーカー遺伝子も一緒に導入する。しかし、多能性幹細胞から分化させた神経幹細胞のゲノム中にセレクションマーカー遺伝子のような外来遺伝子が残存していることは、安全性の面から好ましくない。このため、セレクションマーカー遺伝子を除去することが好ましい。セレクションマーカー遺伝子を除去する手段は特に限定されないが、Cre/loxPシステムなどCreタンパク質とCreタンパク質の標的配列の組み合わせを用いることが好ましい。ここで、「Creタンパク質の標的配列」とは、loxP配列（配列番号１）や変異を有するloxP配列（変異loxP配列）などをいう。loxP配列は、上流繰り返し配列、スペーサー配列、及び下流繰り返し配列からなるが、変異loxP配列における変異は、これらの配列のいずれに存在してもよい。上流繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列の具体例としては、lox71（配列番号２）を挙げることができ、スペーサー配列に変異を有する変異loxP配列の具体例としては、lox2272（配列番号４）を挙げることができ、下流繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列の具体例としては、lox66（配列番号３）を挙げることができる。
　Cre/loxPシステムを用いてセレクションマーカー遺伝子を除去する方法としては、自殺遺伝子、セレクションマーカー遺伝子、及び二つのloxP配列を含み、セレクションマーカー遺伝子は二つのloxP配列に挟まれている遺伝子コンストラクトを作製し、これを多能性幹細胞のゲノムに挿入し、その後、Creタンパク質により多能性幹細胞のゲノムからセレクションマーカー遺伝子を除去する方法を例示できる。但し、この方法では、多能性幹細胞のゲノム中に一つのloxP配列が残り、それがCreタンパク質と反応する危険がある。そこで、遺伝子コンストラクト中に含まれるloxP配列を変異loxP配列に置き換え、ゲノム中に残るloxP配列をCreタンパク質と反応しにくい変異loxP配列とすることが好ましい。具体的には、遺伝子コンストラクトに含まれる二つのloxP配列を、上流繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列と下流繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列に置き換え、上流繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列がセレクションマーカー遺伝子の上流に位置し、下流繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列はセレクションマーカー遺伝子の下流に位置するような遺伝子コンストラクトを作製し、これを多能性幹細胞のゲノムに挿入し、その後、Creタンパク質により多能性幹細胞のゲノムからセレクションマーカー遺伝子を除去する方法を例示できる。この方法では、ゲノム中に残るのは、上流繰り返し配列及び下流繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列となり、Creタンパク質と反応する危険を軽減できる。
　上記の遺伝子コンストラクトの他に、相同組換えベクターを使用し、ゲノムからセレクションマーカー遺伝子を除去するだけでなく、これと同時にゲノムに第２遺伝子を挿入することも可能である。この場合、遺伝子コンストラクトは、自殺遺伝子、セレクションマーカー遺伝子、繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列、及びスペーサー配列に変異を有する変異loxP配列を含み、セレクションマーカー遺伝子は前記二つの変異loxP配列に挟まれている遺伝子コンストラクトを使用する。また、相同組換えベクターは、第２遺伝子、繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列、及びスペーサー配列に変異を有する変異loxP配列を含み、第２遺伝子は前記二つの変異loxP配列に挟まれている相同組換えベクターを使用する。第２遺伝子としては、自殺遺伝子とは別の治療に関与する遺伝子を使用することができる。
　遺伝子コンストラクトにおける変異loxP配列の位置は特に限定されず、図２２Ｃに示すように、繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列がセレクションマーカー遺伝子の上流に位置し、スペーサー配列に変異を有する変異loxP配列がセレクションマーカー遺伝子の下流に位置してもよく、その逆であってもよい。但し、繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列がセレクションマーカー遺伝子の上流に位置する場合、変異loxP配列は、上流繰り返し配列に変異を有するものが好ましく、逆に、繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列がセレクションマーカー遺伝子の下流に位置する場合、変異loxP配列は、下流繰り返し配列に変異を有するものが好ましい。これにより、変異loxP配列がゲノムに残ることになるからである。
　相同組換えベクターにおける変異loxP配列の位置は、遺伝子コンストラクトにおける変異loxP配列と同じような位置になるようにする。即ち、遺伝子コンストラクトにおいて、繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列がセレクションマーカー遺伝子の上流に位置し、スペーサー配列に変異を有する変異loxP配列がセレクションマーカー遺伝子の下流に位置する場合、相同組換えベクターにおいては、繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列が第２遺伝子の上流に位置し、スペーサー配列に変異を有する変異loxP配列が第２遺伝子の下流に位置するようにする。遺伝子コンストラクトにおける変異loxP配列の位置が上記と逆の場合、相同組換えベクターにおける変異loxP配列の位置が上記と逆になるようにする。
　上記の遺伝子コンストラクが挿入されたゲノムに、Creタンパク質と上記の相同組換えベクターを作用させると、相同組換えが起こり、セレクションマーカー遺伝子がゲノムから除去され、同時にゲノムに第２遺伝子が挿入される。相同組換えベクターには、Creタンパク質をコードする遺伝子を挿入しておき、それによって、Creタンパク質と相同組換えベクターを同時に作用させてもよい。
　多能性幹細胞から神経幹細胞への分化は、胚様体を介する方法、胚様体を介さない方法、公知のいずれの方法に従って行ってもよい。iPS細胞から分化させる場合は、例えば、Stem Cell Reports. 2017 Nov 14;9(5):1675-1691記載の方法に従って行うことができる。例えば、上記方法によれば、iPS細胞から胚様体の形成は、公知の胚様体形成培地を使って行うことができ、胚様体培地は、TGFβファミリー阻害剤（例えば、SB431542）及びBMP阻害剤（例えば、LDN-193189）を含むものである。胚様体から神経幹細胞への分化は、公知のニューロスフェア培地を使って行うことができる。例えば、ニューロスフェア培地は、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子-2、白血病阻止因子、B-27 supplementなどを含むものである。胚様体をニューロスフェア培地で培養することにより、ニューロスフェアと呼ばれる神経幹細胞を含む細胞塊が形成される。形成されたニューロスフェアを回収し、単一細胞に分散し、ニューロスフェア培地で培養することにより、再びニューロスフェアが形成される。このような操作を何度か繰り返した後、ニューロスフェアを回収することにより、神経幹細胞を得ることができる。
　なお、上述のように、本明細書においては、「神経幹細胞」という「物」を構造や特性ではなく、製造方法によって特定しているが、これは、細胞が生体の一部であることから、その構造や特性は極めて複雑であり、それらを特定する作業を行うことは、著しく過大な経済的支出や時間を必要とするからである。
　本発明の細胞製剤は、神経幹細胞の他に、製剤上許容される他の成分を含んでいてもよい。このような他の成分としては、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを挙げることができる。また、凍結保存時の細胞を保護するためにジメチルスルフォキシドや血清アルブミンなどが含まれていてもよく、細菌の混入や増殖を防ぐために抗生物質などが含まれていてもよい。
　本発明の細胞製剤中に含まれる神経幹細胞の数は、腫瘍、脳疾患や脳損傷の治療において所望の効果が得られるように、腫瘍等の疾患、脳疾患や脳損傷の種類、対象の性別、年齢、体重、患部の状態、使用する細胞の状態等を考慮して、適宜決めることができる。
　本発明の細胞製剤は、複数回（例えば、2～10回）、間隔（例えば、1日に2回、1日に1回、1週間に2回、1週間に1回、2週間に1回）をおいて投与してもよい。投与量は、疾患や損傷の種類、対象の性別、年齢、体重、患部の状態、使用する細胞の状態などを考慮して、適宜決めることができるが、一個体（ヒト）あたり幹細胞1×106個～1×1010個で、1～10回の投与が好ましい。
　本発明の細胞製剤の投与部位や投与方法は特に限定されない。投与方法としては、脳又は腫瘍組織への局所投与、頚動脈内投与、静脈内投与などを挙げることができる。
　本発明の細胞製剤は、自殺遺伝子によって活性化されるプロドラッグとともに使用してもよい。プロドラッグは自殺遺伝子の種類によって決めることができ、例えば、自殺遺伝子としてCD-UPRT遺伝子を使用した場合、シトシンデアミナーゼによって5-フルオロウラシルに変換されるプロドラッグ（例えば、5-FC）を使用することができる。このようなプロドラッグを使用することにより、自殺遺伝子を有する細胞に細胞死を誘導することができる。プロドラッグを使用するかどうかは、治療対象とする疾患や損傷に応じて決めることができる。例えば、脳機能障害を治療対象とする場合、プロドラッグの使用による細胞死誘導は直接治療効果に関係するわけではなく、腫瘍細胞の死滅や腫瘍化の可能性のある細胞の死滅を目的とするものなので、プロドラッグは必ず使用しなければならないというわけではない。一方、脳腫瘍を治療対象とする場合、プロドラッグの使用による細胞死誘導は直接治療効果に関係するので、プロドラッグの使用は必須である。
　プロドラッグの投与部位や投与方法も特に限定されない。投与方法としては、経口投与、脳または組織への局所投与、頚動脈内投与、静脈内投与のほか、腹腔内投与なども挙げることができる。
