WO2021200131A1 - 抗体薬物複合体 - Google Patents

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seq
tissue factor
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保広 松村
遼 津村
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国立研究開発法人国立がん研究センター
株式会社凜研究所
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    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
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    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to an antibody drug conjugate and an anticancer composition containing the same.
  • Tissue factor (TF) is expressed in many human cancer cells, and clinical studies have demonstrated a positive correlation between expression and malignancy.
  • the present inventors have produced an antibody targeting tissue factor and an antibody drug conjugate (ADC) containing an anti-tissue factor antibody and a cytotoxic agent (Patent Documents 1 and 2 and non-patents). Document 1).
  • An object of the present invention is to provide an antibody drug conjugate containing an anti-tissue factor antibody and a cytotoxic agent, which exerts an antitumor effect in vivo.
  • the present inventors have conducted intensive studies to achieve the above object, and monomethyl, which is a cytotoxic agent, is used as an anti-tissue factor antibody via a linker composed of maleimide-polyethylene glycol 12-valine-citrulline-p-aminobenzyl alcohol.
  • An ADC to which auristatin E (MMAE) was bound (hereinafter, also referred to as "hu1084-PEG12-MMAE”) was prepared.
  • an ADC in which the cytotoxic agent MMAE is bound to the anti-tissue factor antibody via a linker composed of maleimide caproyl-valine-citrulline-p-aminobenzyl alcohol (hereinafter, also referred to as "hu1084-MMAE"). was produced.
  • an ADC (hereinafter, also referred to as "hu1084-Dxd") in which Dxd, which is a cytotoxic agent, is bound to an anti-tissue factor antibody via a linker composed of maleimide caproyl-glycine-glycine-phenylalanine-glycine was also prepared.
  • Dxd which is a cytotoxic agent
  • hu1084-PEG12- MMAE or hu1084-MMAE showed a higher cell-killing effect than hu1084-Dxd.
  • hu1084-Dxd showed no cell-killing effect on PSN-1.
  • ADC containing anti-tissue factor antibody and MMAE is more effective against human pancreatic cancer.
  • PDX model nude mouse transplanted with human pancreatic cancer tissue
  • hu1084-Dxd is a human-derived pancreatic cancer in vivo. It has been found that a remarkable tumor growth inhibitory effect is exhibited on tissues and tumor regression is also observed, and the present invention has been completed.
  • the present invention provides the following with respect to an ADC to which Dxd is bound to an anti-tissue factor antibody via a linker composed of maleimide caproyl-glycine-glycine-phenylalanine-glycine.
  • a linker composed of maleimide caproyl-glycine-glycine-phenylalanine-glycine.
  • the dissociation rate constant kd of the antibody that binds to the tissue factor is 1 ⁇ 10 -4 (1 / s) or more, and the binding rate constant ka is 1 ⁇ 10 4 (1 / Ms) or more.
  • ⁇ 3> The antibody that binds to the tissue factor One or several amino acids have been substituted, deleted, added and / or inserted in at least one of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 to 3 or the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 to 3.
  • the antibody that binds to the tissue factor In at least one of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, the amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, or the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, 1 Or a heavy chain variable region containing an amino acid sequence in which several amino acids have been substituted, deleted, added and / or inserted. In at least one of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, the amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, or the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8.
  • a light chain variable region comprising an amino acid sequence in which several amino acids have been substituted, deleted, added and / or inserted.
  • the complex according to ⁇ 1> or ⁇ 2> which is an antibody that retains.
  • An anticancer composition comprising the complex according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>.
  • ⁇ 7> A composition for anti-pancreatic cancer containing the complex according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>.
  • the present invention also relates to the use of the complex for the production of anti-cancer compositions (anti-pancreatic cancer compositions, etc.), the use of the complex for anti-cancer use, and the use of the complex. It relates to a method of treating cancer, which is administered to a subject in an effective amount.
  • tissue factor is one of blood coagulation factors, and is also called F3, CD142, TFA, coagulation factor III, thromboplastin, or tissue thromboplastin.
  • Tissue factor is a transmembrane glycoprotein and is known as an initiator of exogenous blood coagulation reactions.
  • the tissue factor is preferably human tissue factor.
  • the amino acid sequence of human tissue factor is, for example, as shown in NCBI Reference Sequence: NP_001984.
  • the DNA sequence of a gene is mutated in nature (that is, non-artificially) due to the mutation or the like, and the amino acid sequence of the protein encoded by the mutation is also modified accordingly. Therefore, the "tissue factor” according to the present invention is not specified as a protein consisting of the typical amino acid sequence, and includes such a natural mutant.
  • the "bonding rate constant” (ka) and the “dissociation rate constant” (kd) are rate constants in the bond dissociation reaction between two molecules. Each can be determined, for example, by measurement by surface plasmon resonance (SPR), as shown in Examples below.
  • SPR surface plasmon resonance
  • the SPR measurement of the binding between the antibody and the antigen is well known, and those skilled in the art can obtain the binding rate constant ka and the dissociation rate constant kd of the antibody based on the well-known technique.
  • the binding rate constant can be obtained from the amount of change in RU in the phase in which the analyst flows at a constant concentration (binding phase), and then the dissociation constant is changed in RU in the phase in which the running buffer is flowed (dissociation phase).
  • the measurement can be performed by single-cycle kinetics. Further, the analysis can be performed by biological analysis.
  • the curve fit of the approximate curve to the measured SPR sensorgram can be performed by the kinetic titration 1: 1 interaction model. For more information on curve fit, see Karlsson, R. et al. , Katsamba, P. et al. S. , Nordin, H. et al. , Pol, E.I. and Myszka, D.M. G. (2006). "Analysis a kinetic titration series using affinity biosensors.”, Anal. Biochem. 349 (1): 136-47. Can be referred to.
  • the antibody binding rate constant ka and dissociation rate constant kd can also be determined according to the manufacturer's manual using, for example, an SPR device such as Biacore (registered trademark) commercially available from GE Healthcare. More specifically, the SPR measuring device is also equipped with a program for obtaining ka and kd, and ka and kd can be calculated from the SPR sensorgram. For example, an SPR sensorgram obtained by a Biacore (registered trademark) device is analyzed using a Biacore T200 Assessment Software, and a Bivalent Analyte model is adopted as a Fitting model to derive a Fitting curve and an antibody or ADC. It is also possible to calculate ka, kd, and KD.
  • an SPR device such as Biacore (registered trademark) commercially available from GE Healthcare. More specifically, the SPR measuring device is also equipped with a program for obtaining ka and kd, and ka and kd can be calculated from the SPR sensorgram. For example, an
  • an antibody drug conjugate containing an anti-tissue factor antibody and a cytotoxic agent which exerts an antitumor effect in vivo.
  • Anti-TF ADC Dxd represents hu1084-Dxd
  • Control ADC Dxd represents a modified amino acid in the CDR region of hu1084 in hu1084-Dxd, which no longer recognizes human tissue factor.
  • the DA R in the antibody-drug conjugate containing these Dxds is 7 to 8 (these notations are the same in FIGS. 1D and 1E). It is a graph which shows the result of having analyzed the cell killing effect of an antibody drug conjugate and a drug alone on a human pancreatic adenocarcinoma cell line (HPAF-II).
  • Tumor tissue formed in nude mice (no, 4) transplanted with human pancreatic cancer tissue (human pancreatic tumor tissue piece model number: PAN-04-JCK (Central Institute for Experimental Animals)) was used with an anti-tissue factor antibody. It is a micrograph showing the result of analysis by the immunostaining.
  • the scale bar in the figure represents 200 ⁇ m.
  • Tumor tissue formed in nude mice (no, 8) transplanted with human pancreatic cancer tissue human pancreatic tumor tissue piece model number: PAN-08-JCK (Central Institute for Experimental Animals)
  • was used with an anti-tissue factor antibody (e.g., a micrograph showing the result of analysis by the immunostaining.
  • the scale bar in the figure represents 200 ⁇ m.
  • results of immunostaining of the tumor tissue formed in the nude mouse (no, 8) by immunostaining using an anti-tissue factor antibody are also shown.
  • the scale bar in the photomicrograph represents 200 ⁇ m.
  • results of immunostaining the tumor tissue formed in the nude mouse (no, 14) by immunostaining using an anti-tissue factor antibody are also shown.
  • the scale bar in the photomicrograph represents 200 ⁇ m.
  • ⁇ Antibody drug conjugate> As shown in Examples described later, a complex (antibody drug conjugate) in which an antibody that binds to a tissue factor and Dxd, which is a cytotoxic agent, are bound via a linker consisting of maleimide caproyl-glycine-glycine-phenylalanine-glycine. , ADC) has been shown to show a remarkable tumor growth inhibitory effect on cancer in vivo and further to a tumor regression effect. Therefore, the present invention provides the antibody-drug conjugate.
  • the “antibody” in the present invention includes all classes of immunoglobulins (IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, IgY, etc.) and subclasses (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, etc.).
  • “Antibody” includes polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and also includes the form of functional fragments of antibodies.
  • a “polyclonal antibody” is an antibody preparation that comprises different antibodies against different epitopes.
  • monoclonal antibody is meant an antibody (including an antibody fragment) obtained from a substantially homogeneous population of antibodies.
  • monoclonal antibodies recognize a single determinant on the antigen.
  • the antibody of the present invention is preferably a monoclonal antibody.
  • Antibodies of the invention are antibodies that have been isolated and / or recovered (ie, isolated) from components of the natural environment.
  • Such an antibody can be prepared by the hybridoma method or by the recombinant DNA method.
  • Typical hybridoma methods include the Kohler & Milstein, Nature, 256: 495 (1975) methods.
  • the antibody-producing cells used in the cell fusion step in this method are animals immunized with an antigen (tissue factor, its partial peptide, a protein in which Fc protein or the like is fused to them, or a cell expressing these).
  • an antigen tissue factor, its partial peptide, a protein in which Fc protein or the like is fused to them, or a cell expressing these.
  • an antigen tissue factor, its partial peptide, a protein in which Fc protein or the like is fused to them, or a cell expressing these.
  • an antigen tissue factor, its partial peptide, a protein in which Fc protein or the like is fused to them, or a cell expressing these.
  • rat, mouse, hamster, rabbit, monkey, goat spleen cells, lymph node cells, peripheral blood leukocytes and the like.
  • myeloma cells can be used as myeloma cells.
  • the antibody-producing cells and myeloma cells may be of different animal species origin, as long as they can be fused, but are preferably of the same animal species origin.
  • Hybridomas are produced, for example, by cell fusion between spleen cells obtained from antigen-immunized mice and mouse myeloma cells, and by subsequent screening, hybridomas that produce tissue factor-specific monoclonal antibodies. Obtainable.
  • Monoclonal antibodies against tissue factor can be obtained by culturing hybridomas and from the ascites of mammals to which the hybridomas have been administered.
  • the DNA encoding the antibody of the present invention is cloned from a hybridoma, B cell, or the like, incorporated into an appropriate vector, and this is incorporated into a host cell (for example, a mammalian cell line such as CHO cell or HEK cell, Escherichia coli). , Yeast cells, insect cells, plant cells, etc.) to produce the antibody of the present invention as a recombinant antibody (for example, PJ Delves, Antibody Production: Essential Technologies, 1997 WILEY, P. Shepherd). and C. Dean Monoclonal Antibodies, 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, Vandamme AM et al., Eur. J. Biochem.
  • the DNA encoding the heavy chain or the light chain may be separately incorporated into the expression vector to transform the host cell, and the DNA encoding the heavy chain and the light chain may be used.
  • Host cells may be transformed by integration into a single expression vector (see WO 94/11523).
  • the antibody of the present invention can be obtained in a substantially pure and uniform form by culturing the host cell, separating and purifying it in the host cell or from the culture solution. For the separation and purification of the antibody, the method used in the usual purification of a polypeptide can be used.
  • transgenic animal cow, goat, sheep, pig, etc.
  • a transgenic animal production technique a large amount of monoclonal antibody derived from the antibody gene can be obtained from the milk of the transgenic animal. It is also possible to obtain it.
  • the antibody of the present invention may bind to tissue factor, and its origin, type, shape, etc. are not particularly limited. Specifically, non-human animal-derived antibodies (eg, rat antibodies, mouse antibodies, camel antibodies), human-derived antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, and functional fragments of these antibodies are included. When the antibody of the present invention is administered to humans as a pharmaceutical, a chimeric antibody or a humanized antibody is desirable from the viewpoint of reducing side effects.
  • the "chimeric antibody” is an antibody in which the variable region of a certain antibody and the constant region of an antibody different from the variable region are linked.
  • a chimeric antibody for example, an antibody variable region (variable region) that binds to an antigen is cut out from the gene of the monoclonal antibody produced as described above, and the antibody constant region (constant region) gene derived from human bone marrow is bound to this.
  • a human-derived antibody is used as the constant region of the chimeric antibody.
  • C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3, C ⁇ 4, C ⁇ , C ⁇ , C ⁇ 1, C ⁇ 2, and C ⁇ can be used as constant regions.
  • C ⁇ and C ⁇ can be used as a constant region.
  • the amino acid sequences of these constant regions and the base sequences encoding them are known.
  • one or several amino acids in the human-derived antibody constant region may be substituted, deleted, added and / or inserted. can.
  • the "humanized antibody” is an antibody obtained by transplanting (CDR graphing) the gene sequence of the antigen binding site (CDR) of an antibody derived from a non-human (rat, etc.) into an antibody gene derived from a human.
  • CDR antigen binding site
  • Methods are known such as overlap extension PCR (eg, European Patent Application Publication No. 239400, European Patent Application Publication No. 125023, International Publication No. 90/07861, International Publication No. 96/02576).