　プロドラッグの投与時期は、治療対象とする疾患や損傷に応じて決めることができる。例えば、脳の損傷を治療対象とする場合は、腫瘍細胞が生じた時点で投与してもよく、また、腫瘍細胞の発生を予防するため、本発明の細胞製剤の投与から一定時間経過後に投与を開始してもよい。このような予防的投与の開始時期は、神経幹細胞の持つ治療効果を失わせず、かつ腫瘍化リスクのある未分化な細胞を死滅させることのできる時期であれば特に限定されず、例えば、本発明の細胞製剤投与から3～60日後としてもよく、5～20日後としてもよい。また、脳腫瘍を治療対象とする場合は、本発明の細胞製剤の投与前、投与、及び投与後のいずれであってもよいが、通常は、細胞製剤の投与後に、複数回に分けて投与する。他の腫瘍においても同様である。
　プロドラッグの投与量は、使用するプロドラッグの種類、疾患や損傷の種類、対象の性別、年齢、体重、患部の状態などを考慮して適宜決めることができるが、5-FCを投与する場合であれば、一個体（ヒト）あたり1日50-200mg/kg、1日4回で投与することが好ましい。
（Ｂ）神経幹細胞の製造方法
　本発明の神経幹細胞の製造方法は、下記の工程（１）及び（２）を含むことを特徴とするものである。
　工程（１）では、ゲノム編集により、多能性幹細胞のβ-アクチン遺伝子の翻訳領域直後の3'側に、自殺遺伝子を挿入する。この工程は、「（Ａ）細胞製剤」に記載した自殺遺伝子の多能性幹細胞への導入と同様に行うことができる。
　工程（２）では、工程（１）で得られた多能性幹細胞を神経幹細胞へ分化させる。この工程は、「（Ａ）細胞製剤」に記載した多能性幹細胞から神経幹細胞への分化と同様に行うことができる。
（Ｃ）抗腫瘍効果を推定する方法
　本発明の抗腫瘍効果を推定する方法は、上述した本発明の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤の脳腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を推定する方法であって、前記脳腫瘍細胞のチミジレートシンターゼ遺伝子及びジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量を測定する工程を含むことを特徴とするものである。
　遺伝子の発現量の測定は、公知の方法、例えば、RT-qPCR法によって行うことができる。
　測定の結果、チミジレートシンターゼ遺伝子及びジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量が高い場合、測定対象とした脳腫瘍細胞に対する本発明の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤の抗腫瘍効果は低いと推定でき、一方、前記遺伝子の発現量が低い場合、測定対象とした脳腫瘍細胞に対する本発明の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤の抗腫瘍効果は高いと推定できる。
（Ｄ）遊走性及び指向性の高い神経幹細胞の選別方法
　本発明の選別方法は、腫瘍又は損傷部位に対する遊走性及び／又は指向性の高い神経幹細胞を選別する方法であって、エフリンA、エフリンA受容体、エフリンB受容体、エフリンB、及びCXCモチーフ型ケモカイン受容体4から選ばれる少なくとも一つの発現量を指標として選別することを特徴とするものである。
　エフリンA、エフリンA受容体、エフリンB、エフリンB受容体、及びCXCモチーフ型ケモカイン受容体4については、これら五者のすべての発現量を指標として選別することが好ましいが、エフリンB、エフリンB受容体、及びCXCモチーフ型ケモカイン受容体4の三者だけの現量を指標として選別してもよく、前記した三者から選ばれる少なくとも一つの発現量を指標として選別してもよい。
　具体的な選別方法としては、例えば、下記の工程（１）及び（２）を含む方法を例示できる。
（１）エフリンA、エフリンA受容体、エフリンB受容体、エフリンB、及びCXCモチーフ型ケモカイン受容体4から選ばれる少なくとも一つの発現量を測定する工程、
（２）工程（１）で測定した発現量が、基準値より高い場合、その神経幹細胞を「腫瘍又は損傷部位に対する遊走性及び／又は指向性の高い神経幹細胞」として選別する工程。
　ここで、選別に使用する基準値は特に限定されず、例えば、一般的に使用される神経幹細胞（例えば、市販の神経幹細胞など）のエフリンA、エフリンA受容体、エフリンB受容体、エフリンB、又はCXCモチーフ型ケモカイン受容体4の発現量を予め測定しておき、それを基準値としてもよい。
　以下に、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例において「NSC」は、通常、「NS/PCs（Neural stem/Progenitor cells）」を意味するものとする。
〔実施例１〕
（Ａ）方法
＜ヒトiPS細胞＞
　使用したヒトiPS細胞(1210B2)は、京都大学iPS細胞研究所(CiRA)から入手した。1210B2は、ヒト末梢血単核細胞にエピソーマルベクターを用いて再プログラミング因子を導入する方法(Okita K, Yamakawa T, Matsumura Y, Sato Y, Amano N, Watanabe A, Goshima N, Yamanaka S. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 2013 Mar;31(3):458-66.)によって樹立された。ヒトiPS細胞は、iMatrix-511（ニッピ社製）でコートしたプラスチック培養ディッシュに播種し、Stem Fit AK03又はAK03N培地（味の素社製）を用いて、既知のフィーダーフリーの方法(Nakagawa M. Sci Rep. 2014) で維持培養した。
＜ヒトiPS細胞から神経幹/前駆細胞(NSC)への分化誘導＞
　ヒトiPS細胞からNSCへの分化誘導は、既知の方法(Sugai K. Mol Brain. 2016)により行った。まずiPS細胞の培地中に10μM ROCK阻害剤Y276352（和光純薬工業社製）を添加し、1～3時間インキュベーションした後、PBSで洗浄し、TrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて単一細胞へ分散した。単一細胞へ分散されたヒトiPS細胞は、10μM ROCK阻害剤Y276352を添加したEB(embryoid body)形成培地（C液を添加していないStem Fit培地に10μM SB431542, 100nM LDN-193189を添加）に懸濁し、低接着96穴培養プレート（Prime Surface 96V，住友ベークライト社製）の1ウェルあたり9.0×103細胞/75μlになるように播種し、培養した。1日後にEB形成培地75μlを加え、以降、毎日半分量のEB形成培地を交換し、13～14日間培養することにより、EBを得た。各ウェルからEBを回収し、NS(neurosphere)培地（D-MEM/Ham's F-12培地(HEPES含有)（和光純薬工業社製）に20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (PeproTech社製), 20 ng/ml Recombinant human fibroblast growth factor 2 (PeproTech社製), 103 units/ml Recombinant human leukemia inhibitory factor (ナカライテスク社製), 2% B-27 supplement (Thermo Fisher Scientific社製), 1単位/ml ヘパリンナトリウム（エイワイファーマ社製）を添加）で7日間培養した。培地交換は、培養3日か4日目に1度行った。細胞塊を遠心で回収し、TrypLE Selectを用いて単一細胞へ分散後、NS培地に懸濁した。1×105細胞/mlの濃度で低接着フラスコ（Corning社製）に播種し、3～4日ごとに培地交換を行い、10日間培養することにより1次NSCを得た。同様にして、1次NSCを遠心で回収し、TrypLE Selectを用いて単一細胞へ分散後、NS培地に懸濁し、1×105細胞/mlの濃度で低接着フラスコに播種し、3～4日ごとに培地交換を行い、7～10日間培養することにより2次、3次、4次、5次NSCを得た。
＜CRISPR/Cas9によるGAPDH、ACTB、AAVS1遺伝子領域へのyCD-UPRT遺伝子導入-治療用幹細胞yCD-NSCの作製＞
各遺伝子領域にyCD-UPRT遺伝子を導入したiPS細胞の作製
　CRISPR/Cas9ゲノム編集技術を用いて、ハウスキーピング遺伝子領域GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、ACTB (β-actin)、及びセーフ・ハーバー領域AAVS1（PPP1R12C）にyCD-UPRT融合自殺遺伝子を挿入したiPS細胞を作製した。ゲノム編集のためのDNAコンストラクトは、GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)遺伝子領域にyCD-UPRTを組み込むため、GAPDHとyCD-UPRTとBsd(blasticidin耐性遺伝子)が2A peptide配列で繋がった形で挿入されるような相同組み換え用コンストラクト(HR-GAPDH-2A-yCD-UPRT-2A-Bsd)と、GAPDHの終止コドン近辺をターゲットとするgRNA及びCas9発現ベクターコンストラクト(U6-GAPDH-gRNA4-Cas9)を作製した。β-actinの場合はGAPDHと同様に、β-actinの終止コドン近辺をターゲットとするgRNA発現ベクターを構築し、相同組み換え用のコンストラクトは、やはりβ-actinとyCD-UPRTとBsdが2A peptide配列で繋がった形で挿入されるように構築した(β-actin-2A-yCD-UPRT-2A-Bsd)。AAVS1領域の相同組み換え用コンストラクトは、EF-1プロモーター下でyCD-UPRT-2A-Bsdを発現する形にし、両端にインシュレーター配列を付加した。これらの遺伝子とyCD-UPRTとBsdが2A peptide配列で繋がった形で挿入されるようにした。
　これらのコンストラクトをヒトiPS細胞株(1210B2)にエレクトロポレーションで導入し、blasticidin S存在下で培養し、クローニングを行った。相同組み換えiPS細胞株の確認は、各クローンのgenomic PCR及びgenomic sequencingによる塩基配列確認により行った。
yCD-UPRT発現NSCの作製(yCD-NSC) 