  • the variable region of an antibody is usually composed of three CDRs sandwiched between four framework regions (FRs).
  • the CDR is substantially the region that determines the binding specificity of the antibody.
  • the amino acid sequences of CDRs are highly diverse, the amino acid sequences that make up FR often show high homology even among antibodies with different binding specificities. Therefore, it is generally said that the binding specificity of one antibody can be transplanted to another antibody by transplanting CDR.
  • a human FR having high homology with the FR derived from the non-human animal is selected. That is, the amino acids in the CDR not only recognize the antigen, but also coordinate with the amino acids of FR in the vicinity of the CDR and are involved in the maintenance of the loop structure of the CDR, so that they are adjacent to the CDR to be transplanted. It is preferable to use a human FR having an amino acid sequence having high homology with the amino acid sequence of the FR.
  • the CDR forms a good antigen-binding site when linked via the CDR.
  • the FR of a human-derived antibody can be preferably selected. If necessary, Sato, K. et al. et al. , Cancer Res, 1993, 53, 851-856 and the like, and the amino acid residue of FR can be substituted so that the CDR of the humanized antibody forms an appropriate antigen binding site.
  • a mutant FR sequence having desired properties can be selected by measuring and evaluating the binding activity of the amino acid-substituted mutant antibody to the antigen.
  • the "functional fragment" of an antibody is also referred to as an antigen-binding fragment, and means a part (partial fragment) of the antibody that specifically recognizes tissue factor.
  • Fab, Fab', F (ab') 2 variable region fragment (Fv), disulfide bond Fv, single chain Fv (scFv), sc (Fv) 2, diabody, multispecific antibody, And these polymers and the like.
  • Fab means a monovalent antigen-binding fragment of immunoglobulin consisting of one light chain and a part of heavy chain. It can be obtained by papain digestion of the antibody and by recombinant methods. "Fab'” differs from Fab by the addition of a few residues at the carboxy terminus of the heavy chain CH1 domain, including one or more cysteines in the hinge region of the antibody. "F (ab') 2” means a divalent antigen-binding fragment of an immunoglobulin consisting of both light chain and both heavy chain portions.
  • a “variable region fragment (Fv)” is the smallest antibody fragment with complete antigen recognition and binding site. Fv is a dimer in which heavy chain variable regions and light chain variable regions are strongly linked by non-covalent bonds.
  • a “single chain Fv (scFv)” comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region of an antibody, which are located in a single polypeptide chain.
  • “Sc (Fv) 2” is a single chain obtained by binding two heavy chain variable regions and two light chain variable regions with a linker or the like.
  • a “diabody” is a small antibody fragment with two antigen binding sites, the fragment containing a heavy chain variable region bound to a light chain variable region within the same polypeptide chain, each region being separate.
  • a “multispecific antibody” is a monoclonal antibody that has binding specificity for at least two different antigens. For example, it can be prepared by co-expression of two immunoglobulin heavy chain / light chain pairs in which the two heavy chains have different specificities.
  • the antibody of the present invention includes an antibody whose amino acid sequence is modified without reducing desirable activity (antigen binding activity, etc.).
  • amino acid sequence variants can be produced, for example, by introducing a mutation into the DNA encoding the antibody chain of the humanized 1084 antibody described below, or by peptide synthesis.
  • modifications include, for example, substitutions, deletions, additions and / or insertions of residues within the amino acid sequence of the antibody.
  • the site where the amino acid sequence of the antibody is modified may be the constant region of the heavy chain or light chain of the antibody as long as it has the same activity as the antibody before modification, and the variable region (FR and CDR). May be.
  • Modification of amino acids other than CDR is considered to have a relatively small effect on antigen-binding activity, but at present, antibodies with enhanced antigen-binding activity are screened by modifying the amino acid of CDR.
  • the method is known (PNAS, 102: 8466-8471 (2005), Protein Engineering, Design & Selection, 21: 485-493 (2008), International Publication No. 2002/051870, J. Biol. Chem., 280: 24880- 24887 (2005), Protein Engineering, Design & Selection, 21: 345-351 (2008), MAbs. Mar-Appr; 6 (2): 437-45 (2014)).
  • the number of modified amino acids is preferably 10 amino acids or less (for example, 9 amino acids or less, 8 amino acids or less, 7 amino acids or less, 6 amino acids or less), and more preferably 5 amino acids or less (for example, 4 amino acids or less). Within), more preferably within 3 amino acids (eg, within 2 amino acids, 1 amino acid).
  • Amino acid modifications are preferably conservative substitutions. "Conservative substitution” means substituting with another amino acid residue having a chemically similar side chain. A group of amino acid residues having chemically similar amino acid side chains is well known in the art to which the present invention belongs.
  • acidic amino acids (aspartic acid / glutamic acid), basic amino acids (ricin / arginine / histidine), and neutral amino acids include amino acids having a hydrocarbon chain (glycine / alanine / valine / leucine / isoleucine / proline) and hydroxy groups.
  • Amino acids with (serine / threonine), amino acids containing sulfur (cysteine / methionine), amino acids with amide groups (aspartin / glutamine), amino acids with imino groups (proline), amino acids with aromatic groups (phenylalanine / tyrosine / It can be classified by tryptophan).
  • an antibody having an antibody chain having an amino acid sequence having an amino acid sequence homology of 80% or more at the amino acid sequence level with respect to the antibody chain of the humanized 1084 antibody described later in the modified amino acid sequence is also before modification. As long as it has the same activity as the antibody, it is included in the antibody of the present invention.
  • the homology may be at least 80%, but preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more (for example, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99). % Or more).
  • sequence homology can be determined using a BLASTP (amino acid level) program (Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990).
  • the program is based on the algorithm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993) by Karlin and Altschul. There is.
  • BLAST Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993
  • the amino acid sequence is analyzed using the Gapped BLAST program, it can be performed as described in Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997).
  • BLAST and Gapped BLAST programs use the default parameters of each program. Specific methods of these analysis methods are known.
  • “having equivalent activity” means that the antigen-binding activity is equivalent to that of the target antibody (typically, humanized 1084 antibody) (
  • the modification of the antibody of the present invention may be a modification of the post-translational process of the antibody, for example, by changing the number or position of glycosylation sites.
  • ADCC activity of the antibody can be improved.
  • Glycosylation of an antibody is typically N- or O-linked.
  • Glycosylation of an antibody is highly dependent on the host cell used to express the antibody.
  • Modification of the glycosylation pattern can be performed by a known method such as introduction or deletion of a specific enzyme involved in sugar production (Japanese Patent Laid-Open No. 2008-113663, US Pat. No. 5,047,335, US Pat. No. 5,510,261). US Pat. No. 5,278,299, International Publication No. 99/54342).
  • deamidation is suppressed by substituting an amino acid to be deamidated or an amino acid adjacent to the amino acid to be deamidated with another amino acid for the purpose of increasing the stability of the antibody.
  • Glutamic acid can also be replaced with other amino acids to increase antibody stability.
  • the present invention also provides an antibody thus stabilized.
  • the antibody of the present invention may have an internalizing ability (see Patent Document 1).
  • "Internalization” means a phenomenon in which an antibody is taken up into a cell after forming an immune complex with an antigen on the cell surface. Whether or not an antibody has an internalizing ability is determined by, for example, a method of contacting an antibody to which a labeling substance is bound with a cell expressing a tissue factor on the surface and confirming whether or not the labeling substance is transferred into the cell. , It is possible to judge by a method of confirming whether cell death or inhibition of cell proliferation is induced when an antibody bound with a cytotoxic substance is brought into contact with a cell expressing a tissue factor on the surface. can.
  • the antibody of the present invention may also have at least one cytotoxic activity selected from ADCC activity and CDC activity.
  • ADCC activity antibody-dependent cytotoxic activity
  • CDC activity complement-dependent cytotoxic activity
  • the dissociation rate constant kd of the antibody according to the present invention is preferably 1 ⁇ 10 -4 (1 / s) or more, more preferably 2 ⁇ 10 -4 (1 / s) or more, and 3 ⁇ . It is more preferably 10 -4 (1 / s) or more, more preferably 4 ⁇ 10 -4 (1 / s) or more, and further preferably 5 ⁇ 10 -4 (1 / s) or more.
  • the coupling rate constant ka is preferably 1 ⁇ 10 4 (1 / Ms) or more, more preferably 2 ⁇ 10 4 (1 / Ms) or more, and 3 ⁇ 10 4 (1 / Ms) or more.
  • Ms Metal-organic compound
  • kd and ka is preferably 1 ⁇ 10 -4 (1 / s) or more and 1 ⁇ 10 4 (1 / Ms) or more, respectively, and 3 ⁇ 10 -4 (1 / s) or more.
  • K D value is preferably from 1 to 100 nM, more preferably 10 ⁇ 50 nM, more preferably from 20 ⁇ 40 nM.
  • the rat-derived hybridoma clone No. 1 described in Patent Document 2 is used as the antibody of the present invention.
  • Monoclonal antibodies produced from 1084 (rat 1084 antibody) can be mentioned.
  • an antibody obtained by humanizing the rat-derived antibody (humanized 1084 antibody) is given as a more preferable example of the antibody of the present invention, and more specific examples include the following. ..
  • One or several amino acids have been substituted, deleted, added and / or inserted in at least one of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 to 3 or the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 to 3.
  • a heavy chain variable region containing an amino acid sequence in which several amino acids have been substituted, deleted, added and / or inserted In at least one of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, the amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, or the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8.
  • a light chain variable region comprising an amino acid sequence in which several amino acids have been substituted, deleted, added and / or inserted.
  • the homology and the number of amino acid modifications are as described above, and those skilled in the art can appropriately adjust the homology and the number of amino acid modifications while using the binding activity to tissue factor as an index.
  • the site to be modified as described above, a person skilled in the art can appropriately select the site, but preferably, the CDRs of the rat 1084 antibody and the site in which the amino acids are different from those in the humanized 1084 antibody can be mentioned, and more specifically. Select from 11 to 13, 15 and 16 positions from the N-terminal side of the heavy chain variable region CDR2, 4th position from the N-terminal side of the light chain variable region CDR1, and 4th position from the N-terminal side of the light chain variable region CDR2. At least one site (eg, 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7 sites) is mentioned. Further, the amino acid at these sites may be any amino acid (so-called Xaa).
  • Linker and drug In the ADC of the present invention, the above-mentioned antibody is bound to the linker and drug represented by the following formula (CAS No. 1594940-13-7).
  • the linker according to the present invention comprises maleimide caproyl (MC, maleimidecaproyl) -glycine (Gly) -glycine (Gly) -phenylalanine (Phe) -glycine (Gly).
  • the drug is an antitumor compound (Dxd, CAS No. 1594940-33-1) represented by the following formula.
  • Dxd has a camptothecin structure
  • the equilibrium is biased toward the structure (closed body) in which the lactone ring is formed in an acidic aqueous medium (for example, about pH 3), while in a basic aqueous medium (for example, about pH 10).
  • an acidic aqueous medium for example, about pH 3
  • a basic aqueous medium for example, about pH 10
  • the equilibrium is biased toward the structure in which the lactone ring is opened (ring-opened body). It was understood that even an ADC into which an exatecan residue corresponding to such a ring-closed structure and a ring-opened structure was introduced is expected to have the same antitumor effect, and both of them are included in the scope of the present invention. ..
  • linkers and drugs can be appropriately synthesized by those skilled in the art using known methods. It can also be obtained by purchasing as a commercially available product (for example, MedChemExpress, product number: HY-13331E, product name: Deluxtecan).
  • the "binding" between the anti-tissue factor antibody according to the present invention and the above-mentioned linker and drug is, as shown in the following formula, the thiol group (SH group, sulfhydryl group) in the antibody and the maleimide group at the linker terminal. It means a bond via a thioether group formed by the reaction.
  • thiol group SH group, sulfhydryl group
  • maleimide group at the linker terminal. It means a bond via a thioether group formed by the reaction.
  • mAb represents an anti-tissue factor antibody according to the present invention
  • Dxd represents a drug according to the present invention.
  • the number of drug bonds per antibody molecule defines reaction conditions such as the amount of raw materials and reagents to be reacted so that the number is constant in consideration of its efficacy and safety. It will be carried out. However, unlike the chemical reaction of low molecular weight compounds, it is usually obtained as a mixture of different numbers of drugs bound together.
  • the number of drug bonds to one antibody molecule is specified and expressed as an average value, that is, the average number of drug bonds. Therefore, unless otherwise specified in the present specification, the number of drug bonds means an average value.
  • the number of drug bonds per antibody molecule is adjusted by adjusting the type and concentration of the reducing agent used, the concentration of the linker and the drug with respect to the antibody (molar excess ratio, etc.), and the temperature or time in the binding reaction, as shown in Examples described later. By doing so, it can be controlled.
  • the "reducing agent” is not particularly limited as long as it can reductively cleave the disulfide bond in the antibody to generate the bond via the thiol group.
  • DTT dithiothreitol
  • DL- DTT
  • DTT 2-mercaptoethylamine
  • TCEP 2-mercaptoethanol
  • the average number of drug bonds per antibody is preferably 3 to 8, more preferably 4 to 8, still more preferably 5 to 8, and even more preferably 6 to 8. It is more preferably 7 to 8 pieces, and particularly preferably 8 pieces.
  • the number of drug bonds per antibody molecule can be determined by those skilled in the art using a reagent such as DTNB for colorimetrically quantifying thiol groups, as shown in Examples described later.
  • the ADC of the present invention may absorb water and become adsorbed water or become a hydrate when left in the air or recrystallized, and compounds containing such water and Salts are also included in the present invention.