　各遺伝子領域にyCD-UPRTを組み込んだiPS細胞から、NSCへ分化誘導を行い、2次～5次NSCを得た（yCD-NSC）。培地には常時blasticidin S 1μg/mlを添加し培養を行った。yCD-UPRT発現NSCは、培地に5-FC 1-5μg/mlを添加することにより細胞死が誘導されることを確認した。
補足情報 
※yCD-NSCの悪性神経膠腫に対する遊走及び抗腫瘍効果に関して
　ヒトグリオーマ細胞株U87(ffLuc)による腫瘍塊の上方1mmにyCD-NSC (hKO1で標識)を移植し、その遊走性を脳切片培養を用いて定量的に評価した（Tamura R. Mol Brain. 2019）。比較対象として、脂肪組織由来及び骨髄由来ヒト間葉系幹細胞株（hKO1で標識）を用いた。方向及び移動距離をパラメーターとし、Rose Diagram Maps(Angular histogram)を作成することで脳内遊走性を定量的に評価した。yCD-NSCの抗腫瘍効果は、U87グリオーマモデルマウスに対してyCD-NSCを移植し5-FC投与することで評価した。
※yCD-NSCの安全性に関して
　正常脳の右線条体に、上記同様に5×105個yCD-NSC（ffLuc）を移植し、7日後から5-FCを2週間投与した。コントロールとして5-FC非投与群も作製した。その後150日後に断頭し、脳組織を評価した。5-FCより変換される5-FUは、理論的には終末分化した細胞が占める脳内の細胞には影響を及ぼさないと考えられるが、脳室近傍に存在する神経前駆細胞や、血管内皮などわずかに分裂を伴う細胞には影響を与える可能性があるため、血管内皮細胞マーカー（CD31）及び、神経幹細胞/前駆細胞マーカー（Nestin）を用いて組織学的に評価した。また、yCD-NSC移植後35日目より5-FC投与を開始し、生着したyCD-NSCを消失させることをIVISで確認した。
※yCD-NSCのバイオマーカーについて
　U87, U251, SF126,hG008, hG021, GL261, TSGに対する5-FUの感受性を評価した（CCK-8 assay）。対象としてTMZを用い比較した。また、それぞれの細胞株、及びyCD-NSCのthymidylate synthase (TS), Dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD)活性をRT-qPCR法およびWestern blotting法により定量解析した。
yCD-UPRT発現NSCのニューロンへの分化及び、分化細胞の5-FU感受性
　yCD-UPRT発現NSCをin vitroでニューロンに分化させた。分化はβIII tubulin及びNeuNの発現及び形態により確認した。未分化増殖細胞の残存はKi-67、PCNA、Nestinの発現により確認した。細胞死はCleaved caspase 3の発現により評価した。5-FCを加え、導入されたyCD-UPRTにより放出される5-FUによる、これら分化細胞・未分化細胞の変化を評価した。
ffLuc発現yCD-NSCの作製
　作製したyCD-NSCにffLuc(Venus蛍光タンパク質とLuc2ホタルルシフェラーゼの融合遺伝子)発現レンチウイルスベクター(CSII-EF-ffLuc)(Takahashi Y, Tsuji O, Kumagai G, Hara CM, Okano HJ, Miyawaki A, Toyama Y, Okano H, Nakamura M. Comparative study of methods for administering neural stem/progenitor cells to treat spinal cord injury in mice. Cell Transplant. 2011;20(5):727-39.)を感染させ、ffLucが安定に高発現するyCD-NSCを得た。
＜脳挫傷モデルマウスにおけるyCD-NSCの治療効果の検討＞
　全身麻酔したT cell-deficient mouse (Female BALB/c nude mouse, 20g, 10w)の大泉門より左外側1.25mm、吻側1.25mmを中心とする直径2.5ｍｍの円形の開頭を行った。骨弁は後に戻すため保護した。脳表を露出しACU22XTアモイルス冷凍手術装置（キーラーアンドワイナー） 2.5ｍｍプローベを用いて、脳表を冷却することで脳挫傷を作製した（60℃ 30sec×10sets）。続いて1×105個のyCD-NSCを大泉門より同部位挫傷直下（左外側2.5mm、吻側1.25mm、深さ2mm）に移植した。摘出した骨弁を戻し皮膚縫合し終了した。
　マウスの行動評価は、まず術前よりRota rod（UGO BASILE）を2回、スマート型ラットマウス用握力測定装置MK-380Si（室町機械）を1回行い、マウスを器具に習熟させた。Rota rodは２r.p.mから20r.p.mまで300秒かけて回転数を増し、マウスがロッドから落下又は安定した歩行が不可能になるまでの時間を計測した。各測定日には3回Rota rodを施行し、平均時間を測定した。本方法は既報に沿ったものである（Tabuse J Clin Neurosci. 2010）。握力測定は測定器付属のネット上にプラスチックカバーを被せ、把持できるネットの面積を制限することで1肢のみの握力測定を可能とした。握力は4肢すべて測定、ネットを5指で把持したところで尾を水平に引き、ネットから肢が離れるまでのピーク値を測定した。各肢7回ずつ測定し、最大値と最小値を除いた5回の平均値を比較した（Alamri FF. Behav Brain Res. 2018）。
　術後は、3、5、7、14、21、28、35、42日後に、上記方法で運動機能を評価した。同一個体のyCD-NSCの継時的変化はIVIS in vivo imaging systemで１週間ごとに観察した。IVIS撮影時は、Isoflurane吸入麻酔下にVivoGloTM Luciferin 30mg/ml を200μl腹腔内投与し、ピークに達する5分で撮影を行った。
　また、脳挫傷作製後7、14、28、42日目時点で4匹ずつ断頭灌流固定し脳組織を得た。断頭の際はEvans blue（Sigma-Aldrich）2％溶液（溶媒は無菌生理食塩水）を、断頭2時間前に0.2ml/匹・尾静脈から注入し、その後断頭した。
　また、挫傷より下方約1mmを目指し（脳表より深さ3mm）、1×105個のyCD-NSCを同日移植した。その後42日目で、断頭し組織を評価。移植したyCD-NSCはSTEM121ヒト細胞特異的抗体を用いることで評価した。
＜脳挫傷モデルマウスにおけるyCD-NSCの安全性の検討＞ 
　上記と同様に、挫傷を作製及びyCD-NSCを移植後、7日後に5-FC 5mg/匹/day腹腔内投与を2週間連日行った。5-FC非投与群及び、yCD-NSC非移植群の両コントロールと運動機能（握力）を比較した。こうして、5-FU放出が脳機能に悪影響を及ぼさないことを確認した。
（Ｂ）結果
＜自殺遺伝子発現・治療用NSCの樹立＞
　レンチウイルスベクターによるヒトiPS細胞に対する自殺遺伝子（yCD-UPRT）の遺伝子導入では、神経幹細胞/前駆細胞（NSC）への分化誘導過程で、遺伝子のサイレンシングが生じた（図１Ａ）。そこで、本発明者はゲノム編集技術CRISPR/Cas9を用い、ハウスキーピング遺伝子領域βactin（ACTB）に挿入することで、yCD-UPRTの恒常的な安定発現を実現することに成功した（図１Ｂ）。yCD-UPRTはプロドラッグである抗真菌剤5-FCを、抗癌剤5-FUに変換することで、細胞死を誘導する（図１Ｃ）。
　本発明者は、自殺遺伝子の挿入部位の最適化を行うために、その他のハウスキーピング遺伝子GAPDHやセーフ・ハーバー領域AAVS1にもCRISPR/Cas9でyCD-UPRTを遺伝子導入した。AAVS1領域ではウイルスベクターと同様にサイレンシングし、GAPDH領域では、プロドラッグ5-FCに対する感受性がβactin領域の半分以下であった（図１Ｄ）。そこで、本発明者はβactinをyCD-UPRTの最適な遺伝子導入領域と決定した。5-FCに対する感受性はCCK-8 assayによる定量解析を行った。
＜治療用NSC(yCD-NSC)の悪性グリオーマモデルマウスに対する抗腫瘍効果＞
　本発明者は、iPS細胞由来NSCが脳内で腫瘍に対し遊走する様子をリアルタイムに撮影し定量的に指向性を評価する独自の方法を構築している(図２ＡRose diagram map参照)。その結果、iPS細胞由来NSCは、移植細胞療法として使用されることがあるその他の脂肪由来(AMSC)及び骨髄由来間葉系幹細胞 (BMSC)よりも脳内で良好に指向・遊走性を示し、Cellular delivery vehicleとしての有用性を示した（図２Ａ）。図１に示した方法で樹立した治療用NSC (yCD-NSC)をグリオーマモデルマウス(U87)に移植した（図２Ｂ）。これは腫瘍への遊走性を利用した治療である。その結果、5-FC投与により、コントロールに比して有効な治療効果を示した（図２Ｃ）。なお、コントロールはyCD-NSCを移植するが、5-FCを投与しない群、yCD-NSCを移植しないが、5-FCを投与する2群作製した。
　5-FCを投与後2W時点の脳組織を評価した際、コントロールに比して、著明な腫瘍縮小及び完全消失を認めた（図２Ｄ）。なお、腫瘍は黄色・Venus蛍光タンパクで標識している。生存期間も、両コントロール群に比して著明に延長した（図２Ｅ）。
＜治療用NSC(yCD-NSC)の脳挫傷に対する脳保護作用＞
　本発明者は冷却装置を用いた脳挫傷モデルを樹立し報告をしている。左前脳に脳挫傷を作製することで、右不全下肢麻痺を呈するモデルを安定して作製することが可能である（図３Ａ）。yCD-NSCにffLuc(Venus蛍光タンパク質とLuc2ホタルルシフェラーゼの融合遺伝子)発現レンチウイルスベクターを感染させ、IVISで移植yCD-NSCを同定できるようにした（図３Ｂ）。なお、図２に示した方法ではグリオーマ細胞株に感染させ、治療効果を評価していた。yCD-NSCは腫瘍細胞のみならず、損傷脳（脳挫傷）にも著明な遊走能を示した。脳挫傷の対側に移植したyCD-NSCは2週間たらずで、脳挫傷部位にシグナルを認めるようになった（図３Ｃ）。
　脳挫傷部位にyCD-NSCを移植し、IVISで生着を追い、35日後に5-FCを投与すると、yCD-NSCの信号は完全に消失した（図３Ｄ）。細胞療法では常に移植細胞の腫瘍化が問題として挙げられるが、本発明者の樹立したyCD-NSCは5-FC投与により死滅するため、腫瘍化に対する安全装置を有しているということになり、安全な再生医療の実現を可能とする。