  • One or more of the atoms constituting the ADC of the present invention may also contain an unnatural proportion of an atomic isotope.
  • atomic isotopes include 2 H, 3 H, 125 I, and 14 C.
  • the ADC of the present invention may be bound with a labeling substance for detection in bioimaging techniques and the like.
  • the labeling substance is appropriately selected according to the type of detection method to be used, and examples thereof include a radioactive labeling substance, a fluorescent labeling substance, a paramagnetic labeling substance, a superparamagnetic labeling substance, and an enzyme labeling substance.
  • the binding between such a labeling substance and the ADC may be direct or indirect. Examples of the indirect binding include a secondary antibody to which the labeling substance is bound and a binding via a polymer (protein A, protein B, etc.) to which the labeling substance is bound.
  • positron emitting nuclides can be used as radioisotopes to label ADCs.
  • Antibodies can be labeled with positron emitting nuclides such as 64 Cu, 18 F, 55 Co, 66 Ga, 68 Ga, 76 Br, 89 Zr and 124 I.
  • positron emitting nuclides such as 64 Cu, 18 F, 55 Co, 66 Ga, 68 Ga, 76 Br, 89 Zr and 124 I.
  • Known methods are used for labeling ADCs with these positron emitting nuclides. It can be used.
  • the radiation emitted from the radionuclide is measured from outside the body by PET (positron emission tomography) and converted into an image by computer tomography. NS. In this way, it is possible to track the penetration of the ADC administered to the subject into the tumor tissue and the like.
  • the ADC of the present invention exhibits a remarkable tumor growth inhibitory effect in vivo, and can also exhibit a tumor regression effect. Therefore, the present invention provides a composition (anticancer composition) for treating cancer, which comprises the ADC of the present invention.
  • cancer subject to the present invention examples include solid tumors, and more specifically, pancreatic cancer, lymphoma, lung cancer, head and neck cancer, prostate cancer, bladder cancer, breast cancer, and the like.
  • Esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, uterine cancer, ovarian cancer, skin cancer, thyroid cancer, thoracic adenocarcinoma, kidney cancer, testis cancer, penis cancer, liver cancer, biliary tract cancer examples include brain tumors, bone and soft tissue tumors, retroperitoneal tumors, and vascular / lymphangioma.
  • such cancers may be primary or metastatic.
  • composition of the present invention can contain other components that are pharmacologically acceptable, in addition to ADC.
  • Such other components include, for example, carriers, emulsifiers, wetting agents, pH buffering agents, excipients, disintegrants, buffering agents, tonicity agents, suspending agents, solubilizing agents, soothing agents, etc. Examples include stabilizers, preservatives and preservatives. More specifically, as other pharmacologically acceptable components, in the case of liquid preparations such as injections, aqueous solutions (physiological saline solution, water for injection, phosphate buffer solution, grape sugar aqueous solution, glycerol aqueous solution, etc.) , Aluminum hydroxide and the like can be mentioned as an example.
  • compositions of the present invention may be in the form of a kit such that the above ingredients can be mixed prior to administration. When used as an injection, it may be in the form introduced into a syringe.
  • composition of the present invention may contain only the ADC of the present invention as an active ingredient, or may contain the ADC and at least one other cancer therapeutic agent.
  • the ADC of the present invention can also be administered together with other cancer therapeutic agents, whereby the anticancer effect can be enhanced.
  • Other anticancer agents used for such purposes may be administered to the subject separately or continuously at the same time as the ADC of the present invention, or may be administered at different dosing intervals.
  • cancer therapeutic agents include immune checkpoint inhibitors (anti-PD-1 antibody, etc.), gemcitabine, S-1, errotinib, 5-FU, leuprorelin, irinotecan (CPT-11), oxaliplatin, abraxane, etc.
  • Carboplatin paclitaxel, pemetrexed, sorafenib, vinblastin, LH-RH analogs (leuprorelin, gocerelin, etc.), estramstin phosphate, estrogen antagonists (tamoxyphene, laroxyphene, etc.), aromatase inhibitors (anthrozol, retrozol, etc.) , Exemestane, etc.), and the agents described in WO 2003/038043, but the agents are not limited as long as they have antitumor activity.
  • the present invention also provides a method of treating cancer by administering to a subject an effective amount of the ADC of the present invention or a composition containing the ADC.
  • the ADC and composition administered in this method are as described above.
  • the "subjects" to which they are administered are not particularly limited as long as they require treatment, and may be those suffering from the above-mentioned cancers, and those who are at risk of suffering from such cancers. It may also have a risk of recurrence of the cancer.
  • the subject may be a human or a non-human mammal.
  • Non-human mammals are not particularly limited, and examples thereof include domestic animals, pets, and laboratory animals, and more specifically, monkeys, mice, rats, hamsters, guinea pigs, cows, pigs, horses, rabbits, sheep, goats, and so on. Examples include cats and dogs.
  • treatment means complete cure, cure, remission, improvement of symptoms or condition, and decrease in progression (deterioration) rate.
  • effective amount means the amount of a drug effective for the treatment.
  • the method of administration of the ADC or composition of the present invention varies depending on the age, body weight, sex, health condition, etc. of the subject to be administered, but parenteral administration (for example, intravenous administration, intraarterial administration, intradermal administration, intramuscular administration, etc. It can be administered by either intraperitoneal administration, local administration) or oral administration.
  • parenteral administration for example, intravenous administration, intraarterial administration, intradermal administration, intramuscular administration, etc. It can be administered by either intraperitoneal administration, local administration) or oral administration.
  • the preferred method of administration is parenteral administration, more preferably intravenous administration. Administration can be, for example, by injection or bolus injection.
  • the dose of the ADC or composition of the present invention may vary depending on the age, weight, sex, health condition, degree of progression of symptoms and components of the composition to be administered, but generally in the case of intravenous administration, In terms of the amount of drug contained, it is 0.001 to 1000 mg, preferably 0.01 to 100 mg per kg of body weight per day for an adult.
  • the number of administrations is, for example, once, or at intervals of 1 day to 1 year (for example, every week, every 10 to 30 days, every month, every 3 to 6 months, every 6 months, every year). May be administered multiple times.
  • each CDR region of the rat 1084 antibody was determined by the definition of Kabat.
  • Each sequence of the determined rat 1084 antibody is as follows. Amino acid sequence of heavy chain variable region CDR1 to 3 ... SEQ ID NO: 9 to 11 Amino acid sequence of heavy chain variable region ... SEQ ID NO: 12 Amino acid sequence of light chain variable region CDR1-3 ... SEQ ID NO: 13-15 Amino acid sequence of the light chain variable region ... SEQ ID NO: 16.
  • each amino acid sequence of the humanized 1084 antibody is as follows. Amino acid sequence of heavy chain variable region CDR1 to 3 ... SEQ ID NO: 1 to 3 Amino acid sequence of heavy chain variable region ... SEQ ID NO: 4 Amino acid sequence of light chain variable region CDR1-3 ... SEQ ID NO: 5-7 Amino acid sequence of light chain variable region ... SEQ ID NO: 8.
  • sequences of some CDR regions are different between the humanized 1084 antibody and the rat 1084 antibody. This is because the part is not exposed on the molecular surface, so it contributes to structural stabilization by interacting with the humanized framework region instead of the antigen recognition site, so the human sequence is used instead of the rat sequence. It depends on the adoption.
  • rituximab monoclonal antibody consisting of anti-human CD20 human / mouse chimeric antibody, CAS Registry Number: 174722-31-7, DrugBank: DB00073
  • the amino acid sequences of the heavy and light chains of the humanized 1084 antibody with the sequences derived from rituximab are shown in SEQ ID NOs: 17 and 18, respectively.
  • a vector encoding the humanized 1084 antibody was prepared by a conventional method, and the antibody was transiently expressed and purified using CHO cells (product name: ExpiCHO expression system (manufactured by Thermo Fisher)).
  • ADC antibody drug conjugate
  • a buffer used during the reduction treatment was prepared.
  • Dalbeccoline acid buffered saline (DPBS) containing 5 mM EDTA (pH 8.0) was prepared as buffer A.
  • buffer B 100 mM sodium dihydrogen phosphate, 150 mM sodium chloride, and 5 mM EDTA (pH 8.0) were prepared.
  • EDTA pH 8.0
  • the amount of liquid at which the final antibody concentration becomes 1 mg / mL is taken as the total reaction liquid volume, 1/6 of the amount of buffer B and the antibody solution are mixed, and finally the final antibody concentration is 1 mg / mL with buffer A. Adjusted to mL.
  • This mixed solution for reduction reaction was pre-incubated at 37 ° C. for 15 minutes in a constant temperature bath. Then, 1/100 of the whole mixture (2-mercaptoethylamine-HCl solution, manufactured by Sigma-Aldrich, final concentration 20 mM) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 30 minutes in a constant temperature bath.
  • the sample was immediately transferred onto ice, and the reducing agent was removed by substituting the buffer A with VIVASPIN TURBO 15 (manufactured by Sartorius, Göttingen, Germany). The buffer replacement was repeated until the original reaction solution could be diluted 1 million times or more.
  • the total reaction volume was set to the amount at which the final concentration of the antibody solution was 0.5 mg / mL, and 1/6 of that amount of buffer B and the antibody solution containing the reduced antibody became free.
  • a molar amount of linker Dxd (MedChemExpress, product number: HY-13631E, trade name: delxtecan), which is three times the required amount calculated from the thiol group, is mixed, and the final concentration of the antibody is 0.5 mg / by buffer A. Adjusted to mL. The mixture was gently stirred by inversion and mixing, and then allowed to stand at 4 ° C. for 18 hours.
  • the linker Dxd is a compound represented by the following formula.
  • DPBS was buffer-substituted again using VIVASPIN TURBO 15. This buffer replacement process was also repeated until the original reaction solution could be diluted 1 million times or more.
  • the ADC prepared in this manner is filtered using a PVDF membrane 0.22 ⁇ m filter unit under sterile conditions, and then dispensed with sterilized DPBS after adjusting the antibody concentration to 2 mg / mL. , It was cryopreserved at -80 ° C until use. Freezing was performed only once, and it was used in each experiment immediately after freezing and thawing.
  • hu1084-Dxd8 The preincubation temperature of the mixture for reduction reaction was 26 ° C., the reducing agent added to the mixture was a DL-DTT solution (manufactured by Sigma-Aldrich, final concentration 35 mM), and the incubation temperature after the addition was 26.
  • the ADC was prepared in the same manner as described above (Preparation of hu1084-Dxd3) except that the temperature was set to ° C.
  • DTNB 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)
  • RPMI-1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and penicillin-streptomycin-ampicillin B (x100) suspension was used as the culture medium.
  • Human pancreatic adenocarcinoma BxPC-3, PSN-1 and HPAF-II were adjusted to 5000 cells / mL, 2000 cells / mL and 5000 cells / mL, respectively, and seeded on a 96-well plate at 100 ⁇ L / well and CO. 2 The cells were allowed to stand in an incubator (37 ° C.) overnight.
  • Each ADC, Dxd single agent and MMAE single agent are adjusted with a culture solution so that the final concentration (MMAE and Dxd conversion) is 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100 nM, etc., and each human
  • the cells were allowed to stand in a CO 2 incubator (37 ° C.) for 6 days.
  • the culture medium containing the drug was removed with an ejector, and the number of viable cells was measured by Cell Counting Kit-8 (manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd.) according to the attached protocol.
  • the reaction time of the reagent was 3 hours, and the absorbance was measured by SpectraMax Paradigm (manufactured by Molecular Devices).
  • the results of the cell-killing effect are shown in FIGS. 1A-1E.
  • the IC50 values of MMAE, hu1084-PEG12-MMAE3, hu1084-PEG12-MMAE8, Dxd, hu1084-Dxd3, and hu1084-Dxd8 with respect to BxPC-3 were 0.62 ⁇ 0.04 nM, respectively. It was 0.05 ⁇ 0.00 nM, 0.05 ⁇ 0.00 nM, 2.58 ⁇ 0.26 nM, 0.27 ⁇ 0.02 nM, and 0.20 ⁇ 0.01 nM.
  • the IC50 values of MMAE, hu1084-PEG12-MMAE3, hu1084-PEG12-MMAE8, Dxd, hu1084-Dxd3, and hu1084-Dxd8 with respect to PSN-1 were 0.73 ⁇ 0.04 nM, respectively. 6.29 ⁇ 1.04 nM, 0.35 ⁇ 0.12 nM, 7.92 ⁇ 0.84 nM, N.I. D. , And N.M. D. Met.
  • the IC50 value of free MMAE was 30 to 50 times lower than that of free Dxd in the three types of human pancreatic adenocarcinoma cell lines. That is, the cell-killing effect on these human pancreatic adenocarcinoma cell lines was significantly higher in MMAE. In addition, in each ADC containing these drugs, MMAE had a several-fold higher cell-killing effect.
  • the complex composed of the MMAE linker (linker PEG12-MMAE or linker MMAE) and the anti-tissue factor antibody is the complex composed of the linker Dxd and the anti-tissue factor antibody.
  • linker PEG12-MMAE or linker MMAE linker PEG12-MMAE or linker MMAE
  • the anti-tissue factor antibody is the complex composed of the linker Dxd and the anti-tissue factor antibody.
  • hu1084-Dxd3 and hu1084-Dxd8 did not give IC50 (both ND), which showed a higher cell-killing effect.
  • the cells were washed with DPBS, and a goat-derived anti-tissue factor polyclonal antibody (R & D systems) was diluted 1/500 with a 5% skim milk solution and reacted at room temperature for 1 hour.
  • HRP-labeled anti-goat polyclonal antibody manufactured by MBL was diluted 1/500 with 5% skim milk solution and reacted at room temperature for 1 hour.
  • DAB diaminobenzidine
  • tissue factor was confirmed in 3 cases of pancreatic cancer PDX models (no, 2, 4 and 8). In both models, some tissue factor-negative cancer cell populations were also found, and the tumors were heterogeneous in terms of tissue factor expression. Further, as shown in FIG. 3E, in no and 14, as in the above three cases, the tumors were heterogeneous in terms of tissue factor expression. In particular, the pancreatic cancer PDX models no, 8 and no, 14 have lower expression levels of tissue factor and are more heterogeneous in their expression than no, 2 and 4, and are tissue factors. Cancer that did not express the disease was present in 50% or more of the total.
  • mice were randomly grouped, and treatment experiments were started by tail vein administration in each administration group.
  • Each ADC was administered at 10 mg / kg once a week for a total of 3 times, and tumor size and body weight were measured once a week.
  • the tumor size was calculated by measuring the major axis and minor axis of the subcutaneous tumor using an electric caliper and calculating by "major axis x minor axis x minor axis x 1/2 of the tumor".
  • Mice were euthanized by isoflurane over-anesthesia at the time when the tumor size exceeded 2000 mm 3 or when ulcers were observed in the tumor site as humanitarian endpoints. The number of N was 3-4.
  • mice to which DPBS was administered instead of ADC were also prepared.
  • the ADC composed of the anti-tissue factor antibody and the linker Dxd can exert a high tumor regression or tumor growth inhibitory effect on cancer in vivo.
  • a cancer cell population negative for some tissue factor was also observed, and even if the tumor was heterogeneous in terms of tissue factor expression, the ADC showed a high tumor growth inhibitory effect and the like.
  • Dxd is highly hydrophobic, and even after attacking tissue factor-positive cancer cells as ADC, it is released extracellularly in a free state and passes through the cell membrane of adjacent tissue factor-negative cancer cells. Then, it is presumed that the cancer cells can be easily invaded into the cells and killed (bystander effect). Most of the solid cancers formed in the body are heterologous cancer tissues in the expression of tissue factor, which strongly suggests the effectiveness of ADC consisting of anti-tissue factor antibody and linker Dxd.
  • linker MMAE when used, unlike the linkers PEG12-MMAE and the linker Dxd shown in FIGS. was expensive. In addition, no significant weight loss was observed in the ADC-treated group in all treatment experiments.
  • recombinant human tissue factor antigen was added to 10 mM sodium acetate solution (pH 5.0) to adjust the final concentration to 20 ⁇ g / mL.
  • the contact time was set to 120 seconds, and the antigen was immobilized on a CM5 sensor chip (manufactured by GE healthcare) by an amine coupling method.
  • the humanized 1084 antibody was replaced with an HBS-N solution (manufactured by GE healthcare) to adjust the antibody concentrations to 320 nM, 160 nM, 80 nM, 40 nM and 20 nM.
  • the binding kinetics of the antibody was measured by single-cycle kinetics.
  • the antibody contact time and dissociation measurement time were set to 120 seconds and 600 seconds, respectively.
  • the sensorgram was analyzed by 1: 1 binding. The results obtained are shown in Table 2.
  • the present invention it is possible to provide an antibody drug conjugate containing an anti-tissue factor antibody and a cytotoxic agent, which exerts an antitumor effect in vivo. Therefore, the present invention is useful in the development of anticancer agents, the treatment of cancer, and the like.

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Abstract

組織因子に結合する抗体と細胞傷害剤であるＤｘｄとが、マレイミドカプロイル－グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシンからなるリンカーを介し、結合している抗体薬物複合体。

Description

抗体薬物複合体
　本発明は、抗体薬物複合体、及びこれを含む抗がん用組成物に関する。
　組織因子（Ｔｉｓｓｕｅ　ｆａｃｔｏｒ、ＴＦ）は、多くのヒトがん細胞で発現しており、発現と悪性度との正の相関が臨床研究により実証されている。また、本発明者らによって、組織因子を標的とした抗体、及び抗組織因子抗体と細胞傷害剤とを含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）が作製されている（特許文献１及び２、並びに非特許文献１）。
国際公開第２０１５／１１５６５６号 国際公開第２０１９／０８７９９４号 特開第２０１８／１８８４５５号公報
Ｋｏｇａ　Ｙ．ら、Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ、２０１５年９月１５日、１３７巻、６号、１４５７～１４６６ページ
　本発明は、生体内において抗腫瘍効果を発揮する、抗組織因子抗体及び細胞傷害剤を含む抗体薬物複合体を提供することを目的とする。
　本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ね、抗組織因子抗体に、マレイミド－ポリエチレングリコール１２－バリン－シトルリン－ｐ‐アミノベンジルアルコールからなるリンカーを介し、細胞傷害剤であるモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）が結合しているＡＤＣ（以下、「ｈｕ１０８４－ＰＥＧ１２－ＭＭＡＥ」とも称する）を作製した。
　さらに、抗組織因子抗体に、マレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－ｐ‐アミノベンジルアルコールからなるリンカーを介し、細胞傷害剤であるＭＭＡＥが結合しているＡＤＣ（以下、「ｈｕ１０８４－ＭＭＡＥ」とも称する）を作製した。
　また、抗組織因子抗体に、マレイミドカプロイル－グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシンからなるリンカーを介し、細胞傷害剤であるＤｘｄが結合しているＡＤＣ（以下、「ｈｕ１０８４－Ｄｘｄ」とも称する）も作製した（リンカー及びＤｘｄについては、特許文献３　参照のほど）。
　そして、これらＡＤＣについて、ヒト膵臓腺がん細胞株（ＢｘＰＣ－３、ＰＳＮ－１、ＨＰＡＦ－ＩＩ）に対する殺細胞効果を解析した結果、いずれのヒト膵臓腺がん細胞においても、ｈｕ１０８４－ＰＥＧ１２－ＭＭＡＥ又はｈｕ１０８４－ＭＭＡＥの方が、ｈｕ１０８４－Ｄｘｄよりも、高い殺細胞効果を示した。特に、ＰＳＮ－１に対しては、ｈｕ１０８４－Ｄｘｄは全く殺細胞効果を示さなかった。
　このように、ヒト膵臓がんに対しては、抗組織因子抗体及びＭＭＡＥを含むＡＤＣの方が有効であることが示唆された。しかしながら、ヒト膵臓がん組織を移植したヌードマウス（ＰＤＸモデル）を用いて評価した結果、驚くべきことに、前記インビトロでの結果に反し、インビボにおいて、ｈｕ１０８４－Ｄｘｄは、ヒト由来の膵臓がん組織に対して顕著な腫瘍増殖抑制効果を示し、更には腫瘍退縮も認められることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、抗組織因子抗体に、マレイミドカプロイル－グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシンからなるリンカーを介し、Ｄｘｄが結合しているＡＤＣに関し、より具体的には以下を提供する。
＜１＞　組織因子に結合する抗体と、下記式にて表されるリンカー及び薬物とが、結合した複合体
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
＜２＞　前記組織因子に結合する抗体の、解離速度定数ｋｄが１×１０－４（１／ｓ）以上であり、かつ、結合速度定数ｋａが１×１０４（１／Ｍｓ）以上である、＜１＞に記載の複合体。
＜３＞　前記組織因子に結合する抗体が、
　配列番号：１～３に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号：１～３に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を、それぞれＣＤＲ１～３として含む、重鎖可変領域と、
　配列番号：５～７に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号：５～７に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を、それぞれＣＤＲ１～３として含む、軽鎖可変領域と
を保持する、抗体である、＜１＞又は＜２＞に記載の複合体。
＜４＞　前記組織因子に結合する抗体が、
　配列番号：４に記載のアミノ酸配列、配列番号：４に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号：４に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を、含む重鎖可変領域と、
　配列番号：８に記載のアミノ酸配列、配列番号：８に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号：８に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を、含む軽鎖可変領域と、
を保持する、抗体である、＜１＞又は＜２＞に記載の複合体。
＜５＞　前記リンカー及び薬物の１抗体あたりの平均結合数が３～８個である、＜１＞～＜４＞のうちのいずれか一項に記載の複合体。
＜６＞　＜１＞～＜５＞のうちのいずれか一項に記載の複合体を含む、抗がん用組成物。
＜７＞　＜１＞～＜５＞のうちのいずれか一項に記載の複合体を含む、抗膵臓がん用組成物。
　また、本発明は、抗がん用組成物（抗膵臓がん用組成物等）の製造のための前記複合体の使用、抗がん用途のための前記複合体の使用、前記複合体の有効量を対象に投与する、がんの治療方法に関する。
　なお、本発明において「組織因子（Ｔｉｓｓｕｅ　ｆａｃｔｏｒ、ＴＦ）」とは、血液凝固因子の１つであり、Ｆ３、ＣＤ１４２、ＴＦＡ、凝固第III因子（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　III）、トロンボプラスチン、組織トロンボプラスチンとも呼ばれるタンパク質である。組織因子は、膜貫通型の糖タンパク質であり、外因系血液凝固反応の開始因子として知られる。組織因子は、好ましくはヒト組織因子である。ヒト組織因子のアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００１９８４に示されるとおりである。しかしながら、遺伝子のＤＮＡ配列は、その変異等により、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し、それにコードされるタンパク質のアミノ酸配列もそれに伴い改変される。したがって、本発明に係る「組織因子」は、前記典型的なアミノ酸配列からなるタンパク質に特定されることなく、このような天然の変異体も含まれる。