　脳挫傷に対し、yCD-NSCを移植した治療群はコントロール群に比し、有意に運動機能（握力）の改善を認めた（図３Ｅ）。さらに、色素（Evans blue）により脳損傷部位を可視化した結果、脳挫傷後14日の脳組織では、yCD-NSCを移植した脳で著明な脳損傷部位の縮小を認めた（図３Ｆ）。これは急性期損傷脳に対するyCD-NSCの脳保護作用を意味する。また、挫傷の下方1mm地点にyCD-NSCを移植し42日後に脳組織を評価した際、顕著に挫傷部位に遊走・集簇を認めた（図３Ｇ）。
＜5-FU放出の運動機能への影響＞
　本発明者は、急性期に脳保護効果を発揮したNSCのうち、未分化状態で残存したもの（腫瘍化リスクあり）を5-FC投与により死滅させることで、脳機能の低下がないかを確認した。挫傷作製日（Day0）の超急性期にNSCを移植し、Day7までの急性期に脳保護作用を発揮させ、その後亜急性期にかけ2週間5-FCを投与する（図４Ａ）。その結果、Day7から、5-FCを投与したとしても、運動機能が落ちることなく、5-FC非投与群と同様の機能回復を得た（図４Ｂ）。また、NSC非移植コントロールに比して有意に機能改善効果を示した（図４Ｂ）。
＜治療用NSC(yCD-NSC)の安全性（分化細胞）＞
　yCD-NSCが分化した細胞には影響を及ぼさないことの証明として、yCD-NSC自身をNeuronにin vitroで分化させ、プロドラッグ5-FCを投与する実験を行った（図５Ａ）。Neurosphereは非常に長い突起を伸ばし形態上Neuronへの分化が予想される。こうして長く突起を伸ばした細胞はNeuron markerであるβIII tubulinが陽性である（図５Ｂ）。こうしてNeuronに分化していることが示された。しかし、一方でKi-67陽性の増殖性細胞もまだ一部残存していた（図５Ｂ）。5-FCを投与すると、それらKi-67陽性の増殖性細胞のみ死滅し、βIII tubulin陽性の分化細胞は放出される5-FUに対して死滅しないことがわかる。PCNA陽性の増殖性細胞には、細胞死が生じ、βIII tubulin陽性の分化細胞には細胞死は生じていないことが示されている（図５Ｂ）。
　また、さらに成熟NeuronマーカーであるNeuNを発現している細胞も一部見られ、その様な細胞にはやはり5-FC投与後放出される5-FUにより細胞死は生じないことが明確に示された（図５Ｃ）。
＜治療用NSC(yCD-NSC)の安全性（モデルマウス）＞
　グリオーマ幹細胞hG008(緑)モデルマウスに移植したyCD-NSC（赤）は、腫瘍細胞に遊走し、腫瘍内に存在しているが、5-FCを投与した結果、腫瘍細胞も殺傷しているが、自らも死滅し、残存はない（図６Ａ）。
　5-FCは理論的には終末分化した細胞が占める脳内の細胞には影響を及ぼさないと考えられるが、脳室近傍に存在する神経前駆細胞や、血管内皮などわずかに分裂を伴う細胞には影響を与える可能性もある。そこで、今回、正常脳にyCD-NSCを移植し、5-FCを投与した結果、移植部位近傍の脳室壁の神経前駆細胞（図６Ｂ）及び血管内皮細胞（図６Ｃ）に対して明らかなアポトーシスを生じた細胞は認められなかった。yCD-NSCは腫瘍や損傷脳に集簇するため、これらの組織の近傍にあえて指向性を示すことはないことが示唆される。正常脳にyCD-NSCを移植した後の経過をIVISで追跡したが、5-FC投与後、信号は消失し、自らの死滅を表してる（図６Ｄ）。なお、図６Ｅの脳組織画像中のＡ、Ｂ、及びＣは、それぞれ蛍光組織画像図６Ａ、Ｂ、及びＣの部位に相当する。
＜yCD-NSCによる抗腫瘍効果のバイオマーカー＞
　5-FUの活性代謝体のFdUMPはDNA de novo系酵素のthymidylate synthase (TS)の酵素活性を阻害する（図７Ａ）。こうしてDNAのde novo合成系は抑制され、DNA障害が時間依存性に生じる。また、通常腫瘍内に取り込まれた5-FUは分解酵素であるDihydropyrimidine dehydrogenase (DPD)により分解される（図７Ａ）。よって、DPD活性が低いほど腫瘍内の5-FU濃度は高まり、標的酵素のTS活性が低いほど、FdUMPにより効率良くTS活性が阻害され、抗腫瘍効果が増強されることが予想される。そこで、TS、DPDの発現が、本発明者のyCD-NSCによる抗腫瘍効果のバイオマーカーになると考えた。5-FUに対する各グリオーマ細胞株の感受性をCCK-8 assayにより評価した。その結果、感受性は,　（良好）GL261, TSG, hG008, U87, U251 (不良）であった（図７Ｂ）。
　TSとDPDのmRNAレベルの遺伝子発現をRT-qPCR法により定量解析した。U251において、TS,DPD共に高値であることがわかる（図７Ｃ）。Western blotting法でも同様の結果であった。図７Ｃをプロットしたグラフを作成すると、5-FUに対して顕著な効果を示したhG008, TSG, GL261は双方のrelative gene expressionが0.5以下（U87を１として評価）であった。また最も5-FUに抵抗性であったU251は双方3.0程度のrelative gene expressionを呈した（図７Ｄ）。これらの結果からTSとDPDは、本治療のバイオマーカーとなり得た。また、ACTB (yCD-NSC)も特にTS活性が高く、5-FUに対する反応が良好とはいえなかった（図７Ｄ）。すなわち、尚更5-FCの感受性が良好な自殺遺伝子挿入部位を決定することが求められ、本発明者の評価したACTB領域はそれに該当するものである。また、NSCが5-FUに対する感受性が良好とはいえない点は、内在性の神経幹細胞に対する影響を及ぼす可能性が少ない「安全性」を示唆する結果でもある。
〔実施例２〕
＜背景＞
　神経幹細胞（Neural stem cell: NSC）及び間葉系幹細胞(Mesenchymal stem cell: MSC)は腫瘍や損傷部位に遊走する性質を有する事から、治療遺伝子のCellular delivery vehicle (CDV)として使用されてきた（引用文献１及び２）。NSCは胎児由来組織等から採取することができるが、その低い増殖性の問題や、倫理的側面から使用は容易ではない。本発明者はヒトinduced pluripotent stem cell (iPS細胞)から、NSCを分化誘導させることでその問題を解決した。そしてNSCを神経膠芽腫に対する治療遺伝子(cytosine deaminase-uracil phosphoribosyl transferase: CD-UPRT)のCDVとして用いる治療戦略を研究してきた。一方で、神経膠芽腫に対して、NSC、MSCどちらが優れたCDVになり得るか、その答えは未だ明らかでない。
　本発明者は、脳切片培養（Tamura R. Mol Brain. 2019[特願2019-052704]）を用いて、脳内に移植したNSC及びMSC（脂肪組織、骨髄由来）の神経膠芽腫細胞に対する遊走性を評価した結果、NSCはMSCに対して有意に良好な遊走・指向性を示すことが明らかになった。そこで今回、本発明者が保有するNSC株、MSC株、神経膠芽腫株に対してRNA-seq解析を行うことで、NSCとMSCの遊走に差異をもたらすKey moleculeを明らかにした。
＜方法＞
　悪性神経膠腫の難治性の根源としてグリオーマ幹細胞（Glioma stem cell: GSC）が報告されている。GSCはGlioma cell (GC)と異なり、自己複製と腫瘍形成能を有し、高い浸潤性と化学・放射線療法抵抗性を有し、再発の根源とされている。
　ヒトiPS cell由来NSC(iPSC-NSC)、ヒト胎児皮質由来NSC(FcNSC)、ヒト胎児海馬由来NSC(FhNSC)、ヒト脂肪組織由来MSC2株(AMSC1, AMSC2)、ヒト骨髄由来MSC2株（BMSC1, BMSC2）、ヒトGC株（U87, U251, SF126）、ヒトGSC株（hG008, hG021）（引用文献３）から、miRNeasy Serum/Plasma kit (QIAGEN) を用いて、 QIAcube (QIAGEN) automation systemによりRNAを抽出した。RNA-seq解析は、Macrogen Inc. による受託解析により行った。
　また、既に報告済みの切除神経膠芽腫のRNA-seq dataはNCBI Short Read Archive (SRR359290 and SRR359291)のデータベースを使用した（引用文献４）。
　遺伝子発現の差異は、DESeq2 suite of bioinformatics toolsを用いてBenjamini-Hochberg 法にてp=0.001、そしてlog2 fold-change ratioで10倍をcutoff値とした。
リガンド-レセプターペアリング解析
　リガンド-レセプターペアリングは既報のデータベースを参照した（引用文献５）。2552のリガンド-レセプターペアが精選され（引用文献６）、ある細胞間でリガンド及びレセプターの両者の発現を認めた際は、マッチドペアとして選出された（図８参照）。
Single-cell RNA-seq
　既報の切除神経膠芽腫のsingle-cell RNA-seq dataを再検討した（引用文献７）。
＜結果＞
　まず、自己反発シグナリング経路を抽出するため、自己分泌相互作用について評価した。自己反発に着目した理由は、NSCとMSCは腫瘍なしで、単独で移植したとしても脳内で挙動が異なるからである。NSCは拡散して生着し、MSCは細胞塊を形成する (図９)。またこの生着の様子は、GSC（拡散した生着）とGC(細胞塊形成)と類似するため[Tamura R. Mol Brain. 2019]、GSCとGCの差異も有力な情報とした。その結果NSC-NSC及びGSC-GSC間で92のリガンド-レセプターペアを同定した（図１０）。これらはMSCには同定されなかった。
　エンリッチメント解析（特定の遺伝子セットと発現比の間に相関の有り無しを判定するための解析）によると、これらのペアはEph/ephrin repulsion signalingとの関係が示唆された。特にEphB/ehrinBがMSCに比較してNSCでアップレギュレートしていた。実際にEphB/ephrinBがGSCの浸潤と関与するという報告がある（引用文献８）。よって、特にEphB/ephrinBがNSC同士の自己反発を生じさせ、拡散した生着と関係するということが示唆された。
　次に、GSCとNSCもしくはMSCの傍分泌相互作用に関して評価した。すなわち、GSCの放出するリガンド、及びそれを感受するNSCのレセプターがあり、このペアが指向性に関与すると考えた。27のリガンド-レセプターペアが、NSCとGSC間に認めた。しかし、これらは、本発明者のin vitroのグリオーマ細胞株で発現が上昇してはいなかった。この結果はin vitroで培養されたGSCが脳内の神経膠芽腫を完全に反映できていない可能性が示唆された。そこで、本発明者は、既報の切除された神経膠芽腫のRNA-seq dataを用い、in silicoリガンド-レセプターペアリング解析を行った。その結果、8のリガンド-レセプターペアを切除された神経膠芽腫とNSCの間に認めた。現在までに報告が多いCXCL12/CXCR4シグナルに着目した（引用文献２）。その結果、CXCR4がNSCで高発現し、MSCでは発現を認めていなかった。CXCL12は in vitroで培養されたGSCよりも、切除された神経膠芽腫で高発現していた。