　「結合速度定数」（ｋａ）及び「解離速度定数」（ｋｄ）は、２分子間の結合解離反応における速度定数である。各々、後述の実施例に示すように、例えば、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）による測定によって決定することができる。抗体と抗原間の結合のＳＰＲ測定は周知であり、当業者であれば周知技術に基づいて抗体の結合速度定数ｋａ及び解離速度定数ｋｄを求めることができる。ＳＰＲ測定では、アナライトを一定濃度でフローさせる相（結合相）において結合速度定数をＲＵの変化量から求めることができ、その後ランニングバッファーをフローさせる相（解離相）において解離定数をＲＵの変化量から求めることができる。測定は、ｓｉｎｇｌｅ－ｃｙｃｌｅ　ｋｉｎｅｔｉｃｓにより行うことができる。また解析は、ｂｉｖａｌｅｎｔ　ａｎａｌｙｓｉｓにより行うことができる。実測されるＳＰＲセンサーグラムに対する近似曲線のカーブフィットは、ｋｉｎｅｔｉｃ　ｔｉｔｒａｔｉｏｎ　１：１　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｍｏｄｅｌにより行うことができる。カーブフィットの詳細は、Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．，Ｋａｔｓａｍｂａ，Ｐ．Ｓ．，Ｎｏｒｄｉｎ，Ｈ．，Ｐｏｌ，Ｅ．ａｎｄ　Ｍｙｓｚｋａ，Ｄ．Ｇ．（２００６）．”Ａｎａｌｙｚｉｎｇ　ａ　ｋｉｎｅｔｉｃ　ｔｉｔｒａｔｉｏｎ　ｓｅｒｉｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ．”，　Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４９（１）：１３６－４７．を参照することができる。
　抗体の結合速度定数ｋａ及び解離速度定数ｋｄはまた、例えば、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から市販されるＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）等のＳＰＲ装置を用い、その製造者マニュアルに従って求めることができる。より具体的には、ＳＰＲ測定装置にもｋａ及びｋｄを求めるプログラムが搭載されており、ＳＰＲセンサーグラムからｋａ及びｋｄを算出することができる。例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）装置により得られたＳＰＲセンサーグラムをＢｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析し、Ｆｉｔｔｉｎｇ　ｍｏｄｅｌとしてＢｉｖａｌｅｎｔ　Ａｎａｌｙｔｅ　ｍｏｄｅｌを採用することにより、Ｆｉｔｔｉｎｇ　ｃｕｒｖｅを導出し、抗体又はＡＤＣのＫｉｎｅｔｉｃｓ　ｐａｒａｍｅｔｅｒとしてｋａやｋｄ、ＫＤを算出することもできる。
　本発明によれば、生体内において抗腫瘍効果を発揮する、抗組織因子抗体及び細胞傷害剤を含む抗体薬物複合体を提供することが可能となる。
ヒト膵臓腺がん細胞株（ＢｘＰＣ－３）に対する、抗体薬物複合体及び薬物単剤の殺細胞効果を解析した結果を示す、グラフである。図中、縦軸はヒト膵臓腺がん細胞株の生存率を示し、横軸は細胞株培養培地への薬物添加濃度（各薬物換算）を示す（グラフの縦軸及び横軸の表記については、以下の図１Ｂ～１Ｅにおいても同様である）。 ヒト膵臓腺がん細胞株（ＰＳＮ－１）に対する、抗体薬物複合体及び薬物単剤の殺細胞効果を解析した結果を示す、グラフである。 ヒト膵臓腺がん細胞株（ＢｘＰＣ－３）に対する、抗体薬物複合体及び薬物単剤の殺細胞効果を解析した結果を示す、グラフである。図中、「ａｎｔｉ－ＴＦ　ＡＤＣ　ＭＭＡＥ」は、ｈｕ１０８４－ＭＭＡＥを表し、「Ｃｏｎｔｒｏｌ　ＡＤＣ　ＭＭＡＥ」は、ｈｕ１０８４－ＭＭＡＥにおけるｈｕ１０８４のＣＤＲ領域のアミノ酸を改変し、ヒト組織因子を認識しなくなったものを表す。これらＭＭＡＥを含む抗体薬物複合体におけるリンカー及び薬物の１抗体あたりの平均結合数（ＤＡＲ）は３～４である。「ａｎｔｉ－ＴＦ　ＡＤＣ　Ｄｘｄ」はｈｕ１０８４－Ｄｘｄを表し、「Ｃｏｎｔｒｏｌ　ＡＤＣ　Ｄｘｄ」は、ｈｕ１０８４－Ｄｘｄにおけるｈｕ１０８４のＣＤＲ領域のアミノ酸を改変し、ヒト組織因子を認識しなくなったものを表す。これらＤｘｄを含む抗体薬物複合体におけるＤＡＲは７～８である（これら表記については、図１Ｄ及び１Ｅにおいても同様である）。 ヒト膵臓腺がん細胞株（ＨＰＡＦ－ＩＩ）に対する、抗体薬物複合体及び薬物単剤の殺細胞効果を解析した結果を示す、グラフである。 ヒト膵臓腺がん細胞株（ＰＳＮ－１）に対する、抗体薬物複合体及び薬物単剤の殺細胞効果を解析した結果を示す、グラフである。 ヒト膵臓がん組織（ヒト膵臓腫瘍組織片　型番：ＰＡＮ－０２－ＪＣＫ（実験動物中央研究所））を移植したヌードマウス（ｎｏ，２）において形成された腫瘍組織を、抗組織因子抗体を用いた免疫染色にて解析した結果を示す、顕微鏡写真である。図中のスケールバーは２００μｍを表す。 ヒト膵臓がん組織（ヒト膵臓腫瘍組織片　型番：ＰＡＮ－０４－ＪＣＫ（実験動物中央研究所））を移植したヌードマウス（ｎｏ，４）において形成された腫瘍組織を、抗組織因子抗体を用いた免疫染色にて解析した結果を示す、顕微鏡写真である。図中のスケールバーは２００μｍを表す。 ヒト膵臓がん組織（ヒト膵臓腫瘍組織片　型番：ＰＡＮ－０８－ＪＣＫ（実験動物中央研究所））を移植したヌードマウス（ｎｏ，８）において形成された腫瘍組織を、抗組織因子抗体を用いた免疫染色にて解析した結果を示す、顕微鏡写真である。図中のスケールバーは２００μｍを表す。 前記ヌードマウス（ｎｏ，２）における、抗体薬物複合体の抗腫瘍効果を解析した結果を示す、グラフである。図中、縦軸は腫瘍サイズを示し、横軸は抗体薬物複合体投与を開始してからの日数を示す（グラフの縦軸及び横軸の表記については、以下の図３Ｂ～３Ｅにおいても同様である）。 前記ヌードマウス（ｎｏ，４）における、抗体薬物複合体の抗腫瘍効果を解析した結果を示す、グラフである。図中、縦軸は腫瘍サイズを示し、横軸は抗体薬物複合体投与を開始してからの日数を示す。 前記ヌードマウス（ｎｏ，８）における、抗体薬物複合体の抗腫瘍効果を解析した結果を示す、グラフである。図中、縦軸は腫瘍サイズを示し、横軸は抗体薬物複合体投与を開始してからの日数を示す。 前記ヌードマウス（ｎｏ，８）における、抗体薬物複合体の抗腫瘍効果を解析した結果を示す、グラフである。図中、「ａｎｔｉ－ＴＦ－ＭＭＡＥ」及び「ａｎｔｉ－ＴＦ－Ｄｘｄ」は各々、ｈｕ１０８４－ＭＭＡＥ（ＤＡＲ：３）及びｈｕ１０８４－Ｄｘｄ（ＤＡＲ：８）を表す。また、前記ヌードマウス（ｎｏ，８）において形成された腫瘍組織を、抗組織因子抗体を用いた免疫染色にて解析した結果を併せて示す。当該顕微鏡写真中のスケールバーは２００μｍを表す。 ヒト膵臓がん組織（ヒト膵臓腫瘍組織片　型番：ＰＡＮ－１４－ＪＣＫ（実験動物中央研究所））を移植したヌードマウス（ｎｏ，１４）における、抗体薬物複合体の抗腫瘍効果を解析した結果を示す、グラフである。また、前記ヌードマウス（ｎｏ，１４）において形成された腫瘍組織を、抗組織因子抗体を用いた免疫染色にて解析した結果を併せて示す。当該顕微鏡写真中のスケールバーは２００μｍを表す。
　＜抗体薬物複合体＞
　後述の実施例に示すとおり、組織因子に結合する抗体と細胞傷害剤であるＤｘｄとが、マレイミドカプロイル－グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシンからなるリンカーを介して結合した複合体（抗体薬物複合体、ＡＤＣ）は、生体内において、がんに対して顕著な腫瘍増殖抑制効果を示し、更には腫瘍退縮効果を示すことが明らかになった。したがって、本発明は、該抗体薬物複合体を提供する。
　（組織因子に結合する抗体）
　本発明における「抗体」は、免疫グロブリンのすべてのクラス（ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＹ等）及びサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２等）を含む。「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体が含まれ、また、抗体の機能的断片の形態も含む意である。「ポリクローナル抗体」は、異なるエピトープに対する異なる抗体を含む抗体調製物である。「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（抗体断片を含む）を意味する。ポリクローナル抗体とは対照的に、モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を認識するものである。本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。本発明の抗体は、自然環境の成分から分離され、及び／又は回収された（即ち、単離された）抗体である。
　かかる抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができ、また組換えＤＮＡ法によって作製することができる。
　ハイブリドーマ法としては、代表的には、コーラー及びミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞は、抗原（組織因子、その部分ペプチド、それらにＦｃタンパク質等が融合してあるタンパク質、またはこれらを発現する細胞等）で免疫された動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球等である。免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞又はリンパ球等に対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することが可能である。ミエローマ細胞としては公知の種々の細胞株を使用することが可能である。抗体産生細胞及びミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、好ましくは、同一の動物種起源のものである。ハイブリドーマは、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、組織因子に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。組織因子に対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得することができる。
　組換えＤＮＡ法は、本発明の抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞等の哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞等）に導入し、本発明の抗体を組換え抗体として産生させる手法である（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７　ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ　ａｎｄ　Ｃ．Ｄｅａｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００　ＯＸＦＯＲＤ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＰＲＥＳＳ、Ｖａｎｄａｍｍｅ　Ａ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：７６７－７７５（１９９０））。本発明の抗体をコードするＤＮＡの発現においては、重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよく、重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい（国際公開第９４／１１５２３号　参照）。本発明の抗体は、上記宿主細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液から分離・精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離・精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。トランスジェニック動物作製技術を用いて、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等）を作製すれば、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。
　本発明の抗体は、組織因子に結合すればよく、その由来、種類、形状等は特に限定されない。具体的には、非ヒト動物由来の抗体（例えば、ラット抗体、マウス抗体、ラクダ抗体）、ヒト由来の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びこれら抗体の機能的断片が含まれる。本発明の抗体を医薬としてヒトに投与する場合は、副作用低減の観点から、キメラ抗体又はヒト化抗体が望ましい。
　本発明において「キメラ抗体」とは、ある種の抗体の可変領域とそれとは異種の抗体の定常領域とを連結した抗体である。キメラ抗体は、例えば、上述のように作製されるモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（可変領域）を切り出して、ヒト骨髄由来の抗体定常部（定常領域）遺伝子と結合し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入して産生させることにより取得することができる（例えば、特開平８－２８０３８７号公報、米国特許第４８１６３９７号公報、米国特許第４８１６５６７号公報、米国特許第５８０７７１５号公報）。
　キメラ抗体の定常領域には、通常、ヒト由来の抗体のものが使用される。例えば重鎖においては、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃμ、Ｃδ、Ｃα１、Ｃα２、及びＣεを定常領域として利用することができる。また軽鎖においてはＣκやＣλを定常領域として使用できる。これらの定常領域のアミノ酸配列、並びにそれをコードする塩基配列は公知である。また、抗体自体の安定性、又は抗体の産生の安定性を改善するために、ヒト由来の抗体定常領域中の１又は数個のアミノ酸を置換、欠失、付加及び／又は挿入をすることができる。
　本発明において「ヒト化抗体」とは、非ヒト（ラット等）由来の抗体の抗原結合部位（ＣＤＲ）の遺伝子配列をヒト由来の抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）した抗体であり、その作製方法は、オーバーラップエクステンションＰＣＲ等、公知である（例えば、欧州特許出願公開第２３９４００号明細書、欧州特許出願公開第１２５０２３号明細書、国際公開第９０／０７８６１号、国際公開第９６／０２５７６号）。抗体の可変領域は、通常、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）にはさまれた３つのＣＤＲで構成されている。ＣＤＲは、実質的に、抗体の結合特異性を決定している領域である。ＣＤＲのアミノ酸配列は多様性に富む一方、ＦＲを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗体の間でも、高い相同性を示すことが多い。そのため、一般に、ＣＤＲの移植によって、ある抗体の結合特異性を、他の抗体に移植することができるといわれている。また、ＣＤＲの機能の維持の観点から、非ヒト由来ＣＤＲのヒトＦＲへの移植においては、その非ヒト動物由来のＦＲと相同性の高いヒトＦＲが選択される。すなわち、ＣＤＲ内のアミノ酸は、抗原を認識するばかりでなく、ＣＤＲの近傍にあるＦＲのアミノ酸と配位し、ＣＤＲのループ構造の維持にも関与しているため、移植すべきＣＤＲに隣接しているＦＲのアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列からなるヒトＦＲを利用することが好ましい。
　非ヒト動物由来のＦＲと相同性の高い公知のヒトＦＲの検索を、例えば、インターネットで利用可能な抗体に特化した検索システム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｙｓｉｓ／）を利用して行うことができる。このようにして得られたヒトＦＲの配列と一致するように、非ヒト由来の抗体のＣＤＲ以外の配列に変異を導入することができる。あるいは、検索によって得られたヒトＦＲのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）が入手可能な場合は、その配列中に非ヒト由来ＣＤＲを導入してもよい。変異の導入等は核酸合成、部位特異的変異誘発等の当該分野で公知の技術を用いて行うことができる。
　このようにして作製されたヒト化抗体の抗原への結合活性を定性的又は定量的に測定し、評価することによって、ＣＤＲを介して連結されたときに該ＣＤＲが良好な抗原結合部位を形成するようなヒト由来の抗体のＦＲが好適に選択できる。また必要に応じ、Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，１９９３，５３，８５１－８５６等に記載の方法に沿って、ヒト化抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するようにＦＲのアミノ酸残基を置換することもでき、さらに当該アミノ酸を置換した変異型抗体の抗原への結合活性を測定して評価することによって、所望の性質を有する変異ＦＲ配列を選択することができる。
　本発明において抗体の「機能的断片」とは、抗原結合フラグメントとも称され、抗体の一部分（部分断片）であって、組織因子を特異的に認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、及びこれらの重合体等が挙げられる。
　ここで「Ｆａｂ」とは、１つの軽鎖及び重鎖の一部からなる免疫グロブリンの一価の抗原結合断片を意味する。抗体のパパイン消化によって、また、組換え方法によって得ることができる。「Ｆａｂ’」は、抗体のヒンジ領域の１つ又はそれより多いシステインを含めて、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端でのわずかの残基の付加によって、Ｆａｂとは異なる。「Ｆ（ａｂ’）２」とは、両方の軽鎖と両方の重鎖の部分からなる免疫グロブリンの二価の抗原結合断片を意味する。
　「可変領域断片（Ｆｖ）」は、完全な抗原認識及び結合部位を有する最少の抗体断片である。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が非共有結合により強く連結されたダイマーである。「一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」は、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、これらの領域は、単一のポリペプチド鎖に存在する。「ｓｃ（Ｆｖ）２」は、２つの重鎖可変領域及び２つの軽鎖可変領域をリンカー等で結合して一本鎖にしたものである。「ダイアボディー」とは、二つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片であり、この断片は、同一ポリペプチド鎖の中に軽鎖可変領域に結合した重鎖可変領域を含み、各領域は別の鎖の相補的領域とペアを形成している。「多特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。例えば、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現により調製することができる。
　本発明の抗体には、望ましい活性（抗原に対する結合活性等）を減少させることなく、そのアミノ酸配列が修飾された抗体が含まれる。このようなアミノ酸配列変異体は、例えば、後述のヒト化１０８４抗体の抗体鎖をコードするＤＮＡへの変異導入によって、またはペプチド合成によって作製することができる。そのような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を含む。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖又は軽鎖の定常領域であってもよく、また、可変領域（ＦＲ及びＣＤＲ）であってもよい。ＣＤＲ以外のアミノ酸の改変は、抗原との結合活性への影響が相対的に少ないと考えられるが、現在では、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原への結合活性が高められた抗体をスクリーニングする手法が公知である（ＰＮＡＳ，１０２：８４６６－８４７１（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：４８５－４９３（２００８）、国際公開第２００２／０５１８７０号、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：２４８８０－２４８８７（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：３４５－３５１（２００８）、ＭＡｂｓ．Ｍａｒ－Ａｐｒ；６（２）：４３７－４５（２０１４））。また、現在では、統合計算化学システム等（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔ、カナダＣＣＧ社製）を利用することにより、抗原への結合活性が高められた抗体をモデリングすることもできる（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｓｉ．ｃｏ．ｊｐ／ｋａｇａｋｕ／ｃｓ／ｃｃｇ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ／ｐｒｏｔｅｉｎ．ｈｔｍｌ　参照）。さらに、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ　Ｄｅｓ　Ｓｅｌ．２０１０　Ａｕｇ；２３（８）：６４３－５１に記載の通り、抗原への結合活性において、重鎖可変領域のＣＤＲ１及び軽鎖可変領域のＣＤＲ３は関与していない例が知られている、また同様に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　４４：１０７５－１０８４（２００７）には、大抵の抗体においては、軽鎖可変領域のＣＤＲ２は抗原への結合活性に関与していないということが報告されている。このように、抗体の抗原への結合活性においては、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域各々のＣＤＲ１～３の全てを要せずとも、同等の活性を発揮し得る。実際に、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．２００３　Ｊｕｌ　１８；３０７（１）：１９８－２０５、Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．２００４　Ｊｕｌ　９；３４０（３）：５２５－４２、Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．２００３　Ａｕｇ　２９；３３１（５）：１１０９－２０においては、元の抗体の少なくとも１のＣＤＲを保持することによって、抗原への結合活性が維持された例が報告されている。然るに、当業者であれば、ＦＲのみならず、ＣＤＲのアミノ酸配列も、その抗体の抗原への結合活性を維持したまま、また向上させることを目的として改変し得る。
　本発明の抗体に関し、改変されるアミノ酸数は、好ましくは、１０アミノ酸以内（例えば、９アミノ酸以内、８アミノ酸以内、７アミノ酸以内、６アミノ酸以内）、より好ましくは５アミノ酸以内（例えば、４アミノ酸以内）、さらに好ましくは３アミノ酸以内（例えば、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。アミノ酸の改変は、好ましくは、保存的な置換である。「保存的な置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸・グルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン・アルギニン・ヒスチジン）、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・トレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）で分類することができる。
　また、改変後のアミノ酸配列が、後述のヒト化１０８４抗体の抗体鎖に対して、アミノ酸配列レベルで８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる抗体鎖を有する抗体も、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、本発明の抗体に含まれる。かかる相同性としては、少なくとも８０％であればよいが、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）である。また、配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸レベル）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０，１９９０）を利用して決定することができる。該プログラムは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４－２２６８，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３－５８７７，１９９３）に基づいている。ＢＬＡＳＴＰによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。また、「同等の活性を有する」とは、抗原への結合活性が、対象抗体（代表的には、ヒト化１０８４抗体）と同等（例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上）であることを意味する。
　また、本発明の抗体の改変は、例えば、グリコシル化部位の数又は位置を変化させる等の抗体の翻訳後プロセスの改変であってもよい。これにより、例えば、抗体のＡＤＣＣ活性を向上させることができる。抗体のグリコシル化とは、典型的には、Ｎ－結合又はＯ－結合である。抗体のグリコシル化は、抗体を発現するために用いる宿主細胞に大きく依存する。グリコシル化パターンの改変は、糖生産に関わる特定の酵素の導入又は欠失等の公知の方法で行うことができる（特開２００８－１１３６６３号公報、米国特許第５０４７３３５号、米国特許第５５１０２６１号、米国特許第５２７８２９９号、国際公開第９９／５４３４２号）。さらに、本発明においては、抗体の安定性を増加させる等の目的で脱アミド化されるアミノ酸若しくは脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより脱アミド化を抑制してもよい。また、グルタミン酸を他のアミノ酸へ置換して、抗体の安定性を増加させることもできる。本発明は、こうして安定化された抗体をも提供するものである。
　また、本発明の抗体は、インターナリゼーション能を有していてもよい（特許文献１　参照のほど）。「インターナリゼーション」とは、抗体が細胞表面の抗原と免疫複合体を形成後、細胞内に取り込まれる現象を意味する。抗体がインターナリゼーション能を有するか否かは、例えば、標識物質を結合した抗体を表面に組織因子を発現する細胞と接触させ、該標識物質が細胞内に移行するか否かを確認する方法、細胞毒性を有する物質を結合した抗体を表面に組織因子を発現する細胞と接触させた際に、細胞死又は細胞の増殖阻害が誘導されるか否かを確認する方法等によって判断することができる。
　本発明の抗体はまた、ＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性から選択される少なくとも１の細胞障害活性を有していてもよい。「ＡＤＣＣ活性（抗体依存性細胞障害活性）」とは、標的細胞の細胞表面抗原に抗体が結合した際、その抗体のＦｃ領域にエフェクター細胞（ＮＫ細胞、単球等の免疫細胞）がさらに結合することにより、当該細胞が活性化され、それに伴い、因子を放出して標的細胞を殺傷する活性を意味する。他方、「ＣＤＣ活性（補体依存性細胞障害活性）」とは、抗体が標的細胞に結合すると補体系が活性化し、その結果、標的細胞を溶解する活性を意味する。
　一旦、組織因子に結合した後に速やかに解離することにより、ＡＤＣとした際に固形腫瘍内部への浸透能が高く、また抗腫瘍効果が高い傾向にあるという観点から（特許文献２　参照のほど）、本発明にかかる抗体の、解離速度定数　ｋｄは１×１０－４（１／ｓ）以上であることが好ましく、２×１０－４（１／ｓ）以上であることがより好ましく、３×１０－４（１／ｓ）以上であることがさらに好ましく、４×１０－４（１／ｓ）以上であることがより好ましく、５×１０－４（１／ｓ）以上であることがさらに好ましく、６×１０－４（１／ｓ）以上であることがより好ましく、７×１０－４（１／ｓ）以上であることがさらに好ましく、８×１０－４（１／ｓ）以上であることがより好ましく、９×１０－４（１／ｓ）以上であることがさらに好ましく、１０×１０－４（１／ｓ）以上であることがより好ましく、１５×１０－４（１／ｓ）以上であることがさらに好ましい。また同観点から、結合速度定数　ｋａが１×１０４（１／Ｍｓ）以上であることが好ましく、２×１０４（１／Ｍｓ）以上であることがより好ましく、３×１０４（１／Ｍｓ）以上であることがさらに好ましく、４×１０４（１／Ｍｓ）以上であることがより好ましく、５×１０４（１／Ｍｓ）以上であることがさらに好ましく、６×１０４（１／Ｍｓ）以上であることがより好ましい。さらに、ｋｄ及びｋａの組み合わせとしては各々、１×１０－４（１／ｓ）以上及び１×１０４（１／Ｍｓ）以上であることが好ましく、３×１０－４（１／ｓ）以上及び２×１０４（１／Ｍｓ）以上であることがより好ましく、１０×１０－４（１／ｓ）以上及び３×１０４（１／Ｍｓ）以上であることがさらに好ましく、１５×１０－４（１／ｓ）以上及び６×１０４（１／Ｍｓ）以上であることがより好ましい。なお、ｋｄ及びｋａの上限は免疫して得られる抗体のそれらの範囲であり得る。また、ＫＤ値は、１～１００ｎＭであることが好ましく、１０～５０ｎＭであることがより好ましく、２０～４０ｎＭであることがさらに好ましい。
　かかる本発明の抗体としては、特許文献２に記載のラット由来ハイブリドーマ　クローンＮｏ．１０８４から産生されるモノクローナル抗体（ラット１０８４抗体）が挙げられる。また後述の実施例に示すとおり、当該ラット由来の抗体をヒト化した抗体（ヒト化１０８４抗体）が、本発明の抗体のより好適な例として挙げられ、より具体的な例として以下が挙げられる。
　配列番号：１～３に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号：１～３に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を、それぞれＣＤＲ１～３として含む、重鎖可変領域と、
　配列番号：５～７に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号：５～７に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を、それぞれＣＤＲ１～３として含む、軽鎖可変領域と
を保持する、組織因子に結合する抗体。
　配列番号：４に記載のアミノ酸配列、配列番号：４に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号：４に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を、含む重鎖可変領域と、
　配列番号：８に記載のアミノ酸配列、配列番号：８に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号：８に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を、含む軽鎖可変領域と、
を保持する、組織因子に結合する抗体。
　なお、相同性やアミノ酸の改変数については上述のとおりであり、組織因子への結合活性等を指標としながら、当業者であれば適宜調整し得る。また改変される部位としても上述のとおり当業者であれば適宜選択し得るが、好ましくは、ラット１０８４抗体のＣＤＲｓとヒト化１０８４抗体におけるそれらとアミノ酸が異なっている部位が挙げられ、より具体的には、重鎖可変領域　ＣＤＲ２のＮ末側から１１～１３、１５及び１６位、軽鎖可変領域　ＣＤＲ１のＮ末側から４位、並びに軽鎖可変領域　ＣＤＲ２のＮ末側から４位から選択される、少なくとも１の部位（例えば、１、２、３、４、５、６又は７の部位）が挙げられる。また、これら部位におけるアミノ酸は、任意のアミノ酸（所謂、Ｘａａ）であってもよい。
　（リンカー及び薬物）