　さらに、本発明者は、既報の神経膠芽腫のsingle-cell RNA-seqのデータを再検討した。その結果、神経膠芽腫周囲の微小環境に集簇することで知られる腫瘍浸潤マクロファージでもCXCL12の高発現を認めた。In vitro 培養のGSCはCD14やCD163といったマクロファージマーカーは低発現であった。これらのデータは脳内の腫瘍浸潤マクロファージのCXCL12もCXCR4を発現するNSC(MSCは発現なし)の指向性を生み出す可能性を示唆する。
　以上よりEphB-ephrinBによる自己反発反応と、CXCL12-CXCR4による指向性が関与し、これらの両因子が、NSCの神経膠芽腫に対する指向性をもった遊走をもたらすと結論づけた。NSCとMSCの神経膠芽腫に対する遊走・指向性の差異及び、それを生み出すkey moleculeを指摘した報告は今まで認めない。また、CXCL12はその他の悪性腫瘍（膵癌等）でも高発現が指摘されているため、神経膠芽腫以外の腫瘍に対する遊走性も予想される。
＜引用文献＞
1.Kim, S.U., Jeung, E.B., Kim, Y.B., Cho, M.H., Choi, K.C. Potential tumor-tropic effect of genetically engineered stem cells expressing suicide enzymes to selectively target invasive cancer in animal models. Anticancer Res. 31:1249-1258 (2011).
2.Vescovi, A.L., Galli, R., Reynolds, B.A. Brain tumour stem cells. Nat Rev Cancer. 6:425-436 (2006).
3. Fukaya, R. et al. MIF Maintains the Tumorigenic Capacity of Brain Tumor-Initiating Cells by Directly Inhibiting p53. Cancer Res. 76,2813-2823 (2016).
4. Chen, L.Y. et al. RNASEQR--a streamlined and accurate RNA-seq sequence analysis program. Nucleic Acids Res. 40, e42 (2012).
5. Camp, J.G. et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546, 533-538 (2017).
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7. Neftel, C. et al. An Integrative Model of Cellular States, Plasticity, and Genetics for Glioblastoma. Cell. 178, 835-849 (2019).
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〔実施例３〕
（Ａ）背景
　本発明者はinduced pluripotent stem cell (iPS細胞)由来のneural stem/progenitor cells (NSC)は、腫瘍組織や損傷脳へ高い遊走能を示すことから、治療遺伝子のCellular delivery vehicleとして利用する治療法を考案した。治療遺伝子として、酵母シトシンデアミナーゼ（yCD）- uracil phosphoribosyl transferase（UPRT）融合遺伝子(yCD-UPRT)）を用いて、ゲノム編集技術でiPS細胞のハウスキーピング遺伝子座（ACTB）に挿入することで、恒常的安定発現を実現した。
　これまでiPS細胞に遺伝子導入後、薬剤耐性遺伝子・蛍光遺伝子により細胞のセレクションを行っていたが、臨床応用に際して、薬剤耐性遺伝子などの外来遺伝子はできるだけ除去することが望ましい。また、CRISPR-Cas9などのゲノム編集技術は、狙っていない場所に変異が入るオフターゲット効果による安全性の懸念がある。最近、新たなゲノム編集技術としてCRISPR/Cas3が開発され、CRISPR/Cas9より認識標的配列が長いため、オフターゲット効果の頻度が低いことが報告されている。
（Ｂ）発明概要
　安全性の高い治療用幹細胞を作製するため、オフターゲット効果が低いゲノム編集技術を用いて治療遺伝子をiPS細胞に導入後、細胞セレクションに用いる外来遺伝子を除去する新たな技術を開発した。
　具体的には、yCD-UPRT融合遺伝子・薬剤耐性遺伝子・蛍光遺伝子をゲノム編集技術CRISPR/Cas3を用いて、ハウスキーピング遺伝子座（ACTB）に挿入したiPS細胞を作製する。蛍光・薬剤セレクション後、Cre/loxPシステムを用いて外来遺伝子（薬剤耐性遺伝子・蛍光遺伝子）を除去する。なお、自殺遺伝子（プロドラッグを代謝して殺腫瘍物質に変換させる酵素をコードする遺伝子）が導入された細胞は、プロドラック投与により自らが死滅する[Tamura R. Neurosurgical review. 2019]。
（Ｃ）方法
＜ヒトiPS細胞＞
　使用したヒトiPS細胞(1210B2)は、京都大学iPS細胞研究所(CiRA)から入手した。1210B2は、ヒト末梢血単核細胞にエピソーマルベクターを用いて再プログラミング因子を導入する方法(Okita K, Yamakawa T, Matsumura Y, Sato Y, Amano N, Watanabe A, Goshima N, Yamanaka S. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 2013 Mar;31(3):458-66.)によって樹立された。ヒトiPS細胞は、iMatrix-511（ニッピ社製）でコートしたプラスチック培養ディッシュに播種し、Stem Fit AK03またはAK03N培地（味の素社製）を用いて、既知のフィーダーフリーの方法(Nakagawa M, Taniguchi Y, Senda S, Takizawa N, Ichisaka T, Asano K, Morizane A, Doi D, Takahashi J, Nishizawa M, Yoshida Y, Toyoda T, Osafune K, Sekiguchi K, Yamanaka S. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 2014 Jan 8;4:3594.)で維持培養した。
＜ヒトiPS細胞から神経幹/前駆細胞(NSC)への分化誘導＞
　ヒトiPS細胞からNSCへの分化誘導は、既知の方法(Sugai K, Fukuzawa R, Shofuda T, Fukusumi H, Kawabata S, Nishiyama Y, Higuchi Y, Kawai K, Isoda M, Kanematsu D, Hashimoto-Tamaoki T, Kohyama J, Iwanami A, Suemizu H, Ikeda E, Matsumoto M, Kanemura Y, Nakamura M, Okano H. Pathological classification of human iPSC-derived neural stem/progenitor cells towards safety assessment of transplantation therapy for CNS diseases. Mol Brain. 2016 Sep 19;9(1):85.)により行った。まずiPS細胞の培地中に10μM ROCK阻害剤Y276352（富士フイルム和光純薬株式会社）を添加し、1～3時間インキュベーションした後、PBSで洗浄し、TrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて単一細胞へ分散した。単一細胞へ分散されたヒトiPS細胞は、10μM ROCK阻害剤Y276352を添加したEB(embryoid body)形成培地（C液を添加していないStem Fit培地に10μM SB431542, 100nM LDN-193189を添加）に懸濁し、低接着96穴培養プレート（Prime Surface 96V，住友ベークライト社製）の1ウェルあたり9.0×103細胞/75μlになるように播種し、培養した。1日後にEB形成培地75μlを加え、以降、毎日半分量のEB形成培地を交換し、13～14日間培養することにより、EBを得た。各ウェルからEBを回収し、NS(neurosphere)培地（D-MEM/Ham's F-12培地(HEPES含有)（和光純薬工業社製）に20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (PeproTech社製), 20 ng/ml Recombinant human fibroblast growth factor 2 (PeproTech社製), 1×103 units/ml Recombinant human leukemia inhibitory factor (ナカライテスク社製), 2% B-27 supplement (Thermo Fisher Scientific社製), 1単位/ml ヘパリンナトリウム（エイワイファーマ社製）を添加）で7日間培養した。培地交換は、培養3日か4日目に1度行った。細胞塊を遠心で回収し、TrypLE Selectを用いて単一細胞へ分散後、NS培地に懸濁した。1×105細胞/mlの濃度で低接着フラスコ（Corning社製）に播種し、3～4日ごとに培地交換を行い、10日間培養することにより1次NSCを得た。同様にして、1次NSCを遠心で回収し、TrypLE Selectを用いて単一細胞へ分散後、NS培地に懸濁し、1×105細胞/mlの濃度で低接着フラスコに播種し、3～4日ごとに培地交換を行い、7～10日間培養することにより2次、3次、4次、5次NSCを得た。
＜CRISPR/Cas3によるACTB遺伝子領域へのyCD-UPRT遺伝子導入-治療用幹細胞の作製(Therapeutic stem cell: TSC)＞