　本発明のＡＤＣにおいては、上述の抗体と、下記式にて表されるリンカー及び薬物とが、結合している（ＣＡＳ番号：１５９９４４０－１３－７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　本発明にかかるリンカーは、上記のとおり、マレイミドカプロイル（ＭＣ、ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）－グリシン（Ｇｌｙ）－グリシン（Ｇｌｙ）－フェニルアラニン（Ｐｈｅ）－グリシン（Ｇｌｙ）からなる。また薬物は、下記式にて表される抗腫瘍性の化合物（Ｄｘｄ、ＣＡＳ番号：１５９９４４０－３３－１）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　なお、Ｄｘｄは、カンプトテシン構造を有するので、酸性水性媒体中（例えば、ｐＨ３程度）ではラクトン環が形成された構造（閉環体）に平衡が偏り、一方、塩基性水性媒体中（例えば、ｐＨ１０程度）ではラクトン環が開環した構造（開環体）に平衡が偏ることが知られている。このような閉環構造及び開環構造に対応するエキサテカン残基を導入したＡＤＣであっても同等の抗腫瘍効果が期待され、いずれのものも本発明の範囲に包含されることを理解されたし。
　かかるリンカー及び薬物は、当業者であれば、公知の方法を用い、適宜合成し得る。また、市販品（例えば、ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ社、製品番号：ＨＹ－１３６３１Ｅ、商品名：デルクステカン（Ｄｅｒｕｘｔｅｃａｎ））として購入することにより、入手することができる。
　本発明にかかる抗組織因子抗体と、上述のリンカー及び薬物との「結合」とは、下記式に示すとおり、該抗体におけるチオール基（ＳＨ基、スルフヒドリル基）と、リンカー末端のマレイミド基との反応によって形成されるチオエーテル基を介した結合を意味する。なお、下記式において「ｍＡｂ」は、本発明にかかる抗組織因子抗体を表し、「Ｄｘｄ」は本発明にかかる薬物を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　本発明のＡＤＣにおいて、抗体１分子あたりの薬物結合数は、その有効性、安全性を考慮し、その数が一定の数となるよう、反応させる原料・試薬の使用量等の反応条件を規定して実施される。しかしながら、低分子化合物の化学反応とは異なり、異なる数の薬物が結合した混合物として得られるのが通常である。抗体１分子への薬物の結合数は平均値、すなわち、平均薬物結合数として特定され、表記される。したがって、本願明細書においても特に断りのない限り、薬物の結合数は平均値を意味する。
　抗体１分子あたりの薬物結合数は、後述の実施例に示すとおり、用いる還元剤の種類及びその濃度、抗体に対するリンカー及び薬物の濃度（モル過剰率等）、並びに結合反応における温度又は時間を調整することにより、コントロール可能である。「還元剤」としては、抗体中のジスルフィド結合を還元的に開裂させて上記チオール基を介した結合を生じさせ得るものであれば特に制限はないが、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ、ＤＬ－ＤＴＴ）、２－メルカプトエチルアミン、メルカプトエタノール、ＴＣＥＰが挙げられる。
　本発明において、１抗体あたりの薬物平均結合数は、好ましくは３～８個であり、より好ましくは４～８個であり、さらに好ましくは５～８個であり、より好ましくは６～８個であり、さらに好ましくは７～８個であり、特に好ましくは８個である。なお、抗体１分子あたりの薬物結合数は、後述の実施例に示すように、ＤＴＮＢ等のチオール基を比色定量する試薬を用い、当業者であれば求めることができる。
　また、本発明のＡＤＣは、大気中に放置したり、又は再結晶することにより、水分を吸収し、吸着水がついたり、水和物になる場合があり、そのような水を含む化合物及び塩も、本発明に含まれる。
　本発明のＡＤＣを構成する原子の１以上に、原子同位体の非天然割合も含有し得る。原子同位体としては、例えば、２Ｈ、３Ｈ、１２５Ｉ、１４Ｃが挙げられる。また、本発明のＡＤＣは、バイオイメージング技術等において検出するために、標識物質が結合されていてもよい。標識物質は、用いる検出方法等の種類に合せて適宜選択されるが、例えば、放射性標識物質、蛍光性標識物質、常磁性標識物質、超常磁性標識物質、酵素標識物質が挙げられる。また、このような標識物質とＡＤＣとの結合は直接的なものであってもよく、間接的なものであってもよい。間接的な結合としては、標識物質を結合させた二次抗体、標識物質を結合させたポリマー（プロテインＡ、プロテインＢ等）を介した結合が挙げられる。
　より具体的には、ＡＤＣを標識する放射性同位元素として、陽電子放出核種を利用することができる。例えば、６４Ｃｕ、１８Ｆ、５５Ｃｏ、６６Ｇａ、６８Ｇａ、７６Ｂｒ、８９Ｚｒ及び１２４Ｉのような陽電子放出核種で抗体を標識することができる。これらの陽電子放出核種によるＡＤＣの標識には、公知の方法（Ｎｕｃｌ　Ｍｅｄ　Ｂｉｏｌ．１９９９；２６（８）：９４３－５０．、Ｊ　Ｎｕｃｌ　Ｍｅｄ．２０１３；５４（１１）：１８６９－７５．等）を利用することができる。また、陽電子放出核種で標識されたＡＤＣが対象に投与された後に、ＰＥＴ（ポジトロン断層撮影装置）により、その放射性核種から放射される放射線を体外から計測し、コンピュータートモグラフィーの手法で画像に変換される。このようにして、対象に投与したＡＤＣの腫瘍組織への浸透等を追跡することができる。
　＜抗がん用組成物＞
　後述の実施例に示すとおり、本発明のＡＤＣは、生体内において、顕著な腫瘍増殖抑制効果を示し、更には腫瘍退縮効果も奏し得る。したがって、本発明は、本発明のＡＤＣを含む、がんを治療するための組成物（抗がん用組成物）を提供する。
　本発明の対象となる「がん」としては、例えば、固形腫瘍が挙げられ、より具体的には、膵臓がん、リンパ腫、肺がん、頭頸部がん、前立腺がん、膀胱がん、乳がん、食道がん、胃がん、大腸がん、子宮がん、卵巣がん、皮膚がん、甲状腺がん、胸腺がん、腎臓がん、精巣がん、陰茎がん、肝臓がん、胆道がん、脳腫瘍、骨軟部腫瘍、後腹膜腫瘍、血管・リンパ管肉腫が挙げられる。また、このようながんは原発性のものであってもよく、転移性のものであってもよい。
　本発明の組成物は、ＡＤＣの他、薬理学上許容される他の成分を含むことができる。このような他の成分としては、例えば、担体、乳化剤、湿潤剤、ｐＨ緩衝化剤、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、等張化剤、懸濁剤、可溶化剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤が挙げられる。より具体的に、薬理学上許容される他の成分としては、注射剤等の液状製剤の場合には、水溶液（生理食塩水、注射用水、リン酸塩緩衝液、葡萄糖水溶液、グリセロール水溶液等）、水酸化アルミニウム等を例として挙げることができる。また、凍結乾燥した製剤の場合、糖（マンニトール、ラクトース、サッカロース等）、アルブミン等を例として挙げることができるが、これらに限定されるものではない。さらに、本発明の組成物は、上記成分が投与前に混合され得るような、キットの態様であってもよい。また、注射剤として用いる場合には、シリンジに導入された形態であり得る。
　本発明の組成物は、有効成分として、本発明のＡＤＣのみを含むものであってもよいし、該ＡＤＣ及び少なくとも一つの他の癌治療剤を含むものであってもよい。本発明のＡＤＣは、他の癌治療剤と共に投与することもでき、これによって抗癌効果を増強させることができる。このような目的で使用される他の抗癌剤は、本発明のＡＤＣと同時に、別々に、あるいは連続して対象に投与されてもよいし、それぞれの投与間隔を変えて投与してもよい。このような癌治療剤として、例えば、免疫チェックポイント阻害薬（抗ＰＤ－１抗体等）、ゲムシタビン、Ｓ－１、エルロチニブ、５－ＦＵ、ロイコボリン、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、オキサリプラチン、アブラキサン、カルボプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ソラフェニブ、ビンブラスチン、ＬＨ－ＲＨアナログ（リュープロレリン、ゴセレリン等）、エストラムスチン・フォスフェイト、エストロジェン拮抗薬（タモキシフェン、ラロキシフェン等）、アロマターゼ阻害剤（アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン等）、国際公開第ＷＯ２００３／０３８０４３号に記載の薬剤を挙げることができるが、抗腫瘍活性を有する薬剤であれば限定されることはない。
　＜がんの治療方法＞
　本発明はまた、本発明のＡＤＣ又は該ＡＤＣを含む組成物の有効量を対象に投与する、がんを治療する方法を提供する。
　当該方法において投与されるＡＤＣ及び組成物については、上述のとおりである。それらが投与される「対象」としては、その治療を必要としているものであれば特に制限はなく、上述のがんを罹患しているものであってもよく、その罹患のおそれがあるもの、またがんを再発するおそれがあるものであってもよい。また対象は、ヒトであってもよく、非ヒト哺乳動物であってもよい。非ヒト哺乳動物としては特に制限はなく、家畜、ペット、実験用動物が挙げられ、より具体的には、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌが挙げられる。
　本発明において「治療」とは、完治、治癒、寛解、症状又は状態の改善、進行（悪化）速度の低下を意味する。また、「有効量」とは、その治療に有効な薬剤の量を意味する。
　本発明のＡＤＣ又は組成物の投与方法は、投与対象の年齢、体重、性別、健康状態等により異なるが、非経口投与（例えば、静脈内投与、動脈内投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、局所投与）、経口投与のいずれかの投与経路で投与することができる。好ましい投与方法は、非経口投与であり、より好ましくは静脈内投与である。投与は、例えば、注入又はボーラス注射によるものであり得る。
　本発明のＡＤＣ又は組成物の投与量は、対象の年齢、体重、性別、健康状態、症状の進行の程度及び投与する組成物の成分により変動しうるが、一般的に静脈内投与の場合、含有する薬物量換算にて、成人には体重１ｋｇ当たり１日０．００１～１０００ｍｇ、好ましくは０．０１～１００ｍｇである。投与回数としては、例えば、１回、又は１日～１年間に１回の間隔（例えば、１週毎、１０～３０日毎、１月毎、３～６月毎、半年毎、１年毎）で複数回投与してもよい。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　[抗組織因子抗体の調製]
　本実施例においては、特許文献２に記載のラット由来ハイブリドーマ　クローンＮｏ．１０８４から産生されるモノクローナル抗体（ラット１０８４抗体）をヒト化し、それを抗組織因子抗体として用いた。
　具体的には、先ず、ラット１０８４抗体の各ＣＤＲ領域の配列を、Ｋａｂａｔの定義で決定した。決定したラット１０８４抗体の各配列は以下のとおりである。
重鎖可変領域　ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列…配列番号：９～１１
重鎖可変領域のアミノ酸配列…配列番号：１２
軽鎖可変領域　ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列…配列番号：１３～１５
軽鎖可変領域のアミノ酸配列…配列番号：１６。
　次に、Ｈｕｍａｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）のＣｈａｐｔｅｒ　７（１２３－１３８）の記載の方法に沿って、ラット１０８４抗体のフレームワーク領域等をヒト由来のそれらに置換した。ヒト化した１０８４抗体の各アミノ酸配列は以下のとおりである。
重鎖可変領域　ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列…配列番号：１～３
重鎖可変領域のアミノ酸配列…配列番号：４
軽鎖可変領域　ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列…配列番号：５～７
軽鎖可変領域のアミノ酸配列…配列番号：８。
　なお、ヒト化１０８４抗体とラット１０８４抗体とは、一部のＣＤＲ領域の配列が異なっている。これは、当該部分は分子表面に露出していないため、抗原認識部位ではなく、ヒト化したフレームワーク領域と相互作用することで構造安定化に寄与するため、ラットの配列ではなくヒトの配列を採用したことによる。
　また、前記可変領域以外の配列（定常領域）は、リツキシマブ（抗ヒトＣＤ２０ヒト・マウスキメラ抗体からなるモノクローナル抗体、ＣＡＳ登録番号：１７４７２２－３１－７、ＤｒｕｇＢａｎｋ：ＤＢ０００７３）のものを用いた。リツキシマブ由来の配列を備えた、ヒト化１０８４抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を、配列番号：１７及び１８に各々示す。
　そして、ヒト化１０８４抗体をコードするベクターを常法にて作製し、ＣＨＯ細胞（製品名；ＥｘｐｉＣＨＯ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製））を用い、当該抗体を一過性で発現させ、精製した。
　［抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の調製］
　前記にて作製したヒト化１０８４抗体を用い、下記表１に示す４種類のＡＤＣを、以下に示す方法にて調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　（ｈｕ１０８４－Ｄｘｄ３の調製）
　先ず、還元処理時に用いるバッファーの作製を行った。バッファーＡとして、５ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）を調製した。またバッファーＢとして、１００ｍＭ　リン酸二水素ナトリウム、１５０ｍＭ　塩化ナトリウム、５ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を調製した。
　次に、抗体を含むＤＰＢＳ溶液に、０．５Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を添加し、最終ＥＤＴＡ濃度が５ｍＭになるように調整した。そして、最終抗体濃度が１ｍｇ／ｍＬになる液量を全反応液量として、その内の１／６量のバッファーＢと、抗体溶液を混合して、最後にバッファーＡで最終抗体濃度を１ｍｇ／ｍＬになるよう調整した。
　この還元反応用混合液を３７℃で１５分間、恒温槽を用いてプレインキュベーションした。その後、混合液全体の１／１００量の還元剤（２－メルカプトエチルアミン－ＨＣｌ溶液、Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ社製、終濃度２０ｍＭ）を添加して、３７℃で３０分間恒温槽を用いてインキュベーションした。
　反応終了後、速やかに氷上にサンプルを移し、ＶＩＶＡＳＰＩＮ　ＴＵＲＢＯ　１５（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製，、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、バッファーＡにバッファー置換を行い、還元剤の除去を行った。バッファー置換は、元の反応液を１００万倍以上希釈できるまで繰り返した。
　続いて、抗体溶液の最終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになる液量を全反応液量として、その内の１／６量のバッファーＢと、還元された抗体を含む抗体溶液、フリーになったチオール基から計算される必要量の３倍のモル量のリンカーＤｘｄ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ社、製品番号：ＨＹ－１３６３１Ｅ、商品名：デルクステカン）を混合して、バッファーＡにより抗体の最終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるように調整した。混合液を転倒混和により、穏やかに攪拌した後に、４℃で１８時間静置した。
　なお、リンカーＤｘｄは、下記式で表される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　最後に、再度ＶＩＶＡＳＰＩＮ　ＴＵＲＢＯ　１５を用いて、ＤＰＢＳにバッファー置換を行った。このバッファー置換の過程においても、元の反応液を１００万倍以上希釈できるまで繰り返した。
　このようにして調製したＡＤＣは、無菌条件下においてＰＶＤＦメンブレン０．２２μｍフィルターユニットを用い、フィルター処理した後に、滅菌済みのＤＰＢＳにて、抗体濃度が２ｍｇ／ｍＬになるよう調整して分注し、使用時まで－８０℃に凍結保存した。凍結はこの１回のみとし、凍結融解後は速やかに各実験に用いた。
　（ｈｕ１０８４－Ｄｘｄ８の作製）
　還元反応用混合液のプレインキュベーションの温度を２６℃とし、該混合液に添加した還元剤をＤＬ－ＤＴＴ溶液（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ社製、終濃度３５ｍＭ）とし、該添加後のインキュベーションの温度を２６℃とした以外は、前記（ｈｕ１０８４－Ｄｘｄ３の調製）に記載の方法と同様にして、ＡＤＣを調製した。
　［ｈｕ１０８４－ＰＥＧ１２－ＭＭＡＥ３の作製］
　リンカーＤｘｄの代わりに下記リンカーＰＥＧ１２－ＭＭＡＥ（Ｍａｌ－ＰＥＧ１２－ｖｃ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ。国立研究開発法人理化学研究所　眞鍋史乃博士からの提供）を用いた以外は、前記（ｈｕ１０８４－Ｄｘｄ３の調製）に記載の方法と同様にして、ＡＤＣを調製した。なお、リンカーＰＥＧ１２－ＭＭＡＥは、下記式で表される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　［ｈｕ１０８４－ＰＥＧ１２－ＭＭＡＥ８の作製］
　リンカーＤｘｄの代わりに前記リンカーＰＥＧ１２－ＭＭＡＥを用いた以外は、前記（ｈｕ１０８４－Ｄｘｄ８の作製）に記載の方法と同様にして、ＡＤＣを調製した。
　［ｈｕ１０８４－ＭＭＡＥ３の作製］
　リンカーＤｘｄの代わりに下記リンカーＭＭＡＥ（Ｍａｌ－ｖｃ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ。商品名：ｖｃＭＭＡＥ、メーカー：ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ、型番：ＨＹ－１５５７５）を用いた以外は、前記（ｈｕ１０８４－Ｄｘｄ３の調製）に記載の方法と同様にして、ＡＤＣを調製した。なお、リンカーＭＭＡＥは、下記式で表される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　［ｈｕ１０８４－ＭＭＡＥ８の作製］
　リンカーＤｘｄの代わりに前記リンカーＭＭＡＥを用いた以外は、前記（ｈｕ１０８４－Ｄｘｄ８の作製）に記載の方法と同様にして、ＡＤＣを調製した。
　なお、これらＡＤＣにおけるリンカー及び薬物の１抗体あたりの平均結合数（ＤＡＲ）は、チオール基を比色定量する試薬　ＤＴＮＢ（５，５’－ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２－ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ））を用いて行なった。すなわち、当該試薬を、還元剤による抗体の還元後とリンカー化合物の付加後とに各々添加した。そして、吸光度（λｍａｘ＝４１２ｎｍ）を測定することにより、フリーのチオール基を定量した。そして、前記還元後と付加後とにおけるフリーのチオール基数に基づき、ＤＡＲを算出した。
　［殺細胞効果］
　上記にて調製したＡＤＣについて、インビトロにてヒト膵臓腺がん細胞に対する殺細胞効果を、以下の方法にて評価した。
　培養液には、１０％　ウシ胎仔血清及びペニシリン－ストレプトマイシン－アンピシリン　Ｂ（×１００）懸濁液を添加したＲＰＭＩ－１６４０を用いた。ヒト膵臓腺がん　ＢｘＰＣ－３、ＰＳＮ－１及びＨＰＡＦ－ＩＩをそれぞれ５０００細胞／ｍＬ、２０００細胞／ｍＬ及び５０００細胞／ｍＬになるよう調整し、１００μＬ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートに播種し、ＣＯ２インキュベーター内（３７℃）で一晩静置した。
　各ＡＤＣ、Ｄｘｄ単剤及びＭＭＡＥ単剤を終濃度（ＭＭＡＥ及びＤｘｄ換算）が０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００ｎＭ等となるように培養液で調整し、各ヒト膵臓腺がんを播種した９６ウェルプレートに１００μＬ／ｗｅｌｌで添加後、ＣＯ２インキュベーター内（３７℃）で６日間静置した。その後、薬剤を含んだ培養液をアスピレーターにより除去して、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８（同仁化学社製）により生細胞数の測定を付属のプロトコールに従って行った。試薬の反応時間は３時間とし、吸光度の測定はＳｐｅｃｔｒａＭａｘ　Ｐａｒａｄｉｇｍ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）によって行った。殺細胞効果の結果を図１Ａ～１Ｅに示す。
　図１Ａに示した結果より、ＢｘＰＣ－３に対するＭＭＡＥ、ｈｕ１０８４－ＰＥＧ１２－ＭＭＡＥ３、ｈｕ１０８４－ＰＥＧ１２－ＭＭＡＥ８、Ｄｘｄ、ｈｕ１０８４－Ｄｘｄ３、及びｈｕ１０８４－Ｄｘｄ８のＩＣ５０値はそれぞれ、０．６２±０．０４ｎＭ、０．０５±０．００ｎＭ、０．０５±０．００ｎＭ、２．５８±０．２６ｎＭ、０．２７±０．０２ｎＭ、及び０．２０±０．０１ｎＭであった。
　図１Ｂに示した結果より、ＰＳＮ－１に対するＭＭＡＥ、ｈｕ１０８４－ＰＥＧ１２－ＭＭＡＥ３、ｈｕ１０８４－ＰＥＧ１２－ＭＭＡＥ８、Ｄｘｄ、ｈｕ１０８４－Ｄｘｄ３、及びｈｕ１０８４－Ｄｘｄ８のＩＣ５０値はそれぞれ、０．７３±０．０４ｎＭ、６．２９±１．０４ｎＭ、０．３５±０．１２ｎＭ、７．９２±０．８４ｎＭ、Ｎ．Ｄ．、及びＮ．Ｄ．であった。
　また、図１Ｃ～１Ｆに示した結果より、ヒト膵臓腺がん細胞の細胞株３種類において、フリーのＭＭＡＥはフリーのＤｘｄよりＩＣ５０値は３０～５０倍低かった。すなわち、これらヒト膵臓腺がん細胞株に対する殺細胞効果は、ＭＭＡＥの方が著明に高かった。また、これら薬剤を含むそれぞれのＡＤＣにおいても、ＭＭＡＥのほうが数倍殺細胞効果が高かった。
　以上のとおり、いずれのヒト膵臓腺がん細胞においても、ＭＭＡＥリンカー（リンカーＰＥＧ１２－ＭＭＡＥ又はリンカーＭＭＡＥ）及び抗組織因子抗体からなる複合体の方が、リンカーＤｘｄ及び抗組織因子抗体からなる複合体よりも、高い殺細胞効果を示した、特に、ＰＳＮ－１に対しては、ｈｕ１０８４－Ｄｘｄ３及びｈｕ１０８４－Ｄｘｄ８では、ＩＣ５０を得るに至らなかった（共にＮ．Ｄ．）。
　［抗腫瘍効果］
　（患者腫瘍組織移植（ＰＤＸ）モデルの作製）
　次に、各ＡＤＣについて、インビボにてヒト膵臓がん細胞に対する抗腫瘍効果を、以下の方法にて評価した。
　全ての実験において１週間馴化させた５週齢ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ　ｎｕ／ｎｕ、メス、日本チャールス・リバー）を用いた。３～５ｍｍ角のヒト膵臓腫瘍組織片（型番：ＰＡＮ－０２－ＪＣＫ、ＰＡＮ－０４－ＪＣＫ、ＰＡＮ－０８－ＪＣＫ、ＰＡＮ－１４－ＪＣＫ（実験動物中央研究所））を、各々ヌードマウスの皮下に移植し、形成した腫瘍をＰａｓｓａｇｅ１（Ｐ１）とした。なお、各ヒト膵臓腫瘍組織は、由来（各膵臓腫瘍を罹患するヒト）が異なる。Ｐ１腫瘍を細断し、３～５ｍｍ角にトリミングしてマウス皮下に移植してＰ２腫瘍を得た。この操作を繰り返して、腫瘍の継代を行った。抗腫瘍効果の検討にはＰ４～Ｐ６を用いる事とした。
　（免疫組織化学染色）
　過麻酔によりマウスを安楽死させた後に、迅速に腫瘍組織を摘出し、ＯＣＴコンパウンドに包埋し、－８０℃で凍結保存した。クリオスタットを用いて６μｍの腫瘍組織を薄切し、スライドガラスに張り付け、３０分間風乾した。４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）－ＤＰＢＳ溶液により１５分間室温で固定処理を行い、ＤＰＢＳで洗浄後、３％過酸化水素水－メタノール溶液に３０分間室温で処理し、内在性ペルオキシダーゼの不活化を行った。その後、ＤＰＢＳで洗浄し、５％スキムミルク－ＤＰＢＳ溶液により１時間室温でブロッキングを行った。同様にＤＰＢＳで洗浄し、ヤギ由来抗組織因子ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社）を５％スキムミルク溶液で１／５００希釈を行い、１時間室温で反応させた。ＤＰＢＳで洗浄後、ＨＲＰ標識抗ヤギポリクローナル抗体（ＭＢＬ社製）を５％スキムミルク溶液で１／５００希釈を行い、１時間室温で反応させた。ＤＰＢＳで洗浄後、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を３分間室温で反応させ、再度ＤＰＢＳで洗浄し、ヘマトキシリン溶液による核染色を１０分間室温で行った。流水で１０分間色出しを行い、エタノール及びキシレンによる脱水、透徹を行った。最後にマウントクイックを用いて、カバーガラスをかぶせて組織の封入を行った。観察はバーチャルスライドシステム（オリンパス社製）を用いて行った。染色の結果を図２Ａ～２Ｃ、図３Ｄ及び３Ｅに示す。
　図２Ａ～２Ｃに示すとおり、膵臓がんＰＤＸモデル３例（ｎｏ，２、４及び８）において、組織因子の発現が確認された。どちらのモデルも、一部組織因子陰性のがん細胞集団も見られ、組織因子発現に関しては不均一な腫瘍であった。また、図３Ｅに示すとおり、ｎｏ，１４においても、前記３例同様に、組織因子発現に関しては不均一な腫瘍であった。特に、膵臓がんＰＤＸモデル　ｎｏ，８及びｎｏ，１４の方が、ｎｏ，２及び４と比較して、組織因子の発現レベルが低く、またその発現においてより不均一な腫瘍であり、組織因子を発現していないがんが全体の５０％あるいはそれ以上存在していた。
　（ＰＤＸモデルを用いた治療実験）
　ＰＤＸモデルの平均腫瘍サイズが２００～３００ｍｍ３になった時点でランダムにマウスの群分けを行い、各投与群において尾静脈投与により治療実験を開始した。各ＡＤＣを１０ｍｇ／ｋｇで週１回、計３回投与し、腫瘍サイズと体重の測定を週１回行った。腫瘍サイズは、電動ノギスを用い皮下腫瘍の長径と短径を測定し、「腫瘍の長径×短径×短径×１／２」により算出した。腫瘍サイズが２０００ｍｍ３を超えた時点、あるいは腫瘍部に潰瘍等が観察された時点を人道的エンドポイントとして、イソフルランの過麻酔によるマウスの安楽死を行った。Ｎ数は３～４とした。また、陰性対照群として、ＡＤＣの代わりにＤＰＢＳを投与したマウスも調製した。
　図３Ａ～Ｃに示すとおり、いずれのＰＤＸモデルにおいても、上述のインビトロでの結果に反して、リンカーＤｘｄ及び抗組織因子抗体からなる複合体を投与した場合、腫瘍退縮又は腫瘍増殖抑制効果が認められた。
　一方、ＭＭＡＥリンカー（リンカーＰＥＧ１２－ＭＭＡＥ又はリンカーＭＭＡＥ）及び抗組織因子抗体からなる複合体を投与した場合には、図３Ｃにおいて示すとおり、ヒト膵臓腫瘍組織片　ＰＡＮ－０８－ＪＣＫを移植したＰＤＸモデルｎｏ．８にｈｕ１０８４－ＰＥＧ１２－ＭＭＡＥ８を投与した際に、腫瘍増殖抑制効果が認められた。また、図３Ｆにおいて示すとおり、ヒト膵臓腫瘍組織片　ＰＡＮ－１４－ＪＣＫを移植したＰＤＸモデルｎｏ．１４にｈｕ１０８４－ＭＭＡＥ３を投与した際に、腫瘍増殖抑制効果が認められた。しかしながら、その効果の程度は、リンカーＤｘｄ及び抗組織因子抗体からなる複合体を投与した場合に比べ、劣るものであった。
　このように、抗組織因子抗体及びリンカーＤｘｄからなるＡＤＣは、インビボにおいてがんに対して高い腫瘍退縮又は腫瘍増殖抑制効果を奏せることが明らかになった。特に驚くべきことに、一部組織因子陰性のがん細胞集団も見られ、組織因子発現に関しては不均一な腫瘍であったとしても、前記ＡＤＣは、高い腫瘍増殖抑制効果等を示した。
　かかる効果を奏せる理由は必ずしも定かではないが、本発明者らは以下のように推察する。すなわち、Ｄｘｄは疎水性が高く、組織因子陽性のがん細胞にＡＤＣとして攻撃した後も、細胞外にフリーな状態で放出され、隣接する組織因子陰性がん細胞の細胞膜を通過する。そして、容易に細胞内へと侵入し、当該がん細胞も殺すことができる（バイスタンダー効果）と推察する。体内において形成される固形がんの殆どは、組織因子の発現においてヘテロながん組織であることから、抗組織因子抗体及びリンカーＤｘｄからなるＡＤＣの有効性が強く示唆される。
　なお、図には示さないが、リンカーＭＭＡＥを用いた場合には、図３Ａ～３Ｃに示すリンカーＰＥＧ１２－ＭＭＡＥ及びリンカーＤｘｄとは異なり、ＤＡＲが３の方が８の時よりも腫瘍増殖抑制効果が高かった。また、全ての治療実験において、ＡＤＣ投与群の顕著な体重減少は観察されなかった。
　［表面プラズモン共鳴解析］
　ヒト化１０８４抗体の解離定数及び結合定数を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、製品名：ＢｉａＣｏｒｅ　Ｔ２００（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製））にて解析した。
　具体的には先ず、１ｍｇ／ｍＬのリコンビナントヒト組織因子抗原を、１０ｍＭ　酢酸ナトリウム液（ｐＨ５．０）に添加して、最終濃度が２０μｇ／ｍＬなるように調整した。次いで、ｃｏｎｔａｃｔ　ｔｉｍｅを１２０秒に設定し、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に前記抗原を、アミンカップリング法により固相化した。一方、ヒト化１０８４抗体を、ＨＢＳ－Ｎ溶液（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にて溶液置換し、抗体濃度が３２０ｎＭ、１６０ｎＭ、８０ｎＭ、４０ｎＭ及び２０ｎＭとなるように調整した。そして、これら希釈抗体を用いて、ｓｉｎｇｌｅ－ｃｙｃｌｅ　ｋｉｎｅｔｉｃｓにより、抗体のｂｉｎｄｉｎｇ　ｋｉｎｅｔｉｃｓを測定した。なお、抗体のｃｏｎｔａｃｔ　ｔｉｍｅと解離測定時間はそれぞれ１２０秒と６００秒に設定した。センサーグラムの解析は１：１　ｂｉｎｄｉｎｇにより行った。得られた結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　以上説明したように、本発明によれば、生体内において抗腫瘍効果を発揮する、抗組織因子抗体及び細胞傷害剤を含む抗体薬物複合体を提供することが可能となる。したがって、本発明は、抗がん剤の開発、及びがんの治療等において有用である。

Claims (7)

  1. 　組織因子に結合する抗体と、下記式にて表されるリンカー及び薬物とが、結合した複合体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  2. 　前記組織因子に結合する抗体の、解離速度定数ｋｄが１×１０－４（１／ｓ）以上であり、かつ、結合速度定数Ｋａが１×１０４（１／Ｍｓ）以上である、請求項１に記載の複合体。
  3. 　前記組織因子に結合する抗体が、
    　配列番号：１～３に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号：１～３に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を、それぞれＣＤＲ１～３として含む、重鎖可変領域と、
    　配列番号：５～７に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号：５～７に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を、それぞれＣＤＲ１～３として含む、軽鎖可変領域と
    を保持する、抗体である、請求項１又は２に記載の複合体。
  4. 　前記組織因子に結合する抗体が、
    　配列番号：４に記載のアミノ酸配列、配列番号：４に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号：４に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を、含む重鎖可変領域と、
    　配列番号：８に記載のアミノ酸配列、配列番号：８に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号：８に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を、含む軽鎖可変領域と、
    を保持する、抗体である、請求項１又は２に記載の複合体。
  5. 　前記リンカー及び薬物の１抗体あたりの平均結合数が３～８個である、請求項１～４のうちのいずれか一項に記載の複合体。
  6. 　請求項１～５のうちのいずれか一項に記載の複合体を含む、抗がん用組成物。
  7. 　請求項１～５のうちのいずれか一項に記載の複合体を含む、抗膵臓がん用組成物。
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