ACTB遺伝子領域にyCD-UPRT遺伝子を導入したiPS細胞の作製(TiPS1,２)　
　CRISPR/Cas3ゲノム編集技術を用いて、ハウスキーピング遺伝子領域ACTB (β-actin)にyCD-UPRT融合自殺遺伝子を挿入したiPS細胞を作製した。ゲノム編集のための相同組み換え用ベクターは、ACTB (β-actin)遺伝子領域にyCD-UPRTを組み込むため、ACTBとyCD-UPRTが2A peptide配列で繋がり、その下流にloxP配列で挟まれたIRES配列、Puromycin耐性遺伝子、2A peptide、蛍光タンパク質Venusが繋がった形で挿入されるようなコンストラクト(HR-ACTB-2A-yCD-UPRT-loxP-IRES-Puromycin-2A-Venus-loxP)を作製した。ゲノム切断用ベクターは、ACTBの終止コドン近辺をターゲットとするcrRNAおよび一連のCas３関連タンパク質を発現するコンストラクト(Cas3-crRNA-All-in)を作製した。これらのコンストラクトをヒトiPS細胞株(1210B2)にエレクトロポレーションで導入し、Puromycin S存在下で培養し、コロニーピックアップによりクローニングを行った。相同組み換えiPS細胞株(TiPS1)の確認は、各クローンのgenomic PCRおよびgenomic sequencingによる塩基配列確認により行った。Cre/loxP組換え用ベクターは、EFプロモーターの下流に蛍光タンパク質mCherry、IRES配列、Creタンパク、human growth hormone polyadenylation signalが繋がったコンストラクト（EF-mCherry-IRES-Cre-hCGpolyA）を作製した。このコンストラクトをTiPS1にエレクトロポレーションで導入し、mCherryの蛍光を発しており、かつVenusの蛍光が消失した細胞をソーティングによりクローニングした（図１５及び１６）。セレクションマーカー除去iPS細胞株(TiPS2)の確認は、各クローンのgenomic PCRおよびgenomic sequencingによる塩基配列確認により行った。
yCD-UPRT発現NSCの作製(TSC1, 2)
　ACTBにyCD-UPRTを組み込んだiPS細胞(TiPS1,2)から、NSCへ分化誘導を行い、2次～5次NSCを得た。TSC1はTiPS1から分化誘導したセレクションマーカー配列が残存している治療用NSCであり、TSC2はTiPS2から分化誘導したセレクションマーカー配列を除去済みの治療用NSCである(図１７)。セレクションマーカーを除去しても（TSC2）、細胞の増殖やCDの発現量等に変化を認めないことを示すため、TSC1を比較対象として培養した。TSC1培地には常時Puromycin S 1μg/mlを添加し培養を行った。TSC1及び2は、培地に5-Fluorocytosine (5-FC) 1-7μg/mlを添加することにより細胞死が誘導されることを確認した。細胞死の評価は、細胞増殖/細胞毒性アッセイキットであるCell Counting Kit-8 (CCK-8)（Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japan）を用いて行った。
TiPSC1,2,TSC1,2の遺伝子発現解析
　リアルタイムqPCRにより、ゲノム未編集iPS細胞株(iPS-nega)、TiPSC1、TSC1、TiPSC2、TSC2、CRISPR/Cas9を用いてゲノム編集を行ったiPS-Cas9、NSC-Cas9のmRNA発現を比較した。TB Green（登録商標）Premix Ex TaqTM II（タカラバイオ）を用いて、GAPDH、ACTB 、yCD-UPRT、Puromycin耐性遺伝子、Venus遺伝子のmRNA発現量を測定し、ACTBの発現量で各遺伝子の発現量を正規化した。
TSC1,2の抗腫瘍効果の確認(TSC1, 2)
　低接着96穴培養プレート（Prime Surface 96V，住友ベークライト社製）を用いて、グリオーマ細胞株U87 (1×104個)あるいはグリオーマ幹細胞株hG008 (1×104個)とTSC1またはTSC2(5×103個)を1日間共培養し、その後5-FCを添加し（2μg/ml）、5日間後に細胞増殖/細胞毒性アッセイキットであるCell Counting Kit-8 (CCK-8)を用いて細胞死を評価した。
（Ｄ）結果
＜NSCへの分化誘導＞
　TiPS1及びTiPS2は、上記方法にて、問題なくNSCに分化誘導可能であった（TSC1及びTSC2）。TSC1はVenus蛍光タンパク質での標識を確認した(図１７Ｂ)。遺伝子発現はTiPS1及びTSC1においてyCD-UPRTとセレクションマーカーの発現を確認、TiPS2及びTSC2においてyCD-UPRTの発現とセレクションマーカーの未発現を確認した(図１７Ｃ)。また、GAPDHまたはACTBの発現量により補正したyCD-UPRTの発現量はiPS-Cas9、NSC-Cas9と大差なかった。(図１７Ｃ)。なお、ACTBと比較してyCD-UPRTの発現量が25～50%程度なっているが、これはヘテロで挿入されているからである。
＜TSC1,2のPuromycinへの耐性＞
　TSC1はPuromycin耐性遺伝子により、Puromycin添加により細胞は問題なくselection可能であった。TSC2はPuromycinにより即座に死滅し、Cre/loxPシステムによりPuromycin耐性遺伝子は予定通り抜けている事を確認した(図１８)。
＜TSC1,2の5-FCへの感受性＞
　TSC1,2いずれも5-FCに対する感受性は良好であり、1μg/mlの濃度で完全に死滅した(図１９)。同じくACTB locusにyCD-UPRTをCRISPR/Cas9で導入し作製したNSCの感受性と同等のものであった(図１９)。
＜TSC1,2の抗腫瘍効果＞
　TSC1,2をグリオーマ細胞株U87及びグリオーマ幹細胞hG008細胞株と共培養し、5-FC(2μg/ml)を投与した。細胞死はCCK-8 assayにて評価したところ、どちらもプロドラッグ投与後、有意な腫瘍細胞死を起こした(図２０)。U87及びhG008単独に対して、5-FCを投与しても特に腫瘍細胞死は生じなかった(図２０)。
〔実施例４〕
（Ａ）変異loxP配列の概要
　図２１Ａに示すように、lox配列は、上流繰り返し配列、スペーサー配列、下流繰り返し配列からなる。各部位に変異が入っている変異lox配列が既に開発されている（図２１Ａ中のアンダーラインが変異部位である）。
　lox71とlox66を組み換えた場合、片方がlox71/66、もう片方がloxPになる（図２１Ｂ）。lox71/66は両端に変異があるため、Creに認識されにくい。従って、ゲノムにlox71/66が残るようにすれば安全性を高めることができる。また、スペーサー配列に変異のあるlox2272は同じlox2272としか組み換えが起きない（図２１Ｃ）。
（Ｂ）背景
(1)Cre/変異loxシステムを用いた抗生剤耐性遺伝子の除去法
　実施例３に記載した薬剤耐性遺伝子・蛍光遺伝子の削除法の安全性を高めるため、loxPの代わりに変異loxP配列（アーム領域変異）を用いた薬剤耐性遺伝子・蛍光遺伝子の削除法を開発した。
　Cre/loxPシステムは、Creタンパク質を発現させることで、loxPで挟まれたDNA配列（薬剤耐性遺伝子など）を削除可能であるが、最終的にloxP配列が１つ残るため、万が一Creと反応する危険性がある。そこで、その危険性を低減するため、削除予定のDNA配列（薬剤耐性遺伝子など）を繰り返し配列に変異を有するloxP （lox71とlox66）で挟む方法を開発した。loxPの変異配列であるlox71は上流繰り返し配列部分に、lox66は下流繰り返し配列部分に変異が組み込まれている。この結果、挟まれた遺伝子を削除後に残るlox71/66融合配列は両端に変異をもつため、Creと反応する危険性が極めて低くなり、より安全な遺伝子治療が可能になる（図２２Ｂ）。
(2)Cre/変異loxシステムを用いた第２遺伝子挿入方法
　変異loxP配列（スペーサー配列変異）を用いて、第２遺伝子を挿入かつ薬剤耐性遺伝子・蛍光遺伝子を削除する方法を開発した。
　変異lox2272はスペーサー配列に変異を有するため、Creにより同じ変異lox配列と反応する特性を有する。この特性を利用して、スペーサー配列変異loxPを利用した目的遺伝子の相同組換え（実施例においては、lox71-lox2272で挟まれた領域とlox66-lox2272で挟まれた領域の組み換え）が可能である。その結果、自殺遺伝子に加えて別の治療遺伝子（第２遺伝子）を挿入し、かつ薬剤遺伝子を削除することが可能となる。Cre/変異loxシステムは、Cas3などのゲノム編集技術より、導入効率が高くかつオフターゲットの問題も極めて少なく安全である(図２２Ｃ)。
（Ｃ）方法
(1)薬剤耐性・マーカー遺伝子の除去
　Cas3発現プラスミド(図２３（１）)及びACTB組み換えプラスミド(図２３（２）)をエレクトロポレーションによりヒトiPS細胞へ導入し、ヒトiPS細胞ゲノムのACTB終始コドンを2A-yCD/UPRT-lox71-IRES- Puromycin耐性遺伝子-2A-Venus-lox66に置き換えた。1μg/mlのPuromycinを培地に加えて培養することで、組み換えが起きた細胞をセレクションした。同細胞にEF-mCherry-IRES-Creプラスミド(図２３（４）)を再びエレクトロポレーションで導入し、72時間後にVenus-/mCherry+の細胞をクローニングした。クローニングした細胞からゲノムを抽出し、PCRで挿入部位のDNAを増幅させてバンド長を確認したのち、シーケンスで配列を確認した。その後、NS/PCsへ分化誘導した。
(2)第２遺伝子の挿入
　Cas3発現プラスミド(図２３（１）)及びACTB組み換えプラスミド(図２３（３）)をエレクトロポレーションによりヒトiPS細胞へ導入し、ヒトiPS細胞ゲノムのACTB終始コドンを2A-yCD/UPRT-lox71-IRES- Puromycin耐性遺伝子-2A-Venus-lox2272に置き換えた。1μg/mlのPuromycinを培地に加えて培養することで、組み換えが起きた細胞をセレクションした。EF-mCherry-IRES-Cre及びlox66-IRES-AmCyan-lox2272配列を含むプラスミド(図２３（５）)を再びエレクトロポレーションで同細胞に導入し、72時間後にVenus-/AmCyan+/mCherry+の細胞をクローニングした。クローニングした細胞からゲノムを抽出し、PCRで挿入部位のDNAを増幅させてバンド長を確認したのち、遺伝子配列を確認した。その後、NS/PCsへ分化誘導した。
(3)遺伝子発現の確認
　リアルタイムqPCRにより(1)及び(2)でセレクションした細胞のmRNA発現を比較した。TB Green（登録商標）Premix Ex TaqTM II（タカラバイオ）を用いて、GAPDH、ACTB 、yCD-UPRT、Puromycin耐性遺伝子、Venus、AmCyanの遺伝子のmRNA発現量を測定し、ACTBまたはGAPDHの発現量で各遺伝子の発現量を正規化した。
(4)抗腫瘍効果の確認
　低接着96穴培養プレート（Prime Surface 96V，住友ベークライト社製）を用いて、グリオーマ幹細胞株hG008 (6×103個)と(1)または(2)で樹立したNS/PCs(3×103個)を1日間共培養し、その後5-FCを添加し（5μg/ml）、5日間後に細胞増殖/細胞毒性アッセイキットCell Counting Kit-8 (CCK-8) assayを行った。
（Ｄ）結果
(1)薬剤耐性・マーカー遺伝子の除去
　自殺遺伝子が挿入され、薬剤耐性遺伝子・マーカーが除去された（ACTB-2A-yCD/UPRT-lox71/66が組み込まれた）iPS細胞が樹立され、胚様体（embryoid body: EB）およびNS/PCsまで分化誘導できた(図２４)。ゲノムPCR及び遺伝子配列解析により、ゲノムに正確に組み込まれていることを確認した(図２５Ａ～Ｃ) 。
(2)第２遺伝子の挿入
　自殺遺伝子および第2遺伝子が挿入され、かつ薬剤耐性遺伝子・マーカーが除去された（ACTB-2A-yCD/UPRT-lox71/66-IRES-AmCyan-lox2272が組み込まれた）iPS細胞を樹立し、NS/PCsまで分化誘導できた。胚様体（embryoid body: EB）およびNS/PCsにおいて第２遺伝子のAmCyanの蛍光を確認した(図２６)。ゲノムPCR及び遺伝子配列解析により、ゲノムに正確に組み込まれていることを確認した(図２７Ａ～Ｃ)。
(3)遺伝子発現の確認
　(1)で樹立したiPS細胞、NS/PCsにおいて、yCD発現、Venus及びPuromycin耐性遺伝子の消失を確認できた(図２８)。(2)で樹立したiPS細胞、NS/PCs細胞において、yCD及び第２遺伝子(AmCyan)の発現、Venus及びPuromycin耐性遺伝子の消失を確認できた(図２８)。
　さらに、(1)で樹立したiPS細胞、NS/PCs細胞において、5-FC及びPuromycinの投与で細胞が死滅することを確認した(図２９)。(2)で樹立したiPS細胞、NS/PCs細胞において、5-FC及びPuromycinの投与で細胞が死滅することを確認した(図３０)
(4)抗腫瘍効果の確認
　(1)または(2)で樹立したNS/PCsとグリオーマ幹細胞株hG008を共培養し、5-FC(5μg/ml)を投与した。細胞死はCCK-8 assayにて評価したところ、どちらもプロドラッグ投与後、有意な腫瘍細胞死を起こした(図３１)。
〔実施例５〕　脳腫瘍以外の腫瘍への効果
以下には、脳腫瘍以外の腫瘍の１例として膵癌への作用を記載するが、他の腫瘍についても同様の作用を有する。
（Ａ）背景
　消化器癌は罹患率が高いが、特に膵癌は2016年の男性の癌死亡数の第5位（17060例）、女性の癌死亡数の第3位（16415例）と、女性では胃癌の死亡数を上回っている[国立がん研究センターがん情報サービス参照]。5年相対生存率は、膵癌は男性で7.9%、女性で7.5%と他臓器癌と比較して最も予後不良である[全がん協部位別臨床病期別 10 年相対生存率]。手術、化学療法、放射線療法を駆使した集学的治療を行うが、全身投与である化学療法の副作用は強く、遠隔転移を来しやすい性質、さらには腫瘍動脈への浸潤などから、診断時既に切除不能あるいは根治切除困難な状態と判定される例も多いことが現状であり、新たな治療法の開発が望まれる。膵癌に対する主な化学療法剤の一つとして5-FUが用いられており、本発明者の樹立した自殺遺伝子導入iPS細胞由来NS/PCsは、悪性腫瘍に対して指向・遊走性を示すことから、腫瘍局所で高濃度の抗がん剤5-FU投与が可能になる。
（Ｂ）方法
　ヒト膵癌細胞株 BxPC3　5×106個をNOD/SCID mouse (6W、雌)の左側腹部皮下に移植した。7日後に自殺遺伝子yCD-UPRT導入iPS- NS/PCs（ffLuc）5×105個を背部皮下移植、もしくは尾静脈投与した (図３２)。NS/PCsにはあらかじめffLuc(Venus蛍光タンパク質とLuc2ホタルルシフェラーゼの融合遺伝子)発現レンチウイルスベクター(CSII-EF-ffLuc)(Takahashi Y, Tsuji O, Kumagai G, Hara CM, Okano HJ, Miyawaki A, Toyama Y, Okano H, Nakamura M. Comparative study of methods for administering neural stem/progenitor cells to treat spinal cord injury in mice. Cell Transplant. 2011;20(5):727-39.)を感染させ、ffLucが安定に高発現するNS/PCsを得た。
　同一個体のNS/PCsの継時的変化はIVIS in vivo imaging systemで観察した。IVIS撮影時は、Isoflurane吸入麻酔下にVivoGloTM Luciferin 30mg/ml を200μl腹腔内投与し、ピークに達する10分で撮影を行った(図３３Ａ及びＢ)。
（Ｃ）結果
　iPS- NS/PCs (ffLuc)を背部皮下移植したモデルマウスにおいて、IVISで18日後に、膵癌移植部位（左側腹部）に信号の集積を認めた。尾静脈投与したモデルマウスでは、投与当日は肺にトラップされるが、３日後から徐々に膵癌移植部位（左側腹部）に信号の集積を認めはじめ、18日後には非常に強い集積を見せた。
　以上より、iPS- NS/PCsは膵癌に対しても強い指向・遊走性を示し、iPS- NS/PCsが膵癌に対しても良好なCellular delivery vehicleとして使用可能であることが明らかになった(図３３Ａ及びＢ)。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
　本発明の腫瘍治療細胞製剤、中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤は医薬として用いることができるので、本発明は、医薬の製造などの産業において利用可能である。

Claims (38)

  1. 　自殺遺伝子が導入された多能性幹細胞から分化させた神経幹細胞を含むことを特徴とする中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
  2. 　脳機能障害の治療に用いられることを特徴とする請求項１に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
  3. 　外傷性脳損傷の治療に用いられることを特徴とする請求項１に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
  4. 　脊髄損傷の治療に用いられることを特徴とする請求項１に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
  5. 　神経変性疾患の治療に用いられることを特徴とする請求項１に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
  6. 　脳腫瘍の治療に用いられることを特徴とする請求項１に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
  7. 　自殺遺伝子が、多能性幹細胞のβ-アクチン遺伝子の翻訳領域直後の3’側に挿入されていることを特徴とする請求項１～６に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
  8. 　多能性幹細胞のβ-アクチン遺伝子の翻訳領域直後の3’側に2Aペプチドをコードする配列が連結し、その2Aペプチドをコードする配列の3'側に自殺遺伝子が連結していることを特徴とする請求項７に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
  9. 　神経幹細胞が、そのゲノム中にセレクションマーカー遺伝子を含まない神経幹細胞であることを特徴とする請求項１～８に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
  10. 　神経幹細胞が、以下の工程（Ａ）～（Ｄ）を含む方法によって得られる神経幹細胞であることを特徴とする請求項９に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤、
    （Ａ）ゲノム編集により多能性幹細胞のゲノムに遺伝子コンストラクトを挿入する工程であって、前記遺伝子コンストラクトは、自殺遺伝子、セレクションマーカー遺伝子、及び二つのCreタンパク質の標的配列を含み、セレクションマーカー遺伝子は二つのCreタンパク質の標的配列に挟まれている遺伝子コンストラクトである工程、
    （Ｂ）工程（Ａ）で得られた多能性幹細胞の中から自殺遺伝子がゲノムに挿入された多能性幹細胞を、セレクションマーカー遺伝子によって選抜する工程、
    （Ｃ）工程（Ｂ）で得られた多能性幹細胞のゲノムからCreタンパク質によりセレクションマーカー遺伝子を除去する工程、
    （Ｄ）工程（Ｃ）で得られた多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させる工程。
  11. 　Creタンパク質の標的配列が、loxP配列であることを特徴とする請求項１０に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
  12. 　遺伝子コンストラクトに含まれる二つのCreタンパク質の標的配列が、上流繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列と下流繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列であり、遺伝子コンストラクトにおいて上流繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列はセレクションマーカー遺伝子の上流に位置し、下流繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列はセレクションマーカー遺伝子の下流に位置することを特徴とする請求項１０に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
  13. 　神経幹細胞が、以下の工程（ａ）～（ｄ）を含む方法によって得られる神経幹細胞であることを特徴とする請求項９に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤、
    （ａ）ゲノム編集により多能性幹細胞のゲノムに遺伝子コンストラクトを挿入する工程であって、前記遺伝子コンストラクトは、自殺遺伝子、セレクションマーカー遺伝子、繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列、及びスペーサー配列に変異を有する変異loxP配列を含み、セレクションマーカー遺伝子は前記二つの変異loxP配列に挟まれている遺伝子コンストラクトである工程、
    （ｂ）工程（ａ）で得られた多能性幹細胞の中から自殺遺伝子がゲノムに挿入された多能性幹細胞を、セレクションマーカー遺伝子によって選抜する工程、
    （ｃ）工程（ｂ）で得られた多能性幹細胞のゲノムからCreタンパク質及び相同組換えベクターによりセレクションマーカー遺伝子を除去すると共に、ゲノムに第２遺伝子を挿入する工程であって、前記相同組換えベクターは第２遺伝子、繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列、及びスペーサー配列に変異を有する変異loxP配列を含み、第２遺伝子は前記二つの変異loxP配列に挟まれている相同組換えベクターである工程、
    （ｄ）工程（ｃ）で得られた多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させる工程。
  14. 　ゲノム編集が、CRISPR/Cas3を用いたゲノム編集であることを特徴とする請求項１０～１３に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
  15. 　自殺遺伝子が、シトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項１～１４に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
  16. 　シトシンデアミナーゼによって5-フルオロウラシルに変換されるプロドラッグとともに使用されることを特徴とする請求項１５に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
  17. 　神経幹細胞が、エフリンA受容体、エフリンA、エフリンB受容体、エフリンB、及びCXCモチーフ型ケモカイン受容体4から選ばれる少なくとも一つの発現量を増加させた神経幹細胞であることを特徴とする請求項１～１６に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
  18. 　神経幹細胞が、エフリンA、エフリンA受容体、エフリンB受容体、エフリンB、及びCXCモチーフ型ケモカイン受容体4の発現量を増加させた神経幹細胞であることを特徴とする請求項１７に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
  19. 　神経幹細胞が、エフリンA、エフリンA受容体、エフリンB受容体、エフリンB、及びCXCモチーフ型ケモカイン受容体4から選ばれる少なくとも一つの発現量を指標として選別された神経幹細胞であることを特徴とする請求項１～１６に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
  20. 　神経幹細胞が、エフリンA、エフリンA受容体、エフリンB受容体、エフリンB、及びCXCモチーフ型ケモカイン受容体4を指標として選別された神経幹細胞であることを特徴とする請求項１９に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤。
  21. 　以下の工程（１）及び（２）を含むことを特徴とする神経幹細胞の製造方法、
    （１）ゲノム編集により、多能性幹細胞のβ-アクチン遺伝子の翻訳領域直後の3’側に、自殺遺伝子を挿入する工程、
    （２）工程（１）で得られた多能性幹細胞を神経幹細胞へ分化させる工程。
  22. 　工程（１）において、β-アクチン遺伝子の翻訳領域直後の3’側に2Aペプチドをコードする配列が連結し、その2Aペプチドをコードする配列の3'側に自殺遺伝子が連結するように、自殺遺伝子を多能性幹細胞のβ-アクチン遺伝子の翻訳領域直後の3’側に挿入することを特徴とする請求項２１に記載の神経幹細胞の製造方法。
  23. 　工程（１）が、以下の工程（１－Ａ）～（１－Ｃ）を含むことを特徴とする請求項２１又は２２に記載の神経幹細胞の製造方法、
    （１－Ａ）ゲノム編集により、多能性幹細胞のβ-アクチン遺伝子の翻訳領域直後の3’側に、遺伝子コンストラクトを挿入する工程であって、前記遺伝子コンストラクトは、自殺遺伝子、セレクションマーカー遺伝子、及び二つのCreタンパク質の標的配列を含み、セレクションマーカー遺伝子は二つのCreタンパク質の標的配列に挟まれている遺伝子コンストラクトである工程、
    （１－Ｂ）工程（１－Ａ）で得られた多能性幹細胞の中から自殺遺伝子がゲノムに挿入された多能性幹細胞を、セレクションマーカー遺伝子によって選抜する工程、
    （１－Ｃ）工程（１－Ｂ）で得られた多能性幹細胞のゲノムからCreタンパク質によりセレクションマーカー遺伝子を除去する工程。
  24. 　Creタンパク質の標的配列が、loxP配列であることを特徴とする請求項２３に記載の神経幹細胞の製造方法。
  25. 　遺伝子コンストラクトに含まれる二つのCreタンパク質の標的配列が、上流繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列と下流繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列であり、遺伝子コンストラクトにおいて上流繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列はセレクションマーカー遺伝子の上流に位置し、下流繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列はセレクションマーカー遺伝子の下流に位置することを特徴とする請求項２３に記載の神経幹細胞の製造方法。
  26. 　工程（１）が、以下の工程（１－ａ）～（１－ｃ）を含むことを特徴とする請求項２１又は２２に記載の神経幹細胞の製造方法、
    （１－ａ）ゲノム編集により、多能性幹細胞のβ-アクチン遺伝子の翻訳領域直後の3’側に、遺伝子コンストラクトを挿入する工程であって、前記遺伝子コンストラクトは、自殺遺伝子、セレクションマーカー遺伝子、繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列、及びスペーサー配列に変異を有する変異loxP配列を含み、セレクションマーカー遺伝子は前記二つの変異loxP配列に挟まれている遺伝子コンストラクトである工程、
    （１－ｂ）工程（１－ａ）で得られた多能性幹細胞の中から自殺遺伝子がゲノムに挿入された多能性幹細胞を、セレクションマーカー遺伝子によって選抜する工程、
    （１－ｃ）工程（１－ｂ）で得られた多能性幹細胞のゲノムからCreタンパク質及び相同組換えベクターによりセレクションマーカー遺伝子を除去すると共に、ゲノムに第２遺伝子を挿入する工程であって、前記相同組換えベクターは第２遺伝子、繰り返し配列に変異を有する変異loxP配列、及びスペーサー配列に変異を有する変異loxP配列を含み、第２遺伝子は前記二つの変異loxP配列に挟まれている相同組換えベクターである工程。
  27. 　ゲノム編集が、CRISPR/Cas3を用いたゲノム編集であることを特徴とする請求項２３～２６に記載の神経幹細胞の製造方法。
  28. 　自殺遺伝子が、シトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項２１～２７に記載の神経幹細胞の製造方法。
  29. 　請求項１５に記載の中枢神経系疾患・損傷治療用細胞製剤の脳腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を推定する方法であって、前記脳腫瘍細胞のチミジレートシンターゼ遺伝子及びジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量を測定する工程を含むことを特徴とする方法。
  30. 　腫瘍又は損傷部位に対する遊走性及び／又は指向性の高い神経幹細胞を選別する方法であって、エフリンA、エフリンA受容体、エフリンB受容体、エフリンB、及びCXCモチーフ型ケモカイン受容体4から選ばれる少なくとも一つの発現量を指標として選別することを特徴とする選別方法。
  31. 　エフリンA、エフリンA受容体、エフリンB受容体、エフリンB、及びCXCモチーフ型ケモカイン受容体4の発現量を指標として選別することを特徴とする請求項３０に記載の選別方法。
  32. 　請求項２１～２８に記載の方法によって製造される神経幹細胞であって、自殺遺伝子が導入された多能性幹細胞から分化させた神経幹細胞を含むことを特徴とする腫瘍治療用細胞製剤。
  33. 　神経幹細胞が、そのゲノム中にセレクションマーカー遺伝子を含まない神経幹細胞であることを特徴とする請求項３２に記載の腫瘍治療用細胞製剤。
  34. 　神経幹細胞が、エフリンA受容体、エフリンA、エフリンB受容体、エフリンB、及びCXCモチーフ型ケモカイン受容体4から選ばれる少なくとも一つの発現量を増加させた神経幹細胞であることを特徴とする請求項３２又は３３に記載の腫瘍治療用細胞製剤。
  35. 　神経幹細胞が、エフリンA、エフリンA受容体、エフリンB受容体、エフリンB、及びCXCモチーフ型ケモカイン受容体4の発現量を増加させた神経幹細胞であることを特徴とする請求項３４に記載の腫瘍治療用細胞製剤。
  36. 　神経幹細胞が、エフリンA、エフリンA受容体、エフリンB受容体、エフリンB、及びCXCモチーフ型ケモカイン受容体4から選ばれる少なくとも一つの発現量を指標として選別された神経幹細胞であることを特徴とする請求項３２又は３３に記載の腫瘍治療用細胞製剤。
  37. 　神経幹細胞が、エフリンA、エフリンA受容体、エフリンB受容体、エフリンB、及びCXCモチーフ型ケモカイン受容体4を指標として選別された神経幹細胞であることを特徴とする請求項３６に記載の腫瘍治療用細胞製剤。
  38. 　腫瘍が、膵癌であることを特徴とする請求項３２～３７に記載の腫瘍治療用細胞製剤。
